‫الجمهىريت الجسائريت الديمقراطيت الشعبيت‬

République Algérienne Démocratique et Populaire

‫وزارة التعليم العالي والبحث العلمي‬
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
‫ قالمت‬1945 ‫ ماي‬8 ‫جامعت‬
Université 8 Mai 1945 Guelma

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la terre et de l’Univers

Mémoire En Vue de l’obtention du diplôme de MASTER

Domaine : Science de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences biologiques
Spécialité : Microbiologie Appliquée
Département : Écologie et Génie de l’Environnement

Thème

Les risques infectieux dans les laboratoires de microbiologie

Présenté par :

BOUSSAHA Samira

YESSAAD Malika

Devant le Jury composé de :

Président : RAMDANI Kamel (MCB) Université de Guelma

Encadreur : HOUHAMDI Moussa (Prof.) Université de Guelma
Co-encadreur : KIRAT Hassina (Doctorante) Université de Skikda
Examinateur : MERZOUG Abdelghani (MCB) Université de Guelma

Année universitaire 2021-2022

 DÉDICACES

Je dédie ce mémoire

À mes chers parents

Pour leur confiance et leur sacrifice compréhension, leur patience, leur amour inestimable,
leur soutien et leurs encouragements.
Je souhaite que dieu les garde en bonne et parfaite santé et leur donne une longue vie.

À ma chère sœur

Pour son soutien et sa gentillesse.

À mes chers frères

Pour leur soutien et leur confiance

À mon cher mari

Pour ses conseils et son soutien

À mon binôme‹‹Malika››

Je la remercie pour le courage qu'elle m'a donné et tous les moments qu'on a passé ensembles

À tous ceux qui m’ont aidé de près ou de Loin lors de la réalisation de ce travail

Merci à tous

Samira
 DÉDICACES

Je dédie ce mémoire

A mes chers parents

Pour tous leurs sacrifces, leur amour, leur tendresse,

Leur soutien et leur priéres tout au long des mes études

A mes chéres fréres et leurs enfants

source de joie et de bonheur

A toute ma famille, source d’espoir et de motivation

A Samira

Chère amie avant d’être binôme

Pour ton support et ton amour

Et au final à toutes personnes qui m’ont aidé de prés ou de lion

Malika
 Remerciements
Notre premier remerciement va à ALLAH, le tout puissant qui nous a aidés pour réussir à
nos choix dans cette vie et réaliser ce modeste travail.

Nous tenons particulièrement à remercier notre promoteur et directeur de mémoire

Professeur Mr: HOUHAMDI Moussa

Nous le remercions de tout cœur, mais ce n’est pas pour avoir fait l’honneur d’accepter de
diriger ce travail seulement, nous le remercions pour le partage des savoirs de la vie et la
connaissance avec nous, pour la patience et la confiance, pour la disponibilité et de son
grand aide durant la réalisation de ce travail. Merci pour les encouragements qui nous ont
indiscutablement permis d’évoluer.

Nous souhaitons aussi à remercier tous les membres de jury présent aujourd’hui.

Au Dr : RAMDANI Kamel (MCB) Pour l’honneur qu’elle nous a fait en présidant ce jury.

et Dr: MERZOUG Abdelghani (MCB) Pour avoir accepté d’examiner ce travail.

J’adresse mes sincères remerciements à tous les professeurs, intervenants et toutes les
personnes qui par leurs paroles, leurs écrits, leurs conseils et leurs critiques ont guidé nos
réflexions et ont accepté à nos rencontrer et répondre à nos questions durant notre Parcours
et nos recherches.
A la fin nous remercions tous nos collègues et particulièrement ceux et celles de notre
promotion.
A tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail.
 Liste des abréviations
AMC : Amoxyclav

AMX : Amoxicilline

C : Chloramphénicol

E : Erythromycin

GEN : Gentamycine

MH : Mueller Hinton

P : Pénicilline
 Liste des tableaux
Numéro Titre Page

01 Consignes avant d’entrer dans la salle 8

02 Consignes avant le début de la manipulation 9
03 Consignes pendant la manipulation 9
04 Consignes Après la manipulation 10
05 Liste des antibiotitiques utilisés 21
06 Résultats de lecture macroscopique des colonies après culture 25
07 Nombre des germes isolés 27
08 Résultats de l’observation microscopique après coloration 28
09 Résultat de l'observation microscopique après coloration 29
10 Résultats des tests « Catalase, Oxydase» 30
11 Résultats des tests coagulases 31
12 Fréquences des bactéries isolées 33
13 Résultats de l'antibiogramme de Enterobacter cloacae 34
14 Résultats de l'antibiogramme de Staphylococcus xylosus 35
15 Résultats de l'antibiogramme de Myroide spp 37
 Liste des figures
Figure Titre Page
01 Laboratoire de microbiologie 2
02 Exemple de tenue de protection individuelle 4
03 Pictogramme utilisés pour caractériser les propriétés des gants, la 6
technique de retrait des gants
04 Illustration d’un masque médical et d’un appareil de protection 7
respiratoire
05 Technique standardisée de friction des mains 7
06 Récipient contenant un liquide biologique cassé 11
07 Contamination par contact 11
08 Les prélèvements 13
09 L’isolement d'échantillons 14
10 Ensemencement par stries 15
11 Test de catalase 17
12 Test d'oxydase 17
13 Protocole d'utilisation de système (API 20E) 18
14 Lecture de l'antibiogramme 21
15 Aspect macroscopique sur gélose nutritive 26
16 Aspect macroscopique sur gélose Chapman 26
17 Aspect macroscopique sur gélose Mac Conkey 27
18 Nombre de germe isolé 27
19 Observation microscopique des cocci Gram positif en amas après 28
coloration de Gram
20 Observation microscopique des bacilles Gram négatif après 29
coloration de Gram
21 Résultats de l’observation microscopique après coloration 29
22 Résultat de catalase positive (+) 30
23 Résultat d’oxydase négative (-) 30
24 Résultat d’oxydase positive (+) 31
25 Résultats des tests coagulases pour les souches de Staphylococcus 31
26 Résultat API 20 E de la souche Enterobacter cloacae 32
27 Résultat API STAPH de la souche Staphylococcus xylosus 32
28 Résultat API 20 NE de la souche Myroide spp 32
29 Api STAPH de la souche Staphylococcus xylosus 32
30 Api 20 E de la souche Enterobacter cloacae 32
31 Api 20 NE de la souche Myroide spp 33
32 Pourcentage des espèces présentes 33
33 Antibiogramme du germe Enterobacter cloacae 34
34 Représentation graphique des résultats de l’antibiogramme appliquée 34
à Enterobacter cloacae
35 Antibiogramme du germe Staphylococcus xylosus 35
36 Représentation graphique des résultats de l’antibiogramme appliquée 35
à Staphylococcus xylosus
37 Antibiogramme du germe Myroide spp 36
38 Représentation graphique des résultats de l’antibiogramme appliquée 36
à Myroide spp
 Sommaire
Dédicaces
Remerciements
Liste des abréviations
Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction 1
Chapitre I : Synthèse Bibliographique
1. Définitions 2
1.1. Laboratoire de microbiologie 2
1.2. Risque infectieux 2
2. Infections acquise au laboratoire 2
2.1. Type d’infections 2
2.1.1. Infection Bactriennes 2
2.1.2. Infection virale 3
2.1.3. Infection fongique et parasitaires 3
3 Les voies de contamination 3
3.1. Voie aérienne 4
3.2. Voie digestive 4
3.3. Voie cutanée et oculaire 4
4. Stratégie de la maitrise du risque infectieux 4
4.1. Protection individuelle 4
4.1.1. La tenue de travail 4
4.1.2. Ports des gants 5
4.1.3. Masque et lunette 6
4.2. D’infection des mains 7
4.3. D’infection des paillasses 8
4.4. Vaccination 8
5 Le bonne pratique du personnel 8
6 Mesure de contamination 10
Chapitre II : Matériel et Méthodes
1. Cadre d’étude 13
2. Objectif 13
3. prélèvements 13
4. Enrichissement 13
5. Isolement 13
5.1. Milieux gélosés utilisés 14
5.1.1. Gélose nutritive 14
5.1.2. Gélose Chapman 14
5.1.3. Gélose Mac Conkey 14
5.2. Ensemencement par stries parallèles 14
6. Etude microbiologique 15
6.1. Caractère morphologique 15
6.1.1. Observation macroscopique 15
6.1.2. Observation microscopique 16
6.2. Identification biochimique 16
a. Recherche de la catalase 16
b. Test d’oxydase 17
c. Test coagulase 18
d. Les galeries d'identification biochimique 18
6.3. Etude de la sensibilité et la résistance bactérienne 20
6.3.1. Préparation d’inoculum 20
6.3.2. Milieu d'ensemencement 20
6.3.3. Technique d'inondation 20
6.3.4. Application des disques 20
6.3.5. Incubation 20
6.3.6. La lecture 20
Chapitre III : Résultats et Discussion
1. Caractères macroscopiques 25
2. Observation microscopique 28
3. Identification 30
3.1. Test préliminaires (catalase, oxydase, coagulase) 30
3.2. Résultats des Tests biochimiques (API 20E, API 20NE, API STAPH) 32
4. L'antibiogramme 34
Conclusion 38
Références Bibliographiques
Annexes
Résumé
Introduction

