Microbiologie Sv5 FF

Filière: Sciences de la Vie
Département de Biologie
Module de Microbiologie II
Génétique Microbienne
Semestre 5 (2022-2023)
Plan de cours
1 Les mutations 5 La transduction
2 Les Antibiotiques 6 Recombinaison

génétique
3 la transformation 7 La transposition
4 la conjugaison 8 Les plasmides

Nomenclature et définitions
Un locus
 (pluriel=loci) se désigne par un groupe de 3 lettres en italique
 est une position fixe (d'un gène ou d'un marqueur génétique) sur un chromosome
Un locus
Ex: his = locus de biosynthèse de l’histidine (hisA, hisB,...etc).

lac = locus de dégradation du lactose.
Le génotype et le phénotype
Le génotype : liste des gènes qui nous intéresse en indiquant si le gène est du type sauvage ou muté.
his+: gène sauvage qui donne la capacité de synthétiser l’Histidine, his ou his-: gène mutant.
Le phénotype : Ensemble des propriétés observables d’un organisme.
His+ avec H majuscule: la souche est capable de croître sans histidine, His- : la souche est incapable
de croître sans histidine)
Une souche
culture pure des bactéries
Souche sauvage de référence Souche parentale

échantillonnage effectué dans la souche portant une
nature mutation dans son
génome
Souche mutante
souche d’origine du mutant

Inoculation Incubation
(ensemencement) addition des processus de maintien de
cellules bactériennes au milieu. la température et autre
Les bactéries ajoutées conditions désirées pour la
s’appellent l’inoculum. croissance bactérienne.
Une culture
milieu liquide ou solide
contenant des bactéries qui
ont poussé ou entrain de
pousser.
Un milieu
solide ou liquide spécialement préparé pour la croissance ou le stockage des bactéries
Les Milieux de culture des bactéries
M ou M0 MMS MC
(Milieu minimum) (Milieu supplémenté) (Milieu complet)
Prototrophes Auxotrophes Prototrophes

Auxotrophes
Les Milieux de culture des bactéries
Ex :
L’opéron Lactose
L’opéron Lactose
Chapitre I : Les mutations
La génétique bactérienne a commencé depuis la découverte du Microscope optique, les bactéries sont
devenues un matériel de choix à cause de leur division rapide : Escherichia coli (20 min) ou encore de leur
encombrement "limité" (dans un tube de 22 mm).
Maintien des
caractères (Fidélité de la réplication)
ADN
variabilité Elaboration des

génétique caractères
(Mutations) (via les protéines)
Variations
génotypiques
phénotypiques
ou mutations
• Phénomènes d’adaptation, Induites, réversibles, instables, non fixées

• Mutations (rares)
• Affectent l’ensemble d’une population
• fortuites, stables
Ex: Variation de la Morphologie d’Arthrobacter au cours de sa croissance
(cytomorphose) selon les conditions de la culture. • fixées et transmissibles
héréditairement
Repérage et isolement
des
mutants.
Mutants non
Mutants
sélectionnables,
résistants à un
identifiables sur
antibiotique
milieu indicateur
Mutants
d’auxotrophie
(compensables)
Mutants
résistants à un Mutation sélectionnable, Avantage particulier en termes de croissance
antibiotique
Exemple: sélection de mutants résistants à la streptomycine (but= isolement de ces mutants dans
une population sensible de 10*6 à 10*9 bactéries)
Aucun avantage en termes de croissance.
Mutants non
Exemple : mutants Lac- dans une population sauvage Lac+, les Lac+
sélectionnables,
identifiables sur synthétisent la Bêta-galactosidase qui dégrade le lactose en glucose et galactose.
milieu indicateur
Milieu indicateur, milieu complet +X-gal (BCIG: bromo-chloro-indolyl-
galactopyranoside) le X-gal est un analogue du lactose qui est dégradé par la
Bêta-galactosidase en deux composés dont l’un est bleu.
-Traitement de la culture par un agent mutagène pour augmenter le taux de mutation.
Mutants
d’auxotrophie -Procéder à un enrichissement de la culture, en ces mutants auxotrophes.
(compensables)
-l’enrichissent se fait par ajout dans un milieu minimum, d’un produit qui tue les
bactéries prototrophes qui se multiplient et épargne les mutants auxotrophes.
- Ensuite utiliser la méthode des répliques pour isoler les mutants.
technique d’enrichissement en pénicilline par

exemple
Mutants
d’auxotrophie Isolement des mutants (méthode des répliques)
(compensables)
Mutants
d’auxotrophie
(compensables)
Isolement des mutants (méthode des répliques)

Mutants
d’auxotrophie
(compensables) Isolement des mutants (méthode des répliques)
Ex: Méthode des répliques: recherche des mutants His- et Leu-

Obtention de lignées pures
Les mutants obtenus sont ré-isolés par la méthode des quadrants. Les lignées pures sont conservées
Isolement Conservation des

Repérage (méthode Culture souches
Mutants des pure (congélation,
quadrants lyophilisation)
Hérédité
Indépendance
Discontinuité
Caractéristiques
d’une mutation
Rareté Stabilité
Spontanéité
• La mutation n’affecte qu’un tout petit nombre d’individus
• Taux de mutation μ = probabilité pour une bactérie de muter pendant le temps d’une
génération (10-6 à 10-9)
Rareté • ≠ Fréquence des mutants = résultante de μ et de la sélection exercée
• Le taux de mutation = probabilité d'occurrence d’une mutation spontanée dans une
population bactérienne le taux de mutation est très rare (10-7/10- 9) mais peut augmenter
dans la présence des mutagènes (chimiques ou physiques et biologique ).
• Une mutation ne modifie pas l’aptitude d’une bactérie à subir une autre mutation affectant
un autre caractère
• Escherichia coli lac+his+:
Indépendance
μ lac+ --> lac-= 10-7
μ his+ --> his-= 10-6
• μ lac+his+ --> lac-his- est de 10-7 x 10-6 = 10-13
-Le nombre (rare) et l’emplacement des colonies résistantes est toujours le même dans une série de
répliques à partir d’une même boîte mère.
- Les individus mutants existent avant la mise en présence de l’agent sélectif et le caractère résistant n’est
Stabilité
et pas lié à la présence de l’agent sélectif qui est la canavanine donc une mutation est spontanée.
Spontanéité -Une colonie résistante à la canavanine le reste même si elle est cultivée en son absence donc une
mutation est stable.
Mutants résistants aux

Mutants nutritionnels
agents antimicrobiens
Les types
de
mutants
Mutants pleiotropes
Mutants Mutants létales

morphologiques conditionnels
Mutants
morphologiques
Modification des caractères morphologiques: les flagelles, les dimensions de la cellule, la forme, la surface de la colonie
Mutants nutritionnels
Apparition ou disparition d’un besoin nutritionnel (mutants auxotrophes, mutants de catabolisme Lac- par exemple)
Mutants résistants aux

agents antimicrobiens
Mutants résistants aux antibiotiques, métaux lourds

Mutants létales
conditionnels
Mutants pleiotropes
C’est une mutation qui affecte un seul gène mais donne plusieurs phénotypes (effet de la
mutation touche différentes fonctions de la cellule) Mutations dans les gènes des opérateurs et les
gènes des protéines régulatrices.
Les agents
mutagènes À l’origine des mutations induites avec augmentation de la fréquence
d’apparition des mutations à 10-3 (mutations spontanées de 10-6 à 10-9)
Chimiques
Physiques
Biologiques
Les agents chimiques
Agents Les analogues Les agents

intercalants des bases désaminants
Agents
intercalants
Exemple : Acridine orange, bromure d’éthidium

