INDICE

INTRODUCCIN PROCEDIMIENTOS GENERALES PARA LA EXTRACCIN DE LPIDOS PREPARACIN DE LAS MUESTRAS DETERMINACIN DEL CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS EXTRACCIN CON DISOLVENTES EXTRACCIN SIN DISOLVENTES MTODOS INSTRUMENTALES EJEMPLOS SELECCIONADOS DE EXTRACCIN DE LPIDOS EN ALIMENTOS DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS FRACCIONAMIENTO DE LPIDOS MTODOS FSICOS DE CARACTERIZACIN DE LPIDOS MTODOS QUMICOS ESTABILIDAD DE LA GRASA Y GRADO DE OXIDACIN

LPIDOS = materia grasa total, materia extrable con hexano o ter etlico, etc... DEFINICIN: componentes mayoritarios de los alimentos que son insolubles en agua pero son solubles en disolventes orgnicos. Fuente importante de energia. Lpidos esenciales. LIMITACIONES DE LA DEFINICIN: los esteroles, escualenos y carotenoides siguen las normas indicadas en cuanto a solubilidad, pero no tienen cidos grasos en su estructura los gangliosidos son solubles en agua e insolubles en la mayora de los disolventes utilizados para la extraccin de los lpidos. Gran nmero de compuestos incluidos dentro del trmino genrico de lpido.

Colesterol

FUNCIONES PRINCIPALES: Culinaria

Capacidad de retener (solubilizar) compuestos aromticos (olores y sabores) Mejora de la textura de los helados Mejor capacidad en la transferencia de calor la fuente ms compacta de caloras (energa) para el hombre presentan el doble de valor calrico que los carbohidratos vitales para la estructura de las clulas tambin sirven como portadores de vitaminas liposolubles.

Nutricional

Fisiolgica

La cantidad de lpidos (y tipo) vara mucho segn el tipo de alimento La determinacin de lpidos, sobre todo en la industria, esta dirigida a tres objetivos diferentes:

Contenido total en lpidos Composicin de la materia grasa Control de calidad

En cada tipo de muestra es ms importante alguno de los aspectos anteriores (y raramente los tres).

La cantidad de lpidos (y tipo) vara mucho segn el tipo de alimento

Alimento grasa animal y aceites vegetales manteca y margarina frutos secos chocolate germen de cereales semillas de aceites carnes queso aguacate helado huevos pescado leche cereales pan frutas y verduras % lpidos 100 81 46-71 35-53 30 18-60 16-50 4-38 16 12 12 4-16 4 3-5 3-6 Muy bajo

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS La preparacin depende del tipo de material analizado y del procedimiento analtico posterior. Precauciones: evitar modificaciones de los lpidos por procesos qumicos, fsicos o enzimticos en esta etapa Recomendaciones: 1. Los procedimientos deberan llevarse a cabo en atmsfera de nitrgeno 2.Los disolventes deberan estar purificados y libres de perxidos 3.Minimizar la calefaccin 4.Purificar el extracto para eliminar los componentes no lipdicos

DETERMINACIN DEL CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS

Clasificacin de los mtodos:

Extraccin con disolventes (por lotes, contnua, ASE, SFE) Extraccin sin disolventes Mtodos instrumentales

CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS. EXTRACCIN CON DISOLVENTES Podemos encontrar:

Extraccin por lotes (discontinua) Extraccin en continuo ASE (Accelerated Solvent Extraction) SFE (Supercritical Fluid Extraction)

Preparacin de muestra para la extraccin con disolventes: Secado de la muestra (eliminacin de agua) Reduccin del tamao de partcula Hidrlisis cida (lipoproteinas o glicolpidos)

CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS. EXTRACCIN CON DISOLVENTES Preparacin de muestra para la extraccin con disolventes: Soluciones a la presencia de agua: Tratamiento de secado a temperatura baja Liofilizacin: muy adecuada por afectar poco a la posterior extraccin y aumentar la superfcie de la muestra Proceso de molturacin de la muestra seca En mortero con arena (semillas aceitosas) Con cuchillas (materiales blandos) preferiblemente a baja temperatura Blenders: extraccin y molturacin al mismo tiempo Molinos de bolas de acero con arena y disolvente orgnico

CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS. EXTRACCIN CON DISOLVENTES Seleccin del extractante (disolvente): Por definicin, los lpidos presentan una muy baja solubilidad en agua y una solubilidad considerable en disolventes orgnicos apolares (resultado de su hidrofobicidad debido a su importante estructura hidrocarbonada) Disolvente universal? seleccin imposible por el amplio espectro de compuestos (y estructuras qumicas) y propiedades fsicas Requerimientos de los disolventes: Capaz de romper los enlaces con el resto de los compuestos, liberar los lpidos y solubilizarlos Polaridad similar a la del analito Trigliceridos solubles en disolventes apolares (hexano o eter de petroleo) Otros compuestos ms polares como glicolpidos son solubles en alcoholes Un disolvente bastante universal es el cloroformo (aunque falla para solubilizar algunos compuestos lipdicos (glicolpidos, proteolpidos))

