COURS Part 4 EST FBS 2020

Ecole Supérieur de
Technologie de Fkih
Ben Salah
Microbiologie générale
Filière Industrie Agroalimentaire
Pr. HAMDALI Hanane
18/03/2020 1
Plan
I – Généralités sur la microbiologie alimentaire
II - Prélèvement et préparation des échantillons
1 - Prélèvements
a) Echantillonnage
1) Normes d’échantillonnage
2) Méthode d’échantillonnage
3) Choix des échantillons
b) Fréquence des prélèvements
c) Conditions du prélèvement
1) Prélèvement en surface
2) Prélèvement de produits liquides
3) Prélèvement de produits solides
2 - Traitement de l’échantillon
a) Transfert au laboratoire
b) Préparation de l’échantillon
c) Les techniques de broyages
3- Les voies de bio contamination et techniques d’asepsie
III- Les milieux de culture

 Composition et classification
 Critères de choix des milieux de cultures
 Principes des réactions révélés par les milieux les plus utilisés
 Préparations et conservation
IV-GERMES IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

16/03/2020 2
V- PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET DE NUMERATION DES
MICROORGANISMES DANS LES ALIMENTS
Contamination des produits dans l’industrie alimentaire
 La contamination est le terme médical utilisé pour

désigner l'envahissement d'un aliment par des micro-
organismes pathogènes.
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 Les causes de contamination sont divisées en 5

groupes:
 1- Contamination liée au matériel , aux équipements.
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groupes:
 2- Contamination liée à la méthode.

La méthode idéale permet :
 d’éviter les apports microbiens

 d’éviter la multiplication bactérienne
 D’éliminer la flore bactérienne existante
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groupes:
 3- Contamination liée à la matière.
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groupes:
 4- Contamination liée au milieu.
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groupes:
 5- Contamination liée à la main d’œuvre.

Le personnel est le maillon faible de
la maitrise de l’hygiène :
il contrôle les matières premières, il
nettoie le matériel, il fait les
méthodes…
Il est la source majeure des germes
donc le personnel en industrie agro-
alimentaire doit respecter les bonnes
pratiques d’hygiène et être en bonne
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santé.
La maîtrise de la qualité microbiologique
Hygiénique Marchande
Fabricant
Obligatoire Souhaitée
consommateur
La maîtrise de la qualité microbiologique passe par un ensemble de

démarches qui vont du contrôle des matières premières brutes, en
cours de transformation ou de l’aliment fini, aux pratiques de bonnes
fabrications en passant par l’identification des principaux points
critiques du système de production / distribution, le plus souvent par
une démarche HACCP.
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Ces analyses microbiologiques prennent aujourd’hui

largement place dans la plupart des usines et des
réseaux de distribution et permettent:
 une bonne évaluation de la qualité et une mise en

évidence d’éventuelles contaminations
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L’analyse microbiologique traditionnelle des produits

finis reste encore indispensable car elle permet avec
une certaine inertie d’éviter, dans le cas où des produits
dangereux ou non conformes seraient fabriqués, leur
commercialisation ou leur consommation.
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Ce type de contrôle souvent pratiqué par des

laboratoires officiels (Direction Générale de la
Concurrence, de la Consommation et de la Répression
des Fraudes « DGCCRF », Laboratoires des Services
Vétérinaires, etc.) n’est pas préventif et ne permet pas
de maîtriser la qualité microbiologique des produits
fabriqués.
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 Le contrôle microbiologique de routine d’un produit alimentaire

solide ou liquide consiste le plus souvent, en absence d’information
sur l’éventuelle implication de ce produit à une maladie infectieuse,
une toxi-infection ou une intoxication, en :
- un contrôle de stérilité pour des produits soumis à des

traitements antimicrobiens de stabilisation (température, additifs,
etc.)
- une estimation du nombre des contaminants (flore aérobie
mésophile totale, coliformes, anaérobies sulfito-réducteurs) ou leur
détection - identification (Salmonella, Listeria etc).
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 Ce contrôle est actuellement long (plusieurs jours), ce qui implique

souvent :
- de stocker le produit en attendant la réponse (impossible pour les

produits très périssables)
- de diffuser le produit sans connaître sa qualité bactériologique avec

tous les risques que cela comporte.
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Les risques au laboratoire de Microbiologie
Les risques liés à la manipulation de

microorganismes, dont l’identité et le
pouvoir pathogène sont souvent inconnus
dans les premières étapes de leur analyse
doivent être parfaitement maîtrisés par des
pratiques et un environnement sans
défaut.
Il faut que le microbiologiste soit toujours conscient des risques liés à la manipulation
de bactéries et à un degré moindre de levures et moisissures, en particulier après
leur amplification nécessaire à leur étude.
Rappelons qu’une colonie est constituée d’environ 109 à 1010 cellules.
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 La maîtrise du risque microbiologique passe par la parfaite

connaissance :
- des germes manipulés ou recherchés

- des voies de “pénétration” de ces germes dans l’organisme
- des meilleures méthodes de manipulation pour minimiser
ce risque.
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 Les microorganismes sont classés en 4 groupes en fonction des risques

potentiels qu’ils représentent.
Le groupe 1: microorganismes peu dangereux pour le microbiologiste et

son environnement.
Le groupe 2: germes faisant courir des risques modérés aux manipulateurs

et des risques limités à la communauté.
Le groupe 3: microorganismes à haut risque pour le manipulateur et à

risque modéré pour la communauté.
Le groupe 4: microorganismes très dangereux pour le manipulateur et son

environnement.
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 Les voies de l’infection sont essentiellement :
- buccale (ingestion) : pipetage, porté à la bouche des doigts ou d’objets contaminés

comme des cigarettes, des stylos, des aliments etc. Ce type de contamination résulte
d’un travail “aseptique” incorrect ou encore de projections, renversements ou actions
diverses non contrôlés.
- aérienne par des aérosols (particules liquides ou non en suspension dans l’air et
porteuses de germes). Ces aérosols peuvent être générés par des opérations
classiques (homogénéisateur, centrifugeuse, etc.) et leur pouvoir de contamination
est très grand.
- par contact cutané (Brucella, Staphylococcus ou encore Pseudomonas par

exemple) ou au niveau de muqueuses ou d’organes comme les yeux.
- par pénétration sous-cutanée accidentelle (par piqûre ou au niveau d’une plaie).

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 Le laboratoire d’analyse microbiologique doit être à même de réaliser des
analyses de routine (contrôle de qualité par rapport à une norme, évaluation
de la qualité des matières premières), mais aussi de permettre l’évaluation
de la qualité des opérations de transformation ou de préparation, la
recherche et maîtrise des éventuels points critiques (HACCP), l’évaluation de
l’efficacité des traitements antimicrobiens de conservation, d’emballage ou de
nettoyage etc.
 Les microorganismes susceptibles d’être rencontrés appartiennent pour la

plupart aux groupes 1, 2 et éventuellement 3.
 Ceci impose donc des règles fondamentales de conception et de

fonctionnement du laboratoire d’analyse microbiologique.
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A- Généralités
L’eau, les matières premières et bon nombre de denrées alimentaires

ne sont pas, à quelques exceptions près comme le lait stérilisé, les
conserves par exemple, des produits stériles.
La qualité marchande des produits dépend beaucoup du “contrôle “ de

la flore présente par des moyens physiques (température, pH,
activité de l’eau par exemple) ou chimiques (additifs à effets
antimicrobiens) et par des règles de “bonne fabrication”.
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A- Généralités
 Les spécifications microbiologiques sont des critères applicables
pendant et après la préparation afin de s’assurer que l’hygiène et les
conditions de production sont satisfaisantes et en accord avec la
règlementation.
 Les normes sont des spécifications microbiologiques adoptées par la

législation qui s’adressent au produit fini et fixent les limites acceptables de
présence de microorganismes donnés dans des produits bien définis.
Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux

(OMS, FAO, ISO, AFNOR, DGCCRF, services vétérinaires, etc.) qui se
préoccupent de l’établissement de critères de qualité microbiologique de
nos aliments.
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A- Généralités
 La qualité hygiénique dépend surtout de la nature mais aussi du

nombre de la flore microbienne présente dans le produit.
 Si cette flore est composée de microorganismes susceptibles

d’engendrer des maladies après consommation (maladies
infectieuses, toxi-infections, intoxications) le produit est dangereux
et ne doit en aucun cas être commercialisé.
 Il appartient alors au microbiologiste de détecter le ou les points

critiques affectant cette qualité hygiénique pour laquelle la norme
zéro défaut doit être un objectif prioritaire de l’ensemble du système
de production.
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A- Généralités
Les microbes recherchés en alimentaire
Au laboratoire, on recherche 4 types de germes qui sont cultivés dans

des boîtes de pétri et identifiés par des techniques de colorimétrie.
1- Microorganismes capables d’altérer la qualité marchande de

l’aliment (La Flore totale ou Microorganismes Aérobies à 30°C)
Ils renseignent sur: - La propreté des manipulations
- Les conditions de conservation
- La fraîcheur du produit
- L’efficacité des procédés de traitement
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A- Généralités
2- Les indicateurs technologiques (Les Coliformes à 30°C)
Ce sont des entérobactéries, c-à-d qu’elles vivent dans les intestins des
animaux et de l’homme.
On retrouve également dans le milieu extérieur (eau, sol, végétaux, poils,
plumes).
Ils renseignent sur: - La propreté des manipulations

- L’efficacité des procédés de traitement
(Pasteurisation)
- La propreté des locaux et du matériel
Sensibles à la chaleur, leur présence dans les aliments cuits indique une
contamination après traitement thermique.
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A- Généralités
3- Les bactéries témoins de contamination fécale (Les coliformes thermo
tolérants à 44°C)
Ils sont d’origine fécale, humaine ou animale, et témoignent d’un non respect
des règles d’hygiène (Indicateurs d’hygiène).
Ils renseignent sur: - L’hygiène du personnel (mains sales)

- La propreté des locaux et du matériel
Leur présence implique le risque que des bactéries pathogènes, qui partagent
le même environnement, soient également présentes dans l’aliment
(=Salmonelles)
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A- Généralités
4- Les germes potentiellement pathogènes: Responsables de TIAC (Toxi-

infection Alimentaire Collective) pouvant entraîner la mort.
Les Staphylocoques Aureus
Les Clostridium perfringens
Les Salmonelles
Les Listéria monocytogenes
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Streptococcus Treponema Vibrio cholerae
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Figure : Exemples de formes de microrganismes couramment
rencontrées dans la nature
1- Prélèvements
Très schématiquement, la taille de l’échantillon d’un produit de même

nature réparti en portions unitaires doit être au moins de 5 unités (lieu
de fabrication ou de distribution), de 5 unités pour les conserves.
Le laboratoire doit disposer d’environ 500 g de produits, soit 5 fois 100

g, ces 100 g pouvant être fournis par une ou plusieurs pièces.
Si le prélèvement de 5 échantillons s’avère trop élevé par rapport à la

production, il est procédé à un étalement dans le temps des
prélèvements.
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1- Prélèvements
Ces prélèvements doivent avant tout respecter des règles d’aseptie et de

représentativité.
La prise d’essai destinée à la préparation de la suspension mère et de ses

dilutions doit correspondre aux parties superficielles et profondes
notamment pour les produits en tranche, hachés, divisés et les plats
cuisinés par exemple.
²Pour les produits liquides, elle est effectuée sur le produit
“homogénéisé” ou sur les parties superficielles et profondes.
Dans le cas d’examens microbiologiques faisant suite à une maladie

de type TIA, il faut rechercher les germes dangereux (pathogènes,
toxinogènes) et leurs toxines aussi bien dans les prélèvements de
surface que dans la masse.
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1- Prélèvements
a- Echantillonnage
 Il s’agit là d’une étape fondamentale souvent délicate.
 Les ouvrages consacrés à l’échantillonnage sont nombreux et

des règles précises par produit ou milieu ont été édictés par
l’AFNOR et la DGCCRF; si les échantillons ne sont pas
correctement prélevés et manipulés ou ne sont pas représentatifs
d’un lot ou d’une production, les résultats d’analyse n’auront
aucune signification.
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1- Prélèvements
a- Echantillonnage
 Un échantillonnage représentatif est essentiel quand l’analyse a

pour but de détecter la présence de germes pathogènes ou de
toxines qui peuvent être distribués de façon hétérogènes dans
l’aliment ou quand la commercialisation d’un produit dépend de la
qualité microbiologique en relation avec les normes imposées par
la législation.
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 Une nouvelle norme ISO pour renforcer la sécurité sanitaire des aliments
(ISO 2007-09-12)
Des accidents récents en matière de sécurité des aliments, les conséquences

importantes sur la santé et les retraits du marché de certains produits
alimentaires assignent les pays à renforcer leurs systèmes de sécurité
sanitaire et à se montrer plus vigilants à l’égard des producteurs de denrées
alimentaires et de ceux qui en font le commerce.
 L'objet de la Norme internationale ISO 7218:2007, Microbiologie des

aliments – Exigences générales et recommandations, est d'aider à
garantir la fiabilité des analyses microbiologiques des aliments, à s'assurer
que les méthodes générales utilisées pour effectuer ces examens sont au
minimum les mêmes dans tous les laboratoires, à participer ainsi à
l'obtention de résultats homogènes dans les différents laboratoires et à
contribuer à la sécurité du personnel de laboratoire, en prévenant les
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risques d'infection.
1- Prélèvements
a- Echantillonnage
1) Méthode d’échantillonnage préconisée par l’ICMSF
(International Commission on Microbiological Specifications for
Foods)
 La Commission Internationale des Normes Microbiologiques

relatives aux denrées alimentaires a défini des méthodes
d’échantillonnage pour l’analyse systématique des produits
alimentaires.
 Le principe de base est le suivant : un échantillon analysé donne

des résultats non satisfaisants s’il renferme des
microorganismes dangereux ou s’il contient des germes en
nombre supérieur à une limite au-delà de laquelle il devient
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potentiellement dangereux.
1- Prélèvements
a- Echantillonnage
(International Commission on Microbiological Specifications for
Foods)
 Dans cette méthode le symbole m représente la limite permettant de
répartir les échantillons en 2 groupes: les acceptables (valeur m) et
les inacceptables (valeur M). Pour certains microorganismes
dangereux m peut être égal à 0.
 Quand un microorganisme donné est toléré dans un aliment 3
catégories d’échantillons sont définies:
- catégorie 1 (acceptables sans réserve)
- catégorie 2 (acceptables mais avec une limite)
- catégorie 3 (inacceptables).
m sépare la 1ère et la 2ème catégories et M la 2ème et la 3ème
(figure 1).
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(Internation Commission on Microbiological Specifications for Foods)
Figure 1: Distribution des échantillons d’après l’ICMSF

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Analyse microbiologique des aliments
Plan à trois classes
Contrairement au plan a deux classes , le plan a trois classes permet de faire des nuances.
La norme en vigeur est défini (ici la lettre m).
•si les résultats de vos test sont < m , le produit est dit satisfaisant.
•si les résultats de vos test sont compris entre m et M' le produit est dit acceptable
•si les résultats de vos test sont > M' le produit est dit non satisfaisant
•si les résultats de vos test sont > M’ le produit est dit corrompus
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3) Méthode d’échantillonnage pour rechercher un nombre peu élevé de micro-
organismes
 On peut déterminer le nombre d’échantillons à analyser dans un lot en fonction du

degré de sûreté recherché
n = log ( 1 - p )
log ( 1 - d)
 p est la probabilité de déceler le micro-organisme (en général p = 0,95)
 d est le pourcentage de défauts admis pour le lot entier (souvent inférieur à 0,05).
 On peut également réaliser un échantillonnage satisfaisant au point de vue statistique

avec n = N dans laquelle n est le nombre d’échantillon à analyser et N le nombre
total de divisions du produit à analyser.
Cependant cette méthode conduit souvent à un nombre trop élevé d’analyses, en
particulier quand n est supérieur à 10.
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- au hasard (tables de nombres)
- on calcule N/n = a et on prélève la aième puis le (a-1) ième et ainsi de suite
- on calcule n = b et on prélève le bième, puis le (b - 1)ième et ainsi de suite.
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1- Prélèvements
b. fréquence des prélèvements

