Validation Methodes Analytique

UNIVERSITE DE LIEGE UNIVERSITE DE LIEGE
Validation des méthodes analytiques
Cadre réglementaire Textes réglementaires

Normes et recommandations
Ph. Hubert, P. Chiap , J. Crommen

Laboratoire d ’Analyse des Médicaments,
Université de Liège, Belgique
B. Boulanger, W. D e wé
E. Lilly, Centre de recherche, Belgique Lyon Lyon
7 octobre 2003 7 octobre 2003
Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

Université de Liège Université de Liège
Validation Validation
Validation des méthodes analytiques - Historique (USA) Validation des méthodes analytiques - Historique (CEE)
è Pharmacopeial Forum - current concept for the validation è Note explicative CEE (III-844-87, 1989)
of compendial assays (1986 + Current revision)
è Federal Code of Regulations - Guidelines for submitting è Commission SFSTP - Guide de validation des
samples and analytical data for method evaluation (21CFR méthodes analytiques (1992) Protocole
10.90, 1987) expérimental
è Pharmacopeial Forum - Validation of compendial assays -
Guidelines (1988) USP XXI (1989) and XXII (1990) è Groupe d'experts de la Pharmacopée Européenne
è FDA:Center for Drug Evaluation and research - Validation è Directive 2002/657/EC (SANCO) complément à la
of chromatographic methods - Reviewer guidance (1994) directive 96/23/EC au sujet des performances des
méthodes analytiques et à l’interprétation des
è ICH-Q2A / ICH-Q2B : Validation of analytical procedures : résultats (09/2002)
definitions and terminology/ methodology(1995)
è FDA - CDER Draft - Analytical procedure and method è ISO 5725 ...
validation (2000)
Validation Validation
Validation des méthodes Bioanalytiques - Historique Bonnes pratiques de Laboratoire
- Testing laboratory act (Nouvelle Zélande - 1972) – Laboratoire souhaite obtenir un label de qualité, accepté par
-Note explicative de la Commission des CE (1989) tous, garantissant la conformité d'un résultat aux normes
internationales (ISO 17025)
èConférence de Washington (Arlington) (1990)
- Conférence de Barcelone (1992) – Laboratoire doit être capable à tout moment de décrire
- Conférence de Munich (1994) l'obtention d'un résultat et de justifier sa validité (SOP)
- Commission SFSTP (1997) – Les règles de validation sont définies dans les différentes
- Conférence de Washington (2000) directives (Normes, guides, etc.) et doivent donc être
appliquées. Le laboratoire dispose donc d'un "outil " (aussi flou
- AAPS, Indianapolis (2000) soit-il…)
- FDA, Bioanalytical Method Validation (2001)
- Bioval , Londres (02/2002) Harmonisation
1
Validation (Harmonisation) Différents types d ’essai
è Pharmaceutique : ICH (1995)
International Conference on Harmonisation ICH
- Texte ICH (Q2A) : “terminology and definition”
- Texte ICH (Q2B) : “methodology” • Identification

• Essai de pureté
è Autres secteurs : ISO 57025... • Dosage
- Directive 2002/657/EC (SANCO) au sujet des • Dosage pharmaceutique

performances des méthodes analytiques et à
l’interprétation des résultats (09/2002) • Dosage biopharmaceutique
- Guide SFSTP 2003 (Harmonisation)

Différents types d ’essai Critères de validation (ICH)

Type de tests Dosage Impuretés Identification Dosage
Essai d ’identification Caract éristiques bioanalyse
Quantitatif Essais limites
Essai de Pureté Exactitude

Identification
Les identifications ont pour objet de Dosage
confirmer Fidélité
Pureté à analyser contenue
l’identité d’une substance répétabilité
dans un échantillon. Fidélité
Les essais de pureté peuvent être soit: fidélité intermédiaire
Cet objectif est généralement Dosage
• Essais quantitatifs;
réalisé par
• Essais limites. Spécificité
comparaison de l’échantillon et d’un matériel de Sélectivité
• Pharmaceutique
référence pour une certaine propriété (ex: temps
L’essai doit refléter avec exactitudeles
• Biopharmaceutique Limite de
de rétention, spectre, etc).
caractéristiques de pureté de l’échantillon. détection
A pour objet de mesurer la quantité de substance Limite de
Les critères de validation sont différents
à analyser contenue selon
dans un échantillon donné. quantification
le cas.
Laboratoired ’ Analyse des Médicaments Linéarité Fonction de
Université de Liège
réponse
Les critères de validation sont différents selon le
cas. Laboratoired ’ Analyse des Médicaments
Intervalle de
Université de Liège mesure
Robustesse
Laboratoired ’ Analyse des Médicaments

