Seminario sobre la Bioluminiscencia

Realizado por: Manuel Pedro Jimnez Garca. DNI: 44651635X Profesor: Dr. Miguel ngel Medina. Asignatura: Bioqumica. Curso: 2B, Licenciatura Biologa (UMA).

Seminario Bioluminiscencia

Seminario sobre la Bioluminiscencia

ndice:

o Introduccin a la bioluminiscencia: Luminiscencia. Cromforo. Quimioluminiscencia.

Desde la pgina 3, hasta la pgina 5.

o Tipos de agentes quimioluminiscentes y bioluminiscentes.

Desde la pgina 5, hasta la pgina 10.

o Bioluminiscencia. Tipos de bioluminiscencia.

Desde la pgina 11, hasta la pgina 16.

o Bioluminiscencia: Procesos bioqumicos.

Desde la pgina 17, hasta la pgina 33.

o Origen de la bioluminiscencia. Funciones y distribucin en los seres vivos.

Desde la pgina 34, hasta la pgina 35.

o Protena GFP. Formacin del cromforo en GFP y derivados.

Desde la pgina 35, hasta la pgina 39.

o Aplicaciones biolgicas de la bioluminiscencia.

Desde la pgina 40, hasta la pgina 41.

o Premios nobeles de qumica 2008 (relacionados con la bioluminiscencia).

Desde la pgina 41, hasta la pgina 42.

o Bibliografa.
Desde la pgina 43, hasta final de pgina .

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ndice:
o o o o o o o o o Introduccin a la bioluminiscencia: Luminiscencia. Cromforo. Quimioluminiscencia. Tipos de agentes quimioluminiscentes y bioluminiscentes. Bioluminiscencia. Tipos de bioluminiscencia. Bioluminiscencia: Procesos bioqumicos. Origen de la bioluminiscencia. Funciones y distribucin en los seres vivos. Protena GFP. Formacin del cromforo en GFP y derivados. Aplicaciones biolgicas de la bioluminiscencia. Premios nbeles de qumica 2008 (relacionados con la bioluminiscencia). Bibliografa.

o Introduccin a la bioluminiscencia: Luminiscencia. Cromforo. Quimioluminiscencia.

Luminiscencia es toda luz cuyo origen no radica exclusivamente en las altas temperaturas, por el contrario, es una forma de "luz fra" en la que la emisin de radiacin lumnica es provocada en condiciones de temperatura ambiente o baja. Cuando un slido recibe energa procedente de una radiacin incidente, sta es absorbida por su estructura electrnica y posteriormente es de nuevo emitida cuando los electrones vuelven a su estado fundamental. En funcin de la radiacin que estimula esta emisin, tendremos los siguientes procesos luminiscentes: Cuando la excitacin se debe a radiaciones ionizantes: Fotoluminiscencia: es una luminiscencia en la que la energa activadora es de origen electromagntico (rayos ultravioletas, rayos X o rayos catdicos). Catodoluminiscencia: si el origen es un bombardeo con electrones acelerados. Radioluminiscencia: si el origen es una irradiacin con rayos , o (fue observada por primera vez por Pierre Curie y Marie Curie con el elemento radio.).

Cuando la excitacin se debe a otros factores: Quimioluminiscencia: la luminiscencia se genera mediante una reaccin qumica. Triboluminiscencia: generada por energa mecnica. Electroluminiscencia: producida por energa elctrica. Bioluminiscencia: se debe a energa biolgica producida por rutas metablicas. Sonoluminiscencia: relacionada con las ondas sonoras.

Un cromforo es la parte o conjunto de tomos de una molcula responsable de su color. Tambin se puede definir como una sustancia que tiene muchos electrones capaces de absorber energa o luz visible, y excitarse para as emitir diversos colores, dependiendo de las 3

Seminario Bioluminiscencia longitudes de onda de la energa emitida por el cambio de nivel energtico de los electrones, de estado excitado a estado basal. Cuando una molcula absorbe ciertas longitudes de onda de luz visible y transmite o refleja otras, la molcula tiene un color. Un cromforo es una regin molecular donde la diferencia de energa entre dos orbitales atmicos cae dentro del rango del espectro visible. La luz visible que incide en el cromforo puede tambin ser absorbida excitando un electrn a partir de su estado de reposo. En las molculas biolgicas tiles para capturar o detectar energa lumnica, el cromforo es la semimolcula que causa un cambio en la conformacin del conjunto al recibir luz. Los cromforos se presentan casi siempre en una de dos formas: sistemas conjugados o complejos metlicos. Sistemas conjugados : los niveles de energa que alcanzan los electrones son orbitales generados a partir de series de enlaces simples y dobles alternados, como sucede en los sistemas aromticos. Los ejemplos ms comunes son los colorantes retinianos, licopeno, -caroteno, y antocianinas. Los cromforos de complejos metlicos: surgen de la divisin de orbitales "d" al vincular metales de transicin con ligantes. Algunos ejemplos de estos cromforos se encuentran en la clorofila, usada por los vegetales para la fotosntesis, la hemoglobina, la hemocianina.

Una caracterstica comn en bioqumica son los cromforos formados por cuatro anillos de pirrol, que pueden ser de dos tipos:

Pirroles en cadena abierta, no metlica. Ejemplos: fitocromo, ficobilina, y bilirubina. Pirroles en anillo (porfirina), con un ion metlico: hemoglobina, clorofila.

La quimioluminiscencia tiene lugar cuando una molcula emite un fotn como resultado de una reaccin qumica en la cual uno de los productos intermedios o finales, es llevado a un estado excitado, y retorna a su estado fundamental emitiendo luz. El fenmeno de la quimioluminiscencia, se produce adiabticamente, o sea, sin prdida ni ganancia de energa en forma de calor. Se podra definir como la produccin qumica de luz. La mayora de las reacciones quimioluminiscentes son de tipo oxidativo, pues se necesita una gran cantidad de energa para producir un fotn (aproximadamente 200 kJ, segn la longitud de onda) y utiliza oxgeno (O2) o perxido de hidrgeno (H2O2) y un sustrato oxidable.

Trminos confusos La quimioluminiscencia se confunde con frecuencia con la fluorescencia, sin embargo, de lo explicado hasta ahora se desprende que existe una clara diferencia entre ambos procesos luminiscentes, que radica en la fuente de energa que lleva a la molcula a un estado de excitacin electrnica. 4

Seminario Bioluminiscencia Se ha de tener en cuenta que para la produccin de luz, los compuestos quimioluminiscentes son destruidos en el proceso, mientras que los fluorescentes no lo son, pudiendo repetirse la medida de su fluorescencia. Para diferenciar, a su vez, fluorescencia de fosforescencia, tenemos que tener en cuenta una unidad de tiempo determinada, as pues, la emisin de luz tiene lugar a un tiempo caracterstico () despus de la absorcin de la radiacin, y es este parmetro el que permite subdividir la luminiscencia en: Fluorescencia: Se restringe a la luminiscencia causada por rayos ultravioleta (ya sean U.V.A (onda corta), U.V.B (onda media), o U.V.C (extremos)). La fluorescencia se produce si < 0,00000001 segundos (10-8 segundos). Fosforescencia: Es una luminiscencia que perdura una vez cortada la excitacin, Si > 0,00000001 segundos (10-8 segundos).

Bioluminiscencia es el nombre que se da a una forma especial de quimioluminiscencia que se observa en los organismos vivos, en los que una enzima aumenta la eficiencia de la reaccin quimioluminiscente favoreciendo la oxidacin de un sustrato especfico. El fenmeno de la bioluminiscencia est ampliamente representado en la naturaleza y ya era conocido en la antigedad. El rendimiento cuntico de una reaccin quimioluminiscente es el cociente entre el nmero de fotones emitidos y el nmero de molculas que reaccionan. En las reacciones quimioluminiscentes, el rendimiento cuntico rara vez es mayor de 0.01; sin embargo, en las reacciones bioluminiscentes es mucho mayor, incluso se aproxima a la unidad.

o Tipos de agentes quimioluminiscentes y bioluminiscentes.