Molécules planes (1) qui s’intercalent dans le plan entre deux paires de base, provoquent l’étirement de l’ADN (2).
L’ADN polymérase ajoute une base (microinsertion) (3) entraînant des mutations de changement de cadre de lecture, ou
reste bloquée (4).
Les analogues
des bases
Même structure que les bases, défauts d’appariement, substitutions de base.
Ex « 5-BU » deux formes existent en solution:
-non ionisée (forme cétone BU), la plus fréquente, s’apparie avec A
-ionisée (forme énol BU) très rare s’apparie avec G
Les agents
désaminants
Les agents désaminants (Acide nitreux HNO2) alkylants (Méthyl méthane sulfonate, Ethyl méthane
sulfonate...).
Interagissent avec l’ADN. Provoquent un changement chimique d’une base et un mauvais
appariement.
Les agents Physiques
Radiations= mutagènes très puissants
Les
Les radiations
radiations non
ionisantes ionisantes
Les
radiations
ionisantes
Les radiations ionisantes: rayons X et g, ionisent la substance qu’elles traversent et on a

formation de particules chargées et excitées.
Les Chapitre I : Les mutations
radiations
non • pic d’absorption de l’ADN et ARN à 260 nm.
ionisantes
• Dimère de thymine.
• Arrêt de progression de l’ADNpol.
UV, pas de changement de la structure de l’eau.
Mutagénèse
dirigée
Technique in vitro- utilisation d’ADN synthétique- qui permet le remplacement d’une base
à une position précise par une autre base ; remplacement d’un AA par un autre AA.
- Analyse des interactions entre protéines ou entre protéine et ADN
Mutagénèse
dirigée
Les méthodes de mutagénèse dirigée sont basées sur la réaction en chaine par polymerase (PCR). Les
mutations sont introduites à l’aide d’amorces oligonucléotidiques qui sont préalablement synthétisées. Ces amorces sont
complémentaires à la séquence sauvage à l’exception des nucléotides qui doivent être mutés. En effet, la PCR n’exige pas
une stricte complémentarité entre l’amorce nucléotidique et la séquence d’ADN cible. A la fin de la réaction PCR, les
mutations sont introduites dans les produits et peuvent être de trois types :
1) Des substitutions : un ou plusieurs nucléotides sont remplacés par un même nombre de nucléotides différents.
2) Des insertions : un ou plusieurs nucléotides sont ajoutés à la séquence cible.
3) Des délétions : un ou plusieurs nucléotides sont enlevés de la séquence.
Test d’Ames pour les carcinogènes
Pour l’identification des produits naturels ou artificiels potentiellement carcinogènes pour l’homme.
Principe: Tous les carcinogènes (agents provoquant le cancer par lésion de l’ADN), sont des mutagènes
Le cancer est une maladie provoquée par la transformation de cellules
qui deviennent anormales et prolifèrent de façon excessive.
Mutagène : est un agent qui change le génome (en général l'ADN) d'un organisme et élève ainsi le
nombre de mutations génétiques au-dessus du taux naturel d'arrière-plan
• Organisme test: Salmonella typhimurium (ST) His-.

• ST(maladie de la typhoïde), phenotype de la souche est His-. ST ne se multiplie pas sur milieu synthétique
dépourvu d’Histidine.
• Le test mesure la réversion de ST (His-) vers la prototrophie (His+)
Le test mesure la réversion vers la prototrophie en présence du possible mutagène C1
C2 est le double de la concentration C1 du produit mutagène à tester.

Le test est positif si le nombre de mutants avec le produit C1 est au
moins le double du nombre de mutants spontanés
GS : gélose de surcouche qui sert pour l’étalement de la préparation

9 mix: extrait hépatique du rat (broyage, centrifugation). Le surnageant contenant les enzymes
monooxygénases permettant de s’approcher le plus de la réalité de l’homme (le foie est le siège des
réactions métaboliques de détoxification)
Variante du test d’Ames (test qualitatif)

TD 1
Exercice 1
On a étalé une population de 107 bactéries sur un milieu complet. Après incubation 24h à 37°C, on obtient
un tapis bactérien. On réalise ensuite des répliques de cette boîte mère sur différents milieux :
1, 2, 3: milieux minimums supplémentés (MMS) avec tous les acides aminés sauf ceux indiqués, le glucose est la
source de carbone.
4: milieux minimum, le lactose est l’unique source de carbone.
Après incubation 24 h à 37°C, on obtient les résultats suivants :
a) Déduire le génotype de cette population bactérienne.

b) Expliquer l’apparition des colonies sur les boîtes répliques 1
et 2 et l’absence de colonies sur la boîte 3.
c) Préciser l’utilité de la boîte 5.
TD 1
Exercice 1
Des colonies sont obtenues après traitement de cette souche avec le 5 Bromo- Uracile. On prépare une
boîte mère sur un milieu complet, de 4 colonies. On réalise ensuite des répliques de cette boîte sur les différents
milieux indiqués. Après incubation 24h à 30°C (sauf pour la boîte 4, l’incubation a été faite à 42°C), on obtient
les résultats suivants :
a) Quel est le but de l’utilisation du 5 Bromo-Uracile

b) Déterminer le phénotype de chaque colonie vis-à-vis des gènes (marqueurs chromosomiques)
cités
TD 1
correction d'exercice 1
TD 1
TD 1
Exercice 2
Le test d’Ames a été réalisé sur un colorant alimentaire, la tartazine E102 (E).
Le résultat du test après 48h d’incubation à 37°C est le suivant :
Boîte 1 (MM+His) : 106 UFC/ml
Boîte 2 (MM sans His) : 5 UFC/ml
Boîte 3 ( MM sans His + 10 g/ml de E + S9 mix) : 50 UFC/ml
Boîte 4 ( MM sans His + 20 g/ml de E + S9 mix) : 100 UFC/ml
Boîte 5 ( MM sans His + 10 g/ml de E, sans S9 mix) : 5 UFC/ml
a) Quel est le but de ce test ?

