Évaluation et prévision de l’activité antimicrobienne des

conservateurs dans des formulations cosmétiques

Samia Almoughrabie

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Samia Almoughrabie. Évaluation et prévision de l’activité antimicrobienne des conservateurs dans
des formulations cosmétiques. Microbiologie et Parasitologie. Université Paris-Saclay, 2020. Français.
�NNT : 2020UPASA014�. �tel-03738124�

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 Évaluation et prévision de l’activité
antimicrobienne des conservateurs
dans des formulations cosmétiques.

Thèse de doctorat de l'université Paris-Saclay

École doctorale n° 581, Agriculture, Alimentation, Biologie,

Environnement, Santé (ABIES)
Spécialité de doctorat : Microbiologie
Unité de recherche : Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech,
Institut Micalis, 78350, Jouy-en-Josas, France.
Référent : AgroParisTech

Thèse présentée et soutenue à Jouy-en-Josas, le 29 mai 2020, par

Samia ALMOUGHRABIE

Composition du Jury
Eric SPINNLER
Président
Professeur, AgroParisTech, UMR SayFood, Thiverval-Grignon
Thèse de doctorat

Christine ROQUES
Rapportrice & Examinatrice
Professeure, Université de Toulouse, Laboratoire de Génie Chimique
Fréderic CARLIN
Rapporteur & Examinateur
Directeur de recherche, INRAE, UMR SQPOV, Avignon
Karine STEENKESTE
Examinatrice
Maitre de conférences, Université Paris Saclay, UMR ISMO, Orsay
NNT : 2020UPASA014

Florence DUBOIS-BRISSONNET Directrice de thèse

Professeure, AgroParisTech, Institut Micalis, Jouy-en-Josas
Chrisse NGARI
Co-encadrante & Examinatrice
Chercheure, Laboratoire Clarins, Pontoise
2
 Remerciements

Cette thèse réalisée au cours de ces trois dernières années, a été possible grâce au
concours de plusieurs personnes à qui je voudrais témoigner toute ma gratitude.

En premier lieu, je tiens à témoigner toute ma reconnaissance et mes remerciements à

ma directrice de thèse, Florence DUBOIS-BRISSONNET, Professeur à AgroParisTech à
l’institut Micalis à l’INRAE de Jouy-en-Josas, pour sa disponibilité et les conseils
précieux qu’elle a su m’apporter tout au long de ma thèse. Au-delà de son expertise
et de son appui scientifique, j’ai pu compter sur son soutien et son aide durant mes
recherches. J’ai pu beaucoup apprendre à son contact et j’en suis
infiniment reconnaissante.

Je remercie Chrisse NGARI, chef de projet R&D à Clarins et co-encadrante de ma thèse,

pour sa présence et nos échanges ainsi que ses encouragements.

Merci aussi à Valérie POULET, chef du service microbiologie et contrôle à Clarins, pour
tous les précieux conseils qui ont permis de faire avancer le projet.

Je transmets aussi mes remerciements à Romain BRIANDET, chef d’équipe B3D, pour
avoir toujours été disponible pour discuter des problèmes rencontrés pendant ma
thèse et pour tous nos échanges passionnés sur l’impression 3D.

Je remercie Véronique BOSC, Physico-chimiste et Maitre de Conférences à

AgroParisTech de Massy, Yves WACHE, Microbiologiste et Maitre de Conférences à
l’université de Bourgogne et Arnaud BRIDIER, Chercheur microbiologiste à l’ANSES,
d’avoir participé à mes comités de thèse et de m’avoir judicieusement conseillée.

Je tiens à adresser mes remerciements aux membres de mon jury de thèse, Christine
ROQUES, Professeur à l’université de Toulouse, Fréderic CARLIN, Directeur de
recherche de l’INRAE d’Avignon, en qualité de rapporteurs et Karine
STEENKESTE, Maitre de conférences à l’université de Paris Saclay, Eric
SPINNLER, Professeur à AgroParisTech de Thiverval Grignon, en tant qu’examinateurs,
pour avoir accepté de lire et de juger mon travail.

Merci à Laurent GUILLIER, ingénieur de Recherche à l’ANSES, pour son expertise sur la
partie modélisation de l’action des conservateurs.

3
Je tiens également à remercier Nathalie ISSACHAR, Directrice de recherche et
développement à Clarins, qui m’a donné l’opportunité de réaliser cette thèse et qui m’a
fait confiance au cours de ces trois années.

Je remercie également tous les membres qui ont composé l’équipe B3D au cours de
ces trois dernières années, pour leur convivialité, pour les moments partagés ensemble
comme les échanges lors de nos pauses café. Également, je garderai de merveilleux
souvenirs des journées raclettes, des journées barbecues autour de l’étang ou
encore des journées ludiques organisées par l’ADAS. Ce sont des moments que je
n’oublierai pas !

Merci donc à Jean-Christophe PIARD, Ingénieur de recherche et Maud

DARSONVAL, Maître de conférence ; sans oublier Charlène LENEVEU-JENVRIN, que je
remercie pour son infinie gentillesse, sa participation et son soutien dans le début de
ma thèse ainsi que pour tous nos fous rires. Ce fut mon coup de cœur amical de la
thèse !

Je voudrais également remercier dans l’équipe B3D, plus particulièrement les

personnes avec qui j’ai pu partager mon bureau en open space surnommé « la crèche »
et avec qui, j’ai passé de super moments :

Marina GREGOIRE, Technicienne de recherche, pour sa bonne humeur au quotidien,

pour toutes ses taquineries, pour son écoute attentive et pour tous les goûters de la
journée !

Julien DESCHAMPS, Technicien de recherche, pour m’avoir formée sur « THE »

microscope confocale à balayage laser et pour ses talents de photographes mis parfois
à contribution de bonnes blagues !

Yasmine DERGHAM, doctorante, qui a été une très belle rencontre, je la remercie pour
son écoute, son soutien, sa grande amitié et aussi de m’avoir permis de bien progresser
en anglais à travers toutes nos passionnantes discussions.

Virgile GUENEAU, chargé de recherche, pour son humour, et sa bonne humeur

quotidienne.

Merci également à Cédric SAINT-MARTIN, doctorant, pour son humour décalé !

Merci à tous les post-doctorants, doctorants et stagiaires précédents et actuels de

l’équipe B3D dont particulièrement Armelle PAULE, Aurélia PERNIN, Caroline PANDIN,
Cécile TOUCHE, Sabrina YAHIAOUI pour tous les bons moments passés ensemble.

4
Merci aussi à Roza MOHAMMEDI, stagiaire de Master 1, qui a participé à mes
expérimentations au laboratoire.

Je remercie également toute l’équipe actuelle ou précédente du service microbiologie

de Clarins qui ont toujours été très accueillants et prêts à m’aider, et
particulièrement Myriam HABOUL, Sylvie VINZANT, Lydie JOUAN, Ophélie BLEOGAT et
Charlène BERMONT.

Un grand merci à « mon p’tit » alias « Minus », Aurélie TRAINOY, chargée de projet
microbiologie recherche à Clarins, qui m’a formée sur les Challenge-tests et la
formulation, elle a toujours fait tout son possible pour m’aider pendant ces années de
thèse. Une très belle rencontre et une amitié qui durera je l’espère !

Merci à Elena EXPOSITO-GARCIA, chef de projet au service matière première et

formulation de Clarins, qui a toujours été disponible et souriante pour répondre à mes
multiples questions sur la formulation cosmétique.

Enfin, je tiens à remercier tous mes proches, ma famille et « meS Amis », avec qui j’ai
pu partager, mes émotions, mes humeurs, et qui m’ont apporté leurs soutiens et
leurs encouragements dans tout ce que j’ai entrepris.

Une mention particulière est attribuée à mes parents qui m’ont toujours soutenue et
encouragée dans mes études et dans ma vie, et cela depuis toute petite. Je
ne les remercierais jamais assez pour tous ce qu’ils m’ont apporté dans la vie.

5
 Liste des abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique

ANSM : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé
BATH : Bacterial Adhesion To Hydrocarbon
BHA : Butyl Hydroxy Anisole
BHT : Butyl Hydroxy Toluène
BPF : Bonnes Pratiques de Fabrication
Calcéine-AM : Acétoxyméthyl ester de calcéine
CAS : Chemical Abstracts Service
CFU : Colony Forming Unit
CIB : Critère d'Information Bayésien ou Bayesian Information Criterion
CTAB : Bromure d'hexadécyl triméthyl ammonium
CMB : Concentration Minimale Bactéricide
CMC : Concentration Micellaire Critique ou Critical Micelle Concentration
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice
DDM : Date de Durabilité Minimale
D.E.F.I : Dispositif Exclusif Formule Intacte
DMSO : Diméthyle sulfoxide
EDTA : Acide éthylène diamine tétra acétique
Émulsion (h/e) ou (e/h) : Émulsion huile dans eau ou eau dans huile
EN : European Norm
g : Gramme
GLDA : Diacétate de glutamate de tétrasodium
GMS : Monostéarate de glycérol
HLB : Balance hydrophile/lipophile ou Hydrophilic Lipophilic Balance
INCI : International Nomenclature of Cosmetic Ingredients
INRAE : Institut national de recherche pour l'agriculture, l'alimentation et
l'environnement
ISO : International Organization for Standardization
LLD : Lactococcus lactis diacetylactis

6
log : Logarithme
MATS : Microbial Adhesion To Solvents
MCBL : Microscopie confocale à balayage laser ou Confocal Laser Scanning Microscopy
(CLSM)
ME : Mobilité électrophorétique
mV : Millivolt
NA : Ouverture numérique ou Numerical Aperture
NF : Norme Française
PAO : Période Après Ouverture
PEG : Polyéthylène glycol
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
S. aureus : Staphylococcus aureus
SDA : Sabouraud Dextrose Agar
SDS : Sulfate de sodium et de dodécyle
TSA : Tryptone Soja Agar
TSB : Tryptone Soja Bouillon
UFC : Unité Formant Colonie

7
 Liste des figures
Figure 1 : Représentation schématique d'une émulsion huile dans eau (h/e) à gauche
et d'une émulsion eau dans huile (e/h) à droite. ........................................................................ 22
Figure 2 : Représentation schématique des différents mécanismes de déstabilisation
d'une émulsion. ........................................................................................................................................ 26
Figure 3 : Causes et conséquences des contaminations microbiennes dans les produits
cosmétiques (Halla et al. 2018). ......................................................................................................... 32
Figure 4 : Staphylococcus aureus observé au Microscope Électronique à Balayage
(MIMA2, INRAE, 2018. Plateforme de Microscopie et Imagerie des Microorganismes,
https://doi.org/10.15454/1.5572348210007727E12, A. Canette, S. Almoughrabie) ...... 33
Figure 5 : Mécanisme d'action des acides organiques sur les microorganismes (Lambert
and Stratford 1999). ................................................................................................................................ 37
Figure 6 : Formule chimique de la chlorphénésine ou 3-(4-chlorophenoxy)-1,2-
propanediol................................................................................................................................................ 39
Figure 7 : Liste non exhaustive des conservateurs de type acide organique, alcool,
phénol et aldéhyde utilisés en cosmétique, adaptée de Halla et al. (2018). .................... 40
Figure 8 : Procédure de challenge-test (Russell 2003) .............................................................. 42
Figure 9 : Principe de fonctionnement d'un microscope confocale à balayage laser
(Paddock 2000). ........................................................................................................................................ 46
Figure 10 : Structure et mécanisme d'action de la calcéine-AM. .......................................... 50
Figure 11 : Observation spatio-temporelle (en min) de la perte de fluorescence verte
de la calcéine-AM par MCBL dans des biofilms de Staphylococcus epidermidis suite à
l’exposition de quatre antimicrobiens. De haut en bas, témoin sans antimicrobien,
biofilms avec 10mg/l d’acide hypochloreux, 50 mg/l d’acide hhypochloreux, 50mg/l de
glutaraldéhyde, 50mg/l de chlorure d’alkyldiméthyl benzylammonium ou 50 mg/l de
nisine. Figure adaptée de l’étude de Davison et al. (2010). .................................................... 51
Figure 12 : Représentation des principales formes de cinétiques d’inactivation
microbienne. A gauche : linéaire (▽, forme I), linéaire avec traîne (×, forme II), en forme
de sigmoïde (□, forme III), linéaire précédée d’un épaulement (◯, forme IV). A droite:
biphasique (▽forme V), concave (×, forme VI), biphasique précédée d’un épaulement
(□, forme VII) et convexe (◯, forme VIII) (Geeraerd et al. 2005). ........................................ 55
Figure 13 : Représentation du nombre de microorganismes survivants au cours du
temps après la mise en contact de différentes concentrations de biocides (modèle
primaire) (A) et relation en coordonnées logarithmiques, pour une même efficacité
d’inactivation microbienne (ici 1 log10), entre la concentration C et le temps d’action du

8
biocide, en fonction du coefficient d’efficacité du biocide a (modèle secondaire) (B)
(Naïtali et al. 2017). ................................................................................................................................. 58
Figure 14 : Dispositif pour mesurer la mobilité électrophorétique ou le potentiel zêta
(Guillaume 2010). ..................................................................................................................................... 60
Figure 15 : Interaction entre E. coli JM109 chargé négativement et les gouttelettes
d'une émulsion hexadécane/eau stabilisée avec un émulsionnant chargé positivement.
Observation de l’émulsion sans bactérie (à gauche, x400), avec bactéries observées au
x400 (au centre) et avec bactéries observées au x 1000 (à droite) au microscope optique
(Li et al. 2001). ........................................................................................................................................... 61
Figure 16 : Observation microscopique d’émulsions (marquées au rouge de Nil, en
rouge) contenant du CTAB ou du Tween 20 mis au contact de bactéries LLD18 (charge
à -18 mV, au centre) ou LLD16 (charge à -43mV, à droite) toutes les deux marquées au
Dapi (en vert). Émulsion sans bactérie à gauche (Ly, Naitali-Bouchez, et al. 2006). ...... 61
Figure 17 : Principe de la méthode de MATS en prenant l’exemple de la mise en contact
de l’hexadecane avec des bactéries hydrophiles et hydrophobes (Burgain et al. 2014).
........................................................................................................................................................................ 63
Figure 18 : Observation microscopique de l'adhésion de deux bactéries lactiques ayant
des propriétés d'hydrophobicité différentes sur une gouttelette. A gauche, LLD18 avec
30% d’affinité à l’hexadécane et à droite, LLD16 avec 3% d'adhésion à l'hexadécane (Ly,
Vo, et al. 2006). ......................................................................................................................................... 64
Figure 19 : Images de microscopie représentant la distribution spatiale des bactéries
(en vert) dans les produits cosmétiques commercialisées (phase lipidique en rouge)
obtenues par MCBL à l'objectif 40x sec. Observation au 40x par MCBL d’une solution
de fluorphlogopite synthétique non marquée (A) et marquée au SYTO9 (B). Particules
présentes dans le gel 3 observée au 40x avec un zoom 1.5 par MCBL (C) et au
microscope optique x 40 (D). Observation au 40x par MCBL d’une solution de
polymethacrylate non marquée (E) et marquée au SYTO9 (F)............................................... 75
Figure 20 : Suivi de fluorescence par MCBL (40x) après marquage de S. aureus au SYTOX
green dans de l’eau physiologique contenant différentes concentrations de potassium
cetyl phosphate. ....................................................................................................................................... 79
Figure 21 : Electrophoretic mobility of three S. aureus strains (A) and the lipid droplets
of a model matrix (B) at a pH from 3 to 8. Data are expressed as the mean ± standard
deviation of two biological replicates.............................................................................................. 93
Figure 22 : Frequency distribution of S. aureus CIP 4.83 surface fluorescence among
675 images mean and variance associated in matrices 1 (A) and 6 (B) and a series of
225 CLSM images in matrices 1 (C) and 6 (D). ............................................................................. 94
Figure 23 : Ratio of bacterial recovery obtained with 0% or 1.6% acrylate polymer by
plate count (A) and by CLSM enumeration from five series of 225 images (B). ............. 95

9
Figure 24 : Frequency distribution of three strains of S. aureus of surface fluorescence
among five series of 225 CLSM images in matrices with various concentrations of
acrylate copolymer (from 0% to 1.6%) or guar gum (2.5%), mean and variance
associated. .................................................................................................................................................. 96
Figure 25 : Correlation between bacterial enumeration by plating (log10 CFU/g) and
bacterial enumeration by CLSM imaging (log10 bacteria/g). ............................................. 110
Figure 26 : S. aureus inactivation kinetics obtained by HCS-CLSM in cosmetic model
matrices with several concentrations of chlorphenesin (A) and benzyl alcohol (B).
Example of the loss of bacterial fluorescence assessed by HCS-CLSM over time for two
concentrations of chlorphenesin (C). ............................................................................................ 111
Figure 27 : Relation between the Dc value and the concentration of chlorphenesin (A,
B) and benzyl alcohol (C, D) by fitting of model#1 (A and C) and model#2 (B and D).
..................................................................................................................................................................... 112
Figure 28 : Correlation between the observed bacterial log-reductions and the
predicted ones using Bigelow linear-model (white dots) or IQ model (black dots) for
chlorphenesin (A) and benzyl alcohol (B). ................................................................................... 113
Figure 29 : Illustration of the possible prediction of the evolution of the bacterial
population over seven days for four concentrations of chlorphenesin (A) or benzyl
alcohol (B) with Bigelow linear-model (dotted lines) or IQ model (plain lines). .......... 114

10
 Liste des tableaux
Tableau 1 : Relation entre la gamme de HLB et leur solubilité dans l'eau d'après (Epstein
2006). ............................................................................................................................................................ 23
Tableau 2 : Liste non exhaustive de produits à faible risque d'après ISO 29621:2017
(Feuilloley 2018) ....................................................................................................................................... 30
Tableau 3 : Gamme de valeurs physico-chimiques dans une formule permettant la
croissance des microorganismes (Berthele et al. 2014). ........................................................... 34
Tableau 4 : Critères d'évaluation pour l'essai d'efficacité de la protection
antimicrobienne d’après la norme NF EN ISO 11930. ............................................................... 43
Tableau 5 : Exemples de fluorochromes utilisés pour marquer les bactéries et les
constituants de matrices complexes (Bridier et al. 2015)......................................................... 48
Tableau 6: Principales caractéristiques des produits cosmétiques commerciaux testés.
........................................................................................................................................................................ 70
Tableau 7 : Composition de la matrice modèle 35/65 h/e%. ................................................. 71
Tableau 8 : Synthèse des essais réalisés dans la crème 8 et la matrice modèle avec les
images de microscopies associées représentant la distribution spatiale des bactéries
(en vert) dans les matrices cosmétiques (en rouge). Pour chaque expérience, un
échantillon de trois images représentatives des trente images obtenues au total par
MCBL à l'objectif 40x air sont présentées. ..................................................................................... 81
Tableau 9 : Estimated parameters (and their 95% CI intervals) and performance criteria
of both secondary models. ............................................................................................................... 113

11
 Sommaire
Remerciements ........................................................................................................................................... 3
Liste des abréviations ............................................................................................................................... 6
Liste des figures .......................................................................................................................................... 8
Liste des tableaux ................................................................................................................................... 11
Sommaire ................................................................................................................................................... 12
Introduction générale ........................................................................................................................... 16
CHAPITRE I : Étude bibliographique............................................................................................... 19
I - Formulation cosmétique ............................................................................................................ 20
1 - Définitions d’un produit cosmétique ............................................................................... 20
2 - Composition des produits cosmétiques ......................................................................... 20
2.1 – Excipients............................................................................................................................ 20
2.1.1 - Phase aqueuse .......................................................................................................... 21
2.1.2 - Phase lipidique ......................................................................................................... 21
2.1.3 – Émulsionnants .......................................................................................................... 21
2.2 - Additifs................................................................................................................................. 23
3 – Étude de la stabilité physique et chimique d’une formule cosmétique
émulsionnée ..................................................................................................................................... 25
3.1 – Étude de la stabilité physique .................................................................................... 25
3.2 – Étude de la stabilité chimique .................................................................................... 28

II - Risques microbiologiques des produits cosmétiques .................................................. 29

1 - Produits à risques microbiologiques ............................................................................... 29
2 - Contaminants microbiens des cosmétiques ................................................................. 30
3 - Conservation antimicrobienne des produits cosmétiques ...................................... 33
3.1 - Facteurs de conservation extrinsèques à la formule cosmétique................. 33
3.2 - Facteurs de conservation intrinsèques à la formule cosmétique ................. 34
3.2.1 - Conservation liée aux caractéristiques physico-chimiques de la
formule ...................................................................................................................................... 34
3.2.2 - Conservation liée à l’ajout de conservateurs ................................................ 36
3.2.2.1 - Définition et réglementations .................................................................... 36
3.2.2.2 - Principaux conservateurs en cosmétique et leur mode d’action .. 37

III - Évaluation et modélisation de l’inactivation bactérienne ........................................... 41

1 – Évaluation de la conservation d’un produit par la méthode de Challenge-test
............................................................................................................................................................... 41

12
 1.1 – Définition et procédure du Challenge-test ........................................................... 41
1.2 – Facteurs pouvant affecter la fiabilité du challenge-test................................... 44
2 - Évaluation de l’inactivation bactérienne par Microscopie Confocale à Balayage
Laser (MCBL) ..................................................................................................................................... 45
2.1 - Principe de la MCBL ........................................................................................................ 45
2.2 – Principe de la fluorescence et exemples de quelques fluorochromes ....... 47
2.3 – Suivi de l’inactivation bactérienne par la MCBL .................................................. 49
3 – Prévision de l’efficacité des systèmes de conservation et des durées de vie de
produits cosmétiques ................................................................................................................... 52
3.1 – Méthode d’estimation de la durée d’utilisation utilisée dans l’industrie
cosmétique ................................................................................................................................... 52
3.2 – Prévision de l’inactivation de la population microbienne dans le temps
grâce à l’utilisation de modèles primaires ....................................................................... 54
3.3 – Prévision de l’activité d’un conservateur selon sa concentration grâce à
des modèles secondaires d’inactivation ........................................................................... 57

IV - Interactions entre les constituants des matrices émulsionnées, les bactéries et

les conservateurs : conséquence sur la conservation des produits. ............................... 58
1 – Influence des interactions physico-chimiques entre bactéries et constituants
de matrices émulsionnées sur la répartition des bactéries contaminantes dans les
produits. ............................................................................................................................................. 59
2 – Influence de la composition et de la structure de matrices émulsionnées sur
l’efficacité antimicrobienne des conservateurs. .................................................................. 64

CHAPITRE II : Étude de la distribution spatiale des bactéries dans les formules

cosmétiques .............................................................................................................................................. 66
I - Introduction .................................................................................................................................... 67