Factores quimioluminiscentes: Los sistemas quimioluminiscentes que se describen a continuacin tienen en comn que son detectores de perxido de hidrgeno. Luminol y sus derivados: el luminol (5-amino-2,3-dihidroftalazina) es una de las molculas quimioluminiscentes ms estudiadas. Qumicamente es una diacilhidracida cclica cuyas caractersticas luminiscentes dependen mucho de la posicin del grupo amino. Un desplazamiento en el grupo amino reduce la eficiencia cuntica. El isoluminol posee una dcima parte de la eficiencia cuntica del luminol. La eficiencia, la longitud de onda y el pH ptimo de emisin del luminol dependen mucho de las condiciones de reaccin. La reaccin del luminol y sus derivados en solucin acuosa precisan de un oxidante fuerte (H2O2, O2, CLO- o MnO4-). Para conseguir la mxima 5

Seminario Bioluminiscencia eficiencia es necesaria la ayuda de un catalizador o cooxidante (Cu+2, Fe(CN6)3- o el grupo hemo). Quiz el grupo hemo sea el catalizador ms eficaz, mientras que el mejor medio sera el tampn de carbonato. El pH ptimo vara con el catalizador u oxidante, pero para la mayora de sistemas oxidantes est cerca de 11. ster de acridinio: esta molcula presenta ventajas respecto al luminol debido a que la reaccin quimioluminiscente se produce con la simple presencia de perxido de hidrgeno en medio alcalino. La rapidez de la cintica de emisin del ster de acridinio, con un mximo a los 01 segundos, de la inyeccin del reactivo de oxidacin y un tiempo medio de descenso de la intensidad de la quimioluminiscencia producida de 11 segundos, permite obtener resultados reproducibles integrando la emisin slo entre 5 y 10 segundos por muestra. Este compuesto tiene cada vez mayor aplicacin en inmunoanlisis, pues cumple los requisistos necesarios para ser un buen marcador. Lucigenina: la lucigenina (nitrato de bis N-metilacridinio) emite luz cuando tiene lugar la reaccin de oxidacin por el perxido de hidrgeno en una solucin bsica y en presencia de iones metlicos catalizadores como el Pb2+. Gran parte de los estudios que se han realizado con esta molcula han sido en relacin con sus reacciones enzimticas, especialmente con la enzima xantina-oxidasa (EC 1.1.3.22) que tiene que ver en reacciones que implican a bases pricas. steres de oxalato: algunos diaril oxalatos como el bis(2,4,6-triclorofenil)oxalato emiten luz cuando son oxidados por perxido de hidrgeno. Un problema que presentan estos compuestos es su elevada susceptibilidad a ser hidrolizados. Sin embargo, el bis(2,4,6-triclorofenil)oxalato es uno de los ms estables y no presenta estos inconvenientes. El bis(2,4,6-triclorofenil)oxalato no es tan sensible como el luminol para la deteccin del perxido de hidrgeno. Otros sistemas quimioluminiscentes: se han descrito muchos otros sistemas quimioluminiscentes. Por ejemplo, la lofina es oxidada en condiciones alcalinas para dar luz amarilla y la siloxina se oxida en medio cido para producir una luz anaranjada, dependiendo del oxidante y del grado de oxidacin. Algunos fenoles polihdricos, como el pirogalol o el cido glico, tambin presentan caractersticas quimioluminiscentes.

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Factores bioluminiscentes: A pesar de que existe un elevado nmero de organismos bioluminiscentes, menos del 1% de las especies biolgicas con bioluminiscencia que se conocen se han estudiado con detalle, as pues: Photinus-luciferina-4-monooxigenasa (hidrolizante de ATP) (EC 1.13.12.7): es el sistema bioluminiscente ms estudiado. Se encuentra en la lucirnaga americana (Photinus pyralis), el ATP acta como cofactor de la enzima photinus-luciferina-4monooxigenasa, tambin conocida como luciferasa, que requiere adems Mg2+, oxgeno molecular, y de su sustrato, luciferina. La reaccin tiene lugar en condiciones ptimas a 25C y con pH=7.8. Los cambios en el pH, fuerza inica y temperatura pueden alterar la potencia radiante y la longitud de onda de la emisin de luz.

Luciferasa presente en la lucirnaga Photinus pyralis

Seminario Bioluminiscencia Luciferina de lucirnaga luciferina de la lucirnaga Photinus pyralis es un cido lucirnaga: orgnico poliheterocclico, cuya frmula molecular es 2 hidroxibenzotiazol-2-il)-22-(6-hidroxibenzotiazol tiazolina-4-cido carboxlico. Es el sustrato de la enzima luciferasa de lucir lucirnaga (explicada anteriormente).

Alcanal-monooxigenasa (unida a FMN) (EC 1.14.14.3) la mayora de los estudios sobre monooxigenasa 1.14.14.3): bacterias marinas bioluminiscentes se ha centrado en dos tipos: beneckea harveyi (Photobacterium fisheri) y Vibrio fisheri. In vitro, los componentes requeridos para la fisheri. produccin de luz son FMN (flavn mononucletido) reducido , un aldehdo aliftico de cadena larga, oxgeno y alcanal monooxigenasa (unida a FMN), tambin conocida alcanal-monooxigenasa como luciferasa bacteriana. Luciferina en s, no existe en bacterias, pero s utiliza al aldehdo aliftico como sustrato de la luciferasa bacteriana, y se necesita, para que se produzca la reaccin flavn mononucletido y oxgeno.

FMN (flavn mononucletido) Aequorina: el sistema bioluminiscente de las medusas del gnero Aequorea consiste en unos complejos cromforo protena denominados fotoprotenas que reaccionan de cromforo-protena forma especfica con el ion calcio (Ca+2) produciendo una reaccin luminosa ( longitud de onda mxima producida: 469 nm), independientemente del oxgeno disuelto. Por lo roducida: que, la interaccin de la aequorina con el ion calcio da lugar a una radiacin luminosa de color azul, que excita a la protena GFP, que al volver a su estado fundamental produce una radiacin de color verde.

Cromforo de Aequorina (luciferina) presente en las medusas del gnero Aequorea

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La protena GFP, presenta un grupo en el conjunto de su estructura (cromforo), que tiene la propiedad de producir radiacin lumnica de color verde, tras ser irradiado con luz azul. Por lo que, la radiacin azul producida por la fosfoprotena aequorina es redireccionada para ser transformada en radiacin verde a travs de la GFP:

Cromforo fluorescente (fluforo) de la protena GFP

Luciferina Latia: quimicamente es el compuesto (E)-2-metil-4-(2,6,6-trimetil-1-ciclohex1-il)-1-buten-1-ol. Este tipo de luciferina se encuentra en el grupo de moluscos gastepodos Latia neritoides. La enzima que cataliza esta luciferina se conoce como luciferina latia monooxigenasa, o simplemente luciferasa latia. (Casi todas las luciferasas son monooxigenasas).

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Colenterazina: se encuentra en algunos ctenforos, cnidarios, coppodos, : quetognatos, peces y algunos crustceos. Concretamente, es el grupo prosttico de la protena aequorina, responsable de la emisin de luz azul en algunas medusas ya que medusas, es el grupo prosttico de la aequorina y adems, acta de luciferina en los grupos aequorina, de animales citados con anterioridad, para producir bioluminiscencia.

Luciferina de dinoflagelados es un derivado de la clorofila, que se encuentra en dinoflagelados: , dinoflagelados e incluso en algunos tipos de krill. Presenta una estructura compleja. Asemeja a un tetrapirrol, con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados para formar un anillo mayor de porfirina, como en la clorofila, en cualquier caso es muy cualquier similar. Cabe aadir que no presenta tomo metlico central, ya que el nitrgeno de central, los cuatro pirroles se encuentra unido con un atomo de hidrgeno, haciendo imposible que se forme enlace de coordinacin bioinorgnica (con un tomo met metlico).

Vargulina (cipridina): compuesto que acta de luciferina en algunos ostrcodos, y : peces de la zona abisal. Tal y como l colenterazina, es una imidazo-piridazinona, por la piridazinona, lo que emite luz de color azul en los animales citados.

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o Bioluminiscencia. Tipos de bioluminiscencia.

Se conoce como bioluminiscencia a la produccin de luz de ciertos organismos vivos a travs de diferentes mecanismos biomoleculares, que siguen rutas metablicas especficas. Es un fenmeno muy extendido en todos los niveles biolgicos: bacterias, hongos, protistas unicelulares, celentreos, gusanos, moluscos, cefalpodos, crustceos, insectos, equinodermos, peces, etc.

Tipos de bioluminiscencia
Puede hablarse de tres tipos principales de bioluminiscencia: la intracelular, la extracelular y la de bacterias simbiticas.

Bioluminiscencia debida a procesos intracelulares: La bioluminiscencia intracelular es generada por clulas especializadas del propio cuerpo de algunas especies pluricelulares o unicelulares(como dinoflagelados) y cuya luz se emite al exterior a travs de la piel o se intensifica mediante lentes y materiales reflectantes como los fotforos, como pueden ser: cristales de urato de las lucirnagas o las placas de guanina de ciertos peces. Este tipo de luminiscencia es propia de muchas especies de calamar y de dinoflagelados, en especial del gnero Protoperidinium.