b) Préciser l’utilité de chacune des boîtes (faire les calculs nécessaires)
TD 1
TD 1
Exercice 3
deux souches d'E. coli (souches S1 et S2) ont été obtenues par traitement aux rayons UV d'une souche
sauvage S0. Vous réalisez trois étalements sur MC+Xgal avec ou sans streptomycine et les résultats sont présentés
après 24h d'incubation. La streptomycine est un antibiotique qui se fixe sur la structure du ribosome. La bactérie
produit des protéines non fonctionnelles et meurt rapidement
a) Quelle est l'action des rayons ultraviolets sur la souche sauvage S0? Préciser sur quelle molécule biochimique
des cellules bactériennes les rayons ultraviolets ont réagi.
b) Décrire les mutations survenues chez S1et S2
Chapitre II : Les Antibiotiques
 Définition
 Types d’ATB selon le mécanisme

d’action et la cible
 Stratégies des bactéries pour résister
aux antibiotiques
 L’Antibiogramme
Définition d’un antibiotique
Produit naturel, synthétique ou semi synthétique qui inhibe (effet bactériostatique) ou tue
(effet bactéricide) les bactéries.
*Toxicité sélective: les cellules animales ou humaines ne sont pas affectées.
*Bactéries Gram négatif : La membrane externe présente est une barrière de perméabilité naturelle
surtout pour les substances hydrophobes et de grande taille.
*Bactéries Gram positif : paroi constituée de peptidoglycane ne constituant pas une barrière de
perméabilité pour les ATB
Types d’ATB selon le mécanisme d’action et la cible
• Inhibition de la synthèse du peptidoglycane et lyse cellulaire

• Bactéricides
paroi • Famille des b-lactamines, Glycopeptides et Fosfomycines
• Les mycoplasma qui n’ont pas de paroi cellulaire sont naturellement résistantes.
• Gram+ et Gram- (interférence avec la synthèse des protéines)

• bactériostatiques à large spectre
Ribosome
• Famille des Aminoglycosides , Tétracyclines (se fixent sur la ss-unité 30 S)- Familles
des Macrolides (50 S)
• Augmentation de la perméabilité de la membrane plasmique

Membrane
• membrane externe endommagée
Plasmique
• Effet plus sur les Gram- , Familles des Polymixines
• Interaction avec la gyrase, blocage de la réplication

• Familles de l’Acide Nalidixique, les Quinolones,Novobiocine
L’ADN
• Altération et dommages de l’ADN
• Famille des Nitrofuranes et 5-nitro-imidazolés
• Inhibition de l’ARN polymérase

L’ARN
• Famille des Rifamycines
• Certains ATB sont des analogues d’un intermédiaire dans la voie de

Les coenzyme synthèse de coenzymes.
du
métabolisme • Famille des Sulfamides, triméthropim est un analogue de PAB=Acide
cellulaire ParaAminoBenzoique (intermédiaire dans la synthèse du Folate ou vitamine
B9 nécessaire à la synthèse des bases)
Stratégies des bactéries pour résister aux antibiotiques
Vitesse de la
pénétration(entrée)
de l’ATB
Concentration
intra
bactérienne de
l’ATB
Vitesse de
l’élimination de
l’ATB (par
inactivation ou
excrétion)
Stratégies des bactéries pour résister aux antibiotiques
Dégradation Source Modification Réduction

de extérieure de de la
l’ATB par des de la cible par perméabilité
enzymes coenzymes mutation cellulaire
• b-lactamase dégrade les b-lactamines • Gyrase mutée (pas d’effet de l’acide nalidixique)
• inactivation de l’ATB par O-phosphorylation, N-acétylation • Protéines ribosomiques mutées (Macrolides,
aminoglycosides)
TP 1 Chapitre II : Les Antibiotiques
L’Antibiogramme
*Test qui permet de déterminer le profil des sensibilités d’une souche (une culture pure est nécessaire)donnée à une série d’ATB.
*Choix des ATB les plus actifs pour la chimiothérapie.
L’Antibiogramme
préparation de la suspension cellulaire
Deux méthodes pour réaliser ce test: la méthode de dilution et la méthode de diffusion

préparation de la suspension cellulaire
La suspension cellulaire doit être préparée dans de l’eau physiologique stérile à partir d’une culture
jeune et pure sur milieu d’isolement approprié. Dans le cas de Neisseria gonorrhoeae, la suspension est
préparée dans du tampon phosphate stérile à pH 7,2.(Un pH trop acide augmente l'activité des ß-lactamines, un
milieu alcalin favorise les aminosides et les macrolides, il doit être compris entre 7,2 et 7,4, valeur qui permet
une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des antibiotiques).
Elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de
McFarland).En Algérie, l'antibiogramme par diffusion est réalisé avec une suspension calibrée à 0,5 MF ou à
une D.O. de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm contenant environ 108 bactéries par ml.Ce nombre est porté à 109 pour
Helicobacter pylori équivalente au standard McFarland 3.
méthode de dilution
Préparation de la gamme de dilution de l’antibiotique (milieu Mueler-Hinton)
[Cm]=640 mg/l : prélever 0,5 ml et le mettre dans 4,5 ml de M.H (VF=5 ml dans le premier tube de la gamme et
[Cm]=64 mg/l ).
F de dilution=Ci/CF=VF/Vi
Préparation de la gamme de dilution de l’antibiotique (milieu Mueler-Hinton)
Série de l’antibiotique : dilution au 1/2

Calcul de la CMI et CMB
Calcul de la CMI et CMB
TP 1
méthode de diffusion
L’Antibiogramme
Ensemencement par inondation

Ensemencement avec une culture pure et jeune d’organisme pathogène à 3x106 UFC/ml
Ensemencement par écouvillon: avec une culture pure et jeune d’organisme pathogène à 3x106
UFC/ml L’inoculum est étalé par un écouvillon sur la surface de la gélose (on sèche la boîte 10-15 min à
37°C). On dépose ensuite les disques imprégnés chacun d’un ATB différent.
Une croissance quasi confluente va se développer après incubation.
3
Notion de concentrations critiques d’un ATB
Les concentrations critiques c et C sont des concentrations définies en fonctions des
CMI des germes et des concentrations sériques ou tissulaires habituelles de l’antibiotique.
• c : concentration critique inférieure représente la concentration sanguine ou sérique
moyenne obtenue après administration de la dose habituelle de l’ATB au malade.
• C : concentration critique supérieure, représente la concentration sanguine ou sérique
obtenue après administration de la dose maximale non toxique, toléré par le malade
(représente le seuil de toxicité de l’ATB).
Notion de concentrations critiques d’un ATB
On rapporte le diamètre mesuré à l’échelle de concordance de l’ATB (chaque ATB a une échelle de
concordance établie entre le diamètre mesuré en mm et la CMI). Ceci permet de définir la catégorie clinique de la
souche étudiée pour donner un traitement adéquat .
Exemples de types de zones observées au niveau des disques
• *Résistance : Aucune zone d’inhibition de croissance n’est observée.
• *Intermédiaire : Une étroite zone sans croissance entoure le disque.
• *Sensible : une large zone sans croissance entoure le disque.
• *Inactivation enzymatique : une étroite zone sans croissance simulant la sensibilité entoure le disque. Cette
zone a un contour nettement défini car les colonies ont une taille normale à grande à la différence de la zone
intermédiaire. Ex : staphylococcus aureus code pour une β-lactamase inducible. Les cellules proches du disque
sont tuées avant d’avoir pu synthétiser une quantité suffisante d’enzyme.
• *Mutants résistants : L’inoculum contient une petite proportion de cellules mutées capables de former des
colonies dans des conditions qui inhibent les non mutées.
• *Contamination : l’inoculum est fait d’un mélange d’organismes dont un au moins est résistant à l’ATB.
• *Synergie : Chacun des deux disques contient un ATB différent. La zone d’inhibition traduit un effet inhibiteur
qui est plus important que l’effet de chaque ATB pris séparément.
• *Antagonisme : Chacun des deux disques contient un ATB différent. La présence d’un ATB inhibe l’activité de
l’autre.
1 2
3
TD 1
Exercice 4
Deux souches bactériennes, E. coli et Staphylococcus aureus ont été soumises à un antibiogramme
sur milieu solide pour voir leur sensibilité vis à vis de l’Amoxicilline. Le résultat après une incubation de 18
h à 37°C est le suivant :
1) placer les catégories cliniques sur l’échelle de concordance.

