Dr BESNACI Sana Enzymologie et Génie Enzymatique

C
es dernières décennies ont vu de nombreuses avancées dans le domaine des
biotechnologies. Reproduire, du moins mimer, les processus biologiques n’est plus tout à
fait
du domaine de l’impossible, et à ce titre, les protéines, et plus particulièrement les enzymes,
en tant que catalyseurs, constituent un sujet d’étude privilégié pour le développement de
nouveaux procédés de synthèse sélectifs. Les nombreux progrès en termes d’isolation, de
purification et de stabilisation de ces protéines, mais également le développement de
l’ingénierie génétique, ont conduit à une intensification de la recherche dans ce domaine, qui
n’intéresse plus seulement la biologie mais aussi le génie des procédés.
En effet, les enzymes sont susceptibles de catalyser une grande variété de réactions
conduisant à des fonctions aussi diverses que les alcools, les hydroxyacides, les acides
aminés, les aldéhydes ou les cétones. Là où les synthèses chimiques classiques nécessitent
souvent plusieurs étapes de catalyses, d’extractions et de purifications, les synthèses
enzymatiques permettent l’obtention de composés complexes, en une seule étape, le plus
souvent en milieu aqueux. De plus, elles fonctionnent à température et pression ambiante, ce
qui diminue le coût énergétique d’un procédé de synthèse. A l’heure actuelle, ce type de
catalyse est appliqué à la préparation de synthons pharmaceutiques, de compléments et
d’additifs alimentaires, de produits cosmétiques ou encore d’herbicides ou d’insecticides.

Le Génie enzymatique
L’Enzymologie, branche de la biochimie, est la discipline
consacrée à l’étude des propriétés structurales et
fonctionnelles des enzymes.

Le « génie enzymatique » est

une branche de l’ingénierie des bioprocédés qui relève de l’exploitation des
enzymes en passant par l'identification de leurs spécificités, les conditions de leur
purification, leur modification dans le but d’améliorer leurs propriétés et les
conditions optimales de la catalyse enzymatique et enfin la production à grande
échelle à des fins appliquées.

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Définitions
Enzyme : Toutes les enzymes sont des protéines; Les enzymes sont des « bio » catalyseurs
(catalyseurs biologiques) de réactions ;

Une enzyme donnée est spécifique d’une réaction, c’est-à-dire qu’elle catalyse toujours la
même transformation, se produisant sur les mêmes corps chimiques initiaux ;

Les protéines enzymatiques sont synthétisées par des êtres vivants. Cette synthèse est
déterminée génétiquement.

La formulation réactionnelle :

Ou avec cofacteur :

Substrat de l’enzyme : Molécule qui entre dans une réaction pour y être transformé
grâce à l’action catalytique d’une réaction. Toutes les molécules qui entrent dans une
réaction enzymatique et sont définitivement modifiées sont appelées substrats.

Produit : Molécule(s) produite(s) au cours d’une réaction catalysée par une enzyme.
Produit résultat de la catalyse.

Ligand : Corps chimique ayant une liaison spécifique avec une enzyme. Toutes les
molécules ayant une liaison spécifique avec une protéine sont appelées ligands. Pour
chaque ligand, il existe au moins un site de fixation sur la protéine qui le reçoit.

Cofacteur : appelé aussi effecteur positif, sont des atomes (exemple des métaux Mg,
Zn, Mn, Fe…) ou des molécules (non protéique : NAD, FAD, CoA) qui interviennent dans
la réaction enzymatique comme activateur, mais ne sont pas transformés
définitivement à la fin de cette réaction. ils interviennent pour transporter le substrat,
pour recevoir le produit ou comme participant à la structure de l’enzyme. Les
coenzymes sont également des cofacteurs que l’on peut qualifier de « biologique ».

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Inhibiteur : appelé également effecteur négatif et comme sont non l’indique, il s’agit
d’atome ou de molécule pouvant inhiber la réaction catalytique. Son action peut se
situer sur l’enzyme comme sur son substrat.

Les principaux inhibiteurs sont :

- Les inhibiteurs irréversibles : liaison covalente
avec un des acides aminés du site actif
- Les inhibiteurs réversibles compétitifs :
analogie structurelle – mais pas de catalyse
- Les inhibiteurs réversibles non compétitifs : pas d’analogie structurelle – mais se fixe sur
d’autre site de l’enzyme spécifique à cet inhibiteur
- Des inhibiteurs à effets mixtes : pas d’analogie mais se fixe sur des sites spécifiques au
niveau de l’enzyme
- L'inhibition par excès de substrat : mauvaise liaison E – S.

La classification des enzymes

Le pouvoir catalytique des enzymes permet de produire de nouvelles substances et de
l’énergie, indispensables au bon fonctionnement des organismes vivants. C’est en fonction de
leur activité catalytique que celles-ci sont classées. Une nomenclature a été proposée par la
Commission des Enzymes de l'Union Internationale de Biochimie divisant les enzymes en six
grandes classes. Chaque classe est divisée en sous-classe et chaque sous-classe en
sous-sous-classe. Un "numéro" de classification est associé à chaque enzyme et est appelé
"EC number". Il se présente de la manière suivante : EC [numéro de la classe]. [numéro de la
sous-classe]. [numéro de la sous-sous-classe]. [numéro individuel de série dans la sous-sous
classe].

