Mécanismes de la catalyse enzymatique

Mécanismes de la catalyse enzymatique

Introduction Page facebook ; Domaine SNV : Biologie,Agronomie,Science Alimentaire,Ecologie

Une réaction enzymatique est caractérisé par le fait quelle se produit à l’intérieur d’une poche
formée par l’enzyme est appelé le site actif.

La molécule lie au site actif est sur laquelle l’enzyme fait la catalyse est appelé substrat.

Définition du site actif : le site actif d’un enzyme est la partie de la protéine nécessaire du
(ou des substrat (s)et à sa (leurs) transformation on produit (s) cette d2finition de site actif
implique l’existence de deux régions inséparable si on souhaite maintenir une activité
catalytique

 Une zone de fixation

 Une zone catalytique

Définition 2 : ensemble de groupes de résidus de la protéine qui entre en contact avec

le substrat par des liaisons faible pour en assuré la fixation et des groupe qui intervient dans
la catalyse proprement dit mais en sait que ces groupes dépendant de certains groupement qui
peuvent être éloignées de site de fixation et au site catalytique mais essentiel pour le maintien
de la conformation native donc en peut fournir ainsi une définition élargie qui peut inclure
tout la protéine.

 Quelque principe pour expliquer le pouvoir catalytique et la spécificité des

enzymes :

Cette poche est souvent bordée par des chaines latérales d’acides aminés non polaires,

Les enzymes sont des catalyseurs puissant capable d’augmenté les vitesses des réactions
enzymatique de 107 jusqu'à 1014

Les enzymes sont aussi très spécifiques ;

La question est d’où vient l’énergie qui permet d’abaissé spécifiquement l’énergie
d’activation de la réaction ?

Une partie de l’explication teint aux réactions chimiques entre le substrat et les groupements
fonctionnels d’enzyme :

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 Chaines latérale des acides aminées

 Ions métalliques
 Coenzymes

Ces groupements fonctionnelles d’enzyme augmentent les vitesses initiales de la réaction et

diminuent l’énergie d’activation (car elle permettre un chemin réactionnelle de moindre
énergie ;

L’autre partie est dû à l’énergie nécessaire à l’abaissement de l’énergie d’activation qui est
fournit par des interactions faibles non covalentes entre l’enzyme et le substrat ;

La distinction des enzymes par rapport d’autres catalyseurs et la formation des complexe
enzyme-substrat ;

La formation de complexe enzyme-substrat dépend de même force qui stabilise la structure de

l’enzyme ;

La formation de chaque interaction faible entre l’enzyme et substrat s’accompagné de petit

libération d’énergie (une liaison faible fourni l’énergie de 4 à 30 Kj/mol) ;

L’énergie prévenante des interactions enzyme-substrat est appelé énergie de liaison son rôle :

D’une part stabilisation du complexe enzyme-substrat

Principale source d’énergie libre utilise par les enzymes pour abaisser l’énergie d’activation
des réactions

 Les interactions faibles entre l’enzyme et le substrat sont optimisé dans l’état de
transition : pour catalysé une réaction, l’enzyme doit être complémentaire de l’état de
transition de substrat

Question : comment fonction les vrais enzymes ?

Des interactions faible sont formé dans le complexe Enzyme substrat mais la totalité des
interactions faible enzyme-substrat ne se forment que quand le substrat est a l’état de
transition ceci implique que l’énergie de liaison libérée par ses interaction permet d’atteindre
le sommait de la courbe en cloche sur le diagramme énergétique.

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Même en présence d’enzyme l’état de transition représente le bref instant qui passe par le
substrat au sommait de la courbe énergétique, simplement dans ce cas le sommait est moins
élevé quand l’absence de l’enzyme et la réaction est plus rapide.

Les interactions faibles formées uniquement dans l’état de transition, contribuent de façon
majoritaire à la catalyse enzymatique ;

Remarque : la nécessité de former de nombreuse liaison faible pour permettre la catalyse est
une des raisons pour laquelle des enzymes et coenzyme sont de si grosse molécules ;

L’utilisation de l’énergie de liaison est responsable de la spécificité et de la rapidité de la

réaction enzymatique.

La spécificité : c’est la capacité une enzyme à faire la différence entre deux substrat
compétiteur, si le site actif d’une enzyme a des groupement fonctionnelle disposés de
manière optimale pour formé des liaisons faibles avec un substrat donné à l’état de
transition ne sera aussi favorable pour autre substrat.

Exemple : si le substrat normale a un groupement hydroxyle OH qui forme nue liaison

hydrogène spécifiques avec un résidu GLU sur l’enzyme, une molécule ne possédant pas
se groupement hydroxyle sera un moins bonne substrat pour l’enzyme, par ailleurs une
molécule possédant un groupement supplémentaire pour le quel l’enzyme n’a ni poche ni
site de fixation a tout les chaines de n’être par reconnus par l’enzyme.