2) Quel est le type de zone observée pour chacune des deux souches ? (justifiez votre réponse)
3) Trouver une solution pour S.A
Chapitres des transferts génétiques
Transfert génétique= transmission de caractères héréditaires d’une

bactérie donatrice à une bactérie réceptrice.
transformation conjugaison transduction

1- La Transformation: pénétration dans une bactérie d’ADN nu, libre, se trouvant dans le milieu et
changement permanent des propriétés de cette bactérie. Les bactéries transformées sont appelées
transformants.
2- La Conjugaison : transfert d’ADN entre 2 bactéries reliées physiquement. Les bactéries recombinantes sont
appelées transconjuguants.
3- La Transduction : transfert d’ADN par l’intermédiaire d’un bactériophage. Les bactéries recombinantes
sont appelées transductants.
Chapitre 3: La transformation.
Transfert génétique au cours duquel un fragment d’ADN bicaténaire , libre et nu est capté par une
bactérie réceptrice compétente avant d'être éventuellement intégré au chromosome.
Historique En 1928, Griffith  travaille sur le transfert de la virulence de la bactérie pathogène
Streptococcus pneumoniae
injection de pneumocoques de
souche S virulentes capsulée et qui
forment des colonies d’aspect lisses
dites « S mooth »
injection de pneumocoques de
souche R non virulentes dépourvues de
capsule et qui forment des colonies
d’aspect rugueuses dites « Rough »
Historique
Historique
Survie des
souris
injection de pneumocoques
de souche S tués par la chaleur
Pas d’infection,
Absence de
pneumocoque
Mort par
pneumonie
injection de pneumocoques de des souris
souche S tués par la chaleur et de souche
R vivantes non virulentes dépourvues de Infection,
capsule présence de
pneumocoque S
vivants
Griffith donna le nom de transformation à ce changement de

bactéries non virulentes en bactéries virulentes pathogènes.
Historique
Conclusion (Expérience de Griffith) : Transformation des bactéries R3 vivantes et non capsulées
(non pathogènes) en bactéries capsulées et pathogènes par l’ADN libéré.
Espèces naturellement transformables :

Gram +:Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis
Gram-: Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae,
E. coli qui est un cas particulier (Transformation artificielle)
La fréquence du phénomène est variable selon les espèces .
Conditions de la transformation
• d’une part des bactéries et de leur aptitude à être réceptrices pour l’ADN : notion de compétence
• d’autre part de l’ADN transformant et de ses propriétés
 La compétence
Une bactérie compétente: c’est une bactérie capable d’absorber un ADN étranger présent dans
son environnement (ADN libéré par autolyse ou par sécrétion) et d’acquérir de nouvelles propriétés.
Transformation
transformation naturelle artificielle
=Transfection
 Escherichia coli
Gram + Gram -
 Bacilles  Nésseria gonorrhoeae

 Pneumocoques  Heamophilus influenzae
transformation naturelle
Gram +
L’activation des gènes « com » est provoquée par la sécrétion de

polypeptides signales très instables = phéromones de
compétence, par certaines bactéries de la population lorsque les
conditions de croissance sont particulières :
•-densité maximale.
•-milieu pauvre et hostile.
Les protéines de compétence sont :
•-Absence d’inhibiteurs de croissance et de sources d’énergie.
* Autolysines membranaires
• Les phéromones activent la compétence d’une proportion (10-
15%) de la population (phénomène transitoire : pic de 15 à 30 * Protéines membranaires fixant l’ADN.Présence
de sites (10 à 50 sites) de fixation de l’ADN.
min).
* Différentes nucléases.
ADN :double brin
Gram + transformation naturelle
L’ADN double brin exogène est

libéré dans le milieu après lyse de
cellules bactériennes
Cellule donatrice
Il se fixe généralement de façon

aléatoire à la surface de la bactérie
réceptrice.
N’importe quelle fraction du

génome peut être transféré
Gram + Chapitre 3: La transformation.
transformation naturelle
la capture de l’ADN exogène est assurée
par des polypeptides capables de lier
l'ADN
et qui font parti d’un complexe protéique

présent à la surface de la cellule.
Gram -
Mécanisme de la transformation chez les Gram-
L'ADN transformant est capturé par les vésicules membranaires ou transformasomes

après reconnaissance de séquences spécifiques de 10 à 11 pb.
exemple: la séquence AAGTGCGGTCA pour Haemophilus influenzae.
Dans ce cas seul des ADN spécifiques peuvent être transformants
La compétence est constitutive tout au long du cycle.

Gram -
Mécanisme de la transformation chez les Gram-
Transformation
artificielle
Pas de transformation naturelle pour de nombreuses bactéries, notamment Escherichia coli Transformation
artificielle (pas d’entrée de petits fragments d’ADN linéaires simple ou double brin)
La compétence artificielle
choc thermique
chlorure de électroporation
calcium
pendant
Bactéries PAS naturellement phase expo
compétentes de
croissance
ARTIFICIELLEMENT COMPETENTES
transformation par ADN
circulaire et de petite taille
TRANSFORMATION ARTIFICIELLE = TRANSFECTION

Transformation
artificielle
2
L’électroporation
Traitement au
CaCl2 et choc
chaud/choc froid
Transformation Chapitre 3: La transformation.
artificielle
Traitement au CaCl2 et
choc chaud/choc froid
• Recherche de conditions permettant l’entrée de l’ADN plasmidique dans une

*bactérie en phase exponentielle, sans utiliser le système de transformation
naturelle:
• E. coli dans une solution glacée de calcium, acquière la
compétence.
• Le calcium provoque un changement de la structure lipidique
de la membrane.
• L’ADN transformant est ajouté sous forme de solution froide.
• Le mélange ADN-Bactéries subit un choc thermique en passant de 4°C à
37°C.
• Apparition de pores dans les membranes lors du choc thermique, permettant
l’entrée de l’ADN
Transformation Chapitre 3: La transformation.
artificielle
L’électroporation
* Mises au point des conditions

