Universidad Nacional

Autónoma De México
Facultad de Estudios Superiores
Cuautitlán, Campo 1
Departamento: Ciencias Bioquímicas
Laboratorio de Bioquímica
Microbiana
PROFESORES: JONATHAN PABLO PAREDES JUAREZ,
MOISES MISSAEL MARTINEZ MEJIA, VICTOR HUGO VAZQUEZ
VALADEZ.
GRUPO: 1501-ABE CARRERA: QUÍMICA INDUSTRIAL
PERIODO: 2019-I

Práctica 3 y 4
“ESTERILIZACION Y MEDIOS DE
CULTIVO”
INTEGRANTES:
·Barba Chamorro Leonardo Daniel
· Flores Pérez Dante Leonardo
· Martínez Valdés Laura Angélica
· Merlos Flores Luis César
EQUIPO N°2
Fecha De Entrega: 4 de octubre del 2018
Objetivos.
Al finalizar la practica el alumno conocerá los métodos de esterilización más
comunes, así como, las condiciones generales para generar una correcta
esterilización en los diferentes materiales.

Clasificar, preparar, esterilización y distribución de medios de cultivo.

Introducción.
Los procesos de esterilización y/o desinfección son diariamente llevados a cabo, no
solamente en el laboratorio, donde son fundamentales para evitar la contaminación de
medios, cultivos, placas etc., sino también en otros ámbitos tales como los hospitales,
donde fallas en estos procedimientos aumentan la morbimortalidad de los pacientes.
ESTERILIZACION: es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas
de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes,
hongos y sus esporos, y virus. Se entiende por muerte, la pérdida irreversible de la
capacidad reproductiva del microrganismo trata de un término absoluto, donde un objeto
está estéril o no lo está, sin rangos intermedios.
DESINFECCION: en este proceso se eliminan los agentes patógenos reconocidos, pero no
necesariamente todas las formas de vida microbianas. Es un término relativo, donde existen
diversos niveles de desinfección, desde una esterilización química, a una mínima reducción
del número de microorganismos contaminantes. Estos procedimientos se aplican
únicamente a objetos inanimados.
ANTISEPSIA: es el proceso que, por su baja toxicidad, se utiliza para la destrucción de
microorganismos presentes sobre la superficie cutáneo-mucosa. Este término tampoco
implica la destrucción de todas las formas de vida
NIVEL DE LOS DESINFECTANTES:

Estos son clasificados en tres niveles (alto, mediano y bajo), según la intensidad de su
actividad sobre bacterias y esporos, virus (lipídicos y no lipídicos), hongos y sus esporos,
etc.
A. Desinfectantes de alto nivel: Se caracterizan por actuar inclusive sobre los esporos
bacterianos (forma más resistente dentro de los microorganismos), produciendo una
esterilización química si el tiempo de acción es el adecuado. Se utilizan sobre instrumentos
médicos o quirúrgicos termo sensibles. Son rápidamente efectivos sobre bacterias no
esporuladas. Por lo general el número de esporos en el material a desinfectar es
insignificante, por lo que la esterilización es rápida. Dentro de este grupo se encuentran: I.
Óxido de Etileno II. Formaldehído al 8% en alcohol 70% III. Glutaraldehído al 2% IV.
Peróxido de Hidrógeno Todos estos son desinfectantes estrictos, no pudiéndose usar como
antisépticos.
B. Desinfectantes de mediano nivel: Si bien no destruyen esporos, si lo hacen con gérmenes
tipo: M. tuberculosis, hongos y virus no lipídicos. Algunos agentes son: I. Compuestos
clorados (por ej.: hipoclorito de sodio) II. Compuestos iodados (eidóforos y alcohol iodado)
III. Compuestos fenólicos IV. Alcoholes V. Clorohexidina La mayoría de estos son utilizados
como desinfectantes y antisépticos.
Se destacan los que actúan a nivel de proteínas y ácidos nucleicos (agentes oxidantes) y
los que actúan a nivel de la membrana citoplásmica; dentro de estos se encuentran
compuestos fenólicos y los alcoholes.
C. Desinfectantes de bajo nivel:
Son aquellos que, actuando durante un tiempo razonable, no destruyen esporos, ni
Micobacterium, ni virus no lipídicos por Ej.: I. Compuestos de Amonio cuaternario II.
Compuestos mercuriales
Se encuentran aquí los compuestos de amonio cuaternarios y los compuestos mercuriales.
Este tipo de agentes no deben usarse como antisépticos, ni para desinfectar elementos
semicríticos; tampoco deben utilizarse dentro de recipientes (por Ej.: vocales) para
desinfectar por inmersión, puesto que muchos microorganismos (por Ej.: Pseudomona) son
capaces de multiplicarse en estas condiciones.
MEDIOS DE CULTIVO

