Formation de l’image

en microscopie optique

Aude Jobart-Malfait
Plateforme de recherche
« Imagerie des processus dynamiques en Biologie Cellulaire
et Biologie du Développement »
IFR 117 – Institut Jacques Monod
Tel: 01 44 27 57 84
jobart@ijm.jussieu.fr
www.ijm.jussieu.fr
Quelques rappels…

La lumière

Optique géométrique

Formation de l’image

La fluorescence
 La nature de la lumière
Aspect ondulatoire Aspect corpusculaire
Huygens, Young Newton, Planck

Lumière = Onde électromagnétique Lumière = Photons

Dualité onde-particule
Einstein, 1906

Énergie transportée par

les photons
E=hxν Fréquence de la
lumière (Hertz)

Constante de Planck
(h = 6.62 x 10-34 J.s)
 Onde électromagnétique

Superposition d’un champ magnétique et d’un champ électrique

oscillants simultanément dans la même direction de propagation

Longueur d’onde (en m) :

Plan de vibration
Trajet parcouru par l'onde pendant
une période

λ =c/ν
C : célérité de la lumière dans le vide
ν: fréquence (nb pertubations en 1s)
λ
E=hxν  λ = (c. h) / E

Longueur d’onde et énergie sont inversement proportionnelles

Plan de vibration :
Plan dans lequel le champ électrique se propage
 Spectre électromagnétique

des rayons γ ….… aux ondes radio

Fortement énergétiques Faiblement énergétiques

Longueurs d’onde du visible : 400nm - 700nm

Du violet … au rouge
 Polarisation de la lumière

polariseurs
Faisceau
non polarisé
Pas de lumière…

Faisceau
polarisé

Lumière non polarisée Plan de vibration aléatoire

Lumière polarisée Un seul plan de vibration

Quelques rappels…

La lumière

Optique géométrique

Formation de l’image

La fluorescence
 Optique géométrique

On considère l’aspect corpusculaire de la lumière uniquement.

Les rayons lumineux sont rectilignes.

Définition d’une lentille convergente :

OF = OF’
F F’
o Axe optique

Foyer objet Foyer image

Les rayons parallèles à l’axe optique coupent celui au point focal F’ de la lentille.
Les rayons passant par le centre de la lentille ne sont pas déviés.
 Formation de l’image d’un objet par
une lentille convergente

3 cas : objet situé sur F, avant F ou après F

1er cas : objet avant F

Plus l’objet sera proche du foyer objet de la lentille et plus l’image sera grande
 Formation de l’image d’un objet par
une lentille convergente
3ème cas : objet entre F et la lentille

Plus l’objet sera proche du foyer objet de la lentille et plus l’image sera grande

2ème cas : objet sur F

Quelques rappels…

La lumière

Optique géométrique

Formation de l’image

La fluorescence
 Formation de l’image

Dualité de la nature de la lumière

Approche géométrique Approche ondulatoire

Réfraction Interférences

Réflexion Diffraction

Diffusion

Absorption
 Réfraction

Indice de réfraction Mesure de la densité optique d’un milieu

n = c/v n≥1 Vide = 1 Air = 1,00029

Eau = 1.33 Verre = 1.5
C : célérité de la lumière dans le vide Glycérol = 1.47 Huile = 1.512
V : vitesse de la lumière dans le milieu traversé

Déviation de la direction de propagation du rayon lors d’un

changement de milieu
Rayon incident
Le faisceau incident va être dévié Angle Rayon réfléchi
d’incidence
selon la loi de Snell-Descartes.
n1
n1.sin i1 = n2.sin i2 n2
Angle de
réfraction

Rayon réfracté
 Angle limite et réflexion totale

Rayon
Rayon à l’interface des 2 milieux
incident
Angle limite
i2 =90°  sin i1=n2/n1 n1
n2
= angle limite de réfraction

Angle incidence > angle limite,

Rayon Angle limite
incident
n1
Pas de réfraction, phénomène n2
de réflexion totale.
 Interférences

2 ondes se rencontrant dans un même point de l’espace et ayant la

même direction de propagation vont pouvoir se composer.