En générale la spécificité provient de la formation de multiple liaison faible entre

l’enzyme et les parties spécifiques de leur substrat, ces principes sont illustrés par
différent mécanisme catalytique connus

La rapidité : L’énergie de la liaison et responsable est suffisante pour expliqué

l’accélération des réactions enzymatiques.

Exemple : une liaison faible fournis une énergie de 4 à 30 KJ/mole, l’énergie globale
fournis par un certains nombres de liaisons de ce type peuvent fournir un abaissement de
60 à 80 KJ/mole de l’énergie d’activation ce qui permettre d’expliqué les grands
d’accélérations observées en présence de nombreux enzyme.

L’énergie de la liaison est la force principale intervenant dans plusieurs de mécanisme

catalytique et elle rend compte souvent à un seul de la catalyse enzymatique.

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 Des groupements catalytiques spécifiques contribuent à la catalyse

Une fois le substrat lié, différents mécanisme peuvent être employé par l’enzyme pour former
ou couper des liaisons en utilisant les groupements fonctionnels qui auront été correctement
positionnés, parmi ces mécanismes on trouve :

 La catalyse générale acide-base (transfert d’un proton).

 La catalyse covalente (elle suppose la formation d’une liaison covalente transitoire
entre l’enzyme et le substrat).
 La catalyse utilisation des ions métalliques

Une enzyme utilise une combinaison de plusieurs stratégies catalytiques pour aboutir à
l’accélération de la vitesse de réaction.

Le mécanisme de la chymotrypsine est un bon exemple d’utilisation à la fois de catalyse

covalente et la catalyse générale acide-base.

 Modification chimique de site actif :

 Méthodologie générale

Lorsqu’on modifier un groupement chimique d’une protéine pour interprété le résultat, il faut
déterminer d’une part l’effet de traitement sur l’activité catalytique ce qui se traduit par une
modification des paramètres cinétiques Km et Kcat.

D’autre part par la nature et la localisation du ou des groupements modifie.

Si en fait réagir un réactif chimique avec la protéine qui ‘est plus ou moins spécifique à la
fonction thiol, carboxylique ou amine, et ensuite en élimine l’excès de ce réactif et on test
l’activité catalytique par la détermination des paramètres cinétiques

Comparé ces paramètres au paramètres de l’enzyme non modifier :

Si il n’y a pas de changement de réaction catalytique (Km, Vmax) donc le groupement n’entre
pas dans la catalyse, si par contre l’enzyme est modifie cela veut dire que le réactif chimique
réagit avec l’enzyme et bloque un groupement nécessaire à la catalyse,

Cependant peu de réactif sont strictement spécifique à l’égard d’un seul groupement
chimique, il sera donc nécessaire de procédé à une analyse de la protéine modifié en
effectuant :

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 Une analyse globale des acides aminés avant et après la modification ;

 Une étude de modification spectrale de la protéine ;
 Une recherche de résidu modifié par un réactif radioactif.

Très souvent plusieurs résidus de même nature au différentes seront modifie et l’attribution a
l’un d’entre eux d’un rôle dans l’activité est très délicate. En ressoude cette difficulté on
étudiant on parallèle au cours de la modification chimique

 Le nombre et la nature des groupements modifiés ;

 L’évolution de l’activité de l’enzyme.
 en essayant d’établir une corrélation entre les deux cinétique ainsi rétablit

 Réactif d’acide aminée utilise

groupement Exemple de réactifs

-NH2 DNFB,anhydride acétique
-COOH carbodiimide
-SH iodacétate
-phénol Anhydrid acétiaue
-imidazole iodacétate
Pont S-S Dithoi-theitol, mercapto-éthanol

II. Topologie et identification des enzymes

Pour décrire avec précision le mécanisme d’action des enzymes il est nécessaire de connaitre
sa structure tridimensionnelle, c’est le cas de touts les protéines mais il est de plus lie la
structure à l’activité enzymatique. Comme il est difficile d’obtenir la structure des protéines
par cristallographie et diffraction des rayons X, l’étude des sites actif des enzymes est réalisé
par des méthodes indirect, soit en modifiant par vois chimique ou génétique certains acides
aminé, soit on utilise pour substrat des analogue variées.

Analyse cristallographique par diffraction des rayons X

Le principe et d’analysé de diffraction obtenu au moyen du bombardement par un faisceau de

rayon X, de cristaux d’enzyme,

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Une des difficultés de la technique est d’obtenir la formation de cristaux a partir d’une
solution concentré d’enzyme il existe de méthode générale de cristallisation toue fois on
cherche de part d’une solution protéine on provoque lentement la cristallisation :

La diffusion en phase gazeuse, La dialyse en solution

Le réseau cristallin est bombardé des rayons X monochromatique, le motif cristallin agit
comme un réseau de diffraction tridimensionnelle chaque fois que les rayons X rencontre les
électrons des atomes.

