république algérienne démocratique et populaire

ministre de l'enseignement supérieure et de la recherche scientifique

institut de science technologique
département de science de la nature et la vie

LES TECHNIQUE DE SEQUENSAGE

Présente par
RAMDANI Naima
Présente par

LAOULAH Ilham
SEBAI Hanane

ANNEE UNIVERSITAIRE: 2019/2020

 INTRODUCTION

◻ Le génome est l’ensemble du matériel génétique d’un

individu ou d’une espèce. La séquence d’ADN, qui en est
le support, contient l’information nécessaire à la survie des
êtres vivants. Le séquençage, qui consiste à déterminer la
suite des acides nucléiques qui la composent, est donc un
enjeu de société majeur. Les applications sont nombreuses
que ce soit dans le domaine médical ou biologique
PLAN DE TRAVAIL

◻ Introduction
◻ Définition
◻ Historique
◻ Les technique de séquençage du base
◻ Les technique de séquençage développe
◻ Conclusion
DEFINITION

◻ Le séquençage de l’ADN est une

technique qui a révolutionné la biologie
moléculaire  dans les années 1970 ,qui
consiste à déterminer l'ordre
d'enchaînement des nucléotides pour un
fragment d’ADN  donné.
HISTORIQUE

◻ Le séquençage de l'ADN est inventé dans la 2iéme moitié des

années 1970. Deux méthodes sont développées
indépendamment, l'une par l'équipe de Walter Gilbert
aux États-Unis, et l'autre par celle de Frederick Sanger en 1977
Ces deux méthodes sont fondées sur des principes
diamétralement opposés : l'approche de Sanger est une
méthode par synthèse enzymatique sélective, tandis que celle
de Maxam et Gilbert est une méthode par dégradation
chimique sélective. Pour cette découverte, Gilbert et Sanger
sont récompensés par le prix Nobel de chimie en 1980
 Les techniques de séquençage

◻ Le séquençage par la méthode Sanger

Le principe de cette méthode consiste à initier la
polymérisation de l’ADN à l'aide d'un petit oligonucléotide
(amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à
séquencer. L’élongation de l’amorce est réalisée par
le fragment de Klenow une ADN polymérase I dépourvue
d’activité exonucléase 5’→3’) et maintenue par des ADN
polymérases thermostables celles qui sont utilisées pour
la PCR Les quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP,
dTTP) sont ajoutés
ainsi qu’une faible concentration de l'un des
quatre didésoxyribonucléotide (ddATP, ddCTP,
ddGTP ou ddTTP)

°Cette terminaison se fait spécifiquement au

niveau des nucléotides correspondant au
didésoxyribonucléotide incorporé dans la
réaction
.Pour le séquençage complet d'un même fragment
d'ADN, on répète cette réaction quatre fois en
parallèle, avec les quatre didésoxyribonucléotides
différents
La détection des fragments ainsi synthétisés se fait
en incorporant un traceur dans l'ADN synthétisé.
Initialement ce traceur était radioactif ; aujourd'hui,
on utilise des traceurs fluorescents, attachés soit à
l'oligonucléotide, soit au didésoxyribonucléotide
 Méthode de Maxam et Gilbert

◻ Méthode de Maxam et gilbert

◻ Cette méthode est basée sur une dégradation chimique
de l'ADN et utilise les réactivités différentes des quatre
bases A, T, G et C, pour réaliser des coupures sélectives7.
En reconstituant l'ordre des coupures, on peut remonter à
la séquence des nucléotides de l'ADN correspondant.
◻ Marquage : Les extrémités des deux brins d'ADN à
séquencer sont marquées par un traceur radioactif (32P).
Cette réaction s'effectue en général au moyen
d'ATP radioactif et de polynucléotide kinase.
 Isolement du fragment
 d'ADN à séquencer. Celui-ci est séparé au moyen
d'une électrophorèse sur un gel
de polyacrylamide.
Séparation de brins.
Les deux brins de chaque fragment d'ADN sont
séparés par dénaturation thermique, puis purifiés
par une nouvelle électrophorèse
Modifications chimiques spécifiques.
Les ADN simple-brin sont soumis à des réactions
chimiques spécifiques des différents types de base. Walter
Gilbert a mis au point plusieurs types de réactions
spécifiques, effectuées en parallèle sur une fraction de
chaque brin d'ADN marqué : par exemple, une réaction
pour les G (alkylation par le sulfate de diméthyle), une
réaction pour les G et les A (dépurination), une réaction
pour les C, ainsi qu'une réaction pour les C et les T
(hydrolyse alcaline
 Coupure
◻ . Après ces réactions, l'ADN est clivé au niveau de la
modification par réaction avec une base, la pipéridine.
Analyse.
◻ Pour chaque fragment, les produits des différentes
réactions sont séparés par électrophorèse en
conditions dénaturantes et analysés pour reconstituer
la séquence de l'ADN. Cette analyse est analogue à
celle que l'on effectue pour la méthode de Sanger
 Technologies en développement :séquençage par
Nanopore

