Chapitre 1 : Eléments de biotechnologie

1.3. Enzymes immobilisés

1. Introduction
Dans la pratique, les applications industrielles des enzymes en solution se trouvent
parfois considérablement limitées par deux choses :

Prix de revient Relative instabilité

Du fait de leur : Nature protéique

Sensibles
Température
Sensibles
pH
Sensibles
Ions
 En solution, même si l'activité de l'enzyme est suffisante, sa récupération après
utilisation nécessite un processus :

Long Coûteux de purification

Par conséquent, ces enzymes sont perdues une fois la réaction effectuée : elles ne
sont pas utilisables pour d'autres cycles de production.

L'immobilisation des enzymes sur des supports solides :

En augmentant leur stabilité opérationnelle.

Et en permettant l'utilisation de réacteurs en

flux continu.

Permet de contourner cette difficulté.

2. Procèdes d'immobilisation des enzymes
L'immobilisation des enzymes sur des supports solides est rendue possible
grâce :

à la présence de certains groupements chimiques réactifs dans la structure

primaire de l'enzyme.

Accessibles à la surface de la molécule :

NH2 (Lys)

(Ser,Thr,Tyr) HO

(Asp, Glu) COOH SH (Cys)

Classification des Groupements chimiques réactifs selon leurs fréquences d’utilisation
Très utilisés
Non
utilisés Fréquemment
utilisés

Non Utilisés
utilisés parfois

Fréquemment
Utilisés utilisés
parfois

Non Fréquemment
utilisés utilisés
Non
utilisés
 L'enzyme peut être retenue sur un support solide par différents procédés
1. Immobilisation par adsorption
Certaines enzymes peuvent se fixer de façon assez
stable, sans aucune modification chimique
particulière, à la surface de certains supports solides,
par adsorption.
Celle-ci est obtenue par la mise en contact du support
et des enzymes actives pendant une période définie.
Cette technique est :
Simple
Peu coûteuse
Réversible
Mais la fixation n'est pas spécifique
Donc les risques de désorption sont importants
Un choix judicieux de support ne nécessitant pas d'agent chimique pour
l'adsorption permet une immobilisation dans des conditions douces résultant en
une stabilité élevée des enzymes retenues.
Les supports les plus utilisés sont les suivants :

Alumine (Al203)
Titane (Ti)
Oxyde d'aluminium

Verre poreux Argile

Résines
échangeuses Charbon actif
d'ions (Agarose)
Gel de silice
Hydroxyde de silicium
Si(OH)4
Cette technique a été la première application commerciale d'une enzyme
immobilisée (L-aminoacylase)

Aminoacylase Structure

Permettant l'isolement de la L-méthionine à partir d'un mélange racémique.

(Technique mise au point par la compagnie Tanabe Seiyaku, au Japon, en 1969).

 L-aminoacylase
fongique immobilisée
(H2O)

Isolement
2. Immobilisation par fixation covalente
Comme il s'agit de protéines, les groupements réactifs
disponibles sont de deux types principaux : des groupements
acides carboxyliques et des groupements aminés primaires.

D'autres groupements existent (R -SH, R -OH), mais leur

utilisation est plus délicate car leur modification se traduit en
général par la perte de l'activité enzymatique.
L'immobilisation des enzymes nécessite donc une « greffe » dans des
conditions douces entre :
R-COOH de l’enzyme Ou R—NH2 de l’enzyme

Certains groupements réactifs du support solide

Parfois, il est nécessaire d'introduire, sur le support solide, d'autres groupements
activés par l'utilisation de réactifs tels que :

Le bromure de cyanogène (BrCN) Le glutaraldéhyde (C5H8O2)

La carbodiimide
(RN=C=NR)

Ces réactifs relient à la fois les enzymes et le support

Fixation d'une enzyme sur un support activé par le bromure de cyanogène

Fixation d'une enzyme sur un support activé par un carbodiimide

Dans le cas de l’immobilisation par fixation covalente Les supports usuels sont :

Des supports minéraux Des supports organiques

Silice Dextran

Verre poreux Agarose

Oxydes métalliques Cellulose

Polystyrène
Ce procédé d'immobilisation offre
l'avantage de pouvoir être utilisé Polyamide
dans une large gamme de pH et
de force ionique.
Nylon
3. Immobilisation par Inclusion ou encapsulation

Le gel polymérise autour de l'enzyme et l'inclut, tout en

permettant, dans une certaine mesure, la circulation
des substrats et produits.

