Pr Georges Barbier (Université de Brest, France) – Cours de microbiologie à l’université de Ngaoundéré (Cameroun), mars 2009

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3 – Croissance

Croissance = augmentation des constituants cellulaires

Si division des cellules alors croissance = augmentation du nombre de cellules

31 - Mesure de la croissance

Dénombrement au microscope

Chambres ou cellules de comptage 

(Thoma, Petroff-Hausser,…) :
lames de profondeur connue avec fond
muni d’une grille de taille définie
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Dénombrement sur boite

Etalement sur boite d’un volume défini, après dilution ou non, puis dénombrement des colonies
Problème : un agrégat de cellules donne une colonie comme une cellule isolée. On parle d’Unités
Formant Colonies (UFC, CFU en anglais).
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Dénombrement par cytomètrie en flux : Plus facilement utilisable pour les cellules de grande taille,
micro-algues par exemple, cette technique permet de faire défiler des particules, molécules ou
cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser. La lumière réémise (par diffusion ou
fluorescence) permet de classer la population suivant plusieurs critères et de les trier.

Exemple d'analyse de peuplements

phytoplanctoniques :
Chaque cellule est identifiée grâce à
ses propriétés de diffusion lumineuse
(relatives à la taille) et de fluorescence
rouge due aux pigments
chlorophylliens.
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Filtration d’un volume défini, après dilution ou non, sur un filtre de porosité calibrée (0,45 µm par
exemple)
 Dépôt sur milieu de culture solide, puis dénombrement des colonies
 Coloration des cellules à l’acridine orange (colorant fluorescent), filtres colorés au noir d’irgalan,
dénombrement au microscope à épifluorescence (UV)
 Comptage automatisable (Cytométrie scanner)

Dénombrement en milieu liquide par inoculation de dilutions successives (utilisation de tables de

nombres les plus probables = NPP)

Pesée de culots cellulaires : technique utilisée pour les mycètes, peu sensible.

Turbidimétrie : mesure de l’absorbance à une longueur d’onde donnée

NB : si concentration supérieure à 107 cellules/ml

Mesure de l ’impédance (équivalente pour les courants alternatifs, à la résistance pour les courants
continus)

Dosage des constituants cellulaires : protéines totales,azote, chlorophylle, ATP

Questions :
Un échantillon d’eau de rivière est observé au microscope en cellule de Thoma. Les résultats de comptage de cellules microbiennes par
carré sont les suivants : 12, 17, 15, 16, 13, 17. Quelle est la concentration microbienne estimée pour cet échantillon ?
1 ml de cet échantillon est ajouté à 9 ml d’eau stérile, puis après homogénéisation 1 ml de cette dilution est ajouté à 9 ml d ’eau stérile et
ainsi de suite. Combien de dilutions successives faut-il réaliser pour espérer obtenir une trentaine de colonies en étalant 0,1 ml sur un
milieu de culture solide de dénombrement de la flore totale en boite de Petri ?
En sortie d’étuve, on dénombre 7 colonies sur la gélose de la boite de Petri. Quelles explications proposez-vous pour expliquer ce chiffre
plus faible que prévu ?
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Question :
Un échantillon d’eau de rivière est observé au microscope en cellule de Thoma.
Les résultats de comptage de cellules microbiennes par carré sont les suivants : 12, 17, 15,
16, 13, 17.
Quelle est la concentration microbienne estimée pour cet échantillon ?

Réponse :
La concentration microbienne estimée pour cet échantillon est
C = 2*107 *(12+17+15+16+13+17)/6
⇒ C = 2*107 *90/6
⇒ C = 30*107
⇒ C = 3*108 cellules/ml
Question :
1 ml de cet échantillon est ajouté à 9 ml d’eau stérile, puis après homogénéisation 1 ml de
cette dilution est ajouté à 9 ml d ’eau stérile et ainsi de suite. Combien de dilutions
successives faut-il réaliser pour espérer obtenir une trentaine de colonies en étalant 0,1 ml
sur un milieu de culture solide de dénombrement de la flore totale en boite de Petri ?
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Question :
1 ml de cet échantillon est ajouté à 9 ml d’eau stérile, puis après homogénéisation 1 ml de
cette dilution est ajouté à 9 ml d ’eau stérile et ainsi de suite. Combien de dilutions
successives faut-il réaliser pour espérer obtenir une trentaine de colonies en étalant 0,1 ml
sur un milieu de culture solide de dénombrement de la flore totale en boite de Petri ?
Réponse :
Dilution Cellules/ml Cellules/0,1 ml
0 3*108 3*107
1 3*107 3*106
2 3*106 3*105
3 3*105 3*104
4 3*104 3*103
5 3*103 3*102
6 3*102 3*101 Il faut donc réaliser 6 dilutions successives
Question :
En sortie d’étuve, on dénombre 7 colonies sur la gélose de la boite de Petri. Quelles
explications proposez-vous pour expliquer ce chiffre plus faible que prévu ?
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Question :
En sortie d’étuve, on dénombre 7 colonies sur la gélose de la boite de Petri.
Quelles explications proposez-vous pour expliquer ce chiffre plus faible que
prévu ?

