4 - Diagnostique Virologique

Les méthodes de diagnostic
virologique
2ème année de médecine
Module de Microbiologie-Immunologie
Dr EL KAMOUNI YOUSSEF
Professeur de Bactériologie-Virologie. FMPM
Cours de virologie 2023 - Pr Y EL KAMOUNI 1

OBJECTIFS
• Citer les étapes de la phase pré-analytique en
virologie.
• Différencier les méthodes de diagnostic direct et

indirect.
• Décrire les principales techniques classiques du

diagnostic direct et indirect des infections virales.

PLAN
I- Introduction
II- Phase pré-analytique en virologie
III-Techniques classiques du diagnostic direct
IV- Techniques classiques du diagnostic indirect
V- Conclusion:

I- Introduction
• Diagnostic virologique consiste à identifier le ou les virus

responsable d’une infection virale
• Le principe est de chercher le ou les marqueurs prouvant

l’implication d’ un virus dans une infection donnée
• Les marqueurs viraux recherchés sont de deux types

➢ M. directs: virus en entier ou un de ses composants (antigènes, génome)
➢ M. indirects: ce sont les marqueurs de la réponse immunitaire contre

l’infection virale (Anticorps)

I- Introduction
• Diagnostic virologique : intérêt majeur en pratique médicale

➢ Diagnostique: c’est la confirmation de l’infection virale
➢ Thérapeutique: traitement adapté et suivi de son efficacité
➢ Prophylactique: permet de prendre des mesures préventives

I- Introduction
• Histoire du diagnostic virologique: trois phases
• Phase pasteurienne: 1949

• Culture cellulaire
1
• Phase immunologique : 1970
• Techniques immuno-enzymatiques
2 • Anticorps monoclonaux
• Phase moléculaire: dés 1983

• Amplification génomique: PCR
3

Evolution du diagnostic virologique: Phase Pasteurienne
•Pionnier de la virologie Début 1949
Culture in vitro des poliovirus.
Phase immunologique
•Apogée en 1970 , Avènement
des techniques immuno-
enzymatiques et les Ac monoclonaux:
Développement des techniques du diagnostic direct
et indirect rapides, sensibles et spécifiques
Phase moléculaire ou génomique:

ESSOR de la virologie médicale avec l’amplification
et quantification génique , séquençage. PCR: 1983
États-Unis, Kary Mullis
PLAN
I- Introduction
IV- Techniques classiques du diagnostic indirect
V- Conclusion:

◾ Diagnostic virologique fiable: Trois phases

Pré-analytique:
• Guidée par les renseignements cliniques
• Respect des conditions de prélèvement
• Prescription, Prélèvement, Transport, Enregistrement, Prétraitement échantillon
Analytique:
•Exécution des analyses
validation techniques des contrôles et des prélèvements
•Pertinence et performance de la technique du
diagnostic virologique
Post-analytique:
Interprétation des résultats, Concertation entre praticien et virologue
• Transmission des résultats, archivage, conservation

Prescription médicale+++
c’est une demande d’analyse prescrite à un malade par
son médecin traitant, elle est porte deux volets d’information
❖ Volet administratif
– Identité du patients ,
– Âge du patient
– Coordonnées du prescripteur ...
❖ Volet médical
– Nature de la demande d’analyse
– Motif de la demande: renseignement cliniques
– Nature du prélèvement et condition de réalisation
– Date et heure du prélèvement

Prélèvements:
❖ Conditions de réalisation:
• Respecter et appliquer les mesures d’asepsie +++
• Rassurer et expliquer au patient la nature du prélèvement à réaliser
• Préparer le matériel nécessaire selon le type de prélèvement à faire
❖ La nature du prélèvement à réaliser dépend de plusieurs facteurs
• Virus recherché,
• Localisation de l’ infection (neurologique, pulmonaire, digestif, cutanéo-muqueux…)
• Stade de l’infection: aigue, chronique, réactivation
• Age du patient, …
❖ Le prélèvement doit être riche en cellules
• les virus sont des parasites intracellulaire obligatoires

Exemples de recommandations pré-analytique en virologie:
Liquide céphalo-rachidien 2h à T° ambiante

LCR Flacon stérile +4°C durant les 24h
Congélation -20
Autres - cutanéo-muqueux - liquide amniotique,

- humeur aqueuse - placenta…..