Cette technique est :

Peu coûteuse

Mais les problèmes de diffusion constituent un

facteur limitant
Dans les mailles d'un gel de polymères naturels ou
synthétiques. Les supports utilisés sont très variés :
Cellulose ou ses dérivés
Dextrans

Carraghénanes

Polyacrylamide
Fibres de polyester

Mousse de polyuréthane

Nylon
L'immobilisation de l'acétylcholinestérase par inclusion dans un gel mixte
d'alginate/ carraghénanes
4. Immobilisation par réticulation

Les enzymes sont immobilisées par l'établissement de

liaisons intermoléculaires entre les enzymes au moyen
de réactifs bi- ou multifonctionnels, formant des agrégats
insolubles.

Le glutaraldéhyde, par exemple, est utilisé comme agent de réticulation qui réagit
avec les fonctions amines ( -NH2) des protéines grâce a ses deux fonctions
aldéhydes.
Les supports inorganiques utilisés pour l'immobilisation des enzymes doivent
présenter :
De bonnes propriétés mécaniques

De bonnes propriétés thermiques

Etre stables dans une large gamme de pH

Avoir une bonne capacité de résistance aux attaques microbiennes

Avoir une bonne capacité de résistance aux solvants organiques

3. Avantages des enzymes immobilisées
Comparativement aux systèmes à enzymes libres, la technologie des enzymes
immobilisées présente les avantages suivants :
Augmentation de la stabilité face à la dénaturation thermique

Augmentation de la stabilité face à la dénaturation aux pH extrêmes

Par conséquent la durée de vie de ces enzymes immobilisées est accrue

ce qui permet leur utilisation pendant de longues durées

À titre comparatif, chez une enzyme immobilisée, sa stabilité en fonctionnement à

30 °C est de l'ordre d'une semaine à quelques mois

Alors que celle de l'enzyme en solution est souvent inférieure à 24 h

Sa conservation est améliorée
La stabilité de l'enzyme immobilisée peut atteindre plus de 6 mois à 4 °C
L'utilisation de températures plus élevées (50 °C et plus) lors des
réactions est également possible à cause du renforcement de
l'architecture tridimensionnelle par l'immobilisation qui empêche le
déploiement des chaînes polypeptidiques de l'enzyme.
Dans ces conditions de température, le développement des bactéries
est également stoppé
Contrairement aux enzymes solubles, l'utilisation de solutions alcooliques
est rendue possible par l'immobilisation des enzymes. Cette propriété est
particulièrement utile lorsque l'on travaille avec des substrats insolubles en
phase aqueuse et solubles en phase organiques (ex. stéroïdes)
Entre autres avantages
Le mécanisme réactionnel de l'enzyme immobilisée n'est en général
pas modifié
Le contrôle du pH d'action optimal est plus aisé
Les produits obtenus sont d'une plus grande pureté et leur récupération
est plus facile
Les processus d'inhibition des enzymes sont réduits voire complètement
éliminés
La productivité est fortement augmentée grâce aux opérations en mode
continu et à la possibilité de réutiliser les enzymes
 4. REACTEURS ENZYMATIQUES
Un réacteur enzymatique est défini comme un dispositif dans lequel une réaction
de conversion chimique est catalysée par une enzyme.

L'immobilisation des enzymes est un procédé permettant leur utilisation

industrielle dans des réacteurs en continu permettant :
Les bioconversions
La synthèse

Ou l'hémisynthèse

De composés de haute valeur ajoutée

Plusieurs types de réacteurs enzymatiques ont été mis au point :
Ils ont pour fonction la production, en continu, du ou des produits de conversion
du substrat.

Le principe de ces réacteurs repose sur le passage lent du substrat (vitesse

déterminée par l'expérience) au travers d'une colonne d'enzyme immobilisée.

