Scribd Logo
Cargar

¡Te damos la bienvenida a Scribd!

  • 6 vistas

    Cromatografía en Capa Fina para La Identificación y

    Cargado por

    Juan Carrillo B
    El documento describe el desarrollo de un método TLC para la detección rápida de aminas biogénicas producidas por microorganismos in vitro. Se mejoró el procedimiento de derivatización con Dns-Cl para acortar el tiempo y facilitar el proceso. Los resultados del método TLC se compararon con un método HPLC cuantitativo estándar para validar su idoneidad como método semicuantitativo.

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como PPTX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd

    Cromatografía en Capa Fina para La Identificación y

    Cargado por

    Juan Carrillo B
    6 vistas27 páginas
    El documento describe el desarrollo de un método TLC para la detección rápida de aminas biogénicas producidas por microorganismos in vitro. Se mejoró el procedimiento de derivatización con Dns-Cl para acortar el tiempo y facilitar el proceso. Los resultados del método TLC se compararon con un método HPLC cuantitativo estándar para validar su idoneidad como método semicuantitativo.

    Título original

    Cromatografía en Capa Fina Para La Identificación y

    Derechos de autor

    © © All Rights Reserved

    Formatos disponibles

    PPTX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd

    ¿Le pareció útil este documento?

    ¿Este contenido es inapropiado?

    El documento describe el desarrollo de un método TLC para la detección rápida de aminas biogénicas producidas por microorganismos in vitro. Se mejoró el procedimiento de derivatización con Dns-Cl para acortar el tiempo y facilitar el proceso. Los resultados del método TLC se compararon con un método HPLC cuantitativo estándar para validar su idoneidad como método semicuantitativo.

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como PPTX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd
    Descargar como pptx, pdf o txt
    6 vistas27 páginas

    Cromatografía en Capa Fina para La Identificación y

    Cargado por

    Juan Carrillo B
    El documento describe el desarrollo de un método TLC para la detección rápida de aminas biogénicas producidas por microorganismos in vitro. Se mejoró el procedimiento de derivatización con Dns-Cl para acortar el tiempo y facilitar el proceso. Los resultados del método TLC se compararon con un método HPLC cuantitativo estándar para validar su idoneidad como método semicuantitativo.

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Descargue como PPTX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd
    Descargar como pptx, pdf o txt
    Está en la página 1de 27

    Objetivo

    • Desarrollar un método TLC para detección


    rápida de AB potencialmente producidos por
    microorganismos in vitro.

    • Mejoras en proceso de derivación Dns-Cl


    para un procedimiento más rápido y
    rutinario.

    • La idoneidad del procedimiento como


    método semicuantitativo comparando
    resultados con el método HPLC cuantitativo
    habitualmente aplicado.
    ¿Qué es una amina biogénica?
    • Son compuestos nitrogenados básicos formados principalmente por
    descarboxilación de aminoácidos o por aminación y transaminación de
    aldehídos y cetonas.
    ¿Qué es la cromatografía liquida?
    • Es un método de separación de
    mezclas complejas.
    • Se puede utilizar para cuantificar,
    identificar y separar los
    componentes de una mezcla.
    • Principio de la retención selectiva
    Tipos de cromatografía liquida en discusión
    • HPLC FASE REVERSA

    • CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA


    Es importante conocer algunos conceptos para poder entender el
    funcionamiento de las técnicas cromatográficas:

    Fase estacionaria Analitos Tiempo de retención

    Fase Móvil Muestra Selectividad


    Eluyente
    TLC(cromatografía de capa fina)
    HPLC(cromatografía de alta eficiencia)

    • Separación, identificación y cuantificación de


    constituyentes de muestras orgánicas complejas.

    • Puede tardar entre 10 a 60min una sola corrida

    • Es automático

    • Requiere un técnico para operarlo


    El principio detrás de la HPLC
    • Separa compuestos por polaridad
    • Concentración de solvente incrementa y el agua
    disminuye
    • Se vuelve apolar
    Ventajas del método TLC
    • gran cantidad de muestras que se pueden manejar en un período corto
    en comparación con la muestra única analizada en cada ejecución de
    HPLC.
    • Es menos costoso
    Generación de aminas biogénicas
    • Las aminas biogénicas (AB) se forman principalmente por la
    descarboxilasa de aminoácidos de diferentes grupos bacterianos
    • Conocimiento exhaustivo de los microorganismos responsables de la
    formación de BA
    Los procedimientos de TLC se han aplicado
    ocasionalmente para determinar:

    Histamina (HI)
    Tiramina (TY)
    Feniletilamina (PHE)
    Putrecina (PU)

    Cadaverina (CA)
    Triptamina (TRP)

    M.L. Latorre-Moratalla et al.