Réponse :
1) Certaines cellules observées au microscope n ’étaient peut-être pas
 viables ou
 cultivables (état dit « viable non cultivable »)
→ cellules mortes, cellules stressées.
2) Les conditions de culture utilisées (milieu, température, pH,…) n ’étaient pas
forcément adaptées à tous les micro-organismes présents dans l ’échantillon
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32 -Courbe de croissance
Culture en milieu liquide en système fermé = culture en "batch" (=fournée)
Au cours du temps : diminution des concentrations en éléments nutritifs et augmentation des
concentrations en déchets

Courbe de croissance à 90°C de Pyrococcus glycovorans

(archée hyperthermophile)

1,00E+09 6,00
Concentrations (cellules/ml)

Concentrations (mmoles/l)

5,00
1,00E+08
4,00
Cellules
1,00E+07 3,00 Glucose
Acide acétique
2,00
1,00E+06
1,00

1,00E+05 0,00
0 2 4 6 8 10 12 14
Temps (h)
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La croissance d'un micro-organisme est représentée par une courbe log(C(t))=f(t)

On observe usuellement
Logarithme
1) Phase de latence : du nombre
→ synthèse des constituants nécessaires de cellules
à la croissance : ATP, cofacteurs, ribosomes viables
→ synthèse de nouvelles enzymes pour 3
utiliser les constituants du milieu
→ réparation des cellules abîmées 4
→ concentrations non mesurables
NB : repiquage de culture en phase 2
exponentielle ⇒ phase de latence plus courte

2) Phase exponentielle : 1
→ Croissance à vitesse maximale
→ doublement du nombre de cellules
à intervalles de temps réguliers
→ la division des cellules n'est pas synchrone ⇒ croissance régulière
Temps

3) Phase stationnaire :
→ la croissance cesse
→ la pente de la courbe de croissance est nulle
→ usuellement atteinte à 109 cellules/ml pour les bactéries, 106 cellules/ml pour les protozoaires et les algues
→ Conséquence de la limitation en éléments nutritifs, de l'accumulation de déchets toxiques, la détection des
autres cellules (« Quorum sensing »)

4) Phase de mortalité :
→ Diminution des concentrations cellulaires au cours du temps
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Le temps nécessaire au doublement du nombre de cellules en phase exponentielle est le temps de

génération = temps de doublement.

N(t)= N0*2n
avec N0, nombre de cellules initial; N(t), nombre de cellules au temps t; n, nombre de générations
au temps t

⇒ n = [ln(N(t))-ln(N0)]/ln2

⇒ k = n/t = [ln(N(t))-ln(N0)]/[t*ln2]
avec k, constante de vitesse ⇔ nombre de générations par unité de temps

si td est le temps de doublement

alors k = [ln2N0-lnN0]/[ td *ln2] = [ln2]/[ td *ln2] = 1/ td

⇒ td =1/ k

N(t)= N0*2n ⇒ N(t)= N0*2kt ⇒ N(t)/V= N0/V*2kt ⇒ C(t)= C0*2kt

avec V, volume de la culture; C(t), concentration cellulaire au temps t; C0, concentration cellulaire
initiale

⇒ C(t)= C0*eµt
avec µ, taux de croissance instantané et µ=k*ln2

td, le temps de doublement varie selon l’environnement du micro-organisme les valeurs les plus
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Exemple :
t (h) : 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
C(t) (cellules/ml) 10000 20000 40000 80000 160000 320000 640000
ln[C(t)] 9,21 9,90 10,60 11,29 11,98 12,68 13,37

Phase de croissance exponentielle

14,00
ln[Concentrations

13,00 y = 1,3863x + 9,2103

(cellules/ml)]

12,00

11,00

10,00

9,00
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Temps (h)

⇒ µ = 1,3863 et C(0) = 9,21 = ln(10000) or µ = k*ln(2) = ln(2)/td

⇒ td = ln(2)/µ avec ln(2) = 0,6931

⇒ td = 0,6931 / 1,3863 = 0,5 h = 30 minutes

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34 - Influence de l’environnement sur la croissance

Solutés et activité de l’eau

Milieu hypotonique ⇒ turgescence ⇒ risque d’éclatement des cellules

La paroi s'oppose à l’éclatement cellulaire
La concentration osmotique du protoplasme des micro-organismes est supérieure à celle de leur
habitat grâce à des solutés compatibles ⇒ la membrane plasmique est plaquée contre la paroi.
Même à forte concentration, les solutés compatibles n’altèrent pas le métabolisme cellulaire des
micro-organismes.
Chez les bactéries : choline, bétaine, proline, acide glutamique et d’autres acides
Chez les algues et les mycètes : saccharose et polyols (arabitol, glycérol, mannitol).