II - Identification des facteurs limitant la répartition homogène des bactéries dans

les matrices cosmétiques ................................................................................................................ 68
1 - Introduction ............................................................................................................................... 68
2 - Matériels et méthodes ........................................................................................................... 68
2.1 - Souche bactérienne et méthode de culture ......................................................... 68
2.1.1 Obtention de précultures en milieux gélosés ou liquides .......................... 68
2.1.2 - Préparation des suspensions de travail .......................................................... 69
2.2 - Matrices cosmétiques .................................................................................................... 69
2.2.1 - Produits commerciaux testés .............................................................................. 69
2.2.2 Matrice modèle ........................................................................................................... 71
2.2.2.1 - Composition ...................................................................................................... 71

13
 2.2.2.2 - Formulation ....................................................................................................... 72
2.2.3 - Caractérisation physico-chimique des matrices cosmétiques ............... 72
2.3 – Observation de la répartition bactérienne par microscopie confocale à
balayage laser (MCBL) .............................................................................................................. 72
2.3.1 - Marquages des bactéries ..................................................................................... 72
2.3.2 - Marquage et inoculation de la formule cosmétique ................................. 73
2.3.3 – Acquisition par MCBL et analyse d’images ................................................... 74
3 - Résultats et discussion........................................................................................................... 74
3.1 - Analyse de la distribution bactérienne dans les produits cosmétiques
commercialisés............................................................................................................................ 74
3.2 - Mise en évidence des matières premières impliquées dans la distribution
spatiale des bactéries par formulation de matrices cosmétiques modèles ........ 79
4 - Conclusion .................................................................................................................................. 82

III - Impact des facteurs influençant la distribution spatiale des bactéries ................. 82
1 - Synthèse de l’étude ................................................................................................................ 82
2 - Article 1 « Mosaic-CLSM assessment of bacterial spatial distribution in
cosmetic matrices according to matrix viscosity and bacterial hydrophobicity » 85
2.1 - Abstract ............................................................................................................................... 85
2.2 - Introduction ....................................................................................................................... 85
2.3 - Materials and Methods ................................................................................................. 87
2.3.1 - Bacterial strains and culture conditions.......................................................... 87
2.3.2 - Chemicals and materials ....................................................................................... 88
2.3.3 - Characterization of bacterial surface properties ......................................... 88
2.3.4 - Cosmetic matrices ................................................................................................... 89
2.3.5 - Characterization of the emulsified matrices ................................................. 89
2.3.6 - Enumeration of the bacterial population ....................................................... 90
2.3.7 - Mosaic-Confocal Laser Scanning Microscopy (M-CLSM) and image
analysis ...................................................................................................................................... 90
2.3.8 - Statistical analysis .................................................................................................... 91
2.4 - Results .................................................................................................................................. 91
2.4.1 - Determination of bacterial surface properties ............................................. 91
2.4.2 - Determination of matrix properties ................................................................. 92
2.4.3 - Bacterial spatial distribution in commercial emulsions ............................ 93
2.4.4 - Bacterial spatial distribution and enumeration in matrices with
thickener ................................................................................................................................... 94
2.4.5 - Spatial distribution of three S. aureus strains according to their level
of hydrophobicity in matrices with thickener ............................................................ 96

14
 2.5 - Discussion ........................................................................................................................... 97
2.6 - Conclusion .......................................................................................................................... 99

CHAPITRE III : Évaluation et prévision de l’action antimicrobienne dans les formules

cosmétiques ............................................................................................................................................ 100
I - Synthèse de l’étude ................................................................................................................... 101

II - Article 2 « Rapid assessment and prediction of preservative efficiency in

cosmetic products using High Content Screening – Confocal Laser Scanning
Microscopy » ...................................................................................................................................... 103
1 - Abstract .................................................................................................................................... 103
2 - Introduction ............................................................................................................................ 104
3 - Materials and Methods ...................................................................................................... 106
3.1 - Chemicals and materials ............................................................................................ 106
3.2 - Bacterial strain and culture conditions................................................................. 106
3.3 - Preparation and characterization of the emulsified model matrix ........... 106
3.4 - Bacterial staining and matrix inoculation ............................................................ 107
3.5 - Enumeration of the bacterial population by drop-plate method ............. 107
3.6 - Acquisition of bacterial inactivation curves by High Content Screening -
Confocal Laser Scanning Microscopy (HCS-CLSM) ................................................... 107
3.7 - Primary models for bacterial inactivation ........................................................... 108
3.8 - Secondary model for estimation of the Dc-value according to the
concentration ........................................................................................................................... 109
3.9 - Prediction of the log-reduction of the bacterial population over a period
of several days.......................................................................................................................... 109
4 - Results ....................................................................................................................................... 110
4.1 - Correlation between enumeration by CLSM and plate counting .............. 110
4.2 - Inactivation of S. aureus according to the concentration of the
preservative ............................................................................................................................... 110
4.3 - Estimation of Dc value according to the preservative concentration ...... 112
4.4 - Prediction of bacterial log reduction on long periods................................... 113
5 - Discussion ................................................................................................................................ 114
6 - Conclusions ............................................................................................................................. 118

Discussion générale et perspectives ............................................................................................. 120

Références bibliographiques ............................................................................................................ 128
Valorisation de la thèse ...................................................................................................................... 143

15
 Introduction générale
Le marché mondial des cosmétiques représente plus de 483 milliards d’euros en 2019.
Le premier foyer de consommation est l’Europe avec 78,6 milliards d’euros, suivi des
États-Unis avec 67,2 milliards d’euros et de la Chine avec 47,6 milliards d’euros
(Cosmetic Valley 2020). La plupart des produits cosmétiques sont favorables à la
prolifération des micro-organismes de par leur composition riche en eau et en
composés organiques. Suite au développement de ce marché, à la controverse
médiatique et au durcissement de la réglementation entraînant des réductions
qualitatives et quantitatives des conservateurs, la surveillance et la maîtrise de la
contamination microbiologique des produits cosmétiques sont au cœur des
préoccupations des industries cosmétiques. Ces contaminations peuvent provoquer la
modification des caractéristiques organoleptiques des formules et/ou mettre en péril
l’innocuité des produits cosmétiques. La conformité microbiologique ou l’efficacité
antimicrobienne d’un produit cosmétique considéré à risque est déterminée par la
méthode de challenge-test, définie dans la norme NF EN ISO 11930. Celle-ci consiste
à évaluer l’évolution de la population microbienne dans un produit, suite à une
inoculation volontaire et contrôlée, par dénombrement de microorganismes
spécifiques viables, sur milieux gélosés et à différents intervalles de temps pendant 28
jours. Les challenges tests donnent une indication sur l’efficacité des conservateurs
utilisés et sur la qualité microbiologique des produits mis sur le marché mais présentent
tout de même quelques limites, notamment du fait d’un protocole fastidieux constitué
de nombreuses étapes (dilutions, dénombrements sur boite, comptages…) mais aussi
du fait du long délai d’obtention des résultats. De plus, comme il n’existe pas de
protocole universel pour chaque forme galénique évaluée (produits liquides, semi-
solides, solides), c’est au responsable microbiologiste de prendre la décision de la mise
en place des détails protocolaires les plus adaptés selon les galéniques. Il est donc
pertinent de pouvoir évaluer de façon automatisée, précise et fiable la capacité de
conservation des formules.

C’est dans ce contexte que le travail présenté dans ce mémoire a eu pour objectif
général de mieux comprendre, d’évaluer, de prévoir et d’optimiser le fonctionnement
des systèmes conservateurs au sein des matrices cosmétiques. Les formules
cosmétiques émulsionnées de forme huile dans eau (h/e) étant les plus répandues en
cosmétique, nous les avons choisies comme modèle d’étude. Nous avons par ailleurs

16
sélectionné Staphylococcus aureus comme modèle bactérien car i) il s’agit de l’un des
pathogènes les plus retrouvés dans les produits cosmétiques et ii) il est porté sur la
peau et les muqueuses de façon asymptomatique par 30% de la population (Ryu et al.
2014).

Le présent rapport est composé de trois parties :

- La première partie de cette thèse est une étude bibliographique (Chapitre I)

présentant dans un premier temps des généralités sur la composition et la stabilité
physico-chimique des formules cosmétiques. Les risques microbiologiques et les
facteurs de conservation des produits cosmétiques sont ensuite abordés, suivi d’une
description de l’évaluation et de la modélisation de l’inactivation bactérienne. Enfin, les
interactions possibles pouvant exister dans les produits cosmétiques entre les
bactéries, les conservateurs et la matrice sont exposées.

- La deuxième partie est consacrée à̀ l’exposé des résultats obtenus au cours de cette
thèse. Les résultats sont regroupés en deux chapitres.

Le premier chapitre consiste en l’étude de la distribution spatiale des bactéries dans

les formules cosmétiques et son influence sur les challenge-tests (Chapitre II). Cette
partie a pour objectif de décrire et de comprendre le comportement des bactéries dans
les matrices cosmétiques en fonction de leurs caractéristiques et de la structuration des
matrices.

Le deuxième chapitre présente le développement d’une méthode alternative aux

challenge-tests permettant l’évaluation et la prévision de l’action des conservateurs
dans les formules cosmétiques (Chapitre III). Celle-ci a pour objectif de prédire
rapidement et de façon automatisée le niveau d’efficacité des conservateurs en
fonction de leur concentration mais aussi de mieux comprendre le comportement des
conservateurs en fonction des interactions conservateurs/matrices/bactéries.

- La dernière partie conclut ce mémoire par une discussion générale incluant les
perspectives du projet.

Cette étude a été réalisée dans l’équipe « Biofilms et Communautés Spatialement

Organisées » (B3D) de l’institut Micalis INRAE/AgroParisTech à Jouy-en-Josas, en
partenariat avec le service de microbiologie des laboratoires CLARINS. L’équipe B3D
mène ses recherches dans le cadre de la sécurité microbiologique des aliments. Elle
cherche à comprendre les comportements bactériens au sein de consortiums

17
tridimensionnels, tels que les biofilms ou les systèmes multiphasiques alimentaires, en
étudiant l’impact de microenvironnements hétérogènes sur la diversification des types
cellulaires.

18
 CHAPITRE I :
Étude bibliographique

19
I - Formulation cosmétique

1 - Définitions d’un produit cosmétique

Selon l'article 2 du règlement n°1223/2009 du Parlement européen et du Conseil du

30 novembre 2009 relatif aux produits cosmétiques, un produit cosmétique est défini
comme : « toute substance ou mélange destiné à être mis en contact avec les parties
superficielles du corps humain (épiderme, systèmes pileux et capillaire, ongles, lèvres
et organes génitaux externes) ou avec les dents et les muqueuses buccales ; en vue,
exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d'en modifier
l'aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs
corporelles ».

De nombreuses formes galéniques existent aujourd'hui :

- les dispersions : ce sont des systèmes multiphasiques formés d’une phase dispersante
(= continue, externe) au sein de laquelle se trouve une phase dispersée dite
discontinue et interne. C’est le cas par exemple des formes galéniques émulsionnées
telles que les crèmes et les laits (Figure 1).

- les solutions : mélange de constituants miscibles entre eux (les lotions et eaux
démaquillantes)

- les gels : plus ou moins transparents, visqueux et élastiques.

- les formes anhydriques : dont la teneur en eau est nulle (rouges à lèvres, poudres et
huiles) (Pensé-Lhéritier and Masson 2016).

2 - Composition des produits cosmétiques

2.1 – Excipients

Les excipients ont un rôle essentiel dans la formulation d'un produit cosmétique, ils
permettent le transport des principes actifs et sont en partie à l'origine de la galénique
du produit. Dans le cas d'une émulsion de type crème, l'excipient sera composé de la
phase aqueuse, de la phase lipidique et d'émulsionnants (Pensé-Lhéritier and Masson
2016).

20
 2.1.1 - Phase aqueuse

Généralement, la phase aqueuse est souvent constituée à plus de 50% d'eau distillée.
Elle contient également des polyalcools ayant un double rôle : celui de solvant mais
aussi d'agent humectant capable de fixer l'eau par liaisons hydrogène à la surface de
l'épiderme grâce à leurs propriétés hygroscopiques (Fukui 2017).

2.1.2 - Phase lipidique

La phase lipidique ou encore appelée phase grasse est souvent composée

d'hydrocarbures et de corps gras oxygénés. Les hydrocarbures ont une chaine
carbonée et hydrogénée qui peut être linéaire, cyclique ou ramifiée. Leur structure
chimique leur apporte leur propriété hydrophobe. La vaseline et la paraffine sont des
hydrocarbures minéraux répandus en cosmétique. La particularité des hydrocarbures
comme l'huile de paraffine, est d'avoir un effet semi-occlusif sur la peau en formant un
film de protection à la surface de l'épiderme, la protégeant ainsi des potentielles
agressions extérieures et favorisant l'hydratation en empêchant l'évaporation de l'eau.
Les corps oxygénés retrouvés dans la plupart des produits cosmétiques sont les acides
gras, les alcools gras comme l'alcool cétylique qui jouent le rôle d'émollients, les esters
gras souvent utilisés comme viscosant, les lipides simples comme les triglycérides et
enfin les lipides complexes comme les phosphoglycérides (Kirk–Othmer 2013).

2.1.3 – Émulsionnants

Les constituants indispensables à la formation d'une formule cosmétique émulsionnée

sont les émulsionnants, appelés également émulsifiants, surfactants ou tensio-actifs
(Figure 1).

Les émulsionnants sont des molécules amphiphiles capables de modifier la tension

superficielle entre deux surfaces non miscibles (ex huile/eau). Ils sont composés d'une
partie lipophile caractérisée par une longue chaine carbonée et d'une tête hydrophile.
Il en existe deux classes : les tensio-actifs ioniques et non ioniques. Les tensio-actifs
ioniques créent des forces de répulsions électrostatiques entre gouttelettes
d'émulsion. La tête hydrophile peut être chargée positivement (cationiques), chargée
négativement (anionique) ou avoir une charge globale nulle (amphotère). Les tensio-
actifs non ioniques ne possèdent pas de charge, ce sont des polymères dont la partie
polaire est souvent constituée de polyéthylène glycol (PEG). Ils agissent par
encombrement stérique en se positionnant à la surface des gouttelettes d'émulsions

21
en formant une barrière dense empêchant ainsi l’attraction des gouttelettes entre elles.
Il est indispensable de déterminer la concentration d’émulsionnant optimale à utiliser
car à trop forte concentration, les molécules de tensio-actifs vont s’agréger entre elles
et former des micelles. Cette concentration est appelée concentration micellaire
critique (Critical Micelle Concentration ou CMC).

Figure 1 : Représentation schématique d'une émulsion huile dans eau (h/e) à gauche
et d'une émulsion eau dans huile (e/h) à droite.

L’action des tensio-actifs dépend de leur solubilité dans chacune des deux phases non
miscibles. Celle-ci peut être caractérisée par une balance hydrophile/lipophile, appelée
HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance), variant sur une échelle variant de 0 à 20 (Tableau
1). Ce système représente l'équilibre entre les parties hydrophiles et lipophiles du
tensio-actif et est donné par la formule ci-dessous :

)*++, -./é12/*34, 5, /* 6*473, ℎ954.6ℎ3/, 5, /* -./é12/,

!"# = 20 ×
)*++, -./é12/*34, 5, /* -./é12/,

Plus la valeur d'HLB sera élevée, plus la solubilité dans l'eau du tensio-actif sera
importante. Ce calcul est utilisé pour optimiser la stabilité des émulsions ; si plusieurs
tensio-actifs sont ajoutés dans une même émulsion, les valeurs d'HLB de chaque
tensio-actif peuvent être additionnées afin d'atteindre l'équilibre requis (Nakama
2017).

22
Tableau 1 : Relation entre la gamme de HLB et leur solubilité dans l'eau d'après (Epstein
2006).

2.2 - Additifs

Épaississants et gélifiants

Les agents épaississants agissent par encombrement stérique : après leur introduction
dans l’eau, l’hydratation permet le passage de la forme enroulée de la molécule, à une
forme déroulée occupant un volume plus important induisant une augmentation de la
viscosité de la formule (Sadok et al. 2013). Ils permettent de stabiliser les émulsions en
augmentant la viscosité, limitant ainsi le mouvement des gouttelettes lié à l'attraction
terrestre empêchant ainsi le crémage dans le cas d'une émulsion h/e ou la
sédimentation (e/h). Les épaississants les plus courants sont les polysaccharides
d'origine naturelle, non ioniques (gomme de guar) ou anioniques (gomme de
xanthane, carraghénanes et alginates). Les polyacrylates de synthèse comme les
carbomères sont également très utilisés en cosmétique. Ils ont un faible pouvoir
épaississant en milieu acide mais l'ajout d'une base comme la trométhamine, entraine
la neutralisation des groupements acides carboxyliques. Cette neutralisation engendre
une augmentation de la charge électrique des macromolécules, entrainant ainsi leur
expansion dans la formule. Les gélifiants participent aussi à la stabilisation d'une
émulsion en créant un réseau tridimensionnel par emprisonnement du solvant à travers
un enchevêtrement de macromolécules liées entre elles par l’intermédiaire de liaisons
hydrogènes ou d’interactions hydrophobes par exemple. D'autres composés peuvent
participer à l'augmentation de la viscosité d'une émulsion comme l'ajout de particules

23
solides, notamment les silices et les argiles, très utilisées dans la formulation de
masques (Lochhead 2017).

Agents conservateurs

Il existe plusieurs types de conservateurs possédant différents spectres d’activité

antimicrobienne : contre les bactéries, ils peuvent avoir un effet bactéricide ou
bactériostatique et contre les moisissures, un effet fongicide ou fongistatique. L'action
d'un conservateur est dépendante de différentes conditions dont le pH,
l'incompatibilité avec d'autres constituants ou encore sa solubilité dans la formule.
L'efficacité d'un conservateur peut être caractérisée par des valeurs de CMI
(Concentration Minimale Inhibitrice) pour l’effet d’inhibition de la croissance
microbienne et de CMB (Concentration Minimale Bactéricide) pour l’effet d’inactivation
(ou de destruction). Il est possible d'associer plusieurs conservateurs et cumuler ainsi
leur action. Les principaux conservateurs utilisés en cosmétique et leur mode d’action
sont présentés dans le chapitre I-II-3-3.2-3.2.2.

Antioxydants et filtres UV

Dans les formules cosmétiques, certaines matières premières s'oxydent en présence

d'oxygène et des radicaux libres se forment. Les constituants les plus sensibles à
l'oxydation sont les huiles, les beurres et les cires. Il existe deux types d'antioxydants :
les antioxydants naturels, comme le tocophérol et l'acide ascorbique, et les
antioxydants synthétiques, comme le BHA (Butyl Hydroxy Anisole) et le BHT (Butyl
Hydroxy Toluène). Les réactions d'oxydation sont favorisées par la présence de cations
métalliques (Fe3+, Cu2+) qui peuvent cependant être neutralisés par l'ajout d'un agent
chélatant comme l'EDTA (acide éthylène diamine tétra acétique). Ce phénomène
d’oxydation peut engendrer un rancissement et un brunissement, ce qui porte atteinte
à la stabilité du produit. D’autre part, l’aptitude de l’EDTA à chélater des cations
métalliques semble contribuer à la protection antimicrobienne des formules,
probablement via l’inactivation de cascades enzymatiques indispensables à la survie
des microorganismes. Les formules peuvent être également sensibles aux
rayonnements lumineux. Elles sont alors dites photosensibles. Un additif anti-UV peut
donc être rajouté si le conditionnement du produit n’est pas suffisant pour protéger la
formule, comme c'est le cas des crèmes en pots. Le butylmethoxydibenzoylméthane,
l’octylméthoxycinnamate et la benzophénone-3 sont des filtres anti-UV, retrouvés
couramment en cosmétique. La liste complète des antioxydants et anti-UV autorisés

24
est disponible dans le règlement CE N°1223/2009. Les filtres anti-UV sont aussi utilisés
pour protéger la peau des rayonnements solaires (Kozlowski 2009).

Principes actifs

Par définition, les principes actifs sont directement liés à l'efficacité d'un produit
cosmétique. Ils se retrouvent en très faible quantité (environ <3%) dans les formules.
L'ajout de principes actifs permet d'apporter différentes propriétés à un produit
comme un effet anti-âge (anti-rides, anti-tâches, raffermissants) ou une action sur
l'hydratation de la peau (agents humectants, émollients, filmogènes) (Pensé-Lhéritier
and Masson 2016).

3 – Étude de la stabilité physique et chimique d’une formule cosmétique

émulsionnée

3.1 – Étude de la stabilité physique

Les émulsions sont des systèmes thermodynamiquement instables stabilisés par des
tensio-actifs. Il arrive dans certains cas, que certains mécanismes de déstabilisation
apparaissent (Brochette 2013) (Figure 2) :

- Le mûrissement d’Ostwald : Lors de la formulation d’une émulsion, il est assez rare

d’avoir une seule et unique taille de gouttelettes. Le mûrissement d’Ostwald est un
phénomène irréversible résultant du flux du contenu des petites gouttelettes vers les
plus grosses gouttelettes dont la pression interne est plus faible afin d'atteindre un état
thermodynamiquement plus stable.

- La floculation : C’est un phénomène réversible résultant de l’agrégation des

gouttelettes sous l’action d’interactions attractives telles que les forces de Van Der
Waals. À cause d’une répulsion insuffisante entre elles, les gouttelettes vont se
rapprocher et former des agrégats tout en gardant leur intégrité.

- Le crémage et la sédimentation : ceux-ci sont soumis à la densité des phases

contenues dans les gouttelettes d’émulsion liée au phénomène de pesanteur et aux
mouvements Browniens. Si la phase dispersée, c’est-à-dire la phase contenue dans les
gouttelettes est moins dense que la phase dispersante, alors les gouttelettes vont
migrer à la surface de l’émulsion et induire un crémage, c’est le cas des émulsions h/e.
Au contraire, dans le cas d’une émulsion e/h, la phase contenue dans les gouttelettes
pouvant être plus dense que la phase dispersante, les gouttelettes vont à l’inverse

25
sédimenter au fond de l’émulsion. Ces phénomènes sont réversibles après une
redispersion des gouttelettes à l’aide d’une agitation douce par exemple.

- La coalescence : C’est un phénomène irréversible résultant de la rupture du film

interfacial entre une ou plusieurs gouttelettes et de leur fusion pour former une
gouttelette de taille plus importante. Cela peut aboutir à la séparation totale des deux
phases : déphasage.

- L’inversion de phases : Ce phénomène apparait lorsqu’un trop grand nombre de

gouttelettes est présent dans la phase dispersante. La phase dispersée étant trop
concentrée par rapport à la phase dispersante présente en minorité, il y a changement
de phase et une émulsion h/e par exemple devient une émulsion e/h.

Figure 2 : Représentation schématique des différents mécanismes de déstabilisation

d'une émulsion.
Afin de contrôler la stabilité physique de l’émulsion, une étude doit être réalisée selon
différents critères d’analyses :

- L’aspect macroscopique : Afin de détecter rapidement un problème de stabilité dès

la fin de la formulation d’un produit, une observation macroscopique consiste à vérifier
à l’œil nu un changement de couleur, un déphasage ou un changement de viscosité
visible au cours du temps (Feuilloley 2018).