Les agents infectieux sont les micro-organismes capables d’envahir et de se multiplier au

sein des tissus des organismes vivants (animaux ou végétaux). Ces micro-organismes peuvent
causer des maladies lorsque leur multiplication n’est pas contrôlée par l’immunité de
l’organisme cible. Ces organismes sont transmissibles, autrement dit un individu sain peut
s’infecter au contact d’un individu infecté (Podglajen, 2020).
Au cours de la manipulation dans un laboratoire de microbiologie on peut contracter un
certain nombre du risque. Parmi lesquels, le risque infectieux est liée a la manipulation
d’agents potentiellement pathogènes ou des produits biologiques contaminés par des agents
pathogènes que ça soit bactérie, virus, parasite ou champignon et qui peut se faire par
différentes voies : aérienne, digestive ou cutanneo-muqueuse (Teyssou, 2001).
Notre démarche désignée dans la recherche des microorganismes pathogènes dans les
locaux du laboratoire de microbiologie de l’Université 8 Mai 1945 de Guelma est structurée
en trois chapitres interdépendants :
 Le premier est dédié à la partie théorique où sont exposées des données sur les
bactéries pathogènes et leurs risques sanitaires.
 Le deuxième décrit la méthodologie suivie pour la réalisation pratique de ce thème,
soit les prélèvements, les études macro et microscopique des souches isolées et l’étude
de leur sensibilité aux agents antimicrobiens standardisés.
 Le troisième expose les résultats obtenus et leur discussion. Il est suivi par une
Conclusion générale qui clôture cette étude.
 Synthèse
Bibliographique
 Synthèse Bibliographique

1. Définitions
1.1. Laboratoire de microbiologie
Un laboratoire de microbiologie est un lieu où sont prélevés et analysés divers fluides
biologiques d'origine humaine ou animale sous la responsabilité des biologistes médicaux, qui
en interprètent les résultats dans le but de participer au diagnostic et au suivi de certaines
maladies (Bouhma, 2020).

Figure 01. Laboratoire de microbiologie (Bouhma, 2020).

1.2. Risque infectieux

C’est un risque d’infection lié à l’exposition à des agents biologiques, Il peut en résulter
des maladies professionnelles (Bouhma, 2020).
2. Infections acquise au laboratoire
2.1. Type d’infection
2.1.1. Infections bactériennes
 Entérobactéries

Les Entérobactéries appartiennent à une grande famille qui regroupe des bacilles à Gram
Négatif (BGN). Cette famille comporte plusieurs genres, espèces et sérotypes.
La classification récente (hybridation ADN-ADN) recense 31 genres et plus de 140 espèces.
Parmitousles genres et espèces décrits, une vingtaine est impliquée en pathologie humaine:
Escherichiacoli, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Entérobacter, Proteus.

2
 Synthèse Bibliographique

 Staphylococcus

Les Staphylocoques sont des cocci à Gram positif très résistants dans le milieu extérieur.
Le genre Staphylococcus comporte deux espèces :
• Staphylococcus aureus (le Staphylocoque à coagulase positive) qui possède un potentiel
de pathogénicité important, impliqué dans les infections communautaires et nosocomiales.
• Staphylocoques à coagulase négative: pathogènes opportunistes impliqués dans les
Infections nosocomiales (Sompiev, 2017).
2.1.2. Infections virales
Les risques viraux majeurs au laboratoire concernent les virus transmis par le sang et les
liquides biologiques, en particulier les virus des hépatites B et C et le virus
d’immunodéficience acquise (VIH). Le risque de transmission régresse grâce à
l’automatisation des techniques qui réduit dans certains secteurs de biologie les expositions
directes, et grâce à l’application des précautions standards de sécurité, ainsi qu’à la
vaccination hépatite B. Actuellement en 2020 durant la pandémie causé par le virus SARS
COV-2 (nouvelle dénomination nCov-2019) de la famille des coronavirus, qui était ajouté aux
risques viraux majeurs au laboratoire vu la variabilité de ces voies de transmission (Bouhma,
2020).
2.1.3. Infections fongiques et parasitaires
Les rares infections fungiques décrites sont dues aux champignons Dismorphiques:
Blastomyces dermatitidis, Coccidioïdes immitis et Histoplasma capsulatum, très rarement
isolés en France. La voie de contamination prédominante est la voie respiratoire à l’origine
d’infections pulmonaires (Bouhma, 2020).
3. Les voies de contamination
3.1. Voie aérienne
C'est le Principale voie d’entrée, mais également la plus insidieuse, elle se fait par
inhalation d’aérosols créés au cours des manipulations :
• par gouttelettes de grandes tailles (> 5μm), se projetant sur des distances courtes (< 1 m) et
pouvant se déposer sur les conjonctives, muqueuse buccale ou nasale (virus de la grippe,
VRS, pneumocoque, B. pertussis…) (Bataillon et al., 2017).
• par aérosols
(particules < 5μm) sous forme de gouttelettes asséchées ou de poussières contenant des micro-
organismes assez résistants dans l’environnement, véhiculables sur des distances assez

3
 Synthèse Bibliographique

longues (plusieurs dizaines de mètres) et pouvant être inhalés (agents infectieux de la

tuberculose, de la variole, de la rougeole, du charbon…) (Bataillon et al., 2017).
3.2. Voie digestive
Les interdictions de pipeter à la bouche, de boire, de manger et de fumer dans les
laboratoires ont considérablement diminué le risque de contamination par ingestion.
Cependant, le non-respect des règles élémentaires d’hygiène (porter ses mains à la bouche
sans les avoir lavées, sucer un stylo…) constitue encore un risque non négligeable (Bataillon
et al., 2017).
3.3. Voies cutanée et oculaire
La contamination peut se faire par projection dans l’œil, ou sur peau saine et surtout lésée
mais également à la suite d’une piqûre, coupure, morsure, griffure. Certains pathogènes
peuvent traverser la peau saine, soit naturellement (Schistosoma mansoni), soit si un produit
facilite le passage par la peau (DMSO qui perméabilise la peau) (Bataillon et al., 2017).
4. Stratégies de la maitrise du risque infectieux
4.1. Protection individuelle
4.1.1. La tenue de travail
La tenue de travail est l’ensemble des pièces vestimentaires nécessaires à l’exercice
professionnel. Elle est associée à l’aspect physique général : cheveux propres, attachés si
besoin (cheveux longs), absence de bijoux aux mains et aux poignets. La tenue est revêtue au
début du travail, quittée pour les pauses, la prise des repas et à la fin de la journée de travail.
Elle comporte une tenue de protection et des chaussures de travail (spécifiques à l’activité),
confortables, faciles à entretenir, à bouts fermés, antidérapantes, de sécurité si besoin (Société
française d'hygiéné hospitalière, 2007).

Figure 02. Exemple de la tenue de protection individuelle [1].

