Partie 2: Techniques générales de prélèvement, transport et analyse des

échantillons
Exceptions près comme le lait stérilisé, les conserves par exemple, des produits stériles. La
qualité marchande des produits dépend beaucoup du “contrôle “ de la flore présente par des
moyens physiques (température, pH, activité de l’eau par exemple) ou chimiques (additifs à
effets antimicrobiens) et par des règles de “bonne fabrication”. Le “microbiological
guideline” comporte en effet des règles à appliquer avant, pendant et en fin de préparation,
pour la distribution et le stokage; ces recommandations sont fondées sur le respect de bonnes
pratiques professionnelles (BPP). Les diverses étapes de ces BPP se situent au niveau des
ateliers (construction, matériels et machines, outillages, facilité de nettoyage etc.), de la
qualité microbiologique des matières premières et de l’eau , du personnel au niveau de son
comportement et de son éducation hygiéniques, de la pertinence et de l’efficacité des
traitements antimicrobiens appliqués aux produits ou aux systèmes potentiellement
dangereux et enfin de la mise en place d’un ensemble de conditions de distribution les plus
favorables au maintien de la qualité.
Les spécifications microbiologiques sont des critères applicables pendant et après la
préparation afin de s’assurer que l’hygiène et les conditions de production sont satisfaisantes
et en accord avec la règlementation. Les parties prenantes d’un marché y trouveront des
garanties.
Les normes sont des spécifications microbiologiques adoptées par la législation qui
s’adressent au produit fini et fixent les limites acceptables de présence de microorganismes
donnés dans des produits bien définis.
Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux (OMS, FAO,
ISO, ICMSF, CEE, AFNOR, CNERNA , DGCCRF, services vétérinaires, etc.) qui se
préoccupent de l’établissement de critères de qualité microbiologique de nos aliments.
La qualité hygiénique dépend surtout de la nature mais aussi souvent du nombre de la flore
microbienne présente dans le produit. Si cette flore est composée de microorganismes
susceptibles d’engendrer des maladies après consommation (maladies infectieuses, toxi-
infections, intoxinations ) le produit est dangereux et ne doit en aucun cas être commercialisé.
Il appartient alors au microbiologiste de détecter le ou les points critiques affectant cette
qualité hygiénique pour laquelle la norme zéro défaut doit être un objectif prioritaire de
l’ensemble du système de production.
En bactériologie alimentaire il n’est donc pas nécessaire de rechercher, de compter et
d’identifier systématiquement toutes les bactéries, levures et moisissures présentes dans le
produit. Il suffit souvent d’effectuer :
1) une étude quantitative de la flore microbienne :
- soit par dénombrement d’une flore microbienne donnée caractérisée par un ensemble de
propriétés physiologiques communes comme par exemple numération de la flore aérobie
mésophile revivifiable sur un milieu du type gélose nutritive ordinaire (germes hétérotrophes
peu exigeants, mésophiles si la température d’incubation est voisine de 30°C avec une durée
d’incubation généralement inférieure à 72 heures, neutrophiles si le pH est voisine de 7,
aérobie ou aéro-anaérobie si l’incubation est réalisée à l’air), la numération des levures et
moisissures confondues (germes acidophiles, aérobies pour la plupart, mésophiles “bas” etc.),
la numération des anaérobies sulfito-réducteurs (germes hétérotrophes, réduisant les sulfites
en sulfure d’hydrogène, mésophiles, anaérobies stricts).
La présence de bactéries d’origine fécale ou tellurique témoigne dans nos aliments d’un
manque d’hygiène et d’un défaut de rigueur technique et peut laisser craindre la présence
concomittante dans le produit de bactéries entéropathogènes en nombre difficilement
détectable ou après un temps d’analyse important.
- soit par dénombrement d’un groupe bactérien pouvant correspondre à une contamination
déterminée: coliformes thermotolérants et/ou streptocoques du groupe D pour la mise en
évidence d’une contamination d’origine., staphylocoques pour la mise en évidence d’une
contamination d’origine cutanée, germes indologènes, germes putrides , etc...