L’échantillonnage doit être réparti dans le temps, et ce, en
fonction du niveau de production et des risques de
contamination.
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1- Prélèvements
c. Conditions du prélèvement
1- le respect des règles d’asepsie et la non modification des flores
présentes dans le produit.
2- les échantillons du produit à analyser doivent être amenés au

laboratoire dans leur conditionnement d’origine, ce qui évite
certaines contaminations.
3- Si le produit se présente sous forme de grands volumes (réservoirs

à lait etc...) s’assurer de la bonne homogénéité de la répartition des
micro-organismes ; une partie représentative du produit sera
prélevée stérilement. Il est parfois nécessaire de réaliser des
prélèvements à divers niveaux de l’aliment (surface, profondeur
d’un aliment solide) ou après broyage et homogénéisation.
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4- Certains instruments doivent être stérilisés sur les lieux du

prélèvement.
Autoclave
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Produit stérilisant
Bec Bunsen mobile
1- Prélèvement en surface
1.1- Ecouvillonnage
Un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution stérile de

bouillon tryptone-sel additionné de Tween (0,5°/°°).
Le prélèvement est effectué par frottement sur la surface du produit ;
l’écouvillon est alors immergé dans 10 ml de bouillon tryptone-sel.
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L’analyse est réalisée à partir de la suspension ainsi obtenue.
1.2- Rinçage:
cette méthode est utilisée dans le cas de récipients ou de tuyauteries; un
volume connu de solution stérile est introduit dans le matériel à analyser.
Après agitation, le liquide est récupéré et soumis à l’analyse.
16/03/2020 43
1.3- Méthode des empreintes :
un ruban adhésif préalablement stérilisé par les UV est appliqué sur la
surface à étudier. Après quelques secondes de contact il est retiré et
appliqué sur la surface d’un milieu gélosé approprié. Après quelques heures
de contact à la température d’incubation désirée il est retiré et la boîte est
incubée jusqu’à apparition des colonies.
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1.4- Méthode du cylindre :

un cylindre creux de section connue est appliqué sur la surface à analyser;
on y introduit alors quelques ml de diluant stérile et après quelques
secondes de contact, le diluant est retiré et analysé.
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1.4- Méthode du cylindre :
16/03/2020 46
2- Prélèvement de produits liquides
La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant.
Il faut toujours s’assurer de la parfaite homogénéisation du liquide

(agitateurs) avant de prélever à la pipette (ou avec un flacon lesté stérile ou
autre) le volume nécessaire à l’analyse.
16/03/2020 47
2- Prélèvement de produits solides
Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde

(fromages et produits mous) ou à la pipette harpon. La surface est souvent
éliminée avant de procéder au prélèvement. Si le produit est hétérogène
(plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer de la bonne représentativité
du prélèvement.
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2- Traitement de l’échantillon
a. Transfert de l’échantillon au laboratoire
16/03/2020 49
2- Traitement de l’échantillon
 Quand le prélèvement aseptique a été réalisé, il faut identifier

immédiatement le produit avec une étiquette ou une référence.
 Noter la température initiale, l’heure du prélèvement, la date et la

température de transport. Amener alors les échantillons le plus rapidement
possible au laboratoire en maintenant les conditions initiales dans
lesquelles se trouvait le produit.
16/03/2020 50
 L’analyse devrait être réalisée dans l’heure qui suit le prélèvement. Dès
réception au laboratoire l’échantillon accompagné de sa fiche signalétique
est enregistré (nature, date, heure, provenance du prélèvement, nom du
préleveur, analyses demandées, autres indications utiles).
16/03/2020 51
 Si l’échantillon doit être transporté il faut réduire au maximum le délai avant

l’analyse. Il est souvent nécessaire de réfrigérer (mais non congeler) le
produit au cours de son transport; certains germes fragiles peuvent
disparaître au cours de cette réfrigération.
 Si un produit est déshydraté ou en conserve il ne doit pas être

réfrigéré.
 Pour un produit congelé s’assurer qu’il n’y ait pas de décongélation pendant
le transport (ce produit peur être gardé pendant 1 mois avant d’être
analysé).
16/03/2020 52
b. Préparation de l’échantillon & Techniques de broyage
 Les échantillons sont amenés au laboratoire dans leur emballage d’origine

s’il s’agit de produits finis ou dans des flacons ou récipients stériles s’il
s’agit de produits en vrac ou de “prélèvements”.
 Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique

s’effectue toujours à partir d’une suspension. Après ouverture aseptique,
l’échantillon sera “homogénéisé” (liquide) ou broyé dans un volume connu
de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la première dilution.
 Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle

vigoureuse en présence de billes de verre permet d’obtenir une
homogénéité satisfaisante.
16/03/2020 53
 Pour les produits solides diverses techniques de “broyage” sont utilisables :
1) broyage manuel au Potter ou en en présence de sable stérile ou de

billes de verre (mortier)
16/03/2020 54
2) broyage mécanique
- avec un broyeur électrique à couteaux de type VIRTIS .
ça permet la dispersion des germes; la température ne doit pas trop s’élever (le récipient peut être placé
dans de la glace).
Le broyage s’effectue en général avec 10 volumes (ou 9) de diluant pour 1 “volume” de produit (par
exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant stérile).
Le diluant peut être de l’eau distillée, de l’eau physiologique, ou une solution tryptone-sel , etc. .
- avec un broyeur du type STOMACHER.

Cet appareil permet de disperser dans des conditions relativement douces l’aliment dans le diluant. Le
Stomacher (digesteur) utilise des sacs plastiques stériles à usage unique. La prise d’essai est le plus
souvent de 10 g (ou 25) d’aliment et de 90 ml (ou 250) de diluant.
16/03/2020 55
Broyage:
la mise en suspension homogène des
microorganismes présents sur ou dans le
produit analysé
Centrifugation:
atteignant 3 à 4000 g permet de décanter les
microorganismes présents dans les liquides.
Un très grand nombre matériels à usage unique
Un ensemenseur spiral et un
compteur de colonies laser.
Pour faciliter la numération des
colonies dans les boîtes de Pétri il
est possible d’utiliser un système du
type stylo-compteur.
16/03/2020 56
Un ensemenseur spiral compteur de colonies laser.