- L’aspect microscopique : L’organisation et la taille des gouttelettes de l’émulsion sont

habituellement observées au microscope optique en lumière normale, ce qui permet
de visualiser des gouttelettes de l’ordre de 1 µm. En revanche, il est impossible
d’observer les micelles, celles-ci étant de l’ordre du nanomètre. D’autres techniques de
microscopies peuvent donc être employées telles que la microscopie électronique à
transmission ou à balayage (Yamashita and Sakamoto 2017). La microscopie optique
en lumière polarisée peut aussi être utilisée pour vérifier la présence de structures

26
cristallisées pouvant résulter d’une mauvaise solubilisation de certaines matières
premières (Feuilloley 2018).

- La viscosité : c’est l’un des paramètres directement liés à la composition et à

l’organisation des différents constituants dans la formule. Le principe de la mesure de
la viscosité d’une formule par un rhéomètre réside dans l’application d’une force de
cisaillement à la formule en mettant en rotation un mobile à une vitesse donnée. La
résistance de la formule est ensuite mesurée par un capteur. Généralement dans le cas
d’une émulsion, plus la force de cisaillement augmente plus la viscosité décroit : on
parle de comportement rhéofluidisant (Pensé-Lhéritier and Masson 2016).

- La granulométrie : elle permet d’étudier la taille des gouttelettes ainsi que leur
distribution volumique dans une formule cosmétique. La méthode la plus utilisée pour
caractériser la granulométrie d’une formule est l’utilisation d’un granulomètre laser
basé sur le principe de la diffraction de la lumière lors du passage des gouttelettes
devant un faisceau laser (Yamashita and Sakamoto 2017).

- La mobilité électrophorétique (ou potentiel zêta) : La mobilité électrophorétique

permet d’accéder à la charge des gouttelettes de l’émulsion et plus précisément à la
charge électrique des molécules adsorbées à leur surface. Cette valeur permet de
déterminer les forces de répulsion entre les globules de l’émulsion : plus la répulsion
est forte et plus l’émulsion sera stable. Le principe de cette mesure consiste à
provoquer la migration des gouttelettes dans une cellule de mesure en appliquant une
tension alternative entre deux électrodes. La vitesse de déplacement (V) des
gouttelettes sous l’action d’un champ électrique (E) est analysée par une caméra reliée
à un microscope. La mobilité électrophorétique (ME) est déterminée par la relation
!
suivante : ): = "

où ME est exprimée en µm.cm.s-1 .V-1, V en µm.s-1 et E en V.cm-1 (Feuilloley 2018;

Pensé-Lhéritier and Masson 2016).

- Les tests de vieillissement accélérés et de dégradation forcée

Afin de garantir la stabilité du produit jusqu’à la fin de sa durée de vie, il est nécessaire
de savoir comment celui-ci va évoluer au cours du temps ou dans des conditions
extrêmes. Pour cela, deux tests sont couramment utilisés : le test de vieillissement
accéléré et le test de dégradation forcée. Le premier consiste à placer le produit au sein
d’une enceinte climatique permettant de faire varier, à différentes échelles, la
température, l’agitation, la luminosité et l’hygrométrie. Dans le cas d’une émulsion, ce

27
test sera très utile pour détecter précocement des problèmes liés à la stabilité des
gouttelettes tels que la floculation, la coalescence et le crémage. Le vieillissement de la
formule peut aussi être étudié en temps réel dans des conditions normales d’utilisation.
Le test de dégradation forcée permet d’évaluer la stabilité de la formule dans des
conditions extrêmes et consiste en une succession de cycle de centrifugation ou de
cycles de réchauffement/ refroidissement (Pensé-Lhéritier and Masson 2016).

3.2 – Étude de la stabilité chimique

Les paramètres généralement contrôlés lors de l’étude de la stabilité chimique d’une

formule cosmétique sont les suivants :

- Le pH ou potentiel hydrogène est un des paramètres importants à surveiller car la

stabilité des gouttelettes d’émulsion ainsi que la sécurité du produit et l’efficacité de
ses principes actifs peuvent fortement dépendre de cette mesure. C’est le cas par
exemple de certains tensioactifs ou conservateurs qui sont performants seulement
dans une gamme de pH donnée (Feuilloley 2018).

- La mesure de la conductimétrie est également essentielle à l’étude de la stabilité

chimique du produit. Sa valeur va dépendre de la nature et de la concentration des
ions présents. Elle est mesurée dans la phase continue. Cette mesure permet de
détecter l’inversion de phase d’une émulsion. Elle est définie par la relation suivante :
>
; = <.
/

Avec G : la conductance en Siemens (S), < : la conductivité de la solution en S.m-1, S : la

surface des électrodes parallèles en m2 et / : la distance entre les deux électrodes en m
(Pensé-Lhéritier and Masson 2016; Feuilloley 2018).

- Analyse et dosage des matières premières ou des produits de dégradation :

La nature et la quantité de certaines matières premières telles que les conservateurs,

les actifs, les filtres ou encore les produits de dégradation pouvant résulter d’une
réaction entre constituants de la formule, peuvent être évaluées par chromatographie
gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ou par chromatographie liquide à haute
pression (Feuilloley 2018; Shen et al. 2007).

L’emballage est essentiel pour la protection du produit vis-à-vis de l’environnement

extérieur, notamment contre l’oxydation, l’évaporation de constituant volatile ou
encore contre les rayonnements lumineux. Cependant, dans certains cas, l’emballage

28
peut aussi participer à l’altération du produit via des interactions du contenant avec le
contenu par migration ou relargage de substance de l’emballage dans la formule
(Pensé-Lhéritier and Masson 2016). Dans le cas des emballages plastiques, certains
additifs, ajoutés pour améliorer la fonctionnalité de l’emballage, peuvent migrer dans
le contenu et s’avérer toxique. C’est le cas par exemple des plastifiants tels que les
phtalates qui favorisent la souplesse du plastique mais qui peuvent avoir une toxicité
sur la reproduction humaine (Gimeno et al. 2012).

II - Risques microbiologiques des produits cosmétiques

1 - Produits à risques microbiologiques

Les formules cosmétiques sont des milieux complexes propices au développement des
microorganismes de par leur composition riche en eau et en nutriments… (Herrera
2004). Chaque produit cosmétique présente un niveau de risque microbiologique qui
sera différent selon la composition de la formule, le type d'emballage (pots, unidose,
pompe airless) ou encore les conditions de fabrication et de remplissage. Tous les
produits cosmétiques ne doivent donc pas nécessairement subir des tests d’évaluation
de la protection antimicrobienne. En effet, selon la norme ISO 29621:2017, certains
produits hostiles à la croissance ou à la survie des microorganismes sont qualifiés à
faible risque microbiologique et dispensent alors le fabricant de réaliser des tests
microbiologiques. Cette norme définit notamment un ensemble de conditions
permettant de considérer les produits comme étant à faible risque. Il s’agit par exemple
d’une faible activité de l’eau (aw) ≤ 0,75, d’un pH ≤ 3 ou ≥ 10 et d’une concentration
d’éthanol supérieur à 20%. C’est le cas des produits ne contenant pas d’eau disponible
pour la croissance des bactéries tels que les huiles corporelles, les baumes ou rouges
à lèvres, ou les poudres dont les fards à joues, ou encore des produits avec un fort
pouvoir oxydant tels que les colorants capillaires. Une liste plus détaillée d’exemples
est présentée dans le Tableau 2. Les produits n’étant pas à faible risque
microbiologique doivent au contraire être soumis à des tests d’évaluation de la
protection antimicrobienne appelés Challenge-tests (Feuilloley 2018).

29
Tableau 2 : Liste non exhaustive de produits à faible risque d'après ISO 29621:2017
(Feuilloley 2018)

Facteur physico-chimique Limite Exemple

Soins peeling (exfoliation de la

pH ≤ 3,0
peau) ; (acide glycolique)

pH ≥ 10,00 Produits défrisants

Anhydre - Huile corporelle, crayons
Éthanol ou autre alcool ≥ 20% Laques, parfums
Activité de l’eau (aw) ≤ 0,75 Baumes pour les lèvres, rouge à
Température de remplissage ≥ 65,0 °C lèvres, fards à joue crème
Solvants organiques :
Produits à base de solvants : par
Acétate d’éthyle > 10%
exemple vernis à ongles
Acétate de butyle > 10%
Composés alcalins : Oxydants :
Ammoniac ≥ 0,5% Par exemple colorants capillaires,
Monoéthanolamine ≥ 1% produits pour permanentes.
Chlorhydrate d’aluminium et
≥ 25% Anti-transpirants
sels connexes
Éclaircissement, décoloration,
Peroxyde d’hydrogène ≥ 3%
permanentes des cheveux.

2 - Contaminants microbiens des cosmétiques

Après contamination, les microorganismes peuvent altérer les caractéristiques

organoleptiques des produits cosmétiques telles que la couleur, l’odeur… (Figure 3). La
présence de contaminants dans le produit avant sa première utilisation est une
contamination microbiologique dite primaire. Elle peut être due par exemple à une
défaillance des bonnes pratiques de fabrication. On parle de contaminations
microbiologiques secondaires lorsque qu’elles apparaissent après ouverture du produit
(Feuilloley 2018). Ce type de contamination est souvent dû à l’introduction par le
consommateur de microorganismes résidant sur la peau. La contamination par les
mains est la plus fréquente, la main accueillant au total près de 1 x 106 bactéries/cm2
(Feuilloley 2018). Il peut également être dû à la mise en contact du produit avec les
microorganismes présents en suspension dans l’air environnant pendant l’utilisation.
Les pathogènes fréquemment retrouvés dans les formules cosmétiques sont
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Burkholderia
cepacia, Candida albicans, Klebsiella oxytoca, Enterobacter gergoviae, et Serratia
marcescens (Halla et al. 2018; Hugbo et al. 2005; Lundov et al. 2009; Lundov and

30
Zachariae 2008). Chaque année dans le monde, il est recensé par différentes autorités
sanitaires (RAPEX, SGS, l’agence nationale de sécurité du médicament et des produits
de santé (ANSM)…) des rappels de produits cosmétiques à cause de contaminations
microbiologiques dont au moins 36 entre janvier 2019 et février 2020 (ANSM 2020;
SGS 2020; Lundov and Zachariae 2008). Ces non-conformités ne sont pas fréquentes
mais elles peuvent avoir un impact sur la santé publique. On peut notamment citer
l’incident lié à une contamination par Burkholderia cepacia dans un lait hydratant pour
le corps, utilisé dans un service de soins intensifs à l’hôpital en 2006 en Espagne. Suite
à l’application de ce lait, certains patients adultes ont développé une bactériémie
(Alvarez-Lerma et al. 2008). En 2008-2009, un shampooing pour bébé, contaminé par
Serratia marcescens a également été utilisé dans un service hospitalier pour
nourrissons. Plusieurs nouveau-nés dont des prématurés ont subi des infections et un
bébé a succombé des suites d’une septicémie et d’une méningite malgré les
traitements médicamenteux (Madani et al. 2011). Ces exemples montrent qu’il est
primordial d’assurer la protection antimicrobienne de chaque produit cosmétique
commercialisé.

31
Figure 3 : Causes et conséquences des contaminations microbiennes dans les produits
cosmétiques (Halla et al. 2018).

De nombreuses études montrent que Staphylococcus aureus est l’une des bactéries les
plus fréquemment retrouvées notamment dans des produits cosmétiques tels que les
gels douche, crèmes, laits… (Tran and Hitchins 1994; Birteksoz Tan et al. 2013; Campana
et al. 2006; Anelich and Korsten 1996). Staphylococcus aureus, aussi appelé
staphylocoque doré en référence à la couleur or des colonies formées, appartient à la
famille des Staphylococcaceae. Ce coque se présente souvent sous forme de grappes
et mesure environ 0,5 à 1,5 µm de diamètre (Figure 4). C’est une bactérie à coloration
de Gram positive, immobile, asporulée, qui possède une catalase et une coagulase. Elle
est aéro-anaérobie facultative et se développe à une température optimale comprise
entre 35 et 41°C (ANSES 2011). C’est une bactérie opportuniste présente sur la peau et
les membranes muqueuses. Elle fait partie de la flore cutanée et est portée par 30% de
la population de façon asymptomatique (Ryu et al. 2014). De nombreuses souches
produisent des toxines exfoliatives sécrétées sur l’épiderme et sont responsables de
maladies infectieuses, notamment des infections de la peau dont des abcès, des
furoncles, des impétigos, des folliculites, des phlyctènes… (Lowy 1998; Tong et al. 2015;
Bukowski et al. 2010). Certaines souches de S. aureus peuvent aussi produire des

32
entérotoxines staphylococciques (SE) thermorésistantes responsables d’intoxications
alimentaires (Le Loir et al. 2003; ANSES 2011). Les conditions physico-chimiques d’une
formule cosmétique favorable à la croissance de S. aureus correspondent à une activité
de l’eau ≥ 0,80 et un pH compris entre 5 et 9 (Feuilloley 2018).

Figure 4 : Staphylococcus aureus observé au Microscope Électronique à Balayage

(MIMA2, INRAE, 2018. Plateforme de Microscopie et Imagerie des Microorganismes,
https://doi.org/10.15454/1.5572348210007727E12, A. Canette, S. Almoughrabie)

3 - Conservation antimicrobienne des produits cosmétiques

3.1 - Facteurs de conservation extrinsèques à la formule cosmétique

Les bonnes pratiques de fabrication (BPF) : Les produits cosmétiques doivent être
fabriqués selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) comme indiqué dans l’article
8 du règlement n°1223/2009 relatif aux produits cosmétiques. La norme NF EN ISO
22716 : 2008 définit des lignes directrices pour la production, le contrôle, le stockage
et l'expédition des produits cosmétiques. Afin de réduire le risque de contaminations
des produits cosmétiques pendant leur fabrication, un ensemble de mesures peut être
entrepris. Par exemple, un système de filtration de l'eau, des contrôles
microbiologiques des matières premières, la désinfection de l'équipement et un
personnel correctement formé et équipé peuvent réduire considérablement le danger
de contamination (Varvaresou et al. 2009; ANSM 2016).

La conservation liée à l’emballage : Elle consiste à limiter l’entrée de potentiels

contaminants microbiologiques (Devlieghere et al. 2015). L’utilisation d’un dispositif de
pompage est de plus en plus répandue car elle permet la diminution du risque d’une
contamination microbiologique apportée par les utilisateurs en comparaison des pots
qui présentent une grande surface d’échange avec l’environnement extérieur et un

33
contact direct du contenu avec l’utilisateur. Le conditionnement le plus sûr est celui à
usage unique en sachet ou en capsule par exemple (Varvaresou et al. 2009). De récents
développements liés à l’emballage contribuent à limiter efficacement les risques de
contaminations microbiennes par les consommateurs. C’est notamment le cas des
systèmes d’emballage « airless » à piston qui une fois pressé ne permettent pas l’entrée
d’air à l’intérieur du contenant mais qui garde tout de même un volume mort dans la
tête du piston. On peut aussi citer le Dispositif Exclusif Formule Intacte
(D.E.F.I.) développé à l’initiative des laboratoires Pierre Fabre qui permet de maintenir
les formules stériles tout au long de leur utilisation grâce à i) une stérilisation de la
formule et/ou des matières premières et des appareils de formulation et à ii) un
système d’ouverture/fermeture hermétique du produit. Ce dernier est composé d’une
membrane souple qui après une pression de la pompe, se soulève puis revient à sa
place initiale, assurant ainsi l’étanchéité du produit. Ce système sans volume mort,
permet alors de formuler des produits sans conservateur (Pierre Fabre 2009).

3.2 - Facteurs de conservation intrinsèques à la formule cosmétique

3.2.1 - Conservation liée aux caractéristiques physico-chimiques de

la formule

Le développement des microorganismes dans les formules cosmétiques dépend des

caractéristiques des microorganismes et des paramètres physico-chimiques des
formules (Tableau 3).

Tableau 3 : Gamme de valeurs physico-chimiques dans une formule permettant la

croissance des microorganismes (Berthele et al. 2014).

34
La conservation physicochimique d’une formule cosmétique consiste en l’ajustement
de plusieurs facteurs :
- La forme de l’émulsion : Les émulsions huile dans l’eau (h/e) ont pour phase continue
une phase aqueuse, les bactéries se développant dans la phase aqueuse, ce type
d’émulsion présente donc plus de risques de contamination qu’une émulsion eau dans
huile (e/h) (Varvaresou et al. 2009; Halla et al. 2018).

- Le pH : C’est l’un des paramètres importants jouant un rôle dans la conservation

microbiologique d'un produit cosmétique et son impact va dépendre des
microorganismes. Le risque de développement bactérien est diminué dans une formule
avec un pH < 5 cependant l’effet du pH sur la croissance bactérienne est variable selon
les espèces. En revanche, la croissance des moisissures et des levures est possible à pH
acide (Berthele et al. 2014; Halla et al. 2018). La plupart des produits cosmétiques ont
un pH compris entre 5 et 8 pour se rapprocher au plus près du pH de la peau qui est
environ égal à 5, ce qui ne permet pas la protection des formules.

- La concentration en éthanol : Son impact sur la conservation va dépendre également

des microorganismes. La présence d’éthanol est par exemple très efficace sur
l’inhibition de la croissance de S. aureus et de C. albicans à une concentration égale à
20% mais pas d’Aspergillus brasiliensis (Berthele et al. 2014).

- L’activité de l’eau (aw) : Les microorganismes ont également besoin d’une quantité
d’eau suffisante pour proliférer dans un milieu. L’activité de l’eau (aw) est la quantité
d’eau libre disponible pour le développement des microorganismes, non impliquée
dans des interactions avec d’autres constituants de la formule. Elle est comprise entre
0 et 1 (1 = eau pure) et est calculée en faisant le rapport de la pression partielle de
vapeur d’eau de la formule (p) et de celle de l’eau pure (p0) à une température donnée
$
selon la relation suivante : *# = $% .

L’activité de l’eau diminue en fonction de la présence de solutés solubles dans la phase

aqueuse tels que le glycérol, le butylène glycol, l’éthanol, les polysaccharides et les
oligosaccharides (Pensé-Lhéritier and Masson 2016; Halla et al. 2018; Enigl and Sorrells
1997).

- La concentration en glycérine : Plus la concentration de glycérine est importante dans

une formule cosmétique et plus la valeur d’aw est faible. Une concentration de glycérine
supérieure à 16% permettrait d’exempter le produit cosmétique du Challenge-test
(Ghalleb et al. 2015).

35
Souvent, l’impact d’un paramètre seul n’est pas suffisant pour inhiber efficacement la
croissance des microorganismes dans les produits cosmétiques mais la combinaison
de plusieurs de ces facteurs peut permettre d’atteindre cet objectif. Des études
montrent un effet synergique entre la concentration en éthanol et le pH sur l’inhibition
bactérienne. Ces deux derniers facteurs ainsi que la concentration de glycérine auraient
un impact direct sur la baisse de l’activité de l’eau de la formule (Berthele et al. 2014).
Il serait donc possible de contribuer à la stabilité microbiologique d’un produit
cosmétique en utilisant une combinaison judicieuse de plusieurs facteurs cités-ci-
dessus (Ghalleb et al. 2015).

3.2.2 - Conservation liée à l’ajout de conservateurs

3.2.2.1 - Définition et réglementations

La réglementation cosmétique N°1223/2009 du parlement européen et du conseil du

30 novembre 2009 relatif aux produits cosmétiques, définit les « agents
conservateurs » comme toutes « les substances qui sont exclusivement ou
principalement destinées à empêcher le développement de micro-organismes dans le
produit cosmétique ». Les conservateurs autorisés en cosmétique et leurs
concentrations maximales sont répertoriés selon les usages dans l'annexe V du
règlement européen N°1223/2009. Le meilleur choix de conservateur à utiliser va
dépendre de plusieurs critères, sachant que le conservateur doit (Pensé-Lhéritier and
Masson 2016; Halla et al. 2018; Scholtyssek 2005) :

- Être incolore et inodore

- Être soluble dans l’eau, car c’est dans la phase aqueuse que les microorganismes se
développent et que l’activité antimicrobienne doit donc être assurée (Shimamoto and
Mima 1979).

- Être efficace sur une large gamme de pH : en effet, certains conservateurs peuvent
avoir une efficacité pH-dépendante, ce qui limite leur utilisation.

- Ne pas avoir d’impact sur la texture et la viscosité des formules

- Avoir un large spectre antimicrobien

- Être compatible avec les autres matières premières ainsi qu’avec les procédés de
formulations (stabilité à la chaleur, à l’agitation…).

36
- Être sans danger pour la santé humaine (sans effet allergène ou irritant, sans effet
cancérigène, mutagène et reprotoxique…).

3.2.2.2 - Principaux conservateurs en cosmétique et leur

mode d’action

Les principaux conservateurs les plus couramment utilisés sont : les acides organiques,
les alcools et phénols, les aldéhydes et les composés d’ammonium quaternaire (Halla
et al. 2018).

Les acides organiques et leurs sels

Les acides organiques et leurs sels sont très utilisés en cosmétique. Pour la plupart, on
les trouve à l’état naturel comme par exemple l’acide benzoïque retrouvé dans certains
fruits tels que les canneberges et les airelles. Les acides organiques les plus utilisés en
cosmétique sont les acides benzoïque, déhydroacétique, sorbique, propionique,
salicilique, formique, indécylénique et leurs sels (Figure 7). Certains sont également
utilisés comme additifs alimentaires pour la conservation des aliments. L’activité
antimicrobienne des acides organiques dépend de différents paramètres : de leur
concentration, de leur solubilité dans la phase aqueuse, de la longueur de leur chaine
carbonée, du pH de la formule… (Lambert and Stratford 1999; Stratford and Eklund
2003; Halla et al. 2018).

Figure 5 : Mécanisme d'action des acides organiques sur les microorganismes (Lambert
and Stratford 1999).