    Experimental
    • Se prepara una solución estándar para cada
    amina.
    • Diclorhidrato de TY 1000 mg/L en ácido tricloroacético (TCA) al 5%.
    • Diclorhidrato de HI Se prepararon estándares con todos los AB
    diluyendo la solución estándar en TCA al 5%. Los
    • Clorhidrato de PHE estándares se refrigeraran protegidos de la luz
    • Clorhidrato de TRP hasta que se requirieran
    • Diclorhidrato de PU
    • Diclorhidrato de CA
    • Sulfato de agmatina (AG)
    • Tetraclorhidrato de espermina (SM)
    • Triclorhidrato de espermidina (SD)
    M.L. Latorre-Moratalla et al.
    Evaluación de la capacidad de descarboxilasa de aminoácidos de
    cepas bacterianas

    • Los microorganismos
    probados incluyeron:
    • Lactobacillus curvatus
    • Lactobacillus brevis
    • Staphylococcus xylosus Lactobacillus curvatus Staphylococcus Xylosus Enterobacter cloacae

    • Staphylococcus carnosus Algunas de estas cepas


    mostraron actividad
    • Enterococcus faecium descarboxilasa en
    condiciones in vitro,
    • Enterobacter cloacae
    produciendo TY, PU, CA,
    • Klebsiela oxytoca HI y/o PHE, mientras que
    Lactobacillus brevis Staphylococcus carnosus
    otras no.
    • Aislados de salchichas
    fermentadas.

    Enterococcus faecium Klebsiela oxytoca


    Dansilacion de aminas biogénicas
    • Modificaciones en las condiciones (110ºC en 10 min)
    • Se compararon las temperaturas (40ºC en 60 min+20 min al agregar
    glicina para reaccionar con Dns-Cl residual)
    • La termo estabilidad de AB a 100ºC fue previamente revisada
    Separación de dansil aminas por TLC
    • Placas cristal TLC 20x20
    • 0.22mm gel sílica G60
    • Activada a 100ºC 1hr
    • 10ul Ext. Etilacetato a 2cm
    • A intervalos de 1cm

    Meseguer-Lloret et al.
    Sistema de solventes
    • A) Cloroformo-dietiléter-trietilamina
    (4:1:1)
    • B) (6:4:1) Y Cloroformo-trietilamina
    (6:1)
    • C) (5:1:1) (mejora resolución) Trietilamina

    • D) (4:2:1) (reduce polaridad) Cloroformo

    • E) (3:1:1) (reduce residuos amb)


    • F) diclorometano-dietiléter-
    trietilamina (4:1:1) (reduce toxicidad
    de cloroformo) Lapa-Guimarães et al.

    Diclorometano
    Validación del método TLC
    • Repetibilidad del método fue estudiado en diferentes concentraciones
    (5 a 50mg/L)
    • Soluciones estándar de concentraciones decrecientes fueron corridas
    (500 a 0.5mg/L) para determinar la sensibilidad a 366nm
    • Interferencia potencial de Dns-Cl y medio descarboxilasa fueron
    evaluados para revisar selectividad
    Análisis de AB por HPLC
    • HPLC de fase inversa de par de iones fue usado para exitosamente
    determinar producción de AB
    • Se uso una derivación post columna o-ftalaldehido/2-mercaptoetanol
    • Detección fluorométrica (340 a 445nm)

    Hernández-Jover et al.
    Fase Experimental

    Análisis de aminas biogénicas


    Preparación de estándares por HPLC

    Cultivo de bacterias con


    capacidad de descarboxilasa Separación de dansil aminas
    de aminoácidos por TLC

    Dansilacion de aminas Sistema de solventes


    biogénicas
    Resultados
    Validación de método
    Semicuantificación de AB producidas por
    bacterias
    Conclusión
    • El sistema de TLC descrito puede simultáneamente detectar y
    semicuantificar mas aminas que métodos previamente publicados
    • El proceso de Dansilacion se redujo drásticamente de 80 a 18 min
    incrementando la temperatura a 100ºC
    • Los resultados de este método coinciden con esos obtenidos por el
    método HPLC

    También podría gustarte