3.1. Les voies de bio-contamination :

- buccale (ingestion) : pipetage, porté à la bouche des doigts ou d’objets
contaminés comme des stylos, des aliments etc.
Ce type de contamination résulte d’un travail “aseptique” incorrect ou
actions diverses non contrôlés.
- aérienne par des aérosols (particules liquides ou non en suspension

dans l’air et porteuses de germes).
Ces aérosols peuvent être générés par des opérations classiques
(homogénéisateur, centrifugeuse, etc.)
- par contact cutané (Brucella, Staphylococcus ou encore

Pseudomonas par exemple) ou au niveau de muqueuses ou d’organes
comme les yeux.
- par pénétration
16/03/2020 sous-cutanée accidentelle (par piqûre ou au 57
niveau d’une plaie).
3.2. Techniques d’asepsie
 Systèmes de stérilisation / désinfection et zones stériles:
 1) L’autoclave vertical ou horizontal pour la stérilisation en milieu vapeur des

milieux, des “déchets” est indispensable. La « stérilisation » est généralement
réalisée à 115 ou 120 °C pendant 10 à 30 minutes.
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 2) Le four Pasteur permet la stérilisation à sec du matériel en verre ou en
métal et doit pouvoir atteindre une température de 170 - 180°C.
 3) Les système de micro ou ultra filtration à membrane sont utilisés

pour les milieux de culture liquides non autoclavables et pour l’analyse des
liquides (eau par exemple).
16/03/2020 59
 4) Les lampes UV germicides munies d’une minuterie et installées dans
la pièce principale de manipulation ainsi que dans les hottes à flux
laminaires. Elles sont efficaces sur les « zones éclairées ».
 5) Les récipients contenant par exemple de l’hypochlorite de

sodium pour recueillir les matériels souillés tels que lames états frais, les
pipettes, les cônes à usage unique etc.
16/03/2020 60
6) Les zones de travail sont situées dans la zone de protection de

becs Bunsen avec déclenchement par bouton “à pied” et/ou dans des
hottes à flux laminaires qui selon leur fonctionnement “protègent” avec
efficacité soit le produit, soit l’opérateur, soit les deux.
16/03/2020 61
 Principes des réactions révélés par les
milieux les plus utilisés
16/03/2020 62
16/03/2020 63
Caractéristiques des milieux de culture
Composition
 Les milieux de culture doivent pour permettre le

développement des micro-organismes réunir certaines
qualités. lis doivent, en particulier:
 contenir en quantité suffisante tous les aliments et

l'eau exigés par leur croissance et leur entretien et
respecter leur besoin en oxygène.
 être ajusté à un pH précis;

16/03/2020  être porté à la température optimale de croissance. 64
 Préparation nutritive destinée à la croissance

de microorganismes en laboratoire
 Peuvent être liquides ou solides
16/03/2020 65
Milieux synthétiques
 Milieu qui doit fournir une source d’énergie

et des éléments tels que le carbone,
l’azote, le soufre, le phosphore et des
facteurs de croissance.
 La composition chimique de ce milieu est
connue.
16/03/2020 66
Milieux complexes
 Aussi appelés milieux empiriques.
 Contiennent des ingrédients dont la

composition chimique est indéterminée.
16/03/2020 67
 Suivant l'utilisation envisagée, on choisira des milieux
de culture liquides ou solides .
a) Les milieux liquides
Ils permettent une culture plus facile et plus rapide
mais les bactéries s'y trouvent dispersées; si des
espèces bactériennes différentes sont en présence,
leur séparation n'est pas possible.
16/03/2020 68
 b) Les milieux solides
 Ils permettent la séparation des espèces bactériennes:
chaque microbe fixé à la surface du milieu donne naissance
en peu de temps à une descendance de plusieurs milliards
d'individus constituant un amas visible à l'œil nu ou colonie.
La forme, la dimension, la couleur d'une colonie sont
caractéristiques de l'espèce bactérienne qui la constitue: la
différenciation des espèces bactériennes est donc
possible sur ces milieux.

16/03/2020 69

b) Les milieux solides

 Milieu liquide auquel on ajoute un agent de solidification
tel que l’agar-agar
 L’agar-agar est un polysaccharide extrait d’une algue

marine.
 C’est un gel qui est à l’état solide à une T° de moins de

60°C et qui se liquéfie à 100°C.
 Permet donc l’incubation à des T° élevées.
 N’est pas une source nutritive pour les bactéries

16/03/2020 70
 Permet d’obtenir des colonies isolées

Classification des milieux en fonction de leur
utilisation
 On peut classer les milieux en 4 catégories:
 1- milieux usuels dits de base;

 2- milieux d'isolement;
 3- milieux d'identification
 4- milieux de conservation.
16/03/2020 71
utilisation
1- Milieux usuels dits de base

 Ces milieux permettent la culture d'une variété de
bactéries aussi grande que possible, mais il n'existe pas
de milieu universel.
Les milieux les plus utilisés sont le bouillon nutritif et la

gélose nutritive (bouillon additionné de gélose à raison
de 20 g environ par litre).
16/03/2020 72
utilisation
2- Milieux d’isolement
 Ces milieux, qui permettent d'obtenir les bactéries contenues dans un
produit naturel à l'état de culture pure, peuvent être:
A- Les milieux de base usuels (précédemment cités.)
B- Les milieux d’enrichissements par de produits biologiques: ex:

sang, … Ces milieux enrichis facilitent l'isolement des bactéries
fragiles et exigeantes.
C- Les milieux sélectifs qui favorisent la culture d'une espèce ou

d'un groupe d'espèces bactériennes alors que la croissance des
autres bactéries est difficile, entravée, ou nulle.
D- Les milieux différentiels qui permet le distinction entre73 la
16/03/2020
bactérie recherché et les autres bactéries dans le même milieu.

B- Milieux d’enrichissement
 Milieu liquide
 Donne des conditions favorables à la

croissance d’un seul microbe donné ce qui en
favorise la multiplication
Ex : milieu sélénite utilisé dans les spécimens

de selles pour favoriser la croissance des
salmonelles et des shigelles au détriment des
autres bactéries présentes.
16/03/2020 74
C- Milieu sélectif
 Inhibe la croissance des bactéries indésirables

et stimule celle des microbes recherchés
 Contiennent des agents inhibiteurs ( Ab, sel,

colorant)
Ex : cristal violet et sels biliaires dans la gélose

MacConkey
16/03/2020 75
Milieux spécialisés dans l’isolement des
bactéries
Milieu gélosé de MACCONKEY
- Milieu sélectif pour l'isolement des bacilles Gram-

Salmonella et Shigella ainsi que des bactéries
coliformes dans les eaux, les produits
alimentaires, les produits pharmaceutiques et
biologiques .
 Mode opératoire:
Isolement par la méthode des cadrans. Incuber 18 à
24 h à 37 °C.
Ce milieu contient deux inhibiteurs de la flore Gram+ :
- les sels biliaires
- le cristal violet
Résultat:
 colonies rouges entourées d’un hâlo opaque de la
même couleur dû à la précipitation des sels
biliaires: lactose+
16/03/2020 76
 colonies jaunes ou incolores : lactose-
Milieux spécialisés dans l’isolement des bactéries
Milieu gélosé de CHAPMAN

Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout utilisé en
microbiologie médicale, permettant la croissance des germes
halophiles.
Mode opératoire:
L'ensemencement doit être massif, en stries serrées ou par
inondation
Résultat:
Les colonies mannitol + sont entourées d’une auréole jaune.
16/03/2020 77
Staphylococcus aureus
D- Milieu différentiel
 Facilite la distinction
entre les colonies de
la bactérie
recherchée et les
autres colonies
présentes sur le
même milieu.
16/03/2020 78
utilisation
3- Milieux d’identification
 L'identification des bactéries est surtout basée sur l'étude de leurs
propriétés biochimiques. Cette étude est rendue possible par la culture
de la souche bactérienne sur un grand nombre de tubes de milieux
spéciaux. On observe la modification des milieux soit directement, soit
grâce à des indicateurs chimiques, puis on rassemble tous les
renseignements obtenus sous forme d'une fiche signalétique qui
permet d'établir l'identité de la bactérie.