Pyrodinium bahamense (causantes de las mareas rojas).

Los dinoflagelados son generalmente responsables de la luminosidad difusa de la superficie del mar. Este efecto solo se puede observar de noche, especialmente si el agua se agita o se rompe por una ola.

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Cristales de urato en las lucirnagas:

Estos complejos rganos fotforos de invertebrados se componen de los siguientes aparatos: CY: cilindros. DZ: zona diferenciada. MI: mitocondria N: nervios. NE: nervatura final. PC: fotocitos. RO: roseta (unidad). T: traquea (de invertebrados). TEO: trquea de final de rgano. Tr: traqueolas. Se produce las reacciones bioqumicas que dan lugar a la bioluminiscencia en la lucirnaga, en los fotocitos. Es decir, en estas clulas se encuentran las enzimas y sustratos necesarios para que tengan lugar las reacciones bioluminiscentes.

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Seminario Bioluminiscencia Bioluminiscencia debida a secreciones extracelulares: La bioluminiscencia extracelular se da a partir de la reaccin entre la luciferina y la luciferasa fuera del organismo. Una vez sintetizados, ambos componentes se almacenan en glndulas diferentes en la piel o bajo sta. La expulsin y consecuente mezcla de ambos reactivos en el exterior producen nubes luminosas. Este tipo de luminiscencia es comn a bastantes crustceos y algunos cefalpodos abisales.

Imagen de luminiscencia azul de un ostrcodo del gnero Cypridina

Pholas dactylus, ostrcodo, que realiza bioluminiscencia extracelular, a travs de clulas fotognicas.

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Simbiosis con bacterias luminiscentes: Este fenmeno se conoce slo en animales marinos tales como los celentreos, gusanos, moluscos, equinodermos y peces. Es el fenmeno de luminiscencia de origen biolgico ms extendido en el reino animal. En diversos lugares del cuerpo los animales disponen de pequeas vejigas, comnmente llamadas fotforos, donde guardan bacterias luminiscentes. Algunas especies producen luz continua cuya intensidad puede ser neutralizada o modulada mediante diversas estructuras especializadas. Normalmente los rganos luminosos estn conectados al sistema nervioso, lo que permite al animal controlar la emisin lumnica a voluntad.

Pez abisal. Bioluminiscencia por simbiosis con bacterias que viven en el extremo de la antena frontal.

Fotforos:
En muchas especies marinas de crustceos, cefalpodos y peces existen fotforos muy especializados para la produccin de la luz, de complejidad variada, constituidos por capas reflectantes, lentes, pantallas pigmentadas asociadas con las clulas fotgenas. Estos rganos estn particularmente desarrollados, sobre todo en las especies que viven a gran profundidad. Si tomamos todos los fotforos de un cefalpodo, se observa que de una estructura relativamente sencilla se pasa a estructuras muy complejas. Un tipo muy sencillo de fotforo es el de un grupo de sepias o de peces; consiste en una masa de clulas fotgenas que se apoyan sobre una capa de clulas alargadas y paralelas transparentes que forman una especie de cristalino, mientras que en la posicin opuesta las clulas se encuentran situadas de manera que forman tres capas concntricas: una capa interna de clulas fotgenas, una intermedia de clulas pigmentadas que acta como pantalla. La lente cristalina est recubierta por clulas epidrmicas transparentes que pueden contener pantallas coloreadas.

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Seminario Bioluminiscencia Las fibras nerviosas penetran a travs de la pared pigmentada del fotforo y se ramifican entre las clulas fotgenas, por lo que este proceso est controlado en todo momento por el organismo portador de estos fotforos.

Ontogenia de un fotforo en un organismo marino:

Bacteria: Vibrio fisheri [figuras 1 y 2] Organismo marino: calamar (Euprymna scolopes) [figuras 3, 4 y 5]

La relacin entre la bacteria Vibrio fischeri y el calamar sepilide Euprymna scolopes supone un sistema que sirve como modelo de simbiosis en el laboratorio. En su fase juvenil, Euprymna scolopes posee una serie de apndices recubiertos de mucosidad alrededor de su rgano luminoso con los que recoge bacterias Vibrio fischeri del entorno marino. sta mucosidad supone un medio ptimo para este tipo concreto de bacterias, de ah

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Seminario Bioluminiscencia que se desarrolle slo este tipo bacteriano, adems, el calamar sepiide vive en zonas donde abunda este tipo bacteriano. Cuando la cantidad bacteriana es suficiente, los apndices mueren al tiempo que el rgano luminoso madura en un proceso fisiolgico que se ha asociado con la aparicin de la citotoxina traqueal propia de este grupo de calamares (descubierto por Tanya Koropatnick, Universidad de Hawaii).

Figuras 1 y 2: bacterias Vibrio fisheri(1), cultivo de Vibrio fisheri a luz normal, y sin luz mostrando bioluminiscencia(2).

Figuras 3(primera a la izquierda), 4(segunda a la derecha) y 5(inferior):

Calamar Euprymna scolopes en cautividad (3) Calamar Euprymna scolopes emitiendo bioluminiscencia (4). Receptculos para Vibrio fisheri en el calamar Euprymna scolopes, se aprecia la bioluminiscencia que emiten las bacterias contenidas en los fotforos (5).

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o Bioluminiscencia: Procesos bioqumicos.

La produccin de bioluminiscencia en los animales es un proceso qumico complejo en el que la oxidacin de un sustrato de protena luciferina es catalizado por la enzima luciferasa. La luciferina acompaada de la enzima luciferasa, la molcula energtica ATP y el oxgeno generan la luz bioluminiscente. La combinacin entre la luciferina y el oxgeno provoca la oxidacin de la luciferina dando lugar a la oxiluciferina. Esta reaccin necesita del ATP para generar molculas de oxiluciferina en estado excitado. Posteriormente los tomos de oxiluciferina vuelven a su estado fundamental generando luz visible. Esta reaccin se producira en todos los casos sin la necesidad de la presencia de la luciferasa, sin embargo en el mundo animal la bioluminiscencia debe producirse en cuestin de segundos o incluso menos de un milisegundo, ya que en la mayora de casos se usa como sistema de defensa. Por esa razn se requiere la enzima luciferasa que hace que la reaccin sea mucho ms rpida. Resumen de pasos en la reaccin bioluminiscente: 1. 2. 3. 4. Luciferina reacciona con O2 en presencia de ATP. Enzima luciferasa interviene para acelerar la reaccin. Como producto se producen [oxiluciferina]* en estado excitado y otros compuestos. Oxiluciferina vuelve a su estado fundamental, liberando radiacin lumnica (h).

Por otro lado cabe destacar que la luciferina cambia segn el organismo. Mantiene su naturaleza proteica en la mayora de los casos, y es nicamente una regin determinada del pptido la que presenta la reaccin principal que da lugar a la bioluminiscencia, por lo que las luciferinas van desde residuos aromticos, alifticos, hasta compuestos derivados de la clorofila. La gran diversidad de luciferinas hace posible que el color de la luz que se produce en la bioluminiscencia sea diferente segn la especie. En todas las especies animales investigadas hasta hace poco tiempo, los colores se encontraban en la seccin visible del espectro y siempre va del verde al azul. Cuando se observaban otros colores se deban a la alteracin del tono original mediante rganos fotforos que actuaban como filtros o superficies reflectantes distorsionadoras. Sin embargo, recientemente se han descubierto especies como en la medusa abisal Periphylla periphylla (imgenes siguientes), que puede producir tonalidades rojizas.

La radiacin bioluminiscente se compone habitualmente de entre un 80% y un 90% de luz fra y entre un 10% y un 20% de emisin de calor, aunque hay ciertos estudios que hacen estimaciones cercanas al 100% de luz fra.

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Grupos de reacciones metablicas implicadas en la bioluminiscencia bioluminiscencia:

Segn los diferentes organismos, o lo que es lo mismo, los diferentes tipos de luciferinas y luciferasas: o En lucirnagas:

En lucirnagas, ocurre el proceso anteriormen explicado de manera genrica: anteriormente

Luciferina + ATP-Mg
2+

+ O2

oxiluciferina + CO2 + AMP + PPi + radiacin lumnica(h h)(max = 560 nm)

Vamos a desglosar un poco ms los pasos intermedios que ocurren a lo largo de todo el proceso enzimtico espontneo. Los pasos I y II son procesos regulados enzimticamente por la enzima luciferasa de lucirnaga. Los pasos siguientes III y IV, son espontneos en la produccin de bioluminiscencia y no estn bioluminiscencia, regulados enzimticamente.