◻ Le séquençage desnanopores est une approche de troisième génération

utilisée dans le séquençage debiopolymères, en particulier de
polynucléotides sous forme d’ADN ou d’ARN. À l'aide du séquençage de
nanopores, une seule molécule d'ADN ou d'ARN peut être séquencée
sans nécessiter d'amplification PCR ni de marquage chimique de
l'échantillon.
◻ Le séquençage desnanopores est une technologie unique et évolutive
qui permet une analyse directe et en temps réel de longs fragments
d'ADN ou d'ARN. Il fonctionne en surveillant les changements d'un
courant électrique lorsque les acides nucléiques passent à travers un
nanopore protéique . Le signal résultant est décodé pour fournir la
séquence d'ADN ou d'ARN spécifique.
La technologie Nanopore offre plusieurs
avantages, tels que:

◈capacité à séquencer des molécules simples

◈ Longues lectures
◈ Analyse en temps réel
  

L'ADN à séquencer est capté par une en Séquençage parnanopore biologique. l’enzyme
hélicase qui extrude l'ADN simple brin à une vitesse réduite. Lenanopore lui-même (
constitue une ouverture dans la membrane lipidique dans laquelle le champ électrique
force le passage de l'ADN simple brin . Ce dernier est ralenti au passage par la
constriction du nanopore ( et permet l'identification des bases individuelles par mesure
de l'intensité du courant électrique traversant le pore à un instant donné . Le trait pointillé
bleu représente le courant à vide du nanopore.
Exemple de utilisation de nonopore :Nanopore technologie des biomolécules de
séquençage a de vastes applications dans les sciences de la vie, y compris l’identification
de pathogènes

 
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 La technologie 454 pyrosequencage
Cette méthode de séquençage par synthèse repose sur l’action d’une ADN polymérase qui, si on
lui fournit le bon désoxyribonucléotide(dNTP), En couplant les données d’intensité lumineuse au
type de dNTP ajouté au milieu réactionnel, on peut déterminer la séquence d’ADN. Si plusieurs
nucléotides identiques se suivent dans la séquence, le signal lumineux émis sera proportionnel a
nombre de nucléotides
Le 454 emploie exactement le même principe mais en le
miniaturisant de façon à pouvoir réaliser des milliers de
réactions simultanément. Pour cela, il faut dans un premier
temps fabriquer un « réacteur » contenant des milliers de puits
indépendants : les « picotiterplates » *produites par fusions de
faisceaux de fibres optiques, dont chaquepuit abritera d’une
réaction de pyroséquençage. Dans la méthodologie 454,
chaque fragment d’ADN à séquencer est dans un premier
temps couplé à deux adaptateurs (petits oligonucléotides de
séquence connue) A et B. Cette librairie d’ ADN est alors mise
en contact avec des billes d’agarose comportant à leur
surface des oligonucléotides complémentaires des
adaptateurs A et B, puis un unique fragment d’ADN se fixe à
chaque bille
. Le mélange bille-ADN est ensuiteadditivé d’huile et émulsionné.
En résulte la formation de micelles, contenant chacune une bille
liée à un fragment d’ADN Chaque bille devient un microréacteur,
utilisé pour une réaction de PCR qui va permettre de copier l’unique
fragment porté par la bille, jusqu’à obtenir environ 1 million de
copies, toutes liées à la bille. Les micelles sont ensuite détruits et
les billes collectées Les billes sont ensuite placées sur la «picotiter
plate » où elles vont chacune occuper unpuit unique. On ajoute
ensuite une solution contenant d’autres billes d’agarose, mais
beaucoup plus petites, sur lesquelles sont greffées les enzymes
nécessaires au pyroséquençage
Dans le séquenceur, chaque « picotiter plate » joue le rôle de
chambre microfluidique dans laquelle va être injectée une
solution de nucléotide. Les quatre nucléotides sont injectés
séquentiellement (TCGA) avec une étape de lavage entre
chaque nucléotide (d’où la nécessité de lier les enzymes à des
billes). On note que la séquence TCGA est présente à la fin des
adaptateurs A et B, juste avant le début du fragment, ce qui
permet au séquenceur de se calibrer pour chaquepuit. Un
capteur CCD à très haute résolution est placé dans l’axe des
puits et mesure en permanence l’émission de photons de
chacun des puits.
Exemple d'application du pyroséquençage : étude du
transcriptome de Arabidopsis thaliana
 CONCLUSION

◻ Le séquençage de l’ADN peut être utilisé pour

déterminer la séquence de gènes individuels, de
grandes régions génétiques, des chromosomes
complets ou des génomes entiers, de n'importe
quel organisme. Le séquençage de l'ADN est
devenu une technologie clé dans de nombreux
domaines de la biologie et d'autres sciences telles
que la médecine, la médecine légale
MERCI POUR VOTRE
ATTONTION