KERGOMARD_Jeanne
KERGOMARD_Jeanne
KERGOMARD_Jeanne
Par
Jeanne KERGOMARD
Département Matière Molle – Institut de Physique de Rennes – UMR UR1 CNRS 5261
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INRAE/CIRAD/UM/Institut Agro Montpellier - UMR 1208 IATE
Composition du Jury :
Isabelle CANTAT Professeure de l’Université de Rennes 1 Examinateur
Jacques FATTACCIOLI Maître de conférences, Université Pierre et Marie Curie, Paris Examinateur
Invité(s)
Tim WOOSTER Group leader, Nestlé Research Center, Lausanne, Switzerland Membre invité
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À Catherine Kergomard, ma mère.
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REMERCIEMENTS
sans qui je ne serais pas devenue celle que je suis aujourd’hui. Merci Maman de m’avoir permis
de prendre confiance en moi. Merci de m’avoir transmis ta passion pour la lecture et l’écriture.
Merci pour cette ouverture sur le monde. Je te dois ma ténacité, mon courage, et mon envie
Je souhaiterais également remercier mon Daddy pour son soutien et sa fierté, pour avoir été là
dans les moments de doute et de stress, et pour m’avoir laissé m’épanouir dans ma vie
personnelle comme dans mon travail pendant ces 3 années. Merci également à mon frère
Mathieu, et ma sœur Louise, pour avoir été là dans les moments compliqués, malgré le fait que
mon travail soit resté assez flou pour vous jusqu’à ma soutenance (et même sans doute encore
aujourd’hui).
Je souhaite également profiter de ces quelques pages pour remercier toutes les personnes ayant
contribué à la réussite de cette thèse, mais également à mon épanouissement personnel pendant
Je remercie tout d’abord mes deux directrices de thèse, Claire et Véronique, pour m’avoir fait
confiance du début à la fin sur ce projet, et pour m’avoir laissé l’espace et le temps nécessaire pour
avancer sur le plan professionnel, mais également personnel. Ce projet de thèse a été
particulièrement salvateur, et m’aura permis d’y voir plus clair sur ma volonté de poursuivre en
Recherche. Merci infiniment pour votre présence, vos précieux conseils, nos discussions
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REMERCIEMENTS
scientifiques (parfois un peu moins), mais surtout pour votre patience et votre bienveillance à mon
égard. Je vous suis particulièrement reconnaissante de m’avoir poussé à voir toujours plus loin et
de m’avoir fait aimer mon sujet dans tous ses aspects. J’ai vécu des expériences formidables
Merci également à mon jury de thèse, Marie-Caroline Michalski, Éric Maréchal, Isabelle
Cantat, Jacques Fattaccioli, Frédéric Carrière, et Tim Wooster, pour avoir accepté d’évaluer
mes travaux, ainsi que pour la discussion et les remarques constructives qui ont suivi ma soutenance
de thèse. Merci également à Didier Dupont et Caroline Nugier pour avoir suivi mon évolution au
Merci à Nathalie pour toutes les heures passées sur mon projet malgré ton emploi du temps bien
rempli. Merci d’avoir été d’un soutien sans failles du début à la fin de ma thèse, et d’avoir pris le
temps de me rassurer pendant les périodes de stress intense… Merci aussi pour les occasions moins
Merci à Gilles, mon collègue de bureau, à qui je dois bien un paragraphe entier pour avoir réussi à
me supporter pendant un peu plus de 3 ans. Merci pour avoir supporté mes « j’en ai marre », mes
doutes, mes questions parfois (souvent) non-scientifiques, mes pauses clopes à heure fixe, et
surtout, ma modestie. Pardon pour mes bêtises en manips, le temps perdu sur les réglages de
l’ellipsomètre (merci aussi à Éric), mes clics trop rapides, et mes quelques crises de nerfs (qui, j’en
suis certaine, vont beaucoup te manquer). Bref, merci pour ta patience avec moi, pour tes
sauvetages d’expériences, pour ton partage de connaissances, et pour tes odeurs de repas le midi
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REMERCIEMENTS
Merci à Frédéric pour ces passionnantes discussions, pour tes précieux conseils, et pour ton
accompagnement au cours de ce projet. J’ai été ravie de travailler avec toi sur ce passionnant sujet
qu’est la digestion des lipides végétaux, et en particulier d’avoir pu élargir mon spectre de
compétences en enzymologie.
Merci à Béné pour avoir tenu à merveille ce rôle de « Maman » dans les moments où j’en ai eu le
plus besoin. Merci pour ton écoute, ton réconfort, la justesse de tes propos dans les périodes
difficiles. Merci aussi pour les moments beaucoup plus joyeux, pour ton incapacité à ouvrir une
porte du premier coup ou encore à éteindre des interrupteurs, pour toutes les pauses-clopes, mais
surtout pour m’avoir écouté raconter un grand nombre de bêtises en toute modestie (Docteur
Melon). Une pensée particulière pour ce week-end à Lyon, ton cadeau au Balthazar, mais surtout
pour cette fête chez toi cet été, qui m’aura fait me sentir un peu chez moi parmi ta famille. (J’espère
Merci à Louis, je ne pouvais pas écrire ces remerciements sans parler de toi. Merci de nous avoir
supporté, moi et mes plantes, pendant ces presque trois années, d’avoir été présent sur tellement de
plans, d’avoir encaissé sans broncher mes sautes d’humeur et mes angoisses. Merci d’avoir fait de
moi une meilleure personne et d’avoir été là pour moi, tout simplement.
Starbucks de l’autre côté de l’Atlantique), pour tes merveilleuses gaffes et ta maladresse. Merci
pour ce super congrès (/vacances) aux US, pour ces moments inoubliables en Floride (arrestation
par le shérif, alligators vivants et frits, requins, paysages incroyables, mauvais avion, mauvaise
réservation, snorkeling en haute-mer, co-pilote de qualité, et j’en passe). Mais surtout merci pour
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REMERCIEMENTS
Merci à Marion pour avoir été ma complice dans la végétalisation de l’IPR, mais également ma
colocataire de chambre dans un Airbnb infesté de rats à Montpellier (big up pour les boules Quies).
Merci pour ton incroyable qualité d’écoute à toutes mes histoires aux pauses-café et au bar (coucou
Maxime et Julien), j’ai été ravie de partager cette dernière année de thèse avec toi.
Merci à mes stagiaires Lauriane, Clémentine, Jérémy, et Ami-Joy pour votre aide, qui m’aura
permis de gagner un temps précieux, et de faire avancer mon sujet au-delà de mes attentes.
Bruno, Jérôme, Erwann, Juliette, Maëva, Mélina, Milena, Thaïs, Jidapa, Ninon
Merci aux non-permanents de l’IPR et de l’ISCR : Marion, Julien, Théo, Maxime, Teïva,
Ambroise, Corentin, Lauriane, Hyazann, Myriam, Romain, Solène, Amélie, Gaël, Guénolé,
Adrien, Noémie, Yoann, Maryam, Donatien, Lucas, Alberto, Alexis, Alexis, JB, Charlène,
William, Quentin, Marie, Louis, Claire, Déborah, Guillaume, Alex, Cécile … (pour les
Afterworks, La Place, les brunchs, les pauses cafés, les chasses aux champignons, les sorties à la
mer et le reste).
Une pensée également pour l’ensemble du personnel de l’IPR avec qui j’ai pu interagir : Jean-
Jean-Charles, Éric, Arnaud, Laurent, Sophie, Thomas, Soraya, Anaïs, Isabelle, Olena,
Lucile, Franck, Jeremy, Marie-Caroline, Axelle, Nicolas, Jeremy, et bien d’autres… Merci à
tous de m’avoir aussi bien accueillie, de m’avoir aidé sur les démarches administratives, de m’avoir
formé sur autant de thématiques différentes, et d’avoir contribué au bon déroulement de mon projet
de thèse. J’ai également été ravie de pouvoir contribuer à mon échelle à la vie du laboratoire et au
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REMERCIEMENTS
Je suis infiniment reconnaissante pour ces trois années passées avec vous tous.
Jeanne
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DIFFUSION SCIENTIFIQUE
DIFFUSION SCIENTIFIQUE
2022 - J. Kergomard, F. Carrière, G. Paboeuf, N. Barouh, C. Bourlieu & V. Vié (2022), Interfacial
adsorption and lipolysis behavior of gPLRP2 onto heterogenous vegetal lipid membrane.
Biochimie – en préparation
2022 - J. Kergomard, F. Carrière, G. Paboeuf, F. Artzner, N. Barouh, C. Bourlieu & V. Vié (2022),
Interfacial organization and phase behavior of mixed galactolipid-DPPC-phytosterol assemblies at
the air-water interface and in hydrated mesophases. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, DOI:
10.1016/j.colsurfb.2022.112646
(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0927776522003290)
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DIFFUSION SCIENTIFIQUE
2020 - Claire Bourlieu, Nathalie Barouh, Jeanne Kergomard, Olivia Ménard, Didier Dupont, et
al., Polar Lipids. Handbook of Dairy Foods Analysis, CRC Press, 2020, 978-0367343132. DOI:
10.1201/9780429342967
(https://www.taylorfrancis.com/books/edit/10.1201/9780429342967/handbook-dairy-foods-
analysis-fidel-toldr%C3%A1-leo-nollet)
2020 - J. Kergomard, V. Vié, G. Paboeuf, Nathalie Barouh, Bruno Barea, et al., Oxidative and
interfacial behavior of oil bodies from walnut. Journées CHEVREUL 2020, Société Française pour
l'étude des Lipides (SFEL), Dec 2020, Paris, France. ⟨hal-03146890⟩
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DIFFUSION SCIENTIFIQUE
2019 - J. Kergomard, V. Vié, G. Paboeuf, N. Barouh, B. Barea, et al., Oxidative and interfacial
behavior of native oil bodies from walnut. Euro Fed Lipid Seville 2019, Oct 2019, Séville, Spain.
⟨hal-02315046v2⟩ - Annexe XIV
Prix (1)
2022 – European Travel grant winner – AOCS Annual meeting and expo – 750€
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FIGURES ET TABLES
FIGURES
La plupart des figures ont été créées ou adaptées à partir des logiciels BioRender et ChemDraw.
Introduction générale
Figure 1 - Structures et rôles biologiques des principaux lipides alimentaires.
Figure 2 - Voies de biosynthèse des principaux acides gras oméga-3 (3) et oméga-6 (6) chez
l’Homme.
Figure 3 - Stratégie globale.
Chapitre 1
Figure 4 – Structure simplifiée de la membrane plasmique des cellules végétales. La membrane
plasmique végétale est composée d’un assemblage de protéines et de lipides spécifiques et définit
l’interface entre les cellules et leur environnement. Trois principales classes de lipides sont
retrouvées dans cet assemblage : les phospholipides (28-50% wt.), les sphingolipides (23-52% wt.)
et les stérols (23-62% wt.), responsables de la structuration de la membrane.
Figure 5 – Structure moléculaire des principaux phospholipides composant la membrane
plasmique des cellules végétales. Les phospholipides principaux de la membrane plasmique sont
la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), le phosphatidylglycérol (PG), le
phosphatidylinositol (PI) et la phosphatidylsérine (PS). Ces phospholipides sont composés d’un
même squelette glycérol relié à deux chaînes d’acide gras et diffèrent par leur tête polaire, identifiée
en jaune sur le schéma.
Figure 6 – Sources et structures moléculaires des principaux stérols végétaux. Le campestérol le
plus représentatif dans l’amande, la noix, l’avocat, la pistache ou encore le colza. Le -sitostérol
est présent en quantité importante dans l’amande, la noix, le maïs, le blé, et le soja. Le stigmastérol
est quant à lui particulièrement présent dans le chocolat noir, la mayonnaise, les frites, la pistache,
l’amande et le soja.
Figure 7 – Structures simplifiées des chloroplastes et de la membrane de thylakoïde. Le
chloroplaste possède trois systèmes membranaires : la membrane externe, la membrane interne, et
les thylakoïdes (membrane photosynthétique). Les principaux lipides composant la membrane
interne et les thylakoïdes sont le monogalactosyldiacyglycérol (MGDG, 52% wt.), le
digalactosyldiacylglycérol (DGDG, 27% wt.), le sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG, 15% wt.)
et le phosphatidylglycérol (PG, 6% wt.). Ce quartet de lipides joue un rôle essentiel dans la
photosynthèse et les mécanismes de signalisation et de régulation des chloroplastes. Pour des
raisons de simplification, les composés phénoliques ne sont pas représentés.
Figure 8 – Formules moléculaires du monogalactosyldiacyglycérol (MGDG) et du
digalactosyldiacylglycérol (DGDG), principaux galactolipides des membranes végétales
photosynthétiques.
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FIGURES ET TABLES
Chapitre 2
Figure 17 - Principe de la cuve de Langmuir et organisation d’une monocouche de lipides à
l'interface air/eau.
Figure 18 - Principe de mesure de la pression de surface par la lame de Wilhelmy.
Figure 19 - Isotherme de compression des monocouches de lipides - Adapté de Bottier (2006).
Figure 20 - Méthode de prélèvement de Langmuir-Blodgett sur plaque de mica.
Figure 21 - Montage expérimental de l'ellipsomètre à annulation couplé à la mesure de pression
de surface.
Figure 22 - Principe de fonctionnement et éléments composant un microscope à force atomique.
Adapté de CC BY-NC 2.0 FR.
Figure 23 - Traitement des hauteurs d'une image AFM.
Figure 24 - Structure d'un liposome.
Chapitre 3
Figure 25 - Stratégie du chapitre 3.
Figure 26 - Répartition des classes de lipides chez Ch. sorokiniana reyto (en g/100 g de biomasse
sur milieu Bold's Basal Medium) à différentes concentrations de glucose.
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FIGURES ET TABLES
Figure 27 - Caractérisation chimique des classes de lipides et de la composition en acides gras des
lipides totaux extraits des Ch. A) vulgaris Purasana et, B) sorokiniana reyto.
Figure 28 - Evolution de la pression de surface du film de lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana
i) formé sous atmosphère inerte (N2, trait noir continu) et ii) contrôle (trait gris pointillé) à une
pression de surface initiale d’environ 20 mN/m.
Figure 29 – Images AFM (5×5 et 2,5×2,5 µm²) de la monocouche interfaciale de lipides totaux de
Ch. vulgaris Purasana obtenue à pH 7 après prélèvement de Langmuir-Blodgett effectué à =19,7
mN/m et =8,1°. Le profil de 3 sections et le tableau relatif aux hauteurs des domaines ont été
obtenus par analyse de l’image via le logiciel Gwyddion.
Figure 30 - Images AFM (5×5 et 2,5×2,5 µm²) de la monocouche interfaciale de lipides totaux de
chlorelle sorokiniana obtenue à pH 7 par prélèvement de Langmuir-Blodgett effectué à =21,0
mN/m et =8,4°. Le profil et le tableau relatif aux hauteurs des domaines ont été obtenus par
analyse de 3 sections de l’image via le logiciel Gwyddion.
Figure 31 - Isothermes de compression des lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana (trait noir
continu) et sorokiniana (trait gris foncé pointillé). Images AFM (5×5 µm²) obtenues à une pression
d’environ 20 mN/m des lipides totaux de chlorelles A) vulgaris Purasana et B) sorokiniana.
Figure 32 - Composition en AG des lipides totaux extraits des oléosomes isolés de noix et
d'amandes. La composition est donnée en % relatif des AG totaux.
Figure 33 - Images AFM (5×5 et 2,5×2,5 µm²) des films interfaciaux de lipides membranaires
d’oléosomes de A) Noix et, B) Amande, obtenues à une pression de surface p=19,9 ± 0,1 mN/m.
Les profils de hauteur ont été obtenues à partir des images à 2,5×2,5 µm² et sont les résultats de
l’analyse de trois sections de l’image.
Figure 34 - Isothermes de compression des monocouches de lipides membranaires d'OB de noix
(noir continu) et d'amandes (gris pointillé) et images AFM (10×10 µm²) des zones 1 et 2
correspondantes, des monocouches interfaciales des lipides membranaires d’OB de A) noix et B)
d’amandes.
Figure 35 – Evolution des produits secondaires d’oxydation (mmol MDA/kg d’huile) dans les
dispersions de liposomes de lipides totaux de Chlorella vulgaris Purasana sur une période de 19
jours (1 µm, 0,2% massique, 40°C, 110 rpm).
Figure 36 - Cinétique d’adsorption de la poudre de chlorelles diluée (C=22,5 mg/L) à l’interface
air/solution tampon (Tris, pH 7). La courbe rouge correspond à la pression de surface et la courbe
bleue à l’angle ellipsométrique. La pression superficielle et l’angle ellipsométrique obtenus après
5h de cinétique sont de 17,2 mN/m et 8,7°, respectivement.
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FIGURES ET TABLES
Figure 37 - Images AFM (5×5 et 2,5×2,5 µm²) du film interfacial obtenu après 5h de cinétique
d’adsorption des d’une solution de poudre de chlorelles à 22,5 mg/L à l’interface air/tampon (Tris,
pH 7). Sur l’image de 5×5 µm², les hauteurs sont obtenues à partir de 3 sections (rouge, bleu, vert).
Figure 38 – Mécanisme d’organisation proposé à l’interface air/eau des constituants de la poudre
de chlorelles Purasana diluée.
Articles de recherche
Kergomard et al., 2022, Colloids and surface B: biointerfaces
Figure 1 - Molecular structure and phase behavior of A) monogalactodiacylglycerol (MGDG) and
B) digalactosyldiacylglycerol (DGDG). L standing for lamellar phase and HII standing for
hexagonal inverted phase.
Figure 3 - 5×5 µm² and 1×1 µm² AFM topographic images of A) GL, B) GL50/DPPC50, and C)
GL45/DPPC45/pS10 model monolayers. The height profiles were performed on a cross-section of the
1×1 µm² image. The Langmuir films were transfer at a surface pressure of 20 ± 0.5 mN/m on a
mica plate using the Langmuir Blodgett method. Experiments were performed in a Tris HCl buffer
at pH 7 and done in duplicate.
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FIGURES ET TABLES
Figure 2 - a) PV and b) TBARS values during 20 days at 40°C and 110 rpm of (A) processed
isolated walnut OB (MP, HHP, HHPT); and (B) walnut complex matrixes with and without 3%
wt. of sodium caseinates. Data shown are average of three replicates.
Figure 3 - a) Evolution of surface pressure (red circles; PI, mN/m) and ellipsometric angle (blue
triangle; DELTA, °) during the 4.5 hours experiments of adsorption on air-water interface and b)
monolayer AFM images (10×10 µm²) and size profiles after 4.5 hours experiments of isolated
solution of (A) Fresh MP OB (PIf=20.3 mN/m; DELTAf=9.2°) and (B) Oxidized MP OB (PIf=14.7
mN/m; DELTAf=5.1°) diluted in UP water at 22.5 mg/L.
Figure 4 - a) Confocal Laser Scanning Microscopy (448×448 µm² and 184×184 µm²) and b)
Atomic force microscopy images (25×25 µm² and 5×5 µm²) of monolayer of MP OB isolated
solution diluted at 22.5 mg/L in UP water dyed with Rhodamine PE.
Figure 5 - AFM images (5×5 µm² and 1×1 µm²) of Langmuir-Blodgett films of 22.5 mg/L of a)
oleo-TAG; b) Oleo-WOIL; c) WOIL; and d) EggPC-WOIL after 4.5 hours of acquisition. Final
values of surface pressure (PI, mN/m) and ellipsometric angle (DELTA, °) were recorded at 4.5
hours of acquisition when the films were transferred on mica plate.
Figure 6 - Proposed mechanisms of OB organization at the air-water interface for (A) Fresh MP
OB; and (B) Oxidized MP OB.
Chapitre 4
Figure 39 - Stratégie du chapitre 4.
Figure 40 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rouge), et de l'angle ellipsométrique (,
°, bleu) sur une cinétique de 10h après injection de la rDGL (1,92 mg/L, 40 nM) en sous-phase
tampon acétate pH 5 (100 mM NaCl, 20 mM CaCl2, 10 mM acétate de sodium) sur une cinétique
de 10h.
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FIGURES ET TABLES
17
FIGURES ET TABLES
Évolution des oléosomes d'amande pendant la phase intestinale (1 image toutes les 5 minutes,
fluorescence 327-335 nm, image 106 × 67 µm, emplacement de l'image B).
Article de recherche
Kergomard et al., 2022, Colloids and surface B: biointerfaces – under review
Figure 1 - 3D structure of recombinant dog gastric lipase. Panel A: ribbon model showing the
secondary structure elements of rDGL with the lid in the open conformation and putative
orientation at lipid-water interface based on the localization of the interfacial recognition site. Panel
B: Top view and molecular surface representation (white=hydrophobic; yellow=polar) of rDGL
showing the hydrophobic ring surrounding the active site entrance. Views were prepared using
PyMol software (Schrodinger, L. (2010) The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3r1.)
and the crystal structure of rDGL (PDB: 1K8Q).
Figure 2 - (A) Kinetic evolution of the surface pressure (circle, red) and ellipsometric angle
(triangle, blue) upon rDGL adsorption at the air/water interface onto GL lipid film and, (B) Kinetic
evolution of the surface pressure (circle, red) and ellipsometric angle (triangle, blue) upon rDGL
adsorption onto GL50/DPPC50 monolayers performed at an initial surface pressure of 20 mN/m.
The rDGL was injected in the subphase after 5 minutes stabilization of the monolayers at the
air/water interface.
Figure 3 - AFM images (5×5 µm² and 2.5×2.5 µm²) at an initial surface pressure of 20 mN/m
before (-rDGL, red) and after (+rDGL, green) rDGL injection (40 nM final concentration, 5h
kinetics) of A) GL/DPPC monolayer (50:50 mol/mol) and B) GL/DPPC/pS monolayer (45:45:10
mol/mol/mol). Cross-sections of height profiles are representative for 2.5×2.5 µm² image after
rDGL injection. (LE – Liquid Expended, fluid phase; LC – Liquid Condensed, gel phase). The
vertical color scale from dark brown to white corresponds to an overall height of 15 nm.
Figure 4 - AFM images (5×5 µm² and 2.5×2.5 µm²) at an initial surface pressure of 20 mN/m
before (-rDGL, red) and after (+rDGL, green) rDGL injection (40 nM final concentration, 5h
kinetics) of A) GL/DPPC monolayer (50:50 mol/mol) and B) GL/DPPC/pS monolayer (45:45:10
mol/mol/mol). Cross-sections of height profiles are representative for 2.5×2.5 µm² image after
rDGL injection. (LE – Liquid Expended, fluid phase; LC – Liquid Condensed, gel phase). The
vertical color scale from dark brown to white corresponds to an overall height of 15 nm.
Figure 5 - Proposed model of rDGL distribution in homogenous galactolipid monolayer under
gastric conditions.
Chapitre 5
Figure 48 - Stratégie du chapitre 5.
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FIGURES ET TABLES
Figure 49 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique
(, °, triangle bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-
phase de la monocouche modèle GL/DPPC/pS à 20 mN/m, pH 7.
Figure 50 - Image AFM (2,5×2,5 µm²) et histogramme de hauteurs du film interfacial obtenus à
2h de cinétique (=20,3 mN/m, =6,9°) après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-
phase de la monocouche modèle GL/DPPC/pS à 20 mN/m.
Figure 51 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique
(, °, triangle bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la PLA2-NMM-CM III (0,128 mg/L)
en sous-phase de la monocouche modèle GL/DPPC/pS à 20 mN/m, pH 7.
Figure 52 - Images AFM (2,5×2,5 et 1×1tabe µm²) et hauteurs des domaines du film interfacial
obtenu après 2h de cinétique (=20,3 mN/m, =6,9°) après injection de la PLA2-NMM-CM III
(0,128 mg/L) en sous-phase de la monocouche modèle GL/DPPC/pS à 20 mN/m.
Figure 53 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique
(, °, triangle bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-
phase de la monocouche modèle GL/DPPC/pS à 10 mN/m, pH 7.
Figure 54 - Images AFM (2,5×2,5 et 1×1 µm²) et hauteurs des domaines du film interfacial obtenu
à 2h de cinétique (=20,3 mN/m, =6,9°) après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-
phase de la monocouche modèle GL/DPPC/pS à 10 mN/m.
Figure 55 – A) Dépôts CCM (révélation primuline, visualisation à 365 nm) des substrats et des
produits de digestion à T0 et après 5 minutes de digestion par la sPLA2-IB (3,3 mg/L),
respectivement, des liposomes micrométriques GL/DPPC/pS.
Figure 56 – Images AFM (5×5 µm²) de l’interface des films des substrats et produits de lipolyse
obtenus à A) T0 et B) T60 minutes à une pression d’environ 10 mN/m.
Figure 2 - A) Kinetic evolution of surface pressure (, mN/m, red circles) and ellipsometric angle
(, °, blue triangle) upon the adsorption and kinetic activity of gPLRP2 (0.128 mg/L) onto GL
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FIGURES ET TABLES
Figure 3 - Kinetic evolution of the surface pressure (, mN/m, red circle) and the ellipsometric
angle (, °, blue triangle) over one hour after the injection of the inactive variant of gPLRP2 in the
subphase of the GL monolayer. B) 5×5 µm² images of the Langmuir-Blodgett sample obtained
after 1 hour kinetic.
Figure 4 - A) Kinetic evolution of surface pressure (, mN/m, red circles) and ellipsometric angle
(, °, blue triangle) upon the adsorption and kinetic activity of gPLRP2 (0.128 mg/L) onto
GL/DPPC/pS monolayer. B) AFM images of Langmuir-Blodgett samples after 1) 45 minutes and
2) 1h45 kinetic of gPLRP2 adsorption onto GL/DPPC/pS monolayer, respectively.
Figure 5 - Evolution of the surface pressure (, red, mN/m) and the ellipsometric angle (, blue,
°) upon the adsorption of gPLRP2 onto A) MGDG/DGDG/SQDG/PG (1h kinetic), and B) total
lipids extracted from Chlorella vulgaris Purasana monolayers (2h kinetic). AFM images (5×5 µm²)
of the interface of C) MGDG/DGDG/SQDG/PG (1h kinetic, =8.5 mN/m, =5.2°), and D) total
lipids extracted from Chlorella vulgaris Purasana (2h kinetic, =9.4 mN/m, =6.9°) monolayers
after the injection of gPLRP2 in the sub-phase.
Figure 6 - AFM images (5×5 µm²) of substrates and lipolysis products obtained at T5min and
deposited at 7.2 ± 0.1 mN/m at the air/water interface of A) GL, B) GL/DPPC/pS monolayers. For
each identified domain, the mean height level was given in the table and was obtained as an average
over three sections of the image. Lipophilic substrates and products were extracted using Folch
method.
Chapitre 6
Figure 58 - Isothermes de compression des monocouches des lipides totaux de Ch. vulgaris
Purasana (trait rouge continu) et sorokiniana (trait rouge pointillé) et des lipides membranaires de
noix (trait noir continu) et d’amandes (trait noir pointillé).Figure 58 - Isothermes de compression
des monocouches des lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana (trait rouge continu) et sorokiniana
(trait rouge pointillé) et des lipides membranaires de noix (trait noir continu) et d’amandes (trait
noir pointillé).
Figure 59 – Représentation du potentiel électrostatique de surface de la structure 3D ruban ouverte
de la rDGL, calculé à pH 5. Les potentiels électrostatiques de surface sont représentés avec un code
couleur sur une surface de van der Waals en utilisant le système graphique moléculaire PyMOL
(version 1.3, Schrödinger, LLC). Les couleurs rouge et bleue représentent les charges nettes
négatives et positives, tandis que la couleur blanche représente les positions globalement neutres,
respectivement. A partir de Bourlieu et al. (2016).
20
FIGURES ET TABLES
Chapitre 7
Figure 60 - Images obtenues par AFM-cellule liquide (3×3 µm²) de la dégradation cinétique par la
gPLRP2 d'une bicouche lipidique obtenue par fusion de liposomes modèles GL/DPPC/pS.
Annexes
Annexe I – Distribution en AG des MGDG et DGDG achetés chez Avanti Polar Lipids.
Annexe II – Procédure d’isolation et de purification des OB, adapté de Kapchie et al. (2011).
Annexe III – Composition de la poudre de chlorelles entières Ch. vulgaris (Purasana, France).
Annexe IV – Images CLSM (88×88 µm²) de la poudre de chlorelles entières (Purasana, France)
en présence de sondes Lipidtox et Rho-PE. De gauche à droite : transmission (nuance de gris),
excitation et collecte aux trois longueurs d’onde 561 (rouge, amphiphiles marqués à la
RhodaminePE), 633 (bleu, chlorophylle) et 488 nm (vert, lipides apolaires marqués au Lipitox).
Annexe VIII - A) Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle
ellipsométrique (, °, triangle bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la PTL-coPTL (1-
0,2 mg/L), et B) images AFM (20×20 et 2,5×2,5 µm²) de l’interface obtenue 2h après l’injection
de l’enzyme et de son cofacteur en sous-phase de la monocouche modèles de lipides GL/DPPC/pS.
21
FIGURES ET TABLES
Annexe X - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique
(, °, triangle bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la PTL-coPTL (1-0,2 mg/L) en sous-
phase d’une monocouche de lipides membranaires d’OB de A) noix, et B) amande à 20 mN/m.
Images AFM (5×5 µm²) de l’interface obtenues à 2h après injection de la PTL-coPTL (1-0,2 mg/L)
en sous-phase des monocouches de lipides membranaires d’OB de C) noix (=28,3 mN/m,
=10,1°), D) amande (=34,6 mN/m, =9,4°).
Annexe XI - J. Kergomard, F. Carrière, G. Lambeau, G. Paboeuf, N. Barouh, P. Villeneuve, C.
Bourlieu and V. Vié, What are the mechanisms of gastrointestinal lipases adsorption onto
heterogenous biomimetic vegetal membranes? 7th International Conference on Food Digestion
ICFD 2022, May 2022, Cork, Ireland. pp.95. https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-03669301
Annexe XIV - J. Kergomard, V. Vié, G. Paboeuf, N. Barouh, B. Barea, et al., Oxidative and
interfacial behavior of native oil bodies from walnut. Euro Fed Lipid Seville 2019, Oct 2019,
Séville, Spain. https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-02315046v2
TABLEAUX
Introduction générale
Tableau 1 – Références nutritionnelles en acides gras (AG) pour l’Homme adulte consommant
2000 kcal/jour selon l’ANSES (2011). Les valeurs sont exprimées, excepté pour l’EPA et le DHA,
en pourcentage de l’apport énergétique sans alcool, que l’on appellera « apport énergétique »
(AE), par souci de simplification. Dans le cas du DHA et de l’EPA, les valeurs sont exprimées en
milligrammes dans la mesure où les études disponibles ont utilisé cette unité.
Tableau 2- Composition en acides gras des lipides de différentes matrices animales et végétales
riches en 3 sous différentes formes (TAG versus phospholipides versus galactolipides).
22
FIGURES ET TABLES
Chapitre 1
Tableau 3 – Formes moléculaires et phases polymorphiques du quartet lipidique responsable du
comportement général et de l’architecture des thylakoïdes. Le MGDG présente une forme conique
et adopte une organisation hexagonale inverse (HII) en solution aqueuse. Les DGDG, SQDG, et
PG ont une forme cylindrique et s’organisent en phases lamellaires (L) quel que soit le taux
d’hydratation.
Tableau 4 - Composition en AG principaux des MGDG et DGDG issus de différentes sources
photosynthétiques. La spiruline (ici Arthrospira platensis) est la cyanobactérie la plus connue
(algues bleues-vertes) dans les applications d’ingrédients fonctionnels. Elle est particulièrement
enrichie en C16:0 et en C18:3 3. La Subterraneus provient de la biomasse microalgale et peut
être utilisée pour la consommation humaine. Elle a la particularité d’être enrichie en EPA. Chez
l’Arabidopsis, le MGDG est riche en ALA et en acide hexadécatriénoïque (HTA, C16:3 3) tandis
que le DGDG est principalement enrichi en ALA. Les feuilles d’épinard présentent quant à elles
un profil particulièrement riche en ALA chez le MGDG et le DGDG. (Lyu et al., 2021).
Tableau 5 - Taille (µm) et composition (pourcentage massique) d'OB isolés de différentes graines.
Tableau 6 - Composition en phospholipides (pourcentage massique) d'OB isolés de différentes
graines.
Tableau 7 - Principales données et hypothèses déterminant la stabilité oxydative des lipides
polaires et des assemblages végétaux : chloroplastes, oléosomes et lécithines.
Chapitre 3
Tableau 9 - Composition en phospholipides d'huile de noix et d'amande. A partir de Zlatanov et
al. 1999.
Tableau 10 - Valeurs de pressions de surface (, mN/m) et de la surface spécifique (S, cm²/µg)
auxquelles a été observé une transition de phase lors de la compression des monocouches de lipides
membranaires d'OB de noix et d'amandes.
Article de recherche
Kergomard et al., 2022, Colloids and surface B: biointerfaces
23
FIGURES ET TABLES
Table 2 - Values of (mN/m), (°) and limiting molecular area (Ų/molecule) at the collapse of
mixed GL, DPPC and pS monolayers.
Chapitre 4
Article de recherche
Kergomard et al., 2022, Colloids and surface B: biointerfaces – under review
Table 1 - Model system compositions.
Table 2 - Summary of height levels identified in AFM images and related to rDGL interactions
with model membranes. Height values are given in nm. The percentages given are the percentage
of pixels covered by the indicated height range (-). Values obtained were based on the analysis of
five plot profiles taken randomly in the AFM image.
Chapitre 5
Article de recherche
Kergomard et al., 2022, Biochimie – en préparation
Table 1 – Quantitative determination of lipid classes composition obtained by TLC at T0 and after
5 minutes (T5min) digestion by gPLRP2 of 1 µm GL, GL/DPPC/pS, MGDG/DGDG/SQDG/PG
liposomes. The reaction was performed at pH 7 in Tris HCl buffer containing 4 mM of NaTDC.
Data are given in relative percentages of the total lipids.
Chapitre 6
Tableau 11 – Valeurs de (°) des monocouches de lipides extraits des systèmes naturels à une
pression de surface d’environ 20 mN/m.
Tableau 12 – Valeurs de coefficient de compressibilité (C-1, mN/m) obtenues à 10, 15, et 20 mN/m
pour chacune des monocouches modèles étudiées (GL, GL/DPPC, GL/DPPC/pS). La
détermination du C-1 à partir des isothermes de compression est explicitée dans Kergomard et al.
(2022).
Tableau 13 - Activités des principales enzymes digestives humaines et leurs proches analogues.
24
ABRÉVIATIONS
Table de matières
INTRODUCTION GÉNÉRALE .................................................................................................... 28
26
TABLE DES MATIERES
I – Dégradation enzymatique des substrats lipidiques modèles et extraits des matrices naturelles
par la gPLRP2 .......................................................................................................................... 243
II – Dégradation enzymatique des substrats lipidiques modèles et naturels par la sPLA2-IB . 272
CHAPITRE 6 – Discussion générale ........................................................................................... 287
27
INTRODUCTION GENERALE
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Hippocrate l’affirmait déjà à l’Antiquité : « Si nous pouvions donner à chaque individu la
bonne quantité de nourriture et d'exercice, pas trop peu et pas trop, nous aurions le plus sûr moyen
pour la santé ». Cette citation est aujourd’hui plus que jamais d’actualité, dans un contexte mondial
où les maladies chroniques liées à une alimentation déséquilibrée connaissent une recrudescence
alarmante.
L’importance des lipides dans la nutrition humaine a été reconnue pour la première fois en
1827 par le chimiste et physicien anglais William Prout, qui a proposé une classification des
nutriments selon trois catégories : protéines, glucides, et lipides (Wisniak, 2015). Au même titre
que les protéines et les glucides, les lipides sont des nutriments essentiels pour la santé humaine,
mais également, de façon plus globale, pour la croissance des organismes vivants. En effet, ces
molécules jouent de nombreux rôles clés dans la régulation homéostatique du métabolisme chez
les animaux et les végétaux, et en particulier à travers leurs trois fonctions principales : (i) les
lipides peuvent être utilisés pour le stockage d’énergie sous leur forme neutre (triacylglycérols,
TAG), (ii) les lipides polaires (phospholipides, galactolipides, sphingolipides…) jouent également
un rôle crucial dans la structuration des membranes, (iii) de nombreux lipides sont des molécules
comme par exemples les eicosanoïdes ou encore les résolvines. La structure et le rôle biologique
28
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Chez l’Homme, la digestion des lipides provenant de son régime alimentaire conduit à la
libération de deux acides gras polyinsaturés (AGPI) essentiels, car non-synthétisés par l’organisme
humain du fait de l’absence de la Δ12-désaturase : l’acide linoléique (LA, C18:2, 6) et l’acide
alpha-linolénique (ALA, C18:3, 3). Ces deux acides gras essentiels peuvent être apportés par
l’alimentation sous différentes formes lipidiques (e.g. TAG ou phospholipides), et sont à la base
de deux voies d’élongations et désaturations, qui conduisent à des AGPI bioactifs à plus longues
chaînes (AGPI-LC) (Figure 2). On peut notamment citer l’acide arachidonique (ARA, C20:4, 6),
l’acide eicosapentaénoïque (EPA, C20:5, 3) et l’acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6, 3). Il
convient néanmoins de noter que la voie de synthèse de l’EPA et du DHA (voie des oméga-3)
possède une faible efficacité de conversion, et c’est pour cette raison qu’il est aujourd’hui
recommandé de consommer des produits riches en ces deux AGPI-LC plutôt que de compter
29
INTRODUCTION GENERALE
uniquement sur leur bioconversion à partir de l’ALA. L’EPA et le DHA jouent en effet un rôle
lipides de signalisation que sont les eicosanoïdes et les médiateurs lipidiques tels que les résolvines,
les protectines ou encore les marésines, impliqués dans les processus de résolution de
l’inflammation dans notre organisme (Saini & Keum, 2018). Le DHA joue également un rôle clé
dans le maintien de la fluidité des membranes de la rétine et du cerveau, ce qui est essentiel pour
le bon déroulement des fonctions neurologiques et cognitives (Stillwell & Wassall, 2003).
Figure 2 - Voies de biosynthèse des principaux acides gras oméga-3 (3) et oméga-6 (6) chez l’Homme.
Les AGPI 6 et 3 sont impliqués dans des mécanismes métaboliques opposés dans le
corps humain et sont en compétition pour la synthèse des médiateurs lipidiques à travers leurs
enzymes biosynthétiques respectives. Néanmoins, ces trois dernières décennies, le ratio 6/3 a
30
INTRODUCTION GÉNÉRALE
considérablement augmenté dans les régimes occidentaux, passant de 1:1 à plus de 20:1 pour les
régimes les plus extrêmes, et ce, en raison de l’augmentation significative des apports en 6 et de
la diminution concomitante des apports en 3 (El Hadi et al., 2019). Dans un même temps, une
augmentation des cas de surpoids et d’obésité a été observée dans les pays occidentaux. Bien que
cette augmentation soit multifactorielle, elle est très probablement liée à des déséquilibres
métaboliques, ainsi qu’aux changements dans la composition des acides gras, provenant par
exemple des régimes alimentaires excédentaires en viandes de mauvaises qualités, et donc sources
d’acides gras saturés et d’6 en excès, ainsi qu’à des diètes riches en « calories vides ».
Tableau 1 – Références nutritionnelles en acides gras (AG) pour l’Homme adulte consommant 2000 kcal/jour selon
l’ANSES (2011). Les valeurs sont exprimées, excepté pour l’EPA et le DHA, en pourcentage de l’apport
énergétique sans alcool, que l’on appellera « apport énergétique » (AE), par souci de simplification. Dans le cas du
DHA et de l’EPA, les valeurs sont exprimées en milligrammes dans la mesure où les études disponibles ont utilisé
cette unité.
l’Alimentation (ANSES) pour l’Homme adulte sont résumées Tableau 1. L’ANSES recommande
aujourd’hui une consommation en lipides représentant 35 à 40% de l’apport énergétique total, afin
31
INTRODUCTION GENERALE
d’assurer la couverture des besoins en acides gras essentiels et de prévenir l’apparition de troubles
métaboliques liés à une alimentation déséquilibrée. En France, cette fourchette est dépassée par
environ 43% des adultes et 34% des enfants, soulignant le manque de diversité dans les régimes
alimentaires et le déséquilibre des apports (INCA III). C’est pourquoi il est aujourd’hui nécessaire
de mettre en place des stratégies nutritionnelles permettant de diminuer le ratio 6/3 dans notre
l’EPA et le DHA, tout en limitant nos apports en lipides totaux (Enos et al., 2014). Une
chaque type d’acide gras sont notamment recommandés par l’ANSES (Saisine n° 2006-SA-0359,
ANC AG, ANSES, 2011). Une telle stratégie peut être atteinte en favorisant le poisson vis-à-vis de
la viande, mais également en augmentant les apports en huiles végétales riches en 3. Plus
récemment, il a également été proposé d’utiliser des sources alternatives d’AGPI essentiels, en
enrichissant par exemple notre régime alimentaire avec des lipides provenant de sources végétales
photosynthétiques (Lane et al., 2014). Pour illustrer ces propos, le Tableau 2 regroupe des sources
animales et végétales riches en 3 présents sous différentes formes moléculaires (TAG versus
phospholipides versus galactolipides), qui peuvent influer sur la biodisponibilité des AG chez
l’Homme.
En effet, outre des variations dans la teneur en ALA, la forme moléculaire (par exemple
TAG versus phospholipides) influence l’assimilation d’AGPI 3 spécifiques. Ainsi, pour les
AGPI-LC 3, il a été montré une biodisponibilité plus forte sous la forme de phospholipides que
sous la forme de TAG. Cette plus grande biodisponibilité n’a pas été démontrée en revanche pour
les chaînes plus courtes comme l’ALA (Robert et al., 2020). En plus des phospholipides, les
32
INTRODUCTION GÉNÉRALE
al., 2020). L’abondance des plantes et des algues sur Terre explique que ces galactolipides
principale d’acides gras (80% versus 20% massique pour les phospholipides et TAG végétaux),
Tableau 2- Composition en acides gras des lipides de différentes matrices animales et végétales riches en 3 sous
différentes formes (TAG versus phospholipides versus galactolipides).
a b b
Acides gras Huile de lin Huile de saumon Epinards
(% massique) (TAG) (Phospholipides) (Galactolipides)
a
Yang et al. (2021)
b
Yamaguchi et al. (2012)
Au-delà de leur forme moléculaire, les 3 sont présents sous la forme de molécules amphiphiles
par l’établissement de liaisons faibles (van der Waals, électrostatiques). Ces membranes sont
stérols, qui contribuent entre autres aux propriétés physiques de l’ensemble. En particulier, la
richesse en AGPI organisés en phases fluides, mais également la présence de zones comprenant
des molécules rigidifiantes ou fluidifiantes, comme les phytostérols ou encore les sphingolipides,
33
INTRODUCTION GENERALE
induisent des coexistences de phase et ainsi une hétérogénéité, pouvant influer sur leur digestibilité.
également un rôle sur la digestibilité et la lipémie postprandiale (concentration des lipides dans le
Les membranes biologiques stabilisent et préservent l’intégrité des assemblages de plus grande
taille, de l’ordre du micron. On peut par exemple citer les oléosomes, des réserves de lipides neutres
délimitées par une monocouche lipoprotéique, ou encore les thylakoïdes, des bicouches empilées
formant les membranes photosynthétiques des chloroplastes. Si plusieurs travaux ont porté sur la
digestibilité des oléosomes, peu concernent celle des sources photosynthétiques, et en particulier
des chloroplastes. Ce questionnement est à la base de mon travail de thèse, d’autant que la demande
du consommateur pour des aliments issus du végétal et moins intensivement transformés et purifiés
a multiplié les matrices dans lesquelles on retrouve ces assemblages. Outre les végétaux à feuilles,
c’est le cas par exemple des boissons végétales riches en AGPI, dont la consommation a peu à peu
augmenté ces dernières années (Sethi et al., 2016). Cette tendance est boostée par les
recommandations nutritionnelles et par une prise de conscience générale des effets bénéfiques sur
par les industriels de produits à base de protéines et de lipides végétaux. Si des boissons à base de
diverses noix ou céréales sont proposées sur le marché, il y a encore peu de diversité concernant
les sources végétales photosynthétiques, et les parties feuillues, en dehors de certains usages
traditionnels dans des sauces (oseilles, sauge, etc.), demeurent encore sous-exploitées dans le
Les lipides végétaux, du fait de leurs caractéristiques (richesse en ALA, diversité de formes
34
INTRODUCTION GÉNÉRALE
digestibilité de ces lipides végétaux spécifiques reste assez méconnue, en particulier en ce qui
concerne les galactolipides, et ce malgré une consommation chez l’Homme qui peut atteindre
jusqu’à 200 mg par jour (De Caro et al., 2008). Ainsi, une meilleure connaissance de leur
Les membranes végétales représentent des ensembles de lipides complexes avec des
compositions variées. En particulier, les membranes végétales sont riches en AGPI organisés en
phases fluides, mais la présence de molécules rigidifiantes, comme les phytostérols ou encore les
sphingolipides, induit des zones plus denses. Ainsi, ces systèmes présentent des coexistences de
phases et donc une hétérogénéité latérale influant sur leur digestibilité. A ma connaissance, les
études scientifiques portant sur le comportement d’adsorption et l’activité enzymatique des lipases
digestives humaines se sont principalement intéressées à des systèmes modèles homogènes, et/ou
riches en acides gras saturés, et/ou présentant une composition se rapprochant des assemblages
membranaires animaux. Or, afin d’exploiter de façon optimale les sources lipidiques végétales, il
est nécessaire de comprendre leur devenir dans le tractus gastro-intestinal humain. Même si des
études ont montré la digestibilité des galactolipides et des phospholipides par certaines enzymes,
les mécanismes restent encore mal connus, notamment au niveau moléculaire. Dans ce contexte,
35
INTRODUCTION GÉNÉRALE
La stratégie globale mise en place pour répondre à cette problématique est présentée Figure 3.
J’ai choisi de m’intéresser au comportement des deux assemblages lipidiques les plus fréquemment
trouvés dans le règne végétal : les oléosomes, principalement rencontrés chez les oléagineux, et les
chloroplastes, trouvés chez les végétaux photosynthétiques. Plus particulièrement, j’ai choisi
d’étudier deux sources végétales riches en acide -linolénique essentiel pour notre organisme
(AGPI, 3) que sont : i) les noix, riches en oléosomes (versus amandes, riches en 6), et ii) les
microalgues Chlorelles, riches en chloroplastes. Ces deux sources contiennent différents types de
réel intérêt nutritionnel. En particulier, la microalgue constitue une source encore peu exploitée
littérature soulignent en effet le potentiel nutritif des lipides de microalgues, alors que peu d’études
Dans ce contexte, j’ai choisi dans un premier temps de caractériser ces deux assemblages
du végétal sous leur forme d’assemblage micronique natif, en étudiant le comportement interfacial
ainsi que la stabilité à l’oxydation des oléosomes de noix et des chloroplastes de chlorelle.
L’oxydation des lipides est en effet responsable de la modulation de l’état physique, et donc du
comportement interfacial des assemblages, impactant ainsi les capacités d’adsorption des enzymes
intéressée au comportement individuel des lipides polaires membranaires extraits de ces matrices
dans des systèmes reconstitués, afin de comprendre l’impact de leur structure et de leur
composition sur leur organisation. Pour compléter ces résultats et mieux comprendre l’organisation
des constituants lipidiques dans les assemblages natifs, j’ai également fait le choix d’étudier trois
systèmes modèles : i) l’un composé uniquement d’un mélange des deux principaux galactolipides
36
INTRODUCTION GÉNÉRALE
trouvés dans le règne végétal ; ii) le second composé d’un mélange de galactolipides dans lequel
supérieures à celles trouvées dans les membranes naturelles (50 mol% versus <10 mol%) dans le
but d’induire une hétérogénéité de phase prononcée, et enfin iii) un dernier modèle dit
mol%.
proches analogues sur les différents systèmes lipidiques naturels et modèles précédemment décrits.