4
 Synthèse Bibliographique

4.1.2. Port des gants

C'est une mesure de prévention contre la contamination par contact. Ceux-ci sont
effectivement probables au cours de n'importe quelle manipulation classique.
• Le port des gants ne doit pas dépasser au maximum 45 minutes. Il sera limité à la
manipulation des prélèvements et matériels souillés (Echantillon, Automate, Plan de travail).
• En revanche, les gants doivent être ôtés pour tout acte « propre » (téléphone...), et pour
tout contact cutané (visage, lèvres,.....) Le gant doit être adapté :
• A la morphologie de la main (taille adéquate).
• A l’acte réalisé (Société française d'hygiéné hospitalière, 2007).
Changer de gants :
• Entre chaque séquence d’examen différent.
• En cas de gants visiblement troués.
Retirer les gants sans se souiller les mains :
• Oter le premier gant en tirant sur le bout des doigts.
• Une fois la première main dégantée, introduire le pouce dans la manchette du second gant
et enlever celui-ci en le retournant
Après usage :
• Jeter immédiatement les gants à usage unique avec les déchets à risques spécifiques (société
française d'hygiéné hospitalière, 2007).

5
 Synthèse Bibliographique

Figure 03. (1) Pictogramme utilisés pour caractériser les propriétés des gants, (2) La
technique de retrait des gants (Société française d'hygiéné hospitalière, 2007).

4.1.3. Masque et lunette

Le masque est une protection efface contre la transmission par voie respiratoire. Il est choisi
en fonction du risque. Les lunettes de protection protègent contre les risques de projection sur
la conjonctive. Le port de masque et lunettes ne sont pas toujours indispensable (Société
française d'hygiéné hospitalière, 2007).

6
 Synthèse Bibliographique

Figure 04. Illustration d’un masque médical et d’un appareil de protection respiratoire
(Société française d'hygiéné hospitalière, 2007).

4.2. Des infections des mains

Lavage réguliers, correctement réalisé d’améliorer la tolérance cutanée du lavage des mains, il
faut d’abord se mouiller les mains puis ajouter le savon, se laver les mains, rincer avec une
action mécanique : paume contre paume.
1- Paume de la main droite sur le dos de la main gauche et inversement.
2- Paume contre paume et doigt entrelacés.
3-Dos des doigts contre paume opposée avec les doigts emboites.
3-Friction en rotation du pouce gauche enchâssé dans paume droite.
4-Friction en rotation et mouvement de va-et-vient avec les doigts joints (société française
d'hygiéné hospitalière, 2007).

Figure 05. Technique standardisée de friction des mains (société française d'hygiéné
hospitalière, 2007).

7
 Synthèse Bibliographique

4.3. Des infections du paillasse

Nettoyer avec un agent tensioactif à l’aide d’un papier absorbant, à éliminer ensuite avec
les déchets à risque infectieux en portant des gants de ménage.
• Rincer à l’eau.
• Désinfecter en laissant agir le produits désinfectant (exemple : l’eau de javel degrés
chlorométrique, fraichement préparée, durant 5 minutes) mis à l’aide d’un papier absorbant à
éliminer avec les déchets à risque infectieux.
• Rincer ou non selon le produit.
Ces opérations doivent etre pratiquées intégralement au moins une fois par jour.
4.4. Vaccination
Ces vaccinations peuvent être soit obligatoires soit recommandé (Société française d'hygiéné
hospitalière, 2007).
Vaccination recommandées :
• Vaccination contre l’hepatite A (virologie, corpologie).
• Vaccination contre la rubéole pour les femmes non immunisées.
• Vaccination contre la rage (laboratoire manipulant du matériel contaminé par cet agent ou
susceptible de l’etre) (Société française d'hygiéné hospitalière, 2007).
 Vaccinations obligatoires
• Tuberculose.
• Typhoïde : une injection, puis revaccination tous les trois ans.
• Diphtérie : rappel tous les 10 ans avec un vaccin contenant une dose réduite d’anatoxine.
• Tétanos-poliomyélite : rappel tous les 10 ans.
• Hépatite : la vaccination doit être faite ou reprise, jusqu’à détection d’anticorps anti-HBs
dans le sérum.
5. Le bonne pratique de personnel
Tableau 01. Consignes avant d’entrée dans la salle (Lacroix, 2009)

Consignes Justifications
Jeter chewing -gom ou autre aliment en cours Eviter contamination digestive
de consommation.
Déposer les vêtements de ville dans le Eviter contamination de l’environnement
vestiaire, ou à l’écart des zones à risque
(téléphone portable).
Attacher les cheveux longs vers l’arriére. Eviter risque inflammation et contamination

8
 Synthèse Bibliographique

du produit manipulé
Oter les bijoux des doigts et poignets. Eviter le risque de contamination du produit

Tableau 02. Consignes Avant le début de la manipulation (Lacroix, 2009)

Consignes Justifications
Fermer les portes et les fenêtres. Eviter les courants d’air et l’extinction de la
flamme du bec.
Mettre une blousse en Cotton couvrants Eviter les risque inflammable, elle peut être
avants bras et genoux, fermée (blouse javellisée et laver à 90°C.
réservée au laboratoire).
Protéger les blessures non cicatrisées par un Eviter contamination manipulateur.
pansement ou un gant si blessure importants
Nettoyer et désinfecter la paillasse Elimination des microorganismes
Se laver les mains à l’aide d’un désinfectant. Elimination des microorganismes sur la peau.
Lire le protocole et réfléchir à l’organisation Eviter les déplacements inutiles.
du tp.

Tableau 03. Consignes Pendant la manipulation (Lacroix, 2009)

Consignes Justifications
Avoir des agents mesurés et contrôlés se Eviter les courants d’air et la formation des
déplacer le moins possible. aérosoles.
Avoir un poste de travail bien organisé Eviter les confusions et les accidents.
marquer les produits, tube.
Ne jamais pipter à la bouche Eviter la contamination digestive.

Ne jamais rien porter à la bouche

(doigts, stylo, aliments, boisson).

Limiter l’usage d’objets coupant, piquant Eviter la contamination cutanée –muqueuse

9
 Synthèse Bibliographique

Ne pas toucher les objets personnels, ne pas Eviter la contamination à l’extérieur du

serrer la main des visiteurs. laboratoire.
Toujours travailler dans la zone stérile du bec Eviter la contamination des produits
bunsen Ne pas parler en manipulant. manipulés.

Tableau 04. Consignes Après la manipulation (Lacroix, 2009)

Consignes Justifications

Stérilisé convenablement le matériel non Eviter les contaminations

jetable contaminé
Eliminer convenablement les matériels Eviter contamination des autres usagers de la
contaminés jetable salle
Nettoyer et désinfecté la paillasse Eviter contamination des autres usagers de la
salle
Ranger la blouse à l’écrart des vêtements de Eviter la dissémination des microorganismes
ville à l’extérieur du laboratoire
Se laver les mains Eliminer les microorganismes

6. Mesure en cas de contamination

 Contamination par liquide :
(Tube de bouillon de culture ou récipient contenant un liquide biologique cassé,) (Ben Hadj,
2017)

10
 Synthèse Bibliographique

Figure 06. Recipient contenent un liquide biologique cassé (Ben Hadj, 2017).

 Contamination par contact :

(Plaque de milieux de culture qui tombent par terre, échantillon clinique qui tombe sur surface
de travail.
• Porter des gants.
• Recouvrir de papier absorbant imbibé de désinfectant. éviter de verser le désinfectants de
haut (surtout pour les sparays) ce qui peut engendrer des aérosols.
• laisser agir
• Eponger et jeter le matériel souillé dans un conteneur adéquat (Ne jamais manipuler du verre
cassé directement avec les mains, même gantées, mais utiliser une brosse et une
remassoire...etc.)

Figure 07. Contamination par contact (Ben Hadj, 2017).

