Scribd Logo
Cargar

¡Te damos la bienvenida a Scribd!

  • 135 vistas

    Northern, Southern y Western Blot

    Cargado por

    BryanLuzón
    El documento describe las técnicas moleculares necesarias para aplicarlas en analisis de DNA, RNA, y proteínas.

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como PPTX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd

    Northern, Southern y Western Blot

    Cargado por

    BryanLuzón
    135 vistas19 páginas
    El documento describe las técnicas moleculares necesarias para aplicarlas en analisis de DNA, RNA, y proteínas.

    Título original

    Northern%2c Southern y Western Blot

    Derechos de autor

    © © All Rights Reserved

    Formatos disponibles

    PPTX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd

    ¿Le pareció útil este documento?

    ¿Este contenido es inapropiado?

    El documento describe las técnicas moleculares necesarias para aplicarlas en analisis de DNA, RNA, y proteínas.

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como PPTX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd
    Descargar como pptx, pdf o txt
    135 vistas19 páginas

    Northern, Southern y Western Blot

    Cargado por

    BryanLuzón
    El documento describe las técnicas moleculares necesarias para aplicarlas en analisis de DNA, RNA, y proteínas.

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como PPTX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd
    Descargar como pptx, pdf o txt
    Está en la página 1de 19

    SOUTHERN BLOT

    Ing. Isaac Armendriz


    2017
    INTRODUCCIN
    Es una tcnica esencial de Biologa Molecular, diseada por E.M.
    Southern en 1975.
    Se basa en la transferencia capilar de fragmentos de restriccin de
    ADN de un gel de agarosa a una membrana de nitrocelulosa, de esta
    manera el patrn de restriccin de una muestra se reproduce en la
    membrana.
    El ADN inmovilizado en la membrana ahora puede ser marcado con
    una sonda radioactiva, que identifique un gen especfico.
    Es un mtodo para detectar un fragmento especfico dentro de un
    gran grupo.
    Bases de la Tcnica
    Un gel de electroforesis con fragmentos de restriccin de ADN se une
    a una membrana de nitrocelulosa y se coloca debajo de una torre de
    papel absorbente. Adems el gel esta sumergido en una solucin
    altamente salina.
    Debido a la presin y al papel absorbente la solucin salina sube por
    capilaridad y transporta al ADN desde el gel hasta la membrana.
    Este proceso dependiendo del tamao de los fragmentos puede durar
    hasta 18 horas.
    Preparacin de componentes
    PREPARACIN DEL ADN:
    La muestra de ADN sea de origen vegetal, animal o bacteriano, debe ser
    purificada con el mayor cuidado posible, de manera que la menor cantidad
    de contaminantes estn presentes.
    PREPARACIN DEL GEL CON FRAGMENTOS DE RESTRICCIN:
    El gel debe ser pre-tratado sumergindolo en HCl por 30 min y despus en
    una solucin alcalina por 30 min y finalmente se regula el pH en un buffer
    de Tris.
    Esto con el objetivo de separar las molculas de ADN para que se
    transfieran fcilmente a la membrana y denaturar la doble cadena de ADN,
    para facilitar la hibridacin.
    Preparacin de componentes
    BUFFER DE TRANSFERENCIA:
    Es un buffer de alta salinidad llamado SSC (Citrato Salino de Sodio),
    debe estar a una concentracin de 20X.
    Despus de la transferencia se reduce la salinidad baando la
    membrana en 2X SSC a 80C y se fija el ADN a la membrana con una
    pequea dosis de irradiacin UV.
    HIBRIDACIN ADN-ADN
    Se trata de detectar un fragmento en especfico al hibridizarlo con
    una sonda complementaria.
    La sonda es generalmente marcada con un compuesto radioactivo (P
    32).
    Pre-hibridacin e Hibridacin
    La membrana con al ADN fijado es lavada con un buffer de
    hibridacin que contiene la sonda marcada.
    La membrana es lavada en buffers que contienen diferentes
    sustancias que bloquean la unin de la sonda a sitios no especficos.
    Esto se realiza de 15 min a 3 horas a 68C.

    Hibridacin
    Se realiza en buffer 2X SSC
    Es un paso crtico donde se pueden generar productos inespecficos.
    Por lo tanto el diseo de la sonda radioactiva es crucial.
    NORTHERN BLOT
    Mismo principio de Southern blot pero con ARN
    APLICACIONES

    Southern Northern

    Identificacin de Expresin de genes


    clones en cncer,
    RFLP transplantes,
    Genes recombinantes enfermedades, etc
    WESTERN BLOT
    Ing. Isaac Armendriz
    2017
    INTRODUCCIN
    Es una tcnica utilizada para identificar y separar protenas.
    La mezcla de protenas es previamente separada por peso molecular,
    por electroforesis en gel de poliacrilamida.
    Las protena en el gel son transferidas a la membrana e incubadas con
    anticuerpos marcados con fluorescencia que son especficos a la
    protena de inters.
    INTRODUCCIN

    Los anticuerpos que no


    hibridizan son lavados de la
    membrana.
    La membrana es detectada en un
    transiluminador donde solo las
    bandas de la protena con el
    marcador de fluorescencia van a
    ser observadas.
    PASOS ESENCIALES
    EXTRACCIN DE PROTENAS: Lisis celular y purificacin del grupo de
    proteinas objetivo.
    ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA: Separar las protenas
    por peso molecular en diferentes bandas, y facilitar el traspaso a la
    membrane de nitrocelulosa o de nylon.
    BLOTTING: Incubacin de las protenas en la membrana con el
    anticuerpo primario y secundario, para la hibridacin.
    DETECCIN: Exposicin a radiacin lumnica que permita la emisin
    de seal por parte del anticuerpo marcado.
    Aplicaciones importantes
    Prueba confirmatoria de VIH (anticuerpos)
    Encefalopata espongiforme bovina
    Enfermedad de Lyme
    Mas enfermedades infecciosas

    También podría gustarte