Chez l’Homme, la digestion des lipides se produit principalement dans le tractus gastro-intestinal
et débute dans le compartiment gastrique avec l’hydrolyse des TAG. Bien qu’il n’y ait pas
d’hydrolyse des lipides polaires dans cette première phase de la digestion, celle-ci représente une
étape clé, puisque la stabilité des émulsions de lipides résultant de la digestion gastrique influence
donc choisi de comparer les mécanismes d’action de la lipase gastrique (HGL), une enzyme
particulièrement tensioactive, mais n’ayant pas d’activité sur les lipides polaires, avec ceux de trois
responsable de la dégradation efficace des triacylglycérols chez l’Homme, et enfin iii) la lipase
pancréatique dites PLRP2 (pancreatic lipase related-protein 2). Une attention particulière a été
donnée à la compréhension du mode d’action de cette dernière, en effet la PLRP2 est responsable
d’acides gras 3 essentiels (Wattanakul et al., 2019). Mes travaux de recherche se sont concentrés
sur une caractérisation à deux échelles de la dégradation de ces assemblages naturels ou modèles,
37
INTRODUCTION GÉNÉRALE
comprenant des microdomaines de types « rafts » potentiellement fonctionnels, par les enzymes
J’ai d’abord réalisé l’étude interfaciale de ces systèmes sous la forme de films lipidiques. Les
monocouches de lipides constituent en effet un modèle pertinent pour reproduire l’interface des
système digestif. Afin d’accéder à une compréhension moléculaire des interactions entre les lipides
végétaux et les enzymes digestives, j’ai travaillé à des concentrations enzymatiques bien inférieures
à celles des conditions physiologiques. J’ai cherché en particulier à comprendre l’impact des
paramètres physico-chimiques (pression latérale, nature des lipides, pH, composition des
monocouches lipidiques…) sur les mécanismes de digestion de ces lipides spécifiques en utilisant
atomique).
de colza à 4% massique et liposomes de 1 µm), formés par les mélanges lipidiques précédemment
décrits, dans des conditions dynamiques ou statiques se rapprochant des conditions physiologiques
qui, couplées à de la microscopie optique et de fluorescence, ont permis de visualiser les substrats
dégradation enzymatique au cours du temps (Marze et al., 2014). Ces systèmes miniaturisés ont
(concentration en enzymes, présence de sels biliaires, pH) tout en limitant les quantités d’enzymes
et de substrats utilisés. Nous avons également mis en place la digestion des systèmes dispersés en
« bulk » statique dans des quantités plus importantes (centaines de µL) afin de caractériser et de
38
INTRODUCTION GÉNÉRALE
quantifier les produits de digestion générés. Ces études en conditions proches des conditions
physiologiques ont ensuite été corrélées avec les données en monocouche, afin de vérifier la
Dans ce contexte, ce manuscrit a été organisé autour de sept chapitres. Le premier chapitre
de synthèse bibliographique est dédié à la description des principaux assemblages issus du végétal
(membranaires et microniques), leur stabilité physicochimique, et leur digestibilité par les enzymes
gastro-intestinales humaines. Le second chapitre présente les grands principes des techniques
expérimentales utilisées dans cette étude, afin d’accéder à une compréhension mécanistique à
différentes échelles de la dégradation de ces assemblages par les principales enzymes digestives
humaines. Le troisième chapitre décrit les résultats de la caractérisation initiale des deux systèmes
choisis à différents niveaux structuraux : systèmes lipidiques modèles, systèmes lipidiques naturels
reconstitués, et assemblages. Le quatrième chapitre présente les résultats obtenus sur l’action
mécanistique de la lipase gastrique sur les différents systèmes étudiés, tant sur ces capacités
d’adsorption à l’interface, que sur la désorganisation induite par son activité dans des conditions
de bulk. Le cinquième chapitre est dédié aux résultats obtenus avec les trois enzymes intestinales
majeures à différentes échelles. Un sixième chapitre est organisé autour d’une discussion générale,
regroupant les résultats majeurs de l’étude. Finalement, un septième chapitre vient conclure ce
manuscrit, et apporte des perspectives à envisager pour compléter ce travail sur la compréhension
39
INTRODUCTION GÉNÉRALE
40
CHAPITRE 1
CHAPITRE 1
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
41
CHAPITRE 1
42
CHAPITRE 1
Ce chapitre est consacré à la description des principaux assemblages membranaires trouvés chez
les végétaux, ainsi qu’à leur digestibilité par l’Homme. Cette introduction au comportement des
lipides végétaux s’appuie largement sur la revue « Digestibility and oxidative stability of plant lipid
Critical Reviews in Food Science and Nutrition en 2021. Afin de faciliter la lecture et la
membranes végétales, ainsi qu’à leur réactivité chimique, et à leur dégradation par les enzymes
plasmique, les chloroplastes, et les oléosomes. Une deuxième partie sera ensuite consacrée au
des lipides polaires végétaux et des assemblages membranaires naturels précédemment décrits. Les
trois chapitres suivants seront dédiés au comportement gastrointestinal des molécules, fragments
chez l’Homme. Plus particulièrement, nous nous intéresserons à la digestibilité des lipides polaires
et des assemblages naturels végétaux par les enzymes du tractus gastro-intestinal humain, ainsi
qu’à l’impact de l’ajout de molécules lipidiques tensioactives isolées sur la digestion des émulsions
de TAG.
43
CHAPITRE 1
Figure 4 – Structure simplifiée de la membrane plasmique des cellules végétales. La membrane plasmique végétale
est composée d’un assemblage de protéines et de lipides spécifiques et définit l’interface entre les cellules et leur
environnement. Trois principales classes de lipides sont retrouvées dans cet assemblage : les phospholipides (28-50%
wt.), les sphingolipides (23-52% wt.) et les stérols (23-62% wt.), responsables de la structuration de la membrane.
La membrane plasmique est l’une des membranes végétales les plus variées en termes de
composition, bien qu’elle ne représente qu’une faible proportion des membranes cellulaires chez
les organismes végétaux. Sa structure simplifiée est proposée Figure 4. Elle contient des lipides et
des protéines dans des proportions qui diffèrent en fonction du type de cellule et de l’espèce
végétale considérée (Sandstrom & Cleland, 1989; Uemura et al., 1995; Uemura & Steponkus,
1994). La membrane plasmique définit l’interface entre les cellules et leur environnement. Bien
que de nombreuses fonctions cellulaires soient assurées par les protéines, les lipides jouent
également un rôle crucial dans la structuration des membranes et la transduction des signaux
cellulaires. Trois principales classes de lipides sont retrouvées dans la membrane plasmique des
cellules végétales : les phospholipides (28-50% wt.), les sphingolipides (23-52% wt.), et les stérols
44
CHAPITRE 1
(23-62% wt.). La proportion et la longueur des chaînes acyles de ces lipides influencent l’état
physique et les propriétés des bicouches lipidiques membranaires (Furt et al., 2011).
Figure 5 – Structure moléculaire des principaux phospholipides composant la membrane plasmique des cellules
végétales. Les phospholipides principaux de la membrane plasmique sont la phosphatidylcholine (PC), la
phosphatidyléthanolamine (PE), le phosphatidylglycérol (PG), le phosphatidylinositol (PI) et la phosphatidylsérine
(PS). Ces phospholipides sont composés d’un même squelette glycérol relié à deux chaînes d’acide gras et diffèrent
par leur tête polaire, identifiée en jaune sur le schéma.
Les phospholipides sont les constituants majeurs des membranes cellulaires, dont l’importance
biologique est directement reliée à leurs propriétés amphiphiles. Celles-ci leur permettent de former
des proportions moins importantes. Les structures moléculaires des principaux phospholipides
45
CHAPITRE 1
composant la membrane plasmique des cellules végétales sont présentées Figure 5. Ces
(C18:2, 6, 20-60% wt.), et de l’ALA (C18:3, 3, 7-26%) dont les quantités dépendent de la tête
La bicouche membranaire des cellules végétales ne présente pas une distribution homogène de
lipides et de protéines. Cette hétérogénéité chimique induit une hétérogénéité physique : les
membranes plasmiques végétales contiennent en effet une majorité de portions fluides, mais
composition, et les fonctions possibles de ces rafts végétaux ont été décrites dans la littérature, mais
leur existence est encore discutée, notamment du fait de leur taille nanométrique, qui les rend
difficilement observables (Mongrand et al., 2004, 2010; Peskan et al., 2000). Ces « plateformes »
sont décrites comme des petits domaines membranaires hétérogènes et dynamiques, de 10 à 100
nm, et insolubles dans les détergents. Elles sont associées avec une proportion élevée de protéines
membranaires (5-10% wt.) impliquées dans la signalétique des cellules, similairement aux rafts des
membranes cellulaires des mammifères, dont le rôle et l’existence sont aujourd’hui bien établis
(Pike, 2006). La formation de domaines membranaires organisés comme les rafts pourrait être
induite en partie par les propriétés d’auto-association entre deux types de molécules : les stérols et
les sphingolipides, qui induiraient une ségrégation latérale in vivo dans les membranes plasmiques
46
CHAPITRE 1
Figure 6 – Sources et structures moléculaires des principaux stérols végétaux. Le campestérol le plus représentatif
dans l’amande, la noix, l’avocat, la pistache ou encore le colza. Le -sitostérol est présent en quantité importante dans
l’amande, la noix, le maïs, le blé, et le soja. Le stigmastérol est quant à lui particulièrement présent dans le chocolat
noir, la mayonnaise, les frites, la pistache, l’amande et le soja.
végétales présentent une plus grande diversité de sphingolipides et de stérols. Ces derniers sont
des composés structurels essentiels aux membranes, puisqu’ils régulent l’ordre des chaînes acyles
des lipides, ainsi que les transitions de phase de la bicouche membranaires en fonction de leur
environnement extérieur (Piironen et al., 2000). Les principaux phytostérols des membranes
plasmiques végétales, dont les structures moléculaires sont présentées Figure 6, sont le
campestérol, le -sitostérol, et le stigmastérol, qui peuvent se trouver sous une forme libre ou
conjuguée (Grosjean et al., 2015; Kumar et al., 2017). Plusieurs études sur des systèmes
membranaires végétaux modèles ont montré que les stérols conjugués sont présents en quantités
importantes dans les rafts végétaux, et seraient des composés clés de leur formation (Borner et al.,
2005; Furt et al., 2007). En comparaison avec les rafts animaux, les rafts membranaires végétaux
ont été montrés comme plus résistants aux chocs thermiques, suggérant que la structure modifiée
des phytostérols par rapport au cholestérol pourrait expliquer l’adaptation des cellules végétales
sur de vastes gammes de températures (Beck et al., 2007). Les phytosphingolipides jouent
47
CHAPITRE 1
particulièrement enrichis dans les rafts membranaires. Les principaux sphingolipides végétaux sont
squelette céramide différent de celui de leurs homologues animaux, ainsi qu’une tête polaire
Figure 7 – Structures simplifiées des chloroplastes et de la membrane de thylakoïde. Le chloroplaste possède trois
systèmes membranaires : la membrane externe, la membrane interne, et les thylakoïdes (membrane photosynthétique).
Les principaux lipides composant la membrane interne et les thylakoïdes sont le monogalactosyldiacyglycérol
(MGDG, 52% wt.), le digalactosyldiacylglycérol (DGDG, 27% wt.), le sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG, 15%
wt.) et le phosphatidylglycérol (PG, 6% wt.). Ce quartet de lipides joue un rôle essentiel dans la photosynthèse et les
mécanismes de signalisation et de régulation des chloroplastes. Pour des raisons de simplification, les composés
phénoliques ne sont pas représentés.
48
CHAPITRE 1
Les chloroplastes sont des organelles aplaties en forme de disque qui mesurent entre 2 et 10 µm de
diamètre, et qui sont présentes dans le cytoplasme des cellules photosynthétiques chez les plantes,
les microalgues, mais également chez les cyanobactéries (Lyu et al., 2021). Les chloroplastes
membranaire, appelé « thylakoïde » (Pribil et al., 2014). Les structures simplifiées des
chloroplastes et des thylakoïdes sont présentées Figure 7. Contrairement à l’enveloppe externe des
chloroplastes, qui possède une composition typique des « cellules eucaryotes », l’enveloppe interne
des chloroplastes et la membrane de thylakoïde ont une composition lipidique similaire. Les
architecture fluide, constituée de plus d’une centaine de protéines globulaires (60-70% wt.)
dispersées dans une matrice lipidique. Cette matrice lipidique est autoorganisée sous la forme d’une
principaux pigments sont la chlorophylle, un élément clé de la photosynthèse, ainsi que les
membrane des chloroplastes contre l’oxydation (Hassan et al., 2017). Divers composés phénoliques
sont également présents dans les chloroplastes et les membranes végétales, et contribuent à la
défense des plantes contre le stress de l’environnement extérieur. La spécificité des thylakoïdes est
leur composition lipidique unique, qui est particulièrement bien préservée chez les plantes
49
CHAPITRE 1
Les thylakoïdes sont en effet composés de lipides spécifiques, les galactolipides, ce qui les
wt.) (Figure 8), sont les galactolipides majoritaires des membranes végétales photosynthétiques,
et correspondent à 80% wt. des lipides totaux (hors pigments) des thylakoïdes des plantes
supérieures et des algues (Gurevich et al., 1997). La fonction et la localisation des MGDG et DGDG
sont déterminées par leur structure moléculaire. Le MGDG présente une petite tête polaire 1--
galactose liée à un diacylglycérol, ce qui lui confère une forme plutôt conique. Le DGDG quant à
lui possède une tête polaire plus large, car il présente un résidu -galactose supplémentaire lié au
groupement -galactose, ce qui lui permet d’adopter une forme cylindrique en solution. En plus de
ces deux glycolipides, les thylakoïdes contiennent dans des quantités moindres du
50
CHAPITRE 1
Tableau 3 – Formes moléculaires et phases polymorphiques du quartet lipidique responsable du comportement général
et de l’architecture des thylakoïdes. Le MGDG présente une forme conique et adopte une organisation hexagonale
inverse (HII) en solution aqueuse. Les DGDG, SQDG, et PG ont une forme cylindrique et s’organisent en phases
lamellaires (L) quel que soit le taux d’hydratation.
Ce quartet de lipides est caractérisé par différents comportements de phase (Tableau 3),
effet, les DGDG, PG et SQDG forment des phases lamellaires (L) quel que soit le taux
relativement petite et de sa forme conique, tend quant à lui à former une structure hexagonale
inverse (HII) en solution aqueuse (Jouhet, 2013). Le ratio MGDG/DGDG, le taux d’hydratation et
51
CHAPITRE 1
les coexistences de phases L et HII. En particulier, la présence de DGDG a été identifiée comme
l’un des principaux facteurs dans l’empilement des membranes par l’établissement de liaisons
hydrogènes entre les têtes polaires des bicouches adjacentes, conduisant à un packing dense des
bicouches de galactolipides dans les membranes de thylakoïdes. De plus, la régularité entre les
couches induites par le DGDG et les forces électrostatiques répulsives induites par la présence des
lipides chargés PG et SQDG permettent une répulsion des molécules d’eau (Demé et al., 2014).
Les lipides (e.g. le SQDG anionique), mais également les protéines photosynthétiques présentes
(HTA, C16:3, 3), ou l’ ALA (C18:3, 3). Une différence de composition en acides gras (AG) des
effet, la distribution des AG C18 et C16 sur le squelette glycérol dépend du site de synthèse (i.e.
chloroplaste ou réticulum endoplasmique) des précurseurs diacyles des galactolipides. Les MGDG
et DGDG synthétisés via la voie procaryote (i.e. synthèse dans les chloroplastes) ont
retrouvée abondamment dans les épinards par exemple). Les MGDG et DGDG synthétisés par la
voie eucaryote (i.e. synthèse dans le réticulum endoplasmique) sont quant à eux principalement
trouvés avec une composition C18:3/C18:3 (Browse & Somerville, 1991; Frentzen et al., 1983).
Les voies de synthèse des galactolipides, en particulier des MGDG et DGDG, sont décrites plus en
52
CHAPITRE 1
Tableau 4 - Composition en AG principaux des MGDG et DGDG issus de différentes sources photosynthétiques. La
spiruline (ici Arthrospira platensis) est la cyanobactérie la plus connue (algues bleues-vertes) dans les applications
d’ingrédients fonctionnels. Elle est particulièrement enrichie en C16:0 et en C18:3 3. La Subterraneus provient de la
biomasse microalgale et peut être utilisée pour la consommation humaine. Elle a la particularité d’être enrichie en
EPA. Chez l’Arabidopsis, le MGDG est riche en ALA et en acide hexadécatriénoïque (HTA, C16:3 3) tandis que le
DGDG est principalement enrichi en ALA. Les feuilles d’épinard présentent quant à elles un profil particulièrement
riche en ALA chez le MGDG et le DGDG. (Lyu et al., 2021)
Les propriétés physicochimiques, mais également les fonctions biologiques des galactolipides, sont
étroitement liées à leur composition en AG et leurs positions sur le squelette glycérol. Certains
extraits comestibles d’algues, de mousses, et de plantes, ont montré des propriétés biologiques
antivirale (de Souza et al., 2012; Ibrahim, 2019; Maeda et al., 2011; J. Zhang et al., 2013). Dans le
matrices photosynthétiques.
53
CHAPITRE 1
thylakoïdes, est appauvrie en MGDG, mais contient d’autres phospholipides (PC, PE, PS, PI…) en
plus du PG. Elle est ainsi bien plus proche des membranes plasmiques ou des organelles non-
Dans les graines, les noix, et certains autres tissus végétaux, les lipides peuvent être trouvés
sous la forme d’assemblages lipoprotéiques appelés oléosomes ou « corps huileux » (en anglais,
« oil bodies », OB). Ces assemblages mesurent entre 500 nm et 2,5 µm de diamètre (Frandsen et
al., 2001), selon les conditions de croissance des végétaux, mais également les facteurs
Ces OB sont considérés comme des ingrédients prometteurs pour la formulation d’aliments
fonctionnels, comme cela a récemment été souligné par Abdullah et al. (2020). Dans la nature, la
principale fonction physiologique de ces entités est le stockage d’énergie sous la forme de TAG,
mais elles sont également impliquées dans de nombreux processus cellulaires, comme le transport
Représentant jusqu’à 75% du volume des graines, en particulier chez les oléagineux et
protéagineux, les OB sont composés d’un cœur de TAG (94-98% wt.), recouvert par une
et al., 2014). Cette membrane permet de protéger les OB du stress chimique ou mécanique. Elle est
54
CHAPITRE 1
des propriétés émulsifiantes aux OB et leur permettent d’être localisés spontanément aux interfaces
Les oléosines sont des protéines alcalines de taille variant entre 15 et 26 kDa en fonction du types
de graine et d’isoforme (Tzen et al., 1990). Les oléosines possèdent des domaines N- et C-
terminaux hydrophiles, qui recouvrent la surface des OB grâce à leur orientation présumée
dans le cœur de TAG hydrophobe des OB (Huang, 1992). Un schéma représentatif de la structure
et de l’organisation des oléosines à la surface des OB est présenté en Figure 10. Les structures
55
CHAPITRE 1
configuration native des oléosines n’étant pas conservée lors de leur extraction/purification (C.-Y.
Figure 10 - Schéma simplifié de la structure des oléosines, adapté du modèle proposé par Huang et Huang (2015).
Les analyses réalisées sur 1000 formes d’oléosines extraites de diverses plantes et algues vertes
représentant un large résidu non-polaire dans les séquences X5 et X3 et un résidu hydrophobe dans
la séquence X30) (Huang & Huang, 2015). Un gène transcrit codant pour une protéine de type
oléosine a été observé chez deux espèces d’algues vertes modernes primitives, la Chlamydomonas
et la Volvox. Cette protéine pourrait être le précurseur de l’oléosine, qui aurait évolué chez l’algue
verte pour donner naissance aux oléosines universelles, dont les gènes sont présents dans toutes les
espèces végétales évoluées aujourd’hui. Malgré les évolutions et diversifications à travers le temps,
56
CHAPITRE 1
cheveux ».
Le point isoélectrique des oléosines d’OB déterminé sur sept espèces par focalisation isoélectrique
a indiqué une plage de valeurs comprises entre 5,7 et 6,6 (colza 6,5, moutarde 5,7, coton 6,3, lin
6,0, maïs 6,3, arachides 6,6, sésame 6,4) (Tzen et al., 1993). Ce pI acide contribue à la stabilité des
répulsion électrostatique et à une gêne stérique entre les objets, prévenant ainsi des phénomènes
qui varie selon le type de graine, on observe une augmentation de la taille globale des OB lorsque
ces ratios diminuent. La taille et la composition massique d’OB isolés de différentes graines sont
renseignés Tableau 5.
Tableau 5 - Taille (µm) et composition (pourcentage massique) d'OB isolés de différentes graines.
Diamètre (µm) 0.6a 1.3a 0.7a 1.4a 2.0a 2.0a 0.4b 1.0-2.0d
Lipides neutres 94.2a 97.6a 94.6a 97.6a 98.2a 97.4a 85.9c 96.0d
[% wt.]
Protéines 3.5a 1.3a 3.2a 1.4a 0.9a 0.6a 8.2c (/)
[% wt.]
PL [% wt.] 2.0a 0.9a 1.6a 0.9a 0.8a 0.6a 5.8c 2.5d
AGL [% wt.] 0.4a 0.1a 0.2a 0.1a 0.1a 0.1a (/) (/)
a
JTC. Tzen et al. (1993)
b
Y. Chen & Ono (2010)
c
Y. Chen et al. (2014)
d
Millichip et al. (1996)
oléagineux, mais peu de données sont disponibles concernant la caractérisation chimique des OB
57
CHAPITRE 1
de ces graines, leur composition étant légèrement différente. Le profil en acide gras des lipides
polaires des OB est généralement enrichi en acides gras insaturés, en comparaison avec le profil
des TAG, mais garde le même modèle en termes d’AGPI prédominants. Les classes de
phospholipides présentes chez les OB incluent cinq types : PC, PE, PI, PG et PS. La PC est le PL
majoritaire, représentant entre 40 et 65% wt. des PL totaux. Les PE et PI sont ensuite trouvés à 5-
15% wt. des PL totaux. La PE est un élément fonctionnel important en raison de sa petite tête
polaire qui favorise la courbure des membranes (Millichip et al., 1996). La distribution des
L’extraction des OB à partir des graines par voie aqueuse résulte en un produit naturellement
émulsifié, avec une stabilité supérieure à celle des émulsions préparées avec des surfactants comme
le Tween 20, ou des protéines comme les caséinates ou le lactosérum (WPI) (Ding et al., 2020). Le
protocole d’extraction des OB à partir des graines est proposé en Annexe II du manuscrit. La
stabilité naturelle des OB (Kergomard et al., 2021) a soulevé l’intérêt de leur utilisation dans des
58
CHAPITRE 1
pharmaceutique (Deckers, 2002; Moloney et al., 2012), ce qui explique leur utilisation répandue
(Nikiforidis, 2019).
De par leur profil nutritionnel, les lipides végétaux représentent des candidats d’intérêt dans
leur forte teneur en AGPI les rend particulièrement sensibles à l’oxydation, un phénomène
d’AGPI 3, il est donc capital de comprendre les facteurs de risques responsables de l’oxydation
lipidique.
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS, Reactive Oxygen Species) sont générées dans
cellulaires, dont les lipides, les protéines et les espèces pro-oxydantes ou antioxydantes (comme la
à la lumière ou encore la présence de métaux sont autant de facteurs qui peuvent jouer un rôle
catalytique dans le déclenchement de l’oxydation lipidique in vivo, mais également dans les
matrices alimentaires au cours de leur stockage (Waraho et al., 2011). Un schéma exhaustif est
59
CHAPITRE 1
proposé Figure 11 pour illustrer les principaux facteurs influant sur la stabilité chimique des
émulsions alimentaires.
L’oxydation des lipides est un phénomène dont les principaux mécanismes, cinétiques et facteurs
de variation sont aujourd’hui bien connus. Cette réaction radicalaire en chaîne affecte les acides
gras insaturés présents dans l’huile, la matière grasse ou au niveau des lipides structuraux in vivo
ou in vitro, et est généralement schématisée sous la forme des trois principales étapes décrites
Figure 12. (i) La première étape d’initiation conduit à la formation d’un premier radical alkyle, par
l’abstraction d’un atome d’hydrogène par le ROS sur un groupe méthylène positionné entre deux
allylique). Cette abstraction de l’atome d’hydrogène constitue donc l’étape limitante de la réaction,
étant donné que cette dernière nécessite la disponibilité d’un hydrogène, ce qui est uniquement le
60
CHAPITRE 1
cas en présence d’un lipide présentant une ou plusieurs chaînes insaturées. Cela explique la
susceptibilité des AGPI à l’oxydation, dont la stabilité est inversement proportionnelle au nombre
d’insaturation(s) présente(s) sur les chaînes acyles. (ii) Au cours de la deuxième étape de
propagation, le radical alkyle formé au cours de l’étape d’initiation réagit avec un l’oxygène
moléculaire, conduisant à la formation d’un radical peroxyle, qui va à son tour réagir avec un autre
acide gras insaturé pour former un hydroxyperoxyde. Ce dernier, composé primaire d’oxydation,
est particulièrement instable et peut être converti en composé secondaire d’oxydation. (iii) Enfin,
l’étape finale de terminaison stoppe la chaîne réactionnelle lorsque deux produits radicaux
Figure 12 - Peroxydation des lipides par les espèces réactives de l’oxygène (ROS).
L’oxydation des lipides est un phénomène que l’on cherche à éviter étant donné qu’il est
responsable (1) de la perte irréversible des AGPI essentiels, (2) de réactions prématurées qui
61
CHAPITRE 1
parfois toxiques peuvent entrer dans la circulation sanguine par l’alimentation et être absorbés dans
II.1.2- Les facteurs structuraux influant sur la sensibilité à l’oxydation des lipides
présentent sous la forme d’un milieu lipidique homogène (huile), d’un système biphasique
exceptions à cette simple règle peuvent être observées en fonction de la structure chimique du lipide
contenant l’insaturation (acide gras, TAG, phospholipides), son état physique et son environnement
(présence d’ions métalliques pro-oxydants, état initial d’oxydation, degré initial d’hydrolyse,
présence d’autres anti-oxydants, coefficient de répartition dans les émulsions o/w et proximité de
l’interface, etc.) (Berton‐Carabin et al., 2014; Decker et al., 2017). A un niveau d’insaturation et
principalement de l’énergie de liaison dissociante (DBE) nécessaire pour rompre la liaison carbone-
hydrogène d’un atome d’hydrogène bis-allylique ou allylique. En effet, plus la DBE est faible, plus
l’oxydation de la molécule est rapide. Néanmoins, l’accès à cette donnée pour les galactolipides
n'est pas simple, en comparaison avec les phospholipides ou les TAG, mais peut être déduite de
données bibliographiques obtenues sur des molécules ayant des chaînes acyles similaires.
Au sein des phospholipides, la PE, qui est souvent la plus insaturée, est la plus rapidement
dégradée. A l’inverse, la PC est la plus résistante. La stabilité oxydative des galactolipides est
moins documentée, bien que leur composition en AGPI les rend potentiellement très sensibles à
l’oxydation (Hazahari et al., 2018; Yamauchi et al., 1983). La réactivité des galactolipides, des
62
CHAPITRE 1
phospholipides et des TAG a été comparée en utilisant des sources de différents degrés
d’insaturations et elle tend à indiquer une stabilité plus importante des galactolipides comparé aux
phospholipides, qui sont eux-mêmes plus stables que les TAG. Dans ces expériences, l’impact des
espèces pro-oxydantes (PO) ou AO est limité par le fait que les extraits ont été purifiés, mais les
différences d’état physique des molécules peuvent également moduler la réactivité à l’oxydation.
L’état physique (solide/liquide) des TAG, des phospholipides ou des galactolipides (packing
hexagonal dans les micelles/liquide condensé, liquide expansé ou gel dans les bicouches) détermine
vitro et in vivo
Dans le règne végétal, des systèmes de défense des membranes sont mis en place pour
contrôler la concentration en ROS et ainsi protéger les cellules. Les plantes possèdent différents
types d’AO, mais également des enzymes innées qui sont capables de neutraliser les ROS ou de
régénérer les formes actives des espèces AO. Ceci explique pourquoi une stabilité chimique à
l’oxydation relative est observée dans les différentes formes natives des assemblages membranaires
végétaux.
Les galactolipides de thylakoïdes sont continuellement exposés au stress oxydatif en raison de leur
niveau élevé en AGPI ainsi que leur exposition prolongée à la lumière pendant la photosynthèse
(Yamaguchi et al., 2012). Les galactolipides pourraient donc présenter des mécanismes de réponse
au stress oxydatif différents par rapports aux autres classes de lipides comme les phospholipides
ou les TAG.
63
CHAPITRE 1
montrée (St‐Pierre et al., 2019). Les extraits de thylakoïdes contiennent en effet des composés
phénoliques (flavonoïdes, tannin) ainsi que des pigments (chlorophylle et caroténoïdes), qui
confèrent des capacités AO durables aux chloroplastes. En plus de ces nombreuses molécules AO,
les thylakoïdes d’épinard contiennent également des enzymes AO, qui régulent le niveau des
radicaux en éliminant les anions superoxydes, et dont l’activité n’est pas affectée par le stockage.
L’activité enzymatique et les composés structuraux des thylakoïdes semblent être responsables de
Les MGDG et DGDG contiennent tous les deux une tête polaire sucre hydrophile et des queues
hydrophobes, de telle façon qu’ils peuvent rester à l’interface entre les phases huile et aqueuse.
Avec leur activité AO, les MGDG et DGDG seraient des candidats parfaits comme émulsifiants,
qui pourraient être utilisés dans des applications alimentaires mais également médicales. Le DGDG
a montré une meilleure activité AO comparé au MGDG, de par leur propension à former de
En plus de leur stabilité physique significative, les OB montrent une stabilité chimique à
l’oxydation relativement importante au cours de leur stockage, malgré la présence d’une quantité
significative d’acides gras insaturés dans la majorité des oléagineux (B. Chen et al., 2012; Gray et
al., 2010; Kapchie et al., 2013; Nikiforidis et al., 2013). La présence de protéines endogènes
entourant le cœur de TAG, mais également de protéines de stockage exogènes dans la phase
continue des jus dérivés de noix par exemple, explique partiellement cette stabilité (Nikiforidis et
al., 2014). En plus des protéines et des lipides, les OB constituent également une source riche de
64
CHAPITRE 1
composés AO bioactifs, comme les tocophérols et les phytostérols, qui ont été montrés comme
étant associés à la surface des objets. En effet, la présence d’une quantité importante de tocophérols
et de composés phénoliques AO a été trouvée dans plusieurs types d’oléagineux, permettant une
protection efficace des AGPI contre l’oxydation et contribuant ainsi à la stabilité oxydative in vivo
En plus de leurs propriétés biologiques et biochimiques multiples mentionnées plus haut, les
lécithines végétales ont montré des propriétés AO quelle que soit la source, leur activité étant
phospholipides possèdent des propriétés AO variées, dont les mécanismes ont été clairement
détaillés dans la littérature (Cui & Decker, 2016; Reis & Spickett, 2012). En particulier, les
phospholipides ont un rôle AO de chélation des espèces métalliques PO, et sont capables de
régénérer les espèces d’AO primaires. De plus, des études scientifiques ont montré que la présence
de phénols dans les lécithines végétales, en synergie avec les phospholipides, augmentait les
capacités AO des lécithines (Judde et al., 2003; J. Li & Guo, 2016). L’hypothèse avancée pour
expliquer cette synergie est que les phospholipides pourraient faciliter le transfert d’un hydrogène
ou d’un électron vers les tocophérols et donc faciliter leur régénération. Néanmoins, comme pour
les OB, les capacités AO des lécithines dépendent fortement de la qualité et de la structure des
matrices alimentaires, et peuvent donc être altérées par les processus de transformation.
Les principales données et hypothèses déterminant la stabilité des lipides polaires à l’oxydation
Tableau 7 - Principales données et hypothèses déterminant la stabilité oxydative des lipides polaires et des
assemblages végétaux : chloroplastes, oléosomes et lécithines.
65
CHAPITRE 1
Le corps humain est capable de digérer et d’adsorber plus de 95% de l’apport lipidique
provenant de l’alimentation. Le système digestif humain se présente sous la forme d’un ensemble
La digestion des lipides débute dès l’ingestion dans la cavité orale, avec la mastication et
la présence des sécrétions salivaires, qui permettent une première déstructuration du bol
alimentaire. Ce dernier va ensuite transiter par les nombreux organes composant le tube digestif,
que sont l’estomac, le pancréas, le foie, la vésicule biliaire, l’intestin grêle et enfin le côlon.
L’intestin grêle est l’organe qui relie l’estomac au côlon. Il s’étend sur plus de deux mètres et est
66
CHAPITRE 1
duodénum que se déroule l’essentiel de l’hydrolyse des lipides par les enzymes digestives,
et de sels biliaires. Le duodénum est ensuite suivi du jéjunum, site préférentiel de l’absorption des
lipides, dans lequel les produits de digestion (acides gras, les monoglycérides, ou encore
lysolécithines) rentrent dans les entérocytes avant d’être réestérifiés sous la forme de chylomicrons,
transportés ensuite de l’intestin grêle vers les tissus adipeux via la circulation sanguine. Le foie est
quant à lui responsable de la production des sels biliaires composant la bile, qui sont ensuite stockés
dans la vésicule biliaire et jouent un rôle clé dans l’action des enzymes responsables de la digestion
des lipides.
Figure 13 – Schéma simplifié du tractus digestif humain et des processus d’absorption et de réestérification des acides
gras dans les chylomicrons avant transport vers les tissus adipeux via la circulation sanguine.
Les lipides digérés puis absorbés dans l’intestin grêle et le côlon sont ensuite en partie transformés
tandis que le surplus sera stocké dans le tissu adipeux. La plus importante partie de la digestion des
67
CHAPITRE 1
lipides se déroulant dans la lumière du tractus gastro-intestinal, nous nous sommes particulièrement
focalisés sur l’activité enzymatique présente au sein de cette partie du tube digestif durant notre
étude.
III.2 – Les enzymes impliquées dans l’hydrolyse des lipides chez l’Homme
Figure 14 - Principales enzymes impliquées dans la digestion des lipides chez l’Homme.
Chez l’Homme, la lipolyse des lipides polaires débute dans l’intestin grêle, les enzymes
responsables de leur digestion n’étant pas produites dans l’estomac. La plupart des enzymes
lipolytiques sont produites dans le duodénum par le tissu exocrine du pancréas et travaillent de
concert pour digérer les lipides alimentaires (Figure 14). Les principales enzymes digestives
sPLA2), l’hydrolase pancréatique carboxyle ester (pancreatic carboxyl ester hydrolase, CEH) –
également appelée la lipase stimulée par les sels biliaires (bile-salt stimulated lipase, BSSL) – et la
68
CHAPITRE 1
lipase pancréatique de type 2 (pancreatic lipase related protein 2, PLRP2) (Bakala N’Goma et al.,
2012).
Tableau 8 - Localisation et concentrations massique et molaire des principales enzymes gastro-intestinales humaines
au cours d’un repas – adapté de Bakala N’Goma et al. (2012).
Les enzymes lipolytiques possèdent une spécificité plus ou moins stricte pour leur substrat. La
sPLA2 pancréatique humaine (14 kDa) est responsable de l’hydrolyse intestinale des
Néanmoins, la sPLA2 ne représente chez l’adulte humain qu’une portion minoritaire des enzymes
digestives, contrairement à la HPL et à la CEH qui sont présentes dans des quantités beaucoup plus
importantes (Sternby et al., 1991). A titre d’information, le Tableau 8 adapté de Bakala N’Goma
et al. (2012) donne une liste exhaustive de la localisation et des concentrations massiques et
molaires moyennes des principales enzymes digestives du tractus gastro-intestinal humain au cours
d’un repas.
69
CHAPITRE 1
La HPL (48 kDa), dont l’activité dépend de son cofacteur spécifique, la colipase (10 kDa), est la
principale enzyme impliquée dans la digestion intestinale des TAG alimentaires chez l’Homme.
En effet, la HPL a été estimée comme responsable de l’hydrolyse de 56% des chaînes acyles de
TAG dans le lumen, alors que la lipase gastrique (HGL, 47 kDa) ne réalise que 10 à 25% de cette
tâche dans l’estomac, en fonction du bol alimentaire ingéré (Bakala N’Goma et al., 2012).
Une activité galactolipase a également été montrée dans le jus pancréatique et dans le contenu
duodénal du système digestif humain (Andersson et al., 1995; De Caro et al., 2004; Wattanakul et
al., 2019). Contrairement à la HPL, la PLRP2 (50 kDa) présente dans le jus pancréatique humain
hydrolyse de manière efficace les galactolipides. En effet, cette enzyme pancréatique n’hydrolyse
pas efficacement les TAG et les phospholipides, mais est responsable de la lipolyse significative
des films monomoléculaires de MGDG (De Caro et al., 2004). Des espèces de PLRP2 possédant
des structures similaires sont également présentes dans le système digestif d’autres espèces, et en
particulier chez les herbivores monogastriques comme le cochon d’Inde (gPLRP2), dont le régime
alimentaire contient des quantités importantes de galactolipides. Les propriétés structurales des
enzymes possédant une activité galactolipase chez l’Homme, les herbivores monogastriques, mais
également certaines poissons, insectes folivores et microorganismes ont été détaillées dans une
revue récente de (Sahaka et al., 2020). L’absence de galactolipides dans les régimes carnivores
peut notamment expliquer l’absence de PLRP2 dans le tractus gastrointestinal de certaines espèces
La CEH – ou BSSL – (100 kDa), possède également une activité galactolipase chez l’Homme,
mais beaucoup moins importante que la PLRP2. La CEH est une enzyme non-spécifique capable
d’hydrolyser les galactolipides, mais également d’autres substrats lipidiques variés comme les
TAG, les phospholipides, ou le cholestérol. Présente dans des proportions plus importantes que la
70
CHAPITRE 1
PLRP2 dans le système digestif humain, elle contribue significativement à la digestion des
galactolipides, mais son activation nécessite la présence de sels biliaires (Bakala N’Goma et al.,
2012; Salhi et al., 2020). La CEH peut également hydrolyser sans distinction les trois positions des
TAG, en synergie avec d’autres lipases. Cette spécificité la distingue des autres estérases
digestives, et lui permet d’hydrolyser partiellement les acylglycérols en produits finaux de réaction
(acides gras libres et glycérols) chez les nouveau-nés (Bourlieu et al., 2014).
La biodisponibilité des acides gras désigne leur capacité à être absorbés et utilisés par les différents
enzymes pour leurs substrats. En effet, la lipolyse est un phénomène interfacial complexe, durant
lequel l’action des lipases dans le duodénum dépend de la structure de leurs substrats mais
Les lipides étant insolubles dans le système digestif aqueux, ils doivent se trouver sous une forme
émulsifiée, c’est-à-dire sous la forme de gouttelettes dispersées, afin d’être digérés. Le processus
d’émulsification constitue donc une étape clé de la digestion des lipides alimentaires, et doit se
dérouler majoritairement avant absorption, la phase gastrique impliquant une agitation, mais le plus
souvent une émulsification faible, voire nulle (déstabilisation acide) du bol alimentaire (Golding
& Wooster, 2010). Les lipides polaires alimentaires, en particulier certains phospholipides de par
leur propension à former des phases lamellaires, jouent en effet un rôle important dans la stabilité
71
CHAPITRE 1
des émulsions alimentaires. Grâce à leurs propriétés amphiphiles naturelles, ceux-ci viennent
former une monocouche à la surface des gouttelettes de TAG, permettant ainsi de limiter les
les aliments, les lipides peuvent également être trouvés sous une forme émulsifiée, proche de leur
structure naturelle, ce qui module la digestion et la biodisponibilité des acides gras (Bourlieu et al.,
2015; Michalski et al., 2013). La taille des gouttelettes d’une émulsion est un facteur clé jouant sur
l’étendue de leur hydrolyse par les enzymes gastrointestinales. En effet, une émulsion fine (0,7 µm)
offrira une interface lipidique plus importante qu’une émulsion de taille plus importante (10 µm),
ce qui multipliera le nombre de molécules de lipases pouvant s’y fixer (Armand et al., 1999; Borel
et al., 1994).
L’activation interfaciale est un paramètre crucial pour les enzymes impliquées dans la digestion
des gouttelettes de lipides émulsifiés (Golding & Wooster, 2010; Sintra et al., 2014). Certaines
lipases sont en effet inactives lorsqu’elles se trouvent en phase homogène (bulk), le site actif étant
rendu inaccessible par la présence d’un « couvercle » en position fermée. Lorsque l’enzyme
lipolytique rentre en contact avec une interface, ce couvercle subit des changements
actif, un espace également appelé « surface interfaciale de reconnaissance » pour les enzymes
lipolytiques. Néanmoins, l’activation interfaciale des lipases ne nécessite pas forcément la présence
d’un « couvercle » contrôlant l’accès au site actif. Par exemple, le site actif de la sPLA2
pancréatique ne présente pas de couvercle, alors même que cette lipase montre une activation
interfaciale au contact des micelles des PL. Plus généralement, l’activation interfaciale des
enzymes se décrit comme l’augmentation de leur activité hydrolytique lorsque leurs substrats
72
CHAPITRE 1
lipidiques sont organisés sous la forme d’un assemblage supramoléculaire, i.e. sous la forme
d’émulsions pour les lipases et de micelles ou de liposomes pour les phospholipases. Par exemple,
la sPLA2 possède une faible activité au niveau des monomères de PL à chaînes moyennes, mais
micellaire critique (CMC) et que les micelles commencent à se former (Bakala N’Goma et al.,
2012). L’activité hydrolytique de la sPLA2 requière également la présence d’ions calcium qui
interagissent avec le substrat et activent l’effet catalytique du site actif de l’enzyme. Ce processus
d’activation interfaciale est différent pour la lipase pancréatique humaine (HPL), qui elle ne
requiert pas la présence d’ions calcium pour être active à l’interface huile/eau. Néanmoins, la HPL
nécessite la présence d’une colipase pour se lier aux gouttelettes lipidiques et hydrolyser les TAG
en présence de sels biliaires. En effet, il a été établi in vitro que l’action de la HPL au niveau des
émulsions de TAG était inhibée par les sels biliaires, qui gênent l’adsorption de la lipase à
l’interface lipide/eau par des phénomènes de compétition. En présence de sels biliaires, l’ancrage
spécifique de la lipase à son substrat est alors permis par la formation d’un complexe à un ratio
molaire 1:1 avec la colipase, une protéine de 10 kDa produite par le pancréas. La HGL est quant à
elle, comme toutes les enzymes, inhibée par la présence des produits de digestion qu’elle génère,
mais les acides gras protonés à pH acide encombrent davantage la surface des gouttelettes que pour
les autres lipases agissant à pH neutre et empêchent son adsorption. Au niveau intestinal, la
présence de sels biliaires permet la micellisation des produits de digestion et une hydrolyse poussée
73
CHAPITRE 1
Figure 15- Représentation de la spécificité d'action des principales enzymes digestives humaines en fonction des
données et hypothèses référencées dans la littérature.
La spécificité des enzymes envers leurs substrats se décline en différentes modalités. Pour les
donné, régiosélectivité, stéréosélectivité (Bourlieu et al., 2009). Pour un même type de substrat,
l’affinité et l’activité d’une enzyme peuvent donc varier. Ainsi, la tête polaire, mais également
l’emplacement des chaînes d’acides gras sur les molécules de lipides, sont par exemple des facteurs
déterminant l’affinité de l’enzyme pour son substrat et donc leur bioaccessibilité. Par exemple,
plusieurs types de PLA2 ont une préférence plus marquée pour les substrats anioniques tels que le
1997). La spécificité de substrat est en revanche plus restreinte en ce qui concerne la sPLA2
pancréatique, dont les substrats physiologiques intestinaux sont les dispersions de PL à longues
chaînes dans les sels biliaires. Il a notamment été montré que la sPLA2 pancréatique porcine (EC
74
CHAPITRE 1
3.1.1.4), dont la structure est proche de la sPLA2 pancréatique humaine, pouvait hydrolyser tous
les types de phospholipides, mais possède une régiospécificité d’hydrolyse au niveau de la liaison
ester en position sn-2, quels que soient la longueur ou le degré d’insaturation des chaînes d’acides
Concernant la PLRP2 humaine, Amara et al. (2010) ont mis en évidence que son activité
galactolipase n’était pas fortement impactée, ni par la longueur des chaînes acyles, ni par la taille
de la tête polaire, mais dépendait fortement du ratio sels biliaire/substrats, qui gouverne la
solubilisation micellaire des DGDG et MGDG. Ce ratio est donc un paramètre important pour
déterminer les conditions optimales pour mesurer l’activité de la PLRP2. Les analyses des produits
de lipolyse des MGDG et DGDG ont également permis de mettre en évidence la spécificité d’action
de la hPLRP2 au niveau de leur fonction ester en position sn-1. Ainsi, l’ALA, l’acide gras
majoritaire (>60% wt.) en position sn-1 dans les MGDG et DGDG issus de chloroplastes, est
l’acide gras majoritairement libéré lors de l’hydrolyse des galactolipides par la PLRP2. Concernant
stéréosélective de la position sn-3, et régiospécifique en position sn-1 et sn-3 des TAG. Les données
et hypothèses relatives aux spécificités d’action des principales enzymes digestives sont résumées
Figure 15.
De nombreuses études se sont intéressées à l’hydrolyse enzymatique des galactolipides issus des
membranes de thylakoïdes et sur leurs effets sur le système digestif. Comme précédemment
mentionné, les assemblages de galactolipides, dont font partie les membranes de thylakoïdes et les
75
CHAPITRE 1
fractions de chloroplastes enrichies (CRF), sont digérés dans le compartiment pancréatique par la
PLRP2, ainsi que par la CEH dans une moindre mesure (Bakala N’Goma et al., 2012). Wattanakul
et al. (2019) ont notamment étudié la digestion in vitro de CRF extraits de résidus de pois de vigne
et de feuilles d’épinard par le jus pancréatique humain et ont montré l’hydrolyse rapide des MGDG
(DGMG).
animaux a également fait l’objet d’une revue récente de Pourteymour Fard Tabrizi & Abbasalizad
Farhangi (2021). Les résultats des études citées indiquent tout d’abord que la supplémentation en
des TAG in vivo en interagissant physiquement avec le complexe lipase-colipase, gênant ainsi son
accès à la surface des gouttelettes d’émulsions (Erlanson-Albertsson & Albertsson, 2015). L’effet
d’inhibition des membranes de thylakoïdes a en effet été montré sur le complexe HPL in vitro,
même en présence de sels biliaires (Albertsson et al., 2007). Cette inhibition du complexe lipase
hydrophobes. Pour expliquer cette inhibition, l’un des mécanismes avancé par Albertsson repose
sur des effets de compétition dans l’adsorption à l’interface lipide/eau. En effet, les membranes de
thylakoïdes étant tensioactives, elles ont tendance à se placer à l’interface lipide/eau, réduisant ainsi
l’accès du complexe lipase-colipase par gène stérique, et diminuant l’hydrolyse des TAG. Il
convient cependant d’être prudent quant aux hypothèses envisagées pour expliquer l’inhibition du
complexe HPL par les membranes de thylakoïdes, car celles-ci se basent sur des études de digestion
76
CHAPITRE 1
des galactolipides des membranes de thylakoïdes par la PLRP2 et la CEH n’a pas été considérée.
concentration des hormones de satiété suggère un retard d’adsorption des nutriments dans
l’intestin, ce qui provoque la prolongation de la digestion des lipides, comme démontré dans des
études in vivo sur des cohortes animale (Köhnke, Lindqvist, et al., 2009) et humaine (Köhnke,
Lindbo, et al., 2009). Les effets observés sur le métabolisme hépatique ont pour conséquence une
diminution des LDL (low-density lipoprotein) circulants, du cholestérol total, ainsi que du glucose
et des lipides plasmatiques. Les études ont également rapporté une diminution de la sécrétion de
leptine, une hormone de satiété produite par le tissu adipeux qui régule les réserves de graisses et
de glucose dans l’organisme, interrogeant ainsi sur les potentiels effets anti-diabète des thylakoïdes
sur l’organisme. Ainsi, les thylakoïdes pourraient être envisagés comme candidats potentiels dans
A ce jour, la plupart des réponses concernant la digestion des GL ont été obtenues sur des
MGDG, DGDG et SQDG purifiés à partir d’extraits lipidiques de feuilles, telles que les épinards.