2) une recherche orientée de certaines bactéries pathogènes telles que Salmonella,
Staphylococcus, Shigella, Mycobacterium, Listeria, Brucella, Campylobacter, Yersinia , etc....
Cette recherche exige l’utilisation de méthodes spécifiques hautement sélectives.
Le plus souvent, ces analyses ne diffèrent d’un produit alimentaire à un autre que par certains
détails d’exécution. Parmi les analyses “communes” à tous (ou presque tous) les produits
alimentaires on peut citer par exemple les numérations des coliformes ou de la flore “totale”.
La bonne qualité microbiologique (hygiénique et marchande) est donc fonction de très
nombreux facteurs ; le microbiologiste se doit néanmoins de définir le plus rapidement
possible la notion quantitative et qualitative de flore normale de son produit ou de ses
matières premières (microorganismes “habituels”et tolérables), et d’une flore contaminante
dont le seuil de tolérance sera défini en fonction du risque que fait courir cette flore à un type
donné de consommateur.
1 . Prélèvements
Les modalités des prélèvements ont fait l’objet d’un arrêté publié au J.O. du 19 janvier 1980.
Très schématiquement, la taille de l’échantillon d’un produit de même nature réparti en
portions unitaires doit être au moins de 5 unités (lieu de fabrication ou de distribution), de 5
unités pour les conserves. Le laboratoire doir disposer d’environ 500 g de produits, soit 5 fois
100 g, ces 100 g pouvant être fournis par une ou plusieurs pièces. Si le prélèvement de 5
échantillons s’avère trop élevé par rapport à la production il est procédé à un étalement dans
le temps des prélèvements. Ces prélèvements doivent avant tout respecter des règles d’aseptie
et de représentativité. La prise d’essai destinée à la préparation de la suspension mère et de
ses dilutions doit correspondre aux parties superficielles et profondes notamment pour les
produits en tranche, hachés, divisés et les plats cuisinés par exemple. Pour les produits
liquides elle est effectuée sur le produit “homogénéisé” ou sur les parties superficielles et
profondes. Dans le cas d’examens microbiologiques faisant suite à une maladie de type TIA il
faut rechercher les germes dangereux (pathogènes, toxinogènes) et leurs toxines aussi bien
dans les prélèvements de surface que dans la masse.
1 - a . Echantillonnage
Il s’agit là d’une étape fondamentale souvent délicate. si les échantillons ne sont pas
correctement prélevés et manipulés ou ne sont pas représentatifs d’un lot ou d’une production,
les résultats d’analyse n’auront aucune signification.
Un échantillonnage représentatif est essentiel quand l’analyse a pour but de détecter la
présence de germes pathogènes ou de toxines qui peuvent être distribués de façon hétérogènes
dans l’aliment ou quand la commercialisation d’un produit dépend de la qualité
microbiologique en relation avec les normes imposées par la législation.
1 - b. fréquence des prélèvements
L’échantillonnage doit être réparti dans le temps, et ce, en fonction du niveau de production et
des risques de contamination.
1 - c. Conditions du prélèvement
Les conditions essentielles à respecter pour le prélèvement sont d’abord le respect des règles
d’asepsie (travail correct du microbiologiste) et la non modification des flores présentes dans
le produit. Dans la mesure du possible, les échantillons du produit à analyser doivent être
amenés au laboratoire dans leur conditionnement d’origine, ce qui évite certaines
contaminations.
Si le produit se présente sous forme de grands volumes (réservoirs à lait etc...) s’assurer de la
bonne homogénéité de la répartition des micro-organismes ; une partie représentative du
produit sera prélevée stérilement. Il est parfois nécessaire de réaliser des prélèvements à
divers niveaux de l’aliment (surface, profondeur d’un aliment solide) ou après broyage et
homogénéisation. Les manipulations effectuées au cours du prélèvement ne doivent en aucun
cas être à l’origine d’une contamination : nécessité d’utiliser des instruments stériles et de
travailler stérilement. Certains instruments doivent être stérilisés sur les lieux du prélèvement.