Validation des méthodes analytiques

UNIVERSITE DE LIEGE
CRITERES DE VALIDATION
• Critères usuels
– Spécificité-Sélectivité
Critères de validation – Fonction de réponse
– Linéarité
– Intervalle de mesure
– Exactitude
– Fidélité (répétabilité, fidélité intermédiaire)
– Seuil de quantification
Lyon – Seuil de détection
7 octobre 2003

2
Linéarité Fonction de réponse
Linéarité (ICH - PE)
La linéarité d’une procédure analytique est sa capacité, à La fonction de réponse traduit à l'intérieur de l'intervalle de
l'intérieur de l'intervalle de dosage, à fournir des résultats dosage, la relation existant entre la réponse et la
directement proportionnels à la concentration (quantité) en concentration en substance à examiner dans l'échantillon.
substance présente dans l'échantillon.
Fonction linéaire Fonction non-linéaire

Linéarité requise
è Concentration
Résultats
Réponse
= quantité introduite
Réponse
è Résultat
Concentration = quantité mesurée
Concentration Concentration
Linéarité
Linéarité Linéarité
ICH - Confusion !
ICH
“La linéarité peut être évaluée par un examen

visuel du graphique des réponses en fonction de
“La linéarité doit être établie sur tout l’intervalle de la concentration…….”
mesure.”
Il peut être nécessaire dans certains cas, pour
“Il faut analyser les résultats par des méthodes obtenir une relation linéaire entre les résultats
statistiques appropriées” du dosage et la concentration, d’appliquer une
transformation mathématique aux résultats
“Possibilité dans certains cas d’appliquer une d’essai avant d’effectuer l’analyse de régression”
transformation mathématique”
(???… !!!).
Fonction de réponse - Linéarité Exactitude
Fonction de réponse
Exactitude (ICH - PE)
La fonction de réponse Linéarité
d'une procédure • L’exactitude d’une procédure analytique exprime
d'analyse traduit, à l'intérieur de l’intervalle l’étroitesse de l'accord entre la valeur acceptée comme
de dosage, la relation existant entre la
réponse (signal) et la concentration conventionnellement vraie, ou comme valeur de
(quantité) en substanceLa linéarité d’une
à examiner dans procédure analytique est référence, et la valeur trouvée (= valeur moyenne
sa capacité, à l'intérieur de l'intervalle de
l'échantillon. obtenue en appliquant la procédure d'analyse un
dosage, à fournir des résultats directement
proportionnels à la concentration certain nombre de fois).
La fonction de réponse monotone la plus
(quantité ) en substance présente dans
simple qui exprime cette relation est
l'échantillon.
appelée courbe de calibration.
è Indication sur les erreurs systématiques
Laboratoire d’ Analyse des Médicaments
ISO : JUSTESSE
Laboratoire d’ Analyse des Médicaments

3
Fidélité Exactitude - Fidélité - Justesse ?
Fidélité (ICH - PE)

• La fidélité d’une procédure analytique exprime Erreur Totale = Biais + Ecart-Type
STAT.
l’étroitesse de l'accord (mesure de la dispersion) entre Erreur Totale = Erreur systématique + Erreur aléatoire
une série de mesures obtenue à partir de plusieurs
prises d’essai d’un même échantillon homogène, dans
les conditions prescrites. ISO Exactitude = Justesse + Fidélité
è Indication sur les erreurs aléatoires

ICH Exactitude ? = Exactitude + Fidélité
è 3 niveaux : - Répétabilité
- Fidélité intermédiaire
- Reproductibilité
Fidélité - Justesse - Exactitude

Fidélité UNIVERSITE DE LIEGE
Fidélité (ISO) Justesse

La fidélité exprime l’étroitesse de l’accord (degré
de dispersion, coefficient de variation)
Justesse (ISO)
Exactitude
entre une
série de mesures provenant de multiples prises
La justesse exprime l’étroitesse de l'accord entre
d’un même échantillon
d’essais indépendants
prescrites.
homogène
la valeur
) dansmoyenne
(résultats
obtenue à partir d'une série
des conditions
Exactitude (ISO)
de résultats d'essais et la valeur de référence
• Etroitesse
Erreur totale
qui est acceptée soit comme unedevaleur
l'accord entre le résultat d'essai et
è Indication sur les erreurs
conventionnellement
aléatoires la valeur
vraie, soit de référence
comme acceptée .
une valeur
è 3 niveaux : - Répétabilité
de référence acceptée
(intra-laboratoire)Le(ex
terme
: standard
“exactitude”,
international,
appliqué à un ensemble de
standard
- Fidélité d'une (intra
intermédiaire pharmacopée).
-laboratoire)
résultats d'essai, implique une combinaison de
composantes aléatoires et d'une erreur
- Reproductibilité (inter-laboratoire)
è Indication sur lessystématique commune ou d'une composante de
erreurs systématiques
biais.
è Indication sur l ’erreur totale

