ELISPOT-mesa 4

ELISPOT
Enzyme-linked ImmunoSpot Assay

MESA 4
Plan de Seminario
Fundamento
Soportes
Anticuerpos
Conjugados
Sustratos Cromognicos
Analitos detectados
Usos

Objetivos
Al finalizar este seminario el estudiante ser
capaz de :

Describir el fundamento del ELISPOT.
Describir las caractersticas de ELISPOT.
Describir las diferentes etapas del ELISPOT.
Mencionar algunas aplicaciones del ELISPOT.

Fundamento de la prueba
Basada en el ELISA SANDWICH
Detecta la frecuencia de secrecin celular a
travs de la formacin de manchas cuantificables
sobre el soporte.
Etapas de la Tcnica
Paso1
Incubacin de
las clulas
Paso 2
Removimiento de
clulas
Con lavado
Paso 3
Incubacin con
anticuerpos biotimilados
Paso 4
Incubacin con
conjugado PA-SA
Paso 5
Adicin de
BCIP/NBT
cromgeno

RELATED INFORMATION

Soporte
Placas de 96 pocillos con membrana de
Difloruro de Polivinilo (PVDF) o con
Membrana de nitrocelulosa.
Apoyan el crecimiento de las clulas y tienen
una mucho mayor capacidad de retencin de Ac
de captura. (mayor superficie que las
convencionales ).
Mas populares las placas Milipore.
Incubacin con clulas
1- Las clulas son cultivadas en una placa y
luego son trasladadas en placas ELISPOT.

2- Las clulas son estimuladas y cultivadas
directamente en placas de ELISPOT.

Incubacion de celulas ( 24 o 48 horas a
37 C / CO2 )
-IL- 1,2,6,8 y TNF-a ( 24 h)
-IL-4,5 (48 h)
Anticuerpos
Ac monoclonales o Policlonales.
Factor crtico: Capacidad para reconocer
epitopos del Ag. No usar anticuerpos
monoclonales para la captura y para la deteccin.
Optimizacin de la concentracin de Ac de
deteccin ( manchas intensamente teidas y con
bordes bien definidos ).
Necesidad de conjugarse con Biotina ( evitar
reacciones cruzadas).
Conjugados enzimtico
Peroxidasa de rbano (HPR) o Fosfatasa
Alcalina (AP) conjugada con Estreptavidina.
HRP( ventaja: manchas rpidas;
desventaja: tincin de fondo).
AP (ventaja: no hay coloracin de fondo;
desventaja: manchas desarrollan mas
lentamente).
Sistemas de multianalisis pierden sensibilidad.
Sustratos Cromognicos
Deben producir una intensa y estable coloracin.
HRP(3 -amino-9-ethylcarbazole, C14H14N2
intensos puntos Rojos; 3,3 Diaminobencidina,
C12H14N4 color marrn;
AP: Mezcla de BCIP (5-bromo-4-cloro-3-
indolylphosphate p-toluidina sal y NBT
(Nitroblue tetrazolium cloruro) intensas
manchas negro-azul.( Ms utilizado, alta
estabilidad y duracin).

Lectura
La medicin de la secrecin celular se realiza a
travs del recuento del nmero de manchas.
El termino Puntos Formados por Clulas o
SFC es una medida cuantitativa de la actividad
secretora celular.
Conteo manual bajo un estereoscopio,
semiautomatizado o automatizado.
Analitos detectados
INF-g
IL-5
IL-6
IL-8
IL-10
IL-2

IL-13
IL-4
IL-1
IL-12
GM-CSF
TNF-a

Algunas aplicaciones
En la investigation de respuesta inmune en
varias enfermedades incluyendo infecciones,
cancer, alergias y enfermedades autoinmunes.
En la evaluacin de algunas vacunas virales
candidatas (IFN- ELISPOT ).

Aplicaciones
Ejemplo 1

Respuesta de las clulas T CD 8+, en el control
de la infeccin por VIH-1.
Relacionar, con marcadores de progresin de la
enfermedad.
Este estudio mide la respuesta inmune mediada
por clulas: PBMC.
ELISPOT fue usado para detectar INF-
secretado por PBMC.

Materiales y mtodos
Anticuerpo monoclonal anti-IFN 1-DIK.
Pptidos: Gag, Pol, Env y Nef, p24 y gp160.
PBS, suero bovino fetal y Tween 20.
5-bromo-4-cloro-3-indolfosofatonitroazul de
tetrazolio.
La respuesta media fue de 25 SFU por 10
6
PBMC.
POSITIVOS: > 50 SFU/10
6
PBMC.
Repuesta inmune especifica al VIH, medida por
ELISPOT INF- .
vARN Vs. SFU/10
6
PBMC

Conteo absoluto de clulas T CD4+ Vs. SFU/10
6
PBMC
Ejemplo 2
Infeccin causada por VIH-2, es menos
virulenta, permite al hospedero una respuesta
ms efectiva de clulas T.

Se investiga la secrecin antiviral IFN-,
secretados por la clulas T, como respuesta a un
ensayo ex vivo ELISPOT.
Materiales y mtodos
Anticuerpo monoclonal anti INF- (1-D1K,
mouse immunoglobulin G1; Mabtech, Nacka,
Sweden)
PBS con 0.05% Tween 20.
Complejo enzimtico: avidina-biotina
Sustrato: Peroxidasa
Conclusiones
ELISPOT es una tcnica muy sensible( 200
veces mas sensible que el ELISA, detecta una
clula en 100 000 diferentes.
Utilizado ampliamente en investigacin.
Gran potencial como una herramienta
diagnostica.

Bibliografa
Alexander E. Kalyuzhny Chemistry and Biology of the ELISPOT Assay,
From: Methods in Molecular Biology, vol. 302: Handbook of ELISPOT:
Methods and Protocols. Edited by: A. E. Kalyuzhny Humana Press Inc.,
Totowa, NJ

N. N. Zheng,y cols Comparison of Human Immunodeficiency Virus (HIV)-
Specific T-Cell Responses in HIV-1- and HIV-2-Infected Individuals in
Senegal JOURNAL OF VIROLOGY, Dec. 2004, p. 1393413942

Bradley H. Edwards and cols. Magnitude of Functional CD8_ T-Cell
Responses to the Gag Protein of Human Immunodeficiency Virus Type 1
Correlates Inversely with Viral Load in Plasma. JOURNAL OF VIROLOGY,
Mar. 2002, p. 22982305

AID ELISPOT Procedure

ELISPOT-mesa 4

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

ELISPOT-mesa 4

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

ELISPOT-mesa 4

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

ELISPOT

Enzyme-linked ImmunoSpot Assay

También podría gustarte