Biochimie
Biochimie
Biochimie
CHAARI Kacem
2009
Objectifs du cours
Le cours de Biochimie II occupe une place centrale et capitale dans la formation des étudiants engagés dans le
domaine des sciences biologiques et des études technologiques. Il doit asseoir les concepts fondamentaux qui
régissent les réactions chimiques et biochimiques.
Partie enzymologie
Définir les termes d'enzymologie : enzyme, substrat, produit, coenzyme, activateur, inhibiteur, réaction
enzymatique, propriétés et classification des enzymes (nomenclature).
Rappeler la cinétique chimique, en terme de notion d'ordre d'une réaction, réactions élémentaires et
complexes formées.
Donner des exemples d'inhibitions de réactions enzymatiques en expliquant les effets de cette inhibition sur
les paramètres de la réaction.
Donner des exemples d'effets allostériques : activation coopérative et rétroinhibition.
Etablir un schéma densemble des carrefours et des voies métaboliques impliquées dans la synthèse et la
dégradation des glucides, des protides et des lipides.
Donner des exemples denzymes et de molécules impliquées dans lanabolisme et le catabolisme des
glucides, protides et lipides.
1
Aperçu général et structure du cours de Biochimie II
Contenu du cours (45 h)
Partie enzymologie
Chapitre 1 : Introduction aux enzymes
•
Séance 1 :
Objectif :
Ce chapitre permet de :
De décrire certaines caractéristiques comme : Pouvoir catalytique, Spécificité, équilibre chimique, états de
transition.
L'étudiant pourra :
Connaître la notion d'enzymes ainsi que les propriétés et les classes d'enzymes.
Distinguer les différentes conformations des protéines enzymatiques selon les types suivants : enzymes
simples, iso−enzymes, multi−enzymes, enzymes allostériques.
2
Chapitre 2 : Rappel de cinétique chimique
L'étudiant pourra :
Etudier la cinétique d'une réaction chimique : évolution du substrat et du produit en fonction du temps.
Démontrer graphiquement l'ordre d'une réaction simple et complexe: ordre 0, ordre 1, ordre 2, etc
Connaître des exemples d'illustration.
3
Détermination graphique de KM et VM selon plusieurs représentations.
Connaître les UNITES DACTIVITE ENZYMATIQUE.
Autoévaluation
Autoévaluation
4
Chapitre 5 : Applications des enzymes dans le domaine industriel
Ce module est offert à distance sur un semestre de 15 semaines. Le volume de travail exigé pour l'étude du
module et la réalisation des évaluations sont de 45 heures. En moyenne, la charge hebdomadaire est donc
denviron 3 heures. Certains chapitres sont un peu plus longs à lire que dautres, mais ils exigent moins de
travail sous forme dexercices. Un calendrier pédagogique détaillé (Voir Tableau).
Approche pédagogique
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• DETERMINATION DE LORDRE DUNE
REACTION EN FONCTION DU TEMPS ET DE
LA CONCENTRATION DU SUBSTRAT
• Séance 4 : Travaux dirigés
• Séance 5 : Travaux dirigés
6 7
• Séance 6 : vitesses initiales des réactions
enzymatiques et EQUATION DE VITESSE DE
Chapitre 3 MCHAELIS ET MENTEN par deux formulations
• Séance 7 :Détermination graphique de KM et VM,
UNITES DACTIVITE ENZYMATIQUE et effet
de la température.
Autoévaluation
10
• Séance 8 : (1.5 heures)
11 − Définition et caractéristiques générales des
inhibiteurs réversibles et irréversibles
− Les inhibiteurs de la réaction biochimique :
12 compétitifs
Chapitre 4
• Séances 9 et 10 :(3 heures)
13 − Les inhibiteurs de la réaction biochimique : non
compétitifs, incompétitifs, irréversibles et
14 inhibition par excès de substrat (suite).
• Séance 11 : Travaux dirigés
• Séance 12 : Travaux dirigés
Autoévaluation
6
15 Examen final
Évaluation des apprentissages
Des séances de travaux dirigés seront organisées au cours du semestre, en alternance avec les cours, de
manière à permettre aux étudiants de poser des questions tant sur la matière théorique que sur celle des
travaux pratiques, et à les aider à intégrer les différents chapitres du cours de Biochimie II.