11
Matériel
et

Méthodes
 Matériel et Méthodes

1. Cadre d'étude
Cette étude a été réalisée dans laboratoire de microbiologie à l’Université 8 Mai 1945,
Guelma durant la période allant du 13 février au 22 mars 2022.
2. Objectifs
Le but de notre travail est :
• L'isolement et l'identification des bactéries responsables d'une infection dans laboratoire
microbiologie.
• L'évaluation des risques infectieux au niveau du laboratoire de microbiologie.
3. Prélèvements
Durant la période d'étude, 16 prélèvements ont été effectuées à partir des 4 endroits au
niveau du laboratoire de microbiologie (poignet de la porte, microscope optique, paillasse,
robinet).
Selon la méthode suivante :
• Introduit un écouvillon coton stérile dans le bouillon nutritif et éliminer l'excés de liquide
par essuiyant l'écouvillon sur la paroi du tube.
• Passer l'écouvillon imbibé sur les surfaces des endroits mentionné précédemment sans les
avoir nettoyé auparavant.
4. Enrichissement
• Déposer l'écouvillon des chaque prélèvement dans 5 ml de boillon nutritif.
On utilisé le bouillon nutritif qui de par sa composition, crée des conditions particulièrement
favorables au micro-organisme [2].
• Étiqueter les tubes (date, heure et l'endroit de prélèvement).
• Incubés les tubes dans l'étuve à 37°C pendant 24h.

Figure 08. Les prélèvements (photo personnelle).

13
 Matériel et Méthodes

5. Isolement
L'isolement a été fait dans différent milieux de culture (Gélose Nutritive, Chapman, Mac
Conkey).
5.1. Milieux gélosés utilisés
5. 1.1 .Gélose nutritive
Est un milieu d'isolement non-sélectif, la gélose nutritive apporte les éléments nutritifs
nécessaires à la croissance d'une large gamme de micro-organismes, elle est utilisée pour la
culture de bactéries et pour les matériaux [3].
5.1.2. Gélose Chapman
La gélose Chapman ou gélose au sel de mannitol est un milieu sélectif utilisé pour
l'isolement, le dénombrement et la différenciation des Staphylococcus à partir d'échantillons
cliniques, alimentaires, antiseptiques et cosmétiques [3].
5.1.3. Gélose Mac Conkey
Est un milieu sélectif et différentiel utilisé pour l'isolement et la différenciation de bacilles à
Gram négatif non exigeants, en particulier les membres de la famille des Entérobactéries [3].

Figure 09. Isolement d'échantillons (photo personnelle).

5.2. Ensemencement par stries parallèles

L’inoculum, prélevé à partir d’un bouillon de culture, est déposé sur un point périphérique
de la plaque gélosée. La gouttelette de culture est disséminée sur toute la gélose en décrivant
des stries parallèles. La boite est ensuite incubée 24 - 48h à 37°C [4].

14
 Matériel et Méthodes

Figure 10. Ensemencement par stries [3].

6. Etude microbiologique
6.1. Caractère morphologique
6.1.1. Observation macroscopique
Après incubation, observer à l'œil nu les colonies bactériennes développées sur ces milieux
gélosés en boîtes de Pétri et noter leurs caractères culturaux (la couleur, la forme des colonies,
la taille, la transparence, le contour...etc.)
A. Taille
-petites colonies:< 1mm.
-colonies moyennes: 1,5 à 3 mm.
-grosses colonie: > 2mm.
B. Forme de colonie
-à bords circulaire.
-irrégulières et parfois envahissantes.
-déchiquetées et parfois envahissantes (Haouam et Boucheligha, 2019).
D. Transparence (en lumière naturelle et artificielle)
-colonies transparentes.
-colonies translucides.
-colonies opaques (Haouam et Boucheligha, 2019).

15
 Matériel et Méthodes

E. surface
-colonies lisses.
-colonies muqueuses (aspect en coulée de miel).
-colonies rugueuses (aspect comme le cuir) (Haouam et Boucheligha, 2019).
6.1.2. Observation microscopique
Cette observation est réalisée à l'aide de frottis pratiqués à partir des colonies obtenues et
ayant subi une coloration de gram.
• Les frottis sont observés au microscope optique à l'objectif d'immersion (×100) .
Coloration de Gram (coloration différentielle)
La coloration de Gram est la coloration différentielle microbiologique la plus importante et la
plus largement utilisée, elle permet de différencier les bactéries selon 2 critères principaux :
Forme : Paires, Tétrades, Groupes, Chaînes, Lancettes...etc.
Affinité pour les colorants : Gram positif ou Gram négatif [3].
Technique
• Préparer et fixer une suspension de la souche bactérienne.
• Recouvrir le frottis d’une solution de violet de gentiane ; laisser agir une minute.
• Entrainer le violet par la solution de lugol. Recouvrir la lame de lugol et laisser agir
1minute sans laver à l’eau.
• Décolorer aussitôt par l’alcool acétone ; pour cela, verser l’alcool à la surface de la
préparation placée obliquement et observer sa couleur en s’écoulant, il est d’abord violet puis
bleuté et enfin incolore ; arrêter à ce stade.
• laver rapidement à l’eau courante (eau distillée).
• Recouvrir la lame de solution de fuchsine et laisser agir 20 à 30 secondes.
• Laver et sécher entre deux feuilles de papier filtre.
• Observer à l'objectif à immersion [4].
Les Gram+ (Gram positifs) apparaissent en violet, les Gram- (Gram négatif) apparaissent
en rose [4].
6.2. Identification biochimique
a. Recherche de la catalase
La catalase est une enzyme contenant du fer, qui catalyse la décomposition du peroxyde
D’hydrogène (H2O2) en eau et en oxygène. Synthétisée par la plupart des bactéries aérobies,
Elle élimine le peroxyde d'hydrogène produit au cours du métabolisme aérobie. Le test de la
Catalase sert à détecter la présence de cette enzyme dans une souche bactérienne donnée. Il
Consiste essentiellement à exposer les cellules bactériennes au peroxyde d’hydrogène : la

16
 Matériel et Méthodes

Présence de catalase se marque par la formation de bulles de gaz (oxygène) (Singleton,

2004).
Selon la réaction :
H2O2 ½ O2 + H2O

Figure11. Test de catalase [5].

b. Test d’oxydase
Appelé aussi phénylène diamine oxydase est une enzyme intervenant dans divers couples
d'oxydo-réduction. Ce test est à la base de l’identification des bactéries à Gram (-).
• Placer un disque d’oxydase sur une lame propre et stérile.
• Déposer à l’aide d’une pipette pasteur (il est strictement interdit d’utilisé l’anse de platine
pour ne pas fausser le résultat) une goutte de suspension bactérienne pure sur " un disque
oxydase", celui-ci contient de l’oxalate de diméthyle paraphénylène diamine.
• Les bactéries oxydase-positives donnent rapidement une coloration violette foncée ; dans
le cas contraire, il n’ya pas de coloration [5].

Figure 12. Test d'oxydase [5].

17
 Matériel et Méthodes

c. Test coagulase
Une version du test en tube consiste à ajouter dans un tube à essai, 0,5 ml d’une culture
liquide (dans un bouillon cœur cervelle) de 18 à 24 heures de la souche à tester à 1 ml de
plasma. Le tube est maintenu à 37 °C et est examiné après 1, 2, 3, 4 et 24 heures, pour voir si
un caillot s'est formé (Singleton, 2005).
d. Les galeries d'identification biochimique
• La galerie (API 20 E)
La galerie API 20 E est un système d’identifications des Enterobacteriaceae et autres
bacilles à Gram négatif non fastidieux (Leyral et al., 1998).
Technique
• Prélever à l'aide d'une pipette, une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé.
• Réaliser une suspension bactérienne en homogénéisent soigneusement les bactéries dans
une ampoule de suspension Medium (5 ml) ou dans un tube d'eau distillée stérile.
• Remplir les tubes et les cupules des tests : CIT, VP, GEL avec la suspension bactérienne.
• Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.
• Créer une anaérobiose dans les tests : ADH, LDC, ODC, URE, H2S en remplissant
Leurs cupules de l’huile de paraffine.
• Placer la galerie dans la boite d’incubation puis l’incuber à 37°C pendant 18 à 24 heures
(Leyral et al., 1998).

Figure 13. Protocole d'utilisation de système (API 20E) [5].