L’onde résultante dépend de

la différence de marche δ.

Nb pair λ Interférences constructives : les amplitudes s’ajoutent

Nb impair λ/2
Interférences destructives : les amplitudes s’annulent

λ/2 < δ < λ  Interférences partiellement destructives

 Diffraction

Lorsque une onde rencontre d’un obstacle ou une ouverture

Principe de Huygens-Fresnel
Chaque point d’ une onde peut être considéré comme
la source d’une nouvelle petite onde (ondelette)

Fentes d’Young (1802)

Interférences entre les ondelettes
 pattern de diffraction
 Diffusion

Déviation du faisceau lumineux dans de multiples directions

Selon la taille des particules par rapport à la longueur d’onde incidente

Diffusion élastique Diffusion inélastique

Pas de changement de fréquence Changement de fréquence
Diffusion Rayleigh, Mie Effet Raman

Si νdiff < ν0 : diffusion Stokes

Augmentation de la longueur d’onde

Si νdiff > ν0 : diffusion anti-Stokes

Diminution de la longueur d’onde
 Absorption

Due à l’absorption de photons lors de la traversée d’un matériau

Absorbance du milieu définie par la

loi de Beer-Lambert :
I0 I
A = DO = log(I0/I) = ε.l.C

C ε : coefficient d’extinction molaire (L mol-1 cm-1)

l l : distance (cm)
C : concentration substance (mol.L-1)

Propriété d’absorption des matériaux permettent de filtrer certaines longueurs d’onde

Lumière
blanche Lumière Filtres de fluorescence
filtrée
Quelques rappels…

La lumière

Optique géométrique

Formation de l’image

La fluorescence
 Qu’est ce que la fluorescence ?

Luminescence Émission d’un rayonnement électromagnétique

Classement en fonction du mode d’excitation

Chaleur Thermoluminescence
Réaction enzymatique Bioluminescence
Réaction chimique Chimiluminescence
Champ électrique Electroluminescence

Fluorescence
Photons Photoluminescence État excité : quelques nanosecondes

Phosphorescence
État excité : quelques secondes
Passage à un état intermédiaire
(état triplet)
 Diagramme de Jablonski

Représente les différents niveaux d’énergie d’une molécule

S1 1 Absorption
CIS Absorption de l’énergie d’un photon (10-15s)
S1’ T1

Absorption 2 Conversion interne

Fluorescence Phosphorescence Relaxation vibrationnelle (10-12-10-10s)

3 Retour à l’état fondamental

S0 Émission d’un photon…

… Ou phénomènes non radiatifs

(quenching, transfert d’énergie,…)

Phénomènes radiatifs
Phénomènes non radiatifs (pas d’émission de photon)

États vibrationnels
 Les différents modes de désexcitation

hν Émission d’un photon

Transfert d’énergie

Conversion interne
Molécule à l’état
excité
Transfert de charge
intramoléculaire
Transfert d’électron
Changement conformationnel
Transfert de proton

Transformation photochimique
 Spectres d’émission et d’excitation

Caractéristiques d’une molécule donnée, dans des conditions données.

S1
S1’ Effet miroir :
image inversée des spectres
d’absorption et d’émission

S0
Décalage de Stokes :
Absorption Émission
déplacement du spectre d’émission vers +
grandes longueurs d’onde
Décalage de Stokes

Overlap :
 nécessité de séparer lumière
d’excitation et d’émission par des filtres

S0  S1 S1’  S0
λem > λex
Eem < Eex
 Caractéristiques de la fluorescence

Nb photons émis
Rendement quantique :
Nb photons absorbés

Rend compte de la compétition entre les phénomènes de désexcitation radiatifs et non radiatifs
Compris entre 0.1 et 1

Coefficient d’extinction (ε) : Probabilité d’absorption d’un photon

Plus ε élevé, plus fluorescence élevée, à intensité incidente et rendement quantique égaux