Néanmoins, davantage d’études sont encore nécessaire concernant les mécanismes de digestion
des galactolipides par l’action directe des enzymes pancréatiques sur des sources plus variées et
77
CHAPITRE 1
plus complexes, comme le matériel végétal non purifié, dans le but de mieux comprendre les
mécanismes d’inhibition et les effets synergiques observés sur l’action des enzymes digestives.
des quantités très élevées de lipides polaires (0,6 à 2,0% wt. de phospholipides). Néanmoins, les
OB possèdent une faculté remarquable à former des émulsions quasi-naturelles, ou du moins peu
transformées, par extraction directe des matrices végétales et redispersion dans une phase aqueuse.
Ce potentiel émulsifiant naturel a soulevé l’intérêt de leur utilisation dans des applications
comportement des OB au cours de la digestion (Nikiforidis, 2019). Une étude de Gallier & Singh
(2012) a notamment fait état de la déstabilisation physique des OB d’amande dans des conditions
gastriques in vitro, induite par une agrégation des objets à pH acide, mais également par une
possible protéolyse partielle des oléosines composant la membrane protectrice des OB. La
transition vers un pH neutre et l’ajout de sels biliaires a ensuite conduit à la rupture de ces agrégats
lors du passage dans le tractus intestinal. Malgré la déstabilisation physique constatée des OB, la
structure membranaire de l’assemblage a globalement été préservée et une phase de latence a été
observée avant le début de la lipolyse intestinale. Cette phase a été induite par l’adsorption retardée
de la HPL, suggérant ainsi que la préservation de la structure membranaire des OB pourrait entraver
l’accès de la lipase pancréatique à l’interface lipide/eau. Des résultats similaires avaient été obtenus
par Beisson et al. (2001), qui avaient étudiés les OB d’amande comme substrats de différentes
78
CHAPITRE 1
lipases purifiées, dont la HPL et la gPLRP2. Les deux lipases avaient été trouvées actives sur les
OB, mais avec une activité plus faible (18 à 38%) que celle observée sur des émulsions artificielles
d’huile d’amande. Les résultats, en accord avec ceux de Gallier et al., avaient montré que la couche
et une phase de latence plus ou moins longue avait également été observée avant l’initiation de
l’hydrolyse. Cette phase de latence est assez caractéristique des systèmes lipidiques possédant une
densité de packing élevée, comme les chylomicrons ou les globules gras laitiers, qui possèdent une
structure relativement proche de celle des OB (Walther & Farese, 2012). L’activité phospholipase
également être l’un des mécanismes expliquant l’action des lipases sur le cœur TAG des OB.
cœur de TAG. Cette hypothèse avait été avancée par Noll et al. (2000), qui avait montré qu’une
activité phospholipase était nécessaire avant l’action de la lipase pour accéder au cœur de TAG au
cours de la croissance des graines de concombre. Un autre mécanisme possible serait lié au
placement des TAG au niveau de l'interface lipide/eau des OB, permettant leur hydrolyse par les
tractus gastro-intestinal a également été étudié. Une étude de Makkhun et al. (2015) sur les OB de
tournesol non lavés a notamment mis en avant le rôle sacrificiel des protéines exogènes des graines
en présence de pepsine, permettant de protéger les oléosines endogènes des OB d’un clivage total,
les données ayant indiqué la présence d’oléosines « intactes » malgré l’étape de digestion gastrique.
Les OB de tournesol ayant la capacité de s’associer avec les protéines exogènes de la graine, ces
79
CHAPITRE 1
dernières pourraient avoir formé une couche protectrice supplémentaire autour des OB, protégeant
ainsi partiellement les oléosines exposées à la digestion. Une nette réduction de la bande protéique
en électrophorèse avait cependant été observée après l’étape de digestion intestinale in vitro,
indiquant le déplacement des oléosines restantes à la surface des OB par les sels biliaires. La
formation d’une couche de protéines exogènes à la surface d’OB non lavés avait également été
observée dans le cas de la digestion gastro-intestinale in vitro d’OB d’amande par Gallier & Singh
(2012). Les résultats avaient en effet indiqué la présence de peptides d’amandine, une protéine
résistante au clivage par la pepsine même après 15 minutes de digestion gastrique. Les observations
en microscopie confocale avaient en effet mis en évidence la couverture totale des OB par une
deux minutes avait ensuite été observée avant l’initiation de l’hydrolyse intestinale. Cette phase
suggérait une pénétration plus lente de la lipase pancréatique à l’interface des gouttelettes,
probablement inhibée par la couche de protéines exogènes protégeant la membrane des OB avant
Chu et al. (2009) se sont intéressés au comportement digestif de gouttelettes d’huile d’olive
stabilisées par des lécithines et recouvertes par différentes quantités de GL d’épinards. L’objectif
de leur étude était de quantifier les effets des MGDG et DGDG sur l’activité in vitro de la lipase
pancréatique porcine dans des conditions duodénales. Les résultats obtenus ont indiqué que la
présence de molécules de DGDG adsorbées à l’interface des gouttelettes d’huile interférait avec
80
CHAPITRE 1
rapproché avec le substrat et inhibant ainsi la lipolyse intestinale. Les mesures à l’interface ont
permis d’identifier des interactions moléculaires fortes entre les têtes polaires sucre des DGDG,
interfaciale de la lipase pancréatique et de sa colipase. Cet effet d’inhibition a persisté dans des
conditions physiologiques, la présence des sels biliaires n’ayant pas permis le déplacement des
enzymatique des TAG par la lipase pancréatique a été constaté. Cette capacité à retarder et à ralentir
la lipolyse des gouttelettes lipidiques des molécules de DGDG pourrait être un outil efficace pour
prise de graisse chez les patients atteints de troubles métaboliques tels que l’obésité.
Bien que de tels effets d’inhibition des galactolipides sur l’activité de la lipase pancréatique soient
intéressants, des études complémentaires restent nécessaires pour valider cette approche, de tels
lipidique par les lécithines végétales (Robert, Couëdelo, Vaysse, et al., 2020). En effet, comme
précédemment mentionné, la nature amphiphile des phospholipides leur confère des propriétés
émulsifiantes naturelles, qui induisent leur arrangement spatial à la surface des gouttelettes
lipidiques, que ce soit dans le cas de la préparation d’une émulsion ou bien dans le tractus
81
CHAPITRE 1
gastrointestinal lors du mélange des lipides du bol alimentaire avec les PC endogènes. En favorisant
surface spécifique disponible pour l’adsorption des enzymes digestives, augmentant ainsi le taux
lécithine-huile de colza (sans émulsifiants) sur l’augmentation des niveaux de lipides lymphatiques
a récemment été mis en évidence chez le rat par Robert, Couëdelo, Knibbe, et al. (2020). La lipolyse
gastrique in vitro d’une émulsion d’huile de lin a également été montrée comme étant 30% plus
étendue lorsque les gouttelettes lipidiques étaient recouvertes par des lécithines de soja, en
comparaison avec des émulsifiants commerciaux largement utilisés comme les caséinates ou le
Tween 80 (Couëdelo et al., 2015). Ces résultats ont par ailleurs été confirmés in vivo, accompagnés
d’une absorption intestinale plus rapide et d’une meilleure biodisponibilité de l’ALA observées
Plus généralement, l’impact bénéfique des lécithines végétales sur l’absorption des lipides a été
mis en avant, et s’accompagne d’une amélioration subséquente du profil lipidique dans le plasma,
le foie, et les tissus adipeux (Robert, Couëdelo, Vaysse, et al., 2020). En effet, Lee et al. (2014) ont
lipoprotein), et allégeant les complications liées à l’obésité. Au global, ces résultats suggèrent le
potentiel des lécithines de soja dans la délivrance de certains acides gras spécifiques vers des tissus
Néanmoins, des recherches complémentaires sont encore nécessaires pour déterminer si ces effets
se retrouvent chez l’humain en bonne santé, mais également pour étudier les effets des lécithines
82
CHAPITRE 1
présentant des compositions lipidiques et des structures plus variées. Pour nuancer ces effets
bénéfiques potentiels, il est néanmoins important de rappeler que l’utilisation des lécithines comme
émulsifiants peut contourner les mécanismes de satiété déclenchés dans la partie distale de
graisses (Couëdelo et al., 2015). En effet, il a été démontré in vitro que les émulsions stabilisées
par la lécithine de soja engendraient une lipolyse plus rapide et plus importante que celles
stabilisées par des émulsifiants synthétiques (Vors et al., 2012). Cette absorption plus rapide des
lipides conduit à des concentrations moins élevées d’acides gras libres dans la partie inférieure de
l’intestin grêle, altérant ainsi la libération normale des hormones de satiétés telles que le GLP-1 et
le peptide YY (PYY). C’est pourquoi, une évaluation risque/bénéfice doit être réalisée avant de
digestion et de l’absorption des graisses pourrait être intéressante pour éviter par exemple la
malnutrition chez les prématurés et les personnes âgées, alors qu’elle pourrait contribuer à des
A notre connaissance, les effets de l’addition d’oléosines sur la digestion des gouttelettes
d’émulsions lipidiques ne sont pas documentés à ce jour. Néanmoins, des études réalisées sur la
dégradation des OB entiers par différentes lipases purifiées comparée à leur comportement sur des
émulsions stabilisées par des phospholipides ont permis de déduire certains effets des oléosines sur
la lipolyse. Par exemple, en fonction des lipases, l’activité spécifique mesurée sur les OB d’amande
représentait seulement 18 à 38% de celle mesurée sur de l’huile d’amande émulsifiée avec de la
la lipolyse. Également, alors que les phospholipides favorisent l’activité de la HGL sur l’huile de
83
CHAPITRE 1
soja, leur combinaison avec les oléosines sur les OB d’amande résulte en une activité 8 fois plus
faible (Gargouri, Pieroni, Riviere, et al., 1986). Ces effets des oléosines sur la HGL peuvent être
comparés avec ceux de la caséine, qui a également été montrée comme réduisant l’activité de la
lipase gastrique sur l’huile de colza (Vors et al., 2012) et de lin (Couëdelo et al., 2015) par rapport
à la lécithine de soja. Dans le cas de la HPL, la colipase est nécessaire pour mesurer une activité
sur les OB d’amande en présence de sels biliaires, alors que la HPL seule est active sur l’huile
d’amande émulsifiée avec de la gomme arabique. Comme dans le cas de la HGL, l’activité de la
HPL sur les OB était plus faible par rapport à celle observée sur l’huile d’amande émulsifiée avec
Comme énoncé dans la description des OB, les oléosines sont connues pour avoir un rôle de
stabilisation des OB, dont la monocouche membranaire module très probablement leur digestion.
En effet, en tant que composés émulsifiants naturels des OB, les oléosines apportent une
dégradation a notamment été montrée comme induisant la déstabilisation des émulsions d’OB par
Le comportement à l’interface air/eau d’oléosines purifiées à partir de germes de maïs a été étudié
par Nikiforidis et al. (2012). Les auteurs ont mis en évidence que leur comportement à l’interface
air/eau était comparable à ceux des protéines de lait et des apolipoprotéines de jaune d’œuf, ces
élevée des oléosines est une propriété d’intérêt pour leur utilisation en tant qu’émulsifiants pour
stabiliser les aliments. Néanmoins, Barre et al. (2018) ont rapporté l’allergénicité des oléosines de
cacahuètes, noisettes et sésame, qui ont été identifiées et caractérisées comme étant des allergènes
84
CHAPITRE 1
lipophiles majeurs chez les individus sensibles. Leur utilisation comme émulsifiants ou agents
particulier dans les domaines cosmétique, pharmaceutique et alimentaire. Selon l'application, les
brevets déposés soulèvent notamment l'importance de l'élimination des contaminants tels que
d'autres protéines de l'OB pendant la purification, dans le but de réduire l'allergénicité, la couleur
Un schéma illustré est proposé Figure 16 pour résumer les principaux résultats et hypothèses
Figure 16 – Schéma récapitulatif de la dégradation enzymatique des oléosomes et des fragments de thylakoïdes dans
le compartiment gastrique et intestinal et de leurs effets biologiques subséquents.
85
CHAPITRE 1
86
CHAPITRE 2
CHAPITRE 2
TECHNIQUES EXPERIMENTALES
87
CHAPITRE 2
88
CHAPITRE 2
Ce chapitre est consacré à la description des techniques expérimentales générales utilisées pour la
extraits du végétal par les enzymes digestives humaines ou proches analogues. Les techniques et
biologique utilisé. Les méthodes générales de caractérisation chimique des systèmes étudiés,
réalisées dans leur intégralité au CIRAD de Montpellier, ont ensuite été décrites. La troisième
section de ce chapitre est dédiée à la description des outils biophysiques de l’Institut de Physique
caractérisation des films lipidiques à une interface air-eau, ces méthodes ont été utilisées afin
d’obtenir une compréhension des mécanismes mis en jeu dans la digestion des lipides à l’échelle
mésoscopique et moléculaire. Le quatrième chapitre décrit les méthodes utilisées afin d’étudier la
dégradation des assemblages dispersés de lipides (liposomes) par les enzymes digestives dans des
conditions statiques plus proches des conditions physiologiques de la digestion chez l’Homme.
89
CHAPITRE 2
I – Matériel biologique
90
CHAPITRE 2
91
CHAPITRE 2
II – Caractérisation chimique
Les lipides totaux des microalgues de Chlorella vulgaris Purasana et de Chlorella Sorokiniana
reyto ont été extraits par la méthode Folch (Folch, 1957). 5 mL d’eau ultrapure (UP), 40 mL de
solution Folch (CHCl3/MeOH, 2/1 v/v) ont été ajoutés aux matrices algales en poudre. La solution
a été mélangée grâce à un ultra-turrax (IKA, T18 digital) pendant 1 minute entre 9500 et 13500
rpm. Dans une ampoule à décanter, la solution a été lavée une fois avec une solution de NaCl à
0,73%, puis deux fois avec une solution contenant 40 mL de solution Folch et 10 mL d’une solution
de NaCl à 0,58%. La phase inférieure a été récoltée entre chaque lavage, et les solvants ont été
Les OB des noix et des amandes ont été isolés et purifiés par la méthode de Kapchie et al. (2011).
Les oléagineux ont été trempés puis rincés deux fois avec de l’eau (UP) puis broyés manuellement
à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Les échantillons réduits en poudre ont été mélangés avec de
l’eau UP (1/6 p/v) et dispersés à l’Ultraturax à 10 000 rpm pendant 5 min. Le mélange a été filtré
sur un tamis à 315 µm puis centrifugé (Beckman Coulter, Avanti JE) à 4000 g à 4°C. La crème
surnageante a été récoltée, lavée trois fois dans une solution tampon (0,1 M Tris-HCl, 4 M
saccharose, 0,5 M NaCl, pH 8,6, ratio 1:6 g/mL) et centrifugée à 4000 g à 4°C pendant 30 min. La
crème surnageante a été récoltée à chaque lavage, lavée deux fois dans l’eau UP (1/6, p/v), et
centrifugée à 4000 g à 4°C pendant 30 min. Les lipides polaires membranaires des OB ont ensuite
92
CHAPITRE 2
Les lipides ont été séparés après dépôt par migration unidimensionnelle sur des plaques de gel de
(Camag, Muttenz, Suisse) contrôlé par un logiciel Wincats (2008). L’élution a été réalisée en deux
temps : CHCl3/MeOH/eau UP (95/20/2.5 v/v/v) jusqu’à 40 mm, puis Hx/EE/AA (70/30/1 v/v/v)
jusqu’à 80 mm, en utilisant une chambre de développement automatique ADC 2 (Camag, Muttenz,
Suisse). Après migration, les plaques ont été trempées dans une solution de sulfate de cuivre à 15,9
% dans un mélange acide orthophosphorique/eau (92/8, v/v), puis scannées à 500 nm à l'aide d'un
scanner TLC 3 (Camag, Muttenz, Suisse). La détermination des classes de lipides a été réalisée en
utilisant des standards de TAG, DAG, MAG, MGDG, DGDG, MGMG, DGMG, DPPC, lysoPC,
AGL, phytostérols.
Les esters méthyliques d’acides gras (FAME) ont été obtenus par transestérification des lipides
extraits par la méthode Folch (Piombo et al., 2006). Les aliquots (5 µL) des extraits Folch méthylés
ont été analysés par chromatographie phase gazeuse (Focus GC, Thermo Electron Corporation,
Massachusetts, USA) équipée d’un split injecteur (ratio 1/20), d’une colonne capillaire CPCil 88
Varian (50 m × 0.25 mm avec un film de 0.2 μm d'épaisseur ; Chrompack, Middelburg, Pays-Bas),
et de l'hélium à 1 mL/min comme gaz porteur. Les FAME ont été analysés à l'aide d'un détecteur
augmenté de 150°C à 225°C à une vitesse de 5°C/min puis maintenue à 225°C pendant 10 min.
Les FAME ont été identifiés en utilisant un mélange d’esters méthyliques comme standard externe
93
CHAPITRE 2
(Mix 37, Sigma-aldrich, Saint Quentin en Yveline, France). Les températures de l'injecteur et du
sur une période de 20 jours. Les matrices étudiées ont été placées en tripliquât dans un incubateur
(KS4000i control, IKA), et un test de stockage a été mis en place dans des conditions d’oxydation
accélérée à 40°C et sous agitation à 110 rpm. Des prélèvements ont été effectués à J0, J1, J3, J6,
J9, J12, J15 et J20 afin de réaliser les analyses nécessaires au suivi de l’oxydation des lipides
L’indice de peroxyde (PV) est utilisé pour décrire l’état d’oxydation des graisses végétales ou
animales, exprimé en milliéquivalents d’oxygène réactif par kilogramme de matière grasse. Le test
utilisé pour déterminer la valeur de PV est basé sur la mesure de la concentration en oxygène lié
comme les hydroperoxydes, des espèces chimiques particulièrement instables (Shantha & Decker,
1994). Pour chacun des prélèvements, 250 µL d’échantillon ont été dilués dans 500 µL d’un
mélange MeOH/BuOH (3/1, v/v), puis mélangés au vortex pendant 10s. 30 µL ont ensuite été
placés dans une microplaque (UV-Star 96 puits, greinier bio-one) avec 230 µL de MeOH/BuOH
(3/1 v/v), 2,5 µL de solution de chlorure de fer, et 2,5 µL de thiocyanate d’ammonium (30%).
Après 10 minutes de réaction, l’absorbance a été mesurée à 532 nm par un lecteur de microplaque
94
CHAPITRE 2
secondaire de réaction de la peroxydation des AGPI, exprimé en mmol d’équivalent de MDA par
kg d’huile. Le MDA est produit par la dégradation d’un lipide peroxyde instable, dont la formation
a été décrite dans la partie II.1.1 du Chapitre 1 de ce manuscrit. En présence de deux molécules
d’acide thiobarbiturique (TBA), le MDA va réagir et conduire à la formation d’un complexe coloré
qui peut alors être quantifié (Dasgupta & Klein, 2014). Pour chacun des prélèvements, 50 µL
d’aliquot ont été mélangés à 50 µL d’eau UP et 200 µL d’une solution contenant 15% massique
mélange a ensuite été placé dans de l’eau à 90°C pendant 15 minutes puis dans de la glace pendant
mélange ont ensuite été introduits dans une microplaque et l’absorbance a été mesurée à 532 nm
Les monocouches lipidiques et leurs interactions avec les enzymes digestives ont été étudiées à
l’interface air/eau. Depuis le milieu du 20ème siècle, les monocouches lipidiques sont utilisées pour
mimer un des feuillets de la membrane lipidique, organisée en bicouche, des cellules biologiques.
Elles constituent un système plan très bien défini, parfaitement adapté à l’étude des interactions
intermoléculaires au sein des membranes lipidiques, ainsi que des interactions lipides-protéines
(Botet-Carreras et al., 2019; Sarkis & Vié, 2020). Expérimentalement, la formation de ces films
monomoléculaires à l’interface air/eau est réalisée grâce à l’utilisation d’une cuve dite de
Langmuir. Ce système est équipé de barrières coulissantes, permettant de travailler dans des
95
CHAPITRE 2
conditions de température et de pression de surface contrôlées. Une pression de surface située entre
d’équivalence entre les monocouches interfaciales et les membranes cellulaires naturelles dans le
Irving Langmuir est un chimiste et physicien américain dont les recherches sur les films
moléculaires lui ont permis d’obtenir un prix Nobel de Chimie en 1932 (Blodgett, 1935; Blodgett
& Langmuir, 1937). Pour former un film de Langmuir, la première étape consiste à déposer des
lipides à la surface de la cuve grâce à une seringue de haute précision Hamilton (Figure 17).
Figure 17 - Principe de la cuve de Langmuir et organisation d’une monocouche de lipides à l'interface air/eau.
De par leur nature amphiphile, ces molécules s’organisent spontanément à la surface du liquide,
laissant le solvant s’évaporer. Les têtes polaires hydrophiles développent des interactions
favorables avec la sous-phase, tandis que les chaînes aliphatiques s’orientent vers l’air, formant
ainsi une couche monomoléculaire à l’interface air/liquide. Les barrières mobiles vont permettre la
maîtrise de l’aire disponible aux molécules interfaciales. La cuve est également équipée d’un
système de transfert du film interfacial sur support solide appelé transfert de Langmuir-Blodgett,
96
CHAPITRE 2
et développé par M. Blodgett lors de ces travaux avec I. Langmuir. Plusieurs techniques
III.1 – Tensiométrie
Le phénomène de tension de surface a été décrit pour la première fois en 1916 par I. Langmuir au
congrès de l’American Physical Society à Cleveland. Les résultats de ses travaux sur des films
d’huile à la surface de l’eau lui ont permis de proposer une théorie selon laquelle « la structure de
la couche superficielle des atomes est considérée comme le facteur principal déterminant la tension
de surface d’un liquide » (Langmuir, 1917). Cette théorie stipule que les molécules présentes dans
un liquide organique s’autoorganisent de telle façon que la partie de leur structure de plus forte
énergie s’oriente vers la solution aqueuse, tandis que la partie possédant une charge énergétique
plus faible vient former une couche superficielle à l’interface air/eau. Ainsi, les molécules formant
minimale.
La méthode de Wilhelmy (Wu et al., 1999) est utilisée dans nos expériences pour suivre en temps
réel, et donc tout au long des cinétiques, le paramètre que l’on appelle la pression interfaciale. Cette
pression correspond à la différence entre la tension de surface de l’eau pure (0= 72,8 mN/m à
20°C), et celle du film interfacial (1). Notée (ou PI, en mN/m), elle est obtenue grâce à une
l’interface air/eau, exercée sur une lame rectangulaire en papier filtre en contact avec l’interface
97
CHAPITRE 2
() = 0 –
molécule diminue, la différence entre la tension de surface de l’eau pure et la tension de surface
couverte par le film de molécules devient alors de plus en plus importante. Cela se traduit par une
reliée aux interactions entre les molécules présentes à l’interface : plus les molécules interagissent,
et plus la pression augmente. Au contraire, si la pression diminue, cela traduit une baisse
d’interactions entre les molécules à l’interface air/eau, qui peut être induite par une perte de matière
à l’interface, une distance trop importante, ou encore des interactions non-favorables entre les
molécules.
98
CHAPITRE 2
l’aire interfaciale (déplacement des barrières). Le film monomoléculaire peut transiter par plusieurs
phases physiques. A une faible pression de surface, l’aire moléculaire occupée par les lipides est
grande, et la monocouche se trouve dans un état gazeux (G). En diminuant l’aire disponible, les
interactions entre les lipides se font plus importantes, la pression augmente, et la monocouche
transite alors vers un état liquide expansé (LE), puis vers une phase appelée liquide condensé (LC)
phases.
ayant des propriétés d’organisation importantes à des valeurs élevées de pression de surface. A
99
CHAPITRE 2
partir d’une certaine pression de surface, la monocouche ne peut plus être comprimée, ce qui
signifie qu’elle a atteint sa limite de compressibilité. Si cette pression de surface limite est dépassée,
pas être mise en œuvre in situ, et nécessite de prélever l’interface. A cet effet, la technique de
prélèvement se présente sous la forme d’une pince permettant la fixation du substrat, et dont le
déplacement est piloté à distance via le logiciel dédié sur le poste fixe.
La nature du substrat solide dépend du type de molécule ainsi que des techniques de caractérisation
nécessitant son utilisation. Dans nos travaux, un substrat hydrophile a été utilisé : le mica. Ce
minerai est caractérisé par sa structure en feuillets (phyllosilicates), faciles à séparer les uns des
autres par simple clivage de sa surface. Le mica clivé possède la plus faible rugosité de surface
100
CHAPITRE 2
III.2 – Ellipsométrie
III.2.1 – Principe
L’éllipsométrie est une méthode d’analyse non-destructive qui se base sur la mesure des
changements de polarisation d’un faisceau lumineux lorsque celui est réfléchi sur une interface
solide ou liquide. Dans nos expériences, l’ellipsométrie est utilisée dans une configuration « à
annulation », ce qui permet de caractériser des monocouches plus fines qu’une longueur d’onde
perpendiculairement (p) et parallèlement (s) au plan d’incidence avant et après réflexion (Azzam
et al., 1978). L’angle ellipsométrique dépend des propriétés optiques de l’interface à travers son
indice de réfraction et son épaisseur. Dans le cas d’une interface liquide, et dans le but de suivre
les changements interfaciaux induits par la présence de lipides et/ou de protéines, la référence est
l’eau (ou le tampon) contenu(e) dans la cuve, et le montage est calibré pour obtenir une valeur de
0 à l’interface air/eau pure (Bénarouche et al., 2017; Berge & Renault, 1993).
Le dispositif expérimental est décrit Figure 21. Un faisceau laser He-Ne (=632,8 nm) polarisé
linéairement (polariseur Glan-Thompson, P, Melles Griot) est envoyé sur la surface de la cuve de
Langmuir avec un angle d’incidence de 52,12°, correspondant à l’angle de Brewster moins 1°.
Après réflexion sur la surface liquide, le rayon lumineux a une polarisation elliptique, avant de
passer par une lame quart d’onde (/4), permettant ainsi d’obtenir une polarisation à nouveau
101
CHAPITRE 2
linéaire. Le rayon traverse ensuite un analyseur (A), et est détecté par un photomultiplicateur (PM).
La valeur de l’angle ellipsométrique () est obtenue comme le double de la valeur de l’angle de
de la lumière réfléchie. Elle est particulièrement sensible à toute variation de l’indice de réfraction
et de l’épaisseur de la couche interfaciale, et permet d’obtenir des valeurs avec une incertitude de
± 0.5°. Le faisceau laser éclaire une surface de 1 mm² et est impacté par les modifications
Le microscope à force atomique a été inventé en 1985 par Gerd Binnig, Christoph Gerber et Calvin
F. Quate (Binnig et al., 1986). Cet outil permet d’obtenir la topographie à haute résolution de
surfaces planes sur lesquelles sont absorbés des substrats d’intérêt, et peut notamment être appliqué
à l’étude in situ des membranes biologiques (Balashev et al., 2001, 2007). Ici, l’AFM a été utilisée
pour visualiser la surface des échantillons prélevés sur plaque de mica grâce à la méthode de
102
CHAPITRE 2
III.3.1 – Principe
Figure 22 - Principe de fonctionnement et éléments composant un microscope à force atomique. Adapté de CC BY-
NC 2.0 FR.
Le microscope à force atomique permet d’analyser une surface pour en donner sa topographie. Un
levier flexible équipé d’une pointe nanométrique scanne la surface point par point, grâce à un
assemblage de tubes piézoélectriques permettant de déplacer l’échantillon dans les trois directions
de l’espace (Figure 22). Le principe de l’AFM est basé sur la mesure des interactions attractives
et répulsives entre les atomes de la pointe et ceux composant la surface de l’échantillon, ce qui va
induire une déflexion du levier. Les flexions du levier sont suivies par l’intermédiaire d’un faisceau
laser qui se réfléchit sur la surface du levier vers un détecteur (4 quadrants). Sa position sur le
détecteur permettra d’obtenir des informations sur les variations de topographie de l’échantillon,
103
CHAPITRE 2
L’AFM (Multimode Nanoscope 8, Bruker, France) a été utilisé en mode QNM (Quantitative
Nanomechanical Mapping) in air. Dans ce mode, l’échantillon vibre à une certaine amplitude, qui
est réajustée en temps réel par le suivi des courbes d’approche-retrait. Ainsi, la pointe n'est en
contact avec l’échantillon que par intermittence. Par un contrôle des forces point par point, ce mode
AFM obtenues à haute résolution permettent de visualiser la surface topographique des échantillons
à l’échelle nanométrique. Pour toutes les expériences, une pointe standard en silicone a été utilisée
Les images enregistrées ont une taille de 512 pixels par 512 pixels. Sur l’image « hauteur »,
Gwyddion a été utilisé pour traiter l’intégralité des images « hauteur » obtenues dans cette étude
(flatten, étalement de l’échelle de couleur). L’échelle de couleur a notamment été utilisée pour
permettre de visualiser la topographie de surface des échantillons. Ainsi, pour chaque image AFM
104
CHAPITRE 2
présentée dans ce manuscrit, la couleur la plus foncée correspond au niveau le plus bas de la
surface, tandis que, réciproquement, la couleur la plus claire correspond au niveau le plus élevé
(Figure 23).
Les liposomes, dont la structure est décrite Figure 24, sont des vésicules sphériques artificielles
formées par une bicouche lipidique concentrique hydrophobe enfermant un compartiment aqueux
en son centre (Deshpande et al., 2016). Leur taille peut varier de 10 nm à plusieurs micromètres
(Akhavan et al., 2018). Leur première découverte remonte à l’année 1965, lors de l’observation au
britannique Alec D. Bangham. Les liposomes ont dès lors été utilisés en tant que modèles
membranaires en raison de leurs propriétés proches des bicouches composant les membranes
105
CHAPITRE 2
cellulaires. A partir de 1971, la capacité des liposomes à encapsuler des médicaments a également
été soulignée (Liu et al., 2020). Aujourd’hui, les liposomes ont trouvé des applications dans de
amphiphiles (par exemple des phospholipides, galactolipides, etc..) dans un milieu aqueux après
formation d’un film lipidique mince. Cette méthode de dispersion est l’une des plus utilisées, et
consiste à dissoudre le matériel lipidique dans un solvant organique. Après évaporation du solvant
organique sous atmosphère inerte, un film mince de lipides se forme, puis, lors de l’ajout d’une
solution aqueuse, les lipides se dispersent après auto-assemblage, conduisant à des structures
une organisation des chaînes acyles des lipides de telle façon à former un compartiment
hydrophobe, tandis que les résidus polaires vont s’orienter vers le milieu aqueux, formant ainsi une
bicouche concentrique. Des interactions de van der Waals et des liaisons hydrogènes entre les
lipides et les molécules d’eau vont également participer à l’organisation en bicouche des molécules
amphiphiles (Islam Shishir et al., 2019). Ces structures sont alors extrudées pour obtenir des
extrudés à 1 µm (ou GUV – Giant Unilamellar Vesicles), par les enzymes digestives humaines,
106
CHAPITRE 2
Les liposomes ont été préparés à partir des mélanges lipidiques modèles, ainsi qu’à partir des
Pour chaque système étudié, 400 µL de mélange lipidique ont été préparés à 5 mg/mL, puis
évaporés à 45°C dans un petit ballon. Après évaporation, 2 mL de tampon Tris-HCl et 2 billes de
verre ont été ajoutés pour faciliter la dispersion. Les solutions ont ensuite été mélangées pendant 2
min au vortex, puis chauffées à 55°C pendant 1 min, refroidies dans la glace pendant 1 min puis
mélangées à nouveau pendant 30 s. Ces étapes ont été répétées 10 fois pour obtenir des vésicules
multilamellaires. Les vésicules ont ensuite été extrudées 10 fois (extrudeur Avanti Polar Lipids,
Alabama, USA) sur une membrane de 1 µm en utilisant des seringues de 500 µL afin d’obtenir les
vésicules unilamellaires.
La dégradation intestinale des liposomes des systèmes lipidiques modèles et des extraits de
microalgues chlorelle a été étudiée dans des conditions homogènes en présence de sels biliaires.
Les liposomes ont été incubés dans un tampon Tris HCl (10 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2,
CMC). Dans le cas de la gPLRP2, des aliquots de 100 µL ont été prélevés après 5 minutes (T5min)
d’incubation, tandis qu’avec la sPLA2-IB, les prélèvements ont été réalisés après 60 minutes
(T60min). A partir de ces prélèvements, les substrats lipidiques initiaux (témoin, T0) et les produits
de lipolyses (après incubation avec les enzymes), ont été extraits par méthode Folch et analysés en
107
CHAPITRE 2
CCM (cf. chp II.2 mais un solvant de migration différent : CHCl3/MeOH/H2O, 95/20/2,5 v/v/v)
pour déterminer leur concentration. Il a ainsi été possible de suivre l’activité enzymatique
108
CHAPITRE 3
CHAPITRE 3
ASSEMBLAGES ET SYSTÈMES
VÉGÉTAUX
109
CHAPITRE 3
110
CHAPITRE 3
111
CHAPITRE 3
Ce chapitre est dédié à la présentation des résultats de caractérisation initiale des mélanges
lipidiques modèles et extraits des matrices naturelles, ainsi que des assemblages naturels isolés.
Trois systèmes modèles ont tout d’abord été étudiés, afin de caractériser leur comportement de
constituants sur la structure globale des mélanges et sur leur miscibilité a notamment été
déterminée, et a fait l’objet d’un article dans le journal Colloids and Surface B : Biointerfaces,
publié en 2022.
Les lipides extraits des matrices naturelles (microalgues chlorelles versus membranes d’OB de noix
Enfin, les deux objets microniques du végétal (chloroplastes versus OB) ont été caractérisés sous
leur forme d’assemblage natif, afin de déterminer leur stabilité à l’oxydation et leurs propriétés
des OB de noix en fonction de leur ultrastructure (peu transformé versus en appliquant des procédés
Ces résultats ont été déterminés afin de servir de base à la compréhension des interactions lipides-
112
CHAPITRE 3
Name(s) of Author(s) Jeanne Kergomard1,2, Frédéric Carrière3, Gilles Paboeuf1, Franck Artzner1,
ABSTRACT
The structural behavior of model assemblies composed of monogalactosyldiacylglycerol (MGDG)
and digalactosyldiacylglycerol (DGDG), the two main galactolipids found in plants, was
investigated at the air/water interface and in aqueous dispersion. To approach the composition of
the natural photosynthetic membranes, tunable Langmuir model membrane of galactolipids were
used, and were complexified to form either heterogenous binary or ternary assemblies of
properties of galactolipid membrane was studied. The nature of the interactions between the
tensiometry, atomic force microscopy). In addition, the phase behavior was determined by SAXS
Results revealed the good interfacial stability of these specific plant membrane lipids. The
morphology of the galactolipid film was characteristic of a fluid phase, with an interfacial
roughness induced by the intercalation of monogalactosyl and digalactosyl polar heads of MGDG
113
CHAPITRE 3
and DGDG, respectively. A phase heterogeneity in the monolayer was induced by the addition of
DPPC and/or pS, which resulted in the modification of galactolipid organization and headgroup
interactions. These structural changes were confirmed by SAXS analysis, showing more favorable
interactions between MGDG and DPPC than between DGDG and DPPC in aqueous dispersion.
1 INTRODUCTION
Galactolipids are the most abundant polar lipids found in higher plants. These glycolipids are
actively involved in the structuration of the plant membranes and are particularly concentrated in
the photosynthetic chloroplast membranes (80% wt. of total non-pigmented lipids), which contain
(DGDG, 27% wt.) (Gurevich et al., 1997). MGDG possess a small 1--galactose polar head bound
to a diacylglycerol, giving it a conical shape, which can induce curvatures in lamellar phases (Lee,
2000). On the other hand, DGDG has a larger polar head with an additional -galactose, linked to
-galactose (Mizusawa & Wada, 2012) and adopts a cylindrical shape in solution. Both
galactolipids possess two esterified acyl chains at the sn-1 and sn-2 position of the glycerol
Due to their different structure, MGDG and DGDG exhibit distinct phase behaviors, which
govern the overall membrane architecture (Fig. 1). Indeed, studies on the phase behavior of
galactolipids have shown that DGDG forms lamellar phases (L) and induces bilayer formation,
whereas unsaturated MGDG tends to form inverted hexagonal structures (HII) in aqueous solution
114
CHAPITRE 3
galactolipids are of nutritional interest since they are rich in polyunsaturated fatty acids (PUFA),
and their consumption provides essential 3 fatty acids (Sahaka et al., 2020).
Phytosterols are also among the major compounds of photosynthetic plant membranes
where they play crucial roles in regulating the physical properties of membranes (Evans, 1991;
Ostlund, 2002). More than 250 species of phytosterols have been reported, the most abundant being
-sitosterol (70% wt.), stigmasterol (20% wt.) and campesterol (5% wt.) (Evans, 1991). These
phytosterols in their free form participate in the structuration of membranes by stabilizing polar
lipid bilayers, although to a lesser extent than their cholesterol counterpart in animal cell
membranes (Moreau et al., 2002). Beyond their structural properties, phytosterols are also
compounds of nutritional and medical importance. Their consumption from fruits and vegetables
has been shown to lower the total cholesterol and LDL levels in plasma in humans (St-Onge &
Jones, 2003). The interesting structural and nutritional properties of galactolipids and phytosterols
115
CHAPITRE 3
have raised interest in their use in various applications, which requires a deep understanding of the
The monolayer behavior of saturated galactolipids has already been extensively studied at
the air/water interface (Hoyo et al., 2016; Tomoaia-Cotişel et al., 1989). Nevertheless, it should be
noted that galactolipid acyl chains in higher plants are mostly polyunsaturated, and thus less stable
since they are more susceptible to oxidation (Tomoala-Cotişel et al., 1983). Monolayer studies have
also been performed on galactolipid mixtures with unsaturation indices greater than 1, highlighting
the differences in interfacial behavior between saturated and unsaturated galactolipids. Using
Langmuir films, Bottier et al. (2007) studied the interfacial behavior of galactolipids from different
wheat tissues and highlighted the miscibility of MGDG and DGDG in water but also their tendency
to phase separation in mixture. Overall, interface organization and packing were governed by
interactions between the sugar polar heads of galactolipids (Bishop et al., 1980), but also depended
The impact of plant sterols in polar lipid bilayers has already been studied extensively,
showing that they alter phase transitions and membrane fluidity (Itzhaki et al., 1990; McKersie &
Thompson, 1979), depending on their chemical structure and concentration (Kamal &
(DPPC) have also been studied in model Langmuir films at the air/water interface, and the
incorporation of -sitosterol and stigmasterol into phospholipid monolayers has been shown to
increase their packing (Su et al., 2007). Nevertheless, to the best of our knowledge, few results are
116
CHAPITRE 3
The interfacial properties of MGDG and DGDG, as well as their modulation by DPPC
and/or phytosterols in mixed Langmuir monolayers at the air/water interface were studied by
ellipsometry, tensiometry and atomic force microscopy (AFM). The phase behavior and physical
properties of these mixtures in hydrated mesophases were also studied by small angle X-ray
scattering (SAXS).
2 EXPERIMENTAL SECTION
2.1 Lipids
1,2-dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and
digalactosyldiacylglycerol (DGDG) were purchased from Avanti Polar Lipids (see Table S1 in the
supplementary material for the fatty acid repartition). Canola phytosterols were a gift from Cognis
France (Estarac, France) obtained from desodorization distillates of canola oil. Typical molar
composition (calculated from usual normalized GC procedures) was: β-sitosterol (50 mol%),
Monolayer composition
Simple binary mixture of MGDG and DGDG (60:40, mol/mol) was prepared, namely GL. Ternary
and quaternary mixtures of glycerophospholipids, galactolipids and phytosterols (see Table 1 for
117
CHAPITRE 3
relative molar composition) were prepared to add some phase heterogeneity and to mimic the
All reported experiments were performed at least in duplicate, using a computer controlled and
equipped with two mobile barriers, allowing to vary the surface. Before each experiment, the
trough was carefully cleaned with ultrapure water and ethanol to get rid of the surface-active
residual impurities. The surface pressure was measured using a Wilhelmy balance connected to a
microelectronic feedback system (Nima Technology, Cambridge, UK). The values of surface
pressure () were recorded every 15 s with a precision of 0.2 mN/m. A home-made automated
ellipsometer in a “null ellipsometer” configuration was used to carry out the ellipsometric angle
() measurement (Berge & Renault, 1993). The laser beam probed a surface of 1 mm2 and a depth
of 1 µm and allowed the qualitative monitoring of the thickness of the lipid monolayer formed at
the air/water interface. Values of were recorded every 15 s with a precision of ± 0.5 °.
For all the characterizations, the aqueous phase was composed of a 10 mM Tris HCl buffer solution
few microliters of 1 mM solution of lipids in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at the air/water interface
using a Hamilton microliter syringe. The surface area of the Langmuir trough was set at 35 cm²
and the lipids were deposited up to a surface pressure of 20 mN/m. The film was then equilibrated
for 10 minutes before each measurement, allowing the evaporation of solvent and lipid organization
at the air/water interface. After 10 minutes equilibrium, the interfacial film was transferred onto a
118
CHAPITRE 3
freshly cleaved mica plate, using the Langmuir Blodgett method (lipid-transfer ratio ~ 1.0). All
lipid layers were sampled at a very low speed (0.5 mm.min-1) by raising vertically the mica plate
through the air/water interface. The surface pressure was kept constant during the sampling to
maintain the lateral organization of lipids and thus avoid desorption phenomena and interfacial
disorganization.
The surface area of the Langmuir trough was set at 77 cm² before compression. Few microliters of
1 mM solution of lipids in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) were spread at the interface until the pressure
reaches 0.1 mN/m. The surface pressure as a function the surface area of the trough (-A isotherm)
was then recorded upon a symmetrical compression of the lipid monolayer using the two barriers,
from 77 cm² to 21 cm², until the collapse of the film. The barrier speed was set at 5 mm²/min.
Compression isotherms allow to obtain several parameters on the behavior of monolayers under
compression. The minimum molecular area corresponds to the mean molecular area occupied by
the molecules at the collapse of the film and was calculated as the intercept value between the
pressure plateau at collapse and the tangent at the end of the -A isotherm. The lift-off area was
determined as the mean molecular area occupied by the molecules when the pressure begins to
increase under compression. Finally, the monolayer compressibility was obtained from the first
derivate of -A isotherm and the mean molecular area of lipids deposited at the interface (Gaines
& Prigogine, 1966; Smaby et al., 1997). The equation (1) was used to determine the compressibility
1 𝑑𝐴
(1) 𝐶𝑠 = − ×
𝐴 𝑑𝜋
119
CHAPITRE 3
where is the surface pressure and A is the mean molecular area of the lipids forming the
monolayer, estimated from the surface of the trough and the amounts of lipids deposited. The
reciprocal of compressibility coefficient, the compressibility modulus, i.e., Cs-1 was represented as
a function of the mean molecular area (Ų/molecules). Cs-1 values were obtained at equally spaced
2.4. Topographic visualization of the monolayer interface using atomic force microscopy
Imaging of the films transferred to mica plates was carried out using an AFM (Multimode
air, 20°C) was used in all the experiments. This mode provides high-resolution AFM images of the
sample nanoscale surface topography, as well as the modulus and adhesion, at an acquisition speed
comparable to the tapping mode. A standard silicon cantilever was used (0.06 N/m, SNL-10,
Bruker, France), and the scan rate was set at 1 Hz. The force was minimized during all scans and
the scanner size was 100×100 µm². The processed images analyzed by the open-source platform
Gwyddion are representative of at least duplicated experiments. The differences of height of the
LC and LE domains were assessed by the plot of height profile based on three cross-sections of the
image using the software Gwyddion (2.55). For all AFM images, the color scale covers a height
range of 15 nm, with the darkest color corresponding to the lowest domains and the lightest color
to the highest domains, the fluid background corresponding to zero. A color scale is provided in
120
CHAPITRE 3
2.5. Determination of the phase behavior of the model lipid mixture in aqueous dispersions
by SAXS
The phase behavior of the model lipid mixture was investigated in aqueous dispersions using X-
ray scattering with a homemade set-up at the Rennes Physique Institute. The X-ray scattering
results were collected with a Pilatus 300 K (Dectris, Switzerland), mounted on a microsource X-
ray generator GeniX 3D (Xenocs, France) operating at 30 W. The monochromatic CuKa radiation
was of l = 1.541 Å. The X-ray diffraction patterns were recorded in a reciprocal space q = (4.
sin)/ from repetitive distances q=0.012 to 1.742 Å-1. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) and
Wide-Angle X-ray Scattering (WAXS) regions were used to determine the supramolecular
organization (long range order) of the lipid/water systems and the packing of acyl chains (short
range order), respectively. The samples were prepared by evaporation of the solvent containing the
solubilized lipids and then hydration at 5% wt of the lipid films in a Tris buffer solution pH 7 (0.5
mg of lipids hydrated in 10 µL of Tris buffer). The samples were then introduced in thin calibrated
quartz capillaries (Ø 1.5 mm, GLAS W. Muller, Berlin, Germany) before being centrifuged and
sealed with candle wax. For the analysis, they have been introduced in a capillary holder
checked at two y-positions. The analyses were carried out following a heating and cooling
temperature ramp from 12 °C to 42 °C and 42 °C to 12 °C, respectively, every 8°C with an exposure
time per point of 10 minutes. The results were collected by a homemade program and the positions
of Bragg reflections were determined by the Igor Pro 7.0 software (Wavemetrics, US).
121
CHAPITRE 3
3.1 Study of the compression isotherms -A of the GLx/pSy systems – influence of the pS
concentration
Figure 2 Compression isotherms of 1) GL (red), 2) GL95/pS5 (deep blue), 3) GL90/pS10 (green), 4) GL70/pS30 (black)
monolayers at the air/water interface. A) The graph corresponds to the evolution of (mN/m) as a function of the mean
molecular area (Ų/molecules). B) The graph corresponds to the evolution of the surface compressibility moduli (Cs-1,
calculated following the equation (1)), as a function of (mN/m) of 1), 2), 3) and 4). C) The graph corresponds to the
evolution of (mN/m) as a function of the mean molecular area (Ų/molecules) of the pure pS system. D) The graph
corresponds to the mean molecular area (Ų/molecules) at 20 mN/m of each monolayer as a function of the percentage
of pS in the systems (pure pS monolayer in light blue). The experiments were performed using Tris HCl buffer at pH
7 and were done in duplicate. Values of were given with a standard deviation on duplicate measurements of ± 0.2
mN/m.
122
CHAPITRE 3
The absence of shoulder and/or inflection point on the compression isotherm of the GL
mixture (Fig. 2.A) was characteristic of a homogeneous liquid-expanded (LE) single phase, which
could be explained by the high unsaturation content of the mixture. Indeed, the unsaturations
decreased the intensity of van der Walls interactions between the acyl chains, and could hinder the
establishment of a tight packing between galactolipid molecules in the monolayer. The isotherm of
the GL film indicated a lift-off area at around 230.8 ± 1.8 Ų/molecule (2.3 nm²/molecule) and
showed a regular increase of the surface pressure until the collapse of the film at =39.9 ± 0.2
mN/m and at a limiting area of 81.0 ± 0.6 Ų/molecule (0.8 nm²/molecule). The evolution of the -
A isotherm of the GL film was consistent with the study of Bottier et al. (2007) on purified wheat
MGDG and DGDG monolayers, pure or in mixture. Nevertheless, a higher collapse pressure of 47
mN/m had been obtained for the less unsaturated wheat MGDG/DGDG equimolar mixture, at a
lower mean molecular area of 70 Ų/molecule (0.7 nm²/molecule). This result was not surprising,
as unsaturated acyl chains cannot adopt a very tight packing, which explains a larger average
molecular area and a lower surface pressure at collapse as the number of unsaturation increases.
The presence of unsaturations in the alkyl chains could also explains the significantly lower Cs-
1
max which was obtain for the GL monolayer in our study (Fig. 2.B) compared to the Cs -1max
reported by Hoyo et al. (2016) on the 2:1 mixture of saturated galactolipids (48 versus 247 mN/m
respectively). These values were determined for pressure values of interest, between 30 and 40
mN/m, =35 mN/m having been proposed as the equivalence surface pressure between lipid
monolayers and cellular bilayers (Marsh, 1996, 2007). This decrease in Cs-1max with increasing
unsaturation number had also been reported by Gzyl-Malcher, Filek, Makyła, et al. (2008),
reflecting the higher lateral elasticity of unsaturated monolayers compared to the saturated ones.