Milieu hypertonique ⇒ plasmolyse : l’eau sort de la cellule

La disponibilité de l’eau est mesurée par l’activité de l’eau (aw)

aw = Pression de vapeur de la solution / Pression de vapeur de l’eau

Pression osmotique élevée ⇔ aw faible

Addition de sucre ou de sel aux aliments ⇒ diminution de aw

∃ micro-organismes osmotolérants : Staphylococcus aureus par exemple

Beaucoup de mycètes sont osmotolérants ⇒ rôle important dans l’altération des aliments secs ou
salés
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Les halophiles se développent en milieu très salé :

de 2,8 à 6,2 (saturation) M NaCl
⇒ accumulation de K+ intracellulaire de 4 à 7 M

pH

pH=-ln[H3O+], varie de 0 (1 M H3O+) à 14 (10-14 M H3O+)

acidophiles : pH optimum ∈ [1,0 ; 5,5]

neutrophiles : pH optimum ∈ [5,5 ; 8,0]
alcalinophiles : pH optimum ∈ [8,0 ; 11,5] Marais salants

La majorité des micro-organismes connus est neutrophile.

Le pH intracellulaire des micro-organismes est voisin de 7,0.

Les produits du métabolisme ont un effet sur le pH du milieu :

Production d’acides organiques ⇒ diminution du pH
Production d’ammoniaque ⇒ augmentation du pH

Par conséquent, les milieux de culture sont souvent tamponnés

Par exemple, avec le tampon phosphate
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Température

Augmentation de température ⇒ augmentation de l’activité enzymatique, multipliée par 2 tous les

10°C

Augmentation de température
⇒ augmentation de la dénaturation
des protéines
⇒ températures cardinales :
températures minimale, optimale
et maximale

NB : Topt-Tmin>Tmax-Topt

Topt Tmax
Psychrophiles < 15°C < 20°C
Mésophiles autour de 37°C ≤ 45°C
Thermophiles > 60°C
Hyperthermophiles ≥ 80°C

Solfatares islandais : sources chaudes et acides

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Concentration en oxygène

Croissance en présence d’oxygène : aérobiose, aérobie

Croissance en absence d’oxygène : anaérobiose, anaérobie

Les organismes supérieurs sont aérobies obligatoires

(respirent l'oxygène)
Organisme anaérobie facultatif → peut se développer
en absence d’oxygène mais meilleure croissance en aérobiose.
Anaérobies aérotolérants (Enterococcus faecalis, par exemple)
→ croissance identique avec et sans oxygène.
Anaérobies stricts ou obligatoires (Methanococcus, par exemple)
→ meurent en présence d’oxygène
 Micro-aérophiles → endommagés par 20% d’oxygène
(concentration atmosphérique) mais requièrent 2 à 10% d’oxygène

La culture des micro-organismes anaérobies suppose

des équipements spécifiques :
- enceinte anaérobie,
- tubes de Hungate,
- flacons à pénicilline, à sérum,
- jarres.

Enceinte anaérobie utilisée pour l'étude de micro-organismes

anaérobies (atmosphère exempte d'O2 : N2 ou N2/CO2 ou N2/H2/CO2)
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Culture de micro-organismes anaérobies : Culture de micro-organismes anaérobies :

tubes de Hungate et flacons à pénicilline "jarres"

L’oxygène est facilement réduit :

Le radical hydroxyde est un oxydant puissant pouvant détruire les constituants cellulaires

Les aérobies obligatoires et les anaérobies facultatives

ont des enzymes pour lutter
Catalase
Peroxydase
Superoxyde dismutase (SOD) 
Superoxyde réductase

Les anaérobies strictes n’ont pas ces enzymes ⇒ ne tolèrent pas l’oxygène.
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Pression

75% du volume océanique est à une profondeur supérieure à 1000 m

1 atmosphère supplémentaire pour 10 m d'eau
Fosse des Mariannes : 1100 atm, 2 à 3°C
Bactéries barotolérantes : tolèrent l’augmentation de pression hydrostatique
Bactéries barophiles : µ augmente quand la pression hydrostatique augmente

Central composite (Surface Response) Experiment

2 Fact. , 1 Bloc , 11 Obs.; MC Pure Err.=,0288505
Depending Variable : LOG10 (Cell number/ml)

90

80

70

Hydrostatic Pressure (MPa)

60

4,5 50
5
5,5 40
6
30
6,5
7
20
7,5
Effet de la pression et de la température sur le taux de 8
10
croissance de l'archée hyperthermophile Pyrococcus 8,5
9
glycovorans plus
0
70 75 80 85 90 95 100 105 110

Radiations Temperature (°C)

∃ micro-organismes radiorésistants, Deinococcus radiodurans, par exemple.

Le rayonnement UV est bactéricide
La lumière visible à une intensité suffisante est aussi bactéricide.