Le trempage dans l’alcool et le flambage sont parfois insuffisants car la température atteinte
n’est pas assez élevée. Il est nécessaire d’utiliser des flacons propres, secs, étanches, à col
large stérilisés au four Pasteur (160°C - 10 mn) ou par autoclavage à 121°C pendant 30 min
ou encore à usage unique et stériles ; leur taille doit être adaptée au volume de l’échantillon.
Les récipients peuvent être en verre, en métal ou en matière plastique (polyéthylène,
polycarbonate, polypropylène); dans ce dernier cas il s’agit de
récipients à usage unique dont la stérilisation est obtenue à froid (radiations ou ). Dans
tous les cas les récipients de prélèvement doivent posséder un système de fermeture
hermétique. Le prélèvement d’un produit non emballé doit être réalisé dans la zone de stérilité
d’un bec bunsen ou d’un système équivalent.
1) Prélèvement en surface
Ecouvillonnage
Un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution stérile de Ringer au 1/4 ou
dans un bouillon tryptone-sel additionné de Tween (0,5°/°°). Le prélèvement est effectué par
frottement sur la surface du produit ; l’écouvillon est alors immergé dans 10 ml de Ringer au
1/4 ou 10 ml de bouillon tryptone-sel. L’analyse est réalisée à partir de la suspension ainsi
obtenue.
- Rinçage: cette méthode est utilisée dans le cas de récipients ou de tuyauteries; un volume
connu de
solution stérile est introduit dans le matériel à analyser. Après agitation, le liquide est récupéré
et soumis à l’analyse.
- Méthode des empreintes : un ruban adhésif préalablement stérilisé par les UV est appliqué
sur la surface à étudier. Après quelques secondes de contact il est retiré et appliqué sur la
surface d’un milieu gélosé approprié. Après quelques heures de contact à la température
d’incubation désirée il est retiré et la boîte est incubée jusqu’à apparition des colonies.
Méthode du cylindre : un cylindre creux de section connue est appliqué sur la surface à
analyser; on y introduit alors quelques ml de diluant stérile et après quelques secondes de
contact, le diluant est retiré et analysé.
2) Prélèvement de produits liquides
La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut néanmoins
toujours s’assurer de la parfaite homogénéisation du liquide (agitateurs) avant de prélever à la
pipette (ou avec un flacon lesté stérile ou autre) le volume nécessaire à l’analyse.
3) Prélèvement de produits solides
Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages et produits
mous) ou à la pipette harpon. La surface est souvent éliminée avant de procéder au
prélèvement. Si le produit est hétérogène (plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer de la
bonne représentativité du prélèvement.
E . 2. Traitement de l’échantillon
E - 2 - a. Transfert de l’échantillon au laboratoire
Quand le prélèvement aseptique a été réalisé il faut identifier immédiatement le produit avec
une étiquette ou une référence. Il est souhaitable de ne pas utiliser de crayons feutres sur des
films plastiques (PVC) car l’encre peut pénétrer et perturber l’analyse. Noter la température
initiale, l’heure du prélèvement, la date et la température de transport. Amener alors les
échantillons le plus rapidement possible au laboratoire en maintenant les conditions initiales
dans lesquelles se trouvait le produit. L’analyse devrait être réalisée dans l’heure qui suit le
prélèvement. Dès réception au laboratoire l’échantillon accompagné de sa fiche signalétique
est enregistré (nature, date, heure, provenance du prélèvement, nom du préleveur, analyses
demandées, autres indications utiles). Si l’échantillon doit être transporté il faut réduire au
maximum le délai avant l’analyse. Il est souvent nécessaire de réfrigérer (mais non congeler)
le produit au cours de son transport; certains germes fragiles peuvent disparaître au cours de
cette réfrigération. Si un produit est déshydraté ou en conserve il ne doit pas être réfrigéré.
Pour un produit congelé s’assurer qu’il n’y ait pas de décongélation pendant le transport (ce
produit peur être gardé pendant 1 mois avant d’être analysé). Les dispositions relatives à
l’analyse des produits congelés sont indiquées dans le JO du 19 janvier 1980. La congélation
d’un produit provoque une diminution plus ou moins importante du nombre de germes qu’il
contient. Il faut veiller à ce que la température du produit prélevé soit au moins égale à -18°C,
transporter le produit à cette température et décongeler à l’air ambiant à température voisine
de 20°C pendant un temps inférieur à 3 heures, temps suffisant pour atteindre une texture qui
permette le prélèvement.