123
CHAPITRE 3
The addition of pS in the GL mixture did not significantly impact the surface pressure at
the collapse of the film (Fig. 2.A). The addition of 5 and 10 mol% pS to the GL mixture did not
significantly impact the limiting area. In contrast, the limiting area was affected by the addition of
30 mol% of pS and shifted from 81.0 ± 0.6 to 66.1 ± 0.5 Ų/molecule (0.8 to 0.7 nm²/molecule).
The inclusion of pS has also significantly altered the Cs-1max of the monolayers (Fig. 2.B.,
logarithmic scale), and this effect was particularly marked in the presence of 30 mol% of pS in the
GL mixture. Indeed, a Cs-1max of 85.7 mN/m was reached for the GL70/pS30 blend, compared to
72.8 mN/m for the GL90/pS10 and GL95/pS5 blends and 48.0 mN/m for the pure GL system. The
greater impact of phytosterols for a content of 0.3 mol% on the compressibility of the monolayer
was consistent with the results presented in Figure 2.D. Indeed, the phase diagram showed a non-
ideal behavior of the GL and pS blends, and this effect was even more noticeable for a molar
concentration of pS of 30% in the system. The reduction of the mean molecular area at collapse
and the increase of Cs-1max with the increase of pS concentration could be attributed either to the
condensation of the unsaturated acyl chains or to the reorientation of the sugar polar heads, induced
by the presence of the pS molecules, thus decreasing the lateral elasticity of the monolayers (X.-
M. Li et al., 2001). Indeed, the presence of a largely hydrophobic small molecule such as pS will
also impact the tilt of the polar heads, which will increase the possibility of packing of the
molecules, explaining the non-ideal behavior observed in the case of unsaturated GL monolayers.
Nevertheless, the animal counterpart of pS, the cholesterol, was shown to establish weaker
interactions with unsaturated lipids, in comparison with saturated lipids (Silvius, 2003), so the
addition of DPPC in the mixtures could drastically alter the phenomena observed in GL-pS
124
CHAPITRE 3
3.2 Influence of GL, DPPC, and pS interfacial composition on collapse pressure and
Ellipsometry combined with tensiometry were used on Langmuir trough to determine the
values of surface pressure (, mN/m), ellipsometric angle (, °) and limiting molecular area
(Ų/molecule) at the collapse of mixed heterogenous films with various compositions in GL, DPPC
and pS. The values of and at the collapse of the films are presented in Table 2.
Table 2 - Values of (mN/m), (°) and limiting molecular area (Ų/molecule) at the collapse of mixed GL,
DPPC and pS monolayers
± stands for calculated standard deviation on duplicated measurement; for , since the
error.
The addition of 10 mol% of pS in the GL mixture has induced a clear increase in the film
thickness at collapse (8.2 versus 7.3 ± 0.5° for the GL90/pS10 versus GL mixture, respectively),
while there was no significant change in collapse pressure, neither in the limiting area. These results
tend to indicate that the inclusion of the pS only impacted the orientation of the GL sugar polar
125
CHAPITRE 3
The addition of 50 mol% DPPC in the GL mixture led to an increase of the collapse surface
pressure to =44.1 ± 0.2 mN/m (versus 39.9 ± 0.2 mN/m for the GL monolayer) as well as a shift
in the mean molecular area at collapse to 60.4 ± 1.0 Ų/molecules (0.6 nm²/molecule), versus 81.0
± 0.6 Ų/molecule (0.8 nm²/molecule) for the GL monolayer. These results indicated a strong
condensing effect of DPPC, which could be explained by the presence of saturated acyl chains and
smaller polar head of DPPC, which decreased the steric hindrance. An increase in the film thickness
at collapse induced by the presence of DPPC was also observed (=8.9° vs 7.30° for the GL film),
suggesting a reorientation of the sugar polar heads of GL, as well as the formation of condensed
The addition of phytosterols at 10 mol% in the GL/DPPC film did not induce a significant
variation of the collapse pressure (44.4 ± 0.2 mN/m versus 44.1 mN/m for the GL/DPPC) but
triggered a shift of the limiting molecular area from 60.4 ± 1.0 to 55.0 ± 1.7 Ų/molecule (0.6 to
0.5 nm²/molecule), indicating an increase of the packing in the mixture in presence of pS. This
decrease in the limiting area was not expected, given that pS probably interacts preferentially with
DPPC than with PUFA-containing GL. Indeed, Botet-Carreras et al. (2019) have studied the impact
confirming that the effect of cholesterol on unsaturated PL was weaker than the one exerted on
saturated PL. Additionally, a variety of biophysical measurements have revealed that sterols have
an aversion to PUFA (Huster et al., 1998; Niu & Litman, 2002; Pitman et al., 2004; Wassall et al.,
2004), explaining the lower impact of pS in the presence of GL in the GL90/pS10 mixture, which
contain a significant amount of PUFA. One possible explanation for such aversion of sterols for
PUFA is the high disorder of PUFA acyl chains, which is incompatible with the usual orientation
of cholesterol vertically with respect to interface plane. Thus, one can expect a change in the
126
CHAPITRE 3
orientation of the sterol backbone (Harroun et al., 2006). Additionally, cholesterol has already been
shown to induce order in lipids in fluid phase, whereas it has the opposite effect on lipids present
in gel phase (Garcia-Manyes et al., 2010). Given these general effects of sterols and their aversion
condensation effect of GL polyunsaturated lipid chains, and thus a larger limiting area for the
decrease in the limiting area of the mixture in the presence of pS, it is likely that the addition of pS
induced GL organization in the presence of DPPC, raising the question of a potential miscibility
between DPPC and MGDG and/or DGDG in the presence of pS, reflecting a more complex
mixture.
The thickness of the three model systems was determined by ellipsometry at a surface
pressure of 20 mN/m. The detailed molar compositions are given in Table 1. The values of
ellipsometric angles obtained at 20 mN/m are presented in Table 3. Eight sub-model systems were
also prepared to give a better understanding of the organization and interactions between polar
lipids at the air/water interface (see supplementary data S1 for the detailed molar compositions and
An ellipsometric angle of 7.5° was obtained for the mixed GL monolayer at 20 mN/m.,
which was identical to the value obtained with DGDG alone and higher than the value for MGDG
(7.5 and 6.3 ± 0.5° respectively). This result was expected as the DGDG lipid film has already been
127
CHAPITRE 3
The addition of DPPC to GL at a molar fraction of 0.5 did not induce a significant variation
in the thickness at 20 mN/m. This result was consistent with the data obtained with the sub-model
systems MGDG50/DPPC50 and DGDG50/DPPC50 (6.3 and 7.4 ± 0.5°, respectively), in which the
addition of DPPC did not induce a significant variation of the ellipsometric angle at 20 mN/m.
Table 3 - Ellipsometric angle values of the lipid films at a surface pressure of 20 mN/m at the air/water
interface
The addition of pS to the mixed model system of GL and DPPC, at a molar content of 10%,
led to a slight decrease of the ellipsometric angle at 20 mN/m, but it was not significant. By
DGDG45/DPPC45/pS10 sub-model systems (5.5 and 6.0 ± 0.5°, respectively), compared to the
MGDG50/DPPC50 and DGDG50/DPPC50 systems (6.3 and 7.4 ± 0.5°, respectively). However, no
significant variation in thickness was obtained for the sub-models MGDG90/pS10 and
128
CHAPITRE 3
DGDG90/pS10, in comparison with the pure MGDG and DGDG systems. These results tend to
indicate different interactions of pS with GL-DPPC mixed films and pure MGDG and DGDG.
In order to better understand the differences in the organization of the different models and
sub-models, atomic force microscopy was used to visualize the interface of the films obtained by
3.4 Nanoscale topographic visualization of interfacial films at 20 mN/m using atomic force
microscopy
Figure 3 5×5 µm² and 1×1 µm² AFM topographic images of A) GL, B) GL50/DPPC50, and C) GL45/DPPC45/pS10 model
monolayers. The height profiles were performed on a cross-section of the 1×1 µm² image. The Langmuir films were
transferred at a surface pressure of 20 ± 0.5 mN/m on a mica plate using the Langmuir Blodgett method. Experiments
were performed in a Tris HCl buffer at pH 7 and done in duplicate.
129
CHAPITRE 3
Figure 3 shows AFM images of the interfacial organization of the three main model
monolayers GL, GL50/DPPC50, and GL45/DPPC45/pS10 after their transfer by the Langmuir-
Blodgett technique onto a mica plate and at a surface pressure of 20 ± 0.5 mN/m. The scale used
was composed of different shades of brown, related to the differences in height in the monolayers.
These color variations were correlated with the different tilt values of the lipid molecules and thus
provide information on the orientation of the molecules and their physical state.
The 5×5 µm² AFM image of the GL system (Fig. 3.A), was characteristic of a homogeneous
liquid-expanded (LE) phase without phase separation, consistent with the presence of unsaturated
acyl chains in the fluid phase. However, the 1×1 µm² image highlights the presence of surface
roughness, with height differences between 2 to 8 Å (0.2 to 0.8 nm) with respect to the baseline. A
similar segregation was previously observed by AFM on mixed films of MGDG:DGDG (68:32
mol/mol) by Sarkis et al. (2014). Additionally, Bottier et al. (2007) had observed the presence of
irregular protrusions of 7 Å (0.7 nm) and 4 Å (0.4 nm) at surface pressures above 25 mN/m on
monolayers of pure MGDG or in equimolar mixture with DGDG, respectively. The presence of
these protrusions had been attributed to a specific organization of the MGDG polar heads between
them or with those of DGDG, this roughness being absent on the AFM images of the DGDG
monolayer. Indeed, a particular orientation of DGDG polar heads induced by the interactions
between galactolipids had been highlighted by PM-IRRAS data. The assumption was that the
monogalactosyl polar head of MGDG could be responsible for the orientation of the digalactosyl
group of DGDG parallel to the interface, with the formation of a network of hydrogen bridges
between the polar heads and the water molecules at the interface (Kanduc et al., 2017).
The addition of DPPC to the system (2) (Fig. 3.B) resulted in the appearance of 1 nm high
condensed domains of varying shapes and sizes at the interface (5×5 µm² image), likely to be
130
CHAPITRE 3
enriched in DPPC, given their degree of saturation. Additionally, a loss of the granularity on 1×1
µm² images suggests changes in the orientation of the galactosyl polar heads of GL, that could
result from a modification by DPPC of the interactions between MGDG and DGDG. This would
fit with the previous results obtained on the compressibility of the film.
The addition of pS to the GL50/DPPC50 mixture (Fig. 3.C) resulted in a subsequent dilution
of the domains in the LC condensed phase, as well as a significant increase in the thickness of the
domains (h=1.6 nm versus h=1.0 nm, with and without pS, respectively), in contrast to the
unchanged value of the ellipsometric angle. The irregular domain boundaries also indicated a
change in line tension induced upon addition of pS in the GL/DPPC system, and suggests a change
in interactions between the different classes of lipids, with miscibility regions between the different
components. Defects were also visible at the condensed phase domains, probably induced by the
inclusion of pS and the local subsequent disorganization of the saturated acyl chains of DPPC.
In order to investigate the composition of the condensed phase domains and to better
understand the interactions involved between the different classes of lipids, four sub-model systems
DGDG30/DPPC60/pS10 (mol%) mixtures. AFM images and height profiles of these sub-models are
presented Figure 4.
In the absence of pS, the 5×5 µm² AFM image of the MGDG50/DPPC50 mixture (Fig. 4.A)
showed the presence of LC phase domains (average domain area=0.1 µm²), of irregular shape and
DGDG50/DPPC50 film (Fig. 4.B) presented a similar fluid background. However, the LC phase
domains are more abundant but smaller (average domain area=0.0002 µm²), and present a greater
height of 1.9 nm, in accordance with the higher ellipsometric angle for this mixture (6.3° versus
131
CHAPITRE 3
7.4° for the MGDG50/DPPC50 and DGDG50/DPPC50 mixtures, respectively). These observations
confirm the different nature of MGDG and DGDG interactions with DPPC and question a possible
The addition of pS up to 10 mol% in these two previous sub-model systems changed the
appearance of the interfacial films. First, the addition of pS in the MGDG/DPPC system (Fig. 4.C)
induced a change in the line tension of the condensed phase domains, which showed irregular edges
as well as the presence of defects at the larger domains, probably induced by the presence of pS,
132
CHAPITRE 3
similar to the previous observations on the model systems. Nevertheless, a significant decrease of
18% in the height of these domains (1.7 nm vs. 1.4 nm in height, without and with pS, respectively)
was observed, consistent with the evolution of the ellipsometric angle (6.3° vs. 5.5°, without and
with pS, respectively). The addition of pS in the DGDG/DPPC mixture induced a similar evolution
of the interface (Fig. 4.D): the line tension and the thickness of the condensed domains were also
modified according to the same trend (16% decrease in thickness), and the presence of defects at
the larger domains with irregular edges was still visible. This change in thickness did not showed
the same trend as that observed in the GL45/DPPC45/pS10 model, for which a 45% increase in
Overall, the results confirm the hypotheses of a different miscibility between DPPC and MGDG
and between DPPC and DGDG. Moreover, it seems that the inclusion of pS in the systems induced,
on the one hand, a transition from the DPPC-enriched gel phase to a less ordered phase, with the
apparition of defects, and on the other hand, a transition from a fluid phase to a less ordered zone,
with reduced height mismatch and a decrease of the line tension in the ternary systems. To validate
these hypotheses and determine the miscibility of DPPC in mixture with MGDG or DGDG, as well
as the impact of pS in GL/DPPC lipid systems, SAXS experiments were performed, in the presence
of water in excess.
equimolar mixture, have already been studied by analysis of the X-ray diffraction patterns and
electron density profile at 20°C in excess of water (Bottier et al., 2007; Hoyo et al., 2016). On one
hand, the lamellar structure L of DGDG was evidenced by the presence of single peaks regularly
spaced, with a lamellar periodicity of 54.9 Å. On the other hand, the X-ray diffraction profile
133
CHAPITRE 3
obtained for MGDG showed six Bragg diffraction pics, with a hexagonal periodicity of 67.2 Å,
that were attributed to an inverse hexagonal phase (HII) distribution, which has been observed in
other studies over a wide temperature range (-15 to 80°C) (Popova & Hincha, 2011). The ability
of unsaturated MGDG to form non-lamellar structures can be neutralized by mixing it with at least
50% of lipids forming lamellar phases. However, unsaturated MGDG can induce defects in the
lamellar structure of MGDG/lipid mixtures forming bilayers when its proportion is between 20 and
50% (Castro et al., 2007). Nevertheless, for the equimolar mixture of MGDG and DGDG in excess
of water, the SAXS diffraction pattern obtained by Bottier et al. was the signature of a bicontinuous
cubic phase (Im3m space group) with a cubic lattice parameter of 202 Å, showing the specific
behavior of MGDG and DGDG in the equimolar mixture compared to the pure lipids. Indeed, the
formation of an Im3m space group could result from specific interactions between the polar sugar
The three-dimensional organization of DPPC has also already been extensively studied by
SAXS, showing a well-ordered multilayer structure in excess of water due to the so-called L gel
phase at 20°C (Et-Thakafy et al., 2017; Varga et al., 2007). Nevertheless, the miscibility of the
mixture of GL with DPPC forming lamellar phases has never been studied by SAXS.
Figure 5.A presented the X-Ray diffraction patterns of three mixtures of GLx/DPPCy in water, with
DPPC at 66 (black curve), 50 (blue curve), and 33 mol% (green curve), respectively. The results
showed that DPPC in large amount of 66 mol% induced a segregation between the components in
water. Indeed, on the diffraction pattern (black line), the large diffraction peaks visible at 0.09 and
0.18 Å-1 were identified as the ones related to the L phase formed by pure DPPC at 20°C.
134
CHAPITRE 3
Additionally, a peak and a shoulder were visible on the diffraction pattern at 0.06 and 0.11 Å-1,
respectively, that could correspond to the diffraction pattern of the cubic phase of the MGDG-
DGDG mixture in water, consistent with the results of Bottier et al. (2007). These results tend to
indicate a segregation between DPPC and the MGDG-DGDG mixture in water, leading to the
existence of two non-miscible phases. Nevertheless, DPPC may also have disrupted the cubic phase
by diluting the MGDG-DGDG interactions, coinciding with the distorted pattern of the MGDG-
DGDG cubic phase. When DPPC was added at 50 mol% in the GL mixture, the diffraction pattern
(blue line) showed a better miscibility between the three components of the system. Indeed, the
intensity of the peaks presumably related to the cubic phase of the GL mixture was decreased and
the pic 0.06 Å-1 was no longer visible, tending to show the existence of two miscible phases. These
results were consistent with AFM images of the GL50DPPC50 mixture, where a fluid phase was
visible, probably composed of a mixture of MGDG, DGDG and DPPC, as well as condensed
domains, likely enriched in DPPC. At a ratio of 33 mol% DPPC, the diffraction pattern (green line)
indicates that the concentration of DPPC was not sufficient enough to segregate the three
components of the system, and the slightly weaker MGDG-DGDG interactions have probably
prevailed, leading to the existence of a single organized phase composed by MGDG, DGDG and
DPPC. Overall, the SAXS data confirm the presence of significant segregation in the systems,
depending on the DPPC proportion and implying the existence of very selective interactions
To our knowledge, this study is the first on the impact of pS on heterogenous model plant
membranes, while the impact of cholesterol on model of animal membranes made of phospholipid
bilayers has been extensively studied. To better understand the impact of pS and the interactions
135
CHAPITRE 3
between DPPC and MGDG/DGDG, the SAXS diffraction patterns of three other model systems
Figure 5 SAXS patterns of the model systems recorded at 20 ± 0.5°C. A) GL/DPPC systems at different
ratios: 33:67 mol/mol (black curve), 50:50 mol/mol (blue curve) and 67:33 mol/mol (green curve). B)
DGDG/DPPC/pS (45:45:10 mol/mol/mol, green curve), GL/DPPC/pS (45:45:10 mol/mol/mol, black
curve), MGDG/DPPC/pS (45:45:10 mol/mol/mol, blue curve)
On one hand, results tend to show that MGDG and DGDG did not interact equivalently
with the DPPC-pS mixture. First of all, the mixture of DGDG with DPPC-pS did not promote the
presence of a single organized phase in water (see green line). Indeed, the diffraction pattern of the
pure DPPC was clearly visible, with the L lamellar phase peaks at 0.09, 0.18, and 0.27 Å-1. The
diffraction pattern of the pure DGDG was also clearly evidenced, with the diffraction peaks
reflecting the L phase at 0.11 and 0.22 Å-1. These results are consistent with those obtained by
Bottier et al. (2007) on the wheat DGDG/water system and they highlight the poor miscibility of
DGDG with DPPC-pS system. On the contrary, in the case of the MGDG 45/DPPC45/pS10 mixture
136
CHAPITRE 3
(blue pattern), only one phase was clearly visible, with two peaks reflecting a lamellar phase at
0.09 and 0.18 Å-1, but slightly shifted compared to pure DPPC in water. In the case of the
GL45/DPPC45/pS10 mixture in water (black pattern), a shoulder was also visible at 0.11 Å-1,
formation of two phases: one phase enriched in MGDG-DPPC-pS and one phase containing a
mixture of MGDG-DGDG. These results showed drastically different interactions between MGDG
and DGDG, respectively, and the DPPC-pS mixture, and highlight the preferential miscibility of
On the other hand, the comparison between the GL50/DPPC50 (fig. 6. A, blue pattern) and
the GL45/DPPC45/pS10 (fig. 5. B, black pattern) mixtures in water allowed us to highlight the impact
of 10 mol% of pS in the system. As expected, pS did not formed a phase on its own but triggered
a modification of the organization of the existing phases. Indeed, the inclusion of pS in the
GL/DPPC system did not induce the appearance of new diffraction peaks, but has led to a
contraction of the L diffraction peaks at 0.09 and 0.18 Å-1, indication a homogenization in the
Overall, the results were consistent with the AFM images obtained on the
GL45/DPPC45/pS10 monolayer, with the visualization of a fluid phase composing the background,
probably enriched in MGDG-DGDG, and the presence of a gel phase enriched in MGDG-DPPC,
in which the inclusion of pS has induced the formation of defects, leading to a thickening of the
gel phase by decreasing the packing. Additionally, the observation of smaller domains in presence
of pS on the AFM images was consistent with a lowering of the line tension at the edges of the gel
domains, resulting from a better miscibility between the two phases and thus a reduced height
mismatch.
137
CHAPITRE 3
CONCLUSION
In this study, tunable Langmuir model membrane of heterogenous assemblies of GL, DPPC and
pS were used to study the structural behavior of the main polar lipids of vegetal photosynthetic
membrane (MGDG and DGDG) at the air/water interface. The impact of pS and 1,2-dipalmitoyl-
studied.
The biophysical results obtained confirmed the good surfactant properties of these polar lipids. The
addition of pS in the mixed GL systems up to 30 mol% induced a reorientation of the sugar polar
heads, leading to a more important packing and thus to a reduction of the lateral elasticity of the
monolayer. The study of the compressibility isotherms of the different films also allowed to
highlight the complex miscibility of the heterogeneous ternary mixtures, and their singular
behavior compared to the pure systems. Indeed, the results obtained on the GL45/DPPC45/pS10
mixture indicated preferential DPPC-pS interactions but a decrease in lateral elasticity despite the
The inclusion of pS into the gel phase regions was visible on the AFM images, leading to a
thickening of the domains and a local decrease of packing by the appearance of defects. This result
highlighted phase miscibility between DPPC and GL, and in particular with MGDG, which was
confirmed by AFM images and SAXS diffraction patterns. The favorable interaction between
DPPC and pS may have caused the appearance of segregated zones, on one side, devoid of pS and
enriched in MGDG-DGDG in the fluid phase, and on the other, enriched in pS and DPPC.
The pS-DPPC-rich areas could also have included the presence of MGDG, due to more favorable
138
CHAPITRE 3
DPPC-pS composition of the gel phase domains. The characterization of these kinds of plant lipid
mixtures is useful for the understanding of mechanisms such as their digestion by specific digestive
enzymes.
139
CHAPITRE 3
- Les mélanges modèles de lipides polaires végétaux forment des monocouches stables à
respectivement. La monocouche de GL est caractérisée par une phase fluide, tandis que la
- L’ajout de DPPC dans les mélanges lipidiques de galactolipides a modifié les interactions
MGDG-DGDG. Les analyses SAXS ont permis de mettre en évidence une miscibilité de
GL/DPPC/pS sont probablement enrichis en DPPC, MGDG, et pS, tandis que la phase LE
140
CHAPITRE 3
Nous avons étudié la composition chimique et le comportement interfacial des lipides totaux issus
végétales a également été effectuée sur cuve de Langmuir à 20 mN/m et à pH 7 (tampon Tris
L’espèce Ch. Sorokiniana présente des propriétés physiques et biologiques proches de Ch.
vulgaris, mais a montré des taux de croissance et de productivité supérieurs, ce qui explique son
utilisation accrue dans le domaine des biocarburants. La souche Ch. sorokiniana reyto utilisée dans
l’INRAE de Narbonne et a fait l’objet d’une étude de caractérisation en fonction de ses conditions
de croissance par J. Wind, M. Subileau et C. Bourlieu en 2021, au sein de l’UMR IATE, à l’INRAE
de Montpellier. La Ch. sorokiniana reyto utilisée dans notre étude a été fournie par M. Subileau de
dans le milieu de culture. Ces conditions permettent d’obtenir un profil lipidique plus riche en
141
CHAPITRE 3
25
20
TAG
Teneur (en g/100 g)
AGL
15
Pigment
DAG
10
MGDG
5 PC
DGDG
0 PE
0 g/L 2 g/L 5 g/L
Concentration en glucose (g/L)
Figure 26 - Répartition des classes de lipides chez Ch. sorokiniana reyto (en g/100 g de biomasse sur milieu Bold's
Basal Medium) à différentes concentrations de glucose.
Les lipides totaux ont été extraits des biomasses algales par la méthode Folch. La caractérisation
des classes de lipides et de la composition en acides gras a été effectuée sur les lipides totaux
extraits de la biomasse algale Ch. vulgaris (Purasana) et sorokiniana. Les résultats obtenus sont
Les lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana représentent 14% massique de la matrice initiale et
faibles en AGL (5% massique) et en TAG (2% massique). La composition en acides gras a montré
un profil riche en LA (C18:2, 6, 43% massique), en acide palmitique (C16:0, 21% massique), en
acide hexadécadiénoïque (C16:2, 12% massique), en acide oléique (C18:1, 9, 8% massique), en
142
CHAPITRE 3
ALA (C18:3, 3, 8% massique), et enfin en HTA (C16:3, 3, 4% massique). Le ratio 6/3 a été
déterminé comme étant de 3, confirmant l’excellent potentiel nutritionnel des microalgues Ch.
Figure 27 - Caractérisation chimique des classes de lipides et de la composition en acides gras des lipides totaux
extraits des Ch. A) vulgaris Purasana et, B) sorokiniana reyto.
Les lipides totaux (23% massique) de Ch. sorokiniana cultivées en laboratoire dans des conditions
d’autotrophie présentent également un excellent profil nutritionnel. Les classes de lipides les plus
représentés sont les galactolipides (MGDG, DGDG – 48% et 18% massique, respectivement),
viennent ensuite les phospholipides (PC, PE – 9% et 2% massique, respectivement), puis les AGL
(2% massique). Contrairement aux microalgues Ch. vulgaris Purasana, les chlorelles sorokiniana
cultivées en laboratoire contiennent de faibles quantités de DAG (3% massiques) mais pas de TAG.
143
CHAPITRE 3
L’analyse des AG montre un profil moins riche en LA (C18:2, 6, 23% massique) que la chlorelle
commerciale, mais plus riche en acide oléique (C18:1, 9, 21% massique). La composition en
acide palmitique est similaire entre les deux microalgues (21% versus 19% massique pour Ch.
vulgaris versus sorokiniana, respectivement). La Ch. sorokiniana présente toutefois un profil plus
riche en 3, avec des compositions respectives en ALA et HTA de 15 et 13% massique. Le ratio
6/3 est de 1 pour cette seconde espèce, confirmant l’excellent profil nutritionnel des
microalgues.
Les différences de composition en lipides totaux et en AG des deux biomasses algales étudiées
pauvre en phospholipides, notamment en PC, pourrait induire des miscibilités de phase différentes,
notamment de par la propension du MGDG à initier des courbures dans les membranes,
contrairement à la PC, qui forme des phases lamellaires peu importe le taux d’hydratation.
Les monocouches de lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana et sorokiniana ont été formées à 20
mN/m à la surface d’une solution tampon Tris pH 7. Pour ensuite pouvoir évaluer l’impact de
l’activité enzymatique sur nos systèmes, les monocouches de lipides ont dans un premier temps été
caractérisées à l’interface sur une cinétique de 1h, temps pendant lequel un effet de la digestion a
été constaté. Les films interfaciaux ont cependant montré une instabilité relative suite au dépôt des
lipides seuls à l’interface, mise en évidence par une baisse de la pression de surface de l’ordre de
4 mN/m sur un temps court de cinétique de 1h, qui pourrait être due à une réorganisation des
molécules du film lipidique. Néanmoins, les lipides sont également largement exposés à
l’atmosphère, et, de par leur contenu important en AGPI, sont particulièrement sensibles à
l’oxydation. Cette baisse de pression pourrait donc également être attribuée à une instabilité
144
CHAPITRE 3
chimique des lipides. Ainsi, l’expérience de stabilité de la monocouche a été réalisée sous
atmosphère inerte en mettant le système en surpression d’azote, afin de vérifier que cette instabilité
n’était pas due à l’oxydation des AGPI, mais bien à une réorganisation des molécules à l’interface
du film. Les variations de pression de surface obtenues sur une cinétique de 1h sont présentées
Figure 28. Les courbes de pression de surface du film témoin (trait gris pointillé) et du film formé
sous atmosphère inerte (trait noir continu) ont montré une évolution similaire. L’oxydation sur un
temps court au niveau des monocouches de lipides totaux de chlorelles riches en AGPI semble
donc être un phénomène négligeable devant la réorganisation des molécules à l’interface air/eau.
Figure 28 - Evolution de la pression de surface du film de lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana i) formé sous
atmosphère inerte (N2, trait noir continu) et ii) contrôle (trait gris pointillé) à une pression de surface initiale d’environ
20 mN/m.
Les prélèvements de Langmuir-Blodgett des monocouches de lipides totaux de microalgues ont été
réalisés après une période de stabilisation de 10 minutes et à une pression d’environ 20 mN/m. Les
145
CHAPITRE 3
Figure 29 – Images AFM (5×5 et 2,5×2,5 µm²) de la monocouche interfaciale de lipides totaux de Ch. vulgaris
Purasana obtenue à pH 7 après prélèvement de Langmuir-Blodgett effectué à =19,7 mN/m et =8,1°. Le profil de 3
sections et le tableau relatif aux hauteurs des domaines ont été obtenus par analyse de l’image via le logiciel Gwyddion.
En accord avec la composition riche en AGPI du système, les images montrent que la phase
majoritaire se trouve dans un état fluide, dans laquelle des domaines ovoïdes en phase LC
coexistent. Ces domaines ont une taille d’environ 200 nm de largeur, et présentent des bords
irréguliers. Ils sont composés d’un domaine central de hauteur h=2,2 ± 0,1 nm, entouré d’une
couronne moins haute aux bords irréguliers de 1,5 ± 0,1 nm de hauteur (variations de hauteur
mesurées par rapport au fond homogène). Par endroits, de plus petits domaines apparaissent,
présentant des hauteurs comprises entre 5 et 6 nm, et sont attribués à la présence de TAG. Au-delà
de 15 mN/m, le collapse des TAG est dépassé, ils forment alors des structures tridimensionnelles
donnant des hauteurs de cette amplitude. La présence de deux hauteurs différentes sur les domaines
146
CHAPITRE 3
en phase LC témoigne d’une coexistence de phases et est attribuée à au moins deux espèces
s’organisant en phase LC (phase plus dense) à une pression de surface de 20 mN/m. Etant donné
domaines.
Figure 30 - Images AFM (5×5 et 2,5×2,5 µm²) de la monocouche interfaciale de lipides totaux de chlorelle sorokiniana
obtenue à pH 7 par prélèvement de Langmuir-Blodgett effectué à =21,0 mN/m et =8,4°. Le profil et le tableau relatif
aux hauteurs des domaines ont été obtenus par analyse de 3 sections de l’image via le logiciel Gwyddion.
La Figure 30 présente les images AFM de la monocouche de lipides totaux de chlorelle sorokiniana
reyto, obtenues après prélèvement à =21,0 mN/m et = 8,4°. L’interface du film est semblable à
celle obtenue dans les cas des chlorelles commerciales, avec la présence de petits domaines en
147
CHAPITRE 3
phase condensée de 200 nm de large, coexistants avec une phase fluide. Contrairement au cas
précédent, les domaines observés sont homogènes, avec une hauteur unique de 1,8 ± 0,1 nm. Cette
hauteur est similaire à celle rencontrée précédemment pour les domaines denses (partie extérieur).
De la même manière, les domaines sont attribués aux longueurs de chaînes acyles majoritairement
palmitiques (C16:0).
La comparaison des résultats obtenus avec les études réalisées sur les systèmes modèles a permis
d’émettre l’hypothèse d’une localisation préférentielle des galactolipides en phase fluide, étant
donné leur composition largement polyinsaturée. Néanmoins, l’attribution des domaines à un type
de molécule n’a pu être déterminée avec exactitude, étant donné la complexité des systèmes
Figure 31 - Isothermes de compression des lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana (trait noir continu) et sorokiniana
(trait gris foncé pointillé). Images AFM (5×5 µm²) obtenues à une pression d’environ 20 mN/m des lipides totaux de
chlorelles A) vulgaris Purasana et B) sorokiniana.
La compression des monocouches de lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana et sorokiniana a été
réalisée afin de déterminer la présence d’une transition de phase. Les isothermes de compression
obtenues sont présentées Figure 31. Les isothermes de compression respectives des lipides totaux
de Ch. vulgaris Purasana (trait noir continu) et sorokiniana (trait gris pointillé) n’ont pas permis de
148
CHAPITRE 3
phase, dans les systèmes lipidiques au cours de leur compression. Cette observation n’est pas
et donc l’organisation en phase fluide (LE). Ces mesures ne sont pas contradictoires avec les
observations par AFM, les phases LC étant peu présentes, et les transitions de phase des molécules
été effectuée. Les lipides polaires des membranes d’OB ont été extraits par méthode Folch, puis
II.2.1 - Caractérisation chimique des oléosomes extraits des noix et des amandes
Tableau 9 - Composition en phospholipides d'huile de noix et d'amande. A partir de Zlatanov et al. 1999
PC 38 18
PI 28 45
PA 8 15
PE 4 7
PS 2 5
déterminée par Zlatanov et al. (1999). Les analyses ont montré des profils riches en PC, PI et PE,
149
CHAPITRE 3
et la présence de petites quantités d’acide phosphatidique (PA) et de PS pour les deux matrices
(Tableau 9). Les phospholipides retrouvés dans les huiles d’oléagineux sont essentiellement ceux
qui composent les membranes des OB. La caractérisation de la composition en AG des lipides
totaux extraits des OB isolés des noix et d’amandes par méthode Folch a été réalisée au CIRAD de
40
30
20
10
0
Noix Amande
Figure 32 - Composition en AG des lipides totaux extraits des oléosomes isolés de noix et d'amandes. La composition
est donnée en % relatif des AG totaux.
Les AG des lipides totaux extraits des OB de noix sont riches en LA (C18:2, 6, 63% massique),
en acide oléique (C18:1, 9, 16% massique) et en ALA (C18:3, 3, 11% massique). Des quantités
moindres d’AG saturés (C16:0 et C18:0, 6% et 2% massique, respectivement) ont également été
détectées. Le ratio 6/3 est de 6, légèrement supérieur aux préconisations de l’ANSES. Dans le
cas des lipides totaux d’OB d’amandes, le profil en AG est particulièrement riche en acide oléique
(C18:1, 9, 70% massique), et en LA (C18:2, 6, 20% massique). De l’acide palmitique a
également été trouvé en faible quantité (C16:0, 6% massique). Contrairement aux OB de noix, les
150
CHAPITRE 3
OB d’amandes ne contiennent pas d’ALA, et présentent donc un profil nutritionnel peu équilibré
Les images AFM des prélèvements de l’interface des lipides membranaires d’OB de noix et
d’amande obtenus à une pression d’environ 20 mN/m sont présentés Figure 33. Sur les images
AFM de l’interface des lipides membranaires d’OB de noix, de larges formes circulaires sont
visibles, entourées par une bordure de 3,4 ± 0,5 nm de hauteur. Ces formes circulaires sont
caractérisées par une phase probablement fluide et hétérogène, en séparation de phases avec le fond
de l’image. Au centre, un domaine circulaire en phase plus dense et plus haute (4,6 ± 0,4 nm) est
visible, probablement composé de TAG non séparés au cours de l’extraction, ou d’AG à longues
chaînes saturées.
Figure 33 - Images AFM (5×5 et 2,5×2,5 µm²) des films interfaciaux de lipides membranaires d’oléosomes de A)
Noix et, B) Amande, obtenues à une pression de surface p=19,9 ± 0,1 mN/m. Les profils de hauteur ont été obtenues
à partir des images à 2,5×2,5 µm² et sont les résultats de l’analyse de trois sections de l’image.
151
CHAPITRE 3
L’organisation interfaciale des deux extraits présente globalement de fortes similitudes, avec
l’apparition de formes circulaires attestant d’une hétérogénéité dans la répartition moléculaire, ou,
autrement dit, d’une immiscibilité moléculaire. En effet, les molécules se regroupent par affinité
pour maximiser les interactions latérales électrostatiques (têtes polaires) et hydrophobes (chaînes
acyles). Les formes circulaires présentent des bordures de hauteurs qui diffèrent entre les deux
extraits. Elle est plus faible pour l’amande, de 2,9 ± 0,8 nm. La principale différence se situe au
cœur de ces formes circulaires, le domaine central plus haut présent dans les extraits de noix étant
absent dans ceux d’amandes. Ces différences de comportement pourraient être dues à une
séparation des lipides polaires et des TAG plus efficace dans le cas du système OB d’amandes,
Figure 34 - Isothermes de compression des monocouches de lipides membranaires d'OB de noix (noir continu) et
d'amandes (gris pointillé) et images AFM (10×10 µm²) des zones 1 et 2 correspondantes, des monocouches
interfaciales des lipides membranaires d’OB de A) noix et B) d’amandes.
d’amandes, a été étudié en faisant varier l’aire de la cuve de Langmuir entre 77 et 21 cm² après le
152
CHAPITRE 3
dépôt d’une faible quantité de lipides à l’interface ( initiale de 20 mN/m) (Figure 34). Les
isothermes de compression respectives des deux systèmes ont permis de mettre en évidence la
Les valeurs de pression de surface et de surface spécifique auxquelles ces transitions de phase ont
été obtenues pour les deux monocouches sont renseignées dans le Tableau 10. Pour chacun des
systèmes lipidiques étudiés, la zone 1 est caractérisée par une phase fluide continue, tandis que la
Tableau 10 - Valeurs de pressions de surface (, mN/m) et de la surface spécifique (S, cm²/µg) auxquelles a été
observé une transition de phase lors de la compression des monocouches de lipides membranaires d'OB de noix et
d'amandes.
153
CHAPITRE 3
3. L’excellent profil nutritionnel de cette biomasse algale a été confirmé par le ratio 6/3
en 3.
- Les monocouches de lipides totaux de chlorelles sont caractérisées par une phase fluide,
monocouches de lipides extraits des membranes d’OB sont caractérisées par une
séparations de phases.
154
CHAPITRE 3
déshydratée (Purasana)
Les algues et les microalgues sont des organismes aquatiques riches en protéines
photosynthétiques sont consommés dans certaines régions du monde depuis des siècles et leur
potentiel nutritif a été souligné dans de nombreux rapports, expliquant un intérêt croissant vers leur
La Chlorella vulgaris est une espèce de microalgue verte photosynthétique unicellulaire d’eau
douce qui appartient au genre des Chlorella, dont le diamètre varie entre 2 et 8 µm en fonction des
espèces. Cette microalgue contient une teneur particulièrement élevée en chlorophylle, qui lui
confère une couleur verte, et lui permet de convertir la lumière absorbée en énergie par le processus
pouvant chélater des métaux (Mg dans photosynthèse), mais comprenant aussi de nombreux
et al., 2020). De plus les galactolipides présents en quantité abondante dans les chlorelles ont aussi
été présentés dans la littérature comme plus stables à l’oxydation que les phospholipides. Sans
entrer dans une caractérisation mécanistique approfondie, il nous a semblé intéressant d’étudier la
stabilité au stockage des extraits de lipides totaux de chlorelles en faisant l’hypothèse que leur
teneur élevée en galactolipides ainsi qu’en chlorophylle résiduelle les rendraient assez stables à
Nous avons donc déterminé la stabilité oxydative des liposomes de lipides totaux extraits des
chlorelles commerciales Purasana sur une période de stockage de 19 jours dans des conditions
d’oxydation accélérées (composition décrite chap. 3.II.1). Nous avons ensuite étudié les propriétés
III.1.1 - Stabilité oxydative des liposomes de lipides totaux extraits des chlorelles Ch. vulgaris
commerciales Purasana
Un test de stockage dans des conditions d’oxydation accélérée (40°C, 20 jours, 110 rpm) des
liposomes (1 µm) de lipides totaux extraits des chlorelles Purasana à 0,2% massique en solution
Tampon pH 7 a été mis en place. La Figure 35 présente l’évolution des concentrations des produits
Les résultats témoignent de l’excellente stabilité chimique des liposomes de lipides totaux de
chlorelle au cours de leur stockage dans des conditions d’oxydation accélérées. Une très faible
augmentation des produits secondaires d’oxydation a en effet été observée sur une période de 19
jours (C=+0,18 mmol MDA/kg d’huile), et une valeur finale de 0,35 mmol MDA/kg d’huile a été
obtenue, bien inférieure à la limite de commercialisation tolérée pour les produits carnés (1 mmol
MDA/kg d’huile). Ce résultat peut paraitre surprenant, étant donné la teneur élevée en AGPI dans
la matrice algale étudiée. En comparaison, la qualité nutritionnelle et la durée de vie des huiles de
poissons, qui sont également très riches en AGPI et représentent une source majeure d’3, a été
montrée comme fortement impactée par l’oxydation rapide de ces lipides (Arab-Tehrany et al.,
2012). Les huiles de poissons sont en effet particulièrement riches en AGPI-LC EPA et DHA
(Ackman, 1967), qui présentent une sensibilité accrue à l’oxydation lipidique, expliquant
l’oxydation rapide et importante des huiles de poissons émulsifiées (Let et al., 2007).
156
CHAPITRE 3
TBARS
1,2
Limite de commercialisation pour les viandes
1
mmol MDA/ kg d'huile
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 5 10 15 20
Figure 35 – Evolution des produits secondaires d’oxydation (mmol MDA/kg d’huile) dans les dispersions de
liposomes de lipides totaux de Chlorella vulgaris Purasana sur une période de 19 jours (1 µm, 0,2% massique, 40°C,
110 rpm).
Dans le cas des liposomes de lipides totaux de chlorelle (1 µm), l’extrême stabilité oxydative
observée peut être expliquée par l’absence d’AGPI-LC EPA et DHA, mais également par la
ont déjà été démontrées (Queiroz Zepka et al., 2019). De plus, l’oxydation rapide et conséquente
des huiles de poissons a précédemment été observée dans le cas de systèmes émulsionnés, tandis
que dans notre étude, la stabilité chimique des lipides totaux de chlorelle a été étudiée dans des
Les propriétés tensioactives d’une poudre de chlorelle (composition en Annexe III) contenant des
fragments membranaires ont ensuite été étudiées à l’interface air/eau. La Figure 36 présente
l’évolution de la pression de surface (, mN/m) et de l’angle ellipsométrique (, °) sur une cinétique
157
CHAPITRE 3
de 5h après remplacement de la sous-phase (tampon pur, =0 mN/m, et =0°) par la solution de
poudre de chlorelles diluée (22,5 mg/L). Dès le changement de la solution de sous-phase, une
l’adsorption rapide des fragments membranaires de chlorelle à l’interface air/eau, et souligne leur
Figure 36 - Cinétique d’adsorption de la poudre de chlorelles diluée (C=22,5 mg/L) à l’interface air/solution tampon
(Tris, pH 7). La courbe rouge correspond à la pression de surface et la courbe bleue à l’angle ellipsométrique. La
pression superficielle et l’angle ellipsométrique obtenus après 5h de cinétique sont de 17,2 mN/m et 8,7°,
respectivement.
les images obtenues en AFM de la surface et de la topographie du film sont présentées Figure 37.
Les images AFM sont très hétérogènes. Elles présentent un fond continu en phase fluide,
probablement composé d’un mélange de galactolipides et d’acides gras libres insaturés. Des
158
CHAPITRE 3
Figure 37 - Images AFM (5×5 et 2,5×2,5 µm²) du film interfacial obtenu après 5h de cinétique d’adsorption des d’une
solution de poudre de chlorelles à 22,5 mg/L à l’interface air/tampon (Tris, pH 7). Sur l’image de 5×5 µm², les hauteurs
sont obtenues à partir de 3 sections (rouge, bleu, vert).
Des domaines plats en phase LC de 2,3 ± 0,3 nm de hauteur sont également visibles, en accord
avec les domaines lipidiques observés dans le cas des monocouches de lipides totaux extraits des
Ch. vulgaris Purasana. Ainsi, on peut supposer qu’une partie des fragments se déstructure à
l’interface, tandis que d’autres restent intègrent. Les produits commerciaux contenaient également
des glucides (17 % massique) et des fibres (12%), qui sont très certainement demeurés en sous-
phase étant donné leur structure hydrophile, d’autant que les fibres n’apparaissent pas sur les
images AFM. Des chlorelles entières sont également visibles sur les images de la dispersion de la
poudre de chlorelle en microscopie confocale (Annexe IV), celles-ci demeurant également en sous-
159
CHAPITRE 3
Figure 38 – Mécanisme d’organisation proposé à l’interface air/eau des constituants de la poudre de chlorelles
Purasana diluée.
les capacités tensioactives des fragments membranaires de chlorelle à l’interface air/eau, grâce à
160
CHAPITRE 3
Abbreviations
161
CHAPITRE 3
ABSTRACT Oil bodies (OB), the form of triacylglycerol storage in seeds, are interesting natural
polyunsaturated fatty acids that could be interesting food ingredients but may be prone to oxidation.
The oxidative and interfacial behavior of walnut OB, either minimally-processed or after
processing, were compared with processed complex walnut juice. The good oxidative stability of
minimally-processed OB over 10 days (PV≤ 8.4 meq O2/kg, TBARS=1.4 mmol eq MDA/kg) and
of processed walnut complex matrixes over 20 days (PV≤ 4.8 meq O2/kg, TBARS=1.4 mmol eq
interfacial studies led to the proposition of a new model of adsorption for minimally-processed OB
that will be useful to design functional emulsion or foam in which OB act as emulsifiers.
KEYWORDS: walnut beverage emulsion; oil bodies; oxidative stability; ellipsometry; minimalist
processes
162
CHAPITRE 3
1 INTRODUCTION
Oleosomes or oil bodies (OB) are very specific lipoproteic entities that enable plants to store
the energy they need for germination and growth (Khor et al., 2013; Walther & Farese, 2012). OB
vary in size from nanoscopic (500 nm) to a few micrometers (2.5 µm) (Frandsen et al., 2001). The
monolayer of phospholipids (PL) (0.6-2% wt.) with embedded proteins (0.6-3% wt.) (A. H. C.
Huang, 1994; Napier et al., 2001). Such lipoproteic monolayer protects the OB from chemical or
mechanical stresses (Nikiforidis et al., 2014). Three types of proteins are present in the lipid
monolayer, oleosins, caleosins and stereosins; oleosins being the most abundant (1-4% wt.) (Napier
et al., 2001). Thanks to the presence of oleosins, OB are remarkably stable against aggregation and
coalescence (Barre et al., 2018; Napier et al., 2001; Nikiforidis et al., 2014). This stability is
attributed to steric hindrance and to the negatively charged surface of the monolayer at
(Shimada et al., 2018). The natural stability of these assemblies explains the considerable attention
recently paid to OB (Nikiforidis, 2019). In addition, they can be considered as minimally processed
entities that deliver TAG, liposoluble vitamins, and proteins for human nutrition. While a multitude
of products is derived from nuts and seeds, few exist where the OB remains in its native or
minimally-processed form.
Walnuts are among the most widely consumed commercially grown tree nuts in the world
(Hayes et al., 2016). Their consumption is associated with many health benefits, including reducing
the risk of cardiovascular disease, and neurological disorders (Simopoulos, 2002). These benefits
are attributed to their fatty acid (FA) profile, which is rich in polyunsaturated fatty acids (PUFA)
(Hayes et al., 2016). Walnut lipids contain 90% unsaturated FA, of which 12-16% is -linolenic
163
CHAPITRE 3
acid (ALA, C18:3, ω3) that very likely explain the cardioprotective effects of a diet rich in walnuts
(Maguire et al., 2004). Walnut lipids are also considered to be a good source of vitamins and dietary
fibers (Miraliakbari & Shahidi, 2008). To date, most research on walnut lipids has focused on their
chemical composition (Venkatachalam & Sathe, 2006). In addition to TAG, tree nut lipids contain
phytosterols, PL, and tocopherols, which are known to confer good oxidative stability to oil in
Several studies have been dedicated to OB colloidal stability, with special emphasis on soybean
source (Kapchie et al., 2013; Zhao et al., 2016). The chemical stability during the storage of
emulsions prepared with OB from oilseeds has been investigated, including issues of endogenous
hydrolytic activity (De Chirico et al., 2020) and oxidative sensitivity (B. Chen et al., 2012) .
Nevertheless, the use of oilseed OB with high PUFA content is limited because of their
susceptibility to oxidation (Nuchi et al., 2002). Lipid oxidation is an undesirable reaction in food
applications and the dispersion of lipids in emulsions further increases this phenomenon by
increasing contact with oxygen and pro-oxidant species. This explains why lipid oxidation is a
major cause of degradation during the manufacture and storage of food products (Villière, 2005),
and also explains why the use of OB in beverages requires a good understanding of their physical
Despite the high number of publications on vegetal juices and OB chemical characterization (J.
Tzen et al., 1993), questions remain open regarding the interfacial behavior of OB. Some insights
have been gained into the physical stability of natural OB (White et al., 2008) and their organization
at the interface (Bettini et al., 2014; Waschatko et al., 2012). However, the mechanism of interfacial
organization of native OB has not yet been fully elucidated, especially when the objects have been
164
CHAPITRE 3
degraded by oxidation, even though such characterization could help understand plant-based
beverage reactivity.