d’électroporation pour chaque espèce.
* On soumet un mélange ADN-
bactéries à un champ électrique de 16
KV/cm pendant une seconde. Le
courant provoque des trous au niveau
de la paroi et des membranes par
lesquels l’ADN passe.
Devenir de l’ADN transformant (Transformation Naturelle)
*ADN chromosomique:
-Homologue: recombinaison et modification génétique permanente.
-Hétérologue: dégradation par le système restriction-modification de la bactérie réceptrice ou dilution
Paramètres de la transformation
Nombre
total des
cellules Nombre de
transformant
viables Quantité obtenus en Efficacité de Fréquence de co-
d’ADN utilisant un transformation transformation:
transformant marqueur de : c’est le fréquence avec
sélection nombre de laquelle les
en micro g
transformants/ marqueurs non
micro g d’ADN sélectionnés sont
obtenus
Applications de la transformation
Intérêt pour la
bactérie: source
énergique de C
et d’N.
Cartographie Réparation des Génie
génétique lésions génétique
accidentelles.
Recombinaisons
génétique
favorisant
l’évolution
TD 1
Exercice 5
Chapitre 3: La transformation. TD 1
Chapitre 4: La Conjugaison
transfert génétique unidirectionnel d’un fragment d’ADN chromosomique ou

plasmidique par contact direct entre deux bactéries « sexuellement » différenciée :
une donatrice = mâle et une réceptrice = femelle
Historique : En 1946, Lederberg et Tatum  mènent une expérience sur :
2 souches mutantes poly-auxotrophes d’E.coli K12
souche A souche B
thréonine - biotine -
leucine - méthionine -
thiamine -
Ensemencement sur milieu minimum sans Thr, leu, bio, Met et Thi
Aucune Aucune
pousse pousse
Il y a eu un transfert de matériel génétique entre les deux souches et

recombinaison entre les gènes parentaux
Bernard Davis  a utilisé : l’expérience du tube en U
un tube en U séparé à la base par une
membrane en verre poreuse (0.2µm)
empêche un contact direct entre les

souches
laisse passer l'ADN libre, les phages ou
les substances solubles (ADN)
Les souches A et B sont placées

chacune dans une branche du tube,
Ensemencement sur milieu minimum
puis le milieu est aspiré et refoulé
sans Thr, leu, bio, Met et Thi
plusieurs fois
Il y a donc nécessité d'un contact

direct entre les souches A et B pour
qu’il y est transfert du matériel
génétique
Aucune bactérie prototrophe
souche A souche B
agitation vigoureusement
Aucune bactérie prototrophe

L’agitation rompt le contact
Au microscope électronique, on observe le phénomène :
il y a contact direct entre les deux

bactéries,
un pont cytoplasmique est établit entre

les bactéries conjugantes
grâce au pili sexuel

réceptrice de gènes donatrice de gènes

= bactéries femelle = bactéries mâles
bactéries réceptrices de gènes= F- bactéries donatrices de gènes = F+

car dépourvues de facteur F possèdent un facteur de fertilité
ou facteur F
 LE FACTEUR F
• Région tra: fonctions de transfert (pilis, endonucléase, hélicase).

• Rep: fonctions de réplication,
• OriS: origine de réplication végétative,
• OriT: origine de réplication conjugative,
• Inc: incompatibilité Trois éléments transposables dans son génome :
IS2, IS3 et Tn1000 (pas de rôle dans la réplication et le transfert, rôle
pour l’insertion du F dans le chromosome d ’E. coli)
• Le génome d ’E. coli : présence d’éléments transposables
Ceci crée des régions d homologie entre le chromosome bactérien et le F
F s’insère dans le chromosome bactérien au niveau des régions d’homologie

Mécanisme du transfert  Conjugaison F+ x F-
Facteur F libre dans

Union F+/F- grâce
cellule donatrice
aux pili sexuels
Transfert de l’ADN à partir de

Création d’un pont l’origine de transfert (ori T) et selon
cytoplasmique le modèle du cercle roulant
Permettant le
transfert de l’ADN
Le facteur F persiste dans La bactérie réceptrice

la bactérie donatrice qui à acquis une copie du
reste F+ facteur F elle devient F+
Formation d'une bactérie Hfr
Les bactéries Hfr dérivent de bactéries F+, le facteur F n'est plus

autonome, il est intégré au chromosome bactérien, on parle d’épisome.
Hfr pour Haute fréquence de recombinaison

car elles sont capables de transférer des marqueurs chromosomiques
avec une fréquence 1000 fois plus importante.
Le facteur F et le chromosome de Escherichia coli contiennent des

transposons et des séquences d'insertion capables de recombinaison.
L'intégration du facteur F dans le chromosome peut se faire à différents

endroits et dans différentes orientations.
Formation d'une bactérie Hfr
(probabilité de 10-5)
Ce sont des mutants de bactéries F+ capables de transférer certains caractères
génétiques (marqueurs chromosomiques) à une fréquence beaucoup plus élevée
(10-3) que lors des croisements F+ x F- (Fr = 10-6).
Souches Hfr et position proximale et distale
Comme le facteur F peut s'intégrer à différents endroits du chromosome, l'ordre des

gènes transférés peut varier d'une souche Hfr à une autre
Devenir de l’ADN transféré
C’est une portion du chromosome bactérien et du plasmide F- (pas d’origine de réplication

( circularisation et réplication impossible) donc soit on a dégradation par des nucléases (système
restriction-modification de la bactérie) ou recombinaison homologue et on obtient une bactérie
recombinante.
Pour cette recombinaison, il faut:
- Deux crossing over ou nombre pair de CO
- Intégration d’un seul brin
- Receveuse rec+
Les souches F’
Intégration facteur F dans chromosome = événement
réversible, le facteur F peut retrouver son indépendance.
2 possibilités lors de l’excision :
 excision correcte
 excision incorrecte => le facteur F emporte avec lui une
fraction du chromosome
Le facteur F possède alors toute l'information génétique
nécessaire à la conjugaison et en plus, il porte un ou
quelques marqueurs chromosomiques.
Un facteur F ainsi modifié est appelé facteur sexuel de
substitution : F'.
Lors d'une conjugaison F' x F- le facteur F' est transmis à
haute fréquence à la bactérie réceptrice qui acquiert avec le
plasmide un ou quelques gènes chromosomiques.
excision normale ou anormale
On parle de sexduction. du facteur F
Les souches F’
Chapitre 4: La Conjugaison 1
Détermination de l’ordre d’entrée des gènes. (La conjugaison interrompue)
En 1957, Elie Wollman et François Jacob  étudient la chronologie du transfert des gènes
chromosomiques, lors d'un croisement Hfr x F-, par la technique des conjugaisons interrompues.
Expérience :
séparation les bactéries
Agitation parentales et interruption
108 brève du transfert de matériel
107 génétique
bactéries F- et intense
bactéries Hfr
Str R et
Str S Dilution des échantillons
auxotrophe
pour éviter de nouveaux contacts
prélève des
Étalement sur milieu ..
échantillons
À intervalle de + streptomycine
temps régulier pour tuer les bactéries Hfr (mâles)
et sans certains facteurs de croissance
absence de pousse des F- non
recombinées
10 bactéries femelles pour 1 bactérie mâle
Détermination de l’ordre d’entrée des gènes.
La conjugaison interrompue.
On constate que :
 plus le temps de contact est long, plus le nombre de gènes transférés est important
 Le transfert des gènes de la souche Hfr vers la bactérie donatrice se fait dans un ordre précis
Il commence à partir d’un point d’origine (oriT) = origine de transfert et s'effectue de manière
orientée et progressive.
 Plus l’allèle pénétré plus tard, plus le nombre maximal de recombinants est faible. La valeur
du plateau (max de recombinants pour l’allèle) dépend de :
 l’efficacité de transfert
 Probabilité de recombinaison
Tableau comparatif
TD 1
Exercice 6
TD 1
TD 1
Exercice 7
correction d'exercice 7 TD 1
Chapitre 5: La transduction
La transduction : est un transfert d’ADN bactérien d’une bactérie vers une autre par l’intermédiaire d’un bactériophage.
Un grand nombre de bactéries subissent la transduction :
– Desulfovibrio, Escherichia, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodobacter, Salmonella, Staphylococcus, Xanthobacter...
– Archaebactéries
Deux types de transduction
Spécialisé
Généralisé restreint,localisé
n'importe quel gène bactérien le transfert ne concerne que