2 - b. Préparation de l’échantillon
Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique s’effectue toujours à
partir d’une suspension. Après ouverture aseptique, l’échantillon sera “homogénéisé”
(liquide) ou broyé dans un volume connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la
première dilution. Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle
vigoureuse en présence de billes de verre permet d’obtenir une homogénéité satisfaisante.
Pour les produits solides diverses techniques de “broyage” sont utilisables :
1. broyage manuel au Potter ou en en présence de sable stérile ou de billes de verre
(mortier)
2. broyage mécanique - avec un broyeur électrique à couteaux de type VIRTIS . Au
cours du broyage les germes doivent être dispersés mais non détruits; la température
ne doit pas trop s’élever (le récipient peut être placé dans de la glace). Le broyage
s’effectue en général avec 10 volumes (ou 9) de diluant pour 1 “volume” de produit
(par exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant stérile). Le diluant peut être
de l’eau distillée, de l’eau physiologique, du Ringer au 1/4 ou une solution tryptone-
sel , etc. .
3. Les diluants
Au cours de la préparation des échantillons (et des dilutions) les microorganismes peuvent
être inhibés ou même altérés par le changement du milieu lié à l’addition de diluant
(changement de Ph mais surtout de force ionique). L’effet bactéricide de certains diluants est
connu: ainsi Staphylococcus aureus est “tué” en quelques heures dans de l’eau distillée de
même que la plupart des entérobactéries (E.coli); il en est de même pour Streptococcus
pyogenes dans du sérum physiologique ou dans du Ringer au 1/4 et pour Escherichia coli
dans de l’eau salée à 8,5‰. Actuellement il paraît souhaitable, sauf indication afférente à un
type donné d’aliment, de réaliser les préparations et les dilutions des échantillons à analyser
dans une solution de tryptone sel. En absence d’information le choix se fera en fonction de la
composition du produit à analyser: si le produit est riche en protéine et en minéraux, Ringer
ou eau physiologique suffisent et même une solution de phosphate à 2 % et pH 7,4 dans le cas
des fromages frais, crèmes fraîches et caséinates . Il faut noter que les milieu tryptone-sel et
eau peptonée tamponnée permettent, dans des conditions particulières (température, temps),
de réaliser une revivification. L’eau peptonée tamponnée est utilisée avec certains produits
acides au fort pouvoir tampon comme les yaourts.
4. La revivification
Les micro-organismes sont souvent “endommagés” mais non tués au cours des traitements
technologiques (déshydratation, chaleur, froid etc.) appliqués aux produits alimentaires ou par
suite de leur vieillissement. Ces altérations se reflètent dans certaines de leurs propriétés
physiologiques en particulier au niveau de leur phase de latence qui est augmentée ou de leurs
besoins nutritionnels ou encore quant à leur sensibilité aux conditions de milieu défavorables
(pH, sels biliaires, colorants, sels etc.). En général ces altérations sont réversibles et après leur
disparition les bactéries
récupèrent leurs propriétés initiales, en particulier au niveau de leur croissance ou de leur
pouvoir pathogène. La nécessité de faciliter le “rétablissement” des cellules ayant subi des
altérations sub-létales, c’està- dire leur “réanimation” ou encore leur revivification, s’impose
avant de les soumettre à des milieux sélectifs souvent peu favorables à la croissance du fait de
la présence d’inhibiteurs. En effet, la présence de cellules endommagées peut entraîner des
variations dans les numérations ou porter à
croire qu’il n’y a pas ou peu de germes et donc pas ou aucun risque pour le consommateur.
Ceci est particulièrement important quand il s’agit de déterminer si des micro-organismes
pathogènes ou indicateurs sont présents ou non.