The aim of this study was thus to investigate the oxidative behavior of walnut OB using accelerated
oxidative storage conditions, to determine the chemical stability of those lipoprotein assemblies
when they are in a complex matrix (walnut beverage) or in isolated form at different levels of
processing (minimum level, homogenized only, homogenized plus heat-treated). Biophysical tools
were used to understand the organization of OB at the interface, and the behavior of their three
different constituents, TAG, PL, and proteins (oleosins). Such investigations are required to better
understand the reactivity of OB and are of interest for a large panel of food technological
applications.
All chemicals were purchased from Sigma Aldrich Ltd. (St. Louis, MO), except for ultrapure (UP)
water, hexane, and acetic acid purchased from Honeywell Research Chemicals (Charlotte, NC,
USA). If not stated otherwise, all biochemical characterizations were conducted at least in triplicate
Walnut kernels (Juglans regia L., Chandler variety, origin Chile) were supplied by Sun-Snack AG
(St Margrethen, Switzerland). Walnut kernels were soaked in 2% wt. NaCl solution (ratio
nuts/solution, 1:20 w/v) and stirred for 16 hours at 200 rpm (Legallais IKA, KS4000 i control) to
remove tannins, astringency and soluble impurities in the skin (Ghaderi-Ghahfarrokhi et al., 2017).
Sodium azide (0.02% wt.) was added to the final preparation to insure preservation.
165
CHAPITRE 3
2.1.1 Complex matrix preparations: walnut beverages with or without added sodium
caseinates (3% wt.)
The procedure for complex matrix preparation was provided by the Institute of Materials Science
(Nestlé Research). After soaking and rinsing twice with UP water, 38 g aliquots of walnut kernels
were dried, redispersed in 500 mL of UP water and boiled at 90°C in the food processor (Vorwerk
Thermomix TM31) for 10 min while blending at low-speed. For one modality of walnut complex
matrix including additional emulsifiers, these emulsifiers, i.e. sodium caseinates (3% wt.) were
added at this stage. Another modality was produced without sodium caseinates (called hereafter
walnut complex matrix). Then, the mixture was blended at maximum power (stage 10). The coarse
nut emulsions were pre-homogenized using a high shear laboratory mixer (Silverson, L5M-A) at a
shearing speed of 8 000 rpm for 1 min with a square head. The emulsion was sieved through a 300
µm stainless steel sieve to get rid of large solid particles that could hinder high pressure
homogenization. To obtain a fine emulsion with a relatively small particle size, the emulsion was
passed through a two-stage laboratory homogenizer (Niro Soavi, Panda 2K) with heads set at
OB were isolated from walnut kernels and purified using the method of Kapchie et al. (2011). After
soaking and rinsing twice with UP water, the walnut kernels were manually ground with a pestle
and mortar. Aliquots (50 g) of walnut kernels were mixed with UP water at ratio of 1:6 (g/mL) and
stirred at 10 000 rpm for 5 min in a lab disperser (Ultra-turrax, IKA, T18 digital). The mixture was
sieved in 315 µm stainless-steel sieve. The first wash consisted of centrifuging the filtered solution
at 4 000 g at 4°C for 30 min (Beckman Coulter, Avanti J-E). The layer of cream at the top of the
tube was collected and washed three times in buffer solution (0.1 M Tris-HCl, 4 M sucrose, 0.5 M
166
CHAPITRE 3
NaCl, pH 8.6, ratio 1:6 g/mL) by centrifugation at 4 000 g at 4°C for 30 min. The upper phase was
collected each time. All the upper phases were pooled, then washed twice in UP water (ratio 1:6
g/mL) by centrifugation at 4 000 g at 4°C for 30 min. The resulting cream layer of isolated OB was
dispersed (4% w/v) in a 0.1 M Tris-HCl solution at pH 7. A diagram for the procedure of OB
homogenizer (Niro Soavi, Panda 2K) by applying 3.0x107 Pa and 8.0x106 Pa, for first and second
head respectively. One fraction of isolated HHP OB was subjected to an additional heat treatment
(modality called hereafter HHPT) at 90°C for 10 min. The minimally processed (MP) sample
underwent no processing. In total, three modalities were obtained based on the dispersed OB cream
layer solution, named respectively, MP, HHP and HHPT, according to the operation units applied.
2.3 Oxidation test challenge to monitor the chemical stability of OB in isolated forms or in
complex matrixes
The OB emulsions were divided into 8 mL triplicates in amber centrifuge tubes and stored in an
incubator (Legallais IKA KS4000 i control) at 40°C for 20 days under constant agitation at 110
rpm (Genot & Michalski, 2010). Aliquots were taken at days 0, 1, 3, 6, 9, 12, 15 and 20 for analysis
Peroxide values (PV) were first determined, using the method of Mihaljević et al. (1996) and
Shantha & Decker (1994). This PV index is indicative of the number of active oxygen atoms in the
167
CHAPITRE 3
organic chains, leading to the formation of unstable primary oxidation products such as
hydroperoxide. 250 µL aliquot of the sample was added to 500 µL of a mixture of methanol and
butanol MeOH/BuOH (3:1 v/v) and vortexed for 10 s, and 30 µL of the diluted sample were placed
on a clear microplate (ANSI/SLAS (SBS) format) with 230 µL of MeOH/BuOH (3:1 v/v), 2.5 µL
of iron chloride solution and 2.5 µL of ammonium thiocyanate. After 10 min of reaction,
absorbance was measured at 532 nm using a microplate reader (Nanoquant Infinite 200 Pro,
TECAN, Gröedig, Austria). Contribution of protein to PV was eliminated by comparison with the
The thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay, adapted from Ghani et al. (2017) and
Ohkawa et al. (1979), was performed. The TBARS assay measures the equivalent concentration of
unstable peroxide lipids. 50 µL aliquot of the sample was added to 50 µL of UP water, 200 µL of
a solution containing 15% (w/w) of trichloroacetic acid (TCA), 0.375% (w/v) of thiobarbituric acid
(TBA) and 0.25 mol/L of hydrochloric acid. The tubes were placed in warm water (90°C) for 15
min, then in ice for 5 min and centrifuged for 10 min at 7 700 g (centrifuge 5427, Eppendorf).
Aliquots (200 µL) of the sample were placed on a clear microplate (ANSI/SLAS (SBS)) and
absorbance was measured at 532 nm using a microplate reader (Nanoquant Infinite 200 Pro,
TECAN, Gröedig, Austria). The results are expressed in mmol equivalent MDA/kg of oil.
Walnut kernels (2 g) were ground and incorporated into 5 mL of UP water and 40 mL of Folch
solution (chloroform/methanol 2:1 v/v) (Folch, 1957). The mixture was passed through a lab
disperser (Ultra-turrax, IKA, T18 digital) for 1 min at between 9 500 and 13 500 rpm. In a 500 mL
168
CHAPITRE 3
separating funnel, the solution was washed once with 22.5 mL of NaCl solution at 0.73%, then
The lower phase was collected between each wash and solvents were evaporated under reduced
pressure.
2.4.1 Lipid class composition of walnut Folch extracts by thin-layer chromatography (TLC)
Wincats software system (2008) (Bourlieu et al., 2012). After migration, the silica plates were
dried at 70°C for 2 min and then revealed with a 15.9% solution of copper sulfate in an
orthophosphoric acid/water (92:8 v/v) solution. For each sample, 0.5 mg/mL of lipid solution was
used to automatically apply 4 and 8 µL on the thin layer. After revelation, the silica plates were
subjected to laser UV detection (Camag TLC scanner 3, Muttenz, Switzerland). The wavelength
of maximum absorption was 500 nm, the spots were quantified and spot intensities integrated with
Wincats software (2008). Calibration curves were performed with standards of TAG,
diacylglycerol (DAG), monoacylglycerol (MAG) and FFA (palmitic, oleic and linoleic acids).
2.4.2 Fatty acid composition of walnut Folch extracts by gas chromatography (GC)
Fatty acid methyl esters (FAME) were prepared from the walnut Folch extracts (Piombo et al.,
2006). Aliquots (5 µL) of methylated Folch extract were analyzed by GC (Focus GC, Thermo
Electron Corporation, Massachusetts, USA) equipped with a split injector (ratio of 1/20), a CP-Cil
88 Varian capillary column (50 m × 0.25 mm with a 0.2 µm thick film; Chrompack, Middelburg,
The Netherlands) and 1 mL/min of helium as carrier gas. FAME were analyzed using a flame
169
CHAPITRE 3
ionization detector and ChromCard Data System (version 2005; Thermo Electron Corporation,
Massachusetts, USA).
The column temperature started at 150 °C, increased from 150 °C to 225 °C at a rate of 5°C/min
and maintained at 225 °C for 10 min. These chromatographic conditions allowed the correct and
rapid separation of all FAME from C10:0 to C24:1. FAME were identified using a mixture of
methyl esters as external standard (Mixture ME 100, Larodan, Sweden). The injector and detector
temperatures were 250 °C and 270 °C respectively. FA contents are expressed in g per 100 g of
fresh product.
HPLC analysis on Folch extracts was performed using the 1290 Agilent System (Massy, France)
equipped with a C18 column (250 mm × 4.6 mm i.d., 5 µm, HALO(R)-5 column, AMT,
Wilmington, Delaware, USA) and a fluorescence detector, to detect and quantify four distinct
tocopherols (𝛼, 𝛽, 𝛿 and 𝛾) (Moustiés et al., 2019). The mobile phase consisted of ethanol/methanol
(40:60 v/v) in isocratic conditions. The temperature of the column was maintained at 25 °C and the
flow rate was 0.8 mL/min. Fluorescence detection was set at 296 nm for excitation and 330 nm for
emission. The injection volume was 20 µL and the calibration curves were performed with standard
solutions from 0.1 to 1.5 mg/L. Each sample was analyzed with three repetitions.
2.5 Structural characterization of dispersed isolated OB as their native form or after different
physico-chemical treatments during the oxidation challenge
170
CHAPITRE 3
The size distributions of OB were measured by laser light scattering using a Mastersizer 3000
(Malvern Instruments, Malvern, UK), with two laser sources. The refractive indexes used were
1.333 for water and 1.460 for dispersed OB respectively. The samples were diluted directly in the
measurement cell of the apparatus in order to reach 7% obscuration. Several parameters were
calculated from the size distribution: the mode diameter, which corresponds to the population of
the most frequent OB in the volume distribution, the surface-weighted average diameter of the OB
d32 (µm), defined as Σnidi3/Σnidi2, and the specific surface area calculated according to the equation
2.5.2 Study of MP, HHP and HHPT matrix microstructure using Confocal Laser
The matrix microstructure was observed using a CLSM system (Leica SP8, Heidelberg, Germany)
on an inverted microscope operated with an argon laser (excitation at 488 nm) and two He-Ne
lasers (excitation at 543 and 633 nm) that enabled multi-imaging of a sample by selecting the
correct excitation wavelength and filters to collect the light emitted from a given stain. A 64x oil-
immersion objective was used for all images. Three fluorescent dyes were used, as already detailed
by Bourlieu et al. (2015) to locate i) proteins - Fast Green FCF (6:100 v/v, λex=633 nm - λem=655-
755 nm, Invitrogen), ii) non-polar lipids - Lipidtox (0.2:100, v/v, λex=488 nm - λem=590 nm,
Invitrogen) and iii) polar lipids - Rd-DOPE (1:100, v/v, 16:0 Liss Rhod PE 1,2-dipalmitoyl-sn-
Avanti Polar Lipids). The three dyes were added in a 200 µL aliquots at least 10 min before
observation. 10 µL samples were then placed on a glass slide just before observations. The software
171
CHAPITRE 3
The apparent -potential of OB in several emulsions diluted at 1:200 v/v in UP water was
determined by measuring electrophoretic mobility (u) at 25°C using laser Doppler electrophoresis
(Nano Z PSS Z300, Nicomp). Measurements were made at 3 mV for 7 min. Henry’s law relates U
and PL) several model solutions were prepared based on the proportions of OB constituents in their
native form. A solution containing oleosins and TAG (named oleo-TAG) extracted from walnut
OB was prepared by introducing 3% wt. oleosins and 95% wt. TAG, diluted to 4% wt. in a solution
of 1 M Tris-HCl pH 7. To promote solubilization of the oleosins, TAG were first emulsified in the
Tris-HCl solution and then sonicated for 30 s at 1.5 W before the oleosins were incorporated. A
second sample containing 3% wt. oleosins and 95% wt. commercial walnut oil (La Tourangelle,
France) was also prepared using the same procedure. Another model solution containing L--
phosphatidylcholine powder from eggPC and commercial walnut oil (named EggPC-WOIL) was
prepared by adding 2% wt. of EggPC and 95% wt. of previously emulsified commercial walnut
oil, diluted to 4% wt. in a 0.1 M Tris HCl solution at pH 7. Another solution containing 4% wt. of
commercial walnut oil diluted in a 0.1 M Tris-HCl solution at pH 7 was also prepared. The model
solutions were named respectively oleo-TAG, oleo-WOIL, EggPC-WOIL and WOIL, according
to their composition.
172
CHAPITRE 3
Experiments were performed using a circular Teflon trough (volume 8 mL, surface area 27 cm 2).
After 5 min of acquisition in UP water to define the zero, the water was replaced by the 4% wt. OB
or model sample diluted at a rate of 22.5 mg/L in UP water (1/1600) in the Langmuir trough. The
surface pressure (PI, mN/m) and the ellipsometric angle (DELTA, °) were recorded simultaneously
at 21.5 °C. The surface pressure was measured according to the Wilhelmy-plate method using a
filter paper connected to a microelectronic feedback system to measure the surface pressure (Nima
Technology, UK). Values of PI were recorded every 15 s with a precision of ± 0.2 mN/m.
Ellipsometric measurements were carried out with a home-made automated ellipsometer in a “null
ellipsometer” configuration (Berge & Renault, 1993; Bourlieu et al., 2020). The laser beam probed
a surface of 1 mm2 and a depth in the order of 1 µm and provided insight into the number of
molecules at the interface. Values of DELTA were recorded every 15 s with a precision of ± 0.5 °.
For AFM imaging, interfacial films were transferred onto a freshly-cleaved mica plate using the
Langmuir-Blodgett method. The transfer took place at the end of the kinetic adsorption in the
Langmuir through, after the surface pressure of the sample reached a plateau. Barriers were set at
a low speed of 10 cm²/min and the surface pressure was held constant during the transfer. The mica
plate was further observed with an AFM (Multimode Nanoscope 8, Bruker, France) in QNM mode
in air (20°C) with standard silicon cantilevers (0.3 N/m), and at a scan rate of 1 Hz. The force was
minimized during all scans. To check the integrity of the samples after the different scans and
zooms, the same zone was imaged at the end of the analysis. The scanner size was 100⨯100 μm2.
173
CHAPITRE 3
All results are presented as mean ± SD. Statistical significance between the OB dispersions was
tested by one-way ANOVA. Statistical significance between the two complex matrixes was tested
3 RESULTS
As expected, lipid class analyses confirmed the presence of TAG, DAG, phytosterols, MAG, PL,
and FFA in the walnut kernels. The results identified high concentrations of unsaturated fatty acids
(~93% w/w of oil), especially of linoleic acid (LA, C18:2, 6) (average= 69.8 ± 7.4 % w/w of oil),
in a range similar to those found by other authors (Christopoulos & Tsantili, 2015; Maguire et al.,
2004). Palmitic acid (C16:0, average= 6.8 ± 0.7 % w/w of oil) was the main saturated fatty acid. In
terms of liposoluble vitamins, only vitamin E isomers were detected (average=41.0 ± 20.7 mg/100g
of oil), with a large majority of -tocopherols (average= 36.9 ± 15.6 mg/100 g of oil). The total
concentrations of fatty acids and the tocopherol contents of OB extracted from walnut are shown
CLSM was performed to visualize the microstructure of isolated walnut OB. Selective fluorescent
probes were used to locate TAG, PL and proteins. As expected, the structure of OB was in
agreement with the model proposed by Huang (1994). Figure 1.A.a. shows OB as a green spherical
droplet of TAG surrounded by a red layer of PL embedded in blue proteins. In agreement with the
results reported by Gallier et al. (2013), OB ranged in size from 0.5 to 10 µm (Fig. 1.A.b.). The -
174
CHAPITRE 3
potential of the isolated solution was also measured to judge the general physical stability of the
emulsion. A moderate absolute value of the -potential was evidenced (-34.0 ± 0.6 mV), providing
Figure 1 - a) Optical microscopy, b) particle size distribution and c) confocal laser scanning microscopy (red dye: PL,
blue dye: proteins, green dye: TAG) of isolated OB emulsions having undergone different treatment(s). (A) MP OB
b) trimodal, modes: 7.64 µm, 0.675 µm, 2.13 µm; (B) HHP OB b) bimodal, modes: 16.4 µm, 0.523 µm; and (C) HHPT
OB b) bimodal, modes: 31.1 µm, 0.523 µm.
175
CHAPITRE 3
The oxidative behavior of the minimally processed (MP) isolated OB solution was monitored by
measuring the formation of primary (PV) and secondary (TBARS) lipid oxidation products during
storage. This test was conducted at neutral pH for a period of 20 days of storage at 40°C. The
results are shown in Figure 2.A (MP OB). PV and TBARS did not change much during the first 10
days of storage, pointing a good stability to oxidation phenomenon. After 10 days, the PV
concentration began to increase slightly, followed by TBARS after 12 days, due to the
transformation of unstable primary products into secondary products. Nevertheless, the change was
The effects of high-pressure homogenization and heat treatment on the structure and oxidative
stability of isolated OB were studied (Fig. 2.A - HHP OB, HHPT OB). PV and TBARS of HHP
and HHPT OB dispersions increased significantly from the 5th day of the test on, revealing lower
chemical stability than for MP OB. The oxidation phenomenon was even faster when the OB had
undergone an additional heat treatment (HHPT) downstream. In addition, a sensory test (sniffing,
n=2) revealed the development of negative off-flavors in the products from the 6th day of
accelerated storage in the HHPT samples, compared to from the 9th and 15th day for HHP and MP
of the membrane of the processed OB, and different impacts depending on the process applied (Fig
1). In the HHP OB sample, fragments of the red and blue layer were missing, indicating membrane
damage. In the HHPT OB sample, the membrane was more deteriorated and a blue layer of protein
formed, around which objects aggregated. These observations are consistent with the changes in
the granulometric profile, in which the largest objects doubled in size (16.4 to 31.1 µm) in isolated
HHP OB compared with HHPT OB (Fig 2). The phenomenon of increasing particle size after
homogenization and even more after heat treatment has already been reported in research on walnut
176
CHAPITRE 3
OB by Chen et al. (2014). It had also been reported in OB from other sources, such as peanuts, on
which Zaaboul et al. (2019) observed severe aggregation and coalescence between OB after HHP
Figure 2 - a) PV and b) TBARS values during 20 days at 40°C and 110 rpm of (A) processed isolated
walnut OB (MP, HHP, HHPT); and (B) walnut complex matrixes with and without 3% wt. of sodium
caseinates. Data shown are average of three replicates.
3.4 Oxidative behavior of OB in complex matrixes (HHPT walnut beverages with or without
added sodium caseinates)
Two complex HHPT walnut matrixes with or without 3% wt. of sodium caseinates, representative
ingredients in the complex matrix (fibers, walnut proteins, added emulsifiers…) on the oxidative
177
CHAPITRE 3
stability of the system. Good chemical stability of complex matrixes was observed in the short term
(10 days) Figure 2.B. Both complex matrixes, i.e., with and without sodium caseinates remained
quite stable to oxidation even after 20 days, with low oxidation values. More precisely, after 20
days of storage at 40°C, the complex matrix with no sodium caseinates reached a PV value of 4.8
meq O2/kg of oil compared to 2.5 meq O2/kg of oil in the complex matrix containing sodium
caseinates. The TBARS values for the complex matrixes, with and without sodium caseinate(s),
Finally, MP OB and HHPT complex matrixes were quite stable to oxidation. Processing isolated
OB with HHP or HHPT treatments decrease their stability to oxidation. In comparison, processing
walnut complex matrixes (global walnut juice) with or without additional emulsifiers (sodium
3.5 Behavior of minimally-processed (MP) fresh versus oxidized OB at the air/water interface
Since MP OB seem quite stable to oxidation and can be considered as interesting ingredients for
human nutrition, we investigated further their behavior at the air/water interface to gather original
data about their behavior when dispersed in an emulsion or foam. Comparison of fresh versus
The interfacial behaviors of fresh and oxidized MP OB solutions (PV=30.8 ± 1.2 meq O2/kg of oil)
were characterized using biophysical tools (tensiometry, ellipsometry, atomic force microscopy).
Figure 3 summarizes the adsorption kinetics and the AFM images obtained for the two samples at
22.5 mg/L of MP OB. The surface pressure of the fresh MP OB increased from 0 mN/m to
approximately 13 mN/m (Fig. 3.A.a.) in less than one minute. After this initial step, the surface
pressure continued to increase more progressively for a period of 4.5 hours until it reached a plateau
at 19.8 ± 0.7 mN/m. The ellipsometric angle followed a similar pattern until it reached a final value
of 9 ± 0.5 °, illustrating the rise of matter at the interface due to the amphiphilic nature of OB. In
178
CHAPITRE 3
contrast, in the oxidized MP OB solution diluted at 22.5 mg/L, the final surface pressure and
ellipsometric angle were respectively 15 ± 0.8 mN/m and 5.1 ± 0.5 °, lower than those in the fresh
MP OB solution. This points to a different organization of the particles at the interface as well as
Figure 3 - a) Evolution of surface pressure (red circles; PI, mN/m) and ellipsometric angle (blue triangle; DELTA, °)
during the 4.5 hours experiments of adsorption on air-water interface and b) monolayer AFM images (10×10 µm²) and
size profiles after 4.5 hours experiments of isolated solution of (A) Fresh MP OB (PI f=20.3 mN/m; DELTAf=9.2°)
and (B) Oxidized MP OB (PIf=14.7 mN/m; DELTAf=5.1°) diluted in UP water at 22.5 mg/L.
Figure 3 summarizes the adsorption kinetics and the AFM images obtained for the two samples at
22.5 mg/L of MP OB. The surface pressure of the fresh MP OB increased from 0 mN/m to
approximately 13 mN/m (Fig. 3.A.a.) in less than one minute. After this initial step, the surface
pressure continued to increase more progressively for a period of 4.5 hours until it reached a plateau
179
CHAPITRE 3
at 19.8 ± 0.7 mN/m. The ellipsometric angle followed a similar pattern until it reached a final value
of 9 ± 0.5 °, illustrating the rise of matter at the interface due to the amphiphilic nature of OB. In
contrast, in the oxidized MP OB solution diluted at 22.5 mg/L, the final surface pressure and
ellipsometric angle were respectively 15 ± 0.8 mN/m and 5.1 ± 0.5 °, lower than those in the fresh
MP OB solution. This points to a different organization of the particles at the interface as well as
of the interfacial film was performed and imaged using AFM. The resulting images Figure 3.b.
samples. A background with height variation of 0.6 nm was observed in the image of the fresh MP
OB (Fig. 3.A.b.), with the presence of evenly spread generally large protuberances of different
lateral sizes and 4 nm in height. Bright "peaks" of 6-8 nm were observed at the center of some
protuberances. Smaller bright domains, around 1.5-2 nm in height, were also visible. These smaller
domains were not spherical but mainly had edges. The AFM image of oxidized MP OB emulsion
(Fig. 3.B.b) shows a different interfacial organization, with the same background as that of the
To better understand the interfacial structure of MP OB observed in AFM images, a RhoPE dye
was incorporated in the MP OB sample to locate the PL in the interfacial film using fluorescence
microscopy. The images of the fluorescent sample observed with CLSM (fig. 4.a) showed that the
layer was heterogenous, with continuous fluorescence (RhoPE) in the background, indicating the
presence of PL (in red). The AFM images were then recorded on the most homogenous parts (Fig.
4.b). The AFM images of MP OB with and without the RhoPE were similar, indicating that the
fluorescent probes do not affect the interfacial organization of the sample. In addition, as described
180
CHAPITRE 3
in the followed section, model solutions were prepared to identify precisely the other components
Figure 4 - a) Confocal Laser Scanning Microscopy (448×448 µm² and 184×184 µm²) and b) Atomic force microscopy
images (25×25 µm² and 5×5 µm²) of monolayer of MP OB isolated solution diluted at 22.5 mg/L in UP water dyed
with Rhodamine PE.
When OB rise to the air/water interface, they are likely to open and the competing interactions of
their three different components will then determine the physical configuration of the interface:
TAG, PL, oleosins but also, probably, some still intact OB. To elucidate the mechanism of
organization at the air/water interface, model samples were prepared. These models were initially
formulated at 4% wt. of lipid in Tris-HCl solution at pH 7, before being diluted at 22.5 mg/L in UP
water. We first compared two model solutions. The first one was formulated with oleosins and
TAG, prepared using the same ratio as that found in natural OB (3% wt. oleosins, 95% wt. TAG
or commercial walnut oil). The second model solution was only composed by commercial walnut
oil (95% wt). In the AFM images of oleo-TAG (Fig. 5.A) and oleo-WOIL (Fig. 5.B), bright
“peaks” 4 to 8 nm in height and irregularly shaped domains 1.5-2 nm in height were visible, similar
to those present in the AFM image of the MP OB sample. However, the “peaks” did not appear in
the WOIL sample (Fig. 5.C), in which irregular protuberances between 2 and 6 nm in height were
complete these observations, the EggPC-WOIL sample containing 2% wt. of EggPC and 95% wt.
181
CHAPITRE 3
of commercial walnut oil, was then compared to the WOIL sample. The ellipsometric angle of the
EggPC-WOIL sample reached a higher value of 6.3° after 4.5 h, compared to 5.2° for the WOIL
sample, reflecting the greater thickness of the interfacial film. The AFM image of the EggPC-
WOIL sample (Fig. 5.D) showed a denser background material, with homogeneous protuberances
6 nm in height, compared to the AFM images of the WOIL sample (Fig. 5.C).
Figure 5 - AFM images (5×5 µm² and 1×1 µm²) of Langmuir-Blodgett films of 22.5 mg/L of a) oleo-TAG; b) Oleo-
WOIL; c) WOIL; and d) EggPC-WOIL after 4.5 hours of acquisition. Final values of surface pressure (PI, mN/m) and
ellipsometric angle (DELTA, °) were recorded at 4.5 hours of acquisition when the films were transferred on mica
plate.
182
CHAPITRE 3
4 DISCUSSION
4.1 The good chemical stability of walnut OB is evidenced in both processed complex matrixes
Despite the limited physical stability of walnut beverages (Y. Chen, Lu, et al., 2014), the results of
storage test under accelerated oxidation conditions highlighted the good chemical stability of these
plant-based beverages, thus increasing their interest for food applications. The remarkable stability
to oxidation of the processed complex matrixes can be explained by the presence of endogenous
proteins that form a second protective layer around OB. Additionally, large quantities of AO
compounds such as -tocopherols, but also various phenolic compounds (polyphenols, phenolic
acids such as gallic, ellagic, and flavonoids) as described by Zhang et al. (2009), help delay the
oxidation phenomenon.
In the complex matrix with added sodium caseinates, we could have expected an enhancement of
stability linked to the addition of this emulsifier. Indeed, Haahr & Jacobsen (2008), who evaluated
the effect of several types of emulsifiers - including sodium caseinates - on the oxidative stability
of 10% wt. oil in water emulsions containing 3 rich fish oil, demonstrated an antioxidant (AO)
effect of sodium caseinates. In their study, the emulsion stabilized by sodium caseinates was shown
to oxidize more slowly than the emulsion stabilized with Tween 80, despite the much more negative
-potential of sodium caseinates at pH 7. The difference in oxidative stability was associated with
the ability of sodium caseinates to chelate iron (Sugiarto et al., 2010) and to form a 10-nm-thick
layer at the surface of dispersed oil droplet, thus protecting unsaturated FA from oxidation (Hu et
al., 2003). In our study, sodium caseinates did not appear to provide significant additional oxidative
stability to the walnut complex matrix, suggesting that the system is already relatively stable with
respect to oxidation.
183
CHAPITRE 3
Similarly, to processed walnut complex matrixes, MP OB exhibited good chemical stability over
the first 10 days of storage, thanks to their native structure and fat-soluble AO content. The limited
difference in the concentration of oxidation products indicates that isolating OB did not affect their
protection capacity against oxidation, underlining the interest of using these minimally-processed
compounds in food applications. Similar results were obtained on soybean OB by Kapchie et al.
(2013), who found low oxidation of isolated OB suspensions without the presence of prooxidant
metal species at physiological pH and after 12 days of storage at 60°C, while the PV was 14 meq
O2/kg and TBARS was 0.4 mmol eq MDA/kg. Ding et al. (2018) also studied the chemical stability
of isolated OB dispersions for 14 days in the dark at room temperature. Their results confirmed the
good stability to oxidation of the emulsions, with low PV and TBARS of 7 meq O2/kg and 0.003
4.2. Processed OB (HHP and HHPT) were less stable to oxidation than MP OB
The processing operations, i.e. homogenization and heat-treatment, resulted in the reorganization
of the OB membrane, increasing exchanges with reactive species. This change in the membrane
led to a significant increase in oxidation compared to MP OB, despite the similar chemical
composition of the systems. These results confirm the importance of the native assembly in the
chemical stability of OB, underlining the need to rethink food processing to insure better
preservation of natural assemblies and their properties when these assemblies are used in quite
purified forms.
Overall, the oxidation of these MP OB reduced the internal cohesion of the OB and consequently
184
CHAPITRE 3
Figure 6 - Proposed mechanisms of OB organization at the air-water interface for (A) Fresh MP OB; and (B) Oxidized
MP OB.
The combination of simultaneous ellipsometry, tensiometry and AFM results of MP OB and model
air/water interface. Overall, biophysical results indicate that isolated fresh MP OB retained their
native microstructure when adsorbed to the air/water interface. The model solutions containing
oleosins (3% wt.) led us attribute the 6-12 nm height “peaks” on the fresh OB AFM images to the
presence of oleosins. Indeed, a height of 12 nm was determined for soybean oleosins by Zielbauer
et al. (2018) using small angle neutron scattering, which correspond to the height of the “peaks”
obtained in AFM size profiles. Big bright protuberances 4 nm in height visible on the AFM images
185
CHAPITRE 3
of MP OB were identified as oleosins, PL and TAG assemblies, that remained very cohesive due
to hydrophobic interactions.
In contrast, the structural modification of the membrane caused by oxidation reduce cohesion
between the different components, as revealed by the results of the biophysical analysis. The final
ellipsometric angle and surface pressure were indeed lower than in the fresh MP OB sample. The
AFM images reinforced these results, showing a different interfacial organization when the objects
were oxidized, in particular the absence of TAG, PL and oleosins assemblies. Smaller domains (1
nm in height) were probably lipid domains in crystalline phase, composed of palmitic and stearic
saturated FA. This observation tends to confirm the thermotropic crystalline mesophase of OB
membrane proposed by (Nikiforidis, 2019) and suggests that oxidation led to the solubilization of
Waschatko, Schiedt, et al., (2012) proposed different models for the structural organization of
soybean OB interface. Figure 6.A presents a model for the organization of walnut OB at interfaces
based on the models of Waschatko et al., emphasizing the new understanding enabled by the results
we obtained in the present study. When the isolated fresh OB solution is deposited in the Langmuir
trough, OB rise to the interface before opening. When the lateral surface pressure is sufficient to
maintain cohesion of the components, they remain assembled and form protuberances, visible at
the interface, with the central hydrophobic domain of oleosin oriented toward the surface. In
addition, mixtures of unsaturated and saturated fats can form fat droplets, as confirmed by the
presence of irregularly shaped globules in the AFM images of isolated fresh MP OB. Low height
domains of saturated TAG and PL complete the interface background. When the membrane
structure is altered by protein cleavage (Waschatko et al., 2012) or by oxidation, the lateral pressure
is no longer sufficient to maintain the assemblies of oleosins, TAG and PL, as illustrated in the
model proposed in Figure 6.B. The rigid native "T" conformation of oleosins is no longer
186
CHAPITRE 3
preserved, and some oleosins are presumed to unfold at the interface or are solubilized as protein-
lipid clusters. Like in the fresh sample, saturated PL and TAG domains also form at the interface,
but oxidation is responsible for the solubilization of unsaturated lipids, leading to the disappearance
This better understanding of the interfacial behavior of MP OB from different botanical sources
will ease the development of innovative emulsions or foams in which MP OB can be used as
functional ingredients. They will be specifically useful to design heterogeneous systems in which
187
CHAPITRE 3
CONCLUSION
Oxidation tests and biophysical tools were used to study the oxidative and interfacial behavior of
walnut OB in different matrixes. Strong chemical stability of the complex walnut matrixes was
evidenced under accelerated oxidation conditions, thanks to the presence of many endogenous
proteins and antioxidant compounds. Isolation of OB from the complex matrix did not alter their
protection against oxidation, thanks to their native assembly as well their fat-soluble antioxidant
MP OB adsorb at an air/water interface, the good cohesive ability of their native assembly allows
them to keep intact their microstructure. Oxidation was shown to alter this internal cohesion of OB
Taken together, our results show that when OB are incorporated in the structure of new food
products, their chemical and physical stability during the design process should be taken into
consideration. Indeed, alteration of the physical structure of OB during processing may affect their
chemical stability during storage and hence the quality of the final product expected by the
consumer. This finding underlines the need to rethink food processing to preserve natural
188
CHAPITRE 3
noix leur apporte une protection naturelle contre la déstabilisation physique et chimique,
constituants de l’assemblage natif permet aux OB de garder leur microstructure intacte lors
189
CHAPITRE 4
190
CHAPITRE 4
CHAPITRE 4
CAPACITÉ D’ADSORPTION ET
ACTIVITÉ ENZYMATIQUE DE LA
NATURELS
191
CHAPITRE 4
192
CHAPITRE 4
193
CHAPITRE 4
niveau des monocouches hétérogènes de lipides végétaux. Pour rappel, la lipase gastrique est une
enzyme particulièrement tensioactive, qui agit dans les premiers temps de la digestion gastro-
intestinale des lipides. Elle ne possède pas d’activité enzymatique sur les lipides polaires, mais la
stabilité des émulsions lipidiques après la phase gastrique influence grandement l’étendue de la
lipolyse intestinale subséquente (Infantes-Garcia et al., 2021; Golding & Wooster, 2010).
Afin d’accéder à une compréhension approfondie des facteurs influençant les mécanismes
enzyme analogue, la rDGL, ont été étudiés. Le comportement de la rDGL à l’interface air/eau a été
déterminé au niveau des monocouches modèles de lipides GL, GL/DPPC, et GL/DPPC/pS, puis au
niveau de membranes de lipides extraits des membranes végétales, présentant des hétérogénéités
de phases naturelles de par leur complexité de composition en lipides totaux et en acides gras. Le
comportement de la rDGL a également été étudié en cellule microfluidique dans des conditions
plus proches de celles retrouvées lors de la digestion gastrique chez l’Homme, en prenant comme
L’objectif était ici de vérifier les mécanismes d’adsorption de la rDGL obtenus sur les membranes
modèles hétérogènes en fonction de leur composition, afin d’étudier son adsorption au niveau des
structure impactant sur le comportement général de l’enzyme en conditions gastrique ont ainsi pu
être déterminés.
194
CHAPITRE 4
ABSTRACT
The rapid and preferential adsorption of a gastric lipase recombinant dog gastric lipase (rDGL) in
heterogeneous films of phospholipids and triacylglycerols has previously been unveiled using
atomic force microscopy. Here we investigate the adsorption behavior of rDGL in heterogeneous
representative of plant membrane. Again rDGL, preferentially got adsorbed at the expanded lipid
phases of the films underlining the genericity of such adsorption behavior. The addition of
phytosterols to these mixtures resulted in the creation of defects, favoring the adsorption of rDGL
at the fluid phases, but also improving the adsorption capacities of the lipase at the phase boundaries
and towards the defects in the condensed phase. rDGL, like all gastric lipases, does not show any
activity on galactolipids and phospholipids but its adsorption impacts their lateral organization and
may change the adsorption and activity of other lipolytic enzymes in the course of digestion.
195
CHAPITRE 4
1 INTRODUCTION
Lipases (EC 3.1.1.3, triacylglycerol hydrolase) play an important role in lipid metabolism, and have
been found in most living organisms, from the plant kingdom to microorganisms and animals (A.
H. C. Huang, 1987; Jaeger et al., 1994). Lipases are water-soluble enzymes that catalyze the
hydrolysis of the ester bonds of insoluble triacylglycerols (TAG). Prior to the hydrolysis of their
substrates, lipases must therefore get adsorbed onto the lipid-water interface (Aloulou et al., 2006).
The digestion of lipids is a complex phenomenon, which depends on their chemical structure, their
organization in water (monolayers, bilayers, micelles, oil/water emulsions…) and the ability of
lipolytic enzymes to interact with these lipid assemblies. Indeed, the mechanisms involved in
In humans, lipid digestion starts in the stomach where gastric lipase is responsible for 10%
to 25% of the TAG total digestion (Carrière et al., 2001; Lengsfeld et al., 2004) and is very central
during neonatal period as it is mature at birth (Bourlieu et al., 2015). It is worth nothing that gastric
lipase is a true lipase, acting on TAG digestion but not on polar lipids, such as phospholipids or
galactolipids. Human gastric lipase (HGL) is a globular enzyme of 50 kDa, belonging to the /
hydrolase family, and possessing a classical Ser-His-Asp catalytic triad (Canaan et al., 1999). The
active site is covered by a lid, which has to be displaced to permit the TAG substrates to have
access to a large hydrophobic binding site, part of the interfacial recognition site.
Gastric lipase has been found to be highly active in the acidic environment of the stomach
with an optimum at pH 4-5.4, thanks to a remarkable stability and adsorption capacity at the
196
CHAPITRE 4
lipid/water interface at low pH, in contrast to other lipases (Bénarouche et al., 2013; Chahinian et
al., 2006). This interfacial adsorption is pH-dependent although it is mainly driven by hydrophobic
interactions between the substrates and the large hydrophobic ring surrounding the active site
Prior to hydrolyzing TAG, lipases frequently have to get adsorbed onto interfacial films composed
of polar lipids and/or amphiphilic proteins (Bénarouche et al., 2017), in which a small fraction of
TAG playing various metabolic part can also be found (Lerique et al., 1994). This is typically the
case of milk fat globules and phospholipid-stabilized emulsions. Polar lipids are not hydrolyzed in
the upper gastrointestinal tract by gastric lipase, but this enzyme has a strong ability to get inserted
into phospholipid (PL) monolayers thanks to its high surfactant capacity (Bénarouche et al., 2013;
de La Fournière et al., 1994) and thus, has access to the TAG substrate. In addition, gastric lipolysis
favors the activity of pancreatic lipase (Gargouri, Pieroni, Rivière, et al., 1986) and has been
recently reported to significantly affect the production and the degradation of intermediate TAG
digestion products during the intestinal phase (Infantes-Garcia et al., 2021). Given the synergy
between the gastric and intestinal digestion phases, it is crucial to obtain knowledge on the protein-
lipid interactions occurring during the gastric phase, including the impact of gastric lipase
adsorption onto the interfacial organization of membrane lipids, even though gastric lipase is not
active on phospholipids (Carrière et al., 1991) nor on galactolipids (Wattanakul et al., 2019).
Polar lipid films are useful tools to study the interfacial properties of lipases, irrespective
of their lipolytic activity. Langmuir films used as model interfaces allows determining the impact
of various physicochemical parameters, including the lipid packing and composition at the
air/water interface, on the adsorption and insertion capacity of a lipase. The variations of surface
pressure are related to interactions between molecules, which are directly connected to the
197
CHAPITRE 4
variations of molecular areas. The coupling of surface pressure measurements and ellipsometry
provides insights on the thickness and refractive index of the surface layer formed, and thus on the
Previous studies have been done on the adsorption behavior of gastric lipase onto model
heterogenous films mimicking the outer layer of the membrane of human and bovine milk fat
globule (Bourlieu et al., 2016, 2020). These studies have shown that the coexistence of expanded
and condensed phases influenced sternly lipase adsorption: lipase got rapidly inserted onto the fluid
phase and at the phase boundaries. In addition, different levels of insertion were observed
suggesting a molecular cooperation and besides hydrophobic interactions local negative charges
reinforced adsorption.
However, to the best of our knowledge, no study has yet tackled the question of adsorption
and penetration mechanisms of gastric lipase onto plant cell membranes, especially the nature
galactoglycerophospholipids (or galactolipids), which accounts for more than 70% of polar lipids
(Dörmann & Benning, 2002). In addition to their biological and structural functions in membranes,
galactolipids are of nutritional importance since they are rich in polyunsaturated fatty acids
(PUFA), essentials to cell functions in the human body, and especially in the -linolenic acid
(C18:3 n-3, ALA) (Sahaka et al., 2020). Phytosterols and carotenes are also major constituents of
plant cell membranes (Grosjean et al., 2015; Silvius, 2005). They play a key role in maintaining
permeability, fluidity and rigidity (Dufourc, 2008; Silva et al., 2007). The chemical structures of
phytosterols are similar to those of animal cholesterol, nevertheless the absorption of the majority
198
CHAPITRE 4
of phytosterols in the intestinal tract of mammals is up to ten times lower than that of cholesterol
(von Bergmann et al., 2005). In humans, phytosterol consumption has been shown to induce a
lowering of plasma cholesterol levels, thus preventing cardiovascular diseases and atherosclerosis
(Moghadasian & Frohlich, 1999). Sterol molecules are known to promote hydrophobic interactions
between membrane lipid acyl chains, which introduce a higher order and a subsequent rigidification
of membranes (Silva et al., 2011). At the air/water interface, the incorporation of phytosterols
molecules in a phospholipid film has been shown to reorganize the monolayer, by modifying the
packing and orientation of the polar heads of phospholipids (Hąc-Wydro et al., 2007).
Figure 1 - 3D structure of recombinant dog gastric lipase. Panel A: ribbon model showing the secondary structure
elements of rDGL with the lid in the open conformation and putative orientation at lipid-water interface based on the
localization of the interfacial recognition site. Panel B: Top view and molecular surface representation
(white=hydrophobic; yellow=polar) of rDGL showing the hydrophobic ring surrounding the active site entrance.
Views were prepared using PyMol software (Schrodinger, L. (2010) The PyMOL Molecular Graphics System, Version
1.3r1.) and the crystal structure of rDGL (PDB: 1K8Q).
199
CHAPITRE 4
In this context, the present work aimed at determining the interaction of gastric lipase with
Biophysical tools such as the combination of ellipsometry and tensiometry were used to monitored
the lipid-protein interactions at the air/water interface. Atomic force microscopy was further used
to study the distribution of the enzyme into the heterogeneous lipid systems. Recombinant dog
gastric lipase (Figure 1) was used as a representative gastric lipase available in a purified and well
characterized form (Roussel et al., 1999) and with close homology with human gastric lipase.
2 EXPERIMENTAL SECTION
Chloroform and methanol were purchased from Sigma Aldrich Ltd. (St. Quentin Fallavier, France).
If not stated otherwise, all biophysical characterizations were conducted at least in triplicate.
Monolayer composition
200
CHAPITRE 4
from Avanti Polar Lipids (see supplementary data for their fatty acid composition). Canola
phytosterols (pS) from the deodorization distillates of canola oil were obtained as a gift from
Cognis France (Estarac, France). The typical molar composition (estimated from usual normalized
GC procedures) was: β-sitosterol (50.3 mol%), campesterol (38.9 mol%) and brassicasterol (10.5
mol%). -sitosterol and campesterol are the most commonly found in the human diet due to their
high composition in nuts and oilseed species (Cañabate-Díaz et al., 2007; Phillips et al., 2005).
Brassicasterol is a phytosterol found in some unicellular algae and terrestrial plants such as
Simple binary mixture of MGDG and DGDG (60:40, mol/mol) was prepared, namely GL. Ternary
and quaternary mixtures of GL, DPPC and pS, namely GL/DPPC (50:50, mol/mol) and
GL/DPPC/pS (45:45:10 mol/mol/mol), respectively, were also prepared to mimic the composition
of natural vegetal membrane (see table 1 for relative molar composition). Lipid-lipid interactions
and molecular organization at the air/water interface of the three monolayers studied are reported
Recombinant dog gastric lipase (rDGL) (86% amino acid sequence identity with HGL) was
as described previously (Roussel et al., 1999). rDGL stock solution was prepared at a concentration
of 1.8 mg/mL in 10 mM sodium acetate buffer, 100 mM NaCl, 20 mM CaCl2, pH 5, and stored at
-20°C. Diluted aliquots at a final concentration of 1.92 mg/mL (40 nM) were prepared in the same
201
CHAPITRE 4
Kinetic measurements over 5 hours were performed using circular Teflon trough of 8 mL (surface
area of 27 cm²). Kinetic measurements over 2 hours before Langmuir Blodgett transfer of the
interfacial film were performed using Langmuir trough of 50 mL and a surface area of 35 cm².
Before each experiment, the Teflon trough have been carefully cleaned with UP water and ethanol
measurements were performed during half an hour on 10 mM acetate buffer, 100 mM NaCl, 20
mM CaCl2, pH 5 before experiments to check the cleaned surface before experiments. The surface
pressure () and the ellipsometric angle () were recorded at the same time. was measured
feedback system to measure the surface pressure (Nima Technology, UK). Values of were
recorded every 4 s with a precision of ± 0.2 mN/m. Ellipsometric measurements were carried out
Renault, 1993; Bourlieu et al., 2020). The laser beam probed a surface of 1 mm2 and a depth in the
order of 1 µm and provided insight on the thickness of the interfacial film formed at the interface.
Values of the ellipsometric angle (, °) were recorded every 4 s with a precision of ± 0.5 °.
2.4 Adsorption of rDGL onto multicomponent lipid monolayers and at the air/water interface
in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) over the surface of the buffer solution until an initial pressure of 20 ± 1
mN/m was reached (Bénarouche et al., 2013). After stabilization of the film over 5 minutes, rDGL
was further injected in the sub-phase at a final concentration of 40 nM. The increase of the surface
202
CHAPITRE 4
pressure and ellipsometric angle due to protein adsorption onto the lipid monolayer was
2.5 Visualization of phase separations and lipase distribution in heterogeneous film by atomic
force microscopy
For AFM imaging, interfacial films were transferred onto a freshly-cleaved mica plate using the
Langmuir-Blodgett method. The transfer was processed after 2 hours kinetics at a constant surface
pressure and at a very low speed (0.5 mm.min-1). Imaging was carried out with an AFM (Multimode
Nanoscope 8, Bruker, France) in contact mode QNM in air (20°C), using a standard silicon
cantilever (0.06 N/m, SNL-10, Bruker, France), and at a scan rate of 1 Hz. The force was minimized
during all scans and the scanner size was 100×100 µm². The processed images analyzed by the
software was used to perform the analysis of AFM images. The functions Plot Profile, Threshold,
Particle Analysis, Make Binary and Dilate were applied to study the different height levels as well
as the shape of the protein networks. ImageJ software was used to perform different height analyses
(based on the analyses of five plot profiles taken randomly in the AFM image) and thresholds on
the raw AFM images (see supplementary data), in line with the study of Bourlieu et al. (2016)
3 RESULTS
The adsorption kinetics of rDGL onto the GL monolayer was studied by tensiometry and
ellipsometry, at 20 mN/m. Under these conditions, the GL monolayer forms a liquid expanded (LE)
phase. The results obtained on this homogenous system were then compared with the rDGL
203
CHAPITRE 4
adsorption kinetics onto heterogenous film based on mixture of galactolipids and phospholipids
(GL/DPPC monolayer). Under these conditions, some phase separation occurs with the coexistence
The gastric lipase was injected into the subphase after 5 minutes equilibrium of the GL and
GL/DPPC lipid films, respectively. The adsorption kinetics were monitored over five hours. The
variations with time in the ellipsometric angle and surface pressure are shown Figure 2.
Figure 2 - (A) Kinetic evolution of the surface pressure (circle, red) and ellipsometric angle (triangle, blue) upon rDGL
adsorption at the air/water interface onto GL lipid film and, (B) Kinetic evolution of the surface pressure (circle, red)
and ellipsometric angle (triangle, blue) upon rDGL adsorption onto GL 50/DPPC50 monolayers performed at an initial
surface pressure of 20 mN/m. The rDGL was injected in the subphase after 5 minutes stabilization of the monolayers
at the air/water interface.