Autoévaluation
Cette évaluation n'est pas notée. Elle est présentée sous forme dactivités dintégration, de questions à
répondre ou d'exercices à effectuer. Cette autoévaluation met l'accent sur les points les plus importants de la
matière enseignée. Le corrigé des exercices est disponible, mais nous vous suggérons de ne le consulter
quaprès avoir traité les exercices. Ces derniers vous préparent aux évaluations notées.
Ces travaux visent à vérifier l'acquisition de vos connaissances et votre compétence à appliquer et à transférer
les notions étudiées à des situations concrètes. Le français utilisé dans vos travaux d'évaluation doit être
correct. Un travail illisible, jugé irrecevable par votre professeur, vous sera retourné pour être refait. Vous
devez obligatoirement réaliser et retourner aux dates prévues (voir la fiche calendrier) les travaux notés et
passer l'examen final sous surveillance.
L'examen final sous surveillance porte sur toute la 1ère partie du cours et sera constitué de questions
objectives, à développement, problèmes, etc& L'utilisation des notes de cours ne sera pas autorisée.
7
Chapitre 1 : Introduction au métabolisme et à la bioénergétique
Ce chapitre permet de :
Chapitre 2 : Glycolse
L'étudiant pourra :
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Chapitre 3 : Métabolisme des acides gras
Dans ce chapitre nous verrons les voies anaboliques et cataboliques des acides gras.
Approche pédagogique
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coenzymes et couplage énergétique.
• Séance 3 : Travaux dirigés
456789
• Séance 4 :Étapes et bilan de la glycolyse.
• Séance 5 : Devenir des produits formés.
• Séance 6 : Régulation de la glycolyse.
• Séance 7 : Étapes du cycle de Krebs et bilan de
Chapitre 2
loxydation complète
• Séance 8 : Fonctions du cycle de Krebs et
régulation
• Séance 9 : Cycle du glyoxylate ou shunt
glyoxylique, voie des pentoses et cycle de Calvin
Autoévaluation (exercice 8)
10
• Séance 10 : Etapes et bilan de loxydation des
11 acides gras
Chapitre 3
• Séance 11 : Anabolisme des acides gras, fonctions
12 et régulation
• Séance 12 : Travaux dirigés
Autoévaluation (exercice 9)
13
• Séance 13 : Lorigine et lassimilation de lazote
Chapitre 4
14 • Séances 14 :Le transport de lammoniac chez les
animaux et le cycle de l'urée
15 Examen final
Charge de travail et calendrier
Ce module est offert à distance sur un semestre de 15 semaines. Le volume de travail exigé pour l'étude du
module et la réalisation des évaluations sont de 22,5 heures.
Les travaux dirigés seront organisés au cours du semestre, en alternance avec les cours, de manière à mieux
comprendre les différents chapitres des cours de Bioénergétiques et de métabolisme.
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I - GENERALITES
I - LE SACCHAROSE
Le saccharose est le composé le plus répandu des diholosides. Il est extrait de la betterave et de
la canne à sucre. C’est un sucre non réducteur qui par hydrolyse chimique ou enzymatique, libère
une molécule de glucose et une molécule de fructose, les deux oses sont des sucres réducteurs.
Son pouvoir rotatoire spécifique [α]D à 20°C = +66,5; alors que le mélange obtenu
par hydrolyse possède un pouvoir rotatoire global lévogyre. Ce mélange est désigné
sous le nom de sucre inverti (inversion du pouvoir rotatoire).
II - BUT
Il s’agit d’extraire la fraction soluble de la levure de boulangerie, et de mettre en
évidence l’activité invertase dans l’extrait cellulaire et de déterminer les conditions
optimales de cette activité enzymatique. Ces expériences illustrent le mode d’action
des enzymes en général.
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MANIPULATION I. EXTRACTION DE LA FRACTION SOLUBLE DE
ETALON.
1 - OBJECTIFS
♦ Extraction de la fraction soluble de la levure de boulangerie
♦ Dosage des protéines par la méthode du biuret
♦ Réalisation de la gamme étalon d’une solution des sucres par la méthode du
DNS
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A - Matériels et Réactifs
♦ Eprouvette de 50 ml
♦ Pipettes graduées
♦ Support de tubes à essai
♦ Tubes à essai
♦ Spectrophotomètre
♦ Solution de Glucose 2,5 mM
♦ Solution de Fructose 2,5 mM
♦ Solution de DNS
B - Mode opératoire
Préparer une gamme étalon à partir d’une solution mère de glucose +fructose de
concentration de 5 mM selon le tableau ci-dessous.