Identification – conditionnement - transport
❖ Les échantillons doivent être bien identifiés et mis

dans un emballage étanche pour éviter toute
contamination
❖Le prélèvement accompagné de la fiche de

prescription doit être immédiatement acheminé au
laboratoire
❖si non, conservation :

oà +4C° dans les 48H au maximum pour les
prélèvements destinés aux examens sérologiques
oet à -20C° pour les ceux destinés à la biologie
moléculaire
-20C°
PLAN
I- Introduction
IV- Techniques du diagnostic indirect
V- Conclusion:

• Isolement du virus: • Diagnostic d’une infection aigue ou
• Cultures cellulaires chronique
• Visualisation du virus: • Détermination du statut
immunitaire
• Microscopie électronique
• Différentes techniques:
• Détection des Ag viraux:
• Techniques immunologiques:
• Techniques immunologique
• immuno-enzymatiques;
• Détection du génome virale:
ELISA et apparentés +++
• Amplification génique, PCR et • Autres:
apparenté
• Séquençage
Diagnostic direct Diagnostic indirect
Détection du virus ou Détection des Ac antiviraux: Ig
de ses composants G et Ig M
Approches complémentaires
15
Diagnostic direct
Détection du virus ou de ses composants
•Isolement du virus:
• Cultures cellulaires et ECP
•Visualisation du virus:
• Microscopie électronique
•Détection des Ag viraux+++:
• Techniques immunologique :
• Ag soluble: ELISA et apparentés, Immunochromatographie; bandelette
• Ag associé aux cellules; Immunocytodiagnostic:
•Détection du génome virale+++:
• Amplification génique, PCR et apparenté
• Détection et /ou quantification du génome viral
• Séquençage
Cours de virologie 2023 - Pr Y EL KAMOUNI

1. Culture cellulaire
• C’est un ensemble de techniques de biologie utilisées pour faire
croître des cellules hors de leur organisme (in vitro)
• Les virus ne sont cultivables que sur des cellules vivantes
(parasites intracellulaires obligatoires)
• Cette condition est assurée sur des :
– Animaux vivant (souris…)
– Œufs de poule : actuellement réservés pour la production de vaccins
– Cellules en culture: c’est la base de la culture cellulaire actuellement
Il n y a pas de cellules de culture universelle : chaque virus a son

tropisme particulier
17
1. Culture cellulaire
Type de cellules origine
•Cellules d’organes:
Cellules primaires - Rein de singe
- lymphocytes humaines
•Durée de vie limitée : une à deux générations
•cellules transformées : immortelles

Cellules en lignées - Humaines: Hela (cancer du col de femme)
continues - Animales:
+++++ ✓ Vero: cellules de rein de singe
✓ MDCK (Madin-Darby canine kidney): rein de chien
✓ MDBK: cellules de rein de bovin
• nombre infinie de subcultures
Cellules fibroblastiques •cellules obtenues du tissus fœtaux (fœtus)

embryonnaires humaines •Quarantaine de générations
1.Culture cellulaire:
composition du milieu de culture cellulaire
•Cellules
•Eléments nutritifs, facteurs de croissances, antibiotiques….

1.Culture cellulaire
• Après inoculation du virus sur une culture de cellules,
• Incubation à 37°C en atmosphère humide (qqh à ++jours)
• Observera en microscope optique à faible grossissement :

❑ Absence de réplication virale: cellules non permissives
❑ Réplication abortive ou faiblement cytolytique: effet cytopathique

• L’effet cytopathique: c’est le résultat de la réplication virale entrainant des
altérations morphologiques de la nappe cellulaire
• L’aspect de l’ECP est un élément d’orientation diagnostique d’un virus, de

genre ou d’une famille virale :
– Destruction de la nappe cellulaire,
– Présence des foyers de lyse
– Cellules ballonisées ou rétractées
– Inclusions nucléaires et ou cytoplasmiques
– Formation de syncytium (fusion des cellules entre elles)
• Délais d’apparition de l’ECP: variable selon les virus
• Actuellement : culture cellulaire rapide par centrifugation après inoculation qui

permet de réduire le délais (appliquée pour les Herpesviridae (CMV++ )