Durée de vie : Temps moyen qu’une molécule reste à l’état excité

État excité

hν hν Processus radiatifs (émission d’un photon)

État Processus non radiatifs (FRET, quenching, conversion interne…etc)
fondamental
 Durée de vie de fluorescence

A l’échelle d’une population de molécules :

∆t1 ∆t2 ∆t3

temps

hν hν hν

τ =(∆
∆t1+∆
∆t2+∆
∆t3)/3

La durée de vie de la population est la moyenne des durées de vie de toutes les molécules
qui constituent la population.
Log (Nb de molécules)
Nb de molécules

I=I0.e(-t/τ)
k K = constante cinétique du
τ = 1/k
processus de désexcitation
τ = durée de vie

Temps (∆t) Temps (∆t)

 Influence de l’environnement

Potentiel électrique
pH
Viscosité

Polarité

Fluorescence Température
moléculaire

Quenchers
Pression

Ions
Liaisons hydrogènes
 Influence du pH sur la fluorescence

Modification du rendement quantique

Modification des spectres

Décalage du maximum d’émission vers les grandes/courtes
longueurs d’onde

SNARF-1, ex 514nm

Développement de sondes sensibles au pH :

GFP pHluorine

Sankaranarayanan et al., Biophys. J., 2000, 79 : 2199-2208

 Influence des ions sur la fluorescence

Mg2+, Mn2+, Na+, Cl-, K+, ion bromure …

Modifications de l’intensité de fluorescence

Modification des spectres

Décalage vers les grandes / courtes longueurs d’onde

Développement de sondes ratiométriques :

Mesure des concentrations cellulaires en Ca2+, Na+, Cl-, K+, …

Ca2+ K+

Fura-2 SBFI
 Influence de l’environnement

Polarité État excité + stable avec augmentation de la polarité du milieu

Décalage du spectre d’émission vers le rouge
S1
S1’

S0
Absorption Émission
S1
S1’

Quenchers Favorisent transitions non radiatives (O2)

S0
Absorption Émission

Température Augmentation du rendement quantique avec une baisse

de température
 Le microscope optique

Les composants du microscope optique

Trajets optiques en lumière blanche

Trajets optiques en fluorescence

Résolution
 Le microscope optique

Produire une image agrandie de l’objet

Séparer les détails de l’objet

Rendre les détails visibles par l’œil ou le capteur

Image
Image intermédiaire
virtuelle
 Le microscope optique à l’infini

Image
intermédiaire
Image
virtuelle

Insertion d’éléments optiques :

anneaux de phase, prismes de Wollaston, polariseur, filtres de fluorescence…

… Sans modifier la localisation du plan image intermédiaire

Les principaux composants du microscope optique

Lampe

Condenseur
Concentre la lumière sur l’échantillon

Échantillon

Objectif
Produit une image agrandie de l’échantillon

Oculaires
Agrandit l’image produite par l’objectif
 Source lumineuse

Lumière blanche

Lampe halogène,
filament de tungstène

a
 Le diaphragme de champ

Le diaphragme de champ permet d’optimiser la taille de l’illumination

à la taille du champ d’observation.

Son ouverture modifie l’intensité lumineuse mais pas la résolution du

système.
 Le condenseur et le diaphragme d’ouverture

NA 1.2 NA 0.6 NA 0.3 NA 0.15

L’ouverture du diaphragme de condenseur est

responsable de l’angle du cône d’illumination et par
conséquent de l’ouverture numérique du condenseur

La résolution est optimale pour une ouverture du

diaphragme de condenseur de l’ordre de 70%.

90%, NA 0.81 70%, NA 0.54 20%, NA 0.18

L’ouverture du diaphragme ne doit pas servir à modifier l’intensité lumineuse !!!