Les acides organiques sont des acides faibles. Ils peuvent partiellement se dissocier
dans le milieu environnant libérant ainsi des protons, ce qui a pour conséquence une
diminution du pH rendant hostile le milieu extérieur au développement de certains
microorganismes. De plus, grâce à leur caractéristique lipophile, ils sont capables de

37
traverser la membrane plasmique des microorganismes sous forme non dissociée. Une
fois dans le cytoplasme, l’acide se dissocie en libérant des protons ce qui induit alors
une acidification intracellulaire. Afin de pallier cette diminution de pH, les
microorganismes expulsent alors les protons dans le milieu extérieur (Figure 5) et
permettent l’entrée d’ions sodium afin de rétablir le pH physiologique intracellulaire.
Ceci entraine également une acidification du milieu environnant du microorganisme,
ce qui modifie l’équilibre réactionnel vers la forme non dissociée active des molécules
d’acide dissociées présentes dans le milieu extérieur. Ce mécanisme d’action inhibe la
croissance des microorganismes qui dépensent toute leur énergie à rétablir le pH
intracellulaire. Ainsi, plus le pH d’une formule cosmétique est acide, plus la forme non-
dissociée sera présente et plus l’efficacité antimicrobienne sera importante. Pour
utiliser efficacement ce type de conservateur, il est donc primordial de tamponner le
pH de la formule à une valeur inférieure au pKa de l’acide organique utilisé, ce qui
permet d’avoir une forte proportion de forme non-dissociée. La forme dissociée de
certains acides organiques à longue et moyenne chaines ou acides phénoliques tels
que l’acide férulique est également active, notamment grâce aux propriétés lipophiles
de ces composés qui sont capables de s’insérer dans la double couche de
phospholipides membranaires et d’en perturber le fonctionnement (Pernin, Guillier, et
al. 2019). Il est à noter que certains acides organiques, comme l’acide sorbique et le
sorbate de potassium, étant sensibles à la photoxydation, il faut prévoir un emballage
cosmétique anti-UV adéquat (Lambert and Stratford 1999; Ricke 2003; Stratford and
Eklund 2003; Moore 2008; Stanojevic et al. 2009; Paulus 2005c).

Alcools et phénols

Les alcools et les phénols, ayant des propriétés antimicrobiennes reconnues, sont des
conservateurs largement utilisés en cosmétique (Figure 7). Les alcools, sont divisés en
deux catégories selon leur structure chimique, d’une part les alcools aliphatiques
comme le chlorobutanol et d’autre part les alcools aromatiques comme l’alcool
benzylique. L’alcool benzylique est plus efficace sur les bactéries à coloration de Gram
positive que sur les bactéries à coloration de Gram-négative, les levures et les
moisissures (Al-Adham et al. 2013; Paulus 2005a; Scholtyssek 2005). Les phénols
possèdent au moins un cycle aromatique associé à un groupement hydroxyle (Macheix
et al. 2006). Les alcools et certains phénols ont la capacité de s’intercaler dans la double
couche phospholipidique de la membrane bactérienne entrainant la perméabilisation
de celle-ci, ce qui a pour conséquence la fuite de divers composants intracellulaires tels

38
que les ions comme que le potassium, l’ATP, les protéines ou les nucléotides
intracellulaires (Al-Adham et al. 2013). Les alcools sont aussi capables de dénaturer les
protéines membranaires essentielles au métabolisme cellulaire (Al-Adham et al. 2013;
Paulus 2005a; Scholtyssek 2005). Les phénols agissent également sur d’autres cibles
cellulaires, telles que la synthèse des acides aminés bactériens, notamment ceux
impliqués dans la formation du peptidoglycane des bactéries. C’est le cas de l’ortho-
phénylphénol qui inhibe la biosynthèse de la lysine chez S. aureus (Jang et al. 2008). Le
phénoxyéthanol est un éther monophénolique de l’éthylène glycol très utilisé en
cosmétique et est plus efficace sur les bactéries à coloration de Gram positive que
celles à coloration de Gram négative (Scholtyssek 2005). Il est souvent ajouté dans une
formule cosmétique pour sa faculté à potentialiser l’action antimicrobienne de
nombreux autres conservateurs tels que le méthylchloroisothiazolinone et le
méthylisothiazolinone (Lundov et al. 2011).

Dans cette classe de conservateurs, on peut également citer les parabènes, sujets à
controverses pour leurs potentiels effets néfastes sur la santé. Ils sont suspectés d’être
des perturbateurs endocriniens pouvant impacter la fertilité humaine (Kirchhof and de
Gannes 2013). Ils ont un large spectre antimicrobien et ne sont pas pH-dépendants. Ils
perturbent la membrane cytoplasmique des micro-organismes, provoquant ainsi la
fuite des constituants intracellulaires (Gorman and Scott 2007).

Il existe également des conservateurs halogénés portant des groupements phénol, tels
que la chlorphénésine (Figure 6) et le triclosan. Ces deux molécules, très utilisées en
cosmétique notamment en remplacement des parabènes, ont notamment la capacité
d’oxyder, de dénaturer les protéines membranaires et d’inhiber la synthèse
enzymatique des microorganismes (Paulus 2005c; Moore 2008).

Figure 6 : Formule chimique de la chlorphénésine ou 3-(4-chlorophenoxy)-1,2-

propanediol.

39
Figure 7 : Liste non exhaustive des conservateurs de type acide organique, alcool,
phénol et aldéhyde utilisés en cosmétique, adaptée de Halla et al. (2018).

Les aldéhydes

Les aldéhydes (Figure 7) couvrent un large spectre d'efficacité antimicrobienne. Leur

mode d’action consiste principalement à altérer la paroi cellulaire et à inhiber la
synthèse des acides nucléiques et des protéines. Le glutaraldéhyde est un dialdéhyde
capable d’altérer les parois cellulaires externes des cellules bactériennes. De plus, son
activité antimicrobienne est d’autant plus grande que le pH et la température
augmentent. D’autres types de conservateurs tels que l’imidazolidinylurée et le

40
diazolidinylurée, appelés agents libérateurs de formaldéhydes, sont capables de libérer
au cours du temps dans les produits cosmétiques du formaldéhyde qui a pour action
d’inhiber la synthèse protéique, d’interagir avec les peptides des parois et d’inhiber le
transport des métabolites et des acides nucléiques (Moore 2008; Halla et al. 2018;
Scholtyssek 2005; Paulus 2005b).

Les composés d’ammoniums quaternaires :

L’action antimicrobienne des composés d’ammonium quaternaire est basée sur

l’altération de la membrane cytoplasmique des microorganismes induisant la fuite des
composés cellulaires et la lyse cellulaire. En effet, de par leur charge positive, ces
composés sont capables de se fixer aux charges négatives des groupements phosphate
des phospholipides de la bicouche lipidique de la membrane plasmique des bactéries.
La partie hydrophobe (chaîne alkyle) des ammoniums quaternaires s’intègre alors dans
la membrane bactérienne et la déstabilise (Buffet-Bataillon et al. 2012). Ce mode
d’action rend incompatible l’utilisation des composés d’ammonium quaternaire avec
des tensio-actifs anioniques. Certains composés d’ammoniums quaternaires tels que
le bromure de cétyltriméthylammonium, peuvent se lier aux acides nucléiques
provoquant la précipitation de l’ADN (Ioannou et al. 2007; Halla et al. 2018; Scholtyssek
2005).

III - Évaluation et modélisation de l’inactivation bactérienne

1 – Évaluation de la conservation d’un produit par la méthode de Challenge-test

1.1 – Définition et procédure du Challenge-test

Le challenge-test ou test d’épreuve de la protection microbiologique permet d’évaluer

l’efficacité de la conservation d’un produit cosmétique tout au long du processus de
fabrication mais aussi au cours de son utilisation par les consommateurs. Le challenge-
test est décrit dans la norme NF EN ISO 11930:2019. Deux autres référentiels, ceux des
pharmacopées européenne (2014) et américaine USP34-NF29 (2011), peuvent
s’appliquer mais leurs critères d’acceptation diffèrent de ceux de la norme NF 11930
(Feuilloley 2018). Les différentes étapes nécessaires à la réalisation d’un challenge-test
sont décrites ci-dessous selon la norme NF EN ISO 11930:2019 (Figure 8) :

41
- Inoculation des microorganismes d’essai : Les microorganismes testés sont les
suivants, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Aspergillus brasiliensis, et Candida albicans. Le produit est inoculé par une suspension
de microorganismes afin d’obtenir une concentration respectivement comprise entre
1 x 105 et 1 x 106 UFC.ml-1 ou g-1 et 1 x 104 et 1 x 105 UFC.ml-1 ou g-1 pour les bactéries
ou pour les levures et moisissures. Le volume de suspension microbienne ajouté ne
doit pas dépasser 1% du volume du produit afin d’éviter toute dilution de la formule
ou de la concentration en conservateur (Russell 2003).

- Incubation et prélèvements du produit inoculé : Le produit inoculé est incubé à

température ambiante, à 22,5°C ± 2,5 °C. Un échantillon est ensuite prélevé à des
intervalles de temps définis, à 7, 14 et 28 jours.

Figure 8 : Procédure de challenge-test (Russell 2003)

- Neutralisation de l’action antimicrobienne des conservateurs : Cette étape permet de

neutraliser rapidement l’action des conservateurs par dilution de 1 g de formule dans
9 ml de solution de neutralisation maintenu pendant un temps d’attente suffisant pour

42
stopper l’action du conservateur. Cette étape permet aux bactéries de se développer
lors du dénombrement par comptage des colonies sur boites de Petri. Le neutralisant
ne doit pas lui-même avoir d'effet antimicrobien sur les microorganismes (Johnston et
al. 2002).

- Dilutions et dénombrements : A partir de la dilution au 1/10e dans le neutralisant de

la formule contaminée, des dilutions décimales successives sont réalisées afin de
dénombrer les microorganismes survivants sur des milieux gélosés spécifiques. Le
dénombrement doit être effectué en double. Le milieu Tryptone Soja Agar (Futsaether
et al.)1993) est utilisé pour les bactéries, le milieu Pomme de terre Dextrose Agar (PDA)
pour A. brasiliensis et le milieu Sabouraud Dextrose Agar (SDA) pour C. albicans.

- Incubation et comptage des colonies : Les boites sont incubées à 32,5°C ± 2,5°C
(température équivalente à celle à la surface de la peau) pendant 48h à 72h pour les
bactéries et C. albicans ; et à 22,5°C ± 2,5°C pendant 3 à 5 jours pour A. brasiliensis.

- Calcul du taux de réduction logarithmique : La réduction logarithmique microbienne

peut s’exprimer de la façon suivante : Rx = log N0 – log Nx où N0 est le nombre de
micro-organismes inoculés au temps t0 et Nx est le nombre de micro-organismes
survivants à chaque temps de prélèvement, tx.

- Comparaison aux critères d’évaluation : A chaque temps de prélèvement, le taux de

réduction logarithmique est calculé et est comparé aux valeurs définies par les critères
d’évaluation A ou B (Tableau 4).
Tableau 4 : Critères d'évaluation pour l'essai d'efficacité de la protection
antimicrobienne d’après la norme NF EN ISO 11930.

Si les valeurs correspondent au critère A, alors le risque microbiologique est considéré

comme acceptable et satisfait à la norme sans justification complémentaire. La
validation par le critère B permet d’éviter un point de dénombrement supplémentaire

43
(J7) par les opérateurs. Cependant une analyse complémentaire de risque prenant en
compte d’autres facteurs que la formule elle-même doit être réalisée pour satisfaire à
la norme. Par exemple l’utilisation d’un contenant protecteur constitué d’un dispositif
de pompe est beaucoup moins propice à la contamination microbienne qu’un pot à
large ouverture. Enfin, si les valeurs ne correspondent ni au critère A et ni au critère B,
une évaluation du risque microbiologique doit être réalisée. Par exemple, les produits
cosmétiques délivrés en monodose, peuvent être jugés comme ayant un risque
microbiologique acceptable, à condition bien sûr que la qualité microbiologique du
produit mis sur le marché soit validée. Si aucun de ces cas n’est rencontré, la protection
antimicrobienne du produit ne satisfait pas à la norme et la protection antimicrobienne
du produit doit être revue.

1.2 – Facteurs pouvant affecter la fiabilité du challenge-test

La réalisation d’un challenge-test comprend de nombreuses étapes dont des étapes

de mélange, dilution et dénombrement sur boites (Russell 2003) qui peuvent être à
l’origine d’une variabilité de résultats. L’incertitude de mesure pour les dénombrements
bactériens est estimée à 0.3 à 0.7 log UFC (Augustin and Carlier 2006; Afssa 2007). Par
ailleurs, les microorganismes stressés, notamment après leur inoculation dans des
formules cosmétiques en présence de molécules antimicrobiennes, peuvent avoir plus
de difficultés à se développer et à croître sur milieux gélosés, ce qui fausse les résultats
de comptage (Stephens and Mackey 2003). La fiabilité des challenge-tests peut
également dépendre des incertitudes des volumes prélevés par pipetage lors des
dilutions en séries ou de l’ensemencement des boites (Hedges 2002). Il arrive
également que la conservation des formules cosmétiques soit surestimée en raison
d’une mauvaise neutralisation de l’activité antimicrobienne des conservateurs avant
dénombrement sur boite (Johnston et al. 2002). La préparation de l’inoculum bactérien
peut également avoir un impact sur l’état physiologique des bactéries. En effet, il a été
montré que les étapes de lavage par centrifugation des cultures peuvent avoir un
impact sur la viabilité, l'hydrophobicité et la charge électrique de surface des bactéries,
(Pembrey et al. 1999; Gilbert et al. 1991). Par exemple, une centrifugation à 15 000 x g
entrainerait la diminution de la viabilité d'E. coli en perturbant l'intégrité de la
membrane bactérienne ainsi qu’une baisse de la charge électrique à la surface d’E. coli
et de S. epidermidis (Pembrey et al. 1999). Enfin, la taille de l’inoculum peut avoir un
effet sur l'activité antimicrobienne des conservateurs. A concentration égale, les agents

44
antimicrobiens seraient plus efficaces sur des concentrations bactériennes basses
(Johnston et al. 2000).

Dans ce travail, nous faisons également l’hypothèse qu’une répartition hétérogène des
bactéries après inoculation des microorganismes dans la formule peut avoir un impact
sur la fiabilité des challenge-tests. Ce dernier aspect fait l’objet du chapitre II de la thèse
sur la mise en évidence et l’étude de facteurs responsables de la distribution spatiale
des bactéries dans des matrices cosmétiques émulsionnées.

2 - Évaluation de l’inactivation bactérienne par Microscopie Confocale à

Balayage Laser (MCBL)

2.1 - Principe de la MCBL

Au cours des vingt dernières années, de nombreuses techniques de microscopie

optique innovantes ont émergé telles que la microscopie confocale à balayage laser,
commercialisée pour la première fois dans les années 1980 (Amos and White 2003; Cox
2002). La MCBL permet de visualiser de manière non invasive à la fois des structures
tridimensionnelles complexes telles que les biofilms mais aussi des organismes à
l’échelle de la cellule unique (Boudjemaa et al. 2006). Le microscope confocal à
balayage laser focalise un faisceau laser en un point de l’échantillon dans un plan focal
déterminé et excite les molécules fluorescentes. Le photomultiplicateur détecte et
amplifie les photons produits suite au phénomène de fluorescence. Un diaphragme
appelé « pinhole » placé devant le photomultiplicateur permet de ne laisser passer que
le signal lumineux provenant d’un plan focal objet de l’échantillon (Figure 9). Ces
signaux sont ensuite convertis en pixels ce qui permet la reconstitution d’une image
observable. Une platine motorisée déplace l’échantillon en hauteur (sur l’axe z)
permettant ainsi l’acquisition d’une succession de coupes optiques mesurant chacune
environ 500 nm (Valeur 2003; Cox 2002; Paddock 2000).

45
Figure 9 : Principe de fonctionnement d'un microscope confocale à balayage laser
(Paddock 2000).

Contrairement à la microscopie classique, la MCBL possède de nombreux avantages

dont sa faible profondeur de champ lui procurant une résolution d’images de qualité,
même dans des échantillons denses comme des matrices alimentaires émulsionnées,
les yaourts ou le fromage (Jeanson et al. 2011; Auty 2013; Cardona et al. 2013; Ding
and Gunasekaran 1998). Un autre avantage de la MCBL est que la plupart du temps,
l’échantillon observé n’a pas besoin d’être dénaturé pour être observé (Cardona et al.
2013). Il existe plusieurs types d’objectifs selon leur milieu d’immersion, leur
grossissement ou leur ouverture numérique. Le choix de l’ouverture numérique (NA,
pour Numerical Aperture) de l’objectif peut influencer l’intensité de fluorescence qui
augmente avec une ouverture plus grande.

Une fois les images obtenues, il est souvent nécessaire de les traiter avant de les
analyser à cause d’un rapport signal sur bruit pouvant dans certains cas être insuffisant.
Pour cela, de nombreux logiciels de traitement et d’analyse d’images, tels que ImageJ,
Icy, Fidji et bien d’autres, permettent de corriger ce problème par l’application de filtres
par exemple. Une fois l’image traitée, ces mêmes logiciels permettent d’extraire les
données quantitatives et qualitatives des images notamment après segmentation de

46
l’image. La segmentation consiste en l’application d’un masque binaire permettant de
délimiter des structures ou des objets d’intérêt sur une image et notamment de calculer
une surface ou un volume de fluorescence. Dans ces logiciels, de nombreux autres
outils et plug-ins sont mis à disposition comme l’édition et l’annotation d’images ou
l’extraction de la taille et le comptage automatique d’objets sur une image (Ferreira
and Rasband 2012; De Chaumont et al. 2012).

2.2 – Principe de la fluorescence et exemples de quelques fluorochromes

Ces dernières années, les molécules aux propriétés fluorescentes appelées

fluorochromes ou fluorophores sont de plus en plus utilisées notamment en biologie.
Le principe de fluorescence est le suivant : les composés fluorescents dits dans un
« état fondamental » absorbent de l’énergie lumineuse (photons) puis sont portés dans
un « état excité ». Ce processus est très rapide, il est de l'ordre de quelques
femtosecondes. Les molécules repassent alors dans leur état fondamental plus stable
en provoquant une libération d’énergie qui peut se traduire par l’émission d’un photon,
processus appelé fluorescence. Les fluorochromes ont souvent des structures cycliques
et chacun d’entre eux est caractérisé par des spectres d'absorption et d'émission
(Lichtman and Conchello 2005; Lakowicz 2006).

De nombreux marqueurs fluorescents ayant différentes cibles cellulaires sont

disponibles sur le marché et sont des outils intéressants pour la compréhension de
systèmes physicochimiques, biochimiques et biologiques (Tableau 5). Ils permettent
d’accéder aux structures ou constituants cellulaires tels que l’ADN, la membrane
plasmique, ou les protéines. Trois grandes classes de marqueurs sont utilisés pour
l’analyse de viabilité des bactéries :

- les marqueurs de viabilité dont le mode d’action est basé sur les activités estérasiques
des bactéries (CFDA, Calcéine-AM…). Ces marqueurs pénètrent passivement les
membranes bactériennes jusqu’au cytoplasme où ils sont clivés par des estérases
induisant alors la libération de résidus fluorescents (Figure 10).

- les marqueurs de mortalité, qui pénètrent seulement dans les bactéries mortes
perméabilisées. On peut citer le Sytox Green et l’iodure de propidium qui se fixent sur
l’ADN après avoir traversé la membrane bactérienne.

47
- les marqueurs totaux, qui pénètrent à la fois dans les bactéries vivantes et mortes.
C’est le cas notamment du SYTO9 et du DAPI ou 4', 6'-diamino-2-phénylindole, qui
s’intercalent entre les bases de l’ADN.

Il existe des kits combinant l’action de deux fluorochromes tels que le kit
LIVE/DEAD™ BacLight™ composé de deux marqueurs d’ADN, le Syto 9 et l'iodure de
propidium permettant de distinguer rapidement les bactéries vivantes aux membranes
plasmiques intactes des bactéries aux membranes perméabilisées (Auty, Gardiner, et
al. 2001; Wadhawan et al. 2011).

D’autres fluorochromes peuvent être utilisés pour marquer des constituants de

matrices complexes telles que les matrices émulsionnées. Le Rouge de Nil ou « Nile
Red » ainsi que le Bodipy sont par exemple très utilisés pour marquer les composés
lipidiques présents dans les matrices alimentaires (Ly et al. 2008; Auty, Twomey, et al.
2001; Bridier et al. 2015).
Tableau 5 : Exemples de fluorochromes utilisés pour marquer les bactéries et les
constituants de matrices complexes (Bridier et al. 2015).

Chaque fluorochrome possède ses propres caractéristiques d’utilisation selon sa

sensibilité au pH, sa photosensibilisation, son mode de pénétration ou encore son
interaction avec certaines molécules présentes dans le milieu environnant. Il est donc
important de bien connaitre ces limites pour une utilisation optimale (Valeur 2003).

48
Le spectre de fluorescence d’un marqueur fluorescent peut par exemple être
dépendant de son environnement physicochimique ; on peut citer le Rouge de Nil qui
émet une fluorescence rouge lorsqu’il s’intègre dans des membranes
phospholipidiques polaires et dans le jaune lorsqu’il se trouve en présence de
triglycérides neutres (Brown and Poujol 2006; Rumin et al. 2015). L’impact du pH sur la
fluorescence d’un marqueur peut être mis à profit dans le développement de
fluorochromes, tels que le BCECF, capables de visualiser un niveau de pH intracellulaire
(Ozkan and Mutharasan 2002; Futsaether et al. 1993).

Par ailleurs, un phénomène de « photobleaching » ou photoblanchiment

correspondant à la dégradation irréversible du fluorochrome peut apparaitre après
l’exposition au laser. Ce phénomène est induit par la génération de réactions
photochimiques causées par les dérivés réactifs de l’oxygène et est aggravé par une
mauvaise calibration des paramètres de microscopie comme par exemple une trop
forte intensité de laser ou une exposition trop longue (Lichtman and Conchello 2005;
Wiederschain 2011).

Certaines bactéries à coloration de Gram négative ou positive, dont Pseudomonas

aeruginosa et Lactococcus lactis, possèdent des pompes à efflux qui rejettent le
marqueur fluorescent hors de la cellule vivante (Molenaar et al. 1992), ce qui rend
impossible la visualisation des bactéries (Bridier et al. 2011). Cependant des solutions
tampons capables d’inactiver ces pompes existent et sont utilisables dans un milieu
liquide (Joux and Lebaron 2000; Molenaar et al. 1992).

2.3 – Suivi de l’inactivation bactérienne par la MCBL

La microscopie confocale à balayage laser est particulièrement utilisée pour visualiser

l’organisation de communautés microbiennes structurées (Bridier et al. 2010; Mai-
Prochnow et al. 2004; Webb et al. 2003; Hope et al. 2002). Plus récemment, elle a été
utilisée pour suivre l’inactivation des microorganismes en temps réel par des agents
antimicrobiens, au sein de structures complexes telles que les biofilms. La perte de
viabilité des bactéries au sein des structures est suivie par corrélation avec la perte de
fluorescence liée à la fuite du marqueur fluorescent hors des cellules dont la membrane
est perméabilisée par les agents antimicrobiens.

L’association de la MCBL et le marquage à la Calcéine-AM a permis de suivre l’évolution

spatio-temporelle de l’action d’antimicrobiens tels que l’éthanol ou le gluconate de
chlorhexidine sur les biofilms. Cette technique associée à l’analyse d’images, a permis

49
de mesurer la pénétration et l’efficacité des antimicrobiens dans le biofilm et de mettre
en évidence la présence potentielle de sous-populations résistantes aux traitements
antimicrobiens (Takenaka et al. 2008).