18
 Matériel et Méthodes

Lecture de la galerie
• Après l'incubation, la lecture de la galerie est réalisée en se référant au tableau de lecture.
• Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées.
• Révéler les tests nécessitant l'addition de réactifs (TDA, IND et VP).
L’identification est obtenue à l’aide d’un logiciel d’identification (Leyral et al., 1998).
• La galerie (API STAPH)
La galerie API STAPH est un système d’identification des genres Staphylococcus et
Micrococcus (Leyral et al., 1998).
Technique
• Préparer une suspension bactérienne homogène dans une ampoule d'API STAPH Medium
avec une seule colonie bien isolé sur milieu gélosé (Leyral et al., 1998).
• Remplir les tubes de la galerie avec API STAPH Medium ensemencé.
• Créer une anaérobiose dans les tests : ADH et URE en remplissant leurs cupules d'huile de
paraffine.
• Placer la galerie dans la boite d’incubation puis l’incuber à 37°C pendant 18 à 24 heures
(Leyral et al., 1998).
Lecture de la galerie
• Après l'incubation, la lecture de la galerie est réalisée en se référant au tableau de lecture.
• Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées.
• Révéler les tests nécessitant l'addition de réactifs (VP, NIT et PAL).
L’identification est obtenue à l’aide d’un logiciel d’identification (Leyral et al., 1998).
• La galerie (API 20 NE)
API 20 NE est un système standardisé pour l'identification des bacilles à Gram négatif non
Entérobactéries est non fastidieux (ex: Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Flavobactérium.
etc.) (Leyral et al., 1998).
Technique
• La même technique d'API 20 E.
• Après l'incubation juste 2 tests (NO, TRP) doivent être ajoutés des réactions (NIT1-NIT2,
KOVACS).
Lecture de la galerie
• la lecture de la galerie est réalisée en se référant au tableau de lecture.
• Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées.
• Révéler les tests nécessitant l'addition de réactifs.
L’identification est obtenue à l’aide d’un logiciel d’identification (Leyral et al., 1998).

19
 Matériel et Méthodes

6.3. Etude de la sensibilité et la résistance bactérienne

La détermination de la sensibilité aux antibiotiques des bactéries isolées est fondée sur
l’antibiogramme (Eyquem et al., 2000), ces méthodes reviennent fondamentalement à classer
un germe en fonction d’une CMI estimée et des concentrations critiques (Flandrois, 1998), la
méthode de diffusion en milieu gélosé (méthode des disques) représente la méthode la plus
utilisée en laboratoire (Eyquem et al., 2000 in Kirat et Agabi, 2019).
6.3.1. Préparation d’inoculum
A partir d’une culture visible du prélèvement, réaliser une suspension bactérienne en
solution salée pour atteindre une turbidité équivalente à celle de l’étalon 0,5 de la gamme de
MacFarland (Société Française de Microbiologie, 2018).
6.3.2. Milieu d'ensemencement
Le milieu standardisé utilisè la gélose de Mueller-Hinton est un milieu solide standardisé
recommandé pour l'étude de la sensibilité des bactéries aux agents antimicrobiens [3].
L'épaisseur de la gélose doit être de 4 mm car elle influe sur la concentration en
antibiotique dans le milieu après addition des disques (Joffin et al., 2009).
6.3.3. Technique d'inondation
• Inonder la boîte avec 3 à 5 cm de suspension prélevée à la pipette .Veiller à bien répartir la
suspension en inclinant la boîte dans toutes les directions.
• Réaspirer soigneusement à la pipette l'excés de suspension (Joffin et al., 2009)
6.3.4. Application des disques
Déposer à la surface les disques d'antibiotiques choisis en les appuyant légèrement à
l'aide de la pince stérilisée .On veillera à ne pas chauffer les disques par la pince flambée.
Un disque appliqué ne peut et doit être distants d'environ 30 mm (Joffin et al., 2009)
6.3.5. Incubation
L'incubation de l'antibiogramme se fait à l'étuve à 37°C pendant 18h-24 heurs.
6.3.6. La lecture
• Mesurer les diamètres des zones d'inhibition au millimètre le plus proche avec une règle .
• Interpréter les diamètres des zones d’inhibition par référence aux tableaux où figurent les
concentrations critiques.
• Classer la bactérie dans l’une des catégories : Sensible, Intermédiaire ou Résistante
(Société Française de Microbiologie, 2018).

20
 Matériel et Méthodes

Figure 14. Lecture de l'antibiogramme [3].

Tableau 05. Liste des antibiotiques utilisés.

Antibiotique Famille Charge (μg) Abréviation

Pénicilline β-lactamine 10 P
Gentamicine Aminosides 10 GEN
Erythromycine Macrolides 15 E
Amoxicilline β-lactamine 25 AMX
Chloramphénicol Phénicolés 30 C
Amoxyclav β-lactamine 30 AMC

21
Résultats
et

Discussion
 Résultats et Discussion

1. Caractères macroscopiques
Pour chaque prélèvement, on réalise l'isolement des souches bactériennes sur les différents
milieux de culture utilisées, Les principaux caractères culturaux sont résumés dans le tableau
suivant :

Tableau 06. Résultats de lecture macroscopique des colonies après culture.

Gélose nutritive Gélose Chapman Gélose Mac Conkey

01 -Colonie petites, -Colonies petites, - Aucune pousse.
moyen, grandes, arrondies,
Poignet de la
arrondies, blanchâtres, blanchâtres et jaune
porte
lisses, à Contours doré lisses, à
réguliers, Légèrement contours réguliers.
bombées.
02 -Colonies petites, - Colonies petites, - Colonies petites,
arrondies, blanchâtres, arrondies, grandes, arrondies,
Robinet
lisses, à Contours blanchâtres et jaune Rose, lisses, à
réguliers. doré lisses, à Contours réguliers,
contours réguliers. Légèrement bombées,
crémeuses.
03 -Colonies petites, -Colonies petites, - Aucune pousse.
moyen, grandes, moyen. arrondies,
Microscope
arrondies, blanchâtres, blanchâtres, à
lisses, à Contours contours réguliers.
optique
réguliers, Légèrement
bombées.
04 -Colonie petites, -Colonies petites, -Colonies petites,
moyen, grandes, moyen, arrondies, arrondies, Rose, lisses,
Paillasse
arrondies, blanchâtres, blanchâtres et jaune à Contours réguliers,
lisses, à Contours doré lisses, à Légèrement bombées,
réguliers, Légèrement contours réguliers. crémeuses.
bombées.

25
 Résultats et Discussion

L’étude des prélèvements a été réalisée suivant un protocole bien déterminé. L’isolement a
été effectué dans des boites de Pétri gélosées (gélose nutritive, gélose Mac Conkey, gélose
Chapman) et incubés à 37°C pendant 24h. Après incubation, nous avons procédé en premier
lieu à un examen macroscopique ou nous avons trouvés des colonies avec les caractéristiques
suivantes :
• Colonies arrondies, blanchâtres, lisses, à contours réguliers, légèrement bombées sur
gélose nutritive.
• Colonies arrondies, blanchâtres et jaune doré lisses, à contours réguliers sur gélose
Chapman.
• Colonies volumineuses, arrondies, bombées, lisses, crémeuses avec un contour régulier,
de couleur rose sur gélose Mac Conkey.

Figure 15. Aspect macroscopique sur gélose nutritive (photos personnelles).

Figure 16. Aspect macroscopique sur gélose Chapman (photos personnelles).

26
 Résultats et Discussion

Figure 17. Aspect macroscopique sur gélose Mac Conkey (photos personnelles).

• Résultats des prélèvements selon le nombre des germes isolés

Le tableau 08 et la figure 16 montrent les nombres des germes isolés de chaque endroit de
prélèvement.

Tableau 07. Nombre des germes isolés.

L'endroit de prélèvements nombres des germes

Poignet de la porte 7
Robinet 8
Microscope optique 4
Paillasse 9

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Poignet de la Robinet Microscope Paillasse
porte optique

Figure 18. Nombre de germe isolé.