est susceptible d'être transféré quelques gènes bactériens dont
à une bactérie réceptrice la nature est variable selon le
bactériophage
A l’aide du document et de vos connaissances sur
les phages répondre aux questions suivantes :
-A quel type de phage correspond la transduction
généralisée ? justifier ?
un phage virulent,
car il réplique son génome dans la bactérie et
provoque la lyse en fin de cycle, libérant les nouveaux
virions = cycle lytique
-A quel type de phage correspond la transduction
spécialisée ? justifier ?
Un phage tempéré,
car il intègre son génome dans le génome de la
bactérie sous forme de prophage cette dernière devient
lysogène
= cycle lysogénique l’ADN viral est répliqué en
même temps que le chromosome bactérien.
 La transduction généralisée
phage composite =
particule transductrice
Elle est assurée par les phages virulents,

qui au cours du cycle lytique encapsident par erreur et de façon aléatoire des fragments
d’ADN de la bactérie.
taille fragment : 1 à 2% de l’ADN bactérien.

Il se forme alors un phage composite appelé particule transductrice qui

peut infecter une nouvelle bactérie et lui transmettre un fragment de l’ADN de la
bactérie précédemment lysée à une fréquence faible (<1%)
La transduction généralisée peut être complète ou abortive selon les cas.
complète phage composite =
Elle implique un expression stable des particule transductrice
marqueurs transférés
L’ADN introduit peut s’intégrer dans
une région homologue du chromosome
par recombinaison homologue
et donner une cellule transduite au

génotype modifié et stable transmit à
toutes sa descendance.
abortive
l’ADN injecté ne s’intègre pas dans le chromosome,

ce qui est fréquent.
Les marqueurs transférés s’expriment transitoirement

jusqu’à ce que l’ADN soit dilué au cours des divisions
bactériennes successives
Les gènes passent de la cellule mère à 1 seule des 2 cellules filles.

Il n’y a pas généralisation du caractère transféré à l’ensemble des
descendants.
La transduction abortive se traduit par l’apparition de colonies de taille minime et de

formes irrégulières sur milieu minimum.
Caractéristiques et applications de la transduction généralisée
 Les deux bactéries donatrice et réceptrice doivent appartenir à la même espèce

en raison de la spécificité d’infection du phage.
La quantité d’ADN bactérien encapsidé dépend principalement de la taille de la

capside :
- le phage P22 de Salmonella Typhimurium contient habituellement de l’ordre de 1 %
du génome bactérien,
- le phage P1 de E.coli contient de 2 à 2.5 % du génome bactérien.
Le plus souvent la transduction ne concerne qu’un seul gène
Dans une population de phages capables d’effectuer une transduction généralisée,

il n’y a que très peu de particules transductrices.
Ex : dans une population de phage P1 de E.coli seulement 0.1% des particules vont
encapsider de l’ADN chromosomique, les autres particules sont virulents et vont déclencher
le cycle lytique.
 Titration du lysat de P1
Les phages sauvages provoquent la lyse des bactéries. Cette lyse est observée sous forme de plages
de lyse sur un tapis bactérien (une même quantité de bactéries est mélangée avec des dilutions en série du lysat
et on étale le mélange sur un milieu gélosé). On procède ensuite à un dénombrement des plages de lyse.
 Titration du lysat de P1
Pour éviter que les phages P1 normaux (sauvages) issus de cycles lytiques normaux ne
viennent réinfecter les bactéries transductantes,
 deux paramètres sont importants :
-On utilise un moi faible à la première étape de l’infection de la souche receveuse.
-On ajoute du trisodium citrate à la fin de l’étape de l’infection de la souche receveuse. Pour
s’adsorber à la bactérie, P1 exige du calcium libre dans le milieu. Ce calcium sera totalement
complexé par le trisodium citrate et le P1 normaux libérés ne peuvent plus réinfecter les bactéries
(transductantes et non transductantes).
 transduction spécialisée ou restreinte
Produite par un phage « tempéré » Ex: le phage l d’E.coli
Le cas le plus connu de la

transduction localisée est provoqué par
le phage lambda de E.coli.
Il possède un site d'attachement

correspondant à un site d'intégration
situé entre les locus gal (nécessaire à
l’utilisation du galactose) et le locus
bio (assure la synthèse de la biotine).
 Intégration du phage lambda
L'intégration de l'ADN du phage dans

le chromosome bactérien se fait grâce à
l’enzyme intégrase du phage qui reconnaît les
sites d’attachements PP’ phagique et BB’
bactérien qui ont quelques nucléotides en
commun.
L’ADN de phages défectifs pourra être intégré dans une bactérie lysogène de type
gal - selon le schéma suivant :
système instable : le phage s’intègre à la

système stable : la recombinaison à
suite du gène gal – bactérien. La bactérie
lieu entre les régions gal bactérien et
réceptrice possède alors son gène gal – et
phagique, le gène gal – bactérien est
un gène gal + apporté par le phage, qui
éliminé par le gène gal+ apporté par le
peut s’exprimer, la bactérie passe alors de
phage, la bactérie devient gal +.
gal – à gal + .
TD 1
Exercice 9
TD 1
Chapitre 6 : Recombinaison génétique
La recombinaison est l’ensemble des processus qui conduisent à des échanges entre
molécules d’ADN et produisent de nouvelles combinaisons de chromosomes ou de gènes. On
distingue trois types de recombinaisons selon le degré d’homologie.
Recombinaison
homologue ou illégitime
générale spécialisée ou site
spécifique
Les séquences qui interagissent regroupe un ensemble
d’événement rare.
doivent présenter de grandes La séquence identique peut
régions d’homologie (quelques être seulement de quelques
dizaines de paires de bases). paires de bases.