 Composant majeur : l’objectif

Nom du constructeur
Type d’objectif

Ouverture numérique
Grandissement
Type d’immersion
Type de microscope
Anneau de phase,
prismes de DIC…
Épaisseur lamelle couvre objet

Couleur  grossissement

+ éventuellement bague réglable

Correction épaisseur lamelle
Ouverture numérique variable
Type d’immersion
 L’objectif

Pupille arrière

Série de lentilles conjuguées

Lentille collectrice

Distance de travail
Objet
Distance entre objectif et objet

Lamelle

Profondeur de champ
Épaisseur de l’échantillon dans laquelle Objectif
mise au point réalisable

Ouverture numérique
 Ouverture numérique

NA = LA caractéristique essentielle pour la résolution de l’objectif

Objet

Lamelle
n
NA = n. sin α
α
Lentille
α : demi angle du cône de lumière récupéré par l’objectif
collectrice
n : indice de réfraction du milieu

Profondeur de champ et distance de

travail diminuent lorsque NA augmente
 Objectifs à immersion

Diminuer les différences d’indice des milieux traversés pour

capter davantage de rayons lumineux

Milieux d’immersion : Eau, Huile, Glycérol

(indices proches de celui du verre)
 Aberrations optiques

Chromatiques Sphériques

Axiales Latérales
 Aberrations optiques

Coma Courbure de champ

 Correction des aberrations

Quelques définitions..

Correction Correction Correction

Type
aberration aberration planéité du
d’objectif
sphérique chromatique champ

Achromat 1 couleur 2 couleurs non

Apochromat 3-4 couleurs 4-5 couleurs non

Fluorite 2-3 couleurs 2-3 couleurs non

Plan --- --- oui

Plan-Apo 3-4 couleurs 4-5 couleurs oui

 Le microscope optique

Les différents composants du microscope optique

Trajets optiques en lumière blanche

Trajets optiques en fluorescence

Résolution

Les capteurs
 Microscopie en lumière blanche

Alignement de Köhler (1893)

Centrage des lentilles et diaphragmes du chemin optique

Illumination homogène de l’échantillon

Réglage de l’ouverture du diaphragme de champ

Optimisation de la résolution et du contraste

Réglage de l’ouverture du diaphragme d’ouverture
 Trajets optiques dans l’illumination de Köhler

Cristallin
2 séries de plans focaux conjugués
Oculaires

Chaque point de la source

illumine tous les points de l’objet Objectif

Échantillon
Tous les points de la source
illuminent un point de l’objet Condenseur

Diaphragme d’ouverture

Diaphragme de champ

Illumination homogène de Lentille collectrice

l’échantillon
Lumière blanche
Optimisation de la résolution
et du contraste
Trajet conoscopique Trajet orthoscopique
(Illumination) (Formation de l’image)
 Pourquoi le contraste est-il mauvais en
lumière blanche ?

Lumière diffractée

Lumière directe
La lumière diffractée possède un retard de phase d’ ¼ de longueur d’onde
par rapport à la lumière directe

D : onde diffractée
S : onde directe P=S+D
P : onde résultante

L ’œil humain est sensible uniquement aux différences d’amplitude (intensité)

et pas aux différences de phase.

Les objets transparents présentent peu ou pas de contraste.

 Augmenter le contraste en microscopie
en lumière blanche

En transformant les différences d’indices de réfraction en différences

d’intensité, on augmente le contraste des échantillons transparents.

Contraste de phase
Contraste interférentiel

Zernike, 1934 Nomarski, 1955

Köhler Köhler
+ anneau de phase + polariseur/analyseur
+ diaphragme annulaire + prismes de Wollaston
 Le contraste de phase

Décrit par Fritz Zernike en 1934, prix Nobel en 1953

Technique qui permet d’obtenir des images

contrastées à partir d’échantillon transparents.