27
 Résultats et Discussion

2. Observation microscopique
Au total 28 frottis ont étè realisés a partir des colonies précèdents, leur observation
après coloration de Gram a mis en évidence la présence des cocci à Gram positif (CG+)
regroupés dans 19 frottis pratiqués à partir de gélose chapman.
Alors que les bacilles à Gram négatif ( BG-) ont été trouvés dans 9 frottis réalisés à partir de
la gélose Mac Conkey.
Les résultats obtenus sont représentés dans le tableau suivant :

Tableau 08. Résultats de l’observation microscopique après coloration.

Gélose Chapman Gélose Mac Conkey

01 Poignet de la porte Cocci Gram+ \
02 Robinet Cocci Gram+ Bacille Gram-
03 Microscope optique Cocci Gram+ \
04 Paillasse Cocci Gram+ Bacille Gram-

Figure 19. Observation microscopique des cocci Gram positif en amas après coloration de
Gram (Gx100) (photo personnelle).

28
 Résultats et Discussion

Figure 20. Observation microscopique des bacilles Gram négatif après coloration de Gram
(Gx100) (photo personnelle).

Tableau 09. Résultat de l'observation microscopique après coloration.

obervation Effectifs Fréquences

CG+ 19 68%
BG- 9 32%
Totale 28 100%

CG+ BG-

32%

68%

Figure 21 : Résultats de l’observation microscopique après coloration.

29
 Résultats et Discussion

3. Identification
3.1. Résultats des Tests préliminaires
Les résultats des différents tests (catalase, oxydase) réalisés sur les différents prélèvements
obtenus sont présentés dans le tableau suivant :

Tableau 10. Résultats des tests « Catalase, Oxydase».

Milieu Gélose Chapman Gélose Mac Conkey
Test CAT OX CAT OX
01 Poignet de la porte (+) / / /
02 Robinet (+) / / (-)
03 Microscope optique (+) / / /
04 Paillasse (+) / / (+)

• Test catalase: Réaction positif pour la totalité des colonies isolées de cocci Gram positif,
ce qui conduit à estimer que ce sont des Staphylocoques.

Figure 22. Résultat de catalase positive (+) (photo personnelle).

• Test oxydase: négatif pour la totalité des colonies isolées sur gélose Mac Conkey, ce
qui mène à présumer leur appartenance à la famille des Enterobacteriaceae, à l'exception de
deux colonies pour laquelle le test était positif (non Enterobacter ) .

Figure 23. Résultat d’oxydase négative (-) (photo personnelle).

30
 Résultats et Discussion

Figure 24. Résultat d’oxydase positive (+) (photo personnelle).

• Test coagulase
Le test de coagulase était négative pour les colonies de Staphylocoques testées, cela
indique l'absence de l'espèce Staphylococcus aureus.

Tableau 11. Résultats des tests coagulases.

Prélèvement Coagulase
01 (-)

Poignet de la porte
02 (-)

Robinet
03 (-)

Microscope optique
04 Paillasse (-)

Figure 25. Résultats des tests coagulases pour les souches de Staphylococcus (photo
personnelle).

31
 Résultats et Discussion

3.2. Résultats des Tests biochimiques

Nous avons utilise 3 types de galeries API (20 E, 20 NE et API STAPH), Après la
préparation et l'incubation des galeries on a observé plusieurs espèces de cellules
bactériennes.

Figure 26. Résultat API 20 E de la souche Enterobacter cloacae (photo personnelle).

Figure 27. Résultat API STAPH de la souche Staphylococcus xylosus (photo personnelle).

Figure 28. Résultat API 20 NE de la souche Myroide spp (photo personnelle).

Figure 29. Api STAPH de la souche Staphylococcus xylosus (code 6737713) (photo
personnelle).

Figure 30. Api 20 E de la souche Enterobacter cloacae (code 7306573) (photo personnelle).

32
 Résultats et Discussion

Figure 31. Api 20 NE de la souche Myroide spp (code 0310004) (photo personnelle).

Tableau 12. Fréquences des bactéries isolées.

Espèce Nombre Fréquence

Staphylocoques 15 68%
Enterobacteries 5 23%
Non Enterobacteries 2 9%

Staphylocoques Enterobacter Non Enterobacter

9%

23%

68%

Figure 32. Pourcentage des espèces présentes.

Nous avons poursuivi notre étude par une identification biochimique de toutes les souches
isolées et ceci par l’utilisation des galeries d’identification API (API 20 NE et API 20 E).
Nous avons ainsi retrouvé : Une abondance (68,18%) des staphylocoques (ex: Staphylococcus
xylosus), Enterobacter (22,73%) (ex: Enterobacter cloacae), et (9,09%) Non (ex: Myroide
spp).

33
 Résultats et Discussion

4. Antibiogramme :
Après l'incubation sur milieu Mueller Hinton (MH) à 37° C pendant 24h, nous avons
obtenus les résultats suivants.

Tableau 13. Résultats de l'antibiogramme de Enterobacter cloacae :

P GEN AMX AMC C E

Enterobacter cloacae 6 mm 25 mm 16 mm 20 mm 26 mm 12 mm

R S I S S I

Figure 33. Antibiogramme du germe Enterobacter cloacae (photo personnelle).

30

25

20

15

10

0
P GEN AMX AMC C E

Figure 34. Représentation graphique des résultats de l’antibiogramme appliquée à

Enterobacter cloacae.

34
 Résultats et Discussion

Nous avons mesuré des grandes sensibilités sur le milieu MH pour la plus part des
antibiotiques. Enterobacter cloacae présente une sensibilité (S) marquée par rapport à la
Gentamicine et le Chloramphénicol et l'Amoxyclav et intermédiaire (I) par rapport à
l’Erythromycine et l’Amoxicilline et une résistance (R) par rapport à la Pénicilline.

Tableau 14. Résultats de l'antibiogramme de Staphylococcus xylosus :

P GEN AMX C E
Staphylococcus 6 mm 30 mm 11 mm 31 mm 10 mm
xylosus.
R S I S I

Figure 35. Antibiogramme du germe Staphylococcus xylosus.

35
30
25
20
15
10
5
0
P GEN AMX C E

Figure 36. Représentation graphique des résultats de l’antibiogramme appliquée à

Staphylococcus xylosus.

35
 Résultats et Discussion

Pour Staphylococcus xylosus nous avons mentionné une sensibilité (S) par rapport à la
Gentamicine et le Chloramphénicol, et intermédiaire (I) par rapport à l’Erythromycine et
l’Amoxicilline, et une résistance par rapport à la Pénicilline.

Tableau 15. Résultats de l'antibiogramme de Myroide spp :

P GEN AMX AMC C E

Myroide 6 mm 32 mm 6 mm 28 mm 12 mm 10 mm
spp
R S R S I I

Figure 37. Antibiogramme du germe Myroide spp (photo personnelle).

30
25
20
15
10
5
0
P GEN AMX AMC C E

Figure 38. Représentation graphique des résultats de l’antibiogramme appliquée à Myroide

spp.

36
 Résultats et Discussion

Pour Myroide spp nous avons mentionné une sensibilité (S) par rapport à la Gentamicine et
l'Amoxyclav, et intermédiaire (I) par rapport à l’Erythromycine et Chloramphénicol, et
résistance par rapport à la Pénicilline et l’Amoxicilline.