CONTINGUT TOTAL DE LIPIDS. EXTRACCI AMB DISSOLVENTS Seleccin extractante (disolvente):

Disolvente Eter etlico Utilizacin General Caractersticas extraccin de lpidos oxidados caro explosivo e inflamable disuelve bastante agua durante la extraccin disuelve tambin componentes no lipdicos al evaporarlo forma perxidos ms selectivo para la extraccin de lpidos reales extraccin de muchos componentes no lipdicos y efectivo en este tipo de muestras evaporacin a temperaturas elevadas incluso a vacio formacin final de dos fases: orgnica y acuosa proporciona una cierta purificacin en la fase orgnica

Eter de petroleo General Eter/alcohol n-butanol saturado de agua cloroformo/ metanol/agua materiales biolgicos cereales harina

CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS. EXTRACCIN CON DISOLVENTES Purificacin de los extractos Problema: Coextraccin de sustncias no lipdicas (carbohidratos, aminocidos,...) Accin: eliminar del extracto antes de realizar una determinacin gravimtrica de la grasa total Soluciones: Extraccin con agua o soluciones salinas Emulsiones en ciertas muestras Prdidas de ciertos lpidos parcialmente solubles en agua Evaporacin de los extractes a sequedaa bajo vacio o corriente de nitrgeno y reextraccin con un disolvente apolar Cromatografa Lquida (GPC)

CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS. EXTRACCIN CON DISOLVENTES Soxhlet 4-6 horas

Sifn

Muestra

Disolvente

CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS. EXTRACCIN CON DISOLVENTES SOXTEC (extractor en continuo por condensacin) Ms rpido (30-60 min) Automatizable y desatendido

ASE
(Accelerated Solvent Extraction)

ASE (Accelerated Solvent Extraction)

SFE (Supercritical Fluid Extraction)

CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS. EXTRACCIN SIN DISOLVENTES Fundamento: uso de reactivos para separar los lpidos del resto de componentes del alimento considerado. Aplicacin: tpicamente indicada para leche y productos lcteos Clasificacin: Mtodo Babcock y Mtodo Gerber Utiliza cido (sulfrico en Babcock y una mezcla sulfrico/alcohol isoamlico en Gerber) para liberar la grasa de la capa protenica que la rodea. Se mide directamente la grasa despus de centrifugar Mtodo del detergente El reactivo es una mezcla de tensioactivos, surfactantes detergentes, que rompe la capa de los glbulos de grasa

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CONTENIDO TOTAL DE LPIDOS. MTODOS INSTRUMENTALES Fundamento: uso de tcnicas instrumentales para medir directamente el contenido de lpidos Clasificacin Basados en propiedades fsicas globales Densidad Conductividad elctrica Basados en absorcin de radiacin UV-Vis IR RMN Rayos X Basados en dispersin de radiacin Ventajas: no-destructivos, poca preparacin de muestra, medida rpida, precisa y simple Inconvenientes: necesidad de curva de calibrado, muestras sencillas, coste equipamiento

DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Es la fraccin lipdica de un alimento simple? O por el contrario est constituda por una gran variedad de molculas? Lpidos de un alimento: tpicamente encontraremos mono-, di- i tri-glicridos, cidos grasos libres, fosfolpidos, esteroles, carotenoides y vitaminas A y D (liposolubles) Incluso considerando que los acil-gliceroles son ms del 90% de los lpidos, los cidos grasos pueden ser muy variados (longitud, insaturacin,...) Inters de la caracterizacin de los lpidos Procesamiento de los alimentos Calidad de los mismos Adulteracin Oxidacin

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DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS.

cidos grasos saturados: Mirstico (C14:0), Palmtico (C16:0), Esterico (C18:0), Lignocrico (C24:0). Slidos (grasa), con punto de fusin elevado. cidos grasos insaturados: Dobles o Triples enlaces. Nunca conjugados. Siempre cis. Lquidos (aceites), con punto de fusin bajo. Oleico (C18:19), Linoleico (C18:29,12), Linolnico (C18:39,12,15), Araquidnico (C20:45,8,11,14) cidos grasos poliinsaturados, no pueden ser sintetizados por el hombre, se conocen como cidos grasos esenciales (un tipo de ellos son los omega-3). Derivados hidroxilados: ricinoleico (12-OH C18:19) Derivados con triple enllace

DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS

PPP

OOO

LaPS

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DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Preparacin de las muestras Secado Extraccin Determinacin de componentes o fracciones: Extraccin en contracorriente Cromatografia lquida (fracciones lipdicas) GC (cidos grasos libres o tras saponificacin)

Caracterizacin qumica Impurezas Grado de insaturacin Saponificacin cidez

DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Determinacin de componentes o fracciones. Cromatografia lquida (fracciones lipdicas) Se basa en la utilizacin de la slica como fase estacionaria y distintos eluyentes de diferente polaridad Aplicacin prctica En columna TLC (muy importante en anlisis cualitativo de lpidos) Cromatografia en columna Lpidos neutros o apolares son eluidos normalmente con hexano o cloroformo, pudiendose separar y recuperar de forma adecuada Los lpidos polares se eluyen con acetato de etilo o metanol, y en algunos casos pueden producirse adsorciones irreversibles Separaciones multicolumna para poder reducir la complejidad de las fracciones inicialmente obtenidas por slica (p.ej., Florisil, almina,) Anlisis de las fracciones mediante cromatografa lquida en fase reversa acoplada a espectrometra de masas en tandem (LC-APCI-MS/MS)