Transformer des différences de phase en différences d’intensité

Utilisé pour l’observation de cellules vivantes, micro-organismes, coupes

de tissus, organites cellulaires.
 Trajets optiques en contraste de phase

Diaphragme
d’ouverture
Condenseur Objectif
Diaphragme
de champ Lumière diffractée

Source
Plan de formation
image

Lumière directe

Diaphragme annulaire Anneau de phase

Dans le plan focal objet du condenseur Dans le plan focal arrière de l’objectif
Créé un cône creux de lumière qui Verre transparent 0
illumine l’échantillon
Masque absorbant λ/4
 Principe du contraste de phase positif

Échantillon
0
(Ordre 0)
λ/4

(Diffractés)
λ/4 + λ/4 = λ/2

Diaphragme Anneau
annulaire de phase

Les rayons qui ne traversent pas l’échantillon ne subissent pas de retard de phase
Les rayons qui traversent l’échantillon subissent un retard de phase de λ/4
Les rayons diffractés au passage dans l’échantillon traverseront le masque
absorbant de l’anneau de phase où ils subiront un retard de phase de λ/4.
 Principe du contraste de phase positif

Le centre de la plaque de phase diminue l’amplitude de la lumière directe

de façon à ce qu’elle puisse interférer avec la lumière diffractée et
déphasée par l’objet

Création d’interférences destructives.

Les objets apparaissent en noir sur fond clair
 Images en contraste de phase

Cellules CHO en culture Coupe de rein de souris

Sacharomyces cerevisiae
 Le DIC : Differential Interference Contrast

Les différences de chemin optique sont transformées en

différences d’intensité
n2 : indice réfraction échantillon
OPD : Optical Path Difference
n1 : indice réfraction milieu
OPD = (n2 - n1) x T T : épaisseur de l’échantillon

dOPD
Intensité ~
dX

L’intensité des images de contraste interférentiel est équivalente à la dérivée

première de la différence de chemin optique

Image d’un objet transparent apparaît en « pseudo volume »

Utilisé pour l’observation de cellules vivantes, micro-organismes, coupes de tissus,

organites cellulaires.
 Principe du contraste interférentiel

Polariseur
Polarise la lumière provenant de la source

Prisme de Wollaston
Sépare la lumière provenant de la source en deux faisceaux orthogonaux et très proches

Faisceau Faisceau
ordinaire extraordinaire

Lumière polarisée

Analyseur
Bloque la lumière provenant de la source
Laisse passer uniquement la lumière déviée par l’échantillon
 Trajets optiques en DIC

Oculaires

Sélection des
faisceaux rassemblés Analyseur

Rassemblement 2nd prisme de Wollaston

des 2 faisceaux

Objectif
2 faisceaux séparés et
orthogonaux
Condenseur
Séparation en 2
faisceaux très proches 1er prisme de Wollaston

Polarisation de la
lumière Polariseur

Source lumineuse
 Images en contraste interférentiel

Cellules Hela en culture

Contraste de phase DIC

Cellules 3T3 en culture Cellule Hela en mitose

O.Bregerie, Hôpital Necker
 Le microscope optique

Les différents composants du microscope optique

Trajets optiques en lumière blanche

Trajets optiques en fluorescence

Résolution
 Microscopie de fluorescence

Diffusion, Absorption

Epi-illumination
Nécessité de séparer la lumière
excitatrice de la lumière émise
Filtres

Filtre d’émission
Sélection d’une gamme de longueur d’onde d’émission du
fluorophore Miroir dichroïque

Échantillon

Filtre d’excitation
Sélection d’une gamme de longueur d’onde d’excitation

Miroir dichroïque
Réfléchi la lumière d’excitation
Transmet la lumière émise par le fluorophore
 Les filtres de fluorescence

% transmission % transmission % transmission

Reflect
Pass

λ λ λ λ
Long pass Short pass Band pass Miroir dichroïque
LP 610 SP 560 BP 530/30 DM 460
> 610 nm < 560 nm 530 ± 15 nm

Blocs filtres

Bloc filtre « simple » Bloc filtre « double » Bloc filtre « triple »

 Sources lumineuses en fluorescence
Les lampes à arc

Ampoule contenant un gaz (mercure, xénon) vaporisé par l’arc électrique

Lampe à vapeur de Mercure (Hg) Lampe à vapeur de Xénon (Xe)

 Sources lumineuses en fluorescence
Les LASER

Light Amplified by Stimulated Emission of Radiations

Emission stimulée :
Un photon interagissant avec un
atome retournant à l’état
fondamental produit 2 photons.