La structure de cristal, enzyme, ou le plus exactement la distribution de sa densité

électronique peut être calculé à partir du diagramme de diffraction,

Cette méthode soufre de deux limitations principales :

Technique délicate nécessite une grande patience et le soutien d’une importante logistique
pour l’analyse des spectres

La cristallographie des enzymes n’est pas a ce jour très simple a réalisé il est parfois difficile
voire impossible d’obtenir des cristaux stable.

III. Les modifications chimiques des enzymes

1. Généralité :

Le principe de cette approche et de faire agir un réactif avec l’enzyme de façon a conduire à
une modification covalent au niveau de la chaine latéral d’un ou plusieurs acide aminé.

L’idéal est déposé un réactif suffisamment spécifique pour une acide aminé donné, si ce
dernier appartient au site actif on peut s’attendre alors à ce que l’activité enzymatique
diminué a mesure de la modification et analyse cinétique de la variation d’activité peut alors
apporter des éléments d’information.

Pour compensé le manque de spécificité des réactifs, des marqueurs d’affinité ont était
conçus, se sont des analogues de ligand spécifique qui peut se fixer par des liaisons covalente.
L’inconvénient de cette méthode est qu’il faux pratiquement concevoir un réactif pour chaque
enzyme ou classe d’enzyme.

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2. Les réactifs spécifiques des groupements fonctionnels de la chaine latérale des

acides aminés

La réactivité des chaines latérales dépend de leur caractère nucléophile, celui-ci est influencé
par les conditions expérimentales et spécialement le pH

Liste des réactifs couramment employés pour la modification des résidus

Acide aminée réactifs

Asp, Glu Cardodimides, réactifs de Woodward(N-ethyle-5-phenylsoxagluim-3-
sulfonate)
Agr Butanedione,phenylglyocale
Lys Trinitrobenzensulfonate,
carbamylation parcyanate
His Diethypynocarbonate
Cys Iodoacetate
Tyr tetranitromethan
Ser Diisopylfluorophosphate
Trp N-bromosuccinide

3. Aspect cinétique de la modification chimique d’enzyme

Le principe et de suivre en fonction du temps la modification de l’enzyme à l’aide d’un

paramètre physicochimique ou à l’aide d’une mesure d’activité

4. Marqueur d’affinité :

Ce sont des molécules qui associe la spécificité lie a la reconnaissances enzyme-ligand et la

modification chimique due à la formation ultérieure d’une liaison covalente généralement par
alkylation, arylation . C’est cette liaison qui lés différenciés des inhibiteurs réversibles.

Exemple : le Tosyl-L-phenylalanine chromethylcéton (TPCK) réagit avec la chymotrypsine

au niveau d’une histidine de site actif entrainant une inhibition irréversible de l’enzyme,
l’analyse de l’inactivation montre que le TPCK agir comme un marqueur d’affinité.

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Pour connaitre l’importance d’un acide aminée au niveau de la structure et/ou de la fonction
de l’enzyme en peut envisager de le remplacer par un autre acide aminé et ensuit d’évaluer
l’effet de mutation ;

Le concept semble a priori simple mais la réalisation est pus complexe, puisque il faut
effectuer un changement très localisé dans la séquence peptidique, une telle approche a était
réaliser grâce au développement en 1984 par M. J. Zoller et M. Smith de la mutagénèse dirigé
on provoquant un changement ou niveau du gène non pas au niveau de protéines. Il suffit
alors d’évaluer l’effet de la mutation sur les propriétés structurales e t/ou biologiques pour
savoir si l’acide aminé initial joue un rôle important dans la structure non muté.

Exemple : pour la tyrosyl-ARNt-synthase de nombreuse mutation on était réalisé et l’activité

enzymatique correspondante mesuré

enzyme Efficacité Kcat/Km (mole/sec)

Enzyme no muté 8400
His 45→Gly45 1140
His45→Asn45 3
Thr51→Ala51 15900
Thr51→Pro51 208000

Les méthodes spectroscopiques

Ces techniques permettre d’obtenir des renseignements sur le changement conformationnel

qui se sont induits globalement soit sur un site spécifique, les informations sur la
conformation globale, ainsi que sur leur modification, peuvent êtres obtenus par des mesures
de fluorescence par dichroïsme circulaire ou par spectrophotométrie RNM .