Figure 10 : Structure et mécanisme d'action de la calcéine-AM.

Davison et al. (2010) a également utilisé la calcéine-AM pour visualiser la perte de
viabilité des bactéries au sein d’un biofilm de Staphylococcus epidermidis dans des
capillaires à flux (technique « Flow cell ») après contact avec quatre antimicrobiens
(l’acide hypochloreux, le glutaraldéhyde, le chlorure d’alkyldiméthylbenzylammonium
et la nisine) (Figure 11) (Davison et al. 2010). D’après les résultats de l’étude, l’acide
hypochloreux a seulement eu une action antimicrobienne localisée à la périphérie des
amas cellulaires du biofilm, y compris à une concentration à 50mg/l et il a été le seul
antimicrobien induisant le détachement du biofilm. Après contact avec le chlorure
d'alkyldiméthyl benzylammonium, la perte de fluorescence a d’abord eu lieu en
périphérie des amas puis le phénomène a migré à l’intérieur des amas. La nisine a
provoqué une perte de fluorescence homogène et rapide. Concernant le
glutaraldéhyde, les auteurs suggèrent que la méthode n'est pas appropriée pour ce
type d’antimicrobien qui n’induit probablement pas la perméabilisation des
membranes cellulaires, et donc la fuite de fluorescence. Cette méthode a permis de
montrer que chaque antimicrobien induit une perte de fluorescence avec des
comportements spatio-temporels distincts.

50
Figure 11 : Observation spatio-temporelle (en min) de la perte de fluorescence verte
de la calcéine-AM par MCBL dans des biofilms de Staphylococcus epidermidis suite à
l’exposition de quatre antimicrobiens. De haut en bas, témoin sans antimicrobien,
biofilms avec 10mg/l d’acide hypochloreux, 50 mg/l d’acide hhypochloreux, 50mg/l de
glutaraldéhyde, 50mg/l de chlorure d’alkyldiméthyl benzylammonium ou 50 mg/l de
nisine. Figure adaptée de l’étude de Davison et al. (2010).

De manière similaire, les dynamiques spatio-temporelles d’action de deux

désinfectants sur des biofilms de Pseudomonas aeruginosa ont été suivies en utilisant
un autre marqueur estérasique de viabilité, le Chemchrome V6. Les auteurs montrent
que les deux agents antimicrobiens ne se comportent pas de façon similaire dans des
biofilms ayant une structure de type « champignon ». En effet, l’acide peracétique y
diffuse plus facilement que le composé d’ammonium quaternaire (Bridier et al. 2011).
La MCBL couplée à l’utilisation du fluorochrome Chemchrome V6 a également été
utilisée pour suivre l’inactivation de biofilms de Salmonella enterica par un hydrolat de
Thymbra capitata, sous-produit de la distillation de l’huile essentielle correspondante.

51
Les auteurs ont montré que cet hydrolat était plus efficace que le chlorure de
benzalkonium sur des biofilms structurés (Karampoula et al. 2016).

3 – Prévision de l’efficacité des systèmes de conservation et des durées de vie

de produits cosmétiques

Les résultats de l’évaluation de la protection antimicrobienne d’une formule

cosmétique par un Challenge-test sont obtenus après environ 1 mois. Ce délai
important est une contrainte pour la formulation et la mise sur le marché de nouveaux
produits cosmétiques. La microbiologie prévisionnelle permet de modéliser l’évolution
de la population microbienne dans un système à partir de données préalablement
acquises. Elle permet de prédire, grâce à des modèles mathématiques, la croissance, la
survie ou l’inactivation des microorganismes en fonction de facteurs
environnementaux tels que la température, le pH ou la concentration en
antimicrobiens. Elle est très utilisée dans l’industrie alimentaire, notamment pour la
détermination de la durée de vie des aliments, pour l’évaluation des systèmes de
conservation ou encore pour l’analyse quantitative des risques (Membré and Lambert
2008; Valdramidis 2016). Cependant, elle n’est pas encore répandue en industrie
cosmétique, qui se base actuellement sur les recommandations de l’ANSM et sur des
études de stabilité et de vieillissement pour estimer la durée d’utilisation des produits.

3.1 – Méthode d’estimation de la durée d’utilisation utilisée dans

l’industrie cosmétique

Les articles 6 et 19 du Règlement cosmétique 1223/2009 stipulent qu’une date limite

d’utilisation doit obligatoirement être inscrite sur tout étiquetage de produit
cosmétique, sauf exceptions dont les unidoses ou les aérosols. De nombreuses
organisations telles que l’ANSM, l'association professionnelle européenne des
industries cosmétiques (Cosmetics Europe), le Comité scientifique pour la sécurité du
consommateur ou encore la Commission Européenne suggèrent des lignes directrices
quant à l’estimation des dates limites d’utilisation des produits cosmétiques. En
revanche, les méthodes de détermination de ces dates ne sont pas encadrées de façon
réglementaire et restent à l’appréciation des industriels.

Dans le cas où la date d’utilisation du produit cosmétique n’excède pas 30 mois, la date
de durabilité minimale (DDM) c’est-à-dire « la date jusqu’à laquelle le produit
cosmétique continue de remplir sa fonction initiale et reste sans danger » doit être
inscrite sur l’emballage. Elle est représentée soit par un symbole de sablier ou par la

52
mention « à utiliser avant fin » suivi de la date en année, en mois et/ou en jours. Aucun
changement de nature physique, chimique et microbiologique ne doit donc avoir lieu
dans la formule depuis sa fabrication jusqu’à la fin de la date limite (Pensé-Lhéritier
and Masson 2016). Cette date est estimée grâce à des études de stabilité (cf Chapitre
I-I-3). Si la date d’utilisation excède 30 mois, le produit est considéré comme stable
jusqu’à son ouverture. Seule une Période Après Ouverture (PAO) est renseignée sur le
produit, correspondant à « la durée pendant laquelle le produit est sûr après son
ouverture et peut être utilisé sans dommage pour le consommateur ». Cette date est
représentée par le symbole d’un pot de crème ouvert, sur lequel est écrit la durée
d'utilisation en mois ou en année. Actuellement, la détermination de la PAO de produits
cosmétiques conservés et utilisés normalement à température ambiante est basée sur
les recommandations de l’ANSM. Elle peut cependant être validée par des tests de
vieillissement accélérés et/ou en conditions réelles (cf Chapitre I-I-3).

Afin de prévoir le risque associé à une formule cosmétique, l’ANSM prend en compte
5 paramètres critiques (ANSM 2007; Pensé-Lhéritier and Masson 2016) :

- Le choix de la formulation : le choix du système conservateur est évalué en fonction

de la sensibilité intrinsèque de la formulation grâce aux résultats des tests d’efficacité
des conservateurs de la formule obtenus à l’issue des challenge-tests.

- Le contact entre le produit et l’environnement extérieur après ouverture : ceux-ci

dépendent directement du type d’emballage choisi.

- La durée prévisible d’utilisation : le volume du pot, la dose et la fréquence d’utilisation

permettent de prévoir la durée prévisible avant que le contenu ne soit terminé.

- La zone d’application : selon la zone d’application, le risque d’une contamination

potentielle du produit est plus ou moins important. Il est par exemple plus élevé si le
produit est destiné à l’application autour des yeux que s’il est appliqué au niveau des
jambes.

- La population ciblée : la sensibilité de la population à laquelle le produit est destiné

est prise en compte. Le risque est par exemple considéré comme plus important dans
le cas de produits à destination de nourrissons.

Ainsi, selon le produit cosmétique, chacun de ces paramètres est associé à une cotation
allant de 1 à 4, 1 étant le niveau de risque le plus faible. Le risque théorique (RT) global

53
du produit correspond à la multiplication de la valeur de cotation de chaque paramètre.
Trois classes de produits en découlent soit :

- Si RT ≥1 à 8 alors la PAO théorique (PAOTh) ≤ 18mois

- Si RT 8 < RT ≤ 48 alors la PAOTh ≤ 6mois

- Si RT > 48 alors la PAOTh ne peut pas être déterminée et la conception du produit

doit être revue.

3.2 – Prévision de l’inactivation de la population microbienne dans le

temps grâce à l’utilisation de modèles primaires

Les modèles primaires d’inactivation permettent de représenter l’évolution du nombre

de microorganismes en fonction du temps lorsqu’ils sont soumis à un traitement à une
intensité létale (température, pH, concentration d’un agent antimicrobien…) dans des
conditions environnementales stables. La représentation la plus courante est la forme
« log-linéaire » qui permet d’exprimer une réduction linéaire logarithmique du nombre
de microorganismes en fonction du temps par la relation suivante :

N (t) = N0 . exp (− k . t)

où N (t) représente le nombre de bactéries survivantes au temps t, N0 la population

bactérienne initiale, k le taux d’inactivation et t le temps de traitement.

Sur une courbe de forme log-linéaire (forme I sur Figure 12) dans une condition
donnée, il est possible de déterminer le temps de réduction décimale D qui correspond
au temps nécessaire pour réduire la population microbienne d’un logarithme décimal.
Cette relation est définie par :
!
'
N (t) = @% .10&" ou log10 (N (t)) = log10 (N0) − (

La valeur du temps de réduction décimale permet de caractériser la sensibilité d’une

souche à un traitement : plus la valeur de D est faible, plus la souche est sensible au
traitement. Les cinétiques d’inactivation peuvent se présenter sous différentes formes
dont les plus couramment retrouvées sont illustrées par Geeraerd et al. (2005) dans la
Figure 12.

54
Figure 12 : Représentation des principales formes de cinétiques d’inactivation
microbienne. A gauche : linéaire (▽, forme I), linéaire avec traîne (×, forme II), en forme
de sigmoïde (□, forme III), linéaire précédée d’un épaulement (◯, forme IV). A droite:
biphasique (▽forme V), concave (×, forme VI), biphasique précédée d’un épaulement
(□, forme VII) et convexe (◯, forme VIII) (Geeraerd et al. 2005).

Les cinétiques d’inactivation peuvent comporter un « épaulement » avant la phase de

déclin et/ou une « traîne » ou « queue » après la phase de déclin. Le phénomène
d’épaulement (forme III, IV et VII sur Figure 12) peut être dû à différentes causes telles
qu’un temps de latence avant le début de la phase de mortalité, une dénaturation
d’amas protecteurs des microorganismes ou une modification du milieu environnant.
Le phénomène de traîne correspondant à une diminution de l’efficacité d’inactivation
sur les temps longs peut être associé à la présence d’une sous-population de
microorganismes résistants ou à une adaptation des microorganismes au stress
appliqué (Naïtali et al. 2017). Il existe plus de nombreux modèles permettant de
modéliser ces différentes formes de cinétique d’inactivation (Naïtali et al. 2017). L’outil
GInaFiT (add-in excel) met à disposition 10 types de modèles d’inactivation primaire
(version 1.6) regroupés en 4 classes. Il y a les modèles log linéaire, log-linéaire avec
épaulement et/ou queue et les modèles biphasiques (forme I, II, V et VII sur Figure 12).
Il y a également les modèles de type Weibull (forme I, VI et VIII sur Figure 12) qui
modulent la forme de la courbe grâce à un paramètre p. Ce modèle est défini par la
relation suivante :
'
Log10 (N (t)) = log10 (N0) – () )$

où D est le temps nécessaire pour réduire d’un facteur de 10 le nombre de

microorganismes. Si la valeur de p est inférieure, égale ou supérieure à 1, la courbe
d’inactivation est respectivement concave, linéaire ou convexe (Mafart et al. 2002).

55
Cependant certains modèles primaires d’inactivation ne sont pas présents dans GInaFiT
dont le modèle IQ appelé « the Intrinsic Quenching model ». Initialement, ce modèle a
été développé pour mettre en évidence le rôle des microorganismes sur l’inhibition de
l’action des désinfectants après un certain temps de contact (Lambert and Johnston
2000). Ce modèle a ensuite été utilisé pour mettre en évidence des phénomènes
d’inhibition par d’autres substances présentes au contact des désinfectants dans
l’environnement d’un modèle étudié (Lambert and Johnston 2001). La relation est
décrite par l’équation suivante :
(1 − * #$.& )
!"#!" (%) = !"#!" (%" ) −
+. -'

où N0 est la population bactérienne initiale, N est la population bactérienne présente

dans l’échantillon prélevé à un temps donné, Dc est le temps de réduction décimale, t
est le temps (min) et Q est le coefficient indicateur du niveau d’inhibition appelé aussi
coefficient de « quenching ».

La sélection du modèle d’inactivation présentant le meilleur ajustement du modèle aux

données expérimentales est généralement effectuée grâce à certaines mesures
statistiques dont :

- La somme résiduelle des erreurs au carré ou Residual Sum of Square errors

(RSS) : est la somme au carré des différences entre le modèle appliqué et les
données expérimentales. Le modèle qui présente le meilleur ajustement aux
données expérimentales est celui qui donne une valeur de RSS la plus petite
(Kamgang et al. 2007).

- Le coefficient de détermination (R2) : il est égal à 1-RSS/SSTO (SSTO étant la

somme au carré des différences entre les valeurs mesurées et la moyenne de
ces valeurs). Le meilleur modèle est celui qui présente une valeur de R2 la plus
proche de 1 (Kamgang et al. 2007).

- Le Critère d'Information Bayésien (CIB) ou Bayesian Information Criterion (BIC) :

est un critère de sélection prenant en compte le nombre de paramètres du
modèle et est égal à :
677
/01 = 2. 34 5 8 + :. 34(2)
2
où p est le nombre de points expérimentaux et k le nombre de paramètres du
modèle. L’utilisation d’un nombre surélevé de paramètres pouvant aboutir à un

56
 ajustement non approprié du modèle, entraine une augmentation de la valeur
de CIB. Donc, plus le CIB est faible plus l’ajustement du modèle est correct.

3.3 – Prévision de l’activité d’un conservateur selon sa concentration

grâce à des modèles secondaires d’inactivation

Les modèles secondaires d’inactivation permettent de représenter les effets des

facteurs environnementaux tels que la concentration d’un agent antimicrobien, le pH
ou la température sur les paramètres des modèles primaires d’inactivation tels que le
temps de réduction décimale. Le modèle de Bigelow (1921) modélise par exemple
l’influence de la température sur le temps de réduction décimale. Plus la température
de traitement est élevée, plus la valeur du temps de réduction décimale est faible. Il est
représenté par l’équation ci-dessous :
(+&+#$% )
log10(D(T)) = log10 (Dref) - -T

où D(T) est le temps de réduction décimale à la température T, Dref est le temps de

réduction décimale à la température de référence Tref et ZT est la variation de
température induisant la variation du temps de réduction décimale D(T) d’un facteur
de 10 (Bigelow 1921).

Des facteurs autres que la température peuvent avoir un impact sur l’inactivation des
microorganismes tels que le pH, l’activité de l’eau, les acides organiques ou l’action de
composés chimiques (Coroller et al. 2015).

Certains modèles secondaires peuvent également intégrer un paramètre de forme,

comme pour le modèle primaire. Ainsi, Mafart et al. (2010) proposent un modèle
combiné prenant en compte la température et le pH, en introduisant un paramètre de
forme du second degré pour le pH :
/
(+&+#$% ) ($.&$.#$% )
log10 (D (T, pH)) = log10 (Dref) – -&
–E -'(
F

où le pHref est le pH de référence du milieu de traitement, zpH est la variation du pH

du milieu de traitement entrainant la variation d’un facteur de 10 du temps de
réduction décimale (D) obtenue à une température de traitement (T) (Naïtali et al. 2017;
Mafart et al. 2010).

57
Dans le cas de la désinfection chimique, un modèle secondaire en représentation log-
log a été décrit pour prévoir l’évolution du temps de réduction décimale en fonction
de la concentration d’antimicrobien (modèle de Chick-Watson). Il s’exprime selon la
relation suivante :
0 1
log100)* = - a . log10 1*
)+ +

où C1 et C2 sont des concentration en agent antimicrobien, Dc1 et Dc2 les temps de

réductions décimales correspondantes et -a est le coefficient directeur de la pente log10
DC = ƒ (log10 C) (Figure 13).

Figure 13 : Représentation du nombre de microorganismes survivants au cours du

temps après la mise en contact de différentes concentrations de biocides (modèle
primaire) (A) et relation en coordonnées logarithmiques, pour une même efficacité
d’inactivation microbienne (ici 1 log10), entre la concentration C et le temps d’action du
biocide, en fonction du coefficient d’efficacité du biocide a (modèle secondaire) (B)
(Naïtali et al. 2017).

IV - Interactions entre les constituants des matrices émulsionnées, les bactéries et les
conservateurs : conséquence sur la conservation des produits.

Au sein des matrices cosmétiques, les bactéries sont au contact des molécules
antimicrobiennes mais aussi d’une multitude d’autres constituants. Ainsi, de
nombreuses interactions positives ou négatives entre eux peuvent exister. Les
connaissances sur les interactions entre les constituants des matrices émulsionnées, les
bactéries et les conservateurs sont encore insuffisantes, pourtant la compréhension de
ces interactions pourrait permettre de i) mieux comprendre et prévenir les mécanismes
d’altération des matrices par les microorganismes, ii) d’optimiser l’action

58
antimicrobienne des conservateurs et améliorer la conservation des produits ou encore
iii) d’optimiser le développement de cosmétiques probiotiques, dans lesquels des
bactéries vivantes sont incorporées afin de palier certains problèmes de santé liés à la
peau, tels que la dermatite atopique (maladie chronique inflammatoire de la peau)
(Tkachenko et al. 2017).

1 – Influence des interactions physico-chimiques entre bactéries et constituants

de matrices émulsionnées sur la répartition des bactéries contaminantes dans
les produits.

Plusieurs études dans des systèmes émulsionnés mettent en évidence certains

paramètres influençant les interactions bactéries/matrices. Les propriétés de surface
des bactéries ont notamment une grande influence sur leur capacité d’interaction avec
leur environnement. La composition et la structure des enveloppes bactériennes sont
complexes et sont soumises à différents types d'interactions physico-chimiques
(Ubbink and Schär-Zammaretti 2007). Celles-ci sont dépendantes de la distance entre
une bactérie et la surface d'interaction. Elles sont de deux types : les interactions de
longue distance, van der Waals et électrostatiques, et les interactions de courtes
distance, de type acide/base de Lewis et d'hydrophobicité (Oss 2003).

Les interactions de van der Waals sont de faible intensité. Elles interviennent à partir
d'une distance de 50 nm entre une bactérie et une surface et diminuent avec
l’augmentation de la distance. Elles sont dues à la fluctuation des nuages électroniques
qui gravitent autour du noyau d’un atome, le rendant momentanément dipolaire.

Les interactions de nature électrostatique interviennent à partir de 20 nm de distance

entre une bactérie et une surface (Neu 1996). Ces forces électrostatiques sont décrites
par la loi de Coulomb de 1785 : deux objets A et B avec des charges électrique de signe
contraire s’attirent et deux objets A et B de même charge se repoussent. Une des
techniques pour mesurer la charge électrique présente à la surface d'une bactérie est
la mesure de la mobilité électrophorétique. Sous l’action d’un champ électrique, les
microorganismes placés dans une chambre de mesure migrent vers la charge opposée
à une vitesse qui dépend de leur charge de surface. La vitesse de déplacement est
mesurée à différents pH, à l’aide d’une caméra reliée à un microscope (Figure 14).

59
La mobilité électrophorétique est définie par la relation suivante :
!
ME = "

où ME est la mobilité électrophorétique, V, la vitesse de déplacement des

microorganismes (m/s) et E, le champ électrique (V/m). Plus les bactéries seront
chargées, plus elles se déplaceront rapidement vers l'électrode et plus leur mobilité
électrophorétique sera élevée (Burgain et al. 2014).

La charge électrique à la surface bactérienne est directement liée à la composition de

la structure membranaire des bactéries. Les charges négatives sont portées par les
groupements phosphates des phospholipides et les charges positives par les
groupements amines du peptidoglycane (Boonaert and Rouxhet 2000). La charge à la
surface des bactéries dépend donc de la valeur de pH du milieu (Burgain et al. 2014).

Figure 14 : Dispositif pour mesurer la mobilité électrophorétique ou le potentiel zêta

(Guillaume 2010).
Dans des matrices émulsionnées, la charge de surface des bactéries peut porter atteinte
à la stabilité des émulsions, notamment en provoquant la coalescence et la floculation
des gouttelettes lipidiques. Une étude de Li et al. (2001) met en évidence les
interactions existantes entre E. coli et les gouttelettes d’une émulsion
(hexadécane/eau). Ces auteurs montrent que lorsque les bactéries et les gouttelettes
ont des charges de surface de signe opposé, les bactéries sont attirées à la surface des
gouttelettes et déstabilisent l’émulsion, notamment par la formation de « ponts »
(Figure 15) (Li et al. 2001).

60
Figure 15 : Interaction entre E. coli JM109 chargé négativement et les gouttelettes
d'une émulsion hexadécane/eau stabilisée avec un émulsionnant chargé positivement.
Observation de l’émulsion sans bactérie (à gauche, x400), avec bactéries observées au
x400 (au centre) et avec bactéries observées au x 1000 (à droite) au microscope optique
(Li et al. 2001).

Ly et al. (2006) confirment ces observations, en étudiant par microscopie de

fluorescence, l’impact de la charge de surface de différentes souches de Lactococcus
lactis subsp. lactis biov. diacetylactis (LLD) sur la stabilité d’émulsions formulées avec
un émulsionnant de nature ionique variable (Ly, Naitali-Bouchez, et al. 2006). Celui-ci
est soit chargé positivement (Bromure d'hexadécyl triméthyl ammonium ou CTAB) soit
chargé négativement (Tween 20). Plus la différence de charge entre les bactéries et les
gouttelettes est importante, plus l’interaction est forte et plus cela conduit à la
formation d’amas de bactéries autour des gouttelettes (Figure 16).

Figure 16 : Observation microscopique d’émulsions (marquées au rouge de Nil, en

rouge) contenant du CTAB ou du Tween 20 mis au contact de bactéries LLD18 (charge
à -18 mV, au centre) ou LLD16 (charge à -43mV, à droite) toutes les deux marquées au
Dapi (en vert). Émulsion sans bactérie à gauche (Ly, Naitali-Bouchez, et al. 2006).

Ly, Aguedo et al. (2008) observent les mêmes résultats dans des émulsions alimentaires
stabilisées avec des protéines de lactosérum (Ly et al. 2008).