4 - a. Revivification en milieu liquide
La revivification peut être réalisée dès la première étape de l’analyse au cours de laquelle le
produit est additionné de diluant. Il suffit alors de choisir un diluant de composition favorable
et d’incuber le tout à la température optimale de croissance du germe à rechercher pendant un
temps qui variera
en fonction du type d’analyse réalisé, temps qui est le plus souvent voisin du temps de latence
du germe “normal”. Si la durée de revivification est supérieure au temps de latence, il se
produira une multiplication des germes non altérés ce qui conduira, selon les techniques de
numération utilisées par la suite, à une surévaluation du nombre de germes. Après cette phase
préalable de revivification la numération est réalisable soit en milieu liquide soit en milieu
solide.
Dans les épreuves du type présence ou absence, la revivification est obtenue par un
préenrichissement dans un milieu favorable (ex. recherche des Salmonella ). La durée
d’incubation peut être relativement longue car la multiplication des germes à rechercher est
dans ce cas très souhaitable.
Dans le cas où la numération des germes doit être réalisée deux autres méthodes sont encore
envisageables :
- Quand la numération est effectuée en milieu liquide, la revivification est réalisable dans des
milieux non sélectifs ensemencés à partir des différentes dilutions. C’est à partir de ces
milieux que sont ensuite ensemencés les milieux sélectifs (de tube à tube).
4 - b. Revivification sur milieu solide
- Quand la numération est effectuée sur milieu solide, la revivification peut être obtenue par
une pré-culture sur une gélose non sélective favorable avec un temps d’incubation supérieur
au temps de latence, mais ne permettant pas la formation de colonies macroscopiques visibles.
Après revivification, la surface de la gélose est recouverte de gélose sélective.
- Quand la numération est réalisée après filtration sur membrane, la membrane sur laquelle se
trouvent les germes est d’abord placée à la surface d’un milieu de revivification pendant un
temps permettant éventuellement plusieurs divisions cellulaires normales puis le filtre est
placé à la surface d’un milieu sélectif.
E - 5. Techniques de dilution
Elles nécessitent la présence de nombreux tubes à essais contenant le plus souvent 9 ml de
diluant stérile et de nombreuses pipettes stériles de 1 et 10 ml. Les pipettes peuvent être
remplacées par des systèmes de pipetage automatique munis de cônes à usage unique. Toutes
les manipulations sont à effectuer avec toutes les précautions d’asepsie exigées en
microbiologie. L’introduction éventuelle d’un contaminant ou la contamination de l’opérateur
doivent ne jamais se produire.
Le récipient contenant le liquide à diluer est agité manuellement avec précaution pour éviter
les projections pendant une dizaine de secondes. On prélève stérilement 1 ml de ce liquide
(aspirer et refouler une fois avant le prélèvement) que l’on introduit dans un tube contenant 9
ml de diluant stérile. Le tube est agité par des mouvements de rotation ou au moyen d’un
Vortex. On obtient ainsi une dilution au 1/10. Avec une nouvelle pipette de 1 ml on prélève 1
ml de cette dilution que l’on
introduit dans un nouveau tube de diluant de 9 ml ; on obtient une dilution au 1/100 et ainsi de
suite jusqu’au niveau de dilution recherché.
E - 6. Principales techniques de numération
En microbiologie alimentaire l’intérêt de l’étude à la fois quantitative et qualitative de la flore
présente dans un aliment est considérable. Bien que de nombreuses techniques de numération
soient utilisables, il n’existe pas à l’heure actuelle de technique parfaite. Certaines méthodes
ne permettent pas de différentier les germes vivants des germes morts, d’autres s’avèrent
incapables de compter individuellement les cellules microbiennes lorsque celles-ci sont
associées (Staphylococcus, Streptococcus , mycélium etc..) et permettent d’évaluer des unités
formant colonies (UFC) ou des
unités formant trouble (UFT).