As pues, en el paso I, se produce la unin de luciferina de lucirnaga con el ATP, , luciferina formndose lucifenil-adenilato y desprendindose una molcula de pirofosfato PPi La adenilato PPi. luciferasa ha invervenido en una actividad ligasa.

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Seminario Bioluminiscencia Cabe aadir, que el in magnesio interviene en la funcionalidad de la enzima luciferasa, por lo que su ausencia, imposibilitara la actividad enzimtica. Paso II: la lucifenil-adenilato se une qumicamente con O2, interviniendo la actividad oxigenasa de la luciferasa, produciendo un compuesto altamente inestable llamado peroxiluciferina y liberando AMP. Paso III: El compuesto peroxiluciferina se transforma rpidamente en [oxiluciferina]*, pero presentando un estado energtico excitado, y liberando, adems, CO2. Paso IV: La [oxiluciferina]* retorna a un estado energtico fundamental, liberando la energa sobrante para dicho proceso, en forma de radiacin lumnica con max = 560 nm.

La luciferasa de lucirnaga est compuesta por un polipptido de 550 residuos de aminocidos, de 60 kDa. Su conformacin tridimensional se modifica en presencia o ausencia de sustrato, as pues, durante la catlisis enzimtica, el dominio C-terminal puede aproximarse a la cavidad formada por el dominio N-terminal, donde los sustratos luciferina y ATP pueden acoplarse, formando el sitio activo y creando un ambiente ptimo para la produccin de luz. La luciferasa de los escarabajos y otros gusanos es muy similar a la de la lucirnaga. Estas luciferasas tienen polipptidos de entre 542546 residuos, que pueden compartir el 45% de identidad con el resto de luciferasas conocidas de las diferentes familias, y conservan el 99% de identidad en isozimas de la misma especie. Las diferencias en la composicin de algunos aminocidos en estas luciferasas hacen responsable los diferentes colores emitidos tras las reacciones bioluminiscentes. Estudios mutagnicos han identificado importantes regiones y residuos implicados directamente en los colores de la bioluminiscencia, sobretodo en luciferasas de escarabajos. Algunos de estos residuos importantes estn, de hecho, localizados en la zona activa de la enzima, y podra encontrarse dicha zona recubierta por aminocidos bsicos, o polares, que reaccionen con el emisor de luz (oxiluciferina). Esta enzima tiene su pico ptimo de funcionalidad a una temperatura ambiente aproximada de entre 15-25C, tiene un alto rango, debido a las posibles modificaciones que existen de esta enzima, adems, presenta mejor funcionalidad a pH ligeramente cidos.

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Otra forma de representar el proceso:

Imagen de una lucirnaga bioluminiscente, que sigue el proceso bioqumico explicado. Emite una luz amarillo-verdosa con una longitud de onda de 590 nm.

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En bacterias:

Para comenzar, hay que aclarar que en bacterias no existe luciferina en s, sino aldehdo de cadena larga en presencia obligatoria de FMN (flavn mononucletido) y O2. A estos dos compuestos se les podran considerar anlogos a la luciferina que utilizan los organi organismos eucariotas pluricelulares. Estas bacterias tan solo producen luz cuando las densidades poblacionales son elevadas y eso es debido a que hay una regulacin positiva sobre la transcripcin de los genes que participan en dicha emisin de luz. En concreto, la reaccin que ocurre es la siguiente: FMNH2 + O2 + RCHO (de cadena larga) de FMN + H2O + RCOOH + h(max = 490 nm) (max

Esta reaccin est catalizada por un enzima que recibe el nombre de luciferasa bacteriana y que como se observa, utiliza poder reductor en forma de flavn mononucletido reducido poder (FMNH2) y oxgeno para transformar un radical aldehdo (R (RCHO ) de cadena larga, en un radical cido (RCOOH), adems de dar agua y flavn mononucletido oxidado (FMN). COOH), La energa que se libera durante la oxidacin del aldehdo al cido, se realiza en forma de luz y no de calor como hemos explicado en la reaccin genrica genrica. Para que la bacteria ponga en marcha dicha reacci hay dos requerimientos claves ara reaccin claves: La presencia del oxgeno La presencia de una elevada densidad bacteriana. encia

El modo mediante el cual las bacterias captan la elevada o baja densidad celular es el siguiente: Todas producen una sustancia en pequeas cantid cantidades, una acetil-homoserina -lactona que homoserina acta como autoinductor. Todos los genes que intervienen en la reaccin anterior estn situados en un gen policistrnico bajo el control de un mismo opern, el opern LUX LUX. Este opern es activado por una protena reguladora positiva que se une al operador activando la operador, transcripcin cuando se une dicha protena reguladora positiva al inductor. El inductor slo se une cuando alcanza ciertos niveles de concentracin, de esta manera, las bacterias detectan una elevada densidad poblacional, ya que a bajas densidades no se alcanza la concentracin especfica de nsidades autoinductor y, por tanto, no se transcribe el opern. Si la concentracin es suficiente se transcriben todos los suficiente,

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Seminario Bioluminiscencia genes necesarios para la reaccin, genes como: LUX I que da lugar al enzima que genera el inductor (por tanto se potencia an ms la induccin). Los genes LUX A y LUX B que darn lugar a las dos subunidades que constituyen la enzima luciferasa bacteriana. LUX C, D y E que se traducen en los enzimas de reciclado de los compuestos cidos que son producto de la reaccin, para proveer de nuevo sustrato disponible en forma de aldehdo. El gen LUX G, que codifica la FMN reductasa, encargada de reducir el FMN a partir de NADH + H+. Un tercer gen, ya fuera del opern es el gen LUX R que codifica la protena reguladora del opern y que se traduce de forma constitutiva.

Representacin de las diferentes zonas existentes en el DNA, para comprender el proceso explicado, aunque no se representan los genes LUX, sino LAC (otro tipo de genes).

La reaccin bioqumica que tiene lugar en las bacterias, realmente es ms compleja que en el resto de seres vivos que presentan luciferina, debido a la ausencia de una luciferina como tal. La alternativa reside en la utilizacin de FMNH2, O2, aldehdos de cadena larga, que suele ser el decanal (10C) o el miristal (14C), para dar lugar a cidos (cido decanoico o miristoico), FMN y agua, liberando energa lumnica. As pues, el proceso metablico que acontece, est intercalado con otras rutas metablicas existentes en la bacteria: Reaccin bioluminiscente ejemplo: Miristal (aldehdo de 14C) + FMNH2 + O2 Acido miristoico + FMN + H2O + h (max = 490 nm)

Para establecer el ciclo completo, si partimos del aldehdo (miristal o miristil-aldehdo), se produce inicialmente la condensacin de FMNH2, O2, y el aldehdo, transformndose respectivamente en FMN y H2O. Dicha transformacin supone que en el compuesto aldehdico se haya producido tambin una modificacin qumica. 22

Seminario Bioluminiscencia Ese compuesto transformado es catalizado por la luciferasa, oxidndolo, produciendo cido miristoico. Que a travs de una serie de reacciones en las que intervienen inicialmente ATP, posteriormente una enzima sintetasa-reductasa, y finalmente el agente reductor NADPH, se produce de nuevo miristil-aldehdo o miristal. Cabe aadir, que existen rutas alternativas, para introducir acido miristoico en el medio, esto propiciara que el ciclo se activara, si la enzima sintetasa-reductasa se encuentra en condiciones ptimas para operar con mxima eficiencia, y si hay en el medio suficiente ATP y NADPH. Otra forma de representar las fases iniciales que hemos explicado:

En la imagen, se hace especial nfasis en la molcula emisora de radiacin lumnica. Ha de transformar su estado qumico excitado, en un estado fundamental, para liberal el exceso de energa, en forma de luz. NOTA: el cido miristoico presenta la siguiente frmula qumica:

En dinoflagelados:

La reaccin bioluminiscente que se produce es la siguiente: Luciferina de dinoflagelados + O2 oxiluciferina de dinoflagelados + H2O + h

En la descripcin del proceso fisiolgico, se establece que la membrana vacuolar (tonoplasto) se hiperpolariza, manteniendo un voltaje negativo con respecto al entorno, posteriormente, ese potencial favorece la salida de protones de unas vesculas externas del tonoplasto, en las que se encuentra la luciferasa de dinoflagelados. sto hace que disminuya el pH, con lo que la luciferina se activa, comenzando la reaccin que da lugar al fenmeno de bioluminiscencia en dinoflagelados. El desencadenante de este proceso puede ser el movimiento por una corriente o un descenso del pH o la temperatura en el entorno.