In figure 2.A, the surface pressure increased quickly after the injection of the enzyme in the
subphase below the GL monolayer, while the ellipsometric angle remained stable over the first few
minutes of kinetics, reflecting the accumulation of the gastric lipase below the air/water interface.
After one hour kinetic, the surface pressure started to slowly decrease, together with a drastic
increase in the ellipsometric angle from 6.9° to a maximum value of 12.9°, reflecting a
204
CHAPITRE 4
reorganization at the interface and the subsequent adsorption of the enzyme onto the lipid
monolayer. The evolution of the surface pressure and ellipsometric angle after injection of gastric
lipase in the subphase of the GL/DPPC system (fig. 2.B) followed a similar evolution. The
maximum increase in the surface pressure (max) was similar for both systems (max=1.2 mN/m
vs 1.4 mN/m, for GL and GL/DPPC films, respectively). Nevertheless, for the GL50/DPPC50
monolayer, the ellipsometric angle started to increase right after the injection of the lipase into the
subphase, reflecting a faster adsorption of the rDGL onto the heterogeneous film, probably due to
the different orientation of the GL polar heads in the presence of DPPC. Indeed, the lag phase
before the start of rDGL adsorption observed in the case of the GL monolayer could be due to the
packing and orientation of the GL polar heads, which could hinder the access of the enzyme active
site to the interface. In addition, it is important to point that addition of DPPC triggers phase
separation which has been demonstrated as a structural feature favoring rDGL adsorption. For both
systems, an equilibrium plateau was reached from 3h and until the end of the kinetics, with similar
The max values obtained upon rDGL adsorption on GL and GL/DPPC films are lower than those
previously recorded upon rDGL adsorption onto pure phospholipid (PC) films (Bénarouche et al.,
2017) or films mimicking bovine milk fat membranes and presenting phases coexistence (Bourlieu
et al., 2016). This may result from weaker electrostatic interactions of rDGL with the neutral GL
(compared to milk polar lipids (MPL)) which in general have charged polar heads. In addition to
weaker electrostatic interactions, the galactose residues of GL polar heads may also generate some
steric hindrance for lipase penetration into the film. Difference in fatty acyl moieties (chain length
and unsaturation degree) may also influence lipid packing and rDGL adsorption.
205
CHAPITRE 4
microscopy
AFM images of monomolecular films in the presence of rDGL were made after sampling the
interface using the Langmuir Blodgett method after 2h of kinetics. The use of AFM allowed the
topographic visualization of the interface at the nanoscopic scale. The AFM images of the interface
were compared before and after the rDGL injection to highlight the distribution of the enzyme in
the GL films and to determine the reorganization of the monolayers induced by the lipid-protein
interactions. Details on AFM study on GL mixed films in the absence of rDGL are reported in
Figure 3 - AFM images (5×5 µm² and 1×1 µm²) of GL monolayers at an initial surface pressure of 20 mN/m before
(-rDGL, red) and after (+rDGL, green) rDGL injection (40 nM final concentration, 5h kinetics). A cross-section of
height profile is representative for 1×1 µm² image after rDGL injection. ImageJ analysis was performed on a 0.56 µm²
crop to determine the shape of the protein network (see material and methods). The vertical color scale from dark
brown to white corresponds to an overall height of 15 nm.
The injection of rDGL in the subphase (40 nM) clearly modified the morphology of the GL film
(fig. 3) and triggered the formation of homogeneous patches onto the fluid phase after 2h of
206
CHAPITRE 4
kinetics. These patches, assumed to reflect protein adsorption, had a mean width of 300 nm, which
could correspond to 60 rDGL molecules, taking a width of about 5 nm for a rDGL molecule
(Bénarouche et al., 2013). The roughness of the GL film before the enzyme injection was no longer
visible on the AFM images in the presence of rDGL, suggesting a modification of the galactolipid-
galactolipid interactions as well as a reorganization of the galactolipid polar heads induced by the
adsorption of the rDGL onto the lipid film. Based on the analysis of five sections of the AFM
image, the height variations of the fluid lipid background ranged from 0 to 0.5 nm (average
height=0.24 ± 0.12 nm), representing about 57% of the interfacial film. After rDGL adsorption, the
cross-section profiles of the AFM images displayed several peaks of varying heights and were
divided into two categories depending on their height levels and occurrences. A first height level
was identified, with peaks ranging from 0.5 to 2.0 nm (average height=0.98 ± 0.4 nm), accounting
for 17% of the interfacial film. A second level was also detected, with heights ranging from 2.0 nm
to 5.5 nm (average height=4.0 ± 0.8 nm), representing about 26% of the interface on the AFM
image. On this second height population, 55% of the heights were included between 3.9 and 4.5
nm, which could correspond to the entire cross-section of rDGL molecules (Roussel et al., 2002)
and thus of protein patches covering an average area of 336 nm² (15 pixels per AFM image), which
would correspond to a consistent value of 47 rDGL molecules, taking a cross-sectional area of 7.2
A saturated phospholipid (DPPC) was added at a molar ratio of 50% in the GL mixture, in
order to induce phase heterogeneity and determine the impact of such heterogeneity on the rDGL
adsorption by introduction of a liquid condensed phase (LC) in the monolayer. The AFM images
207
CHAPITRE 4
(5×5 µm² and 2.5×2.5 µm²) of the interfacial film before and after the injection of the rDGL in the
After injection of the enzyme, the LC domains have merged, adopting a more circular
shape, with heights of 1.7 to 2.3 nm (average height=1.8 ± 0.1 nm), covering an average surface of
36% of the interfacial film. At the very center and on the sides of the LC domains, bright peaks of
2.0 to 8.0 nm in height were also visible, circularly distributed, pointing the heterogeneity of the
gel phase domains. Onto the fluid phase (LE), an irregular protein network was formed, much
denser than the one observed in the case of the GL film (fig. 3), and made of small grains forming
interconnected units of 50.0 ± 20.0 nm width. A sharp demarcation was also visible between the
protein network in the fluid phase and the condensed domains, indicating rDGL exclusion from the
Figure 4 - AFM images (5×5 µm² and 2.5×2.5 µm²) at an initial surface pressure of 20 mN/m before (-rDGL, red) and
after (+rDGL, green) rDGL injection (40 nM final concentration, 5h kinetics) of A) GL/DPPC monolayer (50:50
mol/mol) and B) GL/DPPC/pS monolayer (45:45:10 mol/mol/mol). Cross-sections of height profiles are representative
208
CHAPITRE 4
for 2.5×2.5 µm² image after rDGL injection. (LE – Liquid Expended, fluid phase; LC – Liquid Condensed, gel phase).
The vertical color scale from dark brown to white corresponds to an overall height of 15 nm.
Size analyses and thresholds on AFM images led to the identification of height levels
induced by the interactions of rDGL with the heterogeneous membrane, which are summarized
table 2. As for the GL monolayer, two different height profiles were identified at the fluid phase
level, with similar profiles, indicating the preferential adsorption of the enzyme at the level of the
fluid phase. A new higher height profile was identified at the level of the condensed domains,
where the lipase probably has more difficulty to adsorb due to the high packing.
Table 4 - Summary of height levels identified in AFM images and related to rDGL interactions with model
membranes. Height values are given in nm. The percentages given are the percentage of pixels covered by
the indicated height range (-). Values obtained were based on the analysis of five plot profiles taken
209
CHAPITRE 4
The inclusion of phytosterols in the GL/DPPC mixture has been shown to generate defects at the
level of the condensed phase, due to the preferential interactions between the phytosterols and the
saturated fatty acids [COLSUB_112646, accepted, CSB 2022]. The AFM images figure 4.B
revealed that 2h after the injection of rDGL into the subphase, a regular protein network has formed
onto the fluid phase. This network is composed of interconnected units of the same width as the
protein network formed at the interface of the GL film (30.0 ± 0.0 nm), suggesting a similar
organization of the proteins. Additionally, the delineation between the fluid phase protein network
and the condensed phase domains was no longer visible on the AFM images, in contrast to the
GL50/DPPC50 film, indicating a modification of the protein-lipid interactions and probably a better
miscibility of the components at the interface when pS were added in the system. As for the two
previous samples, image and size analyses have revealed different levels of rDGL adsorption on
4 DISCUSSION
rDGL has been shown to exhibit a high affinity for the interface (air/water or lipid/water) covered
by polar lipids and to form monolayers, which distinguishes it from other globular proteins that
tend to form multilayers (Bolanos-Garcia et al., 2008; Bourlieu et al., 2016). The formation of a
monolayer was also deduced from rDGL adsorption onto a siliconized hydrophobic surface,
monitored using a quartz crystal microbalance (Chahinian et al., 2006). This is probably due to its
structural adaptation that avoids interfacial denaturation and involves a localized conformation
change (lid opening) with the formation of an interfacial recognition site (IRS) on one side of the
molecule (Mateos-Diaz et al., 2017). The binding capacity of the rDGL at the air/water interface
210
CHAPITRE 4
was monitored as the increase in the surface pressure max, correlated to the variations of the lipid
packing and the adsorption of enzyme molecules onto the monolayer. Here, the combination of
data obtained with ellipsometry, tensiometry, and atomic force microscopy analyses provided
insights on the physicochemical behavior and the distribution of rDGL in mixed GL films at the
air/water interface.
4.1. The particular orientation of the galactolipid polar heads could limit the enzyme
adsorption at the interface of the monolayer despite the high surface activity of rDGL
The adsorption of rDGL onto mixed GL film (initial =20 mN/m) triggered a slight increase in the
surface pressure (max=1.2 mN/m). Although this result reflects lipid-protein interactions at the
air-water interface, this increase in the surface pressure was more discrete than those reported by
Bottier (2006) upon the adsorption of pin-a isoform of puroindoline, a small globular protein (13
kDa), onto homogenous monolayers of pure MGDG or DGDG isolated from wheat. Indeed, a
pressure increase of 4.4 and 2.5 mN/m at 20 mN/m was obtained upon adsorption of pin-a onto
pure MGDG and DGDG films, respectively. The insertion of pin-a onto the GL films could be
explained by the fluidity of GL as well as by the establishment of hydrophobic and Van der Walls
interactions between the galactosyl head groups and the numerous tryptophan moieties of
puroindolines, favoring their penetration into GL films. Furthermore, the overlap of the MGDG
heads from 20 mN/m could have induced the formation of local instabilities, favoring the insertion
of the protein in the film, explaining the greater increase of pressure. Conversely, the larger polar
heads of DGDG could have limited the insertion of pin-a, thus explaining the lower pressure
increase. Indeed, despite the larger polar head of DGDG than MGDG, digalactosyl residues possess
the ability to adopt a tilted orientation, at 40° to the interface normal, in contrast to the polar head
of pure MGDG, which was oriented parallel to the interface (Bottier, 2006). The particular
211
CHAPITRE 4
orientation of the digalactosyl residue of DGDG is consistent with the results obtained by Chu et
al. (2010) on the digestibility of an olive oil stabilized by either DPPC or DGDG, showing that the
air/water interface occupied by DGDG was more resistant to the adsorption of bile salts, pancreatic
The small increase in surface pressure and the latency phase observed before the increase of the
ellipsometric angle in the case of rDGL is therefore more consistent with a discrete adsorption
behavior onto the mixed GL monolayers at 20 mN/m. The more limited insertion of rDGL could
have been due to the larger size of the protein (40 kDa versus 13 kDa for pin-a puroindoline), but
also to the fact that the monolayer was composed of a mixture of GL, and not of pure MGDG or
DGDG. Indeed, in the equimolar mixture, a reorientation of the DGDG polar heads was observed,
with the digalactosyl moiety orienting parallel to the interface, suggesting strong interactions
between MGDG and DGDG and allowing tighter packing of mixed galactolipid molecules at the
interface that could inhibit the lipase adsorption (Bottier, 2006). Moreover, the adsorption kinetics
properties of gastric lipase could also result from the interactions between the substrates and the
active site of the enzyme. The active site of rDGL being composed of several basic residues, it is
compared to a charged phospholipid monolayer, explaining the lower adsorption capacity of rDGL
to the GL monolayer in our study. Indeed, electrostatic interactions allow the stabilization of the
open conformation of the lid protecting the active site of the rDGL, ensuring a favorable orientation
for its adsorption. The absence of charge at an interface decreases the establishment of electrostatic
interactions with the enzyme, which could slow down or even hinder its adsorption.
Overall, the extend of rDGL adsorption onto the lipid monolayer seems to be highly dependent on
the lipid packing and acyl chain composition. Indeed, a higher increase of (max=8 mN/m) was
212
CHAPITRE 4
monolayer in the same conditions (Bénarouche et al., 2013). Moreover, rDGL shows a higher
penetration capacity into medium chain DLPC than into long chain egg PC monolayers, with
critical surface pressures of insertion (c) of 30.3 mN/m and 21.5 mN/m, respectively. The surface
pressure chosen here with GL film (=20 mN/m) therefore represents harsh conditions for rDGL
adsorption and penetration. An higher increase of the surface pressure was also reported by
Bourlieu et al. (2016) on milk polar lipids with or without residual triacylglycerols MPL and
In our study, the ellipsometric data suggested that a significant amount of rDGL was adsorbed onto
the GL monolayer after 1h latency phase, with a high ellipsometric angle variation of =4.2°
obtained after 2h of kinetics. This value was higher than that obtained on MPL (=3.1°) but much
lower (=18.3°) than that obtained on MPLTC after 5 hours of kinetics. Overall, the results of
tensiometry and ellipsometry analysis confirmed the adsorption of rDGL onto the GL monolayer,
although to a lesser extent than for bovine milk membranes (MPL and MPLTC) due to the particular
orientation of the polar head of galactolipids and the uncharged surface of the monolayer.
4.2. rDGL undergoes conformational changes upon adsorption, explaining the different level
The AFM images of the GL film evidenced the formation of protein patches at two different height
levels in the fluid phase 2h after the injection of rDGL in the subphase. Different levels of rDGL
adsorption have already been reported (Bénarouche et al., 2013, 2017; Bourlieu et al., 2016, 2020)
as being dependent on the monolayer composition but also on the conformation of the adsorbed
enzyme, which reflect its level of interaction and activity with the substrate. This may result from
213
CHAPITRE 4
structural changes occurring upon protein adsorption at the air/water (or lipid/water) interface. The
unfolding and denaturation of proteins at the interfaces are well-known behaviors, especially when
interfacial tension is high. For example, lipases are rapidly inactivated at the oil-water interface
when using pure triacylglycerols (Aloulou et al., 2006). Nevertheless, denaturation can be avoided
using surfactants decreasing the interfacial tension or by the enzyme itself. Lipases like gastric
lipase are also known to undergo a localized conformational change with a lid opening that controls
the interfacial recognition site and activity (Mateos-Diaz et al., 2017). Coagulation/aggregation are
additional phenomena that may also occur with proteins at interfaces (James & Augenstein, 1966).
Figure 5 - Proposed model of rDGL distribution in homogenous galactolipid monolayer under gastric conditions
4.3. rDGL is excluded from condensed phase domains in mixed heterogeneous GL-DPPC systems and exhibits similar
adsorption behavior to other small globular proteins
All these phenomena were likely to explain the different levels of insertion of the rDGL in the
mixed GL film. Indeed, the lowest height level could correspond to some denatured rDGL,
unfolded upon adsorption and resulting in an increase in the surface pressure, more favorable to
the adsorption of the enzyme in its active conformation. The second height level corresponding to
214
CHAPITRE 4
homogeneous peak sizes between 2.0 and 5.5 nm is likely to correspond to the adsorption of rDGL
the air/water interface. This level of rDGL would fit with the adsorption model previously proposed
for rDGL (Bénarouche et al., 2013). A model for the rDGL distribution in the GL monolayer under
Numerous studies have been conducted in AFM to investigate the adsorption of various lipases and
phospholipases onto heterogenous supported monolayers and bilayers at the air/water interface
(Balashev et al., 2007; Rangl et al., 2017). Overall, results have indicated the preferential
adsorption of these enzymes at the edges of low molecular packing domains, where the increase of
the curvature favor the amphiphile adsorption (Nielsen et al., 1999; Prim et al., 2006).
The lateral distribution of the gastric lipase in monolayers of milk fat globules with phase
heterogeneity has been studied in both human and bovine systems (Bourlieu et al., 2016, 2020).
The coexistence of liquid condensed/liquid expanded (LC/LE) phases in milk fat globule
monolayers has been shown to impact the adsorption of gastric lipase. Indeed, the rDGL gets really
rapidly adsorbed in the LE phase or at the phase boundaries in the bovine milk membrane (BMM)
and human milk membrane (HMM) extracts, showing that the coexistence of LC/LE phase was an
Here, we introduced some phase heterogeneity in the GL monolayer by adding DPPC. As expected,
the AFM images (fig. 4.A) revealed that the rDGL was excluded from the LC phase, and
preferentially adsorb onto the LE phase of GL-DPPC monolayer, which present a lower molecular
packing, probably due to the high composition in PUFA of GL. Indeed, the condensed domains
were likely to include DPPC, with tight packing of its saturated acyl chains preventing lipase
penetration. Nevertheless, the bright peaks visible in the center of the condensed domains seemed
215
CHAPITRE 4
to indicate an adsorption of rDGL at this level, probably due to some compositional heterogeneity
between the center and the edge of the LC domains, favoring a less dense packing or the appearance
of defects at the central level. On the other hand, the adsorption of the rDGL onto the LE phase
nanodomains of irregular shape and width, in contrast to the discontinuous homogeneous network
previously formed in the GL film. Several levels of rDGL insertions were identified, in line with
the results of Bourlieu et al. (2016) on bovine milk fat model membranes (MPL and MPLTC), with
slightly different height values in those different heterogenous systems, which could be explain by
Additionally, the condensed domains composing the LC phase merged and their circularity was
increased, indicating the existence of a line tension at the interface of the LC/LE phases. Indeed,
García-Sáez et al. (2007) have shown that the size and the shape of LC domains composed by
sphingomyelin and cholesterol depend on the balance between the line tension, which tends to
increase the size of the domains in order to reduce the total length of the boundaries, and the
entropic and electrostatic repulsions, which prevent the fusion of the LC domains. Thus, the
increase of the LC domain size in our study is consistent with a higher line tension at their edges.
This change in line tension could be triggered by the greater height difference between the two
phases LC and LE, induced by the adsorption of rDGL onto the fluid phase. Indeed, this height
difference has an unfavorable energy cut per unit length, and as a result, the domain boundary
deforms to counteract this phenomenon, inducing line tension, which may be unfavorable for rDGL
adsorption. Indeed, the sharp domain delineation visible on the AFM image between the fluid-
phase protein network and the LC domains seems to indicate that the rDGL poorly adsorbs at the
phase boundaries.
216
CHAPITRE 4
The adsorption behavior of rDGL on heterogeneous lipid films from animal or plant sources can
be compared to other globular proteins. Weise et al. (2010) studied the adsorption behavior of
several lipid membrane proteins, including N-Ras, a small globular protein (21 kDa), onto
heterogeneous model membranes with coexisting fluid/gel phases. The results of this study
provided direct evidence of the preferential distribution of the N-Ras protein in the fluid phase, but
also at the edges of the LC phase domains, leading to a favorable decrease of the energy between
the phases. This adsorption of proteins at boundary phases was characteristic of proteins inserted
into multiphase lipid systems but which do not show specific preferences for a given phase, so that
they are expelled toward the boundaries. This localization and accumulation of proteins at the phase
interface to decrease the line tension could explain the adsorption behavior of rDGL in the presence
of pS.
4.4. The addition of pS modulated the rDGL adsorption onto mixed GL-DPPC monolayers
In our previous study, the inclusion of phytosterols (pS) in the GL/DPPC film induced a drastic
modification of the interfacial organization, with a dilution of the domains as well as an increase
in the thickness of the condensed phases. This was attributed to interactions between GL and PL
and a condensation effect of pS (X.-M. Li et al., 2003; Su et al., 2007). Moreover, the addition of
pS to mixed DPPC and GL monolayers was found to trigger the appearance of defects into the
condensed phase domains. Previous studies on various other lipases found that defects in lipid
packing could constituted preferential sites for the enzyme anchoring (Balashev et al., 2001, 2007;
Brezesinski & Möhwald, 2003; Nielsen et al., 2002). The presence of local defects in the LC phase
GL/DPPC/pS film reflects a less dense molecular packing, which could favor rDGL adsorption.
Indeed, AFM images recorded after rDGL injection in the subphase of the films revealed
217
CHAPITRE 4
significant differences in the organization at the interface between GL/DPPC and GL/DPPC/pS
films. In the presence of pS, a regular protein network was visible on the AFM images, not only at
the fluid phase but also at the phase domain boundaries and at the defects present on the condensed
phase domains. The absence of a marked delineation of the protein network level between the LE
and LC phases contrasts with the system without pS. It points to an enhancement of the rDGL
adsorption onto the LC domains and at the boundary phase, leading to a decrease of the height
difference between the LC/LE phases and thus to a decrease of the line tension (fig. 4.B), favoring
a more homogenous adsorption of rDGL at the interface. This modulation of rDGL adsorption in
the presence of pS could also be explained by a modification of the lipid-lipid and protein-lipid
interactions. Indeed, hydrogen bridges could be established with the hydroxyl groups of pS, as well
as stacking between rDGL aromatic residues and the sterol backbone, leading to a different
Moreover, the two different levels of rDGL insertion with homogeneous peak sizes onto the GL-
DPPC-pS film (h2, h3) were comparable to those identified in the case of rDGL adsorption onto
models of HMM by (Bourlieu et al., 2020). In contrast, rDGL insertion onto BMM was less
homogeneous, with 3 levels of heights described, similar to the ones evidenced for the GL-DPPC
film. It was speculated by the authors that the particular composition of HMM (high PUFA content,
presence of DHA, presence of anionic PL, coexistence of LC/LE phase) was more favorable to the
action of rDGL than the composition of BMM. Indeed, HMM contained more anionic
phospholipids, which have been shown to enhance the adsorption of rDGL at pH 5 thanks to a
218
CHAPITRE 4
Interest of the study for the adsorption of gastric lipase onto natural plant cell membranes
Plant cell membranes are complex systems containing a large variety of lipid and protein
molecules. The high proportion of DPPC in our model systems (50%) was explained by the need
but was actually far from the palmitic acid compositions (C16 :0) found in natural plant membrane
2021). Indeed, the proportion of palmitoyl chains in natural plant systems is on average between
5-20% wt. of total lipids (D.-S. Lee et al., 1998; Venkatachalam & Sathe, 2006). Nevertheless, the
raft theory in plant membrane systems predicts the existence of lipid assemblies locally enriched
in phytosterol and sphingolipid molecules (Mongrand et al., 2010), which are known to contain
liquid-ordered domains in a fluid environment (Bhat & Panstruga, 2005). These plant membrane
rafts are biochemical homologues of mammalian cell membrane rafts rich in sphingomyelin and
cholesterol, known for their transient dynamic structure in the nanometer range and involved in
signaling and protein transport processes and other cellular processes (Hancock, 2006; Jacobson et
Thus, although our biomimetic membranes constituted a simplified model somewhat far from the
natural plant membrane composition, the general physicochemical trends and adsorption behavior
of gastric lipase at these heterogeneous model membrane systems remain extendable to the protein-
lipid interactions occurring at the so-called raft zones in plant cells. In particular, it appeared that
the presence of phytosterols in condensed domains and, by extension, in plant rafts, may enhance
219
CHAPITRE 4
CONCLUSION
We have shown that Langmuir films and their analysis by tensiometry, ellipsometry and Langmuir-
Blodgett transfer coupled to atomic force microscopy provide a suitable tool for studying the
adsorption and interactions of gastric lipase with biomimetic vegetal membranes. Gastric lipase
binds to these heterogenous membranes with a preference for phase boundaries and defects. It
induces changes in the interfacial organization of lipids although it does not display any activity
on polar acylglycerols from plant membranes (Wattanakul et al., 2019). Since gastric lipase is
known to promote the action of pancreatic lipase through the release of fatty acids and changes in
interfacial properties (Gargouri, Pieroni, Rivière, et al., 1986), the changes observed with plant
polar lipids, without lipolysis, may also trigger the adsorption and activity of other pancreatic
enzymes. This will be the objective of further studies, but the present one is a step forward in the
220
CHAPITRE 4
- La rDGL a été exclue des domaines en phase LC au niveau des monocouches mixtes
GL/DPPC. Ce comportement avait déjà été observé au niveau des membranes hétérogènes
- Les défauts créés au niveau des domaines LC par l’inclusion des pS ont permis d’améliorer
221
CHAPITRE 4
Le comportement d’adsorption de la rDGL a dans un premier temps été étudié au niveau d’une
temps, l’adsorption de la rDGL a été étudiée au niveau des monocouches de lipides extraits des
membranes d’OB de noix et d’amandes, afin de déterminer son comportement au niveau de ces
lipides hétérogènes, en confrontant les modèles végétaux avec les résultats précédemment obtenus
La rDGL a dans un premier temps été injectée en sous-phase d’une solution tampon acétate à pH
5 afin de vérifier son comportement et son activité à l’interface air/eau à une concentration de 1,92
mg/L (40 nM). Les résultats d’évolution de la pression de surface et de l’angle ellipsométrique sur
atteindre une valeur proche de 15 mN/m après 10h de cinétique. Ces résultats confirment ceux
obtenus en 2014 à l’IPR par C. Bourlieu et V. Vié (Annexe V). L’augmentation de l’angle
ellipsométrique a été observée dès le début de la cinétique, et a atteint une valeur proche du plateau
(=11°). Ce résultat était plus faible que celui obtenu en 2014 (=14°) avec une concentration
222
CHAPITRE 4
identique en rDGL. Cette différence pourrait s’expliquer par le changement de cuve (50 mL versus
25
20
(mN/m), (°)
15
10
0
0 2 4 6 8 10
Temps (h)
Figure 40 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rouge), et de l'angle ellipsométrique (, °, bleu) sur une
cinétique de 10h après injection de la rDGL (1,92 mg/L, 40 nM) en sous-phase tampon acétate pH 5 (100 mM NaCl,
20 mM CaCl2, 10 mM acétate de sodium) sur une cinétique de 10h.
surface pendant les premières 30 minutes de cinétique s’explique par l’instabilité marquée de la
hypothèse a été confirmée par la baisse de l’angle ellipsométrique, qui révèle une diminution de
l’épaisseur du film sur cette période. A partir de 30 minutes de cinétique, un plateau a été obtenu à
une pression d’environ =7 mN/m. La pression de surface a ensuite augmenté drastiquement
pendant 1h15, jusqu’à atteindre une valeur de =20 mN/m. Cette évolution témoigne de l’insertion
de la rDGL dans le film, facilitée par la faible compacité de la monocouche induite par la désorption
223
CHAPITRE 4
légèrement augmenté jusqu’à 1h30 de cinétique, puis a atteint un plateau à =9,4° (=2,1 ± 0,1°).
25
20
(mN/m), (°)
15
10
0
0 0,5 1 1,5 2
Temps (h)
Figure 41 - Evolution de la pression de surface (courbe rouge) et de l’angle ellipsométrique (courbe bleue) sur une
cinétique de 2h après injection de la rDGL (1,92 mg/L) en sous-phase de la monocouche de lipides totaux extraits de
la Chlorelle Purasana (pH 5).
obtenue après injection à une pression =21,1 mN/m et à un angle =9,2° montre la formation d’un
réseau protéique, avec des hauteurs variant entre 4 et 5 nm, confirmant l’adsorption de la rDGL en
phase fluide à l’interface. Ces résultats confirment les précédentes observations sur l’adsorption de
préférentielle de la rDGL en phase fluide et à plusieurs niveaux de hauteurs avait déjà été soulignée
(Kergomard et al., CSB, 2022, under review). Néanmoins, la désorption d’un nombre important de
interfacial avant l’insertion de la rDGL, ce phénomène est donc à prendre en compte dans
224
CHAPITRE 4
Figure 42 - Images AFM (5×5 µm²) et variations des hauteurs à la surface du film après 2h de cinétique d’adsorption
de la rDGL (1,92 mg/L) en sous-phase du film de lipides totaux de chlorella vulgaris Purasana (pH 5).
Les capacités d’adsorption de la rDGL ont été étudiées au niveau de monocouches de lipides
extraits des membranes d’OB de noix et d’amandes. Comme précédemment décrit, ces
assemblages membranaires sont composés de phospholipides, qui, avec les oléosines, forment une
Les membranes d’OB de noix et d’amandes présentent des différences de composition notables en
AG. En effet, comme précédemment décrit, les phospholipides membranaires d’OB de noix sont
riches en LA (C18:2, 6, 63% massique des AG totaux), et contiennent de l’ALA dans des
membranaires des OB d’amandes sont riches en acide oléique (C18:1, 9, 70% massique des AG
totaux), acide gras monoinsaturé, et ne contiennent pas d’ALA. Ces différences majeures de
225
CHAPITRE 4
monocouches, qui peuvent avoir des conséquences notables sur l’adsorption des enzymes
rDGL à l’interface air/eau. Les phospholipides extraits respectivement des membranes d’OB de
noix et d’amandes ont été étalés à l’interface air/eau jusqu’à atteindre une pression de surface
initiale de 20 mN/m. Les monocouches formées étaient stables. La rDGL a ensuite été injectée en
sous-phase à une concentration finale de 1,92 mg/L, puis un suivi cinétique de 2h a été réalisé.
Les résultats ont montré des tendances similaires pour les deux systèmes. Quelques minutes après
mN/m pour les deux systèmes) (Figure 43). Un plateau a ensuite été atteint après 1h de cinétique
systèmes. Contrairement au système noix, plusieurs plateaux ont été observés au cours de la phase
d’insertion de l’enzyme. Cette différence dans l’évolution de pourrait être liée à la différence de
composition en AG entre les deux systèmes, celle-ci étant responsable d’une organisation
phospholipides.
226
CHAPITRE 4
Figure 43 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, courbe rouge) et de l’angle ellipsométrique (, °, courbe
bleue) sur une cinétique de 2h après injection de la rDGL (1,92 mg/L) en sous-phase de la monocouche de lipides
membranaires extraits d’oléosomes A) de noix et, B) d’amandes.
L’angle ellipsométrique a également montré une évolution similaire pour les deux systèmes. Une
phase de décroissance (respectivement de =-3,4° et -2,5° pour les systèmes noix et amandes) a
d’abord été observée juste après l’injection de la rDGL en sous-phase, celle-ci étant probablement
liée à la désorganisation de l’interface induite par l’adsorption des premières molécules de rDGL.
L’angle ellipsométrique a ensuite montré une augmentation progressive sur le reste de la cinétique
de =2,0 ± 0,1° à 2h pour les deux systèmes. Cette augmentation de l’épaisseur de la monocouche
rDGL en sous-phase des monocouches de phospholipides extraits des membranes d’OB de noix et
d’amandes, respectivement, est très différente des résultats obtenues par Bourlieu et al. (2016) sur
227
CHAPITRE 4
une faible augmentation de la pression de surface (max=0,6 ± 0,3 mN/m), et au contraire, une
composition proche en classes de phospholipides des monocouches modèles comparée à celle des
En effet, les systèmes modèles étudiés par Bourlieu et al. (2016) étaient composés majoritairement
d’acide oléique monoinsaturé (C18:1, 9, 65% massique) et d’acide palmitique saturé (C16:0, 35%
massique), tandis que, dans notre étude, les phospholipides membranaires sont plus riches en AGPI
(C18:2 et C18:3 pour la noix, et C18:2 pour l’amande). La fluidité plus marquée de ces derniers
Par ailleurs, les expériences de Bourlieu et al. sur des monocouches d’extraits de lipides polaires
purifiés de globules gras laitiers bovins (MPL) corrobore ce résultat. Ce mélange naturel de lipides
(Bourlieu et al., 2020), et les expériences ont montré une augmentation plus importante de la
La Figure 44 présente les images AFM des films interfaciaux de phospholipides membranaires
1h de cinétique, des molécules de rDGL insérées sont visibles à l’interface des deux systèmes.
Dans le cas du système noix, les molécules de rDGL sont présentes sous la forme de traînées
228
CHAPITRE 4
discontinues de points de 4,4 ± 0,2 nm de hauteur, tandis que pour le système amandes, les protéines
Figure 44 - Images AFM (5×5 µm²) de la surface du film de lipides membranaires d’oléosomes de A) noix et B)
amandes, obtenues avant, et après 1h et 2h de cinétique en présence de rDGL (1,92 mg/L) injectée en sous-phase.
Pour les deux systèmes, les domaines circulaires en phase LC sont déstructurés, et il devient
difficile de les attribuer à des caractéristiques topographiques de manière certaine. Par contre, il
229
CHAPITRE 4
apparait des domaines denses, de hauteurs plus importantes, attribuées à la présence de protéines
insérées en bordures des domaines, et probablement adsorbées au centre, avec des hauteurs
hétérogènes moins importantes. Notons que les pressions de surface avant, et après 1h de cinétique
en présence de rDGL sont très différentes pour les deux systèmes, puisque l’insertion de la protéine
A 2h de cinétique, les molécules de rDGL sont plus nombreuses à l’interface des deux systèmes.
Sur le système noix, les traînées de points se sont étendues et ont formé des lignes continues, avec
plusieurs niveaux de hauteurs, comprises entre 2,1 et 5,0 nm. Les domaines en phase LC sont plus
hauts que ceux observés à 1h de cinétique, avec des hauteurs comprises entre 8 et 10 nm. Ces
résultats pourraient s’expliquer par l’adsorption étendue de la rDGL à ce niveau, mais sans
insertion. Un phénomène similaire a été observé dans le cas des phospholipides d’OB d’amandes.
Un réseau protéique moins agrégé et plus étendu est visible sur les images, avec différents niveaux
de hauteurs en phase fluide, comprises entre 1,9 et 4,8 nm, ces valeurs étant cohérentes avec les
et al., 2017).
230
CHAPITRE 4
- Une quantité importante de lipides s’est désorbée en phase fluide à pH 5 dans le cas de la
monocouche des lipides extraits des microalgues Ch. vulgaris Purasana, à cause d’une
probable instabilité due à l’acidité du milieu sur les lipides chargés (SQDG, PE, PS). Cette
désorption a permis à la rDGL de s’insérer en phase fluide, malgré la gêne provoquée par
encombrement stérique des têtes polaires des phospholipides, associé à la présence d’AGPI,
favorisent l’insertion de la rDGL en phase fluide, et son adsorption en dessous des domaines
en phase LC.
231
CHAPITRE 4
gastrique et intestinale au niveau des OB d’amandes. Nous nous sommes intéressés à l’action
coPTL), en présence de sels biliaires. Les OB d’amandes ont été choisis pour leur teneur importante
(2-10 µm) par l’action successive de la lipase gastrique (rDGL) et pancréatique (porcine, PPL-
Des expériences ont été réalisées en utilisant la microscopie UV du synchrotron SOLEIL. A ces
longueurs d’onde (295-305 nm), les acides aminés et notamment le tryptophane émettent de la
fluorescence, ce qui permet de s’affranchir de l’utilisation de sondes exogènes. Les OB ont été
injectés dans des puces microfluidiques, afin de les bloquer dans des pièges lors des différentes
permis de suivre la digestion des OB d’amandes via le microscope Télémos (Figure 45) en
mesurant les variations de fluorescences naturelles des enzymes lors de leur adsorption, ainsi que
232
CHAPITRE 4
Figure 45 – Description du montage utilisé pour suivre la lipolyse des OB d’amande sur la ligne d’imagerie DISCO.
Les puces microfluidiques en polydimethylsiloxane (PDMS) ont été fixées par plasma sur des lamelles rondes en
quartz (R525000, Esco Optics, d=25 mm, t=0,16 mm), puis montées sur une chambre Atto-Fluor, placées dans le
support thermostaté sous le microscope (panneau A) et connectées à une vanne multicanaux et à deux pompes de
micro-injection (panneau B). La première a été utilisée pour l'administration de fluide gastrique simulé contenant de
la lipase gastrique (rDGL) et la seconde pour l'administration de fluide intestinal simulé (SIF) contenant la PPL et sa
colipase. La conception microfluidique contenait quatre chambres parallèles (200×longueur×13 µm) toutes équipées
de pièges conçus pour retenir les oléosomes d’amande. Le panneau C montre les pièges (16×16 µm) dans l'une des
chambres avant l'injection de l'échantillon. Le panneau D montre la même chambre après l'injection des oléosomes
d'amande.
Les images ont été enregistrées avec deux objectifs x40 et x100 (Zeiss Ultrafluar 40x et 100x, Carl
Zeiss GmbH, Allemagne), et 2 images ont été enregistrées successivement sur la même zone, une
en lumière blanche et une en fluorescence. La longueur d'onde d'excitation était de 280 nm et les
filtres passe-bande ont été sélectionnés à 327-353 nm pour la détection des résidus tryptophane
(λmax rDGL =336 nm, λmax PPL=349 nm, le temps d'acquisition était de 20s à 40x et 10s à 100x).
233
CHAPITRE 4
Les images ont été enregistrées toutes les 30 s ou toutes les minutes pendant la phase gastrique de
Le fluide gastrique simulé était à base de NaCl (94 mM), KCl (13 mM) et ajusté à pH 5,5. Il
contenait de la lipase gastrique (rDGL à 17 µg/mL). Le fluide gastrique simulé a été injecté 10
minutes après le début de la phase gastrique à raison de 5 µL/min et pendant 7 minutes. Le fluide
intestinal simulé avait un pH fixé à 6,0 (NaCL, KCl, CaCl2, NaHCO3). Il a été utilisé pour tester
l’action de la PPL à 250 µg/mL + colipase à 50 µg/mL, en absence ou en présence de sels biliaires
(taurodésoxycholate de sodium 4 mM). Après une phase gastrique, les fluides intestinaux ont été
injectés après 5 min d'observation du substrat à un taux de 5µL/min pendant 7 minutes. Une
perfusion continue de ce fluide (2 µL/min) a été maintenue pendant la phase intestinale (40 min au
total).
La dégradation enzymatique des OB d’amandes dans les mini-digesteurs a été testée par injections
fluorescence sur les positions sélectionnées ont montré une bonne répétabilité. La taille des
gouttelettes lipidiques n’a pas évolué de façon significative au cours de la phase gastrique, mais la
à la surface des gouttelettes, en accord avec les observations rapportées à l’interface air/eau sur les
monocouches de phospholipides extraits des membranes d’OB d’amandes (II.3) (Figure 46).
234
CHAPITRE 4
Figure 46 – Visualisation des OB d'amandes pendant la phase gastrique. A) Oléosomes d'amande au début de la
digestion gastrique avant l'injection de la lipase gastrique (image visible T 0 min, 40X, image 283 × 283 µm, position
0), B) Evolution de la fluorescence au cours de la digestion gastrique des oléosomes sur trois positions (POS 0, 1 et 2)
C) Evolution de la fluorescence après injection de la lipase gastrique dans la chambre microfluidique (1 image par
minutes, entre 20 et 30 minutes de phase gastrique, image T+1-T fluorescence 327-335 nm, crop 117 × 108 µm
similaire à l'image.
Après l’addition de la PPL/colipase, une diminution importante de la taille des gouttelettes a été
235
CHAPITRE 4
Figure 47 - Visualisation de la digestion des OB d'amande pendant la phase intestinale. A) OB d'amande au début de
la digestion intestinale avant l'injection de la PTL (image visible T 0, 40X, image 283 × 283 µm), B) Oléosomes
d'amande au début de la digestion intestinale avant l'injection de la lipase PTL (image de fluorescence 327-335 nm T
0 min, 40X, image 283 × 283 µm) C) Evolution des oléosomes d'amande pendant la phase intestinale (1 image toutes
les 5 minutes, image visible, recadrage de l'image 106 × 67 µm, emplacement du recadrage sur l'image A), D) Évolution
des oléosomes d'amande pendant la phase intestinale (1 image toutes les 5 minutes, fluorescence 327-335 nm, image
106 × 67 µm, emplacement de l'image B).
236
CHAPITRE 4
externes l’action de différentes lipases sur les OB d’amandes. Les taux de lipolyse et les
sites d’adsorption des enzymes ont été identifiés grâce à la visualisation de l’évolution de
- L’adsorption de la PPL est moins marquée, mais son action lipolytique rapide est clairement
mise en évidence par une diminution de la taille de gouttelettes, jusqu’à leur disparition.
237
CHAPITRE 4
238
CHAPITRE 5
CHAPITRE 5
COMPORTEMENT D’ADSORPTION ET
SYSTÈMES VÉGÉTAUX
239
CHAPITRE 5
240
CHAPITRE 5
241
CHAPITRE 5
Ce chapitre est dédié à la compréhension des interactions entre les lipases pancréatiques humaines
et les lipides végétaux, qu’ils soient organisés sous la forme de monocouches (échelle moléculaire),
a dans un premier temps été donnée à la compréhension des mécanismes d’action de la PLRP2
L’objectif de cette étude était de comprendre l’impact du packing local des systèmes lipidiques
étudiés (état de condensation, présence de molécules chargées à l’interface), sur les capacités
Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’action de la sPLA2 (modèles sPLA2-IB),
l’Homme. Nous avons notamment étudié l’impact de la composition et de l’état de phase des
systèmes lipidiques modèles et naturels, mais également de la pression de surface, sur les capacités
d’insertion et l’activité phospholipase de l’enzyme. Comme pour la gPLRP2, ce travail doit être
au niveau des monocouches de lipides modèles et extraits des matrices végétales ont également été
étudiées mais n’ont pas été détaillées dans ce manuscrit. Les résultats obtenus pour cette enzyme
242
CHAPITRE 5
1
Author Affiliation(s) IPR Institute of Physics, Rennes 1 University, France;
2 3
INRAE/CIRAD/UM/Institut Agro Montpellier UMR 1208 IATE, France; Aix-Marseille
Beaulieu, UMR UR1 CNRS 6251, Université de Rennes 1, 35042 Rennes cedex, phone number:
Lacanal, UMR 1208 IATE, 2 Place Pierre Viala, Bât. 31, INRAE/UM/Institut Agro
243
CHAPITRE 5
ABSTRACT
Pancreatic lipase related-protein 2 (PLRP2) has been shown to be responsible for the effective
hydrolysis of galactolipids, the main lipids composing plant photosynthetic membranes. Guinea
pig pancreatic lipase related-protein 2 (gPLRP2) is a model enzyme close to its human analogue,
and that has been extensively studied for its ability to hydrolyze a wide range of acylglycerol
substrates, exhibiting remarkable galactolipase and phospholipase A1 activity. However, the extent
of its enzymatic activity of this lipase depends greatly on the supramolecular structure of the
substrates and the presence of surfactant molecules such as bile salts, which can greatly modulate
In this study, Langmuir model monolayers were used to reproduce homogeneous and
uncharged or charged interfaces, in order to understand the adsorption mechanisms and enzymatic
activity of gPLRP2 on simplified vegetal model membrane. In parallel, digestion kinetics were
performed on 1 µm liposomes of the model systems by gPLRP2, under conditions closer to the
human physiological ones, and in presence of bile salts (bulk conditions). The interfacial behavior
of gPLRP2 was then studied at the level of natural plant lipid monolayers (Chlorella microalgae
extracts), in order to verify the data obtained on model systems, and to understand the impact of
the chemical and physical heterogeneity of natural photosynthetic plant membranes on the
The results have shown that the enzymatic activity of gPLRP2 onto mixed monolayer of
mN/m. These results were confirmed in bulk conditions on 1 µm liposomes, where gPLRP2
showed galactolipase but also phospholipase activity in the presence of bile salts. Interfacial studies
244
CHAPITRE 5
showed enhanced adsorption of gPLRP2 onto model and natural monolayers containing negatively
charged lipids, but the compositional complexity in these systems induced a lag phase before the
monolayer, liposomes
1 INTRODUCTION
Galactolipids are the main lipids found in the photosynthetic membrane of plants and algae,
accounting for more than 70% wt. of the total membrane lipids (Dörmann, 2013; Douce et al.,
1973; Gurevich et al., 1997). Due to the natural abundance of plants and algae on Earth,
galactolipids represent the most important class of lipids and therefore the main source of fatty
acids (80% versus 20% wt. for plant phospholipids and TAG), including some essential
polyunsaturated fatty acids (PUFA) (Gounaris & Barber, 1983). The two main galactolipids
(MGDG, 53% wt.) and digalactosyldiacylglycerol (DGDG, 27% wt.). MGDG possess a unique
small 1--galactose polar head bound at the sn-3 position to a diacylglycerol (Lee, 2000), whereas
DGDG has a larger polar head with an additional -galactose, linked to -galactose (Mizusawa &
Wada, 2012). Both galactolipids possess two esterified acyl chains of fatty acids at the sn-1 and
sn-2 position of the glycerol backbone, whose nature depends mainly on the synthesis pathway of
galactolipids (Glöckner, 2013; Sahaka et al., 2020). In addition to these two glycolipids,
vary between photosynthetic plant species. In particular, the microalgae Chlorella vulgaris
represent a good model for the study of photosynthetic membranes and are rich in photosynthetic
245
CHAPITRE 5
proteins, galactolipids, and pigments (Demarco et al., 2022). These photosynthetic organisms have
been consumed in some parts of the world for centuries and their nutritional potential has been
highlighted in many reports, explaining a growing interest in their use in new food applications
(Torres-Tiji et al., 2020). However, their digestibility by gastrointestinal enzymes has not been
extensively studied.
Galactolipids are naturally rich in essential -linolenic acid (ALA, C18:3 3), which is the
basis of elongation and desaturation pathway leading to the production of longer chain 3 fatty
acids, the eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5, 3) and the docosahexaenoic acid (DHA, C22:6
3) (Kergomard et al., 2021). In particular, these two long-chain PUFA play a crucial role in the
homeostatic regulation of the human body by being the basis for the production of signaling
oxygenated lipids involved in inflammation resolution processes in our body (Saini & Keum,
2018). Galactolipids also contain a significant amount of hexadecatrienoic acid (HTA, C16:3 3),
an unusual fatty acid found mainly in green plants and algae, whose nutritional benefits are still
poorly understood although it has been presented as potential precursor of ALA in rodents
The interesting nutritional profile of galactolipids makes them compounds of interest for
the development of food products rich in 3 PUFA. Nevertheless, in order to exploit the nutritional
humans. Human pancreatic juice and duodenal contents have been shown to exhibit galactolipase
activity (Andersson et al., 1995). This activity was associated to the pancreatic lipase related-
protein 2 (PLRP2), as well as, to a lesser extent, to the bile salt-simulated lipase/carboxyl ester
hydrolase (BSSL/CEH) (Amara et al., 2013; Bakala N’Goma et al., 2012). PLRP2 shows
enzymatic activity on lipid substrates with larger heads than other classical pancreatic lipases such
246
CHAPITRE 5
as HPL. Indeed, in addition to limited lipase activity (1250 versus 8500 U/mg for HPL on
tributyrin), PLRP2 exhibits limited phospholipase A1 (74 U/mg on purified L--PC) and high
galactolipase (~2800 U/mg on MGDG for instance) activities (Amara et al., 2009; De Caro et al.,
2004; Sahaka et al., 2020; Wattanakul et al., 2019). This enzymatic activity on a wider range of
substrates than HPL is explained by the unusual conformation of the lid controlling the access to
the active site of hPLRP2. PLRP2 is also present in the digestive system of other species, and in
particular in monogastric herbivores such as the guinea pig (gPLRP2), whose diet contains
significant amounts of galactolipids. Although PLRP2 has been the subject of numerous studies,
these have mainly focused on the identification and quantification of its galactolipase activity on
synthetic (medium chain acyl GL) or natural substrates, but without giving strong attention to local
physical state, whether it is the level of condensation, or the presence of charged molecules. In our
study, we propose to investigate the adsorption mechanisms of gPLRP2, whose structure is close
at the air/water interface and on 1 µm liposomes in “bulk” conditions close to the human
physiological ones.
modulated by the microstructure of the substrates and the presence of surfactant molecules such as
bile salts, that affect the conformation of the molecular lid controlling the access of its active site
(Eydoux et al., 2008; Van Tilbeurgh et al., 1992). More precisely, galactolipid degradation by
PLRP2, as for the other apolar lipid substrates, depends on their initial structure and assembly, as
well as on the modifications that the interface undergoes in the different compartments of the
gastrointestinal tract (Infantes-Garcia et al., 2022). Indeed, the hydrolysis of lipid substrates by
lipolytic enzymes, including gPLRP2, generates digestion products, some of which are poorly
247
CHAPITRE 5
soluble in water and will therefore remain at the interface. The accumulation of these products can
induce changes in the physico-chemical properties of the interfaces, which can lead to an inhibition
of the enzymatic activity and cause a progressive decrease in the rate of hydrolysis by hindering
the subsequent access to the substrate, characterized by a lag period (Callisen & Talmon, 1998;
The mechanisms involved in the digestion of galactolipid-based emulsified systems are therefore
of critical importance for the subsequent intestinal absorption of polyunsaturated fatty acids. Here
we studied the organizational properties and enzymatic activity of gPLRP2 on different galactolipid
substrates, controlling finely the physical state, i.e. on systems with or without phase
heterogeneities. The adsorption and enzymatic hydrolysis capacity of gPLRP2 were first tested on
molecular level (nm). These three lipid mixtures were then formulated into liposomes and
incubated in the presence of gPLRP2 and bile salts to determine the degradation capacity of the
enzyme at the level of dispersed object (µm) and verify its galactolipase and/or phospholipase A1
capacities. Eventually, these experiments were then reproduced using lipid systems extracted from
2 EXPERIMENTAL SECTION
were purchased from Sigma Aldrich Ltd. (St. Louis, MO). 1,2-dipalmitoylphosphatidylcholine
248
CHAPITRE 5
purchased from Avanti Polar Lipids. Canola phytosterols, composed of a mixture of β-sitosterol
(50 mol%), campesterol (40 mol%) and brassicasterol (10 mol%), were kindly donated by Cognis
France (Estarac, France). Phytosterols were collected from desodorization distillates of canola oil.