- Après coloration (inclusions intranucléaire,
intracytoplasmique)
Entérovirus
23
❖ L’identification du virus après culture cellulaire fait appel aux
techniques immunologiques et moléculaires:
❖ Elle consiste à rechercher des Ag et/ou des acides nucléiques viraux
❖ Différentes techniques sont utilisées

• immunofluorescence /Ac monoclonaux (HSV1/HSV2)
• séroneutralisation / Ac polyclonaux (sérotypes de poliov)
• inhibition de l’hémaglutination (Adéno)
• amplification génomique

❖Avantages de la CC
➢ c’est la technique de référence pour le diagnostic (majorité des virus)
➢permet l’étude phénotypique de la sensibilité aux antiviraux
➢Permet la description de nouveaux virus
➢Permet l’élaboration des vaccins et des antiviraux
❖Limites de la CC
➢Technique longue (plusieurs jours d’incubation)
➢Difficile : nécessite du personnel expérimenté et des locaux adaptés
➢Couteuse

2.Microscopie électronique (ME)

• Permet d’observer directement les virus au sein du
prélèvement
• L’utilisation des Antisérums dirigés contre le virus
suspecté facilite la détection des virus sous forme
d’agrégats, c’est l’immuno-microscopie.
• Limites:
• Appareillage couteux,
• Technique ne permet pas la distinction entre les virus

de la même famille
• Limitée à certains laboratoires spécialisés

3.Recherche des Antigènes viraux

• Les techniques des recherche des Ag viraux sont basées sur
l’utilisation des Ac monoclonaux qui forment des complexe immuns
avec les Ag recherchés
• Les Ac monoclonaux sont marqués par un marqueurs facilitant leur

révélation ou détection

• Selon la nature du marqueur utilisé on distingue

– techniques d’immunofluorescence (IF): utilisent un fluorochrome
(fluorescéine) , La présence du virus se traduit par une fluorescence (vert-
pomme) intracellulaire après excitation par des UV, c’est l’IF directe
– techniques immuno-enzymatiques (ELISA) : le marqueur utilisé est une

enzyme (peroxydase ou autre)
– techniques d’agglutination sur microparticules de latex ou sur bandelette

3-1: Techniques d’immunofluorescence (IF)
▪ L’Ac spécifique de l’Ag est marqué par

un fluorochrome (fluorescéine)
▪ Lecture sous microscope à fluorescence
▪ La présence du virus se traduit par une

fluorescence vert-pomme intracellulaire
L’IF peut être directe (IFD) ou indirecte (IFI)

•IFD: la molécule indicatrice est fixée sur l’Ac Indirecte:
• IFI: molécule indicatrice fixée sur un deuxième Ac qui reconnait un premier Ac non marqué

3-1: Techniques d’immunofluorescence (IF)
Exemple d’application: recherche des Ag des virus respiratoire

3-2: Techniques immuno-enzymatiques (ELISA et apparentés)

Principe : l’Ag recherché est détecté par un Ac marqué par une
enzyme qui après ajout de son substrat entrainera le formation
d’un produit coloré (réaction colorimétrique)
• L’intensité de la coloration (densité optique DO) mesurée par
un spectrophotomètre est proportionnelle à la quantité d’Ag
existante dans le prélèvement.