61
Les interactions dites de courtes distances se mettent en place à partir d'une certaine
proximité entre une bactérie et une surface (inférieure à 3 nm) et sont irréversibles. A
ce niveau, il existe des interactions acide/base de Lewis et des interactions
hydrophobes. Les interactions acide/base de Lewis sont de forte intensité et mettent
en jeu un couple accepteur/donneur d'électrons permettant la formation de liaisons
hydrogène. On parle d’interactions hydrophobes pour certaines molécules ou
groupements non polaires ayant très peu d’affinité pour un solvant hydrophile.
Incapables de réaliser des liaisons avec l’eau, les groupements se positionnent alors de
façon à présenter la plus faible surface de contact avec l'eau (Neu 1996). Il est possible
de mesurer le niveau d’hydrophobicité de la surface bactérienne par la méthode de
BATH ou Bacterial Adherence To Hydrocarbons (Rosenberg et al. 1980; Rosenberg
1984). Cette méthode consiste à mettre les bactéries en contact avec des
hydrocarbures (hexadécane, octane et xylène), et à comparer la mesure de l’absorbance
dans la phase aqueuse avant et après mélange. Selon l’hydrophobicité des bactéries,
elles vont alors soit migrer dans la phase hydrophobe contenant les hydrocarbures soit
rester dans la phase aqueuse hydrophile. Une autre méthode appelée MATS ou
Microbial Adhesion To Solvents basée sur un principe similaire (Bellon-Fontaine et al.
1996) permet non seulement de mesurer la surface d’hydrophobicité mais aussi le
caractère acide/base de la surface bactérienne en mettant en contact les bactéries avec
deux couples de solvants comprenant chacun un solvant apolaire (hydrophobe) et un
solvant monopolaire (hydrophile, acide ou basique) ayant des propriétés van der Waals
similaires (Figure 17). Ces couples de solvants sont i) le chloroforme, solvant accepteur
d'électron au sens de Lewis (acide) et l'hexadécane, solvant apolaire et ii) l'acétate
d'éthyle, solvant donneur d'électrons au sens de Lewis (basique) et le décane, solvant
apolaire. Le pourcentage d'affinité des bactéries pour chaque solvant est donné par la
relation suivante :
2
Affinité (%) = G1 − 2*I × 100
,

où A0 est la densité optique témoin avant mélange avec le solvant et A1 est la densité
optique après mélange avec le solvant. Un pourcentage d’affinité à l’hexadécane et au
décane élevé met en évidence un niveau d’hydrophobicité élevé à la surface des
bactéries et inversement. De plus, si après la soustraction de la valeur de l’affinité des
bactéries pour l’acétate d’éthyle à celle du décane, la valeur est élevée alors la surface
des bactéries présente un caractère acide. De la même façon, si après la soustraction

62
de la valeur de l’affinité des bactéries pour le chloroforme à celle de l’hexadécane, la
valeur est élevée alors la surface bactérienne présente un caractère basique.

Figure 17 : Principe de la méthode de MATS en prenant l’exemple de la mise en contact

de l’hexadecane avec des bactéries hydrophiles et hydrophobes (Burgain et al. 2014).

Dès 1924, des chercheurs s’intéressent aux interactions hydrophobes et à la répartition

des bactéries aux interfaces huile-eau (Mudd and Mudd 1924). Dans les années 2000,
plusieurs études montrent que certaines bactéries peuvent interagir avec les globules
gras des matrices laitières, notamment en se positionnant préférentiellement autour
de ces globules et en s’y développant (Lopez et al. 2006; Li et al. 2001; Brisson et al.
2010). Ly et al. (2006) mettent plus spécifiquement en évidence l’implication des
propriétés d’hydrophobicité de surface des bactéries lactiques dans leurs interactions
physicochimiques avec les constituants des matrices alimentaires. Ils montrent
notamment qu'une souche ayant une plus grande hydrophobicité de surface (LLD18)
s'adsorbe davantage sur les lipides et les composés hydrophobes qu'une souche
hydrophile (LLD16) (Ly, Vo, et al. 2006) (Figure 18).

63
Figure 18 : Observation microscopique de l'adhésion de deux bactéries lactiques ayant
des propriétés d'hydrophobicité différentes sur une gouttelette. A gauche, LLD18 avec
30% d’affinité à l’hexadécane et à droite, LLD16 avec 3% d'adhésion à l'hexadécane (Ly,
Vo, et al. 2006).

2 – Influence de la composition et de la structure de matrices émulsionnées sur

l’efficacité antimicrobienne des conservateurs.

Les matrices cosmétiques émulsionnées sont souvent composées d’une multitude

d’ingrédients pouvant interagir avec les agents antimicrobiens. La polarité, la charge
de l’antimicrobien et les conditions environnementales, telles que la température, la
force ionique et le pH, peuvent jouer un rôle majeur sur l’efficacité d’un antimicrobien
(Weiss et al. 2015). En effet, le pH de la phase aqueuse de l’émulsion dépend du
mélange des différents constituants de la matrice et le milieu est généralement
tamponné. Les acides organiques sont majoritairement actifs sous leur forme non
dissociée à des pH inférieurs à leur pKa, la plupart du temps à un pH < 5 (Lambert and
Stratford 1999; Weiss et al. 2015; Scholtyssek 2005). Dans une matrice complexe telle
qu’une matrice alimentaire, il existe également des interactions électrostatiques et
hydrophobes entre les antimicrobiens, et les constituants tels que des lipides, protéines
et polysaccharides chargés (Weiss et al. 2015). Une étude montre par exemple que
l’addition de protéines (Albumine de Sérum Bovin) dans un milieu de culture gélosé
inhibe l’action antimicrobienne du thymol contre Salmonella Typhimurium (Juven et al.
1994). Certains agents gélifiants tel que l’hydroxypropyl méthylcellulose, peuvent être
associés à la perte d’efficacité de certains conservateurs (Scholtyssek 2005). En effet,
les agents antimicrobiens vont se placer préférentiellement à certains endroits dans
une émulsion h/e en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. Selon leur niveau
d’hydrophobicité, ils se placent à l’interface des gouttelettes lipidiques, dans la phase
aqueuse ou dans la phase lipidique. Les microorganismes se développant
essentiellement dans la phase aqueuse, la localisation des conservateurs joue un rôle

64
déterminant dans l'activité antimicrobienne des émulsions (Terjung et al. 2012). Pernin
et al. (2019) ont étudié l’activité antimicrobienne de deux composés phénoliques
naturels, l'acide férulique et l'eugénol, vis-à-vis de Listeria monocytogenes dans une
émulsion modèle alimentaire h/e. Ces auteurs ont montré que l’eugénol, ayant un logP
élevé perd son efficacité antibactérienne dans les systèmes émulsionnés alors qu’il est
efficace dans la phase aqueuse seule. Ils suggèrent alors que l’agent antimicrobien,
pourtant introduit dans la phase aqueuse, se répartirait préférentiellement dans les
gouttelettes lipidiques quand l’émulsion est constituée et qu’il ne serait alors plus
présent en concentration suffisante dans la phase aqueuse pour inhiber la bactérie
(Pernin, Bosc, et al. 2019). Les émulsifiants peuvent aussi participer à la diminution de
l’activité antimicrobienne en séquestrant par exemple les molécules antimicrobiennes
dans des micelles (Shimamoto and Mima 1979; Pernin, Bosc, et al. 2019; Kirk–Othmer
2013).

Au contraire, dans d’autres cas, les émulsifiants peuvent augmenter l’efficacité

antimicrobienne des conservateurs en perturbant les membranes bactériennes, et
facilitant ainsi la pénétration des conservateurs à l’intérieur des bactéries (Halla et al.
2018). Les agents chélateurs, tels que l’EDTA (acide éthylène diamine tétra acétique)
ou le GLDA (diacétate de glutamate de tétrasodium) ont la capacité d’augmenter la
perméabilité membranaire des bactéries, les rendant plus sensibles aux agents
antimicrobiens (Siegert 2014). L'éthylhexylglycérine, généralement utilisé pour ses
propriétés tensioactives, émollientes, humectantes et solubilisantes, peut également, à
une certaine concentration, favoriser l'activité antimicrobienne de conservateurs tels
que le caprylyl glycol, le phénoxyéthanol et le 1,2-pentanediol (Langsrud et al. 2016;
Herman 2019). En effet, en raison de sa structure semblable aux tensio-actifs,
l’éthylhexylglycérine est capable de déstabiliser la membrane des microorganismes,
permettant ainsi au conservateur de pénétrer plus efficacement (Herman 2019).

L’efficacité des agents antimicrobiens dans une matrice émulsionnée peut également
dépendre de la structure même de l’émulsion. Des études mettent en évidence
l’importance de la taille des gouttelettes de l’émulsion sur l’efficacité des
antimicrobiens. Fang et al. (2016) ont testé l’efficacité de plusieurs conservateurs
utilisés en cosmétique dans des matrices émulsionnées composées de gouttelettes de
différentes tailles allant de 100 à 900 nm (Fang et al. 2016). Il apparait que plus la taille
des gouttelettes est grande, plus l’activité antimicrobienne est forte (Terjung et al.
2012; Fang et al. 2016).

65
 CHAPITRE II :

Étude de la distribution spatiale des bactéries

dans les formules cosmétiques

66
I - Introduction

La plupart des produits cosmétiques sont sensibles à la contamination microbienne. Le

challenge-test est un test référencé dans la norme NF EN ISO11930, permettant
d’évaluer l’efficacité de conservation des formules cosmétiques. Il consiste à inoculer
artificiellement des microorganismes dans les formules cosmétiques et à suivre
l’évolution de la population microbienne à des intervalles de temps donnés.
L’évaluation de la conservation de ces produits peut s’avérer difficile lorsque la
composition et la structure des formules cosmétiques sont complexes. Dans cette
première partie de thèse, nous nous interrogeons sur la fiabilité de la méthode de
challenge-test dans le cas où les bactéries inoculées ne se répartiraient pas de façon
homogène dans le produit cosmétique. En effet, si la distribution des bactéries est
hétérogène, selon l’endroit du prélèvement on risque soit de ne pas détecter un
pathogène soit de devoir augmenter inutilement la concentration des conservateurs
dans le produit fini. Jongenburger, Reij, et al. (2012) ont par exemple montré que
différents paramètres tels que la concentration de l’inoculum et la distribution des
bactéries peuvent affecter la quantification des micro-organismes.

Différentes interactions entre les bactéries inoculées et la formule peuvent exister dont
certaines sont décrites dans la littérature. Elles peuvent être de type van der Waals,
électrostatiques, de type acide/base de Lewis ou d'hydrophobicité. Elles mettent en jeu
à la fois les propriétés de surface des bactéries, qui sont directement liées à la
composition et la structure des enveloppes bactériennes, mais aussi celles des
composantes de la formule telles que les gouttelettes lipidiques dans une émulsion
(Ubbink and Schär-Zammaretti 2007; Boonaert and Rouxhet 2000). En effet, selon la
composition et les paramètres physicochimiques de l’émulsion (choix du tensio-actif,
présence de cations, pH), les bactéries pourront se placer préférentiellement à certains
endroits dans l’émulsion. Par exemple, certaines bactéries ayant une surface très
hydrophobe vont se regrouper à l’interface des gouttelettes lipidiques (Brisson et al.
2010; Lopez et al. 2006; Ly, Vo, et al. 2006). Ainsi de nombreux paramètres liés à la
formule ou aux bactéries pourraient avoir un impact sur la distribution spatiale des
bactéries dans les formules cosmétiques.

Au cours de ce chapitre, nous avons cherché à identifier puis à caractériser les

déterminants de la distribution spatiale des bactéries dans les matrices cosmétiques
grâce à la mise en place d’une méthodologie rapide.

67
II - Identification des facteurs limitant la répartition homogène des bactéries dans les
matrices cosmétiques

1 - Introduction

Afin d’identifier les déterminants d’une mauvaise répartition spatiale des bactéries dans
les matrices cosmétiques, nous avons tout d’abord analysé les formules commerciales
des laboratoires CLARINS pour les classer en fonction du niveau de distribution spatiale
de S. aureus. Quinze formules cosmétiques représentatives des principales formes
galéniques ont été sélectionnées. Grâce à l’analyse de la composition de la formule
induisant une mauvaise répartition bactérienne, nous avons pu faire des hypothèses
sur la ou les matières premières pouvant être impliquées dans ce phénomène. Nous
avons alors formulé des matrices cosmétiques modèles avec plusieurs concentrations
de différentes matières premières pouvant être à l’origine de la distribution hétérogène
des bactéries et analysé la qualité de la distribution spatiale en fonction de leur
composition.

2 - Matériels et méthodes

2.1 - Souche bactérienne et méthode de culture

La souche bactérienne utilisée est Staphylococcus aureus CIP 4.83 (lot 17310). Cette
bactérie à coloration de Gram positive est cultivée en milieu TSA ou TSB (Tryptone Soja
Agar/Bouillon) à 30°C. Les souches sont conservées à -80°C dans du TSB contenant du
glycérol à 20 %.

2.1.1 Obtention de précultures en milieux gélosés ou liquides

Les précultures ont été effectuées soit sur milieux gélosés soit en milieux liquides. Pour
les cultures en milieux gélosés, les bactéries sont ensemencées une première fois en
stries sur une boite de TSA à partir d’un cryotube stocké à -80°C (R1). Après incubation
à 30°C pendant 24h, un deuxième repiquage est ensuite effectué sur une boite TSA
puis incubé 24h à 30°C (R2). La boite R1 peut être réutilisée et conservée 7 jours à 4°C.
La préparation de la suspension de travail consiste à transférer à l’aide d’un écouvillon,
quelques colonies bactériennes issues de la boite R2, dans 1 ml d'eau physiologique.
La suspension est homogénéisée à l’aide d’un vortex. Ce protocole a été utilisé dans le
cadre de l’étude de la distribution spatiale des bactéries dans les produits cosmétiques
commercialisés car il correspond aux habitudes de repiquage des Laboratoires Clarins.

68
Pour toutes les autres expérimentations, les cultures ont été faites à partir de milieux
liquides afin d’obtenir des cultures plus homogènes d’un point de vue physiologique.
Le premier repiquage (R1) a alors consisté à transférer 1 ml d'un cryotube de stockage
à -80°C dans 10 ml de TSB puis à incuber la culture à 30°C. Après 7h de croissance
100µl du R1 ont été ajoutés à 100 ml de TSB et incubés une nuit à 30°C (R2).

2.1.2 - Préparation des suspensions de travail

La concentration de la suspension est estimée par turbidimétrie, en mesurant la

transmittance (T) à 620 nm par spectrophotométrie. Elle est mesurée en pourcentage
et est liée à l’absorbance (A) : A = - log (T). Dans le cas d'une culture sur boite, la
concentration bactérienne peut être ajustée par ajout d'eau physiologique ou de
colonies bactériennes. Dans le cas d'une culture liquide, elle est ajustée en ajoutant de
l’eau physiologique au culot bactérien obtenu après une centrifugation à 1575 x g de
10 min à 20°C puis de deux lavages successifs par centrifugation dans les mêmes
conditions. La suspension bactérienne est ajustée à 1 x 1010 - 1 x 1011 UFC/ml dans de
l’eau physiologique afin de pouvoir observer 10 à 100 bactéries par champ (290.62 x
290.62 x 1.6 µm3) au MCBL. Pour obtenir cette concentration cible, la transmittance
doit être comprise entre 84 et 86,5% après dilution de la suspension bactérienne au
millième.

2.2 - Matrices cosmétiques

2.2.1 - Produits commerciaux testés

Quinze formules cosmétiques commerciales de différentes compositions et structures,

ont été sélectionnées de façon à ce qu’elles soient représentatives des principales
formes galéniques, soit 8 crèmes, 3 gels, 2 laits et 2 lotions. Une base de données a été
créée répertoriant les principales informations concernant la composition de chaque
matrice testée (Tableau 6). Pour chaque produit cosmétique, les essais ont été répétés
sur deux lots de fabrication différents.

69
 Tableau 6: Principales caractéristiques des produits cosmétiques commerciaux testés.
Viscosité (cP) ou
% Phase % Phase pH
Numéros Gélifiants et/ou épaississants Emulsionnants Pénétrométrie (mm)
aqueuse grasse (à 20°C)
(à 20°C)
3% glyceryl acrylate/acrylic acid 3% cetearyl glucoside et cetearyl
copolymer alcohol
1 79.54 17.46 4.6-5.6 28-36 mm
1% polyacrylamide 2% monostearate de glycerol
0.2%alcool stearylique 0.2% alcool stearylique
4.5%cetearyl glucoside et cetearyl
alcohol
2 78.98 20.82 0.3% carbomer 5-5.6 33-39 mm
2% monostearate de glycerol
0.5% steareth-21
0.5% polyacrylamide aqua c13-14
isoparaffin laureth-7
3 91.58 8.42 0.8% ammonium Non 5.4-6.3 20 000 - 30 000 cP
acryloyldimethyltaurate/vp copolymer
2.5% oryza sativa starch
0.7% lithium magnesium sodium
4 65.56 33.74 silicate 4% stearic acid 6.8-7.4 26-35 mm
CREMES

0.1% carbomer
3% lubrajel msfree-hydrojel
4% stearic acid
5 83.2 15.5 1 %sepigel 305 5-6 32-38 mm
1% ceteareth-12
0.25 %carbomer
3% monomyristate de glycerol
1.5% alcool stearylique
6 77.85 22.05 1.5 % alcool stearylique 2.25% potassium cetyl phosphate 4.7-5.7 33-39 mm
2% cetearyl glucoside et cetearyl
alcohol
0.35% acrylates/c10-30 alkyl acrylate 2.5% cetearyl glucoside et cetearyl
7 68.74 30.26 crosspolymer alcohol 4.9-5.9 34-40 mm
0.2% gomme xanthane 1% potassium cetyl phosphate
3.5%cetearyl glucoside et cetearyl
1.6% hydroxyethyl acrylate/sodium
8 62.90 37.1 alcohol 5.8-6.3 20-25 mm
acryloyldimethyl taurate copolymer
2.5%monostearate de glycerol ae
1% carbomer 2% monostearate de glycerol
1 76.8 22.2 6.0-7.0 12 000-19 000 cP
1.5% silicone dc rm 2051 2%montanov l
1.5%polysorbate 60
LAITS

0.5% cetearyl glucoside et cetearyl

2 73.45 26.55 Non alcohol 5-6 5 300-7 000 cP
0.4% acrylates/c10-30 alkyl acrylate
crosspolymer
LOTIONS

1 100 0 0.5% sodium chloride 2.5% polysorbate 20 5-6 /

2 100 0 0.75%sodium chloride Non 5.5-6.2 /

1 100 0 0.55%carbomer Non 5.5-6.5 14 000-16 000 cP

0.55%carbomer
2 100 0 3% aqua PEG-8 butylene glycol PEG-32 Non 5.5-6.5 14 000 - 16 000
phenoxyethanol carbomer
GELS

1%sodium polyacrylate starch

0.5% ammonium
0.5% ammonium
3 100 0 acryloyldimethyltaurate/ 6-6.2 30 000-38 000 cP
acryloyldimethyltaurate/
vp copolymer
vp copolymer

70
 2.2.2 Matrice modèle

2.2.2.1 - Composition

Une base modèle 35/65 h/e % composée du minimum de matières premières

essentielles à la fabrication d’une crème cosmétique a été formulée. Cette matrice est
essentiellement composée d’une phase aqueuse, d’une phase lipidique, et
d’émulsionnants pour former l’émulsion huile dans eau (h/e) mais aussi d’un gélifiant
et de glycérine pour mimer la texture d’une crème. Sa composition ainsi que les
propriétés de chaque ingrédient sont détaillées dans le Tableau 7. Au cours des
expériences, deux matières premières présentes dans la crème commerciale 8 et
susceptibles d'être liées au problème de distribution des bactéries ont été ajoutés dans
la base modèle. Ce sont le monostéarate de glycérol et l’hydroxyéthylacrylate/sodium
acryldiméthyltaurate copolymer, appelé copolymère polyacrylate par la suite. Le
monostéarate de glycérol est un co-émulsionnant aidant à la stabilisation de l’émulsion
et a été ajouté dans la base modèle à 2,5%. Le copolymère polyacrylate est pré-
neutralisé et d'origine synthétique. Il possède de nombreuses fonctions, dont celles
d'épaississant, de stabilisant, de texturant et d'émulsionnant. Il a été ajouté dans la base
modèle à des concentrations variables 0,1 - 0,5 - 1,6%.

Tableau 7 : Composition de la matrice modèle 35/65 h/e%.

INCI (International
Noms matières % Matières
Nomenclature of Fournisseurs Propriétés
premières premières
Cosmetic Ingredients)
Eau Laboratoire en
Aqua Ajustée Diluant / hydratation
déminéralisée interne
Carbopol ultrez Gattefossé
Carbomer 0.25 Gélifiant
10 (Lyon, France)
Sepinov EMT 10 Hydroxyethyl
SEPPIC 0 - 0.5 - 0.1
= copolymère acrylate/sodium Épaississant
(Puteaux, France) - 1.6
polyacrylate acryloyldimethyl taurate
Oleon Émollient/humectant/
Glycérine Glycerin 9
(Ertvelde, Belgium) filmogène/hydratant
Cétéaryle BASF France
Cetearyl isononanoate 28.8 - 31,3 Émollient/ filmogène
isononanoate (Lyon, France)
Cétéaryl SEPPIC Émulsionnant et
Cetearyl glucoside 3.5
glucoside Puteaux, France) épaississant
DSM
Acétate de
Tocopheryl acetate (Heerlen, the 0.2 Anti-oxydant
tocophérol
Netherlands)
Monostéarate de SEPPIC
Glyceryl stearate 0 - 2.5 Co-émulsionnant
glycérol (Puteaux, France)
Eau Laboratoire en
Aqua 2 Diluant / hydratation
déminéralisée interne
Azelis
Trométhamine Tromethamine 0.15 Base
(Heusden, Belgium)

71
 2.2.2.2 - Formulation

La phase aqueuse de l’émulsion est d’abord préparée en saupoudrant le carbomer à la

surface de l’eau déminéralisée. Après sédimentation du carbomer, le tout est agité 10
min à 200 tr/min à l’aide d’un homogénéisateur rotatif à pales (Rayneri 33/300P, Group
VMI). Le copolymère polyacrylate est ensuite ajouté et homogénéisé à 700 tr/min
pendant 10 min. Le mélange est ensuite chauffé à 75°C puis la glycérine est ajoutée et
mélangée pendant 5 min. La phase grasse composée de ceteraryl isononanoate, de
cetearyl glucoside, d’acétate de tocopheryl et/ou de monostéarate de glycerol est
chauffée entre 75 et 80°C puis incorporée à la phase aqueuse. Le mélange est ensuite
agité 20 min à 1800 tr/min, permettant ainsi la formation de l’émulsion. Le chauffage
est ensuite arrêté et la trométhamine pré-mélangée à de l’eau déminéralisée est
ajoutée et mélangée 15 min à 1900 tr/min. Enfin, un volume d’eau déminéralisée est
ajouté à 45°C en quantité nécessaire pour remplacer l’eau évaporée lors des étapes de
chauffage pendant la formulation. La formule est ensuite stockée à 20°C pour être
utilisée le jour suivant.