If not stated otherwise, all biophysical characterizations were conducted at least in triplicate.
(45:45:10, mol/mol/mol), respectively was also prepared to simplify the composition of natural
vegetal membrane and provide a pronounced phase coexistence. A biomimetic model system was
also prepared, reproducing more accurately the composition of plant photosynthetic membranes,
(56:24:10:10, mol/mol/mol/mol). Relative compositions of the model systems and fatty acid
repartitions of MGDG and DGDG used in this study are given in table S1 and figure S2,
respectively. Finally, a last system was prepared by extraction of total lipids from a commercial
preparation of dried Chlorella vulgaris (Purasana, France). Total lipids were extracted from the
dehydrated algal biomass by the Folch method (Folch, 1957). 5 mL of ultrapure water (UP), 40 mL
of Folch solution (CHCl3/MeOH, 2/1 v/v) were added to the powdered algal matrix. The solution
was mixed using an ultra-turrax (IKA, T18 digital) for 1 minute at 9500 to 13500 rpm. In a
separating funnel, the solution was washed once with a 0.73% NaCl solution, then twice with a
solution containing 40 mL of Folch solution and 10 mL of a 0.58% NaCl solution. The lower phase
was collected between each wash and the solvents were evaporated under reduced atmosphere. The
249
CHAPITRE 5
total lipid and fatty acid compositions of the microalgae Chlorella vulgaris Purasana are available
in figure S3.
Recombinant guinea pig pancreatic lipase-related protein 2 (gPLRP2) was provided by F. Carrière
France. Lipase was produced in Aspergillus orizae and purified as describe in Hjorth et al. (1993).
For the interfacial measurements, a gPLRP2 stock solution (0.15 mg/mL) was prepared in a Tris
HCl buffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7) and aliquots were prepared in the
same buffer before used in experiments at a final concentration of 0.128 mg/L (2.7 nM). This value
is closed to the physiological one divided by 100, corresponding to the usual value used in
interfacial studied to avoid saturating the interface with digestive proteins. Deactivated gPLRP2
variant S125G was used to control the enzymatic activity of the active variant and was produced
as described by Mateos-Diaz et al. (2018). For digestion experiments in static conditions, 100 µL
Kinetic measurements were performed over 2 hours using a computer controlled and user-
programmable LB Teflon Langmuir trough (KSV Nima, Helsinki, Finland) with a surface area of
35 cm² controlled by two mobile barriers. The Teflon trough have been carefully cleaned with UP
water and ethanol before each experiment, and ellipsometric and tensiometric measurements were
The surface pressure () was measured every 4s with a precision of ± 0.2 mN/m using a filter paper
250
CHAPITRE 5
Wilhelmy-plate method. The ellipsometric angle () was recorded simultaneously every 4 s with a
configuration (Berge & Renault, 1993; Bourlieu et al., 2020). The laser beam probed a surface of
1 mm2 and a depth in the order of 1 µm and provided insight on the thickness of the interfacial film
2.4 Monitoring of the gPLRP2 adsorption onto mixed galactolipid monolayers at the
air/water interface
The four monolayers studied were formed by spreading a few microliters of 1 mM solution of lipids
in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) over the surface of the buffer solution until an initial pressure of 20 ± 1
After stabilization of the film over 5 minutes, 14.6 µL of gPLRP2 solution (0.15 mg/mL) diluted
in 30 µL Tris buffer were injected in the sub-phase to achieve a final concentration of 2.7 nM. The
evolution of the surface pressure and ellipsometric angle due to the enzyme adsorption and lipolytic
activity onto the lipid monolayer was continuously monitored over 45 minutes to 2 hours,
depending on the lipolysis rate and before achieving the surface pressure of 6 mN/m, being the
surface pressure of the gel-fluid phase transition of DPPC (Xu & Zuo, 2018).
For AFM imaging, interfacial films were transferred onto a freshly-cleaved mica plate using the
Langmuir-Blodgett method at the end of the kinetic, at a constant surface pressure and at a very
low speed (0.5 mm.min-1). For each monolayer, two sampling were performed at different times,
in order to observe the organization of the interface at different stages of lipolysis. For the GL
monolayer, sampling was performed at 35 minutes and 1 hour, respectively. For the GL/DPPC
251
CHAPITRE 5
monolayer, sampling was carried out at 45 minutes and 1 hour and 15 minutes of lipolysis,
respectively. For the GL/DPPC/pS monolayer, sampling was done at 45 minutes and 1 hour 45
minutes of lipolysis, respectively. Imaging was carried out with an AFM (Multimode Nanoscope
8, Bruker, France) in contact mode QNM in air (20°C), using a standard silicon cantilevers (0.06
N/m, SNL-10, Bruker, France), and at a scan rate of 1 Hz. The force was minimized during all
scans and the scanner size was 100×100 µm². The processed images analyzed by the open-source
respectively, were prepared at a final concentration of 0.4% wt. in Tris HCl buffer (10 mM Tris,
Liposomes were then incubated under constant agitation in Tris HCl buffer (10 mM Tris, 100 mM
CMC value). 100 µL aliquots were sampled at T0 (control) and after 5 min of gPLRP2 digestion
(T5min) and substrates and lipolysis products were extracted by Folch method before deposited in
thin layer chromatography (TLC) to determine their concentrations. The organic and aqueous
phases resulting from the extraction were separated and eluted on TLC plates using a mixture of
chloroform/methanol/water (95:20:2.5, v/v/v). The TLC plate revelation was made using an
orthophosphoric acid/copper sulphate solution. It was thus possible to monitor the enzymatic
detergent.
252
CHAPITRE 5
3.1. Interfacial behavior of model lipid monolayers versus total lipid monolayer extracted
Figure 1 - 5×5 µm² AFM images of A) GL, B) GL/DPPC/pS, C) MGDG/DGDG/SQDG/PG, and D) total
lipid extracted from Chlorella vulgaris Purasana monolayer at 20 mN/m.
Lipid-lipid interactions and molecular organization at the air/water interface of the monolayers
studied have been investigated at 20 mN/m and pH 7 and are presented figure 1. We were able to
form stable galactolipid based-monolayers at the air/water interface. The GL interface was
characterized by a fluid phase, presenting some roughness due to the intercalation of the polar
heads of MGDG and DGDG. The GL/DPPC/pS system showed a coexistence of condensed
liquid/expanded liquid phases, with the presence of condensed phase domains visible on the AFM
images, enriched in DPPC-MGDG and pS. Additionally, the presence of pS in condensed domains
253
CHAPITRE 5
have induced the appearance of defects, that could modulate the subsequent adsorption of lipolytic
small flower-shape nanodomains of 1.6 ± 0.1 nm height were evidenced at the air/water interface,
coexisting with a fluid phase. The morphology of the LC domains was close to the ones obtained
at the interface of the Chlorella vulgaris total lipid monolayer, which was not surprising given the
close chemical heterogeneity of both systems. In the case of the Chlorella vulgaris lipid interface,
however, the LC domains were characterized by two different heights, with the presence of a
central domain of 2.2 ± 0.1 in height, surrounded by a lower crown with irregular edges of 1.5 ±
0.1 nm in height. Small condensed domains with heights between 5 and 6 nm were also visible,
3.2. Interfacial adsorption and enzymatic activity of gPLRP2 onto homogenous galactolipid
monolayer
The interfacial adsorption and enzymatic activity of gPLRP2 onto homogeneous galactolipid
monolayer (GL) was monitored using tensiometry coupled with ellipsometric measurements.
Figure 2.A shows the evolution of surface pressure and ellipsometric angle over one hour after the
injection of gPLRP2 at 0.128 mg/L in the subphase. Right after the injection of the enzyme below
the GL monolayer, the surface pressure started to decrease drastically, indicating the modifications
of the interactions between molecules at the interface and the probable lipolysis of the acyl chains
of galactolipids by gPLRP2. When considering the maximal slope of this decreasing curve, the
range surface pressure of 15 to 10 mN/m was identified as the one where the enzymatic activity of
gPLRP2 was the highest. This latter result was in line with previous studies, in which the maximum
level of activity of gPLRP2 and hPLRP2 was reported between 10 and 15 mN/m onto medium
chain MGDG monolayer (De Caro et al., 2004; Eydoux et al., 2007).
254
CHAPITRE 5
Figure 2 - A) Kinetic evolution of surface pressure (, mN/m, red circles) and ellipsometric angle (, °,
blue triangle) upon the adsorption and kinetic activity of gPLRP2 (0.128 mg/L) onto GL monolayer. B)
AFM images of Langmuir-Blodgett samples after 1) 35 minutes and 2) 1 hour kinetic of gPLRP2 adsorption
onto GL monolayer, respectively.
The evolution of the surface pressure was consistent with a localization of most of the gPLRP2
molecules right below the surface and not directly adsorbed at the interface onto the monolayer, or
an adsorption counterbalanced by lipolysis product generation, giving the fact that the surface
pressure did not shows a significant increase, contrary to what has been observed with other lipases
on heterogeneous monolayers (Bourlieu et al., 2016). This assumption was consistent with the
evolution of the ellipsometric angle, as no evolution was observed during the first 35 minutes of
kinetic after the lipase injection in the subphase. Nevertheless, after 35 minutes of kinetic, the
ellipsometric angle showed a sharp drop of =0.8 at =15 mN/m, probably related to the high
activity of the enzyme at this surface pressure and the subsequent lipolysis of an important
255
CHAPITRE 5
In order to understand the partitioning of the enzyme and the disorganization of the interface
induced by the enzymatic activity, two Langmuir-Blodgett sampling of the interface were realized;
before and after the drop of the ellipsometric angle. The 5×5 µm² AFM images of the two samples,
after 35 minutes and 1 hour kinetic, respectively, are presented figure 2.B. After 35 minutes of
enzymatic kinetic, small flower-like gel phase domains of 1.9 ± 0.1 nm height appeared at the
MGDG and DGDG by gPLRP2, in accordance to the subsequent decrease of the surface pressure.
Protuberances of 3.6 ± 0.3 nm height were also visible, likely to be attributed to some lipase
molecules adsorbed at the air/water interface without losing their enzymatic activity, gPLRP2
being resistant to surface denaturation (Aloulou et al., 2006). After 1 hour kinetic, the resulting
interface had evolved further. Surprisingly, gPLRP2 seems to have formed protein network of 3.4
± 0.1 nm in height, in addition to the protuberances observed on the 35 minutes images, despite the
absence of increase in the surface pressure. Additionally, gel phase domains have grown,
reinforcing the hypothesis of their attribution to the generation of lipolysis products. gPLRP2 is
case of MGDG and DGDG, respectively, as well as free fatty acids (FFA) (Amara et al., 2010;
Withers-Martinez et al., 1996). Due to their polyunsaturated content, it is likely that MGMG and
DGMG molecules remained in the fluid phase at the air/water interface and that the gel phase
domains were probably enriched in saturated fatty acids, the palmitic acid being in the sn-1 position
of DGDG and thus being hydrolyzed by PLRP2. The hydrolysis of MGMG and DGMG by gPLRP2
could also have led to the production of galactosylated products: monogalactosylglycerol (MGG)
and digalactosylglycerol (DGG), respectively, which, due to their polar structure, were likely to
partition into the solution (Sahaka et al., 2021). Thus, the optimal activity observed at 15 mN/m in
256
CHAPITRE 5
the gPLRP2 activity could correspond to the optimal pressure at which MGMG and DGMG could
be hydrolyzed by gPLRP2, leading to the production of MGG and DGG, and explaining the drop
Figure 3 - Kinetic evolution of the surface pressure (, mN/m, red circle) and the ellipsometric angle (, °,
blue triangle) over one hour after the injection of the inactive variant of gPLRP2 in the subphase of the GL
monolayer. B) 5×5 µm² images of the Langmuir-Blodgett sample obtained after 1 hour kinetic.
To verify that the evolution of the surface pressure and the ellipsometric angle was consistent to
the galactolipase activity of gPLRP2, and not only to the interactions with the lipid monolayer, the
experiment was reproduced using an inactive variant (S125G), where the catalytic serine S152 was
replaced by a glycine, resulting in the loss of the enzymatic activity. The S125G variant of gPLRP2
was characterized using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) in the study of Mateos-
Diaz et al. (2018), showing that the inactive variant retained his correct folding and its lipid-binding
site compared to active gPLRP2, so that its interfacial behavior should not be affected.
Figure 3.A. presents the kinetic evolution of the surface pressure and ellipsometric angle over 1
hour after the injection of the inactive variant of gPLRP2 into the subphase of the GL monolayer.
257
CHAPITRE 5
After the S125G gPLRP2 injection in the subphase, there was no evolution in the surface pressure,
nor in the ellipsometric angle, confirming the absence of enzymatic activity. AFM image showed
figure 3.B indicated the presence of the same protuberances observed with the active enzyme, with
similar height of 3.8 ± 0.2 nm. It thus seems that, despite the lack of surface pressure increase, the
3.3. Modulation of the gPLRP2 adsorption and kinetic activity onto heterogeneous model
Figure 4.A shows the kinetic evolution of the surface pressure and ellipsometric angle upon the
adsorption and enzymatic activity of gPLRP2 onto GL/DPPC/pS monolayer. The surface pressure
showed a similar evolution than for the GL monolayer, with a decrease right after the injection of
the enzyme in the subphase of the GL/DPPC/pS monolayer. However, the decrease in surface
pressure was less pronounced at the beginning of the kinetic in the case of the heterogeneous
monolayer, reflecting the slowing down of the lipolysis rate. A lag phase was indeed observed
before reaching the maximum activity of gPLRP2 at 15 mN/m, with a concomitant decrease in the
ellipsometric angle (=0.9°) probably corresponding to the loss of matter at the interface due to
the generation of MGG and DGG. This lag phase could be explained by a greater difficulty for
gPLRP2 to reach the acyl chains of galactolipids, due to the higher packing of the heterogeneous
heterogeneous GL monolayers has indeed shown that the addition of DPPC into the monolayer led
to the formation of gel phase domains enriched in DPPC and MGDG, reducing the lateral distance
between the acyl chains available for gPLRP2 to insert (Kergomard et al., 2022). This higher
packing could thus explain the lag phase observed before the gPLRP2 could reach its optimal
activity, a high packing density at the air/water interface having been proposed to explain the long
258
CHAPITRE 5
induction times observed for other lipases onto tightly packed short-chained phospholipids (Verger
et al., 1973) and diacylglycerols (Wieloch et al., 1982) monolayers. In the case of GL/DPPC/pS
monolayer, the initiation of lipolysis on the substrate allows the formation of lipolysis products and
the subsequent decrease in surface pressure, thus decreasing the packing of the monolayer and
Figure 4 - A) Kinetic evolution of surface pressure (, mN/m, red circles) and ellipsometric angle (, °,
blue triangle) upon the adsorption and kinetic activity of gPLRP2 (0.128 mg/L) onto GL/DPPC/pS
monolayer. B) AFM images of Langmuir-Blodgett samples after 1) 45 minutes and 2) 1h45 kinetic of
gPLRP2 adsorption onto GL/DPPC/pS monolayer, respectively.
Two Langmuir-Blodgett samples were taken after 45 minutes and 1h45 of kinetics, respectively,
and AFM images of the interfacial organization are available figure 4.B. After 45 minutes kinetic,
condensed domains of 1.5 ± 0.2 nm in height were visible at the air/water interface. Given the small
drop in surface pressure observed at 45 min, these domains are probably not related to the
259
CHAPITRE 5
generation of digestion products. Furthermore, the interfacial organization and heights observed
are similar to those obtained at T0 before the injection of gPLRP2 into the subphase (Figure 1.B),
supporting the hypothesis that lipolysis is probably not yet initiated at this stage of the kinetics. At
1h45 minutes of kinetics, AFM images of the film interface revealed a very different interfacial
organization at =6.3 mN/m, consistent with the associated surface pressure and ellipsometric
angle drops. Thin and discontinuous lines of h1=3.1 ± 0.2 nm in height were visible in the fluid
phase and around the condensed domains, probably attributed to the presence of gPLRP2 molecules
adsorbed at the monolayer interface. Condensed domains of three different heights were also
identified. First, small flower-like shape condensed domains were visible in the fluid phase, with a
height h2 of 2.0 ± 0.1 nm, probably attributed to the generation of lipolysis product MGMG and
DGMG, as observed for the GL monolayer. Fragmented gel phase domains were also revealed,
composed of at least three different height levels (h3, h4, fluid bottom). This observed
fragmentation could be due to the disorganization caused by the adsorption and enzymatic activity
of gPLRP2, but also to the low-pressure value (=6.3 mN/m), causing phase segregation within
the gel phase domains thought to be enriched in DPPC-MGDG-pS. The lateral pressure was indeed
probably no longer sufficient to ensure the miscibility of DPPC and pS with MGDG, causing phase
These observations nevertheless confirm the miscibility of these three compounds and the phase
heterogeneity in the gel phase domains at 20 mN/m , as well as the condensation effect of DPPC
and pS on MGDG chains observed in our previous study (Kergomard et al., 2022). Given the molar
composition of the GL/DPPC/pS monolayer, the central rounded domain (h 3=1.7 ± 0.2) observed
at 1h45 of kinetic could be attributed to the presence of condensed DPPC. The smaller domains of
h3 and h4 heights, coexisting with the fluid phase, could be attributed to the presence of FFA and
260
CHAPITRE 5
pS, coexisting with MGDG and MGMG in the fluid phase, but probably not to lyso-
that gPLRP2 shows significant enzymatic activity on DPPC, since monolayer studies have shown
that gPLRP2 was only active on this substrate at low surface pressure (<5 mN/m) and was totally
inactive at >10 mN/m (Hjorth et al., 1993). However, it remains difficult to attribute each type of
domain to a species of molecule, given the complex interactions and differences in miscibility
observed in this type of ternary mixture. Surface composition studies will be needed to answer
these questions, but the small quantities used for interfacial characterizations do not facilitate these
analyses.
3.4. Influence of the presence of charged lipids on the adsorption capacity and enzymatic
The impact of a charged interface on the adsorption capacities and enzymatic activity of gPLRP2
was studied using MGDG/DGDG/SQDG/PG and total lipid monolayers extracted from Chlorella
The evolution of surface pressure and ellipsometric angle upon the adsorption of gPLRP2 at the
air/water interface onto both monolayers are presented figure 5.A and 5.B, respectively. In the case
observed right after the injection of gPLRP2 in the sub-phase until it reached a value of =8.5
mN/m after 1h of kinetic. In contrast to the GL/DPPC/pS complex system, no lag phase was
observed before the onset of lipolysis, and the decrease was continuous, revealing a constant
enzymatic activity of gPLRP2 over the 1h kinetic. This observation could be explained by the
presence of negatively charged lipids at the interface (SQDG, PG), which could facilitate the
adsorption of gPLRP2 underneath the monolayer, and the subsequent degradation of galactolipids.
261
CHAPITRE 5
The facilitated adsorption onto a charged surface was previously observed for recombinant dog
gastric lipase (rDGL) at the level of heterogeneous monolayers of polar dairy lipids, with the
establishment of electrostatic interactions between the interface and the interfacial recognition site
facilitating the orientation and approach of the active site onto the lipid substrates (Bourlieu et al.,
2016). In our case however the surface potential electrostatic distribution of charge is very different
between rDGL and gPLRP2, but seems to result in favorable interactions with negatively charged
lipid interface. The ellipsometric angle did not significantly evolved during the first 30 minutes of
the kinetics. After this, it decreased again (=-0.7°) at =15 mN/m, in the range of the optimal
surface pressure for the activity of gPLRP2, as previously observed on GL and GL/DPPC/pS
monolayers. The ellipsometric angle then slowly decreased until it reached a value of =5.2° after
1h kinetic, reflecting a decrease in the thickness of the monolayer due to the degradation of
galactolipids and the progressive release of polar lipolysis products into the subphase.
The evolution of the surface pressure and ellipsometric angle was followed during 2h kinetic upon
the adsorption of gPLRP2 onto the total lipid of chlorella vulgaris monolayer (figure 5.B). A
continuous decrease (slope=-9.7) of the surface pressure was observed during the first one hour of
kinetic, until a value of =13.2 mN/m was reached. A change in slope was then observed (slope=-
3.8), marking a slowdown in the lipolytic activity until a value of =9.4 mN/m was reached. This
behavior reflects the facilitated adsorption of the enzyme by the presence of charged lipids at the
interface, but also the slowing down of lipolysis induced by the marked chemical heterogeneity of
the monolayer, explaining the slower decrease of the surface pressure compared to the
MGDG/DGDG/SQDG/PG (2h versus 1h, respectively, before a surface pressure of ~9 mN/m was
reached).
262
CHAPITRE 5
Figure 5 - Evolution of the surface pressure (, red, mN/m) and the ellipsometric angle (, blue, °) upon
the adsorption of gPLRP2 onto A) MGDG/DGDG/SQDG/PG (1h kinetic), and B) total lipids extracted from
Chlorella vulgaris Purasana monolayers (2h kinetic). AFM images (5×5 µm²) of the interface of C)
MGDG/DGDG/SQDG/PG (1h kinetic, =8.5 mN/m, =5.2°), and D) total lipids extracted from Chlorella
vulgaris Purasana (2h kinetic, =9.4 mN/m, =6.9°) monolayers after the injection of gPLRP2 in the sub-
phase.
Chlorella vulgaris lipid monolayer after 1 and 2h kinetic, respectively. AFM image (figure 5.C.)
coexistence of LC snowflake-shape domains of 2.2 ± 0.1 in height in the fluid phase. These
domains shared a similar morphology with those obtained after 35 minutes of digestion of the GL
263
CHAPITRE 5
monolayer by gPLRP2, and can therefore be attributed to the generation of FFA digestion products
were also observed, attributed to the adsorbed gPLRP2 molecules in the fluid phase. AFM image
of the Langmuir-Blodgett film of Chlorella vulgaris lipid monolayer is presented figure 5.D. After
2h of kinetics, the morphology of the domains had evolved, showing a "snowflake" shape as
previously observed in the model systems. Some domains could be the result of the generation of
FFA by gPLRP2, leading to a reduction in line tension probably related to the increase in miscibility
between the LC and LE phases. Again, as observed when studying the adsorption of gPLRP2 at
the interface of the GL and GL/DPPC/pS model systems, small protrusions of 3.5 nm in height
were visible, indicating the adsorption of at least some lipase molecules at the air/water interface,
despite the low surfactant capacity of gPLRP2 and its propensity to locate just below the interface.
The galactolipase and phospholipase A1 activities of gPLRP2 were then assayed in “bulk
conditions” onto dispersed liposomes in presence of bile salts and results are presented table 1. In
a previous study regarding the digestion of galactolipid/bile salt emulsions by hPLRP2 and
gPLRP2, Amara et al. (2010) reported that the rate of hydrolysis of long-chain GL was strongly
dependent on the NaTDC/galactolipid ratio. With natural long-chain MGDG and DGDG, the
optimal ratio NaTDC/substrates giving the optimum galactolipase activity of both gPLRP2 and
hPLRP2 was obtained for a molar ratio of 1.33 and 0.5, respectively. In our study, the
NaTDC/substrate molar ratios were 1.67 and 1.49 for 1 µm GL and GL/DPPC/pS liposomes,
respectively.
264
CHAPITRE 5
Table 1 – Quantitative determination of lipid classes composition obtained by TLC at T0 and after 5 minutes
(T5min) digestion by gPLRP2 of 1 µm GL, GL/DPPC/pS, MGDG/DGDG/SQDG/PG liposomes. The reaction
was performed at pH 7 in Tris HCl buffer containing 4 mM of NaTDC. Data are given in relative
percentages of the total lipids.
GL GL/DPPC/pS MGDG/DGDG/SQDG/PG
MGDG 48.2 ± 0.3 4.9 ± 1.5 41.6 ± 4.7 13.6 ± 7.7 65.4 ± 1.0 10.6 ± 0.1
DGDG 51.8 ± 0.3 3.1 ± 0.8 37.8 ± 4.0 9.8 ± 4.7 34.6 ± 1.0 3.7 ± 0.1
*n.q. – non-quantifiable
After 5 minutes incubation of the GL liposomes with gPLRP2 in presence of bile salt, about 90%
wt. of MGDG and 94% wt. of DGDG have been converted into their lipolysis products, MGMG,
DGMG, respectively, and FFA. Given the differences in the substrate and lipolysis product
concentrations, it is likely that MGMG and DGMG have been in turn converted by gPLRP2 into
MGG and DGG, respectively, but these two compounds being water-soluble, they were not
265
CHAPITRE 5
extracted for the TLC analysis (Sahaka, 2020). This result confirmed the strong ability of gPLRP2
to exert galactolipase activity on galactolipid liposomes in the presence of bile salts in relevant
concentrations. This is an important result, since the activity of gPLRP2 is highly dependent on the
supramolecular structure of its substrate and the presence or absence of surfactant species such as
The galactolipase activity of gPLRP2 was again observed on 1 µm GL/DPPC/pS liposomes after
5 minutes incubation in presence of bile salt-related surfactant, but to a lesser extent than on GL
liposomes. Around 67% wt. of MGDG and 74% wt. of DGDG were converted in MGDG, MGG,
DGMG, DGG, respectively and FFA. Nevertheless, the quantification of DGMG after 5 minutes
digestion was hampered, given the fact that its retention factor was similar to the DPPC ones on
the TLC plate. The lower extent of galactolipase activity in this heterogenous system compared to
the GL ones could be explained by the higher packing due to the presence of DPPC in the system,
that could have hindered the access of gPLRP2 to the acyl chains of galactolipids. In addition to its
galactolipase activity, the results also highlight the phospholipase activity of gPLRP2 on
presence of bile salts. Indeed, the presence of a small amount of lyso-PC was detected in the system
after 5 minutes of digestion with gPLRP2. Even if the gPLRP2 is known to exert phospholipase
A1 activity, this result supplements the study by Mateos-Diaz et al. (2018) which has shown that
gPLRP2 was active on mixed bile salts/DPPC micelles, but did not possess enzymatic activity on
DPPC liposomes in absence of bile salts, due to the high packing of the bilayer which prevents
gPLRP2 penetration (Kergomard et al., 2022). In our case, the presence of galactolipids but
especially phytosterols could have reduced the packing of the DPPC domains by creating
heterogeneous zones in the gel phase, thus inducing a higher mobility of the DPPC bilayer chains,
266
CHAPITRE 5
allowing gPLRP2 to insert and exert its phospholipase A1 activity. In addition, our systems
contained bile salts in the aqueous phase, which could have spaced out the neighboring DPPC
molecules at the interface, thus disordering their tight packing and the interfacial organization (Chu
et al., 2010).
liposomes again in the presence of bile salts to determined its ability to exert a galactolipase activity
on SQDG. As previously observed for GL and GL/DPPC/pS liposomes, gPLRP2 was able to
lipolyze MGDG and DGDG, onto MGMG and DGMG, respectively. More interestingly, gPLRP2
was also able to hydrolyze 91% of the initial SQDG substrate (table 1), emphasizing its wide
specificity of substrate.
liposomes in the presence of gPLRP2 and bile salts were extracted by Folch method and deposited
at the air/water interface at =7.2 ± 0.1 mN/m. After stabilization of the respective T0 and T5min
films, Langmuir-Blodgett samples were observed in AFM. For both systems, the images obtained
at T0 and T5min are available in figure S4 and figure 6, respectively. For the GL system, AFM
images obtained at T0 revealed the presence of small condensed domains of h1=1.3 ± 0.1 nm height,
that could be attributed to the presence of small non-micellized assemblies of NaTDC adsorbed at
the air/water interface. At T5min, flower-shape domains of h1’=1.9 ± 0.1 nm in height were
evidenced, similar to those obtained after 2h hour kinetic digestion of GL monolayer by gPLRP2
at the air/water interface. These domains were attributed to the generation of the FFA by lipolysis
of MGDG and DGDG, in agreement with their detection by TLC (table 1). The remaining subtracts
267
CHAPITRE 5
and digestion products MGMG and DGMG were assumed to be present in the fluid phase giving
their unsaturated composition. The absence of the lines and protuberances observed in the
interfacial characterization study (3.1) confirms the hypothesis of their attribution to gPLRP2
Figure 6 - AFM images (5×5 µm²) of substrates and lipolysis products obtained at T5min and deposited at
7.2 ± 0.1 mN/m at the air/water interface of A) GL, B) GL/DPPC/pS monolayers. For each identified
domain, the mean height level was given in the table and was obtained as an average over three sections of
the image. Lipophilic substrates and products were extracted using Folch method.
For the GL/DPPC/pS system, the interface obtained at was clearly different from the one
obtained for the GL/DPPC/pS monolayer at 20 mN/m during the interfacial study, but was
surprisingly quite similar with the one obtained after two hours kinetic after gPLRP2 injection in
the subphase, at a similar surface pressure (=6.3 mN/m). Thus, the low surface pressure could
explain the fragmentation of the condensed phase domains, as previously observed, with two
268
CHAPITRE 5
identified height levels (h1 and h2) probably enriched in DPPC, pS, coexisting with a fluid phase
probably enriched in MGDG. Additionally, the inclusion of bile salts at the interface could have
spaced out the neighboring DPPC molecules, thus disordering their tight packing and the interfacial
organization (Chu et al., 2010). At T5min, the highest domains became more numerous, probably
related to the generation of FFA, with a height h1'=1.7 ± 0.1 nm. The organization of the interface
was similar to that obtained in the images at 2h kinetics after injection of gPLRP2 in the subphase
heterogeneous liposomes in the presence of bile salts, but also at the level of heterogeneous
monolayers.
CONCLUSION
The organizational properties and enzymatic activity of gPLRP2 was studied on galactolipid-based
heterogeneity. The galactolipase activity of gPLRP2 was evidenced at the level of homogeneous
monolayer. The presence of charged lipids at the interface improved the adsorption capacities of
the enzyme through the establishment of electrostatic interactions between the substrate and the
interfacial recognition site of the active site, resulting in improved adsorption and enzymatic
activity of gPLRP2.The optimal activity of gPLRP2 was obtained at a surface pressure of 15 mN/m
for both systems, even if the tighter packing of the heterogenous monolayer has induced a lag phase
period before the on-set of the lipolysis. The galactolipase activity of gPLRP2 was also observed
in lipid monolayers extracted from the microalgae chlorella vulgaris for the first time. The
chemical heterogeneity of the lipids extracted from this natural matrix induced a physical
269
CHAPITRE 5
heterogeneity of the monolayer, leading to a better adsorption of the enzyme but a slower apparent
liposomes after 5 minutes incubation in presence of bile salts. Phospholipase A1 activity was also
found on heterogeneous GL/DPPC/pS liposomes in the presence of bile salts. In addition to the
obvious effects of bile salts, this could be explained by the phase heterogeneity induced by the
presence of galactolipids in the mixture, as well as by the inclusion of phytosterols which induced
the presence of defects in the condensed phase, thus decreasing packing and allowing access of the
enzyme to the acyl chains of phospholipids. These experiments should be repeated in the absence
270
CHAPITRE 5
- La gPLRP2 s’adsorbe en phase fluide et possède une activité galactolipase sur une gamme
local important dans les systèmes modèles et naturels hétérogènes retarde néanmoins
chargées à l’interface des films améliore les capacités d’adsorption de l’enzyme grâce à
- La gPLRP2 possède une activité galactolipase sur les liposomes microniques riches en
gPLRP2 possède également une activité phospholipase A1 sur les liposomes hétérogènes
GL/DPPC/pS, probablement grâce à la présence de sels biliaires mais aussi grâce à des
271
CHAPITRE 5
noix et d’amandes par la gPLRP2 ont été obtenus et sont disponibles en Annexe VI.
Les PLA2 purifiées (sPLA2-IB et PLA-NMM-CM III) utilisées dans cette étude ont été
Deux espèces de PLA2 ont été injectées en sous-phase de la monocouche modèle hétérogène
sur les capacités d’adsorption et l’activité enzymatique des PLA2 étudiées. Une attention
particulière a notamment été donnée à la sPLA2-IB, une enzyme lipolytique sécrétée par le
pancréas au cours des repas chez l’Homme, et qui joue plusieurs rôle clés dans la digestion des
lipides. Il a en effet été établi que cette enzyme hydrolyse la chaîne d’acide gras en position sn-2
des phospholipides avant leur absorption dans la muqueuse intestinale (Richmond et al., 2001). En
particulier, cette enzyme soluble est conçue pour attaquer in vivo les agrégats micellaires ou
lamellaires de phospholipides. L’hydrolyse des phospholipides par la sPLA2-IB serait une étape
de la lumière intestinale ayant été montrée comme retardant l’absorption du cholestérol (Rampone
& Machida, 1981). Enfin, la dégradation des phospholipides par la sPLA2-IB permettrait de limiter
272
CHAPITRE 5
2017). De précédentes études suggèrent une voie commune d’accès aux substrats entre différentes
PLA2, et décrivent celle de la PLA2 de venin de cobra chinois, qui peut être extrapolée au
comportement de la sPLA2-IB, dont sont connus certains analogues chez l’animal (porc et bovins
oxyanion au cours du cycle catalytique, et est essentiel à la liaison du substrat (Scott et al., 1990).
La PLA2 a également été montrée beaucoup plus active à l’interface lipide-eau qu’en solution, du
PLA2 se manifeste en effet grâce à son site catalytique, responsable de la liaison du substrat, mais
également d’un site de liaison interfaciale, permettant de lier la protéine à ses substrats lipidiques,
(Alekseeva et al., 2021). Le mécanisme d’action de la PLA2 de venin d’abeille a été étudié au
informatiques. Les résultats ont montré l’établissement de liaisons hydrogènes entre la protéine et
phase. En phase LC, la faible diffusion des lipides a en effet entrainé leur fusion, tandis qu’en phase
fluide ceux-ci ont été exclus de la zone de contact avec l’enzyme, entrainant un amincissement
local de la bicouche et l’apparition d’une zone hydrophobe. De la même façon que pour la gPLRP2,
composition chimique et l’état de phase local des assemblages lipidiques (P. Zhang et al., 2019).
Dans notre étude, les capacités d’adsorption et d’activité de la sPLA2-IB à l’interface d’une
273
CHAPITRE 5
comparées avec celles de la PLA2-NMM-CM III, extraite du venin de cobra du Mozambique (Naja
Mossambica). Cette phospholipase possède une séquence protéique proche de la sPLA2-IB, mais
Figure 49 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique (, °, triangle bleu)
sur une cinétique de 2h après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-phase de la monocouche modèle
GL/DPPC/pS à 20 mN/m, pH 7.
concentration de 0,128 mg/L et à une pression de surface initiale =20 mN/m, dans des conditions
sur une cinétique de 2h. Durant l’intégralité de la cinétique, aucune évolution de la pression de
surface ni de l’angle ellipsométrique n’a été observée, soulignant l’absence d’activité de la sPLA2-
274
CHAPITRE 5
A 2h de cinétique (Figure 50), de fines trainées discontinues de 0,8 ± 0,4 nm de hauteur étaient
visibles sur les images AFM, en plus des domaines en phase LC de 1,6 ± 0,2 nm de hauteur attribués
pression de surface de 20 mN/m étant trop importante pour permettre l’insertion de l’enzyme en
conformation active, expliquant l’absence d’évolution de la pression de surface sur les courbes
cinétiques.
Figure 50 - Image AFM (2,5×2,5 µm²) et histogramme de hauteurs du film interfacial obtenus à 2h de cinétique
(=20,3 mN/m, =6,9°) après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-phase de la monocouche modèle
GL/DPPC/pS à 20 mN/m.
GL/DPPC/pS
L’expérience a ensuite été reproduite dans des conditions similaires en utilisant une PLA2 de venin
pénétration plus importante que la sPLA2-IB à des valeurs élevées de pression de surface.
275
CHAPITRE 5
Figure 51 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique (, °, triangle bleu)
sur une cinétique de 2h après injection de la PLA2-NMM-CM III (0,128 mg/L) en sous-phase de la monocouche
modèle GL/DPPC/pS à 20 mN/m, pH 7.
Dans le cas de la PLA2-NMM-CM III, la pression de surface a augmenté de =1,7 mN/m juste
comme le lysoPC. Néanmoins, la faible diminution de la pression de surface semble indiquer une
DPPC à des valeurs élevées de pression de surface. En accord avec cette hypothèse, l’angle
ellipsométrique n’a montré qu’une légère augmentation au cours des deux heures de cinétique.
276
CHAPITRE 5
Figure 52 - Images AFM (2,5×2,5 et 1×1tabe µm²) et hauteurs des domaines du film interfacial obtenu après 2h de
cinétique (=20,3 mN/m, =6,9°) après injection de la PLA2-NMM-CM III (0,128 mg/L) en sous-phase de la
monocouche modèle GL/DPPC/pS à 20 mN/m.
Les images AFM obtenues après 2h de cinétique (Figure 52) confirment l’insertion de l’enzyme à
l’interface du film mixte GL/DPPC/pS. En effet, un réseau protéique de 1,5 ± 0,2 nm de hauteur
conformation de l’enzyme sous sa forme active. Les réseaux protéiques se sont formés en phase
fluide et autour des petits domaines LC enrichis en DPPC (h=2,0 ± 0,1 nm). Néanmoins, la PLA2-
NMM-CM III ne s’est pas insérée au niveau des plus gros domaines en phase condensée, malgré
la présence des défauts induits par l’inclusion des phytostérols. Le packing trop important de ces
exclusion à ce niveau.
277
CHAPITRE 5
Figure 53 - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique (, °, triangle bleu)
sur une cinétique de 2h après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-phase de la monocouche modèle
GL/DPPC/pS à 10 mN/m, pH 7.
L’expérience a été reproduite dans des conditions similaires en injectant la sPLA2-IB à une
déterminer si pression de surface initiale plus basse permettait d’améliorer la capacité d’insertion
ellipsométrique obtenue sur une cinétique de 2h est présentée Figure 53. Juste après l’injection de
la sPLA2-IB en sous-phase, une brève augmentation de la pression a été observée (=0,6 mN/m,
t=8 min), reflétant l’établissement de nouvelles interactions entre les molécules à l’interface,
relatives à l’insertion de la sPLA2-IB dans le film. Ce résultat n’est pas surprenant, la capacité
analogue de la sPLA2-IB, ayant été montrée comme plus favorable à une pression proche de 10
mN/m dans la littérature (Ransac et al., 1992). Une diminution de la pression sur un temps court a
278
CHAPITRE 5
ensuite été constatée (=-0,8 mN/m, t=7 minutes), résultant probablement d’une réorganisation
interfaciale liée à l’adsorption des premières molécules de sPLA2-IB à l’interface et à leur activité
augmentation plus importante de la pression a ensuite été observée pendant les 40 minutes
suivantes de cinétique (=1,8 mN/m), supposée comme étant reliée à l’adsorption de nouvelles
d’une organisation préférentielle plus favorable à l’insertion de l’enzyme après l’adsorption des
création de défauts en phase LC. Une diminution lente de la pression de surface a ensuite été
observée, liée à l’activité phospholipase de la sPLA2-IB (=-1,8 mN/m, t=7 minutes), jusqu’à
atteindre une valeur finale de =10,1 mN/m à 2h de cinétique. Contrairement à la pression, l’angle
ellipsométrique n’a, quant à lui, pas montré d’évolution significative au cours des 2h de cinétique.
Figure 54 - Images AFM (2,5×2,5 et 1×1 µm²) et hauteurs des domaines du film interfacial obtenu à 2h de cinétique
(=20,3 mN/m, =6,9°) après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-phase de la monocouche modèle
GL/DPPC/pS à 10 mN/m.
279
CHAPITRE 5
La Figure 54 présente les images AFM du film interfacial obtenu après 2h de cinétique en présence
de sPLA2-IB. Un réseau protéique irrégulier de 1,6 ± 0,2 nm de hauteur était visible à la frontière
des domaines en phase LC (2,0 ± 0,1 nm) enrichis en DPPC, confirmant l’insertion de l’enzyme à
trous en leur centre, confirmant l’activité phospholipase de la sPLA2-IB. Ce résultat tend par
ailleurs à confirmer la composition complexe des domaines en phase LC, également enrichis en
Figure 55 – A) Dépôts CCM (révélation primuline, visualisation à 365 nm) des substrats et des produits de digestion
à T0 et après 5 minutes de digestion par la sPLA2-IB (3,3 mg/L), respectivement, des liposomes micrométriques
GL/DPPC/pS.
dispersée (0,2%) en présence de sPLA2-IB (3,3 mg/L) et de sels biliaires (NaTDC 4 mM), dans
des conditions similaires à celles utilisées précédemment pour la gPLRP2 (tampon Tris HCl, pH
280
CHAPITRE 5
7). Les substrats à T0 et les produits de digestion obtenus après 60 minutes d’incubation des
liposomes avec la sPLA2-IB ont été analysés par CCM et les résultats sont disponibles dans la
Figure 55.
Après 60 minutes de digestion, l’analyse CCM a révélé la génération d’AGL et de lysoPC par
GL/DPPC/pS en présence de sels biliaires. En revanche, la dégradation des MGDG et DGDG n’a
pas été mise en évidence, soulignant l’absence d’activité galactolipase de l’enzyme sur ce système.
ont été déposés à l’interface air/eau à une pression de surface d’environ 10 mN/m, afin de comparer
Figure 56 – Images AFM (5×5 µm²) de l’interface des films des substrats et produits de lipolyse obtenus à A) T0 et
B) T60 minutes à une pression d’environ 10 mN/m.
l’adsorption des sels biliaires à l’interface. A T60min, les domaines présentaient une organisation
281
CHAPITRE 5
similaire, mais une taille plus importante, probablement du fait de l’accumulation des AGL saturés
résultats CCM.
vulgaris Purasana
La capacité d’adsorption et l’activité enzymatique de la sPLA2-IB ont été étudiés à une pression
de surface initiale de 10 mN/m au niveau des monocouches de lipides extraits des matrices
manuscrit, seuls les résultats concernant les monocouches de lipides totaux extraits de Ch. vulgaris
seront présentés. Les résultats concernant les membranes d’OB de noix et d’amandes sont
de Chlorella vulgaris Purasana est présentée Figure 57.A. Juste après l’injection de la sPLA2-IB
en sous-phase, une légère augmentation de la pression de surface a été observée (=0,6 mN/m,
t=6 min), reflétant l’insertion de la phospholipase au niveau du film, en accord avec les
précédentes observations sur les systèmes modèles à une pression de initiale de 10 mN/m. La
pression de surface a ensuite montré une nette diminution jusqu’à 2h de cinétique, jusqu’à atteindre
une pression de surface finale de =9,9 mN/m (=-1,8 mN/m), probablement liée à la désorption
282
CHAPITRE 5
phospholipides du film de lipides totaux de chlorelles (54% massique des lipides totaux). Ce
résultat a été confirmé par l’évolution de l’angle ellipsométrique, qui a montré une légère
Figure 57 – A) Evolution et la pression de surface (, mN/m, rouge) et de l’angle ellipsométrique (, °, bleu), et B)
image AFM (2,5×2,5 µm²) et hauteurs des domaines à l’interface du film obtenu après 2h de cinétique (=9,9 mN/m,
=7,5 °) ; après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-phase de la monocouche de lipides totaux extraits de
fragments membranaires de chlorella vulgaris Purasana.
lipides totaux de chlorelle Purasana est présentée Figure 57.B. Comme précédemment observé sur
les systèmes modèles, un réseau protéique de 1,7 ± 0,2 nm était visible à proximité des domaines
organisés de 2,0 ± 0,1 nm de hauteur, mais également en phase fluide, formant des patchs. La forme
« flocon de neige » des domaines en phase LC était attribuable à la présence d’AGL générés par la
283
CHAPITRE 5
- A 20 mN/m, la pression latérale entre les lipides est trop importante pour permettre à la
- A 10 mN/m, la sPLA2-IB montre une activité phospholipase et est capable de dégrader les
libres. Aucune activité galactolipase n’a été mise en évidence pour la sPLA2-IB, aussi bien
par les études interfaciales que par les études en phase dispersée.
284
CHAPITRE 6
CHAPITRE 6
DISCUSSION GÉNÉRALE
285
CHAPITRE 6
286
CHAPITRE 6
Ce chapitre 6 a pour objectif de résumer les résultats obtenus dans ce travail et de discuter des
nouvelles avancées concernant la digestibilité des assemblages membranaires végétaux par les
enzymes digestives, comparés aux données disponibles à ce jour dans la littérature. Dans un
premier temps, le comportement interfacial des lipides et assemblages membranaires extraits des
matrices naturelles de microalgues Chlorella vulgaris, ainsi que des oléosomes de noix et
d’amandes est résumé, ainsi que l’impact de la composition lipidique sur le comportement de phase
et les propriétés biologiques globales des membranes. Dans un second temps, la modularité
physique, les intérêts et limites des monocouches modèles de membranes végétales sont discutés.
Les spécificités d’action des enzymes digestives étudiées dans ce travail sur les substrats lipidiques
végétaux sont ensuite résumées, de même que la généricité des effets de l’état physique et des
charges sur leur adsorption au sein d’interfaces naturelles. Enfin, l’utilisation des extraits de lipides
végétaux comme sources d’AO et vecteurs d’3 est discutée, et souligne l’intérêt des lipides
bioactifs.
287
CHAPITRE 6
Les assemblages membranaires végétaux sont riches en AG 3, qui sont déficients dans les diètes
leur intérêt dans les matrices naturelles. Ainsi, nous avons choisi d’étudier deux sources majeures
d’assemblages et/ou membranes végétales que sont les chloroplastes (modèle microalgue) et les
oléosomes (modèles noix/amande). En sélectionnant ces deux types d’extraits, nous avons émis
l’hypothèse que leur composition membranaire, dominée d’un côté par les galactolipides et de
l’autre par les phospholipides, entraînerait un comportement interfacial très différent qui pourrait
impacter sur leur digestibilité. A ma connaissance, peu d’études basées sur la caractérisation
interfaciale des films lipidiques riches en galactolipides sont aujourd’hui disponibles (Bottier et al.,
2007; Eydoux et al., 2007; Kergomard et al., 2022). Concernant les oléosomes, les études ont
principalement porté sur le comportement interfacial de ces objets entiers (tailles microniques)
(Nikiforidis, 2019), mais peu se sont intéressées au comportement des lipides polaires extraits de
Comme supposés, les résultats ont montré une organisation interfaciale très différente des films
lipidiques extraits des deux grands types de matrices naturelles, notamment entre les membranes
de chlorelles et celles d’OB. Ces différences s’expliquent par la structure chimique des lipides, leur
tête polaire (galactolipides versus phospholipides), leur composition en AG (3 et 6 versus 9),
mais également par des effets de charges (galactolipides neutres versus phospholipides
288
CHAPITRE 6
caractérisation fine de ces systèmes à l’échelle moléculaire, permise par le couplage de techniques
biophysiques (ellipsométrie/tensiométrie/AFM).
Tableau 11 – Valeurs de (°) des monocouches de lipides extraits des systèmes naturels à une pression de surface
d’environ 20 mN/m.