Laboratoired ’ Analyse des Médicaments Lyon

7 octobre 2003

Types d’erreurs Routine -Validation- Erreurs

Un résultat analytique n’est jamais parfait Systématique
Il est toujours entach é d’ une certaine erreur. Biais (mesure)
Validation
Justesse (Notion)
Nombre restreint d’expériences.
Aléatoire
Conditions de simulation (l’inconnu est « connu »).
Précision
Répétabilité Décomposition des erreurs possible (aléatoire et systématique)
Fidélité intermédiaire
(Reproductibilité)
En routine
En routine Nombre encore plus restreint d’expériences.
Inconnu ? Conditions réelle (l’inconnu est un vrai « inconnu »).
Décomposition des erreurs impossible (aléatoire et
systématique)
è l’erreur réalisée sur l’inconnu est une erreur totale

4
Pourquoi utiliser l’erreur totale ?
UNIVERSITE DE LIEGE
Erreur totale
Limites d’acceptations
• Objectif de la méthode
• Objectif de la validation
• Minimiser le risque en routine
Lyon
7 octobre 2003

Limites d’acceptation Limites d’acceptation

Recommandations (“Acceptable methods”, Heath Protection
Pharmaceutique Branch, Canada, 1992):
– Fidélité (n = 6):
Matière première: de 99 - 101% à 97 - 103%. - CV = max 1% (matière première);
- CV = max 2% (spécialité pharmaceutique);
Spécialité pharmaceutique: 95 - 105 % . - CV = max 5% (impuretés à 0,2%, n = 6);
- CV = ± 10% (limite de quantification, n = 6).
– Exactitude (min n = 3):

Attention: pour l’ensemble des erreurs - biais = max 1% (matière première);
(Erreur totale = E. systématique + E. aléatoire). - biais = max 2% (spécialité pharmaceutique);
- une exactitude plus faible peut être justifiée.

Limites d’acceptation Limites d’acceptation (EC-SANCO)

Bio-Pharmaceutique Résidus dans les produits d ’origine animale
Justesse d’une méthode quantitative

• Démontrer la sélectivité avec 6 sources
indépendantes de la même matrice Fraction pondérale Biais
≤ 1 µg /kg - 50% à + 20% (-15% ± 35%)

• La relation la plus simple entre la réponse et la
concentration doit être établie et démontrée (k=6) > 1 µg /kg à 10 µg /kg - 30% à + 10% ( -10% ± 20 %)
≥ 10 µg /kg (0,01 ppm) - 20% à + 10% ( -5% ± 15%)

%
• Exactitude: ± 15% et ± 20% à la LOQ +20
0
• Fidélité: maximum 15%, 20% à la LOQ
Attention: idéalement sur l’ensemble des erreurs -50

Conc
(Erreur totale = E. systématique + E. aléatoire).
5
Limites d’acceptation (EC-SANCO)
Résidus dans les produits d ’origine animale UNIVERSITE DE LIEGE
Fidélité (précision) d’une méthode quantitative

Le CV de fidélité inter-laboratoires ne doit pas dépasser
le niveau donné par l ’équation d ’HORWITZ:
Harmonisation ?
CV = 2 (1 - 0,5 log C)
C = fraction pondérale en puissance de 10 (ex: 1 mg/g = 10 -3)
Fraction pondérale CV %
100 µg / kg (0,1 ppm) 23 %
1000 µg / kg (1 ppm) 16 % Lyon

7 octobre 2003

Harmonisation ? Solutions
è Souhaitable è Harmoniser les définitions (ISO)

l Qualité (procédure unique)
è Recadrer les objectifs d ’une
procédure et de sa validation
è Généralisation de la démarche
l indépendante du secteur d ’activité è Utiliser l’erreur totale
l indépendante de la procédure è Dissocier outils de décision (profil
l indépendante de la matrice d ’exactitude) et de diagnostique
(statistique)
è Simplification de la démarche è Intégrer la validation comme un
l outil statistique
élément du cycle de vie d ’une
l outil de décision procédure analytique

1. Harmonisation des critères 1. Harmonisation des critères

Linéarité / Fonction de réponse
Critères de Validation Critères de Validation Linéarité requise Linéarité non requise

• spécificité • spécificité
Résultat
Réponse
• fonction de réponse • fonction de réponse

• linéarité • linéarité
• Justesse • Justesse
• exactitude • exactitude Concentration Concentration
• fidélité • fidélité Linéarité Fonction de réponse
• limite de détection • limite de détection
• limite de quantification • limite de quantification Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments
• autres ... • autres ...