1. Les oxydoréductases (EC1) catalysent les réactions d’oxydo-réduction. La plupart de ces

enzymes sont connus sous le nom de deshydrogénases, mais certains d’entre eux sont appelés
oxydases, peroxydases, oxygénases ou réductases.

2. Les transférases (EC2) catalysent les réactions de transfert de groupes moléculaires d’une
molécule à une autre. Cette classe inclut les kinases.

3. Les hydrolases (EC3) catalysent les clivages hydrolytiques.

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4. Les lyases (EC4) catalysent les réactions d’élimination d’un substrat, non hydrolytique et non
oxydative, ou lyse, avec création d’une double liaison. Dans le sens inverse, les lyases catalysent
l’addition d’un substrat à une double liaison d’un second substrat ; une lyase qui catalyse une
réaction d’addition dans les cellules est souvent appelée synthase.

5. Les isomérases (EC5) catalysent les réactions d’isomérisation ou les réarrangements

intramoléculaires.

6. Les ligases (EC6) catalysent les réactions de légation au cours desquelles deux molécules sont
unies. Ces réactions nécessitent un apport d’énergie chimique, le plus souvent sous forme
d’ATP. Les ligases sont aussi dénommées synthétases. Chaque enzyme a un numéro de code qui
permet d’identifier.

La catalyse enzymatique
La liaison protéines-ligand est à la base de l’étude des interactions de l’enzyme avec son
substrat, et par conséquence la formation du complexe « E-S : enzyme-substrat ». Ce modèle
implique que l’enzyme ne se lie à un substrat qu’au niveau d’un seul site, dit site actif, et que
ce dernier n’accepte qu’un substrat spécifique, comme une serrure qui ne peut fonctionner
qu’avec sa propre clé.

Un catalyseur agit à de très faibles concentrations, il augmente la vitesse des réactions chimiques,
sans en modifier le résultat. Dans le cas de l’enzyme, à la fin de la réaction la structure de
l’enzyme se retrouve inchangée et peut reprendre à nouveau une nouvelle catalyse.

La catalyse enzymatique ne modifie pas les constantes d’équilibre des réactions catalysées,
impliquant la préservation des produits d’une réaction donnée. Elle diminue les énergies
d’activation des réactions et automatiquement accélère la réaction.

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Cinétique enzymatique
L'étude de la cinétique enzymatique a commencé en 1902 quand Adrian Brown a
examiné la vitesse d'hydrolyse de saccharose par l'enzyme invertase

saccharose + H2O ⇌ glucose + fructose

Brown a démontré que lorsque la concentration de saccharose S dépasse celle de

l'enzyme, la vitesse de la réaction devient indépendante de la concentration de saccharose ou
ordre zéro par rapport au saccharose.

Il a donc proposé que la réaction globale est composée de deux réactions élémentaires
le substrat forme d'abord un complexe avec l'enzyme, puis ce complexe se décompose en
produit et enzyme, où E, S, ES, et P symbolisent l'enzyme, substrat, le complexe enzyme-substrat
et le produit, respectivement.

Chaque réaction est décomposée en :

-Phase pré-stationnaire: E mis en présence du S, combinaison E-S rapide (milliseconde).

-Phase stationnaire: enzyme saturée par S, la combinaison E-S à concentration maximal est
constante.
-Phase post stationnaire: concentration en S diminue significativement au bout d’un temps plus
ou moins long.

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L’hypothèse de Mickaelis-Menten:

Le modèle de base de la cinétique enzymatique s'écrit ainsi :

L’équation de Mickaelis-Menten:

Méthode de Lineweaver et Burk pour la détermination de km et vmax

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Facteurs affectant l’activité enzymatique

1. Effet de la température

Une augmentation de la température :

- augmente la vitesse de la réaction chimique.

-augmente la vitesse de dénaturation de l’enzyme (une protéine), diminuant ainsi son activité
catalytique.
La somme de ces deux effets donne une courbe caractéristique de l’activité enzymatique
température qui passe par un maximum, montrant ainsi l'existence d'une température optimale.

2. Effet du pH

Les enzymes sont très sensibles aux variations du pH et fonctionnent bien sur une
gamme limitée du pH. Les mesures de nombreuses activités enzymatiques en fonction du pH
donnent des courbes qui passent par un maximum, montrant ainsi l'existence d'un pH
optimum. Le pH peut agir sur plusieurs facteurs :

-l'ionisation des résidus de l’enzyme et du substrat et/ou du produit

-la structure tertiaire des protéines et donc la stabilité de l'enzyme
-la liaison du substrat à l'enzyme - l'activité catalytique de l'enzyme ;

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(A) Activité catalytique vs. pH (B) Activité mesurée à pH 7.4 après incubation de l’enzyme
pendant 1 h à différents pH

3. Effet de la concentration du substrat

Pour une quantité fixe d’enzyme :

- À faible concentration du substrat, la vitesse de la réaction est proportionnelle à la

concentration du substrat.

- À des concentrations de substrat élevées, la vitesse de réaction est indépendante de

la concentration du substrat et tend vers une valeur constante (vitesse maximale). Le choix
de la concentration du substrat est une considération importante dans le développement
des essais enzymatiques.