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en
composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de
muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que
se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios

de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica
al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que

bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar
el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se
añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias
y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y
amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide
el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,

como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de
carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, las preparaciones
de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida
de los factores nutritivos lábiles.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran
inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente
a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros
tienen la capacidad de licuarla.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos.
Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio,
los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las
estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que
se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe
olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y

43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC,
y los saprofítos tienen rangos más amplios.

Tipos básicos de medios de cultivo

atendiendo a su estado físico:
líquidos, semisólidos, sólidos.

Metodología.

Resultados y Análisis de Resultados.

TECNICAS DE ESTERILIZACION

A. DESTRUCCION DE MICROORGANISMOS MEDIANTE CALOR: La energía térmica es la forma

más efectiva de esterilización. Esta puede utilizarse como calor húmedo o seco.
I. CALOR HUMEDO: Mecanismo de Acción: Al igual que los procesos de desinfección, la
esterilización térmica destruye a los microorganismos en forma gradual; es por esto que no
hay un único mecanismo de acción, sino más bien la suma de distintos eventos complejos
que se van sucediendo a medida que aumenta la temperatura. Así, aunque el efecto final
de la esterilización por calor húmedo a 121ºC es la desnaturalización y coagulación de las
proteínas, son importantes otros mecanismos de destrucción, que justifican la utilización de
calor húmedo a temperaturas inferiores, como veremos más adelante. El primer efecto letal
sería la producción de rupturas de cadena única en el ADN que provocarían la muerte
celular por activación o liberación de enzimas con actividad de endonucleasas. El punto
crítico aquí, para la supervivencia de la célula sería su capacidad para reparar la lesión,
función que depende del estado genético y fisiológico de la bacteria. A medida que aumenta
la temperatura se agregaría la pérdida de la integridad funcional de la membrana
citoplásmica, lo que produciría interferencias en el intercambio con el medio externo, los
procesos respiratorios y la síntesis proteica. Por último, las temperaturas más elevadas
activarían ribonucleasas que degradando el ARNr producen la pérdida de viabilidad de las
células expuestas.

Pasteurización: se utiliza para la destrucción de gérmenes patógenos, con resistencia

térmica similar o inferior a M.tuberculosis, Brucella y Salmonella.
AUTOCLAVE VERTICAL DE MANEJO MANUAL: consta de dos recipientes cilíndricos, uno
externo con tapa de cierre hermético que se asegura por múltiples tornillos y uno interno
donde se pone el material a esterilizar. El recipiente externo contiene además, una válvula
de seguridad, un manómetro o termómetro y una llave de salida o escape. La fuente de
calor puede venir incluida en el equipo, como una resistencia eléctrica o se le suministra
aparte, desde abajo, generalmente mediante gas. Dentro del recipiente externo se coloca
agua destilada, la cual al llegar al punto de ebullición producirá el vapor que al entrar en
contacto con los microorganismos, actuará como agente esterilizante. Los materiales se
cargan dentro del recipiente interno que al no tener tapa permite una fluida entrada de
vapor, pero evita el contacto de estos con el agua. El aire es mal conductor del calor, lo que
impide llegar a las 2 temperaturas necesarias, por lo que una vez cargado y cerrado el
autoclave debe purgarse. Esto se consigue dejando la llave de escape abierta hasta que el
vapor, por arrastre, elimine el aire contenido en el equipo.
HORNO PASTEUR O POUPINELL: consiste en un recinto metálico de doble pared con
aislante entre ambas (para evitar la pérdida de calor) y una puerta. La fuente de calor suele
ser eléctrica y está incorporada. Posee un ventilador que facilita la circulación del aire
caliente, para homogeneizar la temperatura. Un termómetro (con alcance mínimo de 200ºC)
visible desde afuera, registra la temperatura del interior del recinto. Por calor seco se
pueden esterilizar: materiales de inyectables, vidrios, instrumentos quirúrgicos y objetos
metálicos, así como aceites, vaselinas y polvos, que como ya se ha dicho son impermeables
al vapor.
Precauciones: Colocar paquetes pequeños y espaciados, para no interferir con la difusión
del calor. La recarga del horno debe hacerse cuando este se encuentre frío, de lo contrario
su interior alcanzará la temperatura antes que el material a esterilizar, por lo que se medirá
mal el tiempo.
Controles de esterilización:
Existen tres tipos: físicos químicos biológicos.
Controles físicos: están relacionados al operario que realiza el procedimiento y la vigilancia
de ciertos parámetros como: presión, tiempo, temperatura, etc.
Controles químicos: consiste en tiras de papel con una sustancia que cambia de color al
ser expuesto a la temperatura correspondiente. La ventaja de este método, es la rapidez
con que se sabe el resultado, ya que es inmediato. La gran desventaja es que dice poco
sobre el tiempo de exposición, por lo que no asegura un procedimiento correcto. Estos
controles deben utilizarse en todos los ciclos de esterilización
Controles biológicos: consisten en exponer esporos 16 bacterianos al ciclo de esterilización
y luego verificar su viabilidad. Son los más seguros. Dentro de una ampolla se encuentra
un medio de cultivo apropiado para el desarrollo de las bacterias en estudio. Por fuera de
esta, un tubo plástico, contiene una cinta de papel marcador de pH, impregnado con
esporos de bacterias capaces de resistir temperaturas cercanas a los procesos realizados.
Se utilizan esporos de Bacillus estearothermophilus en el autoclave y de B.subtilis en la
poupinell. Este sistema se coloca dentro del paquete menos accesible ya sea para el calor
o el vapor. Finalizado el ciclo de esterilización, se rompe la ampolla (por presión manual)

PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE LOS METODOS DE ESTERILIZACION

Autoclave Horno Pasteur

Temp. Requerida 121°C 150- 180 °C
Tiempo 15´ 90´
Mecanismo Acción Coagulación y Coagulación y
desnaturalización de desnaturalización de
proteínas. proteínas.
Materiales Cerámicos, vidrio, Aluminios.
Estandarizables metal, medio de Vidrios, Porcelanas.
cultivo, isipós, Metales (acero
polvos (que no sean inoxidable,
hidroscopios) niquelados,
cromados), Polvos.
Vaselina.
Parafina. Aceites.
Otras sustancias
grasas.

Materiales no Medios con ciertos Material textil.

estandarizables ATBs, azúcares o Algodón, sedas, telas
proteínas; polvos; en general.
vaselinas y aceites; Gomas.
metales oxidables; Plásticos.
instrumentos Siliconas.
médicos termo Instrumental óptico.
sensibles como Instrumental
broncoscopio, etc eléctrico.
Cualquier material
sensible a las altas
temperaturas.

Tipo de indicador Geobacillus B. subtilis

Biológico steorothermophilus
Para esta práctica que utilizo la autoclave para la esterilización de nuestros tubos
de ensaye con solución NaCl para tener integridad estructural de las bacterias, agua
destilada (líquido que nos ayudara a generar el vapor) (Figura 1) , aprendiendo
como montarla, los cuidados que debíamos de tener al utilizarla, observando que
contaba con 3 válvulas de seguridad; una de ellas es el manómetro que nos muestra
la presión en libras que se maneja y la temperatura dentro de la autoclave.

Válvula de
Válvula de seguridad 1
seguridad 3, de
igual forma es el Válvula de
manómetro seguridad 2

Tapa de la Mariposas
autoclave para cerrar la
Autoclave

Camisa de la
autoclave, es donde
sucede el proceso
de esterilización

Para esta práctica manejamos una presión de 15 libras, y a una temperatura de

121° C; para calentar la autoclave se utilizó el mechero Fisher. (Figura 2)
Utilizamos indicadores biológicos para saber que se había llevado una buena
esterilización; utilizamos El Geobacillus steorothermophilus (en píldora y como tira)
como indicador biológico, es una bacteria Gram-positiva con forma de bacilo que se
encuadra en el filo Firmicutes. Es una bacteria termófila extensamente distribuida
en el suelo, manantiales calientes y sedimentos oceánicos y es causa de
descomposición de los productos alimenticios. Normalmente las ampollas tienen un
indicador de fenolftaleína o algún tipo de indicador que varía de color por desarrollo
de la bacteria que modifica el pH de la ampolla. El viraje habitual es de violeta a
amarillo, si luego de la incubación permanece violeta el ciclo de esterilizado ha sido
efectivo. Se debe incubar un control positivo sin esterilizar para verificar el correcto
el resultado por cambio de color.
En caso de viraje de la o las ampollas se deberá aumentar el tiempo de esterilizado,
revisión de fugas, presión obtenida, cantidad de carga, etc. para volver a realizar la
validación del proceso.