IV. Mécanisme d’action et classification des coenzymes

Les coenzymes sont des cofacteurs indispensable à certains enzymes (appelé apoenzymes) un
même coenzyme est on générale est associer a des enzymes catalysant les réactions de même
type mais la spécificité de l’enzyme envers le substrat demeure liée à l’apoprotéine.

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La plus part des réactions enzymatiques faisant intervenir un coenzyme qui peuvent se
ramener à des réactions de transfert où un radicale R et transféré d’un donneur « D » a un
récepteur « A »

D-R + Coenzymes D + coenzyme-R

E + Coenzyme
D-R + A D + A-R 

Coenzymes-R A-R + coenzyme

Dans ces réactions le coenzyme intervient en soumissions ou radicale R puis en le transférant

à l’accepteur A

Les coenzymes engagé dan la première étape et régénéré dans la second, le coenzyme joue
donc un rôle catalytique à comme l’enzyme lui-même, selon les réactions, les deux étapes
peuvent être effectue par le même enzyme ou des enzymes différent ce qui conduit a distingué
deux types de coenzymes et donc de réaction.

Le 1er cas le composé intermédiaire coenzyme-enzyme n’est pas libéré; le coenzyme qui est
un groupement prosthétique demeure attacher a l’enzyme est intervient comme activateur.

Le 2eme cas le composé intermédiaire coenzyme-enzyme se dissocie de site actif, le coenzyme

qui est alors un substrat intervient comme transporteur.

Les coenzymes ont des origines diverse, certains son synthétisé à partir d’intermédiaires
métaboliques pour la plupart des nucléotides ou dérivés nucléotidique, d’autres drivent des
vitamines ; composés qui ne peuvent synthétiser par l’organisme animale et doivent donc
apporter par l’alimentation. Les principaux coenzymes sont répertoriés dans des tableaux
(voir planche)

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V. Mécanisme d’action de serine protéase :

Les serine protéase forment une superfamille d’enzyme à laquelle appartient avec beaucoup
d’autre la chymotrypsine la trypsine, élastase, subtilisine elle hydrolyse les liaisons peptidique
pour donné 2 peptides, les différentes serine protéase hydrolyse les liaisons peptidique du coté
carboxylique.

Ainsi les chymotrypsine du coté adjacent des acide aminés aromatique (Trp, Phe, Tyr) ;

La trypsine du coté carboxyle des acides aminés chargé positivement (Lys,Arg)

Chymotrypsine les structure tridimensionnel et établie par David Blow en 1967 est une
protéine globulaire compact de PM 25000 elle comporte trois chaine polypeptidique les
acides aminé de site actif sont regroupé dans la structure tridimensionnel.

VI. Activation des enzymes (proenzymes ou zymogènes) :

Chymotrypsinogène ------------- chymotrypsine

A.a

Constitue une régulation enzymatique dans l’organisme (liaison irréversible)

L’activation des zymogène représente un mécanisme de régulation enzymatique

Un précurseur inactif de l’enzyme appelé zymogène est coupée pour donné l’enzyme actif,
beaucoup d’enzyme protéolytique (protéases) de l’estomac et de pancréas sont régulées de
cette manière.

Exemple : la chymotrypsine et la trypsine sont initialement synthétisé sous forme

chymotripsinogène et trypsinogène, des coupure spécifiques provoque des changement de
conformation qui expose le site actif de l’enzyme, au cour de l’activation de chymotrypsine
les résidus 14-15 et 147-148 sont excisés et les trois chaines polypeptidiques résultant reste
liées l’une à l’autre par des ponts disulfures.

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VII. Mécanisme d’action de pyridoxal phosphate

Le pyridoxal phosphate est un cofacteur (coenzyme) c-a-d un groupement prosthétique pour

nombreux enzyme, dérivé de vitamine B6.

Le pyridoxal 5’phosphate dérive de pyridoxine ou pyridoxal c’est le groupement prosthétique

de nombreuse enzyme intervenant dans le métabolisme des acides aminés.

 Réaction de transamination
 Réaction de décarboxylation
 Réaction de désamination
 Réaction de racémisation

Le pyridoxal phosphate est lie a l’apoenzymes par une liaison aldimine (-CH=N-) base de
Shiff entre le groupement aldéhydique et ɛ-amine de résidu de lysine on absence de substrat et
par des liaisons ioniques impliquant le groupement phosphoryle

Exemple 01 réaction de transamination

Exemple 02 réaction de racimesation

Exemple 03 réaction de decarboxylation

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Mécanisme d’action

La formation d’une base de shiff entre le groupement aldéhydique et le groupement amine

(qui déplace la lysine) fragilise en particulier les liaisons –C-Cα- et Cα-N selon l’apoenzyme
la coupure de l’une ou d’autre libère une amine par décarboxylation où un acide α cétonique
par transamination

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