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DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS. FRACCIONAMIENTO EN LC

Tejido Homogenizar con cloroformo/metanol/agua metanol/agua

Fase Normal

cloroformo

Hexano

apolares

DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS. FRACCIONAMIENTO EN LC

Tejido Homogenizar con cloroformo/metanol/agua metanol/agua

Fase Normal

cloroformo

AcOEt

apolares

polares

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DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS. FRACCIONAMIENTO EN LC

Tejido Homogenizar con cloroformo/metanol/agua metanol/agua

Fase Normal

cloroformo

MeOH

apolares

polares

inicos

DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Cromatografa Lquida-Espectrometra de Masas (LC-APCI-MS/MS)

Manteca de Coco Fraccin TGs

12C

POO y PLS coeluyen, y adems son isbaros

13C

MS/MS Hijos m/z 881.8

-2 Da Insaturacin cido olico

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DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS

LC: TGs

directos Determinacin de componentes o fracciones: GC (cidos grasos libres o hidrolizar los glicridos para liberarlos) Es necesaria adems la derivacin de los cidos grasos para aumentar su volatilidad, lo ms habitual es formar steres metilados

Saponificacin

SSS

DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS

C14

C16

C18

C18:1

C18:2

C18:3

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DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Caracterizacin qumica Se trata de una caracterizacin ms burda que la cromatogrfica ya que slo aporta valores de propiedades Impurezas Insaturacin Acidez (cidos grasos libres) Saponificacin

En el proceso de refinado de los aceites se elimina la mayoria de las impurezas.

DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Caracterizacin qumica. Impurezas Impurezas ms habituales : Humedad (agua), Materia insoluble, Materia insaponificable, Metales MIU (moisture, insoluble, unsaponificable): componentes no lipdicos de las grasas y aceites, componentes no deseables Materia insoluble: Restos del material de partida para obtener la grasa o el aceite Qualquier otra sustancia insoluble en los disolventes orgnicos Materia insaponificable: material que no se puede saponificar con KOH (no son steres): Esterols Alcoholes de elevado peso molecular Hidrocarburos

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DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Caracterizacin qumica. Insaturacin Determinacin importante y habitual Gran importancia: Clasificacin de la materia grasa comercialmente Control de procesos de produccin (hidrogenacin para hacer margarina) El parmetro ms utilizado y aceptado es el valor de iodo (o nmero de iodo): adicin de los halgenos a los dobles enlaces C=C Fundamento es la adicin de iodo a una cantidad pesada de muestra y determinar la cantidad de iodo que ha reaccionado Uno de los procedimientos ms aceptado es el presentado por Wijs (1898) El clculo del ndice de iodo (iv): Gramos I2/100g muestra

IV = B = volumen de valorante utilizado en el blanc (mL) massa de mostra S = volumen de valorante utilizado en la muestra (mL) N = normalidad del tiosulfato patrn (B-S)N son meq I2, por Peq (126.92) son mg I2, por 10-3 son g I2 y por 100 g muestra.

( B S )N 12.692

DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Caracterizacin qumica, Insaturacin

Mtode de Wijs

Para un aceite o grasa puro se puede calcular el nmero de dobles enlaces si se tiene el valor de iodo y el peso molecular del TG:
n.doblesenllaos = IV pesmolecular 126.92 100

0.1-3.0 grams de mostra en 15 ml CCl4

+25 ml disol. Wijs (9g ICl3 en HAc/CCl4 7:3)

El ndice de iodo conduce a resultados poco adecuados cuando hay dobles enlaces conjugados. Dos dobles enlaces conjugados consumen la mitad de yodo Utilizar otros procedimientos: valor de hidrgeno (cantidad de hidrgeno consumida en la hidrogenacin total de los dobles enlaces).

reposo 20 C 1 hora*

+20 ml KI 10% +150 ml H2O

Valorar amb tiosulfat patr indicador mid**

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DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN DE LOS LPIDOS Caracterizacin qumica. Saponificacin

Medida de la cantidad de disolucin alcalina que es necesaria para saponificar una cantitdad definida de grasa Miligramos de KOH necesarios para saponificar 1 g de grasa i neutralizar los cidos grasos tanto los que se encontraban en forma libre como los liberados de los glicridos Tratamiento de muestra reflujo sobre 4 g de muestra con 50 ml de disolucin 0.5 N de KOH en etanol 96% durante 30 min valoracin del exceso de KOH con HCl 0.5 N (fenolftaleina)

Si queremos slo los cidos libres, tenemos que realizar una valoracin adicional de otra alcuota con KOH, pero sin reflujar. Podemos expresar el resultado como cantidad de KOH consumida por los cidos libres o en forma del cido graso ms importante en el alimento en cuestin (en aceite de oliva como oleico).

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