Chapitre 6 : Recombinaison génétique Recombinaison
homologue ou
générale
la recombinaison est initiée par l’apparition d’une discontinuité

(simple coupure ou brèche mono- ou bicaténaire) dans l’une des molécules
d’ADN impliquées ou dans les deux. Grâce à cette discontinuité (queue 3’OH
libre), les monomères de la protéine RecA polymérisent sur l’ADN
monocaténaire (utilisant la queue 3’OH libre) pour former un filament de
nucléoprotéine et recherche des régions d’homologie dans l’autre molécule
d’ADN homologue, quelle soit coupée ou non, et la formation de nouvelles
jonctions. La résolution de ces jonctions permet d’avoir l’ADN recombinant.
D’autres activités enzymatiques telles que l’ADN polymérase I et la ligase
participent à la recombinaison pour réparer les brêches monocaténaires.
Chapitre 6 : Recombinaison génétique Recombinaison
homologue ou
générale
Le complexe La protéine
multienzymatique RecA
RecBCD
permet:
C’est un complexe à activité a voie RecE - l’appariement de deux ADN
hélicase, exonucléase simple et monocaténaires homologues.
(Exonucléase VII)
double brins, endonucléase simple - L’introduction d’un ADN
brin). Crée des régions simples monocaténaire dans un ADN
brins
C’est une voie altérnative à RecBCD. duplex circulaire homologue.
RecE digère l’ADN double brin à - L’échange d’un brin entre un
l’extrémité 3’ produisant une « queue » duplex linéaire et un ADN
3’ qui est utilisée par RecA. Dans les monocaténaire circulaire.
conditions normales (voie RecBCD - Transfert réciproque de brins
fonctionnelle), la voie RecE est entre deux ADN duplex
réprimée linéaires.
Recombinaison
homologue ou
générale
Analyse par recombinaison Limites de l’analyse par recombinaison
- Outil pour étudier la distance entre les gènes

- Probabilité qu’une même opération de recombinaison Problème si deux mutations conduisant à un
implique deux gènes est même phénotype sont localisées dans le même
proportionnelle à la distance entre ces gènes gène ou dans deux gènes différents très proches
- Localisation de deux gènes l’un par rapport à l’autre sur et on n’obtient pas de recombinants .
le chromosome
Comment trancher ?
Test de complémentation
- Construction de souches diploïdes partielles (mérodiploïde) sachant que la bactérie est haploïde
- Pour cela, utilisation de plasmides recombinants ou de bactériophages transducteurs
Dans une souche réceptrice recA (pas de recombinaison)

Exemple: Présence d’un parent sauvage His+ et trois mutants isolés His-
Construction de diploïde : allèle mutant /allèle mutant

á Le diploïde a le phénotype sauvage = Complémentation = Les mutations sont
dans des gènes différents
á Le diploïde a le phénotype mutant = Pas de complémentation = Les mutations
sont dans le même gène
TD 1
Exercice 10
Chapitre 7 : La transposition
Transposition = transfert d’un petit morceau spécialisé d’ADN ou d’une copie

de ce morceau d’un site à un autre. Le morceau d’ADN est un « élément
transposable » ou « gène Sauteur ».
- Il se trouve dans le chromosome bactérien, ADN du phage et les plasmides.

- Il peut engendrer une variété de réarrangements (Délétions, insertions, inversions).
- Il existe trois groupes d’éléments transposables selon leur structure génétique et leur mode de
transposition:
Les séquences Transposon Transposon

d’insertion « IS » famille « TnA » composite
Les séquences
Nomenclature IS1, IS2 etc., présence de séquences IR (répétées inverses)
d’insertion « IS »
• Fonctions de transposition (élément cryptique),

fréquence de transposition 10-3 à 10-4
Présence d’IS dans les plasmides et le génome des
bactéries et de bactériophages
– E. coli - nombreuses IS1, IS2 et IS3
– Facteur F - une IS2, deux IS3 et un Tn1000
• Création de souches Hfr
Transposon
composite
- Code pour une ou plusieurs fonctions en plus de la

transposition (phénotype différent)
- Paire d’éléments IS inversée ou directe (fonctions de
transposition)
- Transposition : chaque IS peut transposer
individuellement ou en même temps.
On a alors mobilisation de la séquence centrale
- Fréquence de transposition : diminue avec la distance

séparant les deux IS
- Transposons composites les plus étudiés chez E. coli :
Tn5, Tn9 et Tn10
Transposon famille « TnA »
Ex:Tn3 : plus proche d’une IS que d’un transposon composite. Les

gènes de résistance sont à proximité des gènes de transposition. Tn1
est le plus petit
Le phage Mu est un bactériophage qui transpose. Sa réplication

se fait selon un mécanisme proche de la transposition. Existence
extra chromosomique en temps que bactériophage
Création de répétition directe

b à c : transposition non réplicative (transposase uniquement) ex : Tn10

b à e : transposition réplicative (transposase et résolvase) ex : Tn3
Exemple de transposition réplicative -Famille des TnA (gros transposons 5 kb)
-Tn3 et Tn1000. Pour le Tn3

– 4957 bp - DR de 5 bp
– Une paire d’IR de 38 bp
– Trois gènes
• tnpA : transposase (TnpA 1015 AA)
• tnpR : résolvase (TnpR 185 AA)
• res : site de résolution interne
• Amp : -lactamase
Transposition en deux étapes
– Formation de cointégrat par TnpA
– Echange site spécifique au niveau du site interne de résolution
par TnpR
Chapitre 8: Les plasmides
Structure et rôle d’un plasmide
Structure et rôle d’un plasmide
Elément génétique dans le cytoplasme de la bactérie

- ADN double brin circulaire
- linéaire possible (Taille 1 à 1000 kb)
- En moyenne 0,2 à 4% de la taille du chromosome, forme super enroulée dans la cellule
- Des milliers de plasmides différents dans la nature. 300 plasmides naturels chez E. coli
Techniques d’isolement des plasmides :
propriétés physiques, migration en gel d’agarose

Réplication des plasmides

Se fait dans la cellule hôte en utilisant la machinerie enzymatique de l’hôte
chez les bactéries à gram- chez les bactéries à gram+
– Réplication selon le mécanisme du cercle tournant

– Mécanisme analogue à la réplication du chromosome
– Initiation de la réplication à un point fixe: l’origine de réplication
– Réplication bidirectionnelle (intermédiaire en ) - parfois
unidirectionnelle
DSO= double strand origin, rep=protéine d’initiation de réplication (codée par le

plasmide), polIII=ADN polymérase III, SSO=Single strand origin.
Contrôle du nombre de copies

- Contrôle au niveau de la vitesse d’initiation de la réplication
- Plasmide stringent - faible nombre de copies (1 à 2 copies par cellule)
- Plasmide relâché - fort nombre de copies (10 à 100 copies par cellule)
Répartition des plasmides

(dans les cellules filles lors de la division)
- Plasmide à faible nombre de copies

• Régulation très stricte
- Plasmide à fort nombre de copies
• Répartition au hasard
Incompatibilité entre plasmides

- Plusieurs plasmides différents dans une même souche
• Borrelia burgdorferi: 17 plasmides
-Transfert d’un plasmide dans une cellule hôte qui héberge déjà un autre plasmide
• Pas de réplication du plasmide entrant

• Perte lors des divisions ultérieures de la bactérie
• Les deux plasmides sont incompatibles
classement en groupes d’incompatibilité
- Actuellement 25 groupes
- Pas de coexistence entre des plasmides du même groupe (incompatibles car
même mécanisme de régulation de la réplication)
- Coexistence entre des plasmides de groupes différents (compatibles car
mécanisme différent pour la régulation de la réplication)
Ex de compatibilité : plasmides F et ColE1 (deux répresseurs différents,
réplication indépendante de chacun des plasmides)
Elimination d’un plasmide Guérison de la bactérie « curing »