6 - a. les méthodes générales directes
1) Comptage direct
Il s’effectue au microscope à l’aide de microchambres graduées de volume connu (cellules de
Thoma, de Malassez, de Nageotte, de Salimbéni Cloup etc...) après dilution en eau
physiologique pour les germes morts, en eau formolée à 10 % pour les germes vivants. Ce
type de comptage peut être automatisé (compteurs de particules). Il est également possible
d’estimer au microscope le nombre de micro-organismes d’un produit donné après étalement
et coloration d’une quantité
connue du produit (de l’ordre de quelques microlitres) sur une lame. Enfin, un comptage
direct est réalisable après filtration du produit (ou de ses dilutions) sur membrane, coloration
de la membrane et observation microscopique. Cette dernière technique permet l’évaluation,
après coloration par l’acridine orange et observation en épifluorescence, des micro-
organismes vivants et morts (DEFT). Ce colorant est un intercalant des acides nucléiques avec
lesquels il forme des complexes fluorescents verts (ADN) ou orange (ARN)
2) Détermination du poids sec, ou dosage des protéines microbiennes ou dosage des
acides nucléiques (après sonication par exemple et/ou extraction en milieu alcalin)
3) Néphélométrie
La turbidité d’un milieu est, dans certaines conditions, proportionnelle au nombre de
microorganismes présents dans ce milieu. Ainsi l’absorbance d’une suspension microbienne à
une longueur d’onde supérieure ou égale à 540 nm varie linéairement jusqu’à des valeurs
inférieures ou égales à 0,8 avec le nombre de germes. Il est par ailleurs possible de comparer
visuellement la turbidité du milieu avec une gamme étalon d’albumine (méthode de Mestrezat
: ainsi l’opacité d’une suspension de 5.109 staphylocoques par ml est identique à celle d’une
suspension d’albumine à 0,5 g par litre).
4) Système luciférine - luciférase
Cette méthode permet le comptage des micro-organismes vivants par dosage de l’ATP
intracellulaire, la teneur en ATP intracellulaire étant sensiblement constante pour un
microorganisme donné ; cette teneur est égale à 0 si le germe est mort. Après lyse de la cellule
(SDS) l’ATP est dosé par voie enzymatiqu . Le nombre de photons émis à 562 nm mesuré par
un compteur à scintillations est proportionnel à la quantité d’ATP, elle-même fonction du
nombre de cellules vivantes.
6 - b. Les méthodes générales indirectes
1) Dosage d’un métabolite primaire synthétisé, ou dosage de la quantité d’un substrat
consommé.
Ces méthodes ne sont applicables que dans des conditions bien définies (phase exponentielle
de croissance, température, milieu etc...).
2) Réduction d’un colorant
Certains micro-organismes modifient le potentiel d’oxydo-réduction des milieux dans
lesquels ils se trouvent ; la vitesse de cette modification est à la fois fonction du nombre de
micro-organismes, de leur activité métabolique (réductrice le plus souvent) et d’autres
paramètres tels que la nature du milieu, le germe, la température etc...
Parmi les indicateurs disponibles le bleu de méthylène et la résazurine sont les plus utilisés.
3) Dilution et culture
Cette technique permet en principe la numération des germes vivants. La culture est réalisée
soit en milieu liquide (1 germe ou un groupe de germes donne après inoculation et incubation
1 culture positive) soit en milieu solide (1 germe ou un groupe de germes donne naissance à
une colonie). Dans ce dernier cas l’ensemencement peut se faire dans la masse de la gélose ou
en surface.
E - 7. Numération à partir d’un milieu solide : UFC
Cette méthodologie est le plus fréquemment réalisée dans des boîtes de Pétri. Elle repose sur
le principe que toute bactérie vivante introduite dans la masse ou en surface d’un milieu
gélosé favorable donne en principe naissance après incubation à une colonie macroscopique.
Le nombre total de colonies correspond alors au nombre d’UFC présents dans l’inoculum. De
nombreuses critiques à cette méthode peuvent être formulées. Ainsi, les bactéries aérobies
strictes se développent mal dans la masse de la gélose, tandis que les bactéries anaérobies
strictes ne s’y développeront que dans des conditions d’incubation appropriées (jarre
anaérobie par exemple).
Il peut aussi exister certains antagonismes bactériens (bactériocines etc...). Par ailleurs si la
température de mélange du milieu gélosé mélange à l’inoculum est supérieure à 45 - 47°C , il
peut y avoir inactivation de microorganismes. Cette méthode de culture dans la masse conduit
néanmoins à des dispersions homogènes dans la gélose et donc à une distribution homogène
des colonies. Dans cette méthode des germes se trouveront dans la masse et d’autres en
surface, les colonies formées étant, compte tenu des contraintes stériques imposées par le
réseau gélifié, alors différentes pour un
même micro-organisme. Cet inconvénient est éliminé par la technique de la double couche.