16/03/2020 79
3- Milieux d’identification
 Milieu au citrate de Simmons

 Mode opératoire
 La pente est ensemencée par une strie longitudinale, réalisée à l'anse, à
partir d'une suspension de la culture solide en eau distillée stérile.
Citrate +
Citrate -
16/03/2020 80
utilisation
4- Milieux de conservation
Milieux pauvres qui maintiennent les

bactéries dans un état de vie ralentie. .
16/03/2020 81
Critères de choix des milieux de cultures

 La microbiologie dépend en grande partie de la croissance et du maintien des
MO en laboratoire; ceci n’est possible que si des milieux de culture adéquats
sont disponibles.
 Un milieu de culture est une préparation solide ou liquide, utilisée pour faire
croître, pour transporter et conserver des MO.
 Un bon milieu doit contenir tous les nutriments dont le MO a besoin pour se
développer.
 Il faut des milieux spéciaux pour l’isolement, l’identification et la mesure de la

sensibilité des MO aux antibiotiques, pour les analyses d’eau et de nourriture,
pour la microbiologie industrielles et d’autres activités.
16/03/2020 82
Critères de choix des milieux de cultures
La composition précise d’un bon milieu de culture dépend de

l’espèce à cultiver, car les besoins en éléments nutritifs sont
très spécifiques
La connaissance de l’habitat normal d’un MO est très utile dans

La sélection d’un milieu de culture approprié, les besoins nutritifs
Reflétant les besoins naturels.
La fonction du milieu déterminera sa composition dans le cas de

La recherche sélective de certains MO spécifiques ou pour
l(‘identification d’une espèce particulière.
16/03/2020 83
1
Détermination de l’espèce recherchée

16/03/2020 84
Principes des réactions révélées par les
milieux de culture les plus utilisés en
Microbiologie alimentaire
16/03/2020 85
Milieux spécialisés dans l’identification des
bactéries
 Rappels des activités métaboliques
Les activités métaboliques couramment étudiées pour l’identification des
bactéries chimioorganotrophes sont:
1.1- Le métabolisme énergétique:

1.1.1- Le besoin en oxygène:
Chez les bactéries L’oxygène est
- Aérobies strictes Utilisé, indispensable, non toxique
- Aéroanaérobies
Anaérobies facultatives Utilisé, non indispensable, non toxique
Anaérobies aérotolérentes Non utilisé, non toxique

- Anaérobies strictes Non utilisé, toxique
16/03/2020 86
Milieux d’identification
 Gélose viande-foie (V.F)
But: Pour l’étude du besoin en O2 (ce milieu ne contient pas de nitrate)
Mode opératoire:
La gélose V.F est un milieu semi-solide, en tube de Prévot. Avant d’être
ensemencé, le milieu doit être régénéré par séjour d’une demi-heure au
bain-Marie bouillant.
Refroidir à 45°C
Ensemencer à la pipette boutonnée à partir de la culture en bouillon.
L’introduire jusqu’au fond du tube puis remonter en décrivant des tours
de spire très serrés.
Refroidir à l’eau courante.
Résultats:
16/03/2020 87
1.1.2- La voie d’attaque du Glucose
Chez les bactéries chimioorganotrophes, le Glucose est le substrat principal du

métabolisme énergétique.
Ce métabolisme est dit oxydatif lorsqu’il nécessite la présence d’O2

moléculaire: le catabolisme complet du glucose produit du CO2 et de l’eau.
Le métabolisme est fermentatif lorsqu’il ne nécessite pas l’ O2 : les produits

finaux du catabolisme du glucose sont de petites molécules organiques,
habituellement des acides organiques.
NB: Certaines bactéries sont à la fois oxydatives et fermentatives. D’autres ne

sont ni oxydatives ni fermentatives.
16/03/2020 88
 Milieu de Hugh et Leifson
But: l’étude de la voie d’attaque du Glucose
Mode opératoire:
C’est un milieu semi- solide en tube
Faire fondre deux tubes de milieux au bain- Marie bouillant.
Refroidir à 45°– 50°C
Ajouter aseptiquement quelques gouttes d’une solution stérile concentrée de glucose de
façon à obtenir une concentration finale de 1%.
Agiter et solidifier en plongeant le tube dans l’eau froide.
Ensemencer par piqûre centrale à partir de la culture en bouillon.
Recouvrir un tube seulement d’une couche d’huile de paraffine stérile de 1cm
d’épaisseur.
Résultats: = souche fermentative
= souche oxydative
= souche inactive
16/03/2020 89
1.1.3- Les enzymes respiratoires:
Chez les chimiotrophes, le métabolisme énergétique peut être vu
comme une chaîne d’oxydoréductions alimentée par un donneur
initial et un accepteur final d’H2 et d’e-.
Présence de l’oxydase (oxydase +)
La respiration aérobie utilise l’O2 comme accepteur final d’e-: Chez
certaines bactéries oxydatives les e- passent par une cytochrome
oxydase avant d’être transférés à l’O2.
 But : mettre en évidence la cytochrome oxydase

 Principe: Le réactif TÉTRAMETHYL-P-PHENYLENEDIAMINE
DIHYDROCHLORURE 1% est de couleur pourpre lorsque oxydé
 Technique: Sur papier filtre déposer le réactif et les bactéries
 Résultat:
 Positif : bleu-pourpre
16/03/2020 90
Présence de la catalase (catalase +)
En présence d’O2, il se forme dans le cytoplasme bactérien des
produits toxiques qui doivent être détruits par des enzymes
cellulaires. La présence d’une catalase permet la destruction de
l’eau oxygénée formée:
H2O2 2H2O + O2
But : mettre en évidence la catalase
 Principe: Le réactif PEROXYDE D’HYDROGÈNE 3% est décomposé en
H2O + O2 par l’enzyme
 Technique: Sur une lame de verre déposer les bactéries ajouter le réactif
 Résultat:
 Positif : présence de bulles
16/03/2020 91
Présence de la nitrate réductase (N.R+)
Si l’accepteur final d’électrons est un minéral autre que l’O2, on parle de
respiration anaérobie.
NO3- NO- - N2
Nitrate réductase
16/03/2020 92
A. Organiques à chaînes courtes
1.1.4- Les fermentations: (A. lactique
1 A. Acétique
Glucides Glucose A. pyruvique B. formique)
2 Acétoïne
Glycolyse
1: Fermentation acide mixte
2: Fermentation butylène-glycol
1.2- La prototrophie
Utilisation d’un substrat organique comme seule source de carbone.
Milieu= Le citrate de sodium
1.3- Utilisation des polysaccharides

Recherche des enzymes exocellulaires: amylase, cellulase, pectinase
16/03/2020 93
1.4- Le métabolisme protidique
- Protéolyse de la gélatine
- Hydrolyse de la caséine
- Recherche des décarboxylases:
- Ornithine décarboxylase (ODC)
- Lysine décarboxylase (LDC)
- Arginine dihydrolase (ADH)
- Recherche d’indole par désamination du Tryptophane
- Recherche de la tryptophane désaminase et de la Phénylalanine
désaminase
- Production d’H2S par décarboxylation et désamination
- Hydrolyse de l’urée
1.5- Le métabolisme lipidique
- Recherche de lipase
- Recherche de la Lécithinase
16/03/2020 94
 Eau peptonée lactosée au rouge de phénol

 But: la mise en évidence de la fermentation du lactose.
Le milieu contient comme indicateur coloré le rouge de phénol qui vire
au jaune en milieu acide, donc lorsque le lactose est fermenté. Aux
pH alcalins obtenus lorsque la bactérie métabolise les peptones et
non le lactose, la couleur est rouge sombre.
La cloche de Durham est remplie de gaz lorsque la fermentation du
lactose donne des produits gazeux en plus des acides organiques.
Résultats:
16/03/2020
Lactose - Lactose + (Gaz -) Lactose + (Gaz
95
+)
 Milieu de Clark et Lubs
But: l’étude du type de fermentation.
Mode opératoire:
 Ensemencer largement, incuber 24 h à t°C optimale.
* test RM (Rouge de Méthyle):
- ajouter 2 à 3 gouttes de rouge de méthyl,
- la lecture est immédiate.
 * test VP (Voges-Proskauer) :
 - ajouter 10 gouttes d’alpha naphtol et le même volume de soude concentrée (ou
de potasse).
 - incliner le tube pour permettre une bonne oxygénation.
 - attendre quelques min à 1 heure.
Résultats:
= fermentation acide mixte
RM
- +
VP
= fermentation butylène-glycol
16/03/2020 96
- + (production d’acétoïne)
 Le milieu Kligler Hajna : test d ’auto-évaluation (Métabolisme glucidique)