En cuanto al proceso bioqumico, la luciferina de dinoflagelados (derivado de la clorofila que es un tetrapirrol conteniendo cuatro grupos pentagonales donde hay un tomo de nitrgeno y cuatro de carbono), reacciona con el oxgeno molecular, a travs de la ayuda de la luciferasa, 23

Seminario Bioluminiscencia produciendo una oxiluciferina de dinoflagelados en estado excitado, que al pasar de dicho estado a uno menos energtico, fundamental o basal, emite una radiacin bioluminiscente de color azul-verdoso de 470 nm. Tambin se libera H2O como producto. En las siguientes dos imgenes se muestra el proceso, cabe aadir que en la primera de ellas, se muestra tambin el proceso de autooxidacin, estableciendo que la presencia de luciferasa no es esencial para que se d la reaccin, que slo interviene en la velocidad de la misma.

Dinoflagelados mostrando su bioluminiscencia de color azulado. Siguiendo el proceso anterior. Zonas costeras de: Noruega (imagen de la izquierda), y Letonia (imagen de la derecha), con una sombra verdosa bioluminiscente provocada por dinoflagelados que habitan en masa.

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En algunos grupos de medusas (Aequorina) (Aequorina):

Para comenzar a explicar la bioqumica producida en la bioluminiscencia por parte de la por aequorina, hay que establecer que el grupo prosttico de la misma, donde tiene lugar la reaccin bioqumica bioluminiscence es la colenterazina. La aequorina es una fotoprotena compuesta por dos unidades diferentes, la apoprotena apoaequorina (en la imagen las zonas rojas, amarillas y verdes) con un peso verdes), molecular aproximado de 22 kDa, y el grupo prottico o cromforo mencionado con anterioridad: colenterazina (la parte azul en la imagen). Por lo que, lo que se podra . considerar como luciferina en este caso sera omo nicamente la colenterazina, el resto es una unidad protica con funcin estructural. El mecanismo de accin bioluminiscente comienza con que los dos componentes de la aequorina, forman la protena completamente funcional. La protena porta tres EF EF-hand, que son unas zonas que funcionan como sitios de unin para el ion calcio ( 2+), por lo que se (Ca , unirn 3 Ca2+. Cuando los Ca2+ ocupan los sitios citados, la protena completa sufre un cambio conformacional y convierte, a travs de una oxidacin (requiriendo O2), su grupo prosttico de colenterazina, en colenteramida excitada, liberando CO2. El proceso est regulado por una enzima luciferasa especfica. Cuando la colenteramida pasa de su estado excitado a un estado basal, se desprende una radiacin lumnica azul con longitud de onda de 469 nm. Por lo que, la reaccin bioluminiscente sera: Aequorina (colenterazina) + 3Ca+2 + O2 oxiaequorina (colenteramida) + CO2 + h

Explicando el proceso de manera ms grfica tenemos las siguientes dos imgenes: grfica, La primera explica el proceso como si ocurriera de manera cclica, que realmente ocurre as, puesto que la colenteramida posteriormente se recicla para dar lugar de nuevo a colenterazina, y volver a repetir el proceso bioluminiscente cuando sea preciso , bioluminiscente preciso. 2+ Hace especial nfasis en la unin de los 3 Ca a los EF-Hand. Posteriormente se observa el Hand. proceso de oxidacin, la liberacin de dixido de carbono, y la produccin de raciacin lumnica debido al paso de un estado excitado de la colenteramida, a un estado excitado fundamental o basal de la misma. Por ltimo, la colenteramida se transforma en colenterazina, a travs de la adicin de un protn, y un cambio conformacional en un anillo aromtico. En la segunda imagen, se observa el proceso que acontece en el inicio, la colenterazina se , el une al oxgeno molecular, para producir colenteramida excitada a travs de la accin de una luciferasa con actividad oxigenasa.

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Seminario Bioluminiscencia

Imagen 1

Imagen 2

Como se explic con anterioridad en el apartado de factores bioluminiscentes, la aequorina produce radiacin lumnica azul, pero lo que realmente se observa en estas medusas, es una radiacin de color verde, debido a que la radiacin azul excita al cromforo de la protena verde fluorescente GFP, que al pasar del estado excitado al basal, emite luz verde. Se tratar a la protena verde fluorescente GFP en un apartado posterior.
Imagen de la izquierda medusa izquierda: Aequorea victoria produciendo luz. Imagen de la derecha fotforos derecha: productores de radiacin verde debido a la protena GFP. Se encuentra en el extremo, rodeando la umbrela de la medusa.

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Seminario Bioluminiscencia o En algunos organismos marinos (colenterazina):

La reaccin bioqumica que se produce es la siguiente: Colelenterazina + O2 coelenteramida + CO2 + h

El proceso explicado para la aequorina es completamente anlogo para los organismos que presentan nicamente el grupo cromforo de la aequorina, colenterazina. Pudiendo, si acaso, variar la composicin aminoacdica de la luciferasa, pero eso ocurre, incluso, entre organismos del a misma especie.

En algunos moluscos (luciferina-latia):

La bioluminiscencia producida por organismos con luciferina-latia presenta bastantes similitudes con la produccin de bioluminiscencia por parte de bacterias, ya que la luciferina en s es un aldehdo, y la luciferasa guarda gran parecido molecular. La luciferina-latia-monooxigenasa (EC 1.14.99.21) es una enzima que cataliza la reaccin bioqumica productora de luz, que tiene lugar en numerosos organismos marinos: Luciferina-latia + XH2 + 2 O2 oxiluciferina-latia + CO2 + HCOOH (cido frmico) + X + H2O + h

Los sustratos de esta enzima son la luciferina-latia (aldehdo), un compuesto de la forma XH2 y O2, que tras reaccionar con la luciferina-latia monooxigenasa, se transforman en seis productos: oxiluciferina-latia, CO2, cido frmico, X, H2O, y por supuesto, en el momento de bajar de estado excitado a fundamental en la oxiluciferina-latia, se produce una emisin de radiacin lumnica (h).

La enzima luciferina-latia-monooxigenasa pertenece a la familia de enzimas oxidorreductasas, como el resto de luciferasas. Dependen de O2, y de energa en forma de ATP para producir el estado excitado de la oxiluciferina. En concreto, sta enzima luciferina-latia-monooxigenasa

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Seminario Bioluminiscencia presenta como coenzimas a dos compuestos: FAD y una flavoprotena que se conoce como protena prpura.
Imagen de un molusco bioluminiscente, que utiliza el sistema luciferina-latia y luciferina-latia-monooxigenasa.

En algunos grupos de hongos:

En la bioluminiscencia de hongos, se encuentran descritas species como Armillaria, Mycena, Plerotus, Panellus, etc. Estos hongos se encuentran entre la hojarasca abundante de bosques hmedos tropicales, con temperatura por lo general, altas. La radiacin emitida por los hongos generalmente es de color verde, y se emite por la zona del micelio principalmente. La funcin biolgica de la bioluminicencia en este grupo no est clara, pero se cree se realiza para la atraccin de determinados insectos que propicien la dispersin de las esporas de los hongos, de todas formas se tratar la funcin biolgica de la bioluminiscencia en un apartado posterior. La bioqumica bioluminiscente que se produce en un hongo es la siguiente: Luciferina fngica (L) + NADH + H+ LH2 + NAD+; LH2 + O2 LO + H2O + h

Se muestran los compuestos lampteroflavina y panal. Que forman parte del modelo bioluminiscente de hongos an no descrito con detalle. En las reaccines del recuadro, L representa a la forma oxidada de la luciferina, y LH2 representa a la forma reducida de la luciferina. Abajo se encuentran imgenes in vivo de la bioluminiscencia de hongos.

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Realmente la bioqumica de la bioluminiscencia en hongos no est muy estudiada, incluso ninguna luciferasa fue aislada an, por lo que no se conoce la existencia de la misma en hongos. Se deduce que tienen un sistema productor de bioluminiscencia parecido al que utilizan las bacterias. Utilizan lampteroflavina, que es un derivado del FMN, que tambin participa en la emisin de luz, pero que an no se conoce exactamente su papel en la bioqumica bioluminiscente del hongo. Tambin utiliza NADH dependiende de enzimas reductasas, y se encuentra generalmente asociado a la posible luciferina fngica. Posteriormente, se descubri un precursor de trpenos llamado panal, que fue aislado del hongo Panus stipticus. La quimioluminiscencia de este compuesto y los anlogos a l, podra ser suficiente para explicar la bioluminiscencia, sin embargo, en publicaciones recientes se descarta al compuesto panal como una posible luciferina, y proponen que el sistema bioluminiscente ha de estar regulado por una luciferasa. Por lo que, la nica conclusin es que todo se basa en hiptesis de que existe una luciferasa y una luciferina, pero an no se han conseguido aislar.