❖Avantages
•Technique automatisée
•Microplaques 96 puits (adaptées aux grande série d’échantillon)
•Rapide: résultat obtenu en 1 à 3 heures
•Sensible et spécifique
❖Exemple d’application:
• recherche de l’Ag Hbs du Virus de l’hépatiteB,
•recherche de l’Ag p24 du VIH

33
3-Recherche des Antigènes viraux
3-3: Techniques d’agglutination sur microparticules de latex
•Microparticules sensibilisés par des Ac spécifiques qui en
présence de l’Ag recherché vont s’agglutiner
•L’agglutination est visible à l’œil
•Exemple: recherche des Ag de Rotavirus dans les selles

3-4: Techniques immunochromatographiques: test rapide
principe
l’Ag recherché est prit en sandwich par un ac spécifique préalablement fixé sur une
bandelette de nitrocellulose et un 2eme ac spécifique marqué à l’or colloïdal

3-4: Techniques immunochromatographiques: test rapide
❖Avantages
•Rapide: résultat en 15 mn
•Facile à réaliser
•Moins couteux
❖Limites: faible sensibilité ( faux négatif)
❖Exemple d’application:
•Ag HBs
•Ag du virus grippal

4-Recherche du génome viral
◾ Plusieurs techniques automatisables

◾ PCR: Polymérase Chain Reaction +++
▪ Kary Mullis:
▪ Invention PCR 1983
▪ Prix Nobel 1993
▪ Amplification génique in vitro de l’ADN :
▪ Amplification de l’ADN initial
▪ Un cycle PCR comporte trois étapes:
Dénaturation- hybridation-élongation
▪ Répétition des cycles 30 à 40 cycle par PCR:
▪ n cycles: Amplicon: 2n copies ADN initiale
Principe de la PCR
5’ TGTCAAAGACATGCTACATGC ATGC TAC GATCGATAGCTACATGAC CTGCTAATGAC

3’ TG AC AG TTTC TG TAC G ATG TAC G TAC GATG C TAGC TATC G ATG TAC TG GTACGATTACTG 5’
95° C 
3’ TGAC AGTTTC TGTAC GATGTAC GTAC GATGC TAGC TATC GATGTAC TGG ACGATTACTG 5’
Dénaturation - 95°C
Principe de la PCR

ACGATTACTG 5’
5’ TGTCAAAGAC
Hybridation - 55-60°C
(spécifique)
Principe de la PCR
P = ADN polymérase ADN dépendante thermorésistante
P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P PP

AC AG TTTC TG TAC G ATG TAC G TAC GATG C TAG C TATC G ATG TAC TG G ACGATTACTG 5’
PPP P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P
P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P PP
5’ TGTCAAAGACA TGCTA C ATGC A TGC TAC G ATCG A TAGCTA C ATG AC C AGCTAATG AC

Elongation - 72°C
Répétition du cycle 30 à 40 fois
Préparation du Mix Ajout de la matrice
Mélange contenant des nucléotides, des
amorces sélectionnées et la polymérase
thermorésistante,

thermocycleurs

Pour les virus à ARN: RT-PCR

PCR et variantes
• RT-PCR où la PCR est précédée de transcription inverse dans le cas de virus à ARN
• PCR en temps réel: suivi de l’avancement de la PCR après chaque cycle par mesure
indirecte de l’ADN produit
• PCR quantitative: permettant d’évaluer approximativement le nombre de copie de

génome viral (mesure de charge virale génomique)
• PCR multiplex: utilisant simultanément plusieurs couples d’amorces, ce qui permet

de détecter des virus différents au cours d’une même réaction
• PCR emboîtée ou nichée: Nested PCR: qui consiste à faire suivre une première
série de cycles de PCR par une seconde utilisant des amorces situées à l’intérieur
du premier fragment amplifié; cette double amplification accroît encore la
sensibilité

VIII. Séquençage du génome viral
Principe
• Déterminer l’ordre des nucléotides sur la molécule d’ADN
• Connaitre la séquence exacte du gène recherché
• Comparaison des séquences obtenues à celles de souches de
référence
46
Principe:
Déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides d’un
fragment d’ADN grâce à 1 réaction de polymérisation de
l’ADN avec une ADN polymérase et des
didésoxyribonucléosides (ddNTP)
47
VIII. Séquençage du génome viral
• les virus à ADN grande stabilité
• les virus à ARN font preuve d'une grande variabilité :