Composition :
Extrait de viande de boeuf 3g
Extrait de levure 3g Source de C et N
Peptone 20 g
Chlorure de sodium 5g Equilibre osmotique
Citrate ferrique 0,3 g
Mise en évidence de la formation H2S
Thiosulfate de sodium 0,3 g
Lactose 10 g Source glucidique majoritaire
Glucose 1g Source glucidique minoritaire
Rouge de phénol 0,05 g
Agar (gélose) 12 g Indicateur de pH
ED qsp 1 L
pH = 7,4
6,5 8,2
16/03/2020 97
 Milieu de Kligler (lactose, glucose, H2S)

 But: la mise en évidence de:
 La production de gaz accompagnant ou non la fermentation du glucose.
 La fermentation du lactose
 La production d’H2S par décarboxylation et désamination des acides
aminés.
 Ensemencer abondamment la surface par stries serrées ou par inondation,
puis le culot par simple piqûre, à l'aide de la même pipette boutonnée. Il est
important de ne pas oublier de dévisser partiellement la capsule afin
de permettre les échanges gazeux.
Mettre à l'étuve 24h à 37°C.
Résultats:
16/03/2020 98
Souche glucose +
Lactose –
H2S-
gaz +
Souche glucose +
Lactose –
H2S+
gaz -
Souche glucose +
Lactose +
H2S-
gaz -
16/03/2020 99

But: la mise en évidence de l’utilisation du citrate comme seule
source de carbone.
 Composition
Sulfate de magnésium 0,2 g
Phosphate monopotassique 1g Sources minérales
Phosphate bipotassique 1g
Citrate de sodium 2g Seule source de carbone
NaCl 5g Equilibre osmotique
Bleu de Bromothymol 0,08 g
Indicateur pH
Agar (gélose) 15 g
ED qsp 1 L
pH = 6,8
16/03/2020
6 7,6 100

 Mode opératoire
 La pente est ensemencée par une strie longitudinale, réalisée à l'anse, à
partir d'une suspension de la culture solide en eau distillée stérile.
Citrate +
Citrate -
16/03/2020 101
 Gélose à l’amidon:
But: la mise en évidence de l’amylase
Mode opératoire:
 Ensemencer par une strie à la surface du milieu. Incuber un à huit
jours à la température désirée.
Inonder la surface du milieu avec du lugol. En présence d’iode
l’amidon prend une coloration violette.
La dégradation bactérienne de l’amidon du milieu de culture par les
amylases extracellulaires se traduit par un halo transparent autour
des colonies.
Amylase –
 Résultats:
16/03/2020 Amylase + 102

Conservation d’une culture
bactérienne
16/03/2020 103
Conservation d’une culture
bactérienne
 Réfrigération
 Surgélation
 Lyophilisation
16/03/2020 104
Réfrigération
 Méthode qui permet de ralentir le
métabolisme bactérien sans tuer les
microorganismes.
 Permet de conserver des cultures
bactériennes pendant un court laps de
temps
 Conservation entre 4 et 7ºC (frigo)
16/03/2020 105
Congélation et surgélation
 Conservation pour une plus longue période
 Conservation des bactéries et des virus
 Culture microbienne pure dans un liquide en suspension
 Refroidir rapidement à des T° entre –50 et –95 ºC ( - 18º C pour
congélation).
 Aucune activité métabolique ; développement totalement bloqué
mais la plupart des cellules restent vivantes.
 Permet de décongeler la culture et de la faire croître, même après
plusieurs années.
16/03/2020 106
Lyophilisation ou cryodéshydratation
 Congélation rapide d’une suspension microbienne à des T° entre –
54 et -72ºC tout en éliminant l’eau par la création d’un vide ce qui
donne une poudre.
 Récipient scellé sous vide.
 Les bactéries sont toujours vivantes mais dépourvues d’activité
métabolique.
 Poudre peut être conservée pendant des années.
 Les bactéries peuvent être ranimées en tout temps par hydratation
avec un milieu nutritif.
16/03/2020 107
Plan
1 - Prélèvements
a) Echantillonnage
V- PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET DE NUMERATION DES MICROORGANISMES DANS LES

ALIMENTS
16/03/2020 108
VI- ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE QUELQUES PRODUITS ALIMENTAIRES (EXPOSES)
IV-GERMES IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE
ALIMENTAIRE
Toute présence d’un germe pathogène dans un aliment peut altérer la

qualité de cet aliment et pourra ainsi causer des intoxications et/ou des
maladies infectieuses graves.
Les germes pathogènes les plus répondus sont les suivants:
16/03/2020 109
SALMONELLES
 Nombreuses
 Salmonella typhimurium, Salmonella enteridis,
Salmonella dublin…
 Très résistantes et persistantes dans
l’environnement
 Obligation réglementaire : Zéro salmonelles
dans les fromages (dans 25 g, mélange de 5 échantillons)
Présence Interdiction de
de commercialiser
16/03/2020
salmonelles les fromages 110
Salmonelles
Un enjeu pour la santé publique
 Chez l’adulte bien portant :
 Symptômes : coliques, diarrhées,
vomissements, nausées et fièvres,
+/- déshydratation, mal de tête…
 Apparition : 8 à 48 h 00 après l’ingestion
 Durée 2 à 4 jours – guérison souvent
Intoxications
spontanée
alimentaires collectives
 Taux de mortalité : 0.2 % à salmonelles 2001 :
1 726 cas
272 hospitalisations
3 décès
7.5 % dus à du lait ou
des produits laitiers
Source : BEH
16/03/2020 Toutes les souches sont potentiellement 111
pathogènes
Salmonelles
Un enjeu pour la santé publique
Principale cause des TIAC (toxi infection alimentaire collective) –

aliments suspectés ou identifiés en 2001
Lait et produits laitiers 14 7,5%
Œufs et préparations à base d’œufs 107 56,6%
Viandes 5 2,6%
Produits de charcuterie 15 7,9%
Volailles 11 5,8%
Poissons et crustacés 3 1,6%
Coquillages 3 1,6%
Autres Aliments 3 1,6%
Eau de boisson 0 0
Aliments non retrouvés 28 14,8%
16/03/2020 112
Total (nb foyers) 189
Salmonelles
Conditions de survie et de multiplication
 Pas de croissance si  Assez sensibles au sel

bonne réfrigération du lait  pH de multiplication
 Survit au froid et à la
9
congélation
6,6 -6,8 = pH du
 Température de croissance 6,5 - 7,5
lait frais
= pH optimum
4,0 - 4,3 = pH du 4
fromage au
45-50 °C démoulage
optimum 35 - 37°C
Tank, Citerne,
Usine, 8°C
Supermarché,
Réfrigérateur
16/03/2020 113
Salmonelles
Contamination dans les élevages
Animaux
domestiques
contaminés Animaux sauvages
(volailles, ruminants, porcs…) contaminés (rats, oiseaux)
Eau
Aliments contaminés
Classiquement
par voie orale
Troupeau avec salmonellose
16/03/2020 clinique ou porteurs sains 114
Salmonelles
Eviter la contamination du lait
 Isoler les animaux atteints cliniquement

 Préférer un épandage sur les labours avec
enfouissement immédiat ( dans les élevages présentant des
cas ou ayant des antécédents de salmonelloses cliniques)
 Eau : protection des points d’eau – entretien des
abreuvoirs
 Protection des aliments des souillures animales
 Entretien des litières
 Lutte contre les rongeurs, les pigeons…
 Hygiène de traite
16/03/2020 115
LISTERIA MONOCYTOGENES
 Listeria :
 6 espèces :
 L. monocytogenes : seule pathogène pour l’homme
 L. ivanovii : avortements chez les ruminants
 4 autres espèces non pathogènes
 Normes :
 <100 ufc / g si existe test de vieillissement pour le
produit
 ou absence dans 25g de produit
16/03/2020 116
Listeria circulant dans la cellule
Listeria pénétrant dans une cellule