Figura 1: Tubos de ensaye en Figura 2: Mechero Fisher.

proceso de esterilización.
Medio de cultivo Cantidad Cantidad Pesada Calculos pH
Preparada
Agar soya- 750mL 30g 40 g --- 1 L No se registró el
Tripticaseina x ----- > .750 L valor de pH
por regla de 3
obtenemos el
valor de “x”

Agar MacConkey 750Ml 37.5 50 g --- 1 L No se registró el

x ----- > .750 L valor de pH
por regla de 3
obtenemos el
valor de “x”
Agar AMB 500Ml 18g 36 g --- 1 L No se registró el
(Eusina azul de x ----- > .500 L valor de pH
metileno) por regla de 3
obtenemos el
valor de “x”

ASPECTOS DEL MEDIO DE CULTIVO:

Medio de Estad Tipo de medio de cultivo Condicion Condicione
cultivo o es de s de
físico Esterilizaci almacena
ón miento
Según la Según el
naturaleza propósito de
de los uso
 ingrediente
s
Agar soya- Solido En el medio Medio Se esteriliza Medio de
tripticasein de cultivo, la utilizado para en la cultivo
a tripteina y la propósitos autoclave a deshidratado
peptona generales, 118-121°C a 15-35°C
aportan favorece el durante 15
nutrientes desarrollo y minutos. Medio de
ricos en aislamiento de cultivo
péptidos, una gran preparado a
aminoácidos variedad de 2-8 °C
libres, bases microorganism
puricas y os aerobios y
pirimidicas, anaerobios
minerales y facultativos y
vitaminas. El estrictos.
cloruro de
sodio
mantiene el
balance
osmótico y el
agar agente
solidificante
Agar Solido Las peptonas Se utiliza para Incubación almacenarlas
MacConkey aportan los aislamiento de en en un lugar
nutrientes basilos Gram aereobiosis, oscuro a una
necesarios Negativos de a 35- 37°C temperatura
para el fácil durante 18- entre 2 y 8 °C,
desarrollo desarrollo, 48 hrs envueltas en
bacteriano, aerobios y su envase
la lactosa es anaerobios original,
el hidrato de facultativos a hasta justo
carbono partir de antes de
fermentable, muestras usarlas. Evitar
y la mezcla clínicas, aguas la
de sales y alimentos. congelación y
biliares y el Todas las el
cristal violeta especies de la calentamient
son los familia o excesivo.
agentes Enterobacteria
selectivos desarrollan en
que inhiben el mismo.
el desarrollo
de la gran
parte de la
flora Gran
positiva
 Agar EMB Solido La presencia utilizado para Esterilizar en Medio de
de peptona el aisla- miento autoclave cultivo
que favorece selectivo de 121°C deshidratado
el desarrollo bacilos Gram durante 15 a 10-35 ºC.
microbiano. negativos de minu- tos. Medio de
La rápido distribuir en cultivo
diferenciació desarrollo y placas de preparado a
n entre escasas Petri 2-8 ºC.
organismos exigencias estériles.
capaces de nutricionales.
utilizar la Permite el nota: La
lactosa y/o desarrollo de esterilizació
sacarosa, y todas las n del medio
de cultivo
aquellos que especies de la
reduce el
son familia azul de
incapaces de Enterobacteria meti- leno al
hacerlo, está ceae color
dada por los naranja. El
indicadores color
eosina y azul púrpura se
de metileno; restaura por
agitación. La
éstos ejer-
presencia de
cen un efecto un
inhibitorio precipitado
sobre una en el medio
amplia esterilizado
variedad de es normal y
bacterias no debe ser
Gram removido,
ya que es
positivas. El
parte
agar es el esencial del
agente mismo.
solidificante

Conclusiones.

Bibliografía.
 Schlegel, H.G. Microbiología General (1997). Ediciones Omega, Barcelona.
 Jawetz, Melinick, Adelberg Microbiología médica (2010). 25a Edición. Mc
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 Sanchez M., Marmolejo, F., Bravo N., Microbiología aspectos

fundamentales. Feriva. Colombia.

 ARTÍCULO: Covadonga, A., M., Técnicas básicas de microbiología.

Observación de bacterias. (2010) Reduca (Biología). Serie microbiana.

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 http://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2ed674cf66
1.pdf

 http://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a28240e1c00
4.pdf