6
1. Harmonisation des critères 2. Objectifs
Objectif d’une procédure
analytique est de pouvoir quantifier
Critères de Validation
le plus exactement possible
chacune des quantités inconnues
xi ↔ µT
• spécificité
• fonction de réponse que la laboratoire aura à analyser
• linéarité
Exactitude - Fidélité - Justesse
• Justesse Objectif de le la validation est de
• exactitude
• fidélité donner des garanties suffisantes
• limite de détection STAT. Erreur Totale = Biais + Ecart-Type que chacune de ces mesures qui
xi − µT < λ
Erreur Totale = E. systématique + E. aléatoire
• limite de quantification seront réalisées en routine avec
• autres ... ISO Exactitude = Justesse + Fidélité
cette méthode seront
suffisamment proches de la
λ = limite d ’acceptation
ICH Exactitude ? = Exactitude + Fidélité
"vérité".
Minimiser les risques du
Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments
producteur et du consommateur
3. Erreur totale 4. Outil de décision : Profil d’exactitude

Expériences de Validation
Erreur totale permet
• d ’être en accord avec les définitions Biais Biais + Variance Erreur totale
• d ’appréhender la notion d’incertitude (ISO 17025) 5 +λ

Intervalle de
• d ’expliquer les limites d’acceptations (intuitives) % 0 Biais = 0 confiance
• de répondre aux objectifs de la méthode et de sa bilatéral à 90%
validation -5 -λ
• de minimiser le risque Risque α = 5%
Conc
• de répondre aux contraintes de la routine
Ex: spécialité pharmaceutique: λ = ± 5% (95 - 105%)

5. Validation / Cycle de vie

Validation Optimisation
• Elément du cycle de
vie d’une procédure
(plans d ’expériences)
Prévalidation
Validation des procédures
analytique
DEVELOPPEMENT (cf. protocole)
analytiques quantitatives
SELECTION VALIDATION
• Etape ultime avant la
mise en exploitation
de la procédure
ROUTINE
Reproductibilité
Transfert
Harmonisation des dé marches
è « estimateurs » Validation en routine
en accord avec cette Validation partielle

de validation
routine
STP Pharma Pratiques

è Mode opératoire utilisé en routine Volume 13 – N°3 – mai/juin 2003
è Standards de validation indépendants Lyon
7 octobre 2003

7
Démarche de Validation - PV PV – Niveaux de concentrations
PROTOCOLE
Connaissance Oui
Connaissance
antérieure de la Non
Standards
Niveaux de V1 V2 V3 V4 V5
antérieure ? procédure de dosage? concentration
Bas 2 2
Effet de Prévalidation Effet de la
matrice? Non
Pré- validation
SE. Etalonnage
Médian 2 (2)
(2)
2 (2)
(2)
Effet de Matrice ?
Oui
Possible
Non
sans la matrice
Haut (2) (1) 2 (2) (1) 2
Etalonnage à un
et connu ?
matrice Bas 2 2
connu ? seul niveau de Non
Etalonnage à
niveau de
concentration
un
?
Oui SE. Etalonnage Médian 2 (2)
(2)
(2)
(2)
concentration avec la matrice Haut (2) (1) 2 2

Protocole Protocole Protocole Additionnel (2) (3)
PV5 Etalonnage à unPV2 PV1
Protocole V5 Protocole V2 Protocole V1
Bas 3 3 3 3 3
SV. Validation
Etalonnage à un
avec la matrice Médian 3 3 3 3 3

seul niveau de Non niveau de
concentration ?
Oui
Haut 3 3 3 3 3
concentration
Protocole Protocole Nombre minimum de séries 3 3 3 3 3
Protocole V4 Protocole V3 Nombre total d’essais (minimum) 33 45 39 63 45
PV4 PV3 (1)
: sélection d’un niveau de concentration supérieure à la concentration cible pour l’étalonnage (ex:
Tester des modèles de régression à Justesse et fidélité

Tester les modèles de régression sélectionnés (SE) et estimer la justesse et la fidélité par niveau de concentration (SV)
120 % de la concentration cible).
(2)
: suppression possible du niveau de concentration médian pour l’étalonnage sur la base du modèle
de régression retenu pour exprimer la fonction de réponse (ex : modèle plus simple comme le
modèle mathématique des moindres carrés). Dans ce cas, le nombre total est de 39 essais pour
Construction des profils d’exactitude correspondants Construire et analyser les profils d'exactitudes obtenus
les protocoles V2 (sans matrice) et V5 (avec la matrice). Le nombre d’essais est de 51 pour le
protocole V4.
(3)
: addition d’un niveau de concentration supplémentaire pour une fonction de réponse nécessitant
Sélection du profil qui répond à l’objectif Sélectionner le profil répondant à l’objectif de la procédure
un modèle plus complexe (ex: fonction logistique à 4 paramètres).