37
Conclusion :
Dans cette étude qui vise à isoler et à identifier les bactéries pathogènes des ustensiles et du
matériel du laboratoire de microbiologie montrant ainsi leurs risques potentiels de provoquer
des infections et des maladies pouvant provoquer des hospitalisations du personel hospitalier
(maladies professionnelles) et des malades fréquentants ces lieux.
Ainsi, nos échantillons prelevés de plusieurs endroits du laboratoire de microbiologie
de notre faculté nous ont montrés que tous les prélevements sont souvent polymicrobiens et
renfrement plusieurs espèces bactréiennes. A noter que certains lieux du laboratoire (paillasse
et robinet) sont plus contaminés que d’autres (poignet de la porte et microscope optique). Ceci
est lié à leurs utilisations et à leurs usages fréquents. La majorité des espèces isolées
appartiennent à la famille des Enterobactériaceae (Escherichia coli, Enterobacter cloacae,
Myroides spp…etc.) et des Micrococacceae (Staphylococcus xylosus). Ces bactéries bien que
classées banales peuvent être à l’origine de nombreuses maladies.
Outre ces résultats, ces bactéries isolées et testées à plusieurs antibiotiques, réalisée
par la méthode des diffusions sur surfaces gélosées de Mueller-Hinton, exhibent des
résistances très variables aux antibiotiques. Dans la majorité des cas, ces espèces sont
plyrésistantes. De ce fait, nos résultats ont montré qu’en plus de leur résistance naturelle
toutes les souches étudiées présentent une résistance acquise à au moins un antibiotique testé.
Ainsi, pour gérér ces risques infectieux et éviter ou minimiser les contaminations dans
ces lieux considérés comme des sources de contamination et de contagion, il faut maintenir
des règles d’hygiène et de sécurité appropriées. la sensibilisation ainsi que la conscience du
personnel (les étudiants, les ensignants et les techniciens des laboratoires) et toutes personnes
utilisant ces locaux est obligatoire. Le suivi du protocole d'hygiéne, la stérilisation du matériel
et des postes de travail est de ce fait primordial. Ainsi, pour permettre à l’ensemble du
personnel un travail dans des conditions optimales, il est à suggérer des solutions adéquates et
non impossibles tout en assurant le suivi des bonnes pratiques au laboratoire :
 Obligation de l’utulisation des gants, des masques et des lunettes de protection au
cours de toutes les manipulations à risque.
 Nettoyage et désinfection régulière des paillasses et du matériel utilisé.
 Vaccinations à jour de tos le personnel et des étudiants utilisant ces laboratoires.
 Formation : prévoir des séances de formations sur les risques infectieux dans les
laboratoires de microbiologie et des autres laboratoires qui doit inclure un
enseignement relatif aux mesures de sécurité.

38
 Références bibliographiques

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laboratoires de microbiologie. Laboratoire de bactériologie : Institut Pasteur de Tunis,
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prévention santé, sécurité, environnement, CNRS, 4 édition.
Bouskraou M. Zohair S. Benaouda A. Soraa N, Zerouali K et Mahmoud M. (2017).
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vaccinologie.
Eyquem A. Alouf J. et Montagnier L. (2000). Traité de microbiologie clinique : deuxièmes
mises à jour et compléments. 2éme édition. Padoue, Italie.
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[2]:https://www.humeau.com/media/blfa_files/TC_300-Nutritif-bouillon_FR_230215.pdf
(consulté 06 Avril 2022).
[3]: https://microbiologie clinique.com (consulté 06 Avril 2022).
[4]:https://fsnv.univ-setif.dz/techarger/EDT2017/TP_Microbiologie 2eAnnee_SNV.pdf.
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[5] : https://fac.umc.dz /cours/TP_Bactériologie.pdf.
Manuel des Travaux Pratiques de Bactériologie- Université Des Fréres Mentouri- (consulté
05 Mai 2022).
Annexes :
Annexe 1 : Matériel et réactifs utilisés dans notre étude.

Appareillages Milieux de culture Réactifs et colorant Autres matériel

- Autoclave. - Bouillon Nutritif - Violet de Gentiane - Étiquettes

- Étuve. - Gélose Nutritive - Fuchsine - Anse de platine
- Réfrigérateur. - Gélose Chapman - Huile de cèdre - Bec bunsen
- Four Pasteur. - Gélose Mac - Lugol - Boites de pétri
- Bain marié Conkey - Réactifs de Kovacs stériles
- Bouillon coeur - Réactif de TDA - Scotch
cervelle - Voges-Proskauer - Marqueur
-Gélose Mueller (VPI, VPII) - Écouvillons
Hinton - Réactif de (NITI, - Micropipette
NITII) - Tubes à hémolyse
- Disques - Système API 20E
d’antibiotique - Système API 20NE
-Système API
STAPH
- Lames
- Lamelles
- Pipettes Pasteur
- Tubes à essai stérile

Annexe 2 : les réactifs des colorants

Tableau de la composition des réactifs des colorants.

Colorants Produit Composition

Violet de Gentiane -Violet de gentiane 1g
- Ethanol à 90% 1ml
- Phénol 2g
- Eau distillée 100ml
Lugol - Iode 1g
- Iodure de potassium 2g
- Eau distillée 100ml
Fuschine Fuchsine basique 1g
- Alcool éthylique 100ml
- Phénol 15g
- Eau distillée 100ml
Réactif TDA (pour la - Perchlorure de fer 3,4g
recherche de tryptophane - Eau distillé 100ml
désaminase)
Réactif Kovacs (pour la - Paradimethylaminobenzaldéhyde 5g
recherche de l’indole) - Alcool isoamylique 75ml
- HCL 37% 25ml
Réactif VPI (pour la - Hydroxyde de potassium 40g
recherche de l’acétoïne) -Eau distillée 100ml
Réactif VPII (pour la - Alpha naphto 6g
recherche de l’acétoïne) - Ethanol 100ml
Réactif NIT I (pour la - Acide sulfamilique 0.8g
recherche du nitrate - Acide acétique 5N 100ml
réductase)
Réactif NIT II (pour la - Naphtylamine 0.5g
recherche du nitrate - Acide acétique 5N 100ml
réductase)

Annexe 3 : les milieux de culture

Composition : Formule en grammes par litre d'eau distillée.

Tableau de la composition des milieux de cultures.

Milieu Produits Composition

(g/l)
Bouillon Nutritif -Tryptone 10,0
-Extrait de viande 5,0
-Chlorure de sodium 5,0
-Eau distillée 1000ml
Gélose nutritive - Tryptone 5,0
 - Extrait de viande 1,0
- Extrait de levure 2,0
- Chlorure de sodium 5,0
- Agar agar bactériologique 12,0
- PH : 7,4
Gélose Chapman - Peptone 10
- Extrait de viande de boeuf - 1
Chlorure de sodium 75
- Mannitol 10
- Rouge de phénol 0,025
- Agar-agar 15
- Eau distillé
- PH : 7,4
Gélose Mac Conkey - Peptone 20
- Lactose 10
- Sels Biliaires 1,5
- Cristal violet 0,001
- Rouge Neutre 0,05
- Chlorure de sodium 5
- Agar 15
- PH : 7,1
Bouillon cœur cervelle - Protéose-peptone 10
(B.H.I.B). - infusion de cervelle de veau - 12.5
infusion de cœur de bœuf
- glucose 5
- chlorure de sodium 25
- hydrogénophosphate de sodium 2,5
- PH 7,4
Gélose Mueller-Hinton - Infusion de viande de bœuf 300
- Hydrolysat de caséine 17,5
- Amidon 1,5
- Agar 17
- pH : 7,4
Annexe 4 : Tableaux de lecture des Galeries biochimiques.

Tableau de lecture de Galerie biochimique API 20E

Tests Groupements active Réactions/ Enzymes Résultats

ONPG Ortho-nitro- Beta-galactosidase Positive Négative
phényle-B-D- Incolore Jaune
Galactopyranosi
ADH Arginine Arginine désahydrolase Jaune Rouge/orange

LDC Lysine Lysine décarboxylase Jaune Orangé

ODC Orthine Ornithine décarboxylase Jaune Rouge/orange

‫׀‬CIT‫׀‬ Sodium citrate Utilisation de citrate Vert Bleu-

vert/orange
H2S Thiosulfate de sodium Production de H2S Incolore Noir
URE Urée Uréase Jaune Rouge/orange

TDA Tryptophane Tryptophane désaminase Jaune Marron

IND Tryptophane Production d’indole Incolore Rose

‫׀‬VP‫׀‬ Pyruvate de sodium Production d’acétoine VP1+ VP2
Incolore Rose/rouge
‫׀‬GEL‫׀‬ Gélatine emprisonnant de Gélatinase Pas de Diffusion de
charbon diffusion de pigment noir
pigment noir
GLU Glucose Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune/vert
jaune
MAN Mannitol Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune
INO Inositol Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune
SOR Sorbitol Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune
RHA Rhamnose Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune
SAC Sucrose Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune
MEL Melibiose Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune
AMY Amygdaline Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune
ARA Arabinose Fermentation /oxydation Bleu/bleu vert Jaune
𝐍𝐨𝟑 - GLU tube Production de NO2 NIT 1+NIT
𝐍𝐎𝟐 réduction N2 gaz 2, 2-3 min
Jaune Rouge