Le choix du réacteur dépend, et

Du type de réaction

Du support

De l'utilisation désirée
 Les types de réacteurs enzymatiques
1. Réacteurs à acides aminés
C'est l'un des premiers réacteurs industriels réalisé pour la fabrication de
L-aminoacides

Les acides aminés synthétisés chimiquement à des fins alimentaires sont un

mélange racémique de composés D- et L-. Seul le composé L- est
utilisable en nutrition humaine et animale

Le dédoublement du racémique, difficile par voie chimique, est facilité par

l'utilisation d'une aminoacylase fixée

Le mélange racémique est alors acylé, puis passé sur une colonne
contenant l'enzyme immobilisée qui est le plus souvent d'origine fongique
(Aspergillus oryzae).
Le L-aminoacide libéré est aisément séparé du D-acylaminoacide. Ce dernier est
chimiquement racémisé, avant de passer à nouveau sur la colonne.

Cette synthèse dite combinée (association de méthodes chimiques et

enzymatiques) est très avantageuse pour un grand nombre d’acides aminés.

Ce type de bioréacteur permet de produire des quantités importantes (une

dizaine de tonnes) de L-aminoacides par mois, par exemple :
L-alanine
L-glutamate
L-méthionine
L-phénylalanine
L-tryptophane
L-valine
 Les types de réacteurs enzymatiques
2. Réacteur à Lactose

Ce type de réacteur est utilisé pour fabriquer du lait sans lactose. L'hydrolyse de ce
dernier en glucose et galactose est catalysée par la β-galactosidase.

Cette enzyme peut être co-polymérisée avec la sérum-albumine bovine qui sert alors
de protéine support, grâce au glutaraldéhyde (agent pontant).

Le lait est déposé en continu sur la colonne remplie de l'enzyme immobilisée, le

lactose est alors hydrolysé en glucose et galactose.

Ainsi, le lait se trouve débarrassé du lactose sans avoir perdu ses propriétés
nutritives et en préservant l'ensemble de ses constituants.
5. Biocapteurs enzymatiques
La catalyse enzymatique est étudiée traditionnellement en milieu aqueux La
grande variété et la spécificité des enzymes ont été très tôt exploitées dans le
secteur de I ’analyse et du contrôle.

Particulièrement lorsque l'hétérogénéité du milieu se prête mal à une mesure

spécifique par voie chimique ou lorsque le milieu réactionnel est constitué d'une
phase non aqueuse.

En effet, le développement de biocapteurs à enzymes permet aujourd'hui de

travailler en phases organiques, rendant possible la détermination de composés qui
sont peu ou pas solubles dans l'eau mais solubles dans des solvants organiques
Ce qui a élargit le champ des applications analytiques des biocapteurs enzymatiques
aux substrats et échantillons hydrophobes

Le composant clé du biocapteur enzymatique est l'enzyme qui est responsable de

la reconnaissance spécifique de l'analyte

Lorsqu'on travaille dans des solvants non aqueux, la simple adsorption de l'enzyme
sur un support solide au niveau de l'électrode est souvent une bonne méthode
d'immobilisation en raison de l'insolubilité des enzymes dans les solvants
organiques.

Néanmoins, une grande variété de méthodes d'immobilisation des enzymes est

actuellement disponible, permettant une meilleure stabilisation de l'activité
catalytique. Les durées de vies de ces électrodes enzymatiques sont alors de
quelques jours à plusieurs semaines selon la nature de l'enzyme et son mode
d'immobilisation.
Définition d’un Biocapteurs enzymatiques
D'une manière générale, les biocapteurs associent un dispositif de reconnaissance
biologiquement sélectif appelé biorécepteur à un semi-conducteur le transducteur.
 Le biorécepteur
représente le premier
maillon du biocapteur, sa
spécificité permet
d'identifier la nature du
produit recherché.

Le transducteur constitue l'autre partie du biocapteur. La grandeur à mesurer, en

agissant sur le biorécepteur, génère une énergie (thermique, électronique,
rayonnante, etc.) proportionnelle à l'intensité de la réaction. Cette énergie est
convertie par le transducteur en un signal électrique aisément mesurable.
Plusieurs types de biorécepteurs et de transducteurs existent à l'heure actuelle ;
différentes combinaisons sont alors possibles.

Exemple d’un biorécepteur cellulaire

 Biorécepteur
Ce sont les enzymes purifiées couramment commercialisées qui sont les plus
utilisées. L'utilisation de ces enzymes présente de nombreux avantages comme leur
grande spécificité par rapport au(x) substrat(s), la reproductibilité des analyses,
des caractéristiques et des durées de vie connues, une disponibilité rapide.