Protocole de validation PV 1 Protocole de validation : PV 2

Série
Série 1 Série
Série 22 Série
Série 33
Série
Série 1 Série
Série 22 Série
Série 33
R
Standards de
Standards R
calibration
d’étalonnage Standards de
Standards
calibration
d’étalonnage
( ) ( ) ( )
Standards de
(1) validation Standards de
validation
(1)
Conc
Conc
(1) : standards de validation supplémentaires (Linéarité ICH)

Protocole de validation : PV 3 Exemple 1

Regression linéaire Regression quadratique
Série 1 Série 2 Série 3
Standards
R d’étalonnage Calibration
sans matrice
sans
Standards matrice
d’étalonnage
avec matrice
Standards de Calibration
validation
avec
matrice
Conc

8
Exemple 2 Exemple 3
A B
Profil d’exactitude : choix de la calibration A B
20 20
Sorbate Sorbate
15 15
10 10
C D
5 5
Biais (%)
Biais (%)
0 0
-5 -5
-10 -10
C D
-15 -15
-20 -20
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
Concentration (%) Concentration (%)

A : fonction quadratique ;
Limites d'acceptation (à 15%) Biais (%) Limites d'acceptation (à 15%) Biais (%)
B : fonction lin éaire pondérée (facteur de pondération : 1/x2 )
Intervalle de confiance Limites d'acceptation (à 10%) Intervalle de confiance Limites d'acceptation (à 10%)
C : fonction lin éaire ;

Droite de calibration établie à partir Une solution de référence D : fonction lin éaire passant par l ’origine ;
des solutions de référence à 100 %
Exemple 4 – LOQ
Linéaire Transformation Log
Linéaire pondéré Quadratique
Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments


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Cadre réglementaire Textes réglementaires

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Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

- Texte ICH (Q2B) : “methodology” • Identification

è Autres secteurs : ISO 57025... • Dosage

- Directive 2002/657/EC (SANCO) au sujet des • Dosage pharmaceutique

- Guide SFSTP 2003 (Harmonisation)

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

Différents types d ’essai Critères de validation (ICH)

Essai de Pureté Exactitude

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Validation des méthodes analytiques

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

Fonction linéaire Fonction non-linéaire

“La linéarité peut être évaluée par un examen

Fonction de réponse - Linéarité Exactitude

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

Fidélité (ICH - PE)

è Indication sur les erreurs aléatoires

Fidélité - Justesse - Exactitude

Fidélité (ISO) Justesse

è Indication sur l ’erreur totale

Laboratoired ’ Analyse des Médicaments Lyon

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

Types d’erreurs Routine -Validation- Erreurs

è l’erreur réalisée sur l’inconnu est une erreur totale

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

Limites d’acceptation Limites d’acceptation

– Exactitude (min n = 3):

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

Limites d’acceptation Limites d’acceptation (EC-SANCO)

Justesse d’une méthode quantitative

≤ 1 µg /kg - 50% à + 20% (-15% ± 35%)

≥ 10 µg /kg (0,01 ppm) - 20% à + 10% ( -5% ± 15%)

Attention: idéalement sur l’ensemble des erreurs -50

Fidélité (précision) d’une méthode quantitative

C = fraction pondérale en puissance de 10 (ex: 1 mg/g = 10 -3)

100 µg / kg (0,1 ppm) 23 %

1000 µg / kg (1 ppm) 16 % Lyon

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

è Souhaitable è Harmoniser les définitions (ISO)

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

1. Harmonisation des critères 1. Harmonisation des critères

Critères de Validation Critères de Validation Linéarité requise Linéarité non requise

• fonction de réponse • fonction de réponse

• autres ... • autres ...

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

3. Erreur totale 4. Outil de décision : Profil d’exactitude

• d ’appréhender la notion d’incertitude (ISO 17025) 5 +λ

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

5. Validation / Cycle de vie

en accord avec cette Validation partielle

STP Pharma Pratiques

Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments Laboratoire d ’ Analyse des Médicaments

concentration avec la matrice Haut (2) (1) 2 2

avec la matrice Médian 3 3 3 3 3