La numération en surface n’est réalisable que sur une surface de milieu parfaitement sèche.
L’opération d’étalement au râteau reste à maîtriser (adsorption de germes sur le râteau) et le
volume d’inoculum déposé ne peut en aucun cas excéder 0,5 ml avec des boîtes de 9 cm de
diamètre (des volumes supérieurs ne sont pas absorbés par le gel d’agar et l’eau qui reste en
surface rend impossible toute numération en raison de la formation d’une nappe). Cette
méthode donne de bons résultats avec les germes aérobies et aéro-anaérobies.
E - 7 - a. Technique de numération dans la masse de la gélose
Les milieux gélosés (répartis en erlenmeyer ou en flacon de 15 ml) sont liquéfiés au bain-
marie bouillant ou mieux au four à micro-ondes, puis maintenus en surfusion dans un bain-
marie à 45 ±1°C. 1 ml du liquide dans lequel on veut connaître le nombre de micro-
organismes est introduit au centre de la boîte de Pétri posée bien à plat dans la zone de
protection du bec Bunsen. L’inoculum peut être réparti en gouttes sur le fond de la boîte. Afin
de n’utiliser qu’une seule pipette stérile pour toutes ces opérations il est recommandé de
commencer l’ensemencement par la dilution la plus grande pour terminer avec le liquide non
dilué. Noter avec soin sur chaque boîte l’origine de l’analyse, le milieu utilisé et la dilution
correspondante (sur le côté de façon à ne pas être géné par la suite pour le comptage). On
procède de la même façon pour chaque dilution en réalisant, dans la mesure du possible, deux
essais par dilution.
Le milieu gélosé en surfusion dans lequel l’inoculum sera incorporé doit être à 45°C±1°C. Si
sa température est supérieure à cette valeur il se produira une destruction partielle de la flore ;
au contraire, si sa température est inférieure à 45°C le milieu se solidifiera irrégulièrement et
ne se mélangera pas de façon homogène avec l’inoculum. Pour réaliser l’introduction du
milieu gélosé : retirer le milieu du bain marie à 45°C, essuyer le récipient, l’ouvrir
aseptiquement, flamber son ouverture et couler le milieu dans la boîte de Pétri contenant
l’inoculum après l’avoir entrouverte
dans la zone stérile. Ne pas appuyer le récipient sur la boîte. Mélanger rapidement par
agitations circulaire et alternative horizontales ; éviter les mouvements brusques qui risquent
de projeter le milieu inoculé sur les bords ou même à l’extérieur de la boîte. Laisser refroidir
les boîtes bien à plat jusqu’à solidification complète (environ 30 minutes). Retourner les
boîtes et les placer à l’étuve dans cette position à la température requise.
Pour éviter la formation de colonies de grande taille en surface (par rapport à celles qui se
développeront dans la masse de la gélose) on peut couler à la surface de la gélose ensemencée
une fine couche de milieu de culture identique à celui déjà présent dans la boîte ou couler à la
surface une mince couche de gélose non nutritive (technique de la double couche).
E - 7 - b. Technique de numération en surface de la gélose
100 à 500 microlitres (pipette graduée ou mieux pipette automatique) du milieu à analyser
sont déposés à la surface de la gélose et immédiatement répartis de façon uniforme à la
surface du milieu au moyen d’un ensemenceur stérile du type pipette râteau. La pipette rateau
est “stérilisée” entre deux étalements par immersion dans de l’éthanol, l’éthanol adsorbé sur le
verre étant ensuite enflammé (cette opération ne déforme pas l’ensemenseur).
E - 8. Numération en milieu liquide : UFT
Cette méthode présente certains avantages tels que la possibilité d’étudier un caractère
biochimique du germe difficilement mis en évidence sur milieu gélosé comme la production
de gaz (cloche) ou encore d’effectuer facilement la numération avec une phase de
revivification. Cette méthode repose sur le fait qu’un inoculum contenant au minimum 1
germe (UFT) donnera, après introduction dans un milieu liquide donné, une culture positive.