En organismos marinos como algunos ostrcodos:

Algunos ostracodos marinos, e incluso crustrceos, utilizan el compuesto vargula (tambin llamado cipridina), para producir bioluminiscencia, segn esta reaccin bioqumica: Luciferina-vargula + O2 oxiluciferina-vargula + CO2 + h

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Seminario Bioluminiscencia La bioluminiscencia se produce como resultado de la reaccin enzima-sustrato, en la cual el sustrato es la vargulina (o luciferina-vargula) o luciferina-cipridina, y la enzima es la vargulaluciferasa, que oxida al compuesto vargula, con la adicin de O2, produciendo un intermediario llamado dioxoetanona, que rpidamente debido a su inestabilidad pasa a oxiluciferina-vargula en un estado excitado, que al pasar al estado basal, emite una radiacin lumnica azul con longitud de onda de 460 nm. Tambin se libera como producto CO2. La enzima vargula-luciferasa est compuesta por 555 aminocidos en una nica cadena polipeptdica, en la cual una vez plegada, encontramos dos zonas activas en donde se unirn los sustratos. Concretamente entre los residuos 186-188 y entre los residuos 408-410. La enzima vargula-luciferasa es extremadamente especfica por su sustrato, y opera con un ptimo de actividad enzimtica a pH=7.2 Cabe aadir, que la luciferasa es inhibida por EDTA (agente quelante de iones bivalentes), lo cual indica que esta enzima podra presentar dependencia de iones Ca+2. El uso de esta enzima va enfocado al estudio del desarrollo ontognico de clulas madre en humanos, y adems, tambin se utiliza para el estudio de ritmos circadianos.

Ostracodos del gnero Cypridina, emitiendo luz bioluminiscente azul.

En algunos artrpodos terrestres:

En la bioluminiscencia de gusanos de tierra (algunos anlidos), y algunos artrpodos, interviene una luciferina llamada luciferina-diplocardia, cuya frmula molecular sistemtica es 3-(isovalerilamino)propanal, que reacciona en presencia de H2O2 , y diplocardia-luciferasa, produciendo un compuesto oxidado y excitado de luciferina-diplocardia, oxiluciferinadiplocardia, y liberando H2O. Posteriormente, la oxiluciferina-diplocardia pasa del estado excitado a un estado basal, liberando una radiacin lumnica de color azul-verdoso. Proceso bioqumico: Luciferina-Diplocardia + H2O2 oxiluciferina-diplocardia + H2O + h

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Estudios relacionados con la enzima diplocardia-luciferasa establecen que presenta 300 kDa, es asimtrica, y est formada por mltiples subunidades. Adems, haciendo un estudio acerca de los residuos que la componen, se establece que el 5.8% de los aminocidos que la forman son derivados de la prolina, hidroxiprolinas. El hecho de que la luciferasa necesite perxido de hidrgeno en vez de oxgeno molecular, como en otras reacciones ya explicadas, suscita que esta enzima acta como mltiples reacciones quimioluminiscentes, donde se consigue mayor reactividad y eficiencia con perxido de hidrgeno que con oxgeno molecular, debido a que en este tipo de reacciones no intervienen enzimas.
En este grfico se muestra el espectro de diferentes bioluminiscencias emitidas por insectos (artrpodos), que van desde colores azules, pasando por verdes, amarillos, e incluso rojos. En la imagen de abajo, aparecen gusanos oligoquetos (anlidos) y en la de ms abajo anlidos poliquetos, emitiendo bioluminiscencia azul a travs del mecanismo bioqumico explicado.

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o Reacciones implicadas en la regeneracin de la luciferina (de lucirnagas):

La regeneracin de la luciferina cierra el ciclo propuesto al comienzo de explicar la bioqumica bioluminiscente. La regeneracin desde el producto en la reaccin bioqumica de la bioluminiscencia, oxiluciferina, fue encontrada en un extracto de Photinus pyralis (lucirnaga). La protena regeneradora de luciferina (LRE), tras ser purificada se estableci que presentaba una masa molecular de 38 kDa, y que su funcin era la de convertir la oxiluciferina en 2-ciano-6hidroxibenzotiazol y cido tiogliclico. En presencia de 2-ciano-6-hidroxibenzotiazol, era transformado de nuevo en luciferina. Las mismas actividades se detectaron en extractos de otras especies de lucirnagas, por lo que la reaccin era global en cuanto a ese grupo de organismos. Hay ciertas diferencias entre la LRE de otras lucirnagas, pues algunas presentaban 33.6 kDa y 308 aminocidos, pero en general, cumplan la misma funcin. Cabe aadir que la oxiluciferina, que es el producto de la reaccin bioqumica en la produccin de bioluminiscencia, es un potente inhibidor de la enzima luciferasa. Compite por el sitio activo con la luciferina. Proceso bioqumico:

Tras el experimento del Dr. Suzuki y Dr. Goto, que inyectaron [14C]oxiluciferina y 2-[14C]ciano6-hidroxibenzotiazol en una lucirnaga viva, y al cabo de unas horas detectaron niveles de [14C]luciferina. Concluyeron, con que el producto de la bioluminiscencia, oxiluciferina, era el sustrato de la protena regeneradora de luciferina LRE, en una serie de reacciones: 1. Transformacin de oxiluciferina en 2-ciano-6-hidroxibenzotiazol, a partir de la incorporacin de H2O, liberando cido tiogliclico. 32

Seminario Bioluminiscencia 2. Condensacin de 2-ciano ciano-6-hidroxibenzotiazol con D-cisteina, para dar lugar a la , luciferina de lucirnaga liberando NH3 como producto adicional. lucirnaga, Este paso puede ocurrir sin intervencin enzimtica. Sugieren, adems, que en el primer paso tampoco interviene ninguna enzima, debido a que 2 2ciano-6-hidroxibenzotiazol se produce a partir de oxiluciferina en condiciones aisladas, sin hidroxibenzotiazol realizar el extracto de la lucirnaga, es decir, se realiza in vitro nicamente depositando oxiluciferina y dejando incubar unas horas. ar Por lo que, la regeneracin de luciferina a partir de oxiluciferina sin accin enzimtica podra tener lugar, pero esta reaccin result muy lenta sin regulacin enzimtica. gar, resulta

Proceso ms detallado:

En el recuadro se observa la reaccin bioluminiscente, fuera de l, se observan los procesos por los cuales se procede a la regeneracin de la luciferina. Leyenda: - TGA: cidos tiogliclicos - 2C6HB: 2-ciano-6-hidroxibenzotiazol. hidroxibenzotiazol. - L: luciferina.

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o Origen de la bioluminiscencia. Funciones y distribucin en los seres vivos.

El origen de la bioluminiscencia est sujeto a conjeturas: William McElroy y Howard Seliger, de la Universidad Johns Hopkins en Baltimore, postulan una hiptesis sobre el origen de la luminiscencia bacteriana y por tanto, la del resto de seres vivos, se basa en los primeros cuartos de la historia biolgica terrquea, debido a que en estas etapas las formas de vida predominantes eran bacterias anaerobias, que tras la llegada de las cianobacterias se produjo la alteracin del medio, ya que liberaban como producto de su metabolismo fotosinttico, grandes cantidades de O2. Producto txico para las bacterias anaerbicas estrictas, por lo que, con el propsito de librarse de la toxicidad del oxgeno molecular, dichas bacterias sufrieron, con el paso del tiempo, adaptaciones metablicas de entre las cuales, los fenmenos de bioluminiscencia de ciertas bacterias actuales seran los vestigios que quedan de aquel entonces. Respecto a las funciones de la bioluminiscencia para el organismo, an se discrepa bastante sobre su utilidad o si es un resultado adaptativo. Casos: Como forma de identificacin entre una especie, como en el caso de la lucirnaga, ya que la hembra emite destellos para atraer al macho, ste nota la presencia de una hembra y va a su encuentro para el posterior apareamiento. En el caso de un poliqueto Odontosyllis las hembras suben a la superficie del mar, en la puesta de sol, generando luz para as atraer al macho, que sube a su encuentro generando luz intermitente en forma de crculos luminosos, pero si la hembra deja de emitir luz continua, el macho perder la orientacin y no podrn iniciar el acto reproductivo hasta que la hembra emita de nuevo luz. Como mecanismo de defensa, otras especies emiten una nube luminiscente, que es una caracterstica de cefalpodos y determinados crustceos (como el de la imagen). Con esa nube consiguen ahuyentar a los depredadores. En animales abisales, que poseen ojos extremadamente desarrollados, puede servir para iluminar el ambiente y estar en relacin con la posibilidad de que estos animales distingan la luz reflejada sobre la superficie de diferentes organismos con el fin de conseguir alimento. Esto parecera confirmado debido a la coloracin oscura y mate que presentan los peces abisales, para reducir al mnimo los reflejos lumnicos. En cuanto a la distribucin en los seres vivos: En hbitats marinos, la bioluminiscencia es un fenmeno relativamente frecuente, ya que hasta un 90% de los seres vivos que habitan en la porcin media y abisal de los mares podran ser capaces de producir luz de un modo u otro. En el mar existen bacterias libres como Bacterium phosphorescens o la especie del mar Bltico, Vibrium balticum. Otras muchas bacterias bioluminiscentes viven como parsitos o en simbiosis con otros animales. 34

