Le diagnostic bactériologique

Année universitaire : 2021-2022

Enseignant : Pr Mostafa Elouennass

Pr Elouennass 1
 Introduction
• Évolution de:
– La microbiologie:
• Connaissances fondamentales
• Techniques de diagnostic microbiologique
– La pathologie infectieuse ( émergence, réémergence d’agents
pathogènes), de la résistance aux antibiotiques…
• Impact clinique et économique de l’échec thérapeutique
• L’approche multidisciplinaire de la prise en charge des
maladies infectieuses: rôle centrale du laboratoire de
microbiologie
• Collaboration des Microbiologiste, infectiologue et
l’épidémiologiste, indispensable pour la maîtrise des
risques infectieux
Pr Elouennass 2
 Objectifs
• Comprendre l’intérêt de l’orientation
épidémiologique et clinique
• Savoir les règles générales de la phase pré-
analytique
• Citer les différentes étapes analytiques d’un
examen microbiologique et leurs intérêts
• Comprendre la validation d’un examen
microbiologique: phase post analytique
• Percevoir l’intérêt de la communication
cliniciens/laboratoire
Pr Elouennass 3
Examens bactériologiques: objectifs
• Confirmer l’infection
• Isoler et identifier l’agent causal
• Étudier sa sensibilité aux antibiotiques
• Étayer une enquête épidémiologique
• Orienter les mesures thérapeutiques et
prophylactiques
• Deux types d’examens bactériologiques:
Direct et Indirect

Bonne indication des examens bactériologiques

Optimiser le diagnostic, le traitement et la prévention

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 Le diagnostic
bactériologique direct

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 La phase pré-analytique
Les prélèvements (1)
Deux grandes catégories sont distinguées :
1. Prélèvement à visée diagnostique:
Mettre en évidence une bactérie ( ou une des ses composantes) ou des
bactéries nommément pathogènes ou responsables de surinfections

2. Prélèvement à visée épidémiologique:

• Surveiller l’écologie microbienne du malade ou du service
• Détecter les colonisations par des bactéries résistantes aux
antibiotiques

Pr Elouennass 6
 Différences entre prélèvements à visée
diagnostique et à visée épidémiologique

Visée diagnostique Visée épidémiologique

Échantillons Échantillons
- En l'absence de contamination externe - Écouvillons de peau, plaies,
- Liquide de ponction, muqueuses, expectorations,
- Écouvillons de plaie, muqueuse uniquement biomatériaux traversant la surface
pour les bactéries nommément désignées cutanée: la bactérie recherchée doit
être précisée

Utiliser des milieux de culture diversifiés pour Utilisation d'un milieu sélectif
élargir le potentiel d'isolement des bactéries
Antibiogramme Antibiogramme limité
Quantification Détection d’une seule colonie de
bactérie spécifique significative
Orientation de l’antibiothérapie Dépistage du portage: BMR….
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 Les prélèvements (2)
• Prélèvements de qualité avant le début de toute
antibiothérapie avec:
– Identification nature et lieu
– Renseignements cliniques
– Transport rapide, milieux adéquats : flacons
d’hémoculture, écouvillons mousses, milieux gélosés/les
anaérobies
• Site normalement stérile
– Hémoculture, LCR, Liquide articulaire, pleurale, ….
– Infections pulmonaires: prélèvements protégés.
• Site normalement non stérile: Urine, selles, pus
superficiel..

Pr Elouennass 8
 Les prélèvements (3)
• Il ne faut pas hésiter à interroger le laboratoire
avant de réaliser le prélèvement
• Éviter de recueillir d’autres bactéries que celles
qui sont responsables de l’infection
• En cas de présence de matériel étranger :
prélever le liquide d’écoulement (urine,
produit de drainage) ou le tissu avoisinant et
non le matériel lui-même seul sauf s’il s'agit
de matériel implanté
• Sonde urinaire ou redon: inutile
Pr Elouennass 9
 Les prélèvements (4)
• Devant toute suspicion d’infection
profonde
– Prélèvements du site profond
– Prélèvements superficiels (portes d’entrées
ou localisations secondaires)
– Prélèvements centraux, notamment les
hémocultures

Pr Elouennass 10
 Différentes étapes de l’examen
bactériologique direct
• Macroscopie: Minutes
• Microscopie: 1H
– Examen direct à l’état frais
– Examen direct après coloration de Gram, autres colorations …
• Cultures ( isolement , enrichissement : >24H
• Identification: 24H
• Études de la sensibilité: 24H
• Détection antigénique voir toxinique: 1H
• Détection de gène: 2H à 24H
Pr Elouennass 11
 L’examen direct (1)
• L’examen clef de la microbiologie
– État frais
• Cellules (hématies, leucocytes)
• Bactéries (forme / mobilité)
– Après coloration de frottis: coloration de Gram, autres…
• Grande valeur d’orientation
• Interprétation correcte : expertise du microbiologiste
• Examen qualitatif ou semi quantitatif: données visuelles
Validité et utilité, dépend de la bonne qualité du
prélèvement et de l’orientation clinique

Pr Elouennass 12
 L’examen direct (2)
• La présence de PN plaide en faveur de
la réalité de l’infection du site prélevé

• En leur absence, remise en question

de l’opportunité de l’antibiothérapie

• La présence de flore bactérienne:

antibiothérapie adaptée
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 Cocci à Gram positif

En chaînette
En amas
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Cocci à Gram positif: Streptococcus pneumoniae

Pr Elouennass 15
 Bacilles à Gram négatif
• Entérobactéries
• Pseudomonas: état frais (mobilité)
• Acinetobacter
• Campylobacter

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Type Entérobactérie

Pr Elouennass 17
 Autres bacilles à Gram négatif

Type Acinetobacter Type Pseudomonas Type Campylobacter

Pr Elouennass 18
 Bacilles à Gram positif
• Morphologie, mobilité
– Listeria : petit bacille avec
mobilité en pirouette à
25°C
– Bacillus : long BGP parfois
sporulé mobile
– Flore polymorphe : flore
anaérobie

Pr Elouennass 19
Flore microbienne polymorphe type flore anaérobie
Pr Elouennass 20
 L’interprétation des données de
l’examen direct (1)
• Dépend du site prélevé et de la présence
ou non sur ce site d’une flore microbienne
physiologique

• S’il existe une flore résidente (prélèvements

de fécès, cutanés ,voies respiratoires supérieures):
– Peu d’utilité de l’examen direct, sauf si
présence d’une flore mono microbienne

Pr Elouennass 21
 L’interprétation des données de
l’examen direct (2)
• Dans un site normalement stérile:
– Il faut s’assurer de la qualité du
prélèvement: absence de contamination par
la flore cutanée, digestive ou aérodigestive
– Examen direct positif même poly-microbien:
grande valeur

Pr Elouennass 22
 L’interprétation des données de
l’examen direct (3)
• Les prélèvements de sites stériles
réalisés à travers une flore riche :
interprétation?
– Qualité de la décontamination: cas des
prélèvements urinaires
– Les prélèvements respiratoires pulmonaires
profonds doivent être protégés: LBA ou
prélèvements distaux
Pr Elouennass 23
 Pièges de l’examen direct
• Dépôt de colorants, contamination des colorants
• Variabilité des formes et de la coloration:
– Pneumocoque: diplocoque à Gram positif, qui se décolore
– Klebsiella : coloration bipolaire et forme coccoïde /pneumocoque mal
coloré
– Haemophilus : bactérie de petite taille, se colore mal par le Gram,
morphologie variable fonction du site
– Acinetobacter : diplococcobacille à Gram négatif et morphologie
variable/confusion avec le staphylocoque

Toujours confronter les données de

l’examen direct avec la clinique
Pr Elouennass 24
 Exemple d’interpreation
PDP : CGP évocateur de staphylocoque
• Malade hospitalisé, opéré il y’a 6 jours; fébrile avec
écoulement de pus au niveau du site opératoire

• Prélèvements de pus (Examen direct): Présence de PNN avec

cocci à Gram positif en amas

• Dans la même unité un patient porteur de SARM

• Démarrage du traitement antibiotique suite à l’examen

direct avec vancomycine +gentamicine, à adapter en
fonction de l’antibiogramme
Pr Elouennass 25
 LCR avec bactéries évoquant
pneumocoque

• Enfant avec des antécédents

d'antibiothérapie à répétition : céfotaxime
(forte dose) + vancomycine

• Adulte : céfotaxime (forte dose)

Pr Elouennass 26
 LCR avec bactéries à Gram positif
(bacilles ? cocci ?)

• Listeria ? Pneumocoque ?

– Sujet âgé et nouveau né : céfotaxime +

amoxicilline

– Enfant : céfotaxime ( + vancomycine)

Pr Elouennass 27
Ex : pus d'abcès cérébral avec bactéries à Gram positif
branchées sur une porte d’entrée dentaire
Évocateur Nocardia (imipénème + cotrimoxazole)
ou Actinomyces ( amoxicilline)
Espèce retenue: Actinomyces ( anaérobie stricte) donc traitement débuté: amoxicilline
Pr Elouennass 28
 La mise en culture
• Milieux
– Systématiques
– Orientées
– D’enrichissement
• Incubations
– Systématiques
– Orientées

Pr Elouennass 29
 Identification
• Délai, exigence et conditions de la culture
• Aspect maroscopique de la colonie
• Vérification de la morphologie et l’affinité tinctoriale au
Gram
• Tests biochimiques d’orientation
• Les galeries biochimiques d’identification
• Le typage antigénique
• L’identification moléculaire
– Hybridation
– Amplification
• Identification par spectrométrie de masse (MALDI-
TOF)
Pr Elouennass 30
 Étude de la sensibilité
• Détection colorimétrique de bétalacatamase
• Antibiogramme par méthode de diffusion
• Antibiogramme en milieu liquide
• Étude de la CMI, CMB, PBS, les courbes de
bactéricidie, associations
– En milieu liquide
– En milieu gélosé
– E-test
• Objectif de l’antibiogramme = classification des
souches en Sensibles, Intermédiaires ou Résistantes

Pr Elouennass 31
 L’antibiogramme
• Estimation qualitative qui apprécie l’activité
bactériostatique de plusieurs ATB sur une
espèce bactérienne
• Ne donne pas le niveau précis d’activité d’un
ATB
• Mauvaise corrélation pour certains ATB entre
ATBG et CMI: glycopeptide..

Pr Elouennass 32
 Antibiogramme diffusion en gélose
• Principe : mesure des diamètres
d'inhibition/ diamètres critiques :
résultats S.I.R.
• S.I.R. lecture brute
• S.I.R. lecture interprétative (intégration
dans la lecture des
phénotypes/mécanismes de résistances)
Pr Elouennass 33
 Définition clinique de S, I et R
• Sensibles : souches pour lesquelles la probabilité de succès
thérapeutique est forte dans le cas d ’un traitement par voie
systémique avec la posologie recommandée dans le résumé
des caractéristiques du produit

• Résistantes : souches pour lesquelles il existe une forte

probabilité d’échec thérapeutique quels que soient le type de
traitement et la dose d’antibiotique utilisée

• Intermédiaire :
– «I» sensible à forte posologie, la probabilité de succès thérapeutique
est forte uniquement dans le cas d’un traitement par voie systémique
avec une posologie forte ou lorsque l’antibiotique se concentre au site
de l’infection
– Pour certains antibiotiques il n’y a qu’une seule concentration critique,
donc il n’existe pas de catégorie intermédiaire.
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Mesures des CMIs au coup par coup

Méthode du E-test
Pr Elouennass 35
 Détection d’antigènes
• Différents produits pathologiques: urines, LCR, selles,…

• Différents techniques: problème de sensibilité mais rapidité

• Détection d’antigène soluble: technique d’agglutination….

– LCR et méningocoque, haemophilus, E. coli k1, pneumocoque
– Urine : Legionella et pneumocoque

• Détection d’antigène fixés sur produits pathologiques: IFD,

immunochromatographie
– Chlamydiae, legionella, ..
– Antigène et toxine de Clostridum difficile au niveau des selles

Pr Elouennass 36
 Biologie moléculaire
• Intérêt
– Diagnostic
– Détection de gène de résistance
– Épidémiologique
• Direct sur produit pathologique ou après
culture
• Par hybridation simple ou amplification puis
hybridation

Pr Elouennass 37
 Les limites du laboratoire
• Les données bactériologiques obtenues in vitro ne sont pas toujours
transposables aux situations in vivo

• L’association rifampicine et quinolones, antagoniste in vitro, efficace in vivo

• Les tests de sensibilité au laboratoire sont réalisés avec

– Des bactéries en phase exponentielle de croissance
– Un inoculum standardisé 106 UFC

• Dans le foyer infectieux

– Les bactéries quiescentes, sont parfois nombreuses
– La taille de l’inoculum peut varier de 106 à 109 UFC

• Les antibiotiques sont en général peu efficaces sur les bactéries quiescentes

Pr Elouennass 38
 Diagnostic indirect: les sérologies (1)
• Prélèvements: minium deux à 10-15 j d’intervalle
• Différentes méthodes
– Immunoenzymologie (ELISA), Immunofluorescence indirecte
– Agglutination passive, Inhibition de l'hémagglutination
– Précipitation en milieu liquide ou en milieu solide
– Fixation du complément, Neutralisation (d'une propriété de
l'antigène), Compétition
– Western-blot révèle, dans une même opération, la présence
d‘AC correspondant à différents antigènes autorise une
interprétation analytique des résultats
– Radio-immunologie

Pr Elouennass 39
 Diagnostic indirect: les sérologies (2)
• Interprétation fonction de plusieurs éléments:
– La technique
– Les antigènes
– La cinétique des anticorps
• La technique:
– Problème de sensibilité et spécificité
• Les plus sensibles (peu de faux négatifs) mieux pour un dépistage
• Les plus spécifiques (peu de faux positifs) mieux pour une confirmation
– Dans certains cas, nécessité de mise en œuvre de plusieurs
techniques, simultanément (syphilis) ou successivement

Pr Elouennass 40
 Diagnostic indirect: les sérologies (3)
• Dans les réactions d'agglutination, une concentration d'
anticorps trop élevée: saturation des sites antigéniques du
réactif et empêcher l'agglutination : phénomène de zone

• Techniques immuno chromatographiques:

– Systèmes unitaires
– Réactifs sont fixés à l'état déshydraté sur un support (bandelette, filtre)
– Bonne sensibilité et une spécificité satisfaisante

• Toujours: sérums témoins positifs et négatifs qui valideront la

qualité de la technique mise en œuvre

Pr Elouennass 41
Diagnostic indirect: les sérologies (4)
• L'antigène:
– L’antigène réactif n'est jamais "pur".
– Réactions "croisées" : résultats faussement
positifs (anticorps antibrucella qui coagglutinent
avec les Ag des Yersinia ou de Francisella
tularensis)

Pr Elouennass 42
 Diagnostic indirect: les sérologies (5)
• La cinétique d'apparition des anticorps
– Latence puis apparition et élévation rapide des anticorps puis
stabilisation

– Les IgM apparaissent les premiers lors d'une primo-infection. Ils

disparaissent assez vite et sont remplacés par des IgG

– Comparaison des résultats sur deux sérums prélevés à 10 jours

d'intervalle pour reconnaître une infection actuelle:
• Une séroconversion ou une multiplication par quatre du titre l'affirme,
• Un résultat négatif l'exclut,
• Un titre identique signe une infection ancienne

Pr Elouennass 43
 Diagnostic indirect: les sérologies (6)
• Les défaillances du sérodiagnostic
– Agents pathogènes incapables de stimuler une réaction immunologique
décelable in vitro : staphylocoques, mycobactéries, flore commensale..
– Sujets immunodéficients
– Sujet vacciné ou naturellement immunisé et réinfections : pic transitoire et
titre des IgG difficile à interpréter
• Interprétation des sérologies:
– Tenir compte:
• Du contexte clinique et épidémiologique
• De l'état immunologique du sujet concerné
• Du but de l'examen: diagnostic, suivi ou appréciation de l’état d'immunité,
– Maîtriser la technique, et l'exécuter avec rigueur et réaliser des contrôles

Pr Elouennass 44
 Conclusion
• La qualité des réponses du microbiologiste dépend
– De la qualité des prélèvements
– De la qualité du travail du laboratoire
• Test de sensibilité aux antibiotiques : pièce
centrale pour tous les types de traitements
antibiotiques
• La continuité du dialogue entre laboratoire et
clinicien
• Dialogue enrichissant pour l’une et l’autre partie
– Meilleure connaissance du travail de chacun
– L’amélioration réciproque des connaissances

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