- Action de composés qui inhibent spécifiquement la réplication du plasmide
(acridine orange). On a dilution du plasmide lors des divisions successives
(bactéries guéries). Guérison spontanée possible mais rare
Transfert d’un plasmide

- Pas d’existence en dehors d’une cellule hôte - Transfert possible au moment de la division
cellulaire (Mécanisme le plus fréquent) ou par transformation naturelle (peu probable)
- Transfert par conjugaison est spécifique de certains plasmides : plasmide F
( ilus F), plasmide R (pilus R)
Efficacité du transfert
- Transfert très efficace des plasmides conjugatifs (100 % de transfert). Leur propagation rapide a
un impact écologique très important car dispersion très rapide des résistances aux antibiotiques
et très graves problèmes pour la chimiothérapie des maladies infectieuses
- Perte spontanée de plasmides dans une population naturelle en l’absence de pression de sélection
Rôle biologique des plasmides
Gènes intervenant dans des fonctions très diverses à condition

qu’ils ne bloquent pas la réplication et la survie de la souche
hôte. Soit on a :
Absence de phénotype particulier (plasmide cryptique)
Apport d’un phénotype nouveau avantageux et décelable
Plasmide de résistance
-Découverts pour la première fois au Japon lors de l’épidémie de dysenterie (S. dysenteriae avec une
multiresistance)
-Structure des plasmides R: R1, R6, R100
-Deux fragments d’ADN contigus: fragment RTF = Resistance Transfert Factor (Gènes tra du F) donc
incompatibles avec F. Déterminant R à taille très variable (résistance ATB)
Le plasmide R100 :
ADN double brin circulaire (89,3 kb)
Gènes de résistance
• Sulfonamides, streptomycine, spectinomycine, acide fusidique, chloramphénicol , tétracycline, mercure
Au niveau d’éléments transposables
• Transfert de la résistance par conjugaison ou transposition Transfert par conjugaison entre les entérobactéries du
genre Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella et Shigella
Intérêt médical des plasmides R

Plasmide self transmissible, dispersion très rapide au sein d’une
population , transfert possible entre bactéries responsables
d’épidémies et entre bactéries responsables d’infections
nosocomiales. L’antibiothérapie a conduit à une augmentation
considérable du nombre de plasmide R et à l’émergence de
bactéries à résistances multiples .
Ex : Pénicilline introduite en 1940
• 1946 - 14% des S. aureus Penr
• 1947 - 38% «
• 1969 - 59% «
• 1970 - 100% «
Plasmide de virulence
Présent chez les microorganismes pathogènes
– Fixation du microorganisme sur une cellule
– Colonisation de certains sites spécifiques
• Synthèse de substances telles que toxines, enzymes...
• Destruction de la cellule hôte
Ex: Souche entèropathogène d ’E. coli
– Colonisation de l’intestin grêle grâce au facteur antigénique de colonisation

CFA et production de deux toxines (hémolysine et entérotoxine)
Plasmide producteur de bactériocine
-On a présence de gènes de structure, de dégradation et de transport

-La bactériocine est un peptide synthétisé par les bactéries contenant ce plasmide. Elle inhibe ou tue
les cellules qui ne la produisent pas
- Présence d’un gène codant pour une protéine immunité spécifique à la
bactériocine, Localisée dans la membrane interne (protection de la bactérie productrice)
-Le nom de la bactériocine dérive de l’espèce qui la produit
• Colicine chez E. coli
• Subtilisine chez B. subtilis etc...
Structure d’une colicine
Trois domaines distincts
– Domaine N terminal
• Translocation au travers de l’enveloppe cellulaire de la souche
– Domaine central
• Fixation sur le récepteur de la souche sensible
– Domaine C terminal
• Activité colicinogénique
– Formation de pores (colicine E1) ou activité DNase (E2) ou
Rnase (E3)
• Interaction avec la protéine immunité de la souche productrice
Plasmide de laboratoire
-Utiles dans les techniques du génie génétique

• Facilement manipulables
• Non self transmissibles
• Nombre de résistance limité
-Construction in vitro de nombreux plasmides à partir des
plasmides de la nature
• Dérive de plasmides de résistance
• Délétions des fonctions de transfert et de certains gènes de
résistance

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Filière: Sciences de la Vie

1 Les mutations 5 La transduction

2 Les Antibiotiques 6 Recombinaison

4 la conjugaison 8 Les plasmides

 (pluriel=loci) se désigne par un groupe de 3 lettres en italique

Ex: his = locus de biosynthèse de l’histidine (hisA, hisB,...etc).

Souche sauvage de référence Souche parentale

souche d’origine du mutant

Prototrophes Auxotrophes Prototrophes

variabilité Elaboration des

• Phénomènes d’adaptation, Induites, réversibles, instables, non fixées

technique d’enrichissement en pénicilline par

Isolement des mutants (méthode des répliques)

Ex: Méthode des répliques: recherche des mutants His- et Leu-

Isolement Conservation des

Mutants résistants aux

Mutants Mutants létales

Mutants résistants aux

Mutants résistants aux antibiotiques, métaux lourds

Les agents chimiques

Agents Les analogues Les agents

Exemple : Acridine orange, bromure d’éthidium

Les radiations ionisantes: rayons X et g, ionisent la substance qu’elles traversent et on a

• Organisme test: Salmonella typhimurium (ST) His-.

C2 est le double de la concentration C1 du produit mutagène à tester.

GS : gélose de surcouche qui sert pour l’étalement de la préparation

Variante du test d’Ames (test qualitatif)

a) Déduire le génotype de cette population bactérienne.

a) Quel est le but de l’utilisation du 5 Bromo-Uracile

a) Quel est le but de ce test ?

 Types d’ATB selon le mécanisme

Définition d’un antibiotique

• Inhibition de la synthèse du peptidoglycane et lyse cellulaire

• Gram+ et Gram- (interférence avec la synthèse des protéines)

• Augmentation de la perméabilité de la membrane plasmique

• Interaction avec la gyrase, blocage de la réplication

• Inhibition de l’ARN polymérase

• Certains ATB sont des analogues d’un intermédiaire dans la voie de

Dégradation Source Modification Réduction

Deux méthodes pour réaliser ce test: la méthode de dilution et la méthode de diffusion

Série de l’antibiotique : dilution au 1/2

Ensemencement par inondation

1) placer les catégories cliniques sur l’échelle de concordance.

Transfert génétique= transmission de caractères héréditaires d’une

transformation conjugaison transduction

Griffith donna le nom de transformation à ce changement de

Espèces naturellement transformables :

 Bacilles  Nésseria gonorrhoeae

L’activation des gènes « com » est provoquée par la sécrétion de

L’ADN double brin exogène est

Il se fixe généralement de façon

N’importe quelle fraction du

et qui font parti d’un complexe protéique

L'ADN transformant est capturé par les vésicules membranaires ou transformasomes

exemple: la séquence AAGTGCGGTCA pour Haemophilus influenzae.

Dans ce cas seul des ADN spécifiques peuvent être transformants

La compétence est constitutive tout au long du cycle.

TRANSFORMATION ARTIFICIELLE = TRANSFECTION

• Recherche de conditions permettant l’entrée de l’ADN plasmidique dans une

* Mises au point des conditions