VIH, VHC : intérêt du génotypage
Intérêt du génotypage
• intérêt épidémiologique.
• intérêt thérapeutique : mutation de résistance
résistance aux anti-rétroviraux : recherche
de mutation sur les codons de la reverse
transcriptase
48
Apport de la Biologie moléculaire
en virologie
◾ La PCR a révolutionné le diagnostic virologique:
▪ Rapide / détection directe à partir des prélèvements
▪ Sensibles / Prélèvements pauci-viraux

▪ Spécifiques / gène virale recherché
▪ Détection des virus non ou difficilement cultivables
▪ Automatisation et disponibilités des trousses de diagnostic in
vitro
◾ Limites:
▪ Cout; complexité variable
▪ Absence de preuve du caractère infectieux du virus
49
49
Applications de la Biologie
moléculaire en virologie
Diagnostic précoce avant séroconversion : ex VIH,
VHC , VHB
▪ Primo-infection clinique
▪ Sécurité transfusionnelle ( Diagnostic génomique
viral)
▪ Virologie moléculaire « multiplexe »
▪ virus respiratoires
▪ virus neurotropes
▪ Suivi thérapeutique:
▪ Quantification de la charge virale :
▪ Risque de transmission : VIH, VHC, VHB ...
▪ Prédiction de l’efficacité thérapeutique VHC,VIH
Intérêt du diagnostic indirect
Mise en évidence des Ac synthétisés en réponse à une

infection virale:
➢ IgM : marqueurs d’une infection aiguë ou récente
➢ IgG : marqueurs d'une infection passée ou ancienne

(état immunitaire)

Rubéole
VHB
52
5
2
Principe
• Le diagnostic indirect (DI) repose sur la spécificité de la
réaction Ag-Ac;
• On utilise un ou plusieurs antigènes viraux comme moyen de de

formation des complexes immuns Ag-Ac avec les Ac spécifiques
recherchés,
• Les antigènes viraux utilisés peuvent être :
❑ virus entier purifié
❑ protéines virales extraites ou recombinantes
❑ oligopeptides synthétiques
•Deux catégories de techniques de DI peuvent être distinguées

1-Techniques ne permettant pas de distinguer l’isotype des

Anticorps
➢Techniques d’hémagglutination
➢Techniques d’inhibition de l’hémagglutination
➢Technique de séroneutralisation
➢Techniques de fixation de complément

1-Techniques ne permettant pas de distinguer l’isotype des Anticorps
Technique
d’hémagglutination
Technique d’inhibition
de l’hémagglutination

2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps
➢Ces techniques utilisent un deuxième Ac spécifique permettant de
déterminer la classe des immunoglobulines (Ac) humaines détectées:
IgM –IgG- IgA ou Ig totales.
➢Ce sont les plus utilisées en diagnostic indirect
Principe : basé sur la fixation d’un Ag viral sur un support solide

Le sérum à tester est mis en contact avec l’Antigène
Après une étape de lavage, un Ac anti-Ig humaine est ajouté
Cet Ac est couplé à un système de révélation qui détermine le type
de la technique

Selon la nature du marqueur utilisé, on distingue différentes techniques
➢ Fluorochrome dans le cas de l’immunofluorescence indirect
➢ Radio-isotope dans le cas des techniques radio-immunologiques
➢ Enzyme spécifique d’un substrat : tech. immuno-enzymatiques

• Dominées actuellement par les techniques ELISA et

apparentés
• Avantages:
✓ Rapides,
✓ sensibles, spécifiques
✓ automatisables
✓ Résultats qualitatifs et quantitatifs
✓ Distinguent les Ig M et les Ig G

❖Enzyme (paroxydase ou autre) qui après ajout de son substrat il y aura production d’un produit
coloré, l’intensité de la couleur mesurée par un spectrophotomètre sera proportionnelle à la
quantité des Ac recherchés :

• ELISA combinée ou mixte

Consiste à rechercher l’antigène et l’Anticorps spécifiques d’un virus
en une seule réaction ELISA
Applications:
•VIH: Ag p24 + Ac anti VIH
•VHC: Ag capsidique + Ac anti VHC