16/03/2020 117
Listeria monocytogenes
La listériose chez les Humains
 Conséquences pour la santé :
 Avortements
 Méningites
Surtout chez les personnes
immunodéprimées
 Décès dans 30 % des cas chez personnes
sensibles
16/03/2020 118
Listeria monocytogenes
La Listériose chez les ruminants
Méningites Avortements
Mammites Affections
oculaires
 Fréquence de la maladie :
 ovins > caprins > bovins
Presque toutes les espèces animales peuvent être porteuses de Listéria

16/03/2020 119
Source : GIE Rhône-Alpes
 Température de croissance pH de multiplication
50 °C
optimum 35 - 37°C
9,6
6,6 -6,8 = pH du 7,2 – 7,6

0°C
lait frais
 Sensible : = pH optimum
 à la chaleur (> 60° C)
4,0 - 4,3 = pH du 4,6
 à la plupart des fromage au
désinfectants (chlore) démoulage
Résiste au sel
(saumure)
16/03/2020 120
Environnement
contaminé
Fèces Litière
contaminés contaminée
Eau d’abreuvement ou
Aliments de lavage
contaminés contaminée
Matériel de traite contaminé
Mammites
à Listeria
Lait Traite
16/03/2020 121
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
 S. aureus est une bactérie

mieux connue sous le nom de :
Staphylocoque doré
 Hôte naturel des muqueuses et de la peau
de l'homme et des animaux
 Portage sain possible : intestin,

muqueuses, peau, (vêtements) …
16/03/2020 122
Staphylococcus Aureus
Conséquences pour la santé
 Chez l'homme
 (3h après ingestion, pendant 24-48 heures)
 Toxi-infections alimentaires :
 nausées, douleurs abdominales,
diarrhées, maux de tête, douleurs
musculaires, hypertension,…
 Choc toxinique : rare

 Chez l'animal
 Infections mammaires
 Surinfections de plaies, abcès, dermites, métrites,
16/03/2020
vaginites, … 123
Staphylococcus Aureus
Normes
Lait concerné Normes
Lait cru de vache pour fabrications au lait cru Aucun depuis 01/01/06
Produit laitier concerné Normes

Fromages au lait cru m = 10 000 M=100 000
Fromages avec traitement thermique< pasteur m = 100 M = 1 000
Fromages au lait pasteurisé m = 10 M = 100
 En cas de dépassement de M, mise en œuvre des actions

correctives du plan de maîtrise et recherche d'entérotoxine sur les
produits laitiers
16/03/2020 124
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
 Pas de croissance si  pH de multiplication

bonne réfrigération du lait
congélation
9,8
 Température de croissance
6,6 -6,8 = pH du
lait frais 5,0 - 7,5
= pH optimum
4,0 - 4,3 = pH du 4,0

48 °C
fromage au
optimum 37°C
Démoulage (lactique)
Tank, 7°C Survit à des taux

Supermarché,
Réfrigérateur de sel (20 %) et
16/03/2020 sucre élevés 125
ESCHERICHIA COLI
 E.coli est une bactérie coliforme
 Peut donner des caillés ou fromages gonflés
35 – 37°C, 48 H
Lactose acides, éthanol, H2 et CO2
bactéries coliformes (gaz)
 Peut entraîner des altérations du goût

 E.coli : pathogénicité dépend des souches
Ex : O157:H7, une des plus dangereuses
16/03/2020 126
ESCHERICHIA COLI
4 Types
Entéro- Entéro- Entéro- Entéro-

pathogènes toxinogènes invasives hémorragiques
Diarrhées
Affections Diarrhées Diarrhées sanglantes
néonatales infantiles sanglantes
Coliques
Adultes
"Tourista" hémorragiques
porteurs Dysenteries
sains adultes Infections
urinaires
16/03/2020 127
Escherichia Coli
Conséquences pour la santé
 Chez l'homme
 Infections intestinales :
 diarrhées du nourrisson, fièvre,
diarrhées avec sang, déshydratation
 Infection du système urinaire
 Méningites: surtout chez le nourrisson
 Chez l'animal
 Gastro-entérite
 Mammites cliniques colibacillaires
16/03/2020 128
Escherichia Coli
Normes (voir partie réglementation)
 E.coli
Lait ou produit laitier concerné Normes
Fromages au lait cru aucun
Fromages au lait ayant subi traitement thermique m = 100 M = 1000
Coliformes à 30° C
Lait ou produit laitier concerné Normes
Beurre et crème au lait cru m = 10 M = 100
16/03/2020
En cas de dépassement de M, mise en œuvre des actions 129
correctives du plan de maîtrise
ESCHERICHIA COLI
 Pas de croissance si  pH de multiplication
bonne réfrigération du lait
congélation
10
 Température de croissance
6,6 -6,8 = pH du
lait frais 6,0 – 8,0
= pH optimum
47 °C 4,0 - 4,3 = pH du 4,4

optimum 30 à 40 °C fromage au
Démoulage (lactique)
Tank 8°C
Supermarché,
Réfrigérateur Peu sensible au sel
16/03/2020 130
Escherichia Coli
Coliformes : indicateurs d'hygiène
 Les coliformes se différencient en 2 types :
 Non fécaux (origine environnement), détectés dès 30°C
 Fécaux (origine tube digestif), plus thermo-tolérants, détectés à
44°C, et dont E.coli fait partie
 Le ratio E. coli / Coli à 30°C est un bon indicateur de l'origine de
la contamination du lait
 Faible (20 %) : origine matériel, environnement
 Elevé : origine fécale, hygiène
 Colonisation rapide du matériel (1 à 2 semaine),
favorisée par les résidus (lait, tartre) et l'humidité
 Formation de biofilms
16/03/2020 131
Escherichia Coli
Moyens de maîtrise en Elevage
Bâtiments : préserver
Repérer les
l'état des aires
mammites
d'exercice, de
colibacillaires
couchage, litières
Entretien et
Qualité de
nettoyage de la
l'eau utilisée
machine à traire
Réfrigérer
Bonne hygiène correctement
de traite le lait
16/03/2020 132
Escherichia Coli
Bonnes pratiques en fromagerie
 Changer de sérum en cas de gonflement
 Veiller à une bonne acidification (freine la multiplication)
 Qualité de l'eau (tartre)
 Nettoyage et Entretien de la vaisselle laitière
 Dose, Durée, T°C, Action mécanique
 Contrôle visuel : rayures, fissures, tartre…
 Locaux : plan de nettoyage (+ désinfection si nécessaire)
 Hygiène du transformateur
 Lavage des mains
 Tenue
 Limiter accès aux visiteurs
16/03/2020 133
Principales sources de
contamination / Elevage
Contamination Multiplication Staph Listeria E.
Salmonella
aureus mono Coli
Aliments, eau
contaminés
Litière contaminée,
sol boueux, fumier
contaminé
Mamelle souillée
Mamelle infectée ?
Traite Hygiène/technique
Machine à traire
T°C, vitesse
refroidissement
Nettoyage, entretien
16/03/2020 134
Plan
1 - Prélèvements
a) Echantillonnage
V- PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET DE NUMERATION DES

16/03/2020
MICROORGANISMES DANS LES ALIMENTS 135
VI- ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE QUELQUES PRODUITS ALIMENTAIRES (EXPOSES)