Le développement d'électrodes biologiques, dites « électrodes à enzymes » est

certainement une des plus importantes innovations dans le domaine des applications
industrielles des enzymes. Ces électrodes sont recouvertes d'une couche constituée
d'une enzyme immobilisée sur un support et couplée à un transducteur
(généralement ampérométrique) qui traduit sous forme de signal électrique l'activité
de cette enzyme.
 L'enzyme peut être fixée directement à la surface de l'électrode ou incluse dans un
gel polymérique et retenue par une membrane perméable au substrat à doser. Si
celui-ci est présent dans l'échantillon, il diffuse à travers la membrane et la réaction
catalytique est déclenchée. Le produit qui peut être un ion ou un gaz induit une
différence de potentiel mesurée par l'électrode de platine et proportionnelle à la
concentration du produit de la réaction.

Ainsi, dans le cas d'une électrode à urée, l'uréase adsorbée sur un gel convertit
l'urée en ions ammonium et en HC03- et l'électrode sensible aux ions NH4+ permet
la mesure directe de la quantité d'urée présente dans l'échantillon. De telles
électrodes permettent la mesure instantanée d'un certain nombre de substances
dans des systèmes biologiques complexes, (le sang, par exemple) du fait de la
spécificité des enzymes utilisées. De plus, ces électrodes peuvent être adaptées à
des mesures en continu, ce qui facilite grandement le suivi de l'évolution de tel ou tel
produit au cours d'une réaction.
Dans le domaine de la détermination des pesticides, un biocapteur basé sur
l'acétylcholinestérase (AChE), obtenue par manipulation génétique chez Drosophila
melanogaster, montre une constante d’inhibition pour le methamidophos (insecticide)
avec un ordre de grandeur trois fois plus élevé qu'avec les préparations
commerciales d'AChE d'Electrophorus electricus (anguille électrique). Ce même
biocapteur est sensible à un autre insecticide, l’omethoate, avec une limite de
détection de 10-17 M.

Des avancées importantes dans le développement des biocapteurs portent sur I

immobilisation de l'élément de reconnaissance biologique à la surface de la sonde.
Ces approches incluent l'usage de nouveaux matériaux et l'incorporation de
médiateurs d'oxydo-réduc-tion dans le processus de l'immobilisation.
Plusieurs enzymes sont inhibées par des métaux toxiques qui contaminent
l'environnement. Pour détecter ces métaux, les enzymes les plus utilisées sont
l'uréase et I AChE. La transduction du signal est souvent obtenue en suivant par
potentiométrie le changement du pH causé par la présence de métaux toxiques tels
que Hg (II), Cu (II), Cd (II), ou Zn (II).

L'activité de la chromate reductase du cytochrome C3 de bactéries réductrices du

sulfate a été utilisée pour construire un biocapteur sélectif du Cr (VI). Cette électrode
enzymatique est sensible à Cr (VI) à des concentrations comprises entre 3,8 et 132
pM et n'est pas affectée par des interférants potentiels tels que As (V), As (III) ou Fe
(III).
L'analyse de certaines substances telles que la lécithine exige le couplage de deux
enzymes. Une électrode bienzymatique qui utilise la phospholiphase D (PLD) et la
choline oxydase (ChOx) immobilisées sur un gel de K-carraghénane avec une
électrode à oxygène comme transducteur a été utilisée pour l'analyse de la lécithine
(phosphatidylcholine).

Le biocapteur, fonctionnant sur le principe de deux réactions enzymatiques

couplées, établit une corrélation entre la concentration en substrat et l'oxygène
consommé par la réaction catalysée par la choline oxydase et la diminution de
l'intensité du courant mesuré par la sonde oxymétrique de l'appareil.
Les limites de détection obtenues à l'aide des biocapteurs mono- ou bi-enzymatiques
sont relativement plus élevées que celles obtenues par les méthodes
immunologiques ou chro-matographiques qui restent des méthodes de référence.

Transducteur
Le transducteur représente l'élément permettant de mettre en évidence la réaction
assurée par le biorécepteur auquel il est intimement connecté ou de doser
directement et rapidement un composé chimique ou biologique dans un milieu
complexe en transformant le signal biologique ou biochimique (modification de
charges, de pH, de température, de fluorescence, etc.) en un signal électrique
enregistrable.