Tableau de Lecture de galerie biochimique API 20NE

Tests Substrat Enzymes/Réactions Résultats

𝐍𝐎𝟑 Nitrate de potassium Réduction des nitrates Négatif Positif
en nitrites
NIT 1 + NIT 2 / 5 min
Réduction des nitrates Incolore Rouge-rose
en azote ZN / 5 min
Rose Incolore
TRP Tryptophane Formation d’indole TRP / 3-5 mn
Incolore Goutte rouge
GLU Glucose Fermentation Fermentation Bleu à vert Jaune
ADH Arginine Arginine Jaune Orange/rose/
DiHydrolase Rouge

URE Urée Uréase Jaune Orange/rose/

Rouge
ESC Esculine Hydrolyse Jaune Gris/marron/Noir

GEL Gélatine Hydrolyse Pas de Diffusion du

diffusion du pigment noir
pigment
PNPG p-nitro-phényl-β- β-galactosidase Incolore Jaune
Dgalactopyranoside
GLU Glucose Assimilation
ARA Arabinose
MNE Mannose
MAN Mannitol
NAG N-acétylglucosamine
MAL Maltose Transparence Trouble

GTN Gluconate
CAP Caprate
ADI Adipate
MLT Malate
CIT Citrate
PAC Phényl-acétate
OX Tetraméthyl-p-phenylène Cytochrome Incolore Violet
Diamine oxydase

Tableau de Lecture de galerie biochimique API STAPH

Tests COMPOSANTS Enzymes/Réact Résultats

ACTIFS ions Négatif Positif
0 Aucun Témoin négatif Rouge -
GLU D-glucose Témoin Positif Rouge Jaune
FRU D-fructose acidification
MNE D-mannose acidification
MAL D-maltose acidification
LAC D-lactose acidification
TRE D-tréhalose acidification
MAN D-manitol acidification
XLT xylitol acidification
MEL D-mélibiose acidification Rouge Jaune

NIT Nitrate de potassium Réduction des NIT 1 + NIT 2 /10 min

nitrates en Incolore-rose Rouge
nitrites pâle
PAL β-naphtyl phosphate Phosphatase ZYM A + ZYM B /10 min
Alcaline Jaune Violet
VP Sodium pyruvate Production VP 1 + VP 2 / 10 min
d'acétyl méthyl- Incolore-rose violet-rose
carbinol pâle
RAF D-raffinose acidification
XYL D-xylose acidification
SAC D-saccharose acidification Rouge Jaune
MDG Méthyl-αD- acidification
glucopyranoside
NAG N-acétyl-glucosamine Acidification
ADH L-arginine Arginine Jaune Rouge/orange
DiHydrolase
URE urée UREase Jaune Rouge/violet
Résumé :

Le laboratoire de microbiologie a cause des manipulations des échantillons riche en

microorganismes très diversifiés (bactéries, virus ou parasites est présente un lieu à risque
surtout infectieux. Ces microorganismes sont des agents pathogènes, responsables des
infections acquises au laboratoire.
Ainsi, en cas des non respects des stratégies de maitrise des risques, ces
microorganismes peuvent être une source majeure et importante d’infection respiratoire et
cutanée. L’objectif principal de notre étude réalisée durant la période allant du 13 février au
22 mars 2022 est l’étude (isolement et identification) des bactéries susceptibles de jouer une
responsabilité des contaminations dans le laboratoire de microbiologie de l’Université 8 Mai
1945 de Guelma et évaluer leur Resistance et/ou leur sensibilité vis-à-vis aux des
antibiotiques standardisés.
Les résultats obtenus nous montrent la présence d’un grand nombre des bactéries sur
les quatre lieux de prélèvement (poignet de la porte, robinet, microscope optique, paillasse).
Les principales bactéries isolées sont (staphylococcus xylosus, Enterobacter cloacae, Myroide
Spp) La majorité de ces microorganismes sont résistants aux agents antimicrobiens utilisés ce
que peut être considérer comme un risque de contamination assez important et un fléau de
santé publique. De ce fait et pour éviter ces problèmes de contamination, des pratiques
rigoureuses et régulières doivent impérativement appliquées.
Mots clés : Risque infectieux, laboratoire de microbiologie, bactéries, contamination,
microorganismes.
Summary :

Due to its permanent exposition to contaminants, microbiology laboratorypresents a high

risk of microbial infections. These microorganisms may be pathogenic agents, responsible for
infections acquired in the laboratory.Thus, in the event of non-compliance with risk
management strategies, these microorganisms can be a major and important source of
respiratory and skin infections. The main objective of our study carried out during the period
from February 13 to March 22, 2022 is the study (isolation and identification) of bacteria
likely to be responsible for contamination in the microbiology laboratory of the University
May 8, 1945 of Guelma and assess their resistance and/or sensitivity to standardized
antibiotics.The results obtained show the presence of a large number of bacteria at the four
sampling locations (door handle, faucet, optical microscope, bench). The main bacteria
isolated are (Staphylococcus xylosus, Enterobacter cloacae, Myroide Spp). The majority of
these microorganisms are resistant to the antimicrobial agents used, which can be considered
as a fairly significant risk of contamination and a public health scourge. As a result, and to
avoid these contamination problems, rigorous and regular practices must imperatively be
applied.

Keywords: Infectious risk, microbiology laboratory, bacteria, contamination,

microorganisms.
 ‫ملخص‪:‬‬

‫ًَثم يخزجز عهى األحُبء انذقُقخ يكبَب يعزضب نخطز انعذوي ثسجت انزالعت ثبنعُُبد (انجكزُزَخ أو انفُزوسُخ أو‬
‫انطفُهُخ) حُش رعزجز غبنجُخ هذِ انكبئُبد انذقُقخ كبئُبد يقبويخ نهعىايم انًسزخذيخ كًضبداد حُىَخ‪ .‬وفٍ حبنخ عذو‬
‫االيزثبل السززارُجُبد إدارح انًخبطز ًَكٍ أٌ ركىٌ هذِ انكبئُبد انحُخ انذقُقخ يصذرا رئُسُب نالنزهبثبد ويهذدح نهجُئخ‬
‫وانصحخ انعبيخ‪.‬‬

‫رى خالل انفززح يٍ ‪ 13‬إنً ‪ 22‬يبرس ‪ 2022‬دراسخ انجكززَب انزٍ َحزًم أٌ ركىٌ يسؤونخ عٍ انزهىس فٍ يخزجز‬
‫األحُبء انذقُقخ ثجبيعخ ‪ 8‬يبٌ ‪ 1945‬فٍ قبنًخ‪ ،‬حُش قًُب ثعزل ورحذَذ انجكزُزَب ثبإلضبفخ إنً يعزفخ يذي يقبويزهب‬
‫وحسبسُزهب نهًضبداد انحُىَخ انًعُبرَخ‪.‬‬

‫ا)‪staphylococcus xylosus‬‬ ‫أظهزد انُزبئج انذ ٌ رى انحصىل عهُهب وجىد عذد كجُز يٍ ثكزُزٌ‬
‫‪ )Enterobacter cloacae,Myroide spp‬فٍ أرثعخ يىاقع ألخذ انعُُبد (يقجض انجبة‪ ،‬انصُجىر‪ ،‬انًجهز انضىئٍ‬
‫وسطح طبونخ انعًم)‪ .‬ونزجُت يشكم انزهىس فٍ انًخزجز الثذ يٍ رطجُق قىاعذ يُظًخ وصبريخ‪.‬‬

‫الكلماث المفتاحيت‪ :‬يخبطز يعذَخ‪ ،‬يخزجز عهى األحُبء انذقُقخ ‪ ،‬ثكزُزَب‪ ،‬رهىس‪ ،‬انكبئُبد انحُخ انذقُقخ‪.‬‬