2.2.3 - Caractérisation physico-chimique des matrices cosmétiques

Un test de stabilité est systématiquement réalisé sur les matrices modèles formulées
après un et quatre jours à température ambiante, par la mesure de viscosité, du pH et
une observation de l’aspect micro- et macroscopique des matrices. Le pH des crèmes
commerciales et des matrices modèles a été mesuré à l’aide d’un pH-mètre SI Analytics
(Lab 870). La viscosité est mesurée par pénétromètrie (pénétromètre PNR10,
PetroMesures) : un cône est lâché d’une hauteur fixe dans 300g de matrice et la
profondeur de pénétration du cône (en mm ± 0,1 mm) est mesurée après 5 secondes.
Plus le cône s’enfonce profondément, plus la matrice est fluide et inversement. Chaque
mesure a été réalisée trois fois.

2.3 – Observation de la répartition bactérienne par microscopie confocale

à balayage laser (MCBL)

2.3.1 - Marquages des bactéries

Plusieurs fluorochromes ont été utilisés pour marquer les bactéries. Le SYTO9 (life
technologies) est un fluorochrome traversant passivement la membrane bactérienne
et s’intercalant entre les bases de l’ADN. C’est un marqueur total c’est-à-dire qu’il a la
capacité de marquer toutes les bactéries, vivantes ou mortes. Il est préparé à une

72
concentration de 3,34 mM dans du diméthyle sulfoxide (DMSO). Le DMSO est un
solvant soluble dans l’eau et favorise la pénétration des marqueurs fluorescents à
travers les membranes bactériennes (Brayton 1986). Les longueurs d’onde d’absorption
et d’émission du SYTO9 sont respectivement de 485 et 498 nm. Le marquage des
bactéries se fait en ajoutant 3 µl de SYTO9 dans 100 µl d’une suspension bactérienne
à 1 x 1010 – 1 x 1011 UFC/ml. Le mélange est homogénéisé 30 secondes au vortex puis
incubé 30 à 60 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Les bactéries
apparaissent en vert après excitation du fluorochrome.
Le SYBR green (Invitrogen SYBR green I nucleic acid gel stain, life technologies, 10 000
x concentré) est lui aussi un marqueur total, capable de pénétrer passivement dans les
bactéries et de marquer l’ADN. Ses longueurs d’onde d’absorption et d’émission sont
respectivement de 497 et 520 nm. Le marquage des bactéries se fait en ajoutant 3 µl
de SYBR green dans 100 µl d’une suspension bactérienne à 1 x 1010 – 1 x 1011 UFC/ml.
Le mélange est homogénéisé 10 secondes au vortex et incubé 30 minutes à
température ambiante à l’abri de la lumière.

Le SYTOX green (life technologies, 5 mM dans DMSO) est un marqueur fluorescent vert
ayant la capacité de passer uniquement au travers des membranes bactériennes
perméabilisées puis de se fixer sur les acides nucléiques. C’est donc un indicateur de
cellules mortes. Ses longueurs d’onde d’absorption et d’émission sont respectivement
de 504 et 523 nm. Dans les expériences présentées ci-après, 100 µl d’une suspension
bactérienne à 1 x 108 – 1 x 109 UFC/ml sont déposés dans un puits d’une plaque 96
puits, auxquels sont ajoutés 25 µl de SYTOX green 20 µM avant observation par MCBL.

2.3.2 - Marquage et inoculation de la formule cosmétique

Le Rouge de Nil ou Nile Red (lot BCBH3600V, Sigma, 1M dans DMSO) est un
fluorochrome hydrophobe ayant une faible solubilité dans l’eau. Il est très utilisé pour
localiser et quantifier les lipides surtout les lipides neutres. Les gouttelettes lipidiques
apparaissent en rouge dans les formules émulsionnées après excitation par un laser.
Ses longueurs d’onde d’absorption et d’émission sont respectivement de 552 et 636
nm. 3 µl de Nile Red (concentration à 5 mM) sont ajoutés dans 1 g ± 0,05g de matrice.
Le mélange est homogénéisé au vortex 1 min, puis incubé 10 min à température
ambiante à l’abri de la lumière.

73
Dix microlitres de suspension bactérienne de S. aureus à 1 x 1010 – 1 x 1011 UFC/ml
marquée sont ajoutés dans 1g de matrice préalablement marquée au Nile Red dans un
tube conique de 50 ml. Le mélange est ensuite homogénéisé au vortex 1 minute.

2.3.3 – Acquisition par MCBL et analyse d’images

La formule inoculée est déposée au fond d’un puits d’une microplaque de 96 puits
(Greiner Bio-one, France) à l’aide d’une seringue. L’échantillon est observé au
Microscope Confocal à Balayage Laser Leica SP8 AOBS (Leica® Microsystems, France),
par le biais d’un objectif à air 40x ayant une ouverture numérique de 0.85. Les images
ont une taille de 290,62 µm x 290,62 µm (512 x 512 pixels) x 1,6 µm. Trente images par
essai sont acquises, à raison de dix images dans 3 puits différents. Chaque image
correspond à un volume observé de 1.2 105 µm3. A ce stade de l’étude, l’analyse de la
distribution spatiale des bactéries s’est faite visuellement en comparant les différentes
images obtenues par MCBL dans les différentes formules.

3 - Résultats et discussion

3.1 - Analyse de la distribution bactérienne dans les produits cosmétiques

commercialisés

Dans les lotions et les gels, le marquage au Nile red ne révèle pas de phase lipidique
(aucune structure rouge), ce qui est cohérent puisque ces formules sont composées
uniquement d’une phase aqueuse (Figure 19). Dans les crèmes et les laits testés, les
gouttelettes lipidiques formant la phase grasse de l’émulsion apparaissent en rouge
après marquage au Nile red. Dans certaines formules, les gouttelettes lipidiques sont
bien définies (crèmes 1, 3, 5 et laits) alors que pour d’autres systèmes, on peut observer
un tapis lipidique rouge assez diffus en arrière-plan des quelques gouttelettes (crèmes
2,6-8). On peut noter également que la taille des gouttelettes n’est pas la même dans
toutes les formules. Dans les crèmes 6 et 7, on peut observer une émulsion fine avec
une taille homogène des gouttelettes alors que pour la crème 1, les gouttelettes ont
des tailles hétérogènes.

Dans les lotions, gels et laits testés, les bactéries marquées au SYTO9 en vert semblent
réparties de façon homogène. A ce stade de l’étude, la qualification de l’homogénéité
de la distribution spatiale des bactéries dans les formules a été faite visuellement
d’après les images acquises par MCBL.

74
Figure 19 : Images de microscopie représentant la distribution spatiale des bactéries
(en vert) dans les produits cosmétiques commercialisées (phase lipidique en rouge)
obtenues par MCBL à l'objectif 40x sec. Observation au 40x par MCBL d’une solution
de fluorphlogopite synthétique non marquée (A) et marquée au SYTO9 (B). Particules
présentes dans le gel 3 observée au 40x avec un zoom 1.5 par MCBL (C) et au
microscope optique x 40 (D). Observation au 40x par MCBL d’une solution de
polymethacrylate non marquée (E) et marquée au SYTO9 (F).

75
La distribution spatiale des bactéries marquées au SYTO9 dans les crèmes 1, 2 et 3 est
homogène. La répartition des bactéries dans les crèmes 4 et 5 est homogène mais
d'importants bruits de fond de couleur verte perturbent l'observation de la
fluorescence des bactéries. Après marquage au SYTO9 de certains des composés
constituant la crème 5, il a été possible d’identifier la matière première à l’origine de
ces structures vertes en arrière-plan : il s’agit de fluorphlogopite synthétique plus
communément appelée mica synthétique (Figure 19B). Cette matière première
minérale est composée de silicate de magnésium, d’aluminium et de potassium. Elle
est utilisée dans de nombreux produits cosmétiques pigmentés plus particulièrement
dans les poudres de maquillage pour son effet recouvrant, brillant et nacré (Ohta 2006).
Sans apport de fluorochromes, la matière première reste visible par MCBL, il semblerait
alors qu’elle soit naturellement autofluorescente (Figure 19A).

Dans le gel 3, des formes globulaires fluorescent également de façon intense (Figure
19C). Ces formes sont également observables au microscope optique (Figure 19D). La
matière première à l’origine de ces structures a pu être identifiée après marquage au
SYTO9 (Figure 19F), il s’agit de polymethylmethacrylate utilisé comme adoucissant
cutané et lubrifiant. Le composé n’étant visible par MCBL qu’après ajout de
fluorochrome (Figure 19E), il n’est pas autofluorescent. Il semblerait alors que cette
matière première soit marquée de façon non spécifique par le SYTO9. Des études
mettent en évidence que le SYTO9 a l’inconvénient d’induire du bruit de fond (Feng et
al. 2014; Stiefel et al. 2015). Le SYTO9 pourrait se fixer de manière non spécifique sur
des composés présents dans le milieu environnant tels que de l'ADN issu des extraits
végétaux utilisés comme principes actifs dans certaines formules ou d’autres
substances ayant des affinités avec le SYTO9, ce qui pourrait expliquer les résultats de
cette étude pour la crème 4 et le gel 3.

Dans les crèmes 6 et 7, malgré le marquage des bactéries au SYTO9, nous n’avons
visualisé aucune bactérie dans la formule. Un second marqueur total, le SYBR green, a
donc été utilisé afin de comprendre l’origine de ce phénomène. Les bactéries ont ainsi
pu être observées avec ce marqueur et leur répartition dans ces deux crèmes s’est
avérée homogène. Une hypothèse serait qu’un ou plusieurs constituants présents dans
ces deux crèmes puissent interagir négativement avec le SYTO9. En comparant la
composition de ces deux crèmes (6 et 7), il s’est avéré que celles-ci avaient un composé
en commun, un émulsionnant anionique appelée potassium cetyl phosphate et qui
pourrait donc être à l’origine du problème. Afin de comprendre l’interaction de ce

76
composé avec le marquage au SYTO9, des cellules de S. aureus marqués au SYTO9 ont
été mises en suspension dans une solution de potassium cetyl phosphate à une
concentration équivalente à celle dans la crème 6 soit à 2,25%. Lors de l’observation
des cellules au MCBL, une rapide perte de fluorescence a été constatée. L’intensité de
fluorescence résultant de la fixation d’un marqueur sur l’ADN peut dépendre de
différents paramètres. Elle peut notamment être altérée par la présence de certains
composés dans le milieu environnant comme l’albumine de sérum bovin et le rouge
de phénol (Feng et al. 2014) ou encore par la présence de cations (Na+, K+, Ca2+, Mn2+,
Mg2+) induisant la photodégradation des marqueurs fluorescents (Wong and Campbell
2011). Une étude montre que le phénomène de bleaching ou « blanchissement » du
SYTO9, correspondant à une perte de fluorescence aspécifique au cours du temps, se
produirait plus rapidement pour des bactéries mortes que vivantes (Stiefel et al. 2015).
Le potassium cetyl phosphate pourrait peut-être avoir une activité antimicrobienne qui
entrainerait une dégradation du complexe ADN/SYTO9 ou plus probablement agirait
sur l’intégrité membranaire des bactéries ce qui engendrerait la fuite de la fluorescence
liée à l’ADN dans le milieu extérieur.

Afin de confirmer l’hypothétique action antimicrobienne du potassium cetyl

phosphate, nous avons utilisé un troisième marqueur fluorescent, le SYTOX green. Il
s’agit d’un marqueur incapable de pénétrer dans les cellules vivantes. En revanche, dans
les cellules à la membrane perméabilisée, le marqueur traverse la membrane et se fixe
sur les acides nucléiques. Les bactéries marquées au SYTOX green sont mises en
suspension dans différentes concentrations de potassium cetyl phosphate, et la
fluorescence par MCBL est suivie au cours du temps. On observe alors une
augmentation de fluorescence au cours du temps traduisant ainsi une augmentation
de la mortalité bactérienne. De plus, plus la concentration de potassium cetyl
phosphate est forte, plus la fluorescence augmente rapidement (Figure 20). Pour
vérifier l’inactivation des cellules de S. aureus en présence de potassium cetyl
phosphate, un dénombrement sur boite a été réalisé en parallèle de l’observation par
MCBL. Sans potassium cetyl phosphate, il n’y pas de régression bactérienne alors qu’à
une concentration de 2,25% on observe une perte d’environ 2 log en 20 min. Il
semblerait alors que le potassium cetyl phosphate ait bien des propriétés
antimicrobiennes agissant sur la membrane bactérienne et pouvant être à l’origine de
la perte de fluorescence du SYTO9 des bactéries mortes.

77
Ainsi, dans certaines formules cosmétiques, le SYTO9 serait inapte à marquer les
cellules mortes, contrairement à ce qui est habituellement décrit (Wiederschain 2011).
Le SYBR green est utilisé dans divers domaines de la biologie notamment dans les
réactions en chaines par polymérases (PCR) pour suivre en temps réel l’accumulation
d’amplicons ou pour marquer l’ADN ou l’ARN après électrophorèse sur gel ou encore
pour accéder à l’état physiologique des bactéries et les dénombrer (Patel et al. 2007;
Gudnason et al. 2007; Berney et al. 2007). Nous avons montré dans cette partie de
thèse que l’utilisation du SYBR green comme marqueur total des bactéries est
préférable à celui du SYTO9 dans les formules cosmétiques car il ne semble pas être
affecté par un composé à activité antimicrobienne, le cetyl phosphate de potassium.

Enfin, dans la crème 8, on peut observer distinctement des endroits de la crème sans
bactéries et d’autres avec au contraire de très nombreuses bactéries. Il semblerait alors
que la distribution spatiale des bactéries dans cette crème soit hétérogène.

78
 Figure 20 : Suivi de fluorescence par MCBL (40x) après marquage de S. aureus au
SYTOX green dans de l’eau physiologique contenant différentes concentrations de
potassium cetyl phosphate.

3.2 - Mise en évidence des matières premières impliquées dans la

distribution spatiale des bactéries par formulation de matrices
cosmétiques modèles

Dans l'étude bibliographique réalisée dans le chapitre I, il apparait que certains facteurs
pourraient être impliqués dans la répartition hétérogène des bactéries dans les
produits cosmétiques tels que la structuration des émulsions, les propriétés de surface
des bactéries ou encore la présence de certaines matières premières (Brisson et al.
2010; Chalier et al. 2007; Li et al. 2001; Lopez et al. 2006; Ly et al. 2008; Ly, Naitali-
Bouchez, et al. 2006; Ly, Vo, et al. 2006). La crème 8 est celle dont la formulation
interfère avec une bonne répartition des bactéries. Afin de mieux comprendre les
facteurs impliqués dans cette mauvaise distribution, une base modèle émulsionnée de
type crème ayant un ratio de phase grasse/phase aqueuse similaire à la crème 8
(37,1/62,9 h/e %) a été formulée. Deux matières premières, le monostéarate de glycérol
et l’hydroxyéthylacrylate/sodium acryldiméthyltaurate copolymer, appelé copolymère
polyacrylate par la suite, présentes dans la crème 8 et susceptibles d'être liées au

79
problème de distribution, ont été ajoutés à différentes concentrations séparément et
ensemble.

La distribution spatiale des bactéries dans la base modèle sans les deux matières
premières soupçonnées est homogène : c’est le témoin négatif (Tableau 8). En
revanche, lorsque celles-ci sont ajoutées ensemble dans la base modèle et aux
concentrations équivalentes à celles présentes dans la crème 8, soit avec 1,6% de
copolymère polyacrylate et 2,5% de monostéarate de glycérol, elles induisent une
distribution hétérogène des bactéries. Cet essai est considéré comme le témoin positif
car il mime la répartition des bactéries dans la crème 8. L’ajout de monostéarate de
glycérol seul à 2,5% ne semble pas être impliqué dans la répartition hétérogène des
bactéries. L'ajout de 1,6% de copolymère polyacrylate seul ne permet pas d’obtenir une
émulsion stable. Il a donc été nécessaire d'intégrer à la base modèle le monostéarate
de glycérol à la concentration de 2,5% tout en faisant ensuite varier le pourcentage de
copolymère polyacrylate. Grâce à sa fonction de co-émulsionnant, le monostéarate de
glycérol stabilise l'émulsion. L’ajout du copolymère polyacrylate à 1% entraine toujours
une distribution hétérogène des bactéries mais moins importante qu’avec 1,6%. La
distribution des bactéries devient homogène à 0,5%. Pour l’ensemble des formules, les
valeurs de pH sont globalement comprises entre 5,3 et 5,9. En revanche, les valeurs de
pénétromètrie, varient. En effet, nous observons que plus la concentration de
copolymère polyacrylate est élevée et plus la viscosité de la matrice est importante. La
distribution hétérogène des bactéries pourrait donc être liée soit à la présence de la
molécule de copolymère polyacrylate, soit à la viscosité de la crème induite par la
présence de copolymère polyacrylate. Nous investiguerons cette question lors de la
prochaine partie de ce chapitre.

80
Tableau 8 : Synthèse des essais réalisés dans la crème 8 et la matrice modèle avec les
images de microscopies associées représentant la distribution spatiale des bactéries
(en vert) dans les matrices cosmétiques (en rouge). Pour chaque expérience, un
échantillon de trois images représentatives des trente images obtenues au total par
MCBL à l'objectif 40x air sont présentées.

81
 4 - Conclusion

L’association de la microscopie confocale à balayage laser et l’utilisation de marqueurs

fluorescents ont permis la visualisation de la structuration de la matrice cosmétique
émulsionnée ainsi que des gouttelettes lipidiques la composant grâce au marquage au
Nile red. Elle a également permis d’accéder à la distribution spatiale des bactéries dans
les formules grâce à l’utilisation de marqueurs fluorescents (SYTO9 et SYBR green).
C’est par ce biais que nous avons pu montrer que l'observation des bactéries était
possible dans les formules cosmétiques émulsionnées, sauf dans quelques cas,
notamment lorsque des composés autofluorescents ou marqués de façon non
spécifique par le SYTO9 perturbent la visualisation des bactéries dans les formules.

Ces premières expériences nous ont permis de mettre en évidence que la distribution
spatiale des bactéries semble être dépendante de la composition de la formule, et
notamment de la présence d’épaississant tel que le copolymère polyacrylate. La suite
de l’étude sur l'analyse de la distribution spatiale des bactéries a donc portée sur une
meilleure compréhension des facteurs influençant la répartition des bactéries dans les
matrices.

III - Impact des facteurs influençant la distribution spatiale des bactéries

1 - Synthèse de l’étude

La partie précédente a permis l’identification d’un épaississant, un copolymère

polyacrylate, qui entraine une mauvaise répartition des bactéries dans la matrice.

Cette partie de chapitre vise à i) déterminer si cette mauvaise répartition est seulement
liée à l’ajout du copolymère polyacrylate ou si elle est liée à la viscosité induite, ii) à
quantifier l’effet de la concentration d’épaississant sur la répartition des bactéries
notamment à l’aide d’outils statistiques quantitatifs et iii) à explorer l’impact d’autres
facteurs tels que les caractéristiques bactériennes de surface, notamment leur
hydrophobicité, sur la distribution spatiale des bactéries. Elle fait l’objet d’un article
intitulé « Mosaic-CLSM assessment of bacterial spatial distribution in cosmetic matrices
according to matrix viscosity and bacterial hydrophobicity ».

Différentes concentrations de copolymère polyacrylate ont tout d’abord été

incorporées dans des matrices modèles et la distribution spatiale a été quantifiée par
la détermination de la fréquence de distribution de la surface de fluorescence des
bactéries marquées après acquisition dans chaque matrice de près de 700 images au

82
minimum, acquises par MCBL en utilisant le mode mosaïque (acquisition de 15x15
images par échantillon). Un autre épaississant, la gomme de Guar, a également été
testé à des viscosités similaires à celles obtenues avec le copolymère polyacrylate pour
confirmer l’impact de la viscosité.

Par ailleurs, les profils de distribution spatiale de trois souches de S. aureus ayant
différentes propriétés de surface et de billes inertes hydrophiles de 1 µm ont été
comparés. Le niveau d’hydrophobicité des souches a été déterminé par la méthode
« Bacterial Adhesion To Hydrocarbon » (BATH) (Rosenberg et al. 1980). Les trois
souches testées présentaient des niveaux d’hydrophobicité de 42%, 76% et 95%
d’affinité pour l’hexadécane. La charge de surface des souches a également été évaluée
par mesure de la mobilité électrophorétique, mais les trois souches se sont toutes
révélées chargées négativement de manière similaire, ce qui n’a pas permis de mettre
en évidence le rôle de la charge à la surface des bactéries sur leur distribution spatiale
dans les formules cosmétiques.

Les travaux présentés dans cet article ont permis, grâce à l’utilisation de la microscopie
confocale à balayage laser associée à l’analyse statistique des fréquences de
distribution, de caractériser rapidement la distribution spatiale des bactéries dans une
formule cosmétique. L’acquisition semi-automatique des images en mosaïque a permis
de prendre plus d’une centaine de photos d’un échantillon dans un même puits d’une
microplaque. La macro automatique créée sous le logiciel d’analyse d’image « ImageJ »
a ensuite permis la binarisation de lot d’images et de calculer le pourcentage de
fluorescence des bactéries marquées pour chaque image. La moyenne, la variance et
la fréquence de distribution des pourcentages de fluorescence ont ensuite été
calculées sur l’ensemble des images pour chacune des conditions. La comparaison
entre la moyenne et la variance nous a ainsi permis de classer la distribution spatiale
des bactéries comme uniforme (homogène) ou en cluster (hétérogène).

Les résultats montrent que plus la concentration en copolymère polyacrylate

augmente, plus la distribution spatiale des bactéries est hétérogène. Les essais menés
avec la gomme de Guar confirment les résultats précédents : lorsque la viscosité de la
formule augmente, suite à l’ajout d’épaississant, la distribution spatiale des bactéries
ne se fait plus de manière uniforme.

Parallèlement, l’analyse de l’impact du niveau d’hydrophobicité de la surface

bactérienne sur la distribution spatiale des trois souches de S. aureus a révélé que plus

83
les bactéries sont hydrophobes et plus leur répartition dans la matrice cosmétique
modèle est hétérogène.

Lors des challenge-tests, lors de l’étude de l’évolution de la population au cours du

temps, il est évident qu’une répartition hétérogène des bactéries inoculées dans une
formule cosmétique de forte viscosité peut engendrer une surestimation ou une sous-
évaluation du nombre de bactéries dans un échantillon en fonction de l’endroit de
prélèvement. Cet article décrit une méthode rapide qui permet de classer les matrices
cosmétiques en fonction de leur capacité à permettre ou non une bonne répartition
des bactéries inoculées. Ainsi, il est possible d’adapter le protocole d’échantillonnage
en fonction des matrices, en augmentant le volume de prélèvement pour les matrices
dans lesquelles la distribution est hétérogène. Par ailleurs et à plus long terme, il serait
intéressant de chercher à mettre au point une méthode performante pour améliorer le
niveau d’homogénéisation des bactéries dans les matrices cosmétiques visqueuses
tout en évitant de déstabiliser la structure de la formule. L’amélioration de la
distribution spatiale des bactéries dans les formules cosmétiques au moment de
l’inoculation permettrait d’améliorer la fiabilité des résultats issus des challenge-tests.