Seminario Bioluminiscencia Como curiosidad, el 25 de enero de 2005, fue fotografiada por primera vez, a travs de un satlite de la NASA una extensa zona bioluminiscente en el ocano ndico, confirmando la existencia del Mar de Ardora.

Este fenmeno era avistado desde la antigedad por numerosos marinos, e incluso lo relat Julio Verne en su obra 20.000 Leguas de viaje submarino. Se crea que eran fantasas de marineros, pero cientficos empezaron a registrar este fenmeno desde 1915. En hbitats terrestres la bioluminiscencia no es tan comn, pese a presentarla numerosas especies de artrpodos. Cabe aadir, que la luz emitida por el pescado o la carne en descomposicin se debe a bacterias, mientras que la de la madera muerta se debe tanto a bacterias como a los micelios de ciertos hongos.

o Protena GFP. Formacin del cromforo en GFP y derivados.

La protena verde fluorescente (GFP) es una protena compuesta por 238 aminocidos, de 26.9 kDa (es una protena pequea), que presenta fluorescencia de color verde brillante cuando se expone a la radiacin de luz azul. GFP se aisl por primera vez de la medusa Aequorea victoria. La protena GFP de la A.Victoria tiene un pico de excitacin importante en una longitud de onda de 395 nm y uno menor a 475 nm. Su pico de emisin es de 509 nm, que se encuentra en la parte inferior verde del espectro visible. Martin Chalfie, Osamu Shimomura y Roger Y. Tsien fueron galardonados con el premio Nobel en qumica el 10 de octubre de 2008 por el descubrimiento y desarrollo de la protena verde fluorescente (GFP). En cuanto a su estructura, GFP Tiene la tpica estructura de barril beta, compuesta por 11 lminas- (color verde en la imagen) y 4 hlices- (color rojo) que contienen el cromforo, que atraviesa el centro. En la zona interna, las cadenas laterales del barril inducen una serie de 35

Seminario Bioluminiscencia reacciones de ciclacin especficas, en los residuos que forman el tripptido de Ser65 -Tyr66 Gly67 que conducen a la formacin del cromforo.

Este proceso de modificacin postraduccional se conoce como maduracin proteica. La red de enlaces de hidrgeno e interacciones electrostticas, producen la compilacin relativa de las cadenas laterales, influyendo en el color de la GFP, ya que presenta numerosos derivados. Cabe aadir, que la compactacin que confiere la estructura en forma de barril, excluye a las molculas de disolvente, por lo que la proteccin del cromforo est asegurada.

Formacin del cromforo (fluforo) de GFP y dos derivados de ella. DsRED y ZsYellow: La formacin autocataltica del fluforo (tambin llamado cromforo), ocurre tras una serie de procesos que no requieren accin enzimtica, sino que es la propia protena la que lo regula. Ocurren una serie de reacciones despus de la sntesis de la protena, para la maduracin del cromforo, que suelen ser inicialmente reaccines de ciclacin, y posteriores modificaciones del cromforo que varan dependiendo del tipo de protena. Dando lugar a un cromforo que emitir radiaciones lumnicas de diferente color, dependiendo del tipo de reacciones que se hayan producido en la formacin del cromforo. Formacin del cromforo de GFP: la maduracin proteica se produce a partir del tripptido de serina, tirosina y glicina, que se encuentran en las posiciones 65, 66, 67 respectivamente. Estas secuencias pueden variar, como por ejemplo en la posicin 65 una treonina, por serina, pero en general los procesos que se siguen son los siguientes: 1. Se parte del cromforo inmaduro tras la sntesis de la protena completa. 2. Se producen dos torsiones moleculares, reacciones isomricas de los diferentes grupos, para prepararse para ciclarse entre s. 3. Se produce la ciclacin, que unir los tres residuos entre s, formando un anillo. 4. Se produce tras la ciclacin, una deshidratacin, y a la par ocurre la formacin de un grupo imidazol. 5. Tiene lugar una reaccin de oxidacin, que tras la misma, el cromforo se vuelve completamente funcional emitiendo radiacin lumnica verde tras una excitacin del cromforo.

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Formacin del cromforo de DsRed: la protena roja fluorescente (DsRed) fue descubierta en los antozoos del gnero Discosoma durante una investigacin en arrecifes de coral, en la bsqueda de protenas fluorescentes de diferente color al verde. Aunque la proteina DsRed comparte aproximadamente el 26% de la secuencia aminoacdica de la protena GFP de la medusa Aequorea victoria, algunos aminocidos son modificados para constituir una estructura general tambin de barril-, y dando lugar a un cromforo similar en cuanto a estabilidad qumica. La proteina DsRed presenta una emisin superior en 75 nm a la protena GFP, es decir, presenta 583 nm. Para ello, tras la formacin de la protena completa, ha de producirse una maduracin de un tripptido de la misma (formado por glutamina, tirosina y glicina, que se encuentran en las posiciones 66, 67, 68 respectivamente), para que exista un cromforo y sea funcional. Las reacciones que tienen lugar son las siguientes: 1. Se parte del cromforo inmaduro, y se producen torsiones moleculares del tipo isomricas, para una posterior ciclacin. 2. Se produce una ciclacin y acto seguido tiene lugar una deshidratacin. 3. Posteriormente, se forma un grupo imidazol. 4. En un radical cercano al del grupo imidazol formado, se produce una oxidacin, dando lugar a un cromforo que emite luz verde, pero an inmaduro. 5. En la zona de la glutamina, se produce una reaccin isomrica geomtrica de tipo cis. 6. Tiene lugar una ltima oxidacin, para dar lugar al cromforo maduro que emite radiacin lumnica de color rojo.

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Seminario Bioluminiscencia Formacin del cromforo de la protena ZsYellow: la protena amarilla fluorescente (ZsYellow) fue descubierta en los antozoos de la especie Zoanthus. Aunque la protena ZsYellow comparte aproximadamente el 28% de la secuencia de aminocidos con la protena GFP de Aequorea victoria, existe una modificacin de residuos tal, que permiten conservar la estructura general en forma de barril-. Una de las caractersticas nicas de la protena ZsYellow es que su mximo en cuanto a longitud de onda emitida una vez el cromforo es funcional, es de 538 nm, que se encuentra entre los 508 emitidos por la GFP, y los 583 emitidos por la DsRed, permitiendo la posibilidad de realizar marcaje con este tipo de protenas, ya que emiten radiaciones de diferentes colores del espectro visible, y debido a que son protenas de bajo peso molecular. El conjunto de procesos que tienen lugar en la formacin del cromforo de la protena ZsYellow es anlogo a los anteriores, pues se parte de un tripptido del conjunto de la protena (formado por lisina, tirosina y glicina, que se encuentran en las posiciones 66, 67, 68 respectivamente), aunque hay notorias modificaciones, que se explicarn paso a paso: 1. Se parte del cromforo inmaduro tras la sntesis de la protena completa, pasando por reacciones isomricas que implican torsin molecular. 2. Se produce la ciclacin, unindose en un anillo los tripptidos. 3. Tiene lugar una deshidratacin y posteriormente la formacin de un grupo imidazol. 4. Como novedad, se produce un ataque nucleoflico, produciendo una escisin de una parte del esqueleto molecular de la zona de la lisina 66. 5. Por ltimo, tiene lugar una oxidacin, y el cromforo de la protena ZsYellow est completamente maduro emitiendo radiacin amarilla cuando es excitado.