Pompage :
La lumière ou l’électricité sont
utilisés pour exciter le milieu
amplificateur

Amplification :
Miroirs aux extrémités dont un
semi transparent Faisceau laser
 Les différents types de LASERs

LASER à gaz Argon, Krypton, Hélium Néon,

Argon ion…

LASER solides Cristal Ti:Sa Cristal dioxide de silicium

(diodes laser)
Accordables en longueur d’onde
(700-1000 nm) 405 nm, 488 nm, 561 nm…

LASER liquides Laser à colorant (Rhodamine, …)

 Images en lumière blanche + fluorescence

Contraste de phase
+
fluorescence

DIC
+
fluorescence
Trajets optiques en lumière blanche

Droit Inversé
Trajets optiques en fluorescence

Droit Inversé
 Le microscope optique

Les différents composants du microscope optique

Trajets optiques en lumière blanche

Trajets optiques en fluorescence

Résolution
 La Point Spread Function (PSF)
Image d’un point à travers un système optique

L’image d’un point n’est pas un point…

PSF en XY
Système optique

A a Tâche d’Airy

Diffraction + interférences  Tâche d’Airy

PSF en XZ
 Acquisition d’une pile d’images

Objet 3D

Pile d’images
Dans chaque plan :
Tâche centrale des points du plan
+ anneaux de diffraction des points situés dans plans supérieurs et inférieurs..

 Flou, diminution du contraste..

Cellule HeLa,
Marquage Tau-GFP + DAPI
 Résolution optique

Plus petite distance entre deux points de même intensité permettant de les discriminer

Critère de Rayleigh :
Tâche d’Airy d’un point coïncide avec la 1ère frange sombre du point adjacent.

Points résolus Points résolus Points non résolus

Critère de Rayleigh

Wide field Confocal

Résolution latérale dxy = 0,61 λ /NA dxy = 0.46 λ /NA + 25 %
Résolution axiale dz = 2 λ n/NA2 dz = 1.4 n λ /NA2 + 30%
Résolution et ouverture numérique

NA=0.7 NA=1.25 NA=1.4

Plus NA importante, plus la tâche d’Airy sera étroite

et meilleure sera la résolution
 Utilité de la PSF

Connaître les déformations optiques du système pour corriger les images

Déconvolution =

Image brute PSF Image déconvoluée

Mesure de la résolution du système

Résolution du système
=
largeur à mi-hauteur

XY XZ

Évaluation de la qualité du système

Défaut d’alignement des optiques

 Mesure de la PSF

Utilisation de billes fluorescentes de diamètre inférieur à la résolution

optique (170nm). (PS-Speck, Molecular Probes-Invitrogen)

Acquisition d’un stack aux résolutions axiale et latérale de l’objectif

Reconstruction des sections XZ

Section XZ

Images XY

Si déconvolution : Mesure à faire dans les mêmes conditions que l’acquisition des images.
 Capteurs

2 types de capteurs utilisés en microscopie :

Point par point Balayage de l’échantillon

Photomultiplicateur

Capteurs plans Matrice de capteurs élémentaires : pixels

Caméras CCD (Charge Coupled Device)
Structure d’un photomultiplicateur (PMT)

Aucune résolution spatiale

Détecte des intensités lumineuses

La position spatiale est

déterminée par la position des
galvanomètres

D’un photon à une avalanche d’électrons

Numérisation
 Structure d’un CCD

Capteur CCD = matrice de cellules photosensibles 1392*1040 pixels

Registre Convertisseur
Photons Électrons analogique/numérique
de lecture

3 types de capteurs selon mode de lecture des charges