• La réaction chimiluminescente qui en résulte est
mesurée en Unités Relatives de Lumière (URL). Il
existe une relation directe entre la quantité d'Ac ou
d ’ Ag présente dans l ‘ échantillon et les URL
détectées
par le système optique ARCHITECT i System.
61
EIA techniques automatisées- systèmes fermés
Autres techniques
CLIA Chemi Luminescence ImmunoAssay
ELFA Enzyme Linked Fluorescent Assay
ELCA Technique immunoenzymatique avec

détection finale en
chemiluminescence
MEIA Microparticle Enzyme immuno Assay

Technique de Western blot
❖ elle permet de vérifier la spécificité des Anticorps vis-à-vis des

antigènes d’un virus donné
❖Avantages : ils sont plus spécifiques que les techniques ELISA
❖Application en virologie : confirmation d’une sérologie positive

exp: infection à VIH

Technique de Western blot
Réaction ELISA
Sur la bandelette

limites du diagnostic indirect

Conclusion
• Les techniques classiques: très variées
• Place importante en pratique médicale
• Indications dépendent de plusieurs facteurs

– Virus recherché
– Stade de l’infection
– Contexte clinique…

• Isolement du virus: • Différentes techniques: Révélation CI
• Cultures cellulaires: Ag-Ac
• Visualisation du virus: • Techniques immuno-enzymatiques;
• Microscopie électronique ELISA et apparentés +++
• Détection des Ag viraux: • Immunofluorescence
• Techniques immunologique : • Immuno-empreinte; Western-Blot (confirmation)
• ELISA et apparentés • Immunochromatographie; bandelette
• Immunochromatographie; bandelette • Autres:
• Immunocytodiagnostic … • Séroneutralisation
• Détection du génome virale: • Fixation du complément
• Amplification génique, PCR et apparenté • Inhibition de l’hémagglutination
• Détection et /ou quantification du génome viral • Agglutination passive ou conditionnée …
• Séquençage
Diagnostic direct Diagnostic indirect
Détection du virus ou de ses Détection des Ac anti-
composants viraux
Approches complémentaires
676
7

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• Différencier les méthodes de diagnostic direct et

• Décrire les principales techniques classiques du

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II- Phase pré-analytique en virologie

III-Techniques classiques du diagnostic direct

IV- Techniques classiques du diagnostic indirect

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• Diagnostic virologique consiste à identifier le ou les virus

• Le principe est de chercher le ou les marqueurs prouvant

• Les marqueurs viraux recherchés sont de deux types

➢ M. indirects: ce sont les marqueurs de la réponse immunitaire contre

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• Diagnostic virologique : intérêt majeur en pratique médicale

➢ Thérapeutique: traitement adapté et suivi de son efficacité

➢ Prophylactique: permet de prendre des mesures préventives

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• Phase pasteurienne: 1949

• Phase moléculaire: dés 1983

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Phase moléculaire ou génomique:

II- Phase pré-analytique en virologie

III-Techniques classiques du diagnostic direct

IV- Techniques classiques du diagnostic indirect

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◾ Diagnostic virologique fiable: Trois phases

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Liquide céphalo-rachidien 2h à T° ambiante

Autres - cutanéo-muqueux - liquide amniotique,

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❖ Les échantillons doivent être bien identifiés et mis

❖Le prélèvement accompagné de la fiche de

❖si non, conservation :

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III-Techniques classiques du diagnostic direct

IV- Techniques du diagnostic indirect

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Il n y a pas de cellules de culture universelle : chaque virus a son

•cellules transformées : immortelles

Cellules fibroblastiques •cellules obtenues du tissus fœtaux (fœtus)

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• Après inoculation du virus sur une culture de cellules,

• Incubation à 37°C en atmosphère humide (qqh à ++jours)

• Observera en microscope optique à faible grossissement :

❑ Réplication abortive ou faiblement cytolytique: effet cytopathique

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• L’aspect de l’ECP est un élément d’orientation diagnostique d’un virus, de

• Délais d’apparition de l’ECP: variable selon les virus

• Actuellement : culture cellulaire rapide par centrifugation après inoculation qui

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❖ Elle consiste à rechercher des Ag et/ou des acides nucléiques viraux

❖ Différentes techniques sont utilisées

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2.Microscopie électronique (ME)