N° tube Blanc 1 2 3 4 5
(Glucose+
Fructose) 5 mM 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
(ml)
H2O (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
DNS (ml) 1 1 1 1 1 1
Chauffage pendant 5 mn à 100°C
H2O (ml) 8 8 8 8 8 8
Agiter, lire la DO à 550 nm
C - Compte rendu
A - Principe :
B - Matériels et Réactifs
♦ Eprouvette de 25 ml
♦ Eprouvette de 50 ml
♦ Pipettes graduées
♦ Support de tubes à essai
♦ Tubes à essai
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♦ Spectrophotomètre
♦ Réactif du biuret
♦ Solution standard ou mère d’ovalbumine à 5 mg/ml
C - Mode opératoire
Préparer une gamme étalon avec l’ovalbumine selon le tableau ci-dessous (tubes 1 à
6).
N° tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ovalbumine (solution
mere) 0 0,1 0,2 0,4 0,8 1
Extrait enzymatique
0,5 1 2
dilué au 1/50 (ml)
H2O (ml) 2 1,9 1,8 1,6 1,2 1 1,5 1 0
Réactif Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Agiter, incuber 15 mn à T° ambiante
Lire la DO à 540 nm
D - Résultats
E - COMPTE RENDU
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N° tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ovalbumine (mg)
DO à 540 nm
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MANIPULATION II : MESURE DE L’ACTIVITE DE L’INVERTASE EN
FONCTION DU TEMPS
I – PRINCIPE
Une fois l’activité invertase est mise en évidence dans la fraction soluble de la
levure, l’étude cinétique de cette activité peut être faite en variant à chaque fois l’un
des paramètres suivants : quantité d’enzyme, temps d’incubation, quantité du substrat,
température, pH, force ionique etc.
1 - MATERIELS ET REACTIFS
- Tubes à essai
- Pipettes de 1, 2 et 5 ml
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- Solution d’acide acétique à 0,3 %
2 - MODE OPERATOIRE
3 - COMPTE RENDU
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- Tracer la courbe V = f(t) en portant en ordonnée le nombre de micro-moles
de saccharose hydrolysé et en abscisses le temps d’incubation en minute.
Interpréter la courbe.
- Déterminer l’activité de l’invertase dans le surnageant.
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MANIPULATION III: INFLUENCE DE LA CONCENTRATION DE
1 - MODE OPERATOIRE
N° du tube 1 2 3 4 5 6 7
Saccharose 4% (ml) 3 3 3 3 3 3 3
CH3COOH à 0,3% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Eau (ml) 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3
Pré-incubation pendant 5 mn à 56°C
Extrait enzymatique dilué
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
au 1/50 (ml)
Incubation pendant 10 mn à 56°C
Prise en ml pour le
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
dosage du glucose
Solution de DNS 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubation pendant 10 mn à 100°C
Ajouter 1,6 ml d’eau distillée ; agiter et
faire la lecture de la DO à 550 nm
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2 - RESULTATS
Des volumes constants renfermant des quantités variables de substrat seront testés de façon à
déterminer la concentration en substrat pour laquelle en obtient la moitié de la vitesse maximale
(KM).
A - MODE OPERATOIRE
N° du tube 1 2 3 4 5 6 7
Saccharose 0,36 M (ml) 1 2 3 4 0 0 0
Saccharose 1,2 M (ml) 0 0 0 0 2,5 3 4
CH3COOH à 0,3% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Eau (ml) 5,5 4,5 3,5 2,5 4 3,5 2,5
Préincubation pendant 5 mn à 56°C
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Extrait enzymatique dilué
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
au 1/50 (ml)
Incubation pendant 10 mn à 56°C
Prise en ml pour le dosage
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
du glucose
Solution de DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubation pendant 10 mn à 100°C
Ajouter 1,6 ml d’eau distillée ; agiter et faire la lecture de la DO à 550nm
NB : faire un témoin pour chaque concentration
B - Résultats
- Tracer le graphique V=f (S).
- Tracer le graphique 1/V= f (1/S).
- Déterminer KM et Vmax.
C - Compte rendu
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- Tracer un graphique V = f(S) en portant en ordonnée le nombre de micro-moles de
glucose produit par minute et en abscisses la concentration en saccharose dans le
milieu réactionnel, en sachant que la masse molaire du saccharose est de 342 g.
- Interpréter les résultats obtenus.
- Tracer le graphique 1/V = f (1/S).