Dans cette technique, la disponibilité des nutriments
pour le micro-organisme est excellente.
E - 8 - a. fractionnement de grands volumes liquides
Pour éviter l’accumulation de produits de dégradation qui pourraient avoir une action
inhibitrice, on ensemence 1 ml d’inoculum dans 100 ml de milieu de culture. Ce milieu est
ensuite réparti aseptiquement dans 10 tubes à essais à raison de 10 ml par tube, puis incubé.
En supposant une distribution homogène des micro-organismes, on peut conclure à la
présence de 1 à 10 microorganismes dans l’inoculum initial de 1 ml.
Si tous les tubes cultivent.........plus de 10 germes/ml
Si 9 tubes cultivent.................. plus de 9 germes/ml
..................................................................
Si 1 tube cultive....................... plus d’un germe/ml.
E - 8 - b. Méthode de Mac Grady (technique du nombre le plus probable NPP)
McGRADY, MH. (1918) Tables for rapid interpretation of fermentation test results.
Cette méthode permet de révéler de plus faibles quantités de germes que la plupart des
méthodes de numération en milieu solide. Elle repose sur une analyse statistique et fournit par
calcul des nombres les plus probables (NPP). Il existe de nombreuses variantes à la
méthode en fonction de la charge microbienne à évaluer. Cette méthode suppose que le micro-
organisme est normalement distribué dans le milieu et donc qu’un même volume
d’échantillon contient en moyenne le même nombre de microorganismes (en réalité il en
contient un peu plus ou un peu moins) ; le nombre le plus probable correspond à la valeur
moyenne. Si le nombre de micro-organismes est faible l’écart par rapport à la moyenne peut
être élevé et inversement.
Exemple : un produit liquide contient 100 micro-organismes / 100 ml
Des prélèvements de 10 ml contiennent en moyenne 10 germes avec des tubes à plus de 10 et
peu à moins de 1.
Des prélèvements de 1 ml contiennent en moyenne 1 germe avec des tubes à plus de 1 et des
tubes négatifs.
Des prélèvements de 0,1 ml conduisent à 1 tube positif pour 10 tubes et de nombreux tubes
sont négatifs.
E - 9. Numération par filtration
Cette méthode consiste à faire passer un certain volume d’échantillon ou de ses dilutions au
travers d’une membrane filtrante (par exemple une membrane Millipore ou Sartorius ou ...de
47 mm de diamètre et dont la porosité moyenne est de 0,45 mm à 0,22 μm) sur laquelle sont
retenus les microorganismes recherchés. Après filtration, on rince l’entonnoir supérieur avec
de l’eau distillée stérile ou avec une solution
tamponnée stérile afin de récupérer la totalité des germes et d’éliminer du filtre lui-même
d’éventuels agents microbicides. Le filtre est alors posé sur la surface d’un milieu de
numération imbibant un filtre adéquat ou sur un milieu gélosé spécifique du germe à
rechercher, face portant les micro-organismes vers le haut. Après incubation, comme dans le
cas de la numération en milieu gélosé, on compte les colonies formées à la surface du filtre.
Cette méthode présente certains avantages par rapport aux méthodes déjà écrites. Ainsi, le
temps d’incubation est généralement plus court (18 heures au lieu de 24 heures), le volume
d’échantillon analysable plus grand (jusqu’à plusieurs litres, ce qui permet de réaliser des
numérations de germes dans des liquides en contenant très peu tels que certaines eaux) ; il n’y
a aucune interférence entre micro-organismes (séparés à la surface du filtre et nourris par
diffusion du milieu de culture au travers des pores) et les agents microbicides associés au
produit sont éliminés (chlore, antibiotiques,
conservateurs etc.). Les différences existant entre les résultats des numérations spécifiques
d’un micro-organisme donné ont le plus souvent comme origine la nature du milieu de culture
choisi ainsi que la méthode utilisée, la température et la durée de l’incubation sans omettre les
variations liées au manipulateur.