Les principaux procédés
d'ensemencement:
- ensemencement dans la masse
16/03/2020 136
d'ensemencement:
- ensemencement par stries
transversales pour dissémination
16/03/2020 137
Technique des stries
16/03/2020 138
d'ensemencement:
- ensemencement par stries épaisses
16/03/2020 139
d'ensemencement:
- ensemencement par inondation
16/03/2020 140
d'ensemencement:
- ensemencement par piqûre et par
touche
16/03/2020 141
Examen macroscopique et
microscopique des
bactéries
16/03/2020 142
1) Aspect macroscopique des colonies
16/03/2020 143
Aspect des colonies
(macroscopie)
16/03/2020 144
2)Examen microscopique des
bactéries
Coloration de Gram
16/03/2020 145
Coloration de Gram
 La coloration de Gram doit son nom au
bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mit
au point le protocole en 1884.
 C'est une coloration qui permet de mettre en
évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et
d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les
classifier.
 Son avantage est de donner une information rapide
sur les bactéries présentes dans un produit ou un
milieu tant sur le type que sur la forme.
16/03/2020 146
La paroi des bactéries Gram- est riche en
lipides, ce qui la rend perméable à l’alcool
qui décolore le cytoplasme, alors que la paroi
des Gram+ est imperméable à l’alcool et le
cytoplasme reste coloré en violet.
16/03/2020 147
Réalisation du frottis
 Elle nécessite d'avoir un frottis fixé, soit
par l'alcool durant 5 minutes (et rinçage à l'eau),
plus classiquement en effectuant une fixation simple à

l'eau et à la flamme selon les indications suivantes :
sur une lame, déposer une goutte d'eau stérile. Ajouter

à l'anse de platine stérilisée une goutte de la colonie
isolée. Étaler et fixer à la chaleur à environ 40°C
pendant 10 à 15 minutes. Poser la lame séchée sur
16/03/2020 le portoir reposant sur un bac de coloration. 148
Réalisation de la coloration
 Voici succinctement les différentes étapes de cette

coloration :
 1. Coloration par le violet de gentiane ou cristal violet.

Laisser agir de 30 secondes à 1 minute.
 Rincer à l'eau déminéralisée.
 2. Mordançage au lugol (solution d'iode iodo-iodurée): étaler

le lugol et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau
16/03/2020 149
déminéralisée.
Réalisation de la coloration
 3. Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser
goutte à goutte l'alcool ou un mélange alcool-acétone
sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la
décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à
la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau
déminéralisée ;
 4. Recoloration à la safranine ou à la fuchsine. Laisser

agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à
l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine
chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes.
 5. Observer avec une goutte d'huile à immersion

16/03/2020 150
objectif 100 (grossissement ×1000).

Des bactéries à Gram – Des bactéries à Gram +
(Escherichia coli) ( Bacillus subtillis)
16/03/2020 151
16/03/2020 152
I. Isolement d’une
flore microbienne
spécifique
16/03/2020 153
1- choix du biotope:
Milieu biologique déterminé offrant des conditions d'habitat stable

à un ensemble d'espèces
Conditions physico -chimique
biotope
.pH
.température
.lumière
.eau
.Source de
carbone
.O2
16/03/2020 .etc… 154
2- choix du milieu de culture:
Milieux
usuels
Exemple: bouillon nutritif et gélose nutritif
Milieux sélectifs
Exemple: milieu de Sabouraud

milieu Kana-Vanco(kv)
(kv)
Milieux d’enrichissement
Exemple: Gélose Baird Parker (BP)

Exemple: Gélose de MacConkey (MCK)
Gélose de Chapman (MSA)
milieux de conservation
16/03/2020 155
II . Dénombrement de
la flore microbienne
16/03/2020 156
1- dénombrement direct
hématimètre de Thoma
une lame de Breed
16/03/2020 157
2- dénombrement indirect
Par comptage des colonies après culture
Technique en surface
Technique dans la masse (en profondeur)
Evaluation du nombre de bactéries par mL

Nombre de colonies compté
n dilution de l’échantillon
N = —————— x d
V
UFC.ml-1 Volume de l’inoculum ml
16/03/2020 158
16/03/2020 159
16/03/2020 160
Technique de filtration sur membrane
16/03/2020 161
16/03/2020 162
16/03/2020 163
16/03/2020 164
2- dénombrement des grands groupes microbiens
Actinomycètes
16/03/2020 165
champignon
Colonies obtenues après un premier

passage sur le milieu PDA
(A) ; les colonies de la boite de
Petri de gauche peuvent être
isolées à partir
d’un seul repiquage ; du fait d’une
sporulation, celles de la boite de
Petri de droite nécessiteront
plusieurs repiquages.
Culture d’Aspergillus clavatus
(B, à gauche) et de Fusarium
camptoceras (B, à droite) sur milieu
PDA.
16/03/2020 166
Plan
1 - Prélèvements
a) Echantillonnage
V- PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET DE NUMERATION DES MICROORGANISMES DANS LES ALIMENTS
16/03/2020 167
VI- ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE QUELQUES PRODUITS ALIMENTAIRES
(EXPOSES)
Bon courage
16/03/2020 168
Exposés à réaliser / Groupe
Sujet 1: Gestion de la qualité
microbiologique des produits laitiers
Sujet 2: Contrôle de Qualité des thés et
infusions
Sujet 3: Analyses, inspections et audits sur
les aliments transformés
Sujet 4: Biotechnologies: Contrôle Qualité
des Produits Alimentaires et Hygiène
16/03/2020 169

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Ecole Supérieur de

Pr. HAMDALI Hanane

III- Les milieux de culture

IV-GERMES IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

Contamination des produits dans l’industrie alimentaire

 La contamination est le terme médical utilisé pour

 Les causes de contamination sont divisées en 5

 1- Contamination liée au matériel , aux équipements.

 Les causes de contamination sont divisées en 5

 2- Contamination liée à la méthode.

 d’éviter les apports microbiens

 Les causes de contamination sont divisées en 5

 3- Contamination liée à la matière.

 Les causes de contamination sont divisées en 5

 4- Contamination liée au milieu.

 Les causes de contamination sont divisées en 5

 5- Contamination liée à la main d’œuvre.

La maîtrise de la qualité microbiologique

La maîtrise de la qualité microbiologique passe par un ensemble de

Ces analyses microbiologiques prennent aujourd’hui

 une bonne évaluation de la qualité et une mise en

L’analyse microbiologique traditionnelle des produits

Ce type de contrôle souvent pratiqué par des

 Le contrôle microbiologique de routine d’un produit alimentaire

- un contrôle de stérilité pour des produits soumis à des

 Ce contrôle est actuellement long (plusieurs jours), ce qui implique

- de stocker le produit en attendant la réponse (impossible pour les

- de diffuser le produit sans connaître sa qualité bactériologique avec

Les risques liés à la manipulation de

 La maîtrise du risque microbiologique passe par la parfaite

- des germes manipulés ou recherchés

 Les microorganismes sont classés en 4 groupes en fonction des risques

Le groupe 1: microorganismes peu dangereux pour le microbiologiste et

Le groupe 2: germes faisant courir des risques modérés aux manipulateurs

Le groupe 3: microorganismes à haut risque pour le manipulateur et à

Le groupe 4: microorganismes très dangereux pour le manipulateur et son

 Les voies de l’infection sont essentiellement :

- buccale (ingestion) : pipetage, porté à la bouche des doigts ou d’objets contaminés

- par contact cutané (Brucella, Staphylococcus ou encore Pseudomonas par

- par pénétration sous-cutanée accidentelle (par piqûre ou au niveau d’une plaie).

 Les microorganismes susceptibles d’être rencontrés appartiennent pour la

 Ceci impose donc des règles fondamentales de conception et de

L’eau, les matières premières et bon nombre de denrées alimentaires

La qualité marchande des produits dépend beaucoup du “contrôle “ de

 Les normes sont des spécifications microbiologiques adoptées par la

Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux

 La qualité hygiénique dépend surtout de la nature mais aussi du

 Si cette flore est composée de microorganismes susceptibles

 Il appartient alors au microbiologiste de détecter le ou les points

Au laboratoire, on recherche 4 types de germes qui sont cultivés dans

1- Microorganismes capables d’altérer la qualité marchande de

Ils renseignent sur: - La propreté des manipulations

Ils renseignent sur: - L’hygiène du personnel (mains sales)

4- Les germes potentiellement pathogènes: Responsables de TIAC (Toxi-

Les Staphylocoques Aureus

Les Clostridium perfringens

Les Listéria monocytogenes

Très schématiquement, la taille de l’échantillon d’un produit de même

Le laboratoire doit disposer d’environ 500 g de produits, soit 5 fois 100