Les travaux présentés dans cet article ont permis de mettre en évidence deux facteurs
impactant la distribution spatiale des bactéries dans les formules cosmétiques : la
viscosité des matrices et le niveau d’hydrophobicité des bactéries.

84
 2 - Article 1

« Mosaic-CLSM assessment of bacterial spatial distribution in cosmetic

matrices according to matrix viscosity and bacterial hydrophobicity »

Samia Almoughrabie1, Chrisse Ngari2, Romain Briandet1, Valérie Poulet2, and Florence
Dubois-Brissonnet1
1
Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Micalis Institute, 78350 Jouy-en-Josas,
France
2
Laboratoires Clarins, 5 Rue Ampère, 95300 Pontoise, France

2.1 - Abstract

The present study aims to quickly identify factors that are susceptible to impair a
uniform distribution of inoculated bacteria in cosmetic matrices in the context of
challenge-tests. We used mosaic confocal laser scanning microscopy (M-CLSM) to
obtain rapid assessment of the impact of the composition and viscosity of cosmetic
matrices on S. aureus spatial distribution. Several model cosmetic matrices were
formulated with different concentrations of two thickeners and inoculated with three
S. aureus strains having different levels of hydrophobicity. The spatial distribution of
S. aureus in each matrix was evaluated according to the frequency distribution of the
fluorescence values of at least 675 CLSM images. We showed that, whatever the
thickener, an increasingly concentration of thickener results in increasingly clustered
bacterial distribution. Moreover, higher bacterial hydrophobicity also resulted in a
more clustered spatial distribution. In conclusion, CLSM-based method allows a rapid
characterization of bacterial spatial distribution in complex emulsified systems. Both
matrix viscosity and bacterial surface hydrophobicity affect the bacterial spatial
distribution which can have an impact on the reliability of bacterial enumeration during
challenge-test.

Keywords: clustered distribution; regular distribution; viscous matrix; thickener;

bacterial hydrophobicity; challenge-test; CLSM.

2.2 - Introduction

Controlling the contamination of cosmetic products is essential to avoid alterations of

their organoleptic characteristics (color, odor, composition, etc.) and maintain their
innocuity for consumers. These products can be contaminated during the processing

85
or because of consumer’s repetitive use. Among other pathogens, Staphylococcus
aureus has been found in various cosmetic products (Birteksoz Tan et al. 2013;
Campana et al. 2006). This Gram-positive bacteria is present on the skin and mucous
membranes of 30% of the population (Ryu et al. 2014) and causes a wide range of skin
infections such as abscesses, furuncles, impetigo, etc. (Lowy 1998; Tong et al. 2015).

Each cosmetic product is characterized by a level of microbiological risk according to

the standard ISO 29621:2017, which depends on several parameters such as the
formula composition (preservative, ethanol, aw, pH) or the type of packaging (unidose,
airless pump, pots) (Berthele et al. 2014; Halla et al. 2018).

The preservation efficiency of a cosmetic product is evaluated by a challenge test, as

defined in the European standard EN ISO 11930:2019. This procedure consists in
artificially inoculating a product with a target microorganism at a defined concentration
which is between 1 x 105 and 1 x 106 CFU.ml-1 for bacteria. The evolution of the
microbial population is then monitored at defined intervals for 28 days. A preservative
system is considered as efficient against bacteria if the formula composition leads to a
bacterial logarithm reduction ≥ 3 seven days after inoculation and without the growth
of bacteria after 14 and 28 days.

Cosmetic products are complex systems, resulting from a mixture of an aqueous phase,
a lipophilic phase, and an emulsifier. Thus, the evaluation of their microbiological
contamination is a major challenge. The reliability of the challenge-test could be
related to the spatial distribution of microorganisms in the matrix (Jongenburger et al.
2011). Microbial clustering can indeed influence the effectiveness of sampling plans. If
the bacterial spatial distribution is heterogeneous, the probability of failing to detect a
pathogen in a batch is higher than if the distribution is uniform and it can have
consequences on public health (Jongenburger, Reij, et al. 2012). Many factors can affect
contaminant distribution, such as the inoculum preparation step (Gilbert et al. 1991;
Pembrey et al. 1999; Bruinsma et al. 2001), inoculum concentration (Jeanson et al.
2011), precision of serial dilutions (Hedges 2002), microbial growth or death, sampling
process (partitioning, mixing) (Jongenburger, Bassett, et al. 2012; Nauta 2005) and
composition and structure of the matrix (Lopez et al. 2006). In complex systems, many
types of physico-chemical interactions are involved between bacteria and the matrix
components, including van der Waals, electrostatic, Lewis acid–base, and hydrophobic
interactions (Oss 2003). These interactions depend on the properties of the suspending
media (ionic strength, temperature) and the interfacial physico-chemical properties of

86
both the bacteria and matrix components. Bacterial cell-surface properties have already
been demonstrated to influence bacterial interactions with food-matrix components
(Burgain et al. 2014; Ly, Vo, et al. 2006) and stability of the emulsion (Dorobantu et al.
2004; Li et al. 2001; Ly, Naitali-Bouchez, et al. 2006). In addition, matrix viscosity may
also influence bacterial distribution. Thickeners are added to several types of cosmetic
products to stabilize the system and prevent creaming or sedimentation (Pensé-
Lhéritier and Masson 2016). The most common thickeners are natural nonionic (guar
gum) or anionic (xanthan gum, carrageenan, and alginates) polysaccharides (Kirk–
Othmer 2013). Synthetic polyacrylates, such as carbomers, are also widely used in
cosmetics. They have a low thickening power in acidic medium but the addition of a
base, such as tromethamine, neutralizes the carboxylic acid groups, which increases the
electric charge of the macromolecules, causing their expansion in the formula (Kirk–
Othmer 2013). The hydroxyethyl acrylate/sodium acryloyl dimethyl taurate copolymer,
used in this study, is a pre-neutralized polyacrylate copolymer with many functions,
including those of a stabilizer, texturizer, and emulsifier.

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) has been extensively used to explore
biofilm structure after cell labeling with fluorescent markers. It enables non-destructive
fluorescence investigation of bacterial distribution, physiological heterogeneity, and
spatial organization in such three-dimensional communities (Bridier et al. 2011; Bridier
et al. 2010). Direct bacterial observation has also been achieved in thick systems, such
as dairy matrices (Doherty et al. 2010; Auty, Gardiner, et al. 2001; Jeanson et al. 2011).
Here, we took advantage of the confocal laser scanning microscopy to characterize the
spatial distribution of S. aureus in oil-in-water (O/W) emulsified matrices according to
the matrix structure and bacterial surface properties.

2.3 - Materials and Methods

2.3.1 - Bacterial strains and culture conditions

The strains used in this study were S. aureus CIP 4.83, S. aureus ATCC 29213, and
S. aureus ATCC 27217. S. aureus CIP 4.83 is a strain recommended by the EN ISO
11930:2012 standard for cosmetic-product challenge tests. The other strains were
chosen due to their different levels of hydrophobicity. Each strain, stored in cryovials
at -80°C, was resuscitated by two successive subcultures in tryptic soy broth (TSB)
before each experiment. Cultures were grown at 30°C until the end of the exponential
growth phase.

87
The bacterial inoculum was calibrated to 1 x 1010 to 1 x 1011 CFU.ml-1 in 150 mM NaCl
in order to observe at least 10-100 bacteria per CLSM image (290.62 x 290.62 x 1.6
µm3). S. aureus cells were labelled with 2 µl Syto 9 (3.34 mM in DMSO, Life
Technologies) and incubated in the dark for 1 h at room temperature. Syto 9 is a green
cell-permeable nucleic-acid marker that stains live and dead bacteria. One gram of
matrix in a 50 ml centrifuge tube was inoculated with the stained inoculum and
vortexed for 30 s.

2.3.2 - Chemicals and materials

Acrylate copolymer, cetearyl glucoside, and glyceryl stearate were purchased from
SEPPIC (Puteaux, France), carbomer from Gattefossé (Lyon, France), glycerin from
Oleon (Ertvelde, Belgium), cetearyl isononanoate from BASF France (Lyon, France),
tocopheryl acetate from DSM (Heerlen, the Netherlands), tromethamine from Azelis
(Heusden, Belgium), and guar gum and hexadecane from Sigma-Aldrich (Saint-
Quentin Fallavier, France).

When necessary, 200 µl of latex green fluorescent beads latex (L4655, carboxylate-
modified polystyrene, 1 µm) from Sigma-Aldrich were added to the model matrices at
a concentration of 4.75 x 1010 beads.ml-1.

2.3.3 - Characterization of bacterial surface properties

Bacterial surface hydrophobicity

S. aureus surface hydrophobicity was measured by Bacterial Adherence To

Hydrocarbons (BATH) (Rosenberg 1984). Bacterial cells were harvested by
centrifugation at 1,575 x g for 10 min and resuspended to an OD400 of 0.8 in 150 mM
NaCl, precisely measured, and noted as A0. Hexadecane (0.25 ml) was added to 1.5 ml
of bacterial suspension. The two-phase system was vortexed for 2 min and allowed to
separate for 15 min at room temperature before the OD400 was measured in the
aqueous phase (A1). The percentage of solvent affinity was calculated as: the
percentage of solvent affinity = (1- A1/A0) x 100. Each experiment was performed in
triplicate with independently grown cultures.

Bacterial electrophoretic mobility

The bacterial electrophoretic mobility (EM) was measured by determining the rate at
which bacteria migrate in a constant electric field (120 mV). EM was assessed using a

88
Zetameter ZetaCOMPACTTM from CAD instrumentation (Les Essarts le Roi, France).
Bacterial cells were harvested by centrifugation at 1,575 x g for 10 min, washed twice
in 150 mM NaCl, and resuspended in several phosphate buffers with a pH from 3 to 8.
Each measurement recorded the movements of approximately 100 individual bacterial
cells by automated video analysis. Each experiment was performed at least six times
with two independent cultures.

2.3.4 - Cosmetic matrices

Commercial matrices

Six commercial matrices (Laboratoires CLARINS, Pontoise, France), named from 1 to 6,

were selected to represent the main emulsified cosmetic products, such as body lotions
or creams.

Preparation of the emulsified model matrix (35/65 O/W %)

The aqueous phase was first prepared with 0.25% carbomer in water, with the addition
of acrylate copolymer (0.4 to 1.6%) when necessary and heated to 75°C before glycerin
(moisturizer, 9%) was added. The oil phase, composed of 28.8% cetearyl isononanoate
(emollient), 3.5% cetearyl glucoside (emulsifier), 0.2% tocopheryl acetate (antioxidant),
and 2.5% glyceryl stearate (co-emulsifier), was heated to 75 to 80°C before being
blended with the aqueous phase at 1,800 rpm using a rotor-stator homogenizer
(Rayneri 33/300P, Group VMI) to obtain an emulsion. Tromethamine (base, 0.15%) was
finally added. Guar gum was pre-mixed with glycerin and added to a final concentration
of 2.5% when necessary.

2.3.5 - Characterization of the emulsified matrices

Viscosity measurements

The viscosity of industrial or model matrices was measured by penetrometry using a

penetrometer (PNR10, PetroMesures). A specific cone was released in 300 g of matrix
and the penetration depth measured (in mm ± 0.1 mm) after 5 s: the deeper the cone
sinks into the matrix, the softer the matrix. Three replicates were performed for each
measurement.

89
Determination of lipid droplet electrophoretic mobility

Emulsified matrices, with or without acrylate copolymer, were diluted 1,500 times in
appropriate phosphate buffer prior to analysis. Electrophoretic mobility (EM) was
measured at pH 4 to 6 using a ZetaCOMPACTTM zetameter (CAD instrumentation; Les
Essarts le Roi, France).

2.3.6 - Enumeration of the bacterial population

Just after bacterial inoculation, 15 samples were harvested from different locations of
the contaminated matrix and enumerated by serial dilution. Enumeration was
performed on tryptone soya agar (TSA, Biomérieux) by the drop-plate method (Chen
et al. 2003). Plates were incubated at 30°C for 24 to 48 h before counting. Each
experiment was performed in triplicate. The ratio of recovery is the log CFU/g divided
by the log inoculated CFU/g (Figure 23A). The enumerated bacterial population was
similar to the level of inoculation if the ratio of recovery is equal to 1 (Figure 23A).

2.3.7 - Mosaic-Confocal Laser Scanning Microscopy (M-CLSM) and

image analysis

The inoculated matrix was dropped into the wells of polystyrene 96-well microtiter
plates (Greiner Bio-One, France). Image acquisition was performed using a Leica SP8
AOBS Confocal Laser Scanning Microscope (Leica Microsystems, France) at the INRAE
MIMA2 microscopy platform (https://doi.org/10.15454/1.5572348210007727E12). Syto
9 and Nile red were excited at 488 nm and 561 nm and the emitted fluorescence
collected from 498 to 560 nm and 630 to 750 nm, respectively.

Each image was acquired using a 40x air objective (Numerical Aperture = 0.85) and its
size was 290.62 x 290.62 x 1.6 µm3 (512 x 512 pixels). The CLSM control software was
programmed to take in each well a mosaic of 15 x 15 images, each of them
corresponding to an observed volume of 1.3 x 10-7 ml. Acquiring mosaics instead of
single images allows to visualize bigger volumes of matrix and to decrease the
detection threshold per g. Each experiment was performed at least in triplicate.

The percentage of surface fluorescence (SF) for each image was calculated by binarizing
the images using the MaxEntropy function in an automatic macro executed in the
ImageJ software, (National Institutes of Health, USA) (Schneider et al. 2012). In our
experimental conditions, the range of SF that can be visualized on one image is
between 0.0005% (one bacteria) to 100% (over 2 x 105 bacteria).

90
The equivalent CFU.ml-1 for each image acquired by CLSM was calculated first by
dividing the SF of the image by the SF of one bacterium leading to a number of bacteria
per image. Bacterial concentration was then calculated in bacteria per g taking into
account the volume observed for one image and the matrix density (1.15 g/ml). The
ratio of recovery is the equivalent log bacteria/g divided by log inoculated CFU/g.

The bacterial spatial distribution was quantified by calculating the frequency

distribution, the mean and the variance of the fluorescence values obtained on at least
675 and up to 1125 images. A variance superior, equal or inferior to its mean indicates
a clustered, uniform or regular spatial distribution respectively (Jongenburger, Bassett,
et al. 2012).

2.3.8 - Statistical analysis

All statistical analyses were performed using a free version of XLSTAT (Addinsoft).
Factors were considered to have a statistically significant effect for a critical probability
associated with the Fisher test P value lower than 0.05.

2.4 - Results

2.4.1 - Determination of bacterial surface properties

Bacterial surface hydrophobicity

The three S. aureus strains were chosen according to their hydrophobicity to evaluate
the impact of bacterial surface properties on bacterial distribution in matrices. S. aureus
CIP 4.83 was the most hydrophobic strain (95% affinity for hexadecane), whereas
S. aureus ATCC 292312 and ATCC 27217 had 76% and 42% affinity, respectively. We
also tested the behavior of fluorescent polystyrene microspheres. These inert beads
have similar morphology to that of S. aureus (sphere of 1 µm in diameter) but are more
hydrophilic than the tested bacteria (5% affinity for hexadecane).

Bacterial surface charge

The electrophoretic mobility of the three strains was measured at a pH from 3 to 8

(Figure 21A). All strains were negatively charged at an ionic strength of 1 mM. Their
electrophoretic mobility was near -3 µm.s-1.V-1.cm-1 at pH 3, increased to
approximatively -1.5 µm.s-1.V-1.cm-1 at pH 6, and remained constant from pH 6 to 8.
There were no significant differences in electrophoretic mobility between the three
strains.

91
 2.4.2 - Determination of matrix properties

Matrix viscosity

Among the six commercial cosmetic matrices, matrices 1 and 4, which were body
lotions, had penetrometry values of 38.0 ± 0.1 mm and 34.1 ± 0.2 mm, respectively.
Matrices 2, 3, 5, and 6 were creams and had penetrometry values of 35.2 ± 0.4 mm,
34.4 ± 0.1 mm, 32.1 ± 0.6 mm, and 23.2 ± 0.1 mm, respectively.

Model matrices formulated with 0, 0.4, 0.8, or 1.6% acrylate copolymer had
penetrometry values of 31.5 ± 0.4 mm, 28.5 ± 0.3 mm, 27.7 ± 0.4 mm, and 26.6 ± 0.3
mm, respectively. Those with 2.5% guar gum had a penetrometry value of 25.5 ± 0.4
mm.

Matrix droplet electrophoretic mobility

Model matrices had a pH between 5 and 6. The mobility of droplets was near zero at
pH 4 and slightly decreased from pH 5 to 6 for matrices with or without acrylate
copolymer (Figure 21B). There was no significant difference between the
electrophoretic mobility of droplets in either matrix.

92
Figure 21 : Electrophoretic mobility of three S. aureus strains (A) and the lipid droplets
of a model matrix (B) at a pH from 3 to 8. Data are expressed as the mean ± standard
deviation of two biological replicates.

2.4.3 - Bacterial spatial distribution in commercial emulsions

We assessed the spatial distribution of S. aureus CIP 4.83 in six commercial cosmetic
matrices of various viscosities by CLSM imaging to identify the formulas in which
uniform homogenization is not complete.

Figure 22A and B show the frequency distribution of surface fluorescence (SF), the
mean and the variance for two of the six matrices taken as examples. For matrix 1, the
variance of the SF is inferior to the mean which indicates a regular bacterial distribution.
Figure 22C illustrates the regular distribution in matrix 1 showing one series of 225
images. Matrices 2 to 5 showed similar regular distribution with SF means being
between 0.03% and 0.45% (data not shown). The matrices 1 to 5 had low viscosities,
with penetration values superior to 32 mm. In contrast, matrix 6 showed clustered

93
bacterial distribution with a variance of SF superior to the mean (Figure 22B and D).
Figure 22B shows the higher dispersion of frequency distribution values in comparison
to matrix 1 (Figure 22A). Matrix 6 had the highest viscosity, with a penetration value of
23.2 ± 0.1 mm.

Figure 22 : Frequency distribution of S. aureus CIP 4.83 surface fluorescence among

675 images mean and variance associated in matrices 1 (A) and 6 (B) and a series of
225 CLSM images in matrices 1 (C) and 6 (D).

2.4.4 - Bacterial spatial distribution and enumeration in matrices

with thickener

From the matrix 6 composition, several assays were conducted to identify the
component that impairs the regular distribution of S. aureus in the matrix. It appears
to be the acrylate copolymer (data not shown). To confirm the impact of its presence,
we formulated two emulsified model matrices, without or with acrylate copolymer at
1.6% and evaluated the ratio of recovery between the initial inoculum and by plate
count (Figure 23A) or by M-CLSM enumeration (Figure 23B). Bacterial enumeration by

94
both methods was significantly more variable in matrices with 1.6% acrylate copolymer
than in the matrix without acrylate copolymer (p < 0.05). We can note a higher
variability of enumeration by CLSM imaging than by plate count, due to the
substantially smaller analyzed volume (1.5 x 10-7g compared to 1g).

Figure 23 : Ratio of bacterial recovery obtained with 0% or 1.6% acrylate polymer by

plate count (A) and by CLSM enumeration from five series of 225 images (B).

We further investigated the impact of the concentration of thickener by formulating

four model matrices with 0, 0.4, 0.8, or 1.6% acrylate copolymer and inoculating them
with three different S. aureus strains or fluorescent beads. The frequency distribution
of surface fluorescence is more dispersed with increasing acrylate copolymer
concentration, regardless of the strain. The variance is superior to the mean for 0.8%
and far more for 1.6% acrylate copolymer resulting in clustered bacterial distribution
(Figure 24D-I). Without acrylate copolymer or with 0.4% (data not shown), the variance
is inferior to the mean resulting in regular distribution. The results are similar for
hydrophilic beads which are regularly distributed in matrices with 0% to 0.4% acrylate
polymer, contrarily to 0.8% and 1.6% (data not shown).

We intend next to determine if the clustered bacterial distribution is due to the viscosity
which increases when the concentration of acrylate copolymer increases or if it is due
to this thickener itself. We thus formulated model matrices with guar gum, another
thickener. The viscosity obtained with 2.5% guar gum is similar to that obtained with
1.6% acrylate copolymer (25.5 ± 0.3 mm versus 26.2 ± 0.1 mm). The spatial distribution

95
of S. aureus was clustered with the guar gum (Figure 24A-C) but not without (Figure
24J-L), regardless of the strain. The results are similar for hydrophilic beads (data not
shown).

Figure 24 : Frequency distribution of three strains of S. aureus of surface fluorescence

among five series of 225 CLSM images in matrices with various concentrations of
acrylate copolymer (from 0% to 1.6%) or guar gum (2.5%), mean and variance
associated.

2.4.5 - Spatial distribution of three S. aureus strains according to

their level of hydrophobicity in matrices with thickener

Spatial distribution was not affected by the level of hydrophobicity of the three
bacterial strains in matrices with 0 (Figure 24J-L) or 0.4% acrylate copolymer (data not
shown). Conversely, in the matrix with 1.6% acrylate copolymer, the variance of SF is
highly superior to the mean and reached 176.26 for S. aureus CIP 4.83, 11.32 for S.
aureus ATCC29213, 8.43 for S. aureus ATCC27217 (Figure 24D-F). The most
hydrophobic bacteria also showed the most clustered spatial distribution in the matrix

96
with 2.5% guar gum (Figure 24A). Hence, the spatial distribution was increasingly
clustered with increasing hydrophobicity of the strain in high viscosity matrices.

2.5 - Discussion

The study of the spatial distribution of three S. aureus strains with different levels of
hydrophobicity in several matrices with specific characteristics allowed us to
understand the determinants of their distribution. First, we succeeded to obtain
accurate M-CLSM images that allow rapid characterization of the bacterial spatial
distribution in emulsified matrices. Despite the light diffraction by high lipid-content
droplets, we optimized the settings to obtain high resolution images with a low
fluorescence background signal. The mosaic mode allows lowering the threshold of
bacterial enumeration and each mosaic image (225 images) was quickly acquired in
only 8 min. An Image J macro was developed to batch, accelerate and standardize
image quantification. Afterwards, the calculation of the frequency distribution together
with the comparison of the variance and the mean of SF allowed to classify the spatial
distribution as clustered, uniform or regular, as did Jongenburger, Bassett, et al. (2012)
for bacterial spatial distribution in milk powders. M-CLSM appears to be a quick and
relevant in situ approach for both bacterial enumeration and investigation of spatial
distribution in complex matrices