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o Aplicaciones biolgicas de la bioluminiscencia.

Muchos sustratos o enzimas pueden ser medidos mediante reacciones bioluminiscentes, lo cual puede tener utilidad en mltiples disciplinas como en investigacin biolgica, en anlisis forenses, etc. Con la photinus-luciferina-4-monooxigenasa (hidrolizante de ATP) de la lucirnaga se pueden medir concentraciones de componentes que participen en reacciones en las que se produzca o consuma ATP (creatina-cinasa, glicerol, triglicrido, etc.). La medicin bioluminiscente de ATP como indicador de la presencia de clulas vivas, es la base de varios mtodos rpidos utilizados en microbiologa para detectar microorganismos en orina y medir su sensibilidad a los antibiticos. Asimismo, con los sistemas bioluminiscentes de las bacterias marinas se han desarrollado procedimientos de medida con una gran sensibilidad y especificidad metrolgicas para mltiples componentes de inters bioqumico. Por un lado, las que participan directamente en la propia reaccin (NADH, FMN, aldehdos, oxgeno, etc.) y, por otro, los sustratos o enzimas que participan en reacciones en las que se produce o consume alguno de los componentes de la reaccin bioluminiscente (deshidrogenasas, aminotransferasas, malato, oxalacetato, glucosa, amonio, etanol y otros). La especificidad de la bioluminiscencia de las medusas del gnero Aequorea por los iones calcio ha permitido utilizarla para la medicin de dicho ion intracelular. sto ha sido til para el estudio del ion calcio en fibras musculares estimuladas, mitocondrias y fibras nerviosas.

Uso de la protena GFP y derivados de la misma: La disponibilidad de la GFP y sus derivados ha redefinido por completo la microscopa de fluorescencia y la forma en que se utiliza en la biologa celular y otras disciplinas biolgicas. Esto ha provocado el desarrollo de sistemas altamente automatizados en vivo de microscopa de fluorescencia de clulas que pueden ser utilizados para observar las clulas en el tiempo que expresa una o ms protenas marcadas con protenas fluorescentes: GFP puede expresarse en diferentes estructuras que permitan la distincin morfolgica. En tales casos, el gen para la produccin de la GFP se empalma en el genoma del organismo en la regin del ADN que codifica la protena diana. El uso de GFP y sus derivados que emiten radiaciones de mltiples colores, ha redefinido la comprensin de muchos procesos biolgicos como el plegamiento de protenas, el transporte de protenas, y la dinmica de ARN, que en el pasado haban sido estudiados utilizando tejidos fijados (es decir el material muerto, no in vivo). GFP y sus derivados permite hacer estudios in vivo. Otro uso de gran alcance de la GFP es para expresar la protena en pequeos grupos de clulas especficas, como clulas cancergenas formando un tumor (imagen).

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Seminario Bioluminiscencia Una buena tcnica de marcaje se realiza combinando varias variantes de la GFP (que produzcan radiaciones lumnicas de diferentes colores), para el anlisis de los circuitos cerebrales (imgenes de abajo), los receptores de la membrana celular, la entrada de algn virus, etc.

Imagen 1 y 2: corte histolgico de un cerebro donde se observan las clulas nerviosas con sus respectivos axones y ramificaciones, en diferentes colores, ya que en cada tipo celular se ha introducido el gen de una variante de GFP. Imagen 3: se muestra una imagen realizada con el microscopio confocal, donde se muestran clulas nerviosas, axones, centros sinpticos, etc. Que se encuentran en diferentes planos.

o Premios nobeles qumica 2008 (relacionados con la bioluminiscencia)

Se otorgaron a los siguientes tres doctores:

Osamu Shimomura:
Fue la primera persona en aislar la protena GFP de las medusas del gnero Aequorea Victoria y el primero en averiguar que parte de la protena GFP desempeaba la funcin de la bioluminiscencia. Lo estudi a fondo, durante aos con la medusa Aequorea victoria, sobretodo.
La medusa Aequorea victoria vive en los mares de la costa oeste de Norteamrica (a). La medusa tiene un rgano bioluminiscente localizado a lo largo del borde de la umbrela (b y c)

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Martin Chalfie:

Chalfie quera usar la protena GFP como marcador, para que pudiera ser anclado a un gen promotor, que es una regin del DNA localizado delante de un gen codificador de una protena. Cuando las clulas necesitan sintetizar una protena especfica, se induce al promotor para que active al gen determinado. Chalfie quera conocer la secuencia gnica cuya traduccin diera lugar a la protena GFP, por ello esper a que un compaero suyo (Prasher) que investigaba sobre ello, le transmitiera los resultados, tras sto, Chalfie intent incluir este gen de la GFP en unos gusanos Caenorhabditis elegans y en E.coli, justo en medio del promotor de un determinado gen y el propio gen de una protena determinada, para as conseguir que la GFP se codificara junto con la protena determinada, y as estar ancladas para saber donde se encuentra dicha protena en todo momento en la clula, a travs de la emisin de radiaciones lumnicas de color verde, tras la aplicacin de radiacin azul. Realmente este trabajo lo realiz conjuntamente el equipo de Chalfie y el equipo de Prasher.
Chalfie coloc el gen de GFP detrs de un gen promotor activo en seis neuronas receptoras del tacto en C. elegans. Despus inyect el ADN modificado en las gnadas de un gusano adulto (a). El gusano es hermafrodita y se autofertiliza. El gen de la GFP est presente en muchos de los huevos que el gusano pone (b). El huevo se divide formando nuevos individuos cuyos receptores neuronales brillan con luz verde bajo la luz UV. (c y d). La ilustracin muestra dos de estas neuronas (e).

Roger Tsien:

Mientras Shimomura, Prasher (que fue el que descubri la secuencia gnica que codificaba para la protena GFP, y el que consigui, junto con Chalfie, que sta se pudiera anclar a otras protenas para el marcaje molecular en la clula) y Chalfie, estuvieron con el desarrollo de la protena GFP de la medusa Aequorea victoria, y mostraron que podra ser utilizada como trazador molecular, Roger Tsien estaba inmerso en el descubrimiento de nuevas protenas que emitieran radiaciones de diferente color al verde y al azul. As pues, quienes desarrollaron una serie de protenas derivadas de GFP o hbridas, que podran producir radiaciones lumnicas que cubrieran el espectro visible, fueron Roger Tsien y su equipo. Han desarrollado protenas mutadas que producen fluorescencia ms rpido incluso que la propia GFP.
Colonias de bacterias, en las que se han introducido diferentes genes de protenas creadas por Tsien.Demostrando, los diferentes colores en los que emiten radiacin lumnica.

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o Bibliografa:
Se compone en un 80% de pginas webs, publicaciones, trabajos y libros de texto completamente en ingls, y un 20% de contenido en espaol: Para la bioqumica general de cada proceso: http://mips.stanford.edu/public/abstracts/hastings.pdf http://en.wikipedia.org/wiki/Aequorin http://lasoledaddelcombate.blogspot.com/2008/05/bioluminiscencia-8-gonyaulaxpolihedra.html http://books.google.es/books?id=DNrTfH5PcWoC&pg=PA241&lpg=PA241&dq=diplocardi a+luciferin&source=bl&ots=bLUdKcbLY2&sig=ZURr5EQG8AnA5KYdh1bola9igv0&hl=es&ei =XQlBS4H0I4SqjAe8oqCtDQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=9&ved=0CD4Q6A EwCA#v=onepage&q=diplocardia%20luciferin&f=false http://www.photobiology.info/Viviani.html http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm http://en.wikipedia.org/wiki/Green_fluorescent_protein http://www.planetasapiens.com/?p=1587 http://www.jbc.org/content/276/39/36508.full

Libros de texto: David L. Nelson y Michael M. Cox. Lehninger Principios de Bioqumica. Quinta Edicin.

Lubert Stryer, Jeremy M. Berg y John L. Tymoczko. Bioqumica. Sexta Edicin. Revert.

Publicaciones y trabajos: Bioluminiscence, J. Woodland Hastings. Harvard University, Cambridge Massachusetts. March 2004.

Seminario Bioluminiscencia de Invertebrados. Nelson Sebastin Martnez Martnez. Universidad de Tarapaca de Arica. Facultad de ciencias. Departamento de biologa. Apuntes Luz. Cambios de color. Bioluminiscencia de la asignatura Ecofisiologa animal. Universidad de Murcia. Facultad de ciencias. Departamento de fisiologa. 43