Monocouche (°)
a
Bottier (2006)
particulièrement riches en 9 et pauvres en 3, et les trois autres systèmes naturels, plus riches en
3 et en 6, confirmant l’impact des longueurs de chaînes d’AG sur l’épaisseur des monocouches
(Tableau 11).
majoritairement en phase fluide, coexistant avec des nanodomaines en phase LC résultant d’une
289
CHAPITRE 6
forte affinité moléculaire entre les AG saturés (acides palmitiques dans nos extraits). Les
monocouches de lipides totaux extraits des Chlorelles sont caractérisées par une compressibilité
importante des films, et montrent un comportement fluide même à des valeurs de pressions élevées
(Figure 58). L’absence de transition sur les isothermes de compression peut s’expliquer par le fait
que la contribution des lipides à chaînes saturées en phase condensée à l’aire moléculaire moyenne
de la monocouche est masquée par celle des lipides aux chaînes insaturées.
Figure 58 - Isothermes de compression des monocouches des lipides totaux de Ch. vulgaris Purasana (trait rouge
continu) et sorokiniana (trait rouge pointillé) et des lipides membranaires de noix (trait noir continu) et d’amandes
(trait noir pointillé).
Au contraire, les phospholipides extraits des membranes d’OB forment des monocouches
en AFM avaient déjà été observée par Gallier et al. (2010) au niveau de monocouches de
phospholipides extraits de lait bovin, comme modèle membranaire de globules gras laitiers natifs.
Cette ségrégation latérale avait également été rapportée à des pressions inférieures (dès 10 mN/m)
par Bourlieu et al. (2020) sur des extraits membranaires de globules gras laitiers humain (HMM)
290
CHAPITRE 6
et bovin (BMM), en accord avec les isothermes de compression respectives. Il est important de
souligner que ces extraits contenaient, en plus des phospholipides, un lipide polaire spécifique, la
sphingomyéline, basée sur un aminodiol (la sphingosine) lié à un acide gras par sa fonction amide,
et à une choline via une liaison phosphodiester. En restant centré sur la composition en AGT de
ces extraits, une compressibilité plus importante des monocouches de HMM que celle des BMM
avait été mise en évidence, en lien avec la composition plus riche en DHA (0,8%), favorisant une
meilleure insertion de la lipase gastrique. La longueur et le degré d’insaturation des chaînes acyles
est en effet un facteur clé de la compressibilité des monocouches. Les insaturations augmentent la
l’interface au cours de la compression. Ainsi, la réorganisation des molécules sous compression est
favorisée par la présence des AGPI-LC 3 (DHA). De même, la teneur plus élevée en AGPI 9
des monocouches de lipides membranaires d’OB d’amandes en comparaison avec les OB de noix
Dans la littérature, il a été montré que les frontières entre les phases LC et LE sont des zones de
désordre présentant des lignes de tension fortes, pouvant induire l’adsorption préférentielle de
certaines protéines (Bourlieu et al., 2016; Chu et al., 2010; Leidy et al., 2011). Ce comportement
de phase, et notamment la présence de domaines en phase LC coexistant avec une phase LE,
pourrait ainsi impacter l’adsorption des protéines impliquées dans les processus métaboliques des
organites végétaux, en offrant des plateformes d’interactions propices aux interactions lipides-
Globalement, l’auto-assemblage des lipides sous la forme de membranes stabilisant les objets
291
CHAPITRE 6
membrane plasmique exerce un rôle essentiel dans la protection de l’intégrité des cellules en jouant
le rôle de barrière avec l’environnement extérieur, et régule les échanges de diverses substances
chimiques spécifiques dont découlent les propriétés biologiques des membranes (Sych et al., 2018).
phospholipides, permet par exemple de leur conférer in vivo des propriétés de protection en
maintenant une stabilité physique (coalescence limitée) et chimique (oxydation) (Kergomard et al.,
2021). Chez les chloroplastes, la composition lipidique permet d’assurer la structure spécifique
et en acides gras, impactant la compressibilité locale des monocouches et, in fine, leurs interactions
naturelles permettent de définir des modèles d’organisation pour des systèmes présentant des
compositions lipidiques proches, et peuvent donc servir de base pour accéder à la compréhension
cependant de réaliser une caractérisation approfondie de ces systèmes, couvrant un large panel de
compositions, certaines microalgues pouvant par exemple présenter des profils plus riches en EPA
interfacial global et multipliant les applications possibles pour ces membranes naturelles. La
compressibilité locale des monocouches naturelles pourrait en effet être un paramètre clé des
292
CHAPITRE 6
comprendre les mécanismes impliqués dans la digestion des objets microniques alimentaires chez
l’Homme, la barrière membranaire représentant le premier rempart entre leur interface et les
enzymes digestives.
Les monocouches de lipides constituent un modèle pertinent pour reproduire l’interface des
système digestif. A ma connaissance, les études référencées dans la littérature ont principalement
homogènes ou hétérogènes, mais peu concernent le comportement des films de lipides modèles ou
extraits du végétal, alors que cette caractérisation représente une étape essentielle à la
Dans ce contexte, les systèmes végétaux naturels étudiés ont été simplifiés à quelques molécules
clés (dichotomie galactolipides versus phospholipides), afin de constituer une base pour accéder à
une compréhension fine au niveau moléculaire des interactions protéines (ici enzymes) - lipides.
Ces systèmes présentent donc des limites, notamment de par le fait qu’ils n’incluent pas tous les
lipides majoritaires des membranes végétales, et ne sont pas chargés (absence de phospholipides
que ces derniers aient été intégrés en fin d’étude), ce qui peut influer sur les capacités d’adsorption
de certaines enzymes (Smith, 2012). Des systèmes homogènes et hétérogènes ont été étudiés,
comprenant des compositions en ALA fixées (MGDG et DGDG commerciaux issus de feuilles
293
CHAPITRE 6
d’épinard, ALA=50 et 70% massique, respectivement). Deux types de lipides ont été utilisés pour
moduler l’état physique et la compressibilité des monocouches : d’une part le DPPC, dont le
comportement de phase est très bien connu, ainsi que les phytostérols, molécules du végétal
homologues au cholestérol largement étudié dans les membranes de mammifères. Le DPPC pur
montre une transition de phase claire en monocouche. Il possède deux chaînes saturées, et est la
molécule de référence pour induire une hétérogénéité de phases dans les mélanges étudiés. En
fonction de la composition et des ratios molaires des systèmes modèles, un effet mixte des
constituants a été observé. Le DPPC a induit une rigidification et une coexistence de phase dans
les mélanges de galactolipides. Dans les systèmes purs de galactolipides, l’ajout de pS a diminué
l’orientation particulière des têtes polaires galactosyles. Dans les systèmes hétérogènes, le pS a
fluidifié les micro-domaines enrichis en DPPC (rôle analogue au cholestérol), tout en augmentant
l’ordre dans la phase fluide enrichie en galactolipides. Cet effet des phytostérols peut être corrélé
avec leur rôle de molécules structurelles dans les végétaux. In vivo, par ces mêmes effets, les
phytostérols sont indispensables à la vie des plantes, car ils leur permettent de s’adapter à leur
(Itzhaki et al., 1990; Kamal & Raghunathan, 2012; McKersie & Thompson, 1979). Ce
généralisé aux propriétés globales de structuration des stérols dans les membranes biologiques.
Néanmoins, cet effet est plus marqué chez le cholestérol, le stérol majoritaire des membranes
animales (Moreau et al., 2002). Contrairement aux membranes animales, la diversité de stérols
dans les membranes végétales est très forte : plus de 250 espèces de stérols différentes ont été
rapportées (Evans, 1991). Dans la nature, les phytostérols et les sphingolipides sont responsables
de la formation de radeaux lipidiques qui se déplacent dans la bicouche fluide, et interagissent avec
294
CHAPITRE 6
les protéines et les lipides de la membrane cellulaire végétale (Simons & Ikonen, 1997).
phytostérols, leur proportion peut être multipliée par deux dans les rafts, et cet enrichissement est
particulièrement clair pour les stérols conjugués, qui jouent un rôle important dans la signalétique
des membranes (Cacas et al., 2012). Une telle diversité de phytostérols dans le règne végétal
s’explique par la présence de différentes voies de synthèse, mais également par des procédés de
résister aux multiples facteurs de stress de leur environnement extérieur (Griebel & Zeier, 2010;
Malgré la simplicité apparente des systèmes modèles étudiés, les outils de caractérisation
interfaciale et le SAXS nous ont permis de mettre en évidence des miscibilités différentes entre les
molécules, induisant une complexité locale dans l’organisation interfaciale des monocouches
modèles. La miscibilité préférentielle du MGDG avec le DPPC a en effet été observée, ainsi que
la génération de défauts fonctionnels au niveau des microdomaines organisés par l’inclusion des
phytostérols, pouvant influer sur les processus biologiques comme la digestion. Dans nos
mélanges, le MGDG a induit une miscibilité encore plus importante avec le DPPC qu’avec d’autres
simplifiés (Bourlieu et al., 2016), le MGDG agissant comme un solvant pour les molécules rigides
de DPPC. Contrairement aux systèmes animaux, dans lesquels la miscibilité entre les molécules
est gouvernée essentiellement par les chaînes aliphatiques, dans les systèmes modèles végétaux, la
tête glycosylée des galactolipides semble jouer un rôle non-négligeable. Ce comportement peut
être rapproché de la miscibilité observée du GM1 dans un mélange présentant des séparations de
phases. Ce ganglioside composé d’une tête polaire glycosylée de grande taille et deux chaînes
295
CHAPITRE 6
d’AG saturées forme des sous-domaines dans la phase LC du DPPC (Vié et al., 1998). Les systèmes
développés dans ce travail ouvrent un nouveau champ de comparaison avec d’autres types de
versus phospholipides), ont ainsi permis de mettre en lumière la complexité d’organisation des
molécules végétales, même dans le cas des systèmes simplifiés, pouvant impacter
la spécificité chimique des enzymes gastrique et intestinales impacte l’activité des enzymes et a pu
être vérifiée au cours de ce travail, des phénomènes génériques d’interactions physiques sont
III - Spécificité d’action des lipases digestives sur les molécules lipidiques
du végétal
La digestion des lipides, et en particulier des lipides apolaires, a fait l’objet de nombreux travaux
de recherche, et notamment dans les années 1980-1990, où la spécificité d’action des lipases a été
mise en évidence à l’interface de substrats donnés (Bernbäck et al., 1990; de La Fournière et al.,
1994; Gargouri et al., 1986). Davantage d’attention a été portée sur la digestion des lipides polaires
à partir des années 1990-2000. Cependant, la majorité des groupes de recherche se sont concentrés
sur la digestion des phospholipides par l’action spécifique de la sPLA2 pancréatique (Borgström,
1980, 1993; Karray et al., 2011; Lengsfeld et al., 2004). Les mécanismes impliqués dans la
digestion des galactolipides par la PLRP2 ne sont quant à eux pas encore complètement compris,
296
CHAPITRE 6
malgré leurs propriétés nutritionnelles, et l’intérêt croissant porté à leur utilisation dans des
applications alimentaires (Amara et al., 2010; Ohlsson, 2000; Wattanakul et al., 2019) dans le cadre
digestion des lipides polaires végétaux, en portant une attention particulière à l’action de la PLRP2,
dont les activités galactolipase et phospholipase A1 ont été démontrées précédemment dans la
L’action des enzymes digestives humaines ou de proches analogues a été étudiée séparément avec
nos outils de caractérisation interfaciale, car leur mécanisme n’étaient pas totalement connus à
chaque enzyme séparément peut aussi être justifié par des conditions d’action assez différentes
conditions interfaciales. Ainsi, les expériences en monocouche ont été réalisées en excès de
également été étudiée en systèmes statique et dynamique en présence d’excès d’enzymes, afin de
Comme attendue, l’absence d’activité lipolytique de la lipase gastrique (modèle rDGL) a été
confirmée sur les lipides polaires. Sa capacité d’insertion et/ou d’adsorption a été vérifiée dans les
moléculaire importante des films, pouvant ensuite impacter l’étendue de la lipolyse intestinale
(Infantes-Garcia et al., 2022; Lengsfeld et al., 2004). Cette observation a été confirmée en cellule
297
CHAPITRE 6
Concernant la sPLA2 (modèle IB et NMM-CM III), aucune activité galactolipase n’a été détectée,
Ce résultat n’est pas surprenant, l’interaction substrat-site actif de la sPLA2 étant beaucoup plus
contraint que celui d’une lipase, entravant sa capacité à accommoder des substrats présentant des
têtes polaires encombrées comme les galactolipides. De plus, le mode d’action calcium-dépendant
de la sPLA2 implique une interaction avec le calcium, qui, contrairement à son interaction avec les
têtes polaires des phospholipides, ne se trouve pas à proximité immédiate des têtes sucres de
galactolipides. De façon moins surprenante, une activité phospholipase a ainsi été mise en évidence
au niveau des monocouches GL/DPPC/pS, ainsi que sur les liposomes mixtes GL/DPPC/pS en
systèmes de digestion statique en présence de sels biliaires. Enfin, comme présumée, l’activité
statique en présence de sels biliaires, sur les systèmes lipidiques modèles ou extraits des matrices
naturelles. De plus, une activité phospholipase, bien que faible, a également été détectée sur les
biliaires. Cet élément vient compléter de précédents résultats de Mateos-Diaz et al. (2018), qui
avait montré une absence d’activité enzymatique sur les liposomes de DPPC en absence de sels
substrat. Ainsi, la présence de sels biliaires, mais également l’apparition de défauts au niveau des
phases organisées riches en galactolipides dans les systèmes mixtes permet d’améliorer la
pénétration de l’enzyme et son activité enzymatique sur les têtes polaires de DPPC.
298
CHAPITRE 6
Les spécificités d’action des enzymes digestives peuvent s’expliquer par les différences
structurelles observées au niveau de leur site actif. En outre, au-delà du site actif, la structure
modulent les interactions enzyme-substrat. La structure 3D de la lipase gastrique est basée sur un
repliement / hydrolase ainsi que sur un site actif composé d’une triade catalytique Ser-His-Asp
et d’un trou oxyanion, retrouvés chez la majorité des lipases (Canaan et al., 1999; Roussel et al.,
s’explique par une meilleure capacité d’adsorption à l’interface lipide/eau à de faibles valeurs de
pH, tandis qu’elle a tendance à rester en phase aqueuse au-dessus d’un pH neutre, le pH modifiant
principalement gouvernée par des interactions hydrophobes entre le substrat et le site actif, entouré
par un large anneau apolaire (Chahinian et al., 2006). Des travaux plus récents en systèmes modèles
avec des films pouvant contenir des phospholipides anioniques et des modèles de potentiel de
surface de la rDGL ont néanmoins démontré la contribution des interactions électrostatiques aux
al., 2017; Bourlieu et al., 2016). La structure de la hPLRP2 inclue également une triade catalytique
classiques (Giller et al., 1992; Roussel et al., 1998). L’accès au site actif de la hPLRP2 est contrôlé
par la présence d’un volet, dont la structure est légèrement différente de celle retrouvée chez les
autres lipases pancréatiques, lui permettant d’accommoder des substrats plus hydrophiles comme
les galactolipides et les phospholipides, qui présentent des larges têtes polaires (Withers-Martinez
et al., 1996). Ce volet est en revanche absent sur la gPLRP2. Les lipases pancréatiques
« classiques » des mammifères ne présentent d’activité enzymatique que sur les TAG. Ainsi, les
299
CHAPITRE 6
différences de cinétiques observées pour la PLRP2, en comparaison avec la PTL, seraient corrélées
avec la structure particulière du volet recouvrant le site actif, expliquant sa spécificité de substrat
(Eydoux et al., 2008). La longueur des chaînes acyles et la nature des têtes polaires de galactolipides
naturels n’ont pas montré d’impact significatif sur l’activité de la PLRP2 purifiée du jus
2010). L’activité des deux enzymes était en effet importante sur les AG à chaînes moyennes (1786
± 208 à 5420 ± 85 U/mg) et à longues chaînes (1756 ± 208 à 4167 ± 167 U/mg), et a uniquement
été détectée en position sn-1 des ponts esters de galactolipides. Une activité similaire peu importe
la nature de la tête polaire des galactolipides avait également été obtenue par Wattanakul et al.
(2019), lors de l’incubation de CRF de pois et d’épinards, riches en MGDG et DGDG à longues
chaînes, en présence de jus pancréatique porcin contenant de la gPLRP2. L’hydrolyse rapide des
galactolipides et leur présence en mélange dans les végétaux verts expliquent le choix de ne pas
différencier dans cette étude la dégradation du MGDG et du DGDG à longues chaînes par la
gPLRP2 purifiée. En bulk, les concentrations des substrats MGDG et DGDG des liposomes de
lipides modèles et naturels n’ont d’ailleurs pas montré d’évolution significative après 5 minutes de
Certaines enzymes présentent ainsi des spécificités de substrats assez strictes, tandis que d’autres,
comme la gPLRP2, présentent des spécificités moins strictes, et une activité sur différents types de
substrats (activité galactolipase et phospholipase A1). Cette spécificité plus large de substrats
permet d’induire une notion de complémentarité d’action, malgré l’étude de l’action individuelle
des enzymes. Les données obtenues dans ce projet, ainsi que celles rapportées dans la littérature,
permettent ainsi d’offrir une compréhension plus approfondie des mécanismes de digestion des
lipides végétaux chez l’Homme. Les lipases gastro-intestinales, de par leur complémentarité de
300
CHAPITRE 6
spécificité d’action, ont la capacité de digérer les lipides alimentaires issus de différentes sources,
aussi bien animales que végétales. Pour obtenir des informations sur les activités spécifiques
comparatives des enzymes, la reproduction du système digestif in vitro statique ou en « bulk » dans
des conditions proches des conditions physiologiques, semble plus adaptée que la caractérisation
interfaciale (Wattanakul et al., 2019). Néanmoins, nous avons utilisé ici des enzymes purifiées, ce
qui n’est pas toujours le cas dans la littérature (sécrétions pancréatiques, sucs gastriques, enzymes
non purifiées, etc…), et peut induire un biais sur la compréhension des mécanismes d’adsorption
Les principaux résultats précédemment répertoriés dans la littérature et les nouveaux résultats
apportés dans cette étude concernant l’activité des principales enzymes digestives humaines et leurs
301
Tableau 13 - Activités des principales enzymes digestives humaines et leurs proches analogues
Enzyme Concentration Activité Spécificité de Ref Effet de l’état Ref Complément sur Effet de l’état physique
molaire spécifique substrat physique la spécificité de démontré dans cette étude
moyenne (substrat) démontré avant démontré substrat démontré
(µM)+ cette étude avant cette étude dans cette étude
Jus gastrique Activité sur Activité sur les Pression critique Bénarouche Pas d’activité sur Insertion en phase fluide
2,4 Intralipid TAG>DAG>>M d’insertion sur et al., 2017 MGDG, ni sur des monocouches de
HGL (pH 5, 30%*) AG ; DLPC=30 mN/m DGDG. phospholipides et des
Contenu 600 U/mg# stéréosélectivité (Bénarouche et al.) Bénarouche galactolipides, adsorption
DGL gastrique pour la position et al., 2013 Pas d’activité sur moins importante au niveau
0,6 sn-3 des TAG ; Adsorption en Bourlieu et les phospholipides des monocouches de
Pas d’activité sur phase fluide au al., 2016 membranaires galactolipides (gêne
Contenu les lipides niveau des d’OB de noix et stérique et interface non
duodénal polaires PEG et monocouches d’amandes. chargée).
0,4 les esters de hétérogènes de Adsorption favorisée au
cholestérol lipides extraits de niveau des défauts en phase
globules gras condensée quand présence
Similaire, mais laitiers. de phytostérols.
activité optimale Adsorption favorisée au
à pH 4 et non pH niveau des interfaces de
5 lipides végétaux chargés
grâce à l’établissement
d’interactions
électrostatiques avec le site
actif.
Adsorption hétérogène et
localisée sur les OB
d’amandes en conditions
gastriques.
Jus Activité sur Activité sur les De Caro, Pas d’activité sur Distribution en phase fluide
pancréatique tributyrine TAG> DAG ; BBA, les galactolipides et et à la frontière des
HPL 15,2 8500±500 U/mg stéréosélectivité 1998 les phospholipides domaines en phase
pour les positions végétaux. organisée.
PPL Contenu sn-1 et sn-3 des
duodénal Activité sur TAG ; Activité
6,5 tributyrine Pas d’activité sur hydrolytique sur les
10200±500 les MAG à TAG des OB
U/mg longues chaînes, d’amandes.
les esters de
cholestérol, les
phospholipides et
les GL, faible
activité sur les 2-
MAG à chaînes
moyennes, et sur
les esters-PEG.
pH optimal : 7,0-
7,5
CEH/ Contenu CEH native: Activité sur Amara et Non étudiée Non étudiée
BSSL duodénal 240±17 U/mg MGDG>SQDG> al. BBA,
7,9 sur micelles DGDG 2009
NaDC/MGDG ;
240±17 U/mg
sur micelles
NaTDC/MGDG,
et 16±2 U/mg
sur MGDG sans
sels biliaires ;
Recombinante :
432 ± 62 U/mg
sur micelles
mixtes sels
biliaires/MGDG
HPLRP2 Jus Maximum de Activité sur les Amara et La HPLRP2 Eydoux et Activité La gPLRP2 s’adsorbe en
pancréatique 2800 ±60 U/mg MAG, les al. BBA, recombinantes est al., JLR, phospholipase phase fluide et possède une
4,3 sur les micelles phospholipides 2009 active à des 2007 lorsque le DPPC activité enzymatique
mixtes (position sn-1), Andersso pressions de est pris dans un optimale sur une gamme de
Contenu NaDC/MGDG les galactolipides, n et al. surface plus élevées système hétérogène pression de surface située
duodenal (dioctanoylglyce les esters de 2011 sur les MGDG et et en particulier en entre 10 et 15 mN/m au
1,8 rol)=1,33:1 (pH vitamines DGDG que la interaction avec le niveau des monocouches
GPLRP2 8.00-9.00); Pas d’activité sur GPLRP2 MGDG en présence homogène et hétérogène de
1786±100 sur les les TAG à chaînes (conformation de sels biliaires. galactolipides.
micelles mixtes moyennes à différente du L’hétérogénéité de phases
NaTDC/MGDG; longues mais il couvercle Activité et l’organisation condensée
1250±150 U/mg subsiste des recouvrant le site galactolipase très des lipides retardent
sur la tributyrine
incohérences, par actif). rapide (> 145 l’initiation de la lipolyse et
exemple Activité plus (Mateos- U/mg) sur les ralentissent l’activité
~74 U/mg sur les Andersson et al. importante sur le Diaz et al. MGDG et DGDG à enzymatique.
L-α-PC purifiés 2011 ont conclu à DGDG C12:0 à une Chem Phys longues chaînes La présence de molécules
à 24 mM CaCl2 ; une activité sur pression de 12 Lipids, 2018) polyinsaturées en chargées à l’interface des
Maximum de les TAG mN/m versus 5 monocouche et en films améliore les capacités
8000 ±500 U/mg système dispersé en d’adsorption de l’enzyme
sur les micelles (trioléine) et sur mN/m pour la présence de sels grâce à l’établissement
mixtes la tributyrine rGPLRP2. biliaires. d’interactions
NaDC/MGDG Activité plus électrostatiques entre le
(dioctanoylglyce importante sur le Pas d’activité sur substrat et l’enzyme.
rol)=1,33:1 (pH MGDG C12:0 à 20 les TAG des
8.00-9.00); mN/m versus 10-17 extraits lipidiques
5420±85 U/mg mN/m pour la de chlorelle.
sur les micelles rGPLRP2.
mixes
NaTDC/MGDG;
700±100 U/mg La GPLRP2
sur les MGDG e, hydrolyse le DPPC
l’absence de sels dans les micelles
biliaires ; mixtes en présence
2700±300 U/mg de sels biliaires
sur la tributyrine NaTDC, mais pas
dans les MLV et
LUB de DPPC.
Explication :
l'interaction entre
GPLRP2 S152G et
DPPC n'est
observée que
lorsque le NaTDC
est ajouté au
système pour
former des micelles
et cela peut être
expliqué par
l'organisation
différente du DPPC
dans les micelles
mixtes par rapport
aux vésicules
lamellaires
(hydratation plus
élevée de la tête
polaire, mobilité
plus importante des
chaînes alkyles),
qui favorisent la
pénétration de
GPLRP2 dans la
couche de
phospholipides.
Les systèmes complexes étudiés, modèles ou naturels, présentaient des hétérogénéités chimiques
induisant une hétérogénéité physique, pouvant impacter l’adsorption et l’activité enzymatique des
lipases digestives.
L’organisation locale des systèmes lipidiques impacte l’adsorption des enzymes digestives et leur
d’insertion des lipases digestives humaines a ainsi pu être observée dans les zones fluides à
montré une capacité d’insertion en phase fluide dans les membranes hétérogènes des végétaux, un
lipides extraits de globules gras laitiers, aussi bien humains que bovins (Bourlieu et al., 2016). La
présence des têtes polaires galactosyles des galactolipides a cependant gêné l’insertion de l’enzyme
et l’accès à l’interface hydrophobe, du fait d’un encombrement stérique plus important que dans le
cas des têtes polaires de phospholipides. La gPLRP2 ne s’est pas insérée, mais s’est en revanche
adsorbée de façon plus homogène en phase fluide en dessous de l’interface des monocouches.
L’écartement des têtes et la capacité des chaînes à pouvoir se réorganiser semblent favoriser
l’adsorption de certaines lipases chez les systèmes présentant des coexistences de phases LC/LE.
Or, il a été rapporté que le « packing » local des monocouches de lipides pouvait impacter ou non
la capacité d’adsorption de certaines protéines, et leur rôle dans le métabolisme des lipides (Chièze
307
CHAPITRE 6
et al., 2012). En effet, bien que la pression de surface soit identique en tout point d’un même
échantillon, la compacité locale des molécules est variable, et ce phénomène est d’autant plus
marqué chez les systèmes présentant des hétérogénéités de phases. L’aire moléculaire des lipides
se trouvant dans les microdomaines en phase LC est faible, contrairement à celle des molécules en
phase LE, qui présentent une moindre capacité à se compacter sous l’influence de l’insertion de
molécules exogènes.
La pression de surface donne donc une indication sur la pression latérale des monocouches, mais
ne constitue pas un outil idéal pour décrire et prédire l’insertion et/ou l’adsorption de molécules
externes au système, alors que la compressibilité et l’état physique local de l’interface représentent
des paramètres qui apparaissent primordiaux. La rDGL montre d’ailleurs une insertion à différents
niveaux de hauteur en fonction du packing local dans les monocouches hétérogènes. Dans la
littérature, de nombreuses études ont pourtant rapporté l’existence d’une pression critique
d’insertion pour les enzymes au niveau des monocouches de substrats (Damodaran, 2015). Des
gammes de pression de 15-25, 10-15 et 5-10 mN/m ont notamment été rapportées pour la rDGL,
et al., 1998; Ransac et al., 1992). Cette pression critique d’insertion peut en effet s’appliquer dans
le cas des systèmes lipidiques homogènes (lipides purs, système monophasique), mais pour les
systèmes hétérogènes, l’organisation locale des molécules étant différente, elle va drastiquement
impacter l’insertion de l’enzyme. Plusieurs facteurs sont donc à considérer pour étudier les
mécanismes d’adsorption des lipases digestives humaines : la pression de surface à l’interface, mais
rapportées pour l’activité respective des lipases étudiées, nous avons pu déterminer des valeurs de
coefficients de compressibilité (C-1, mN/m) idéales pour l’insertion de chacune des enzymes, peu
308
CHAPITRE 6
importe la composition de l’interface. Les valeurs de C-1 obtenues à différentes pressions de surface
(10, 15 et 20 mN/m pour l’insertion optimale de la sPLA2, gPLRP2 et rDGL, respectivement) pour
chacun des systèmes modèles étudiés sont résumées dans le Tableau 12. Pour chaque pression de
surface considérée, les systèmes ont montré des gammes de C-1 équivalentes. Il serait donc possible
de générer des mélanges lipidiques dans des fenêtres de compressibilité idéale pour l’insertion des
l’interface, améliorant ainsi l’absorption dans la lumière intestinale des AGL libérés. Ce résultat
ouvre la voie vers le développement d’applications spécifiques, comme par exemple le design de
Tableau 12 – Valeurs de coefficient de compressibilité (C-1, mN/m) obtenues à 10, 15, et 20 mN/m pour chacune des
monocouches modèles étudiées (GL, GL/DPPC, GL/DPPC/pS). La détermination du C -1 à partir des isothermes de
compression est explicitée dans Kergomard et al. (2022).
C-1 (mN/m)
hétérogènes permet notamment de créer des défauts au niveau des phases LC et de diminuer la
tension de ligne au niveau des frontières de phases, améliorant de façon notable l’adsorption des
309
CHAPITRE 6
enzymes digestives à ce niveau. Les défauts structuraux présents dans les substrats en monocouche
ont en effet déjà été montrés comme étant des sites préférentiels d’adsorption de certaines enzymes
à l’interface (Prim et al., 2006). L’effet de solvatation du MGDG sur les molécules lipidiques
rigides a également permis de créer des zones de miscibilité complexe, mais son inclusion dans les
phases LC pourrait ralentir l’action de la PLRP2 à ce niveau, étant donné l’adsorption préférentielle
végétales ou animales, favorise donc globalement leur dégradation par les enzymes digestives
humaines, mais peut induire, suivant les molécules dominantes et le jeu de spécificité de substrats,
Figure 59 – Représentation du potentiel électrostatique de surface de la structure 3D ruban ouverte de la rDGL, calculé
à pH 5. Les potentiels électrostatiques de surface sont représentés avec un code couleur sur une surface de van der
Waals en utilisant le système graphique moléculaire PyMOL (version 1.3, Schrödinger, LLC). Les couleurs rouge et
bleue représentent les charges nettes négatives et positives, tandis que la couleur blanche représente les positions
globalement neutres, respectivement. A partir de Bourlieu et al. (2016).
La présence de lipides chargés à l’interface a également été montrée comme influençant la capacité
d’adsorption et/ou d’insertion des lipases digestives humaines ou analogues. Dans le cas de la
(IRS) hydrophobe entourant le site actif, via une couronne de résidus basiques entourant cet IRS.
310
CHAPITRE 6
charges positives sur l’extérieur de l’IRS, ainsi que de patchs de charges négatives à l’opposé de
l’entrée du site actif, permettant l’attraction de l’anneau chargé positivement vers l’interface
concentrant des charges négatives. Une distribution similaire de charges est également retrouvée
chez la HGL, laissant présager une insertion également facilitée dans le cas d’une interface
négative. Dans le cas de la gPLRP2, la présence de lipides chargés (SQDG, PG, et par extrapolation
PE, PI) semble également pouvoir améliorer son adsorption et accélérer la dégradation de la
monocouche. Le processus d’adsorption des enzymes digestives semble donc globalement modulé
par les interactions hydrophobes, mais également par les interactions électrostatiques, qui jouent
Concernant le processus de dégradation des lipides, la génération de produits de digestion par les
enzymes digestives module l’adsorption des lipases, et notamment par libération des AGL (Bhat
& Brockman, 1982; Sugar et al., 2001). La dégradation des substrats lipidiques et la libération des
miscibilité entre les phases. Les produits de lipolyse générés montrent une tendance à rester proche
l’environnement acide (pH 5) induit une protonation des produits de digestion, qui encombrent
davantage la surface des gouttelettes que pour les autres lipases agissant à pH neutre et empêchent
ainsi son adsorption. Une adsorption plus faible de l’enzyme avait en effet déjà été observée au
niveau des monocouches modèles de phospholipides en présence d’AGL (Bourlieu et al., 2016).
Dans le cas des monocouches de galactolipides, le fort caractère insaturé des produits de digestion
311
CHAPITRE 6
néanmoins été observée autour des domaines supposés enrichis en AGL dans les monocouches
homogènes, alors qu’un tel phénomène n’a pas été observé dans les systèmes hétérogènes à
l’interface.
Les extraits lipidiques végétaux sont riches en lipides polaires variés (galactolipides,
lipides par les enzymes digestives spécifiques dans le tractus gastrointestinal humain pourrait
ouvrir la voie vers des applications de délivrance vers des tissus cibles de l’organisme. En
particulier, la PLRP2 pourrait être utilisée pour produire des fractions lipidiques et des AGL riches
en AGPI 3 C16:3 ou C18:3, trouvés en quantité importante chez les galactolipides, et dont la
la biodisponibilité des AG et des nutriments lipophiles des chloroplastes isolés demandent encore
à être établies chez l’Homme. Les lécithines végétales, riches en phospholipides, ont également
déjà été proposées chez la souris comme des vecteurs d’ALA efficaces et prometteurs, en plus de
leurs propriétés d’émulsifiants naturels alimentaires sans effet néfaste notable sur la santé
l’absorption intestinale des lipides, un effet dose-réponse ayant été mis en évidence chez le rat pour
des doses de supplémentation représentant à minima 30% des lipides totaux (supérieure à une dose
le rat, a permis d’accélérer la biodisponibilité de l’ALA en engendrant une apparition plus précoce
312
CHAPITRE 6
des lipides dans la lymphe, mais également d’augmenter dans le plasma en période postprandiale
sa bioconversion en ses dérivés à longues chaînes, dont les effets physiologiques bénéfiques sur
l’organisme ont déjà été montrés (Robert, Couëdelo, Knibbe, et al., 2020; Shahidi & Ambigaipalan,
2018). Une question demeure néanmoins sur la généralisation de ces effets aux lécithines végétales
de manière générale chez l’Homme. L’utilisation des lécithines en tant qu’émulsifiants naturels
impacte également l’activité des lipases digestives, et ce, en fonction de leur composition et du
type de phospholipide. Des études in vitro ont en effet montré que les émulsions stabilisées par la
lécithine de soja engendraient une lipolyse plus rapide et plus étendue que celles stabilisées par du
Tween 80 ou du caséinate de sodium (Couëdelo et al., 2015; Vors et al., 2012). A contrario,
l’hydrolyse des lipides était plus importante dans le cas d’une émulsification par des lipides polaires
laitiers, ce qui peut s’expliquer par la présence de sphingomyéline, par ailleurs absente des
En plus de leur potentiel en tant que vecteurs d’ALA, les lipides polaires végétaux (galactolipides,
phospholipides) présentent des activités AO et sont plus stables à l’oxydation que les TAG. La
capacité antioxydante et l’activité de chélation des métaux des chlorophylles, souvent associées
aux lipides polaires dans les membranes végétales, en font notamment d’excellents candidats pour
leur utilisation sous forme de fragments AO dans des applications alimentaires. Leur organisation
de phase (L pour le DGDG) leur confère également une stabilité physique et augmente leur
résistance à l’oxydation. Les phospholipides des lécithines végétales possèdent également des
propriétés antioxydantes naturelles, la charge négative des groupements phosphates pouvant se lier
aux métaux pro-oxydants, inhibant ainsi l’oxydation des lipides (Cui & Decker, 2016). En outre,
Néanmoins, il convient de noter que les propriétés antioxydantes des lécithines dépendent de leurs
313
CHAPITRE 6
propriétés intrinsèques, mais sont également modulées par les différents procédés d’extraction (Li
et al., 2018).
De manière générale, les assemblages de lipides sous la forme d’objets microniques (OB,
chloroplastes) présentent des structures natives complexes, qui les protègent des déstabilisations
Les lipides membranaires et les assemblages végétaux constituent donc des sources intéressantes
d’ingrédients fonctionnels et bioactifs, et représentent des composés très prometteurs avec une
vaste gamme d’applications pour vectoriser des AGPI 3 et rééquilibrer le régime humain. Des
assemblages qui peuvent résister jusqu’à des sites distants intestinaux sont certes d’intérêt pour
pouvoir véhiculer des constituants ou pour leurs effets prébiotiques potentiels, mais ouvrent aussi
des questions concernant leur tolérance intestinale. Ils peuvent en effet moduler la balance
en outre des phytostérols, qui, en plus de leur propriété structurelle, présentent un intérêt
nutritionnel de par leur effet hypocholestérolémiant chez l’Homme, soulignant l’intérêt de leur
314
CHAPITRE 7
CHAPITRE 7
CONCLUSION GÉNÉRALE
315
CHAPITRE 7
316
CHAPITRE 7
approfondie des mécanismes d’interactions entre les enzymes digestives et les assemblages
membranaires végétaux. En particulier, ce travail est pionnier en ce qui concerne la digestion des
l’Homme. L’originalité de cette étude repose sur une caractérisation poussée du comportement
La digestibilité des assemblages lipidiques végétaux hétérogènes naturels a également été étudiée
pour la première fois par de proches analogues des principales enzymes digestives humaines à
rendre compte de la spécificité de substrat des lipases et phospholipase étudiées (rDGL, sPLA2-
IB, gPLRP2) sur les lipides polaires végétaux. En particulier, les activités galactolipase, mais
également phospholipase A1 de la gPLRP2, ont été observées au niveau des systèmes hétérogènes
physique des membranes (adsorption préférentielle en zone fluide et au niveau des défauts dans les
phases organisées où la ligne de tension est abaissée) a également été prouvée, et a conforté les
résultats obtenus sur la lipase gastrique sur des systèmes hétérogènes modèles animaux (globules
gras laitiers). Il semble donc primordial pour étudier les mécanismes d’action des biocatalyseurs
317
CHAPITRE 7
de prendre en compte l’état physique du substrat à l’échelle nanoscopique, en plus des différents
présence de molécules chargées, nous démontrons ici que la compressibilité locale, qui renseigne
sur l’organisation des molécules et leur capacité à se compacter pour permettre l’insertion de
molécules exogènes, est un paramètre primordial pour étudier les interactions lipase-substrat.
Ainsi, des fenêtres de compressibilité idéale pour l’insertion des enzymes digestives, peu importe
la composition de l’interface, ont été mises en évidence dans ce travail. Ces fenêtres pourraient
paramètre à prendre en compte, puisque leur accumulation à proximité des enzymes digestives
humaines module leur activité. In vivo, la présence des sels biliaires permet de décharger les
interfaces lipidiques encombrées par les AGL, et ce paramètre a été pris en compte en systèmes in
vitro statiques, permettant de s’affranchir de l’inhibition des sels biliaires sur l’action enzymatique
Nous démontrons ici qu’au niveau des interfaces lipidiques, une forte teneur en groupements acyles
polyinsaturés peut amplifier la compressibilité locale et être un atout pour l’insertion des lipases
digestives. Néanmoins, ces systèmes sont généralement plus sensibles à l’oxydation chimique.
Dans notre étude, des interfaces stabilisées par des galactolipides et des molécules AO naturelles
(par exemple la chlorophylle et les tocophérols) peuvent donc être des atouts pour la génération
nutritionnelles d’intérêt. Globalement, les assemblages lipidiques végétaux sont en effet riches en
318
CHAPITRE 7
modulables, mais également au niveau des assemblages membranaires naturels, ouvre la voie vers
Limites et perspectives
Dans ce travail, l’approche mécanistique des interactions entre les enzymes digestives et des
substrats modèles et naturels nous a permis de vérifier la généricité des interactions enzymes-
substrats tout en accédant à une caractérisation fine de l’état physique des systèmes. Toutefois,
certains aspects n’ont pas été explorés dans ce travail, et mériteraient de l’être, comme par
exemple :
- Les synergies d’action des lipases digestives. Dans ce travail, l’activité des enzymes a été
l’organisation interfaciale et les cinétiques d’hydrolyse des lipides polaires végétaux. Les
néanmoins été étudiées en microfluidique, mais ce travail demande à être approfondi sur
complexe. Par exemple, l’action de la CEH n’a pas été étudiée dans ce travail, alors qu’elle
par exemple des molécules AO, sur l’activité enzymatique. En particulier, le comportement
végétaux pourraient être approfondis, des premiers résultats ayant déjà été obtenus dans ce
319
CHAPITRE 7
d’interprétation rencontrée dans cette étude réside principalement dans l’association entre
des mécanismes d’interactions entre cette enzyme et son cofacteur avec les lipides polaires
moins actif sur les chaînes acyles polyinsaturées. Il aurait également pu être intéressant de
comme la PTL. Nos systèmes modèles et naturels contenaient de la chlorophylle, mais que
- L’activité des enzymes digestives humaines. Dans ce travail, les enzymes utilisées, bien
que purifiées, étaient issues de sources analogues et partageaient une structure et une
spécificité de substrat entre les enzymes humaines et analogues. Par exemple, la gPLRP2
pouvant impacter sur leur capacité à accommoder les substrats et leur activité d’hydrolyse.
- Nous avons été capables de former des monocouches de galactolipides riches en AGPI
stables à l’oxydation sur des temps courts de cinétique (1h), nous permettant de nous
affranchir de travailler dans des conditions inertes, plus lourdes à mettre en place.
Néanmoins, si de futurs travaux sont réalisés sur des sources photosynthétiques riches en
320
CHAPITRE 7
systématiser les études sous atmosphère inerte, en utilisant un montage similaire à celui
Figure 60 - Images obtenues par AFM-cellule liquide (3×3 µm²) de la dégradation cinétique par la gPLRP2 d'une
bicouche lipidique obtenue par fusion de liposomes modèles GL/DPPC/pS
fin de ma thèse via une collaboration avec le Centre de Biochimie Structurale (CBS) de
lipidiques après fusion de liposomes modèles GL/DPPC/pS par la gPLRP2 (Figure 60) et
intéressant d’obtenir des informations sur les niveaux d’insertions des enzymes lipolytiques
et l’étendue de la dégradation de ces systèmes. Continuer ces investigations est donc une
321
CHAPITRE 7
suivi cinétique en s’affranchissant du biais apporté par l’excès d’enzyme dans nos
expériences en monocouche. Un tel travail permettrait notamment de faire le lien entre les
« bulk ».
Rebalance human diet – co-encadrement d’une stagiaire de M2). Des puces microfluidique
dégradation de gouttelettes lipidiques bloquées dans des puits par l’action successive des
enzymes digestives. Ce travail a été initié au cours de ma thèse, et pourrait par la suite faire
l’objet d’un futur projet de recherche. Des tests d’observation en microscopie confocale de
la dégradation par la gPLRP2 de liposomes marqués ont notamment été réalisés. Cet outil
de digestion in vitro représente un réel potentiel pour l’étude des synergies entre les
enzymes digestives et la persistance des assemblages, ces deux paramètres ayant un impact
- Au vu des résultats obtenus dans cette thèse, il semble maintenant intéressant d’effectuer
une étude nutritionnelle chez l’animal et l’humain en se focalisant sur les effets de la
subséquente de cet AGPI 3. Un projet in vivo en collaboration avec C. Vors a par ailleurs
obtenu une subvention du GLN (Groupe Lipides et Nutrition) et doit être mis en place, afin
préventives dans la lutte contre l’obésité et les maladies métaboliques. Cette étude
322
CHAPITRE 7
permettrait de compléter les efforts en cours à l’international pour démontrer l’intérêt des
Ce travail ouvre donc des perspectives tant sur des recherches fondamentales nécessitant des outils
biophysiques pour des approches fines de mécanistique, que sur des recherches en nutrition sur des
modèles animaux.
323
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Annexes
368
ANNEXES
Annexe I – Distribution en AG des MGDG et DGDG achetés chez Avanti Polar Lipids.
Annexe II – Procédure d’isolation et de purification des OB, adapté de Kapchie et al. (2011).
369
ANNEXES
Annexe III – Composition de la poudre de chlorelles entières Ch. vulgaris (Purasana, France).
Annexe IV – Images CLSM (88×88 µm²) de la poudre de chlorelles entières (Purasana, France) en présence de sondes
Lipidtox et Rho-PE. De gauche à droite : transmission (nuance de gris), excitation et collecte aux trois longueurs
d’onde 561 (rouge, amphiphiles marqués à la RhodaminePE), 633 (bleu, chlorophylle) et 488 nm (vert, lipides
apolaires marqués au Lipitox).
370
Surface pressure (mN/m)
ANNEXES
1131023-pression de surface et delta par rapport à concentration DGL
20
15
Surface pressure (mN/m)
10
0
0 20 40 60 80 100
Annexe V - Evolution de la pression de surface (, mN/m) en fonction de la concentration de la rDGL en sous-phase
(pH 5) après 15h de cinétique.
371
ANNEXES
Annexe VI - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique (, °, triangle
bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la gPLRP2 (0,128 mg/L) en sous-phase d’une monocouche de lipides
membranaires d’OB de A) noix, et B) amande à 20 mN/m. Images AFM (5×5 µm²) de l’interface obtenues à 2h après
injection de la gPLRP2 (0,128 mg/L) en sous-phase des monocouches de lipides membranaires d’OB de C) noix
(=28,0 mN/m, =8,0°), D) amande (=36,2 mN/m, =8,0°).
372
ANNEXES
Annexe VII - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique (, °, triangle
bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-phase d’une monocouche de lipides
membranaires d’OB de A) noix, et B) amandes à 20 mN/m. Images AFM (5×5 µm²) de l’interface obtenues à 2h après
injection de la sPLA2-IB (0,128 mg/L) en sous-phase des monocouches de lipides membranaires d’OB de C) noix
(=11,5 mN/m, =6,6°), D) amandes (=11,6 mN/m, =6,2°).
373
ANNEXES
Annexe VIII - A) Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique (, °, triangle
bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la PTL-coPTL (1-0,2 mg/L), et B) images AFM (20×20 et 2,5×2,5
µm²) de l’interface obtenue 2h après l’injection de l’enzyme et de son cofacteur en sous-phase de la monocouche
modèles de lipides GL/DPPC/pS.
Annexe IX - A) Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique (, °, triangle
bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la PTL-coPTL (1-0,2 mg/L), et B) images AFM (20×20 et 2,5×2,5
µm²) de l’interface obtenue à 1h et 2h après injection de l’enzyme et de son cofacteur en sous-phase d’une monocouche
de lipide totaux de Chlorella vulgaris Purasana.
374
ANNEXES
Annexe X - Evolution de la pression de surface (, mN/m, rond rouge) et de l'angle ellipsométrique (, °, triangle
bleu) sur une cinétique de 2h après injection de la PTL-coPTL (1-0,2 mg/L) en sous-phase d’une monocouche de
lipides membranaires d’OB de A) noix, et B) amande à 20 mN/m. Images AFM (5×5 µm²) de l’interface obtenues à
2h après injection de la PTL-coPTL (1-0,2 mg/L) en sous-phase des monocouches de lipides membranaires d’OB de
C) noix (=28,3 mN/m, =10,1°), D) amande (=34,6 mN/m, =9,4°).
375
ANNEXES
Annexe XI - J. Kergomard, F. Carrière, G. Lambeau, G. Paboeuf, N. Barouh, P. Villeneuve, C. Bourlieu and V. Vié,
What are the mechanisms of gastrointestinal lipases adsorption onto heterogenous biomimetic vegetal membranes?
7th International Conference on Food Digestion ICFD 2022, May 2022, Cork, Ireland. pp.95. https://hal.archives-
ouvertes.fr/hal-03669301
376
ANNEXES
Annexe XII - J. Kergomard, M. Robert, N. Barouh, G. Paboeuf, B. Barea, P. Villeneuve, O. Schafer, T. Wooster, V.
Vié & C. Bourlieu-Lacanal, Effects of processing and concentration on the oxidative stability and interfacial behavior
of tree nuts oil bodies (OB). Euro Fed Lipid 2021, Oct 2021, Leipzig - Online, Germany.
377
ANNEXES
Annexe XIII - J. Kergomard, N. Barouh, G. Paboeuf, P. Villeneuve, O. Schafer, T. Wooster, V. Vié & C. Bourlieu-
Lacanal, Stability to oxidation and interfacial behavior at the air-water interface of minimally-processed versus
processed walnut oil-bodies. Lipid droplets & Oleosomes - 2nd International Conference, Dec 2021, Strasbourg,
France. https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-03466652
378
ANNEXES
Annexe XIV - J. Kergomard, V. Vié, G. Paboeuf, N. Barouh, B. Barea, et al., Oxidative and interfacial behavior of
native oil bodies from walnut. Euro Fed Lipid Seville 2019, Oct 2019, Séville, Spain. https://hal.archives-
ouvertes.fr/hal-02315046v2
379
Titre : Activité enzymatique sur les lipides végétaux : combinaison de mesures interfaciales à l'échelle
moléculaire (nm) et de mesures cinétiques de dégradation à l'échelle de l'objet (μm).