- Déterminer KM et
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MANIPULATION IV : INFLUENCE DU pH SUR
L’ACTIVITE DE L’INVERTASE.
1 - PRINCIPE
2 - MATERIEL ET REACTIFS
- Spectrophotomètre
- Burette
- Pipettes 1, 2, 5 et 10 ml
-Tubes à essai
- Phosphate disodique 0,2 M
- Saccharose 0,36 M
- Acide citrique 0,1 M
- Solutions de tampon citrate phosphate à des pH différents
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Solution B : Phosphate disodique 0,2 M :
Na2HPO4, anhydre 28,4 g/l
Na2HPO4, 7 H2O 53,65 g/l
Na2HPO4, 12 H2O 71,7 g/l
pH X (ml) de A Y (ml) de B
2,6 44,6 5,4
3,4 35,9 14,1
4,2 29,4 20,6
5 24,3 25,7
5,8 19,7 30,3
6,6 16,6 36,4
3 - MODE OPERATOIRE
N° Tube 1 2 3 4 5 6
Saccharose à 0,36M
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
(ml)
Tampon (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Valeur du pH 2,6 3,4 4,2 5 5,8 6,6
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Pré-incubation pendant 5 mn à 56°C
Extrait enzymatique
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
dilué au 1/50 (ml)
Incubation pendant 5 mn à 56°C
Prise d’essai pour
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
dosage des sucres (ml)
Solution de DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubation pendant 5 mn à 100°C
Ajouter 1,6 ml d’H2O, Agiter
Faire la Lecture de la DO à 550 nm
4 - Résultats
Compte rendu
N° du Tube 1 2 3 4 5 6
pH
Nombre de micro moles de glucose
formé
Nombre de micro moles de
saccharose hydrolysé par mn
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MANIPULATION V : INFLUENCE DE LA
1 - PRINCIPE
2 - MODE OPERATOIRE
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Tableau n°1
n° du Tube 1 2 3 4 5 6 7
Saccharose 0,36 M
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
(ml)
Eau distillée (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
CH3COOH 0,3% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Extrait enzymatique
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
dilué au 1/50 (ml)
Incubation pendant 10
mn à la Température 4 37 50 56 60 80 100
indiquée (°C)
Prise d’essai du milieu
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
réactionnel (ml)
Ajouter la solution de
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
DNS (ml)
Incuber pendant 10 mn à 100°C
Ajouter H2O (ml) 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6
Lecture de la DO à 550 nm
3 - Résultats
N° du Tube 1 2 3 4 5 6 7
PH
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MANIPULATION VI: INFLUENCE D'UN INHIBITEUR SUR
L'ACTIVITE DE L'INVERTASE.
1 - GENERALITES
- Inhibition compétitive
I
k M' = k M ⋅ (1 + )
kI
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phenylurée, chloramphénicol, phenylalanine, hydroxyrée, hydroxylamine et
thiourée.
Les différents complexes ES, EI, EIS et ESI se forment. Ce type d’inhibition
se produit lorsque l’inhibiteur se fixe sur l’enzyme à un emplacement différent
du site de fixation du substrat, sans entraîner de variation dans l’affinité
apparente de l’enzyme pour le substrat. La constante de Michaelis n’est pas
modifiée, seule la vitesse maximale de la réaction varie en fonction de la
concentration de l’inhibiteur.
1 1 I
= ⋅ (1 + )
VM' VM kI
- Inhibition “incompetitive”:
2 - PRINCIPE
Les sels de métaux lourds, comme Cu++, Hg++ et Ag+ sont des
inhibiteurs réversibles de l’invertase. Cette inhibition est fonction de
la concentration en inhibiteur, mais n’est pas en fonction du temps.
On peut récupérer l’activité initiale en cheminant les métaux lourds
par dialyse ou par addition d’agents complexant ces ions.
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3 - MATERIAL ET METHODES
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4 - MODE OPERATOIRE
N° du tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Saccharose
2 3 4 2 3 4 2 3 4
2% (ml)
Saccharose
2,5 3 2,5 3 2,5 3
4% (ml)
CH3COOH
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
0,3% (ml)
H2O (ml) 4 3 2 3,5 3 4 3 2 3,5 3 4 3 2 3,5 3
HgCl2 10-4M
(ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
HgCl2 10-5M
(ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
HgCl2 10-6M
(ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Extrait
enzymatique 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
dilué au 1/50
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(ml)
Prise d’essai 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Solution
DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
H2O (ml) 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6
Mesurer la DO à 550 nm
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&
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