Le choix du transducteur dépendra donc du type de réaction et des substances

libérées ou consommées. Il peut s'agir d'une cellule électrochimique, d'une
thermistance, d'un photomètre, etc.
Transducteur
1. Transducteurs électrochimiques
Dans le cas d'une détection chimique, il existe un grand nombre d'électrodes
sensibles au pH, aux cations et aux anions. Ces transducteurs sont de plusieurs
types, suivant la nature du signal enregistré :

Conductométriques qui permettent de suivre les modifications de conductivité

d'une solution lorsque, au cours d'une réaction, des espèces ioniques sont générées.

Potentiométriques qui mesurent la différence de potentiel (ddp) entre l'électrode de

mesure et l'électrode de référence. Selon la loi de Nernst, la ddp est proportionnelle
au logarithme de la concentration de l'élément chimique à doser.

Ampérométriques qui mesurent l'intensité du courant qui traverse une cellule

électrochimique. Cette intensité dépend de la concentration des espèces chimiques
pouvant être oxydées ou réduites.
Transducteur
2. Transducteurs thermiques ou calorimétriques
Certains transducteurs sont sensibles à la température. Ils sont basés sur la mesure
de la chaleur générée par la catalyse enzymatique. Cette approche a été utilisée
pour la détermination de l'activité de la lipase.

3. Transducteurs optiques
Il peut s'agir aussi d'une détection à l'aide de fibres optiques d'un changement des
condi¬tions optiques du milieu : émission de lumière, de fluorescence, absorption de
la lumière, phosphorescence, luminescence.
CARACTERISTIQUES DES BIOCAPTEURS
Un biocapteur va pouvoir être caractérisé en fonction de plusieurs critères :

Sa spécificité qui correspond à sa capacité à détecter un composé parmi d'autres.

Elle dépend de la nature du biorécepteur.

Par exemple, un biocapteur basé sur le suivi de la conductimétrie sera sensible à

toutes les espèces d'électrolytes qui pourraient être présentes dans un milieu. Par
contre, les électrodes spécifiques d'un ionomètre ne sont sensibles qu'à des ions
particuliers.
CARACTERISTIQUES DES BIOCAPTEURS
Un biocapteur va pouvoir être caractérisé en fonction de plusieurs critères :

Sa sensibilité qui correspond à la plus petite concentration d'un polluant donné

générant un signal. Elle dépend du biorécepteur, du transducteur et de l'interaction
entre ceux-ci.

Le signal émis par le biorécepteur lors de la reconnaissance moléculaire doit être

dans les limites de détection du transducteur.

Or, plus le signal est important, meilleure est la détection, compte tenu du rapport
signal/bruit de fond. Il faut donc choisir d'étudier une fonction qui soit fortement
perturbée par le(s) toxique(s) à détecter et à quantifier.
Sa capacité à donner une réponse en temps réel. Chaque essai doit être
reproductible et facile à calibrer.

Un biocapteur doit être robuste et résister aux changements de température, de

pH, de force ionique. De plus, son utilisation doit être simple, requérant un minimum
d'entretien de technicité. Il devra donc être un outil compact, peu onéreux, fiable,
facilement miniaturisable et automatisable (dans la majorité des cas).

La stabilité du biorécepteur dans les conditions de l'analyse est une caractéristique

d'une importance primordiale.
Le choix du transducteur va aussi dépendre des possibles interférences qui peuvent
perturber la détection (ex. milieux troubles dans le cas d'une détection optique) et de
l'application du biocapteur.
Utilisé en milieu biologique, il doit répondre à des critères de biocompatibilité : dépôt
à sa surface de protéines, de lipides ou de cellules. Utilisée in vivo, sa dimension doit
être réduite et sa forme adaptée pour éviter un endommagement important du
matériel biologique.

Pour une utilisation de longue durée, il faut tenir compte du relargage éventuel de
composants toxiques, métalliques ou polymériques du transducteur.
IMMOBILISATION DE L'ENZYME
L'un des principes fondamentaux des biocapteurs est la proximité du biorécepteur et
du transducteur. Ce dernier doit être à même de capter et transmettre rapidement les
changements biologiques ou biochimiques existant.

De ce fait, la technique d'immobilisation du biorécepteur, directement sur le

transducteur ou à proximité, constitue un des points critiques de l'élaboration et du
bon fonctionnement des biocapteurs.
Dans les biocapteurs à enzymes, les méthodes d'immobilisation sont :

• immobilisation sur des billes de verre poreuses,

• liaisons covalentes sur membranes de dialyse,

• réticulation avec du glutaraldéhyde,

• immobilisation sur gel d'agarose.

Domaines d'application des biocapteurs enzymatiques
De nombreux exemples d'applications des enzymes en général et des enzymes
immobilisées, en particulier en industrie et en médecine.

Les applications potentielles des biocapteurs enzymatiques concernent la mesure de

substances antigéniques, de nombreux paramètres chimiques (glucose, urée) ou la
détection de corps toxiques (dioxyde de carbone, métaux lourds, pesticides, etc.).

Ces mesures relèvent des domaines d'applications suivants : analyses médicales,

industrie agro-alimentaire, environnement, etc.
Les premiers biocapteurs ont été développés à des fins médicales. Puis l'industrie
agroalimentaire s'est intéressée aux biocapteurs comme outils analytiques rapides.
Enfin, depuis quelques années,

les biocapteurs trouvent des applications dans le domaine de la surveillance de

l'environnement. Très récemment, d'autres dispositifs, les puces à ADN (encart 12)
sont de plus en plus développés et utilisés dans des buts similaires, en complément
ou en concurrence avec les biocapteurs.
Domaines d'application des biocapteurs enzymatiques
1. Domaine de la santé
Le premier biocapteur développé en 1967 permettait la détection du glucose dans le
sang. En 1972, un biocapteur enzymatique sensible à l'urée a été mis au point. Une
suspension d'uréase est maintenue à la surface d'une électrode munie d'une toile en
nylon ; l'ensemble est recouvert avec une membrane de dialyse. Ce biocapteur
permet de détecter I urée à des concentrations variant de 1,1 10-7 M à 2,2.10-2 M.

D'autres biocapteurs ont été développés pour les besoins de l'industrie

pharmaceutique et le domaine médical, principalement pour la recherche de
stéroïdes tels que le cholestérol l'androstendione, la testostérone, des antibiotiques
tels que la nystatine et d autres composés comme des hormones, l'acide urique, la
créatinine et le fer (Il et III).
Les biocapteurs les plus utilisés sur le marché sont les biocapteurs à glucose,
constitués de la glucose-oxydase comme biorécepteur et d'un transducteur
électrochimique, pour leur utilisation dans le diagnostic du diabète.
Domaines d'application des biocapteurs enzymatiques
2. Industrie agro-alimentaire
C'est notamment dans les procédés de fermentation où les applications sont les plus
utilisées pour le suivi, en continu, de la concentration de sucres grâce à des
biocapteurs à enzymes ou à microorganismes immobilisés.

Un biocapteur à base de tyrosinase est utilisé pour la détermination de polyphénols

dans les huiles et aliments.
Domaines d'application des biocapteurs enzymatiques
3. Industrie agro-alimentaire
Contrôler les contaminants dans l'air, l'eau et le sol est incontournable lors de la
prévention des risques pour la santé humaine et l’environnement. Compte tenu du
temps consacré et du coût des techniques analytiques traditionnelles

Il y a un besoin accru de méthodes plus simples, plus rapides, moins coûteuses et

directement applicables sur le terrain.
L'utilisation des biocapteurs dans le domaine de l'environnement est récente. Ils
permettent la détection rapide de polluants dans les écosystèmes et donc
d'intervenir plus rapidement pour y remédier.

La détection peut se faire directement dans des systèmes complexes (eau douce,
eau de mer, sol, etc.) prélevés dans le milieu naturel.

Un grand nombre de biocapteurs destinés à la détection des pesticides

organophosphorés et des carbamates utilisent des capteurs électrochimiques
comme transducteurs et des biorécepteurs à base d'enzymes purifiées et
immobilisées (estérases, acétyle choline estérase).
Des biocapteurs basés sur l'utilisation de la tyrosinase ont été développés pour la
détection des phénols, molécules polluantes dont l'usage est très répandu
(pesticides, plastiques, surfactants, etc.).