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    Université Abbes LAGHROUR, Khenchela

    Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Niveau: L2

    TP 1: Extraction et séparation des pigments chlorophylliens par CCM


    1. But

    L’extraction de la chlorophylle brute à partir des organes des plantes vertes et la séparation de
    ses pigments en utilisant la Chromatographie sur Couche Mince (CCM).

    2. Principe

    La chromatographie sur couche mince, est effectuée surtout en vue d'une analyse d'un
    mélange. La phase stationnaire solide (gel de silice) est fixée sur une plaque, et la phase
    mobile liquide, nommée éluant, est un solvant ou un mélange de solvants.
    La CCM repose principalement sur des phénomènes d’adsorption. En effet, l’échantillon à
    analyser contenant un ou plusieurs types de molécules est entrainé par la phase mobile le long
    de la phase stationnaire et bien entendu, chaque espèce chimique migre à une vitesse
    dépendant de son affinité à l’égard des deux phases.

    3. Modes opératoires

    3-1- Extraction des pigments


    Prendre quelques feuilles vertes d’une plante quelconque, les rincer à l’eau distillée
    puis les couper à l’aide d’un ciseau.

    Mettre les feuilles coupées dans un mortier puis rajouter une spatule de sable, une
    pincée de chlorure de calcium (pour faciliter le broyage) et quelques millilitres
    d’acétone (environ 5ml)

    Laisser décanter et récupérer le liquide dans un tube en verre, et verser le liquide dans
    un tube de centrifugeuse
    Centrifuger et récupérer le surnageant.
    3-2- Séparation des pigments par CCM
    Préparation de la phase mobile
    La phase mobile est un mélange de solvant (système solvant): (cyclohexane, 5% ; éther de
    pétrole, 85% ; acétone, 10%) ; ou
    éther de pétrole/ éther diéthylique (40/60),
    Préparation de la cuve de chromatographie
    Mettre un volume du solvant à l’intérieur de la cuve de chromatographie de telle sorte que la
    hauteur du solvant ne dépasse pas 1 Cm.
    Université Abbes LAGHROUR, Khenchela
    Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Niveau: L2

    Fermer la cuve hermétiquement avec son couvercle, et laisser l’atmosphère à l’intérieur de la


    cuve se saturer en vapeur de solvant.
    Préparation de la phase stationnaire
    (Chaque binôme d’étudiants doit disposer d’une plaque de 20 Cm X 10 Cm)
    Tracer au crayon et sans appuyer un trait horizontal à environ 2 Cm du bord de la plaque (la
    ligne de dépôt).
    Indiquer légèrement au crayon l’emplacement des dépôts tout en évitant de toucher la plaque
    avec les doigts.
    Dépôt de l’échantillon
    A l’aide d’une pipette pasteur (ou micropipette) appropriée pour chaque binôme, prélever
    quelques microlitres de l’extrait vert, les mettent sur le point repère situé sur la ligne de dépôt
    tout en réduisant au maximum possible la surface des spots. Laisser sécher à l’air libre avant
    d’effectuer un nouveau dépôt. Le fait de faire plusieurs dépôts superposés permet de
    concentrer la tâche et donc augmenter l’intensité des couleurs lors de la révélation.
    développement de la CCM
    Tremper la plaque doucement et verticalement dans la cuve de telle façon que la ligne de
    dépôt soit en parallèle avec le front (initial) de migration du solvant.
    Une fois le front de migration du solvant arrive à 2 Cm du bord supérieur de la plaque, retirer
    la plaque de la cuve avec une pince.
    Repérer rapidement le front de migration du solvant puis laisser la plaque se sécher à l’air
    libre.

    Questions
    - Observer le chromatogramme et entourer les différentes tâches qui apparaissent au crayon.
    - Calculer les rapports frontaux correspondants.
    - Schématiser et interpréter le chromatogramme obtenu.
    Université Abbes LAGHROUR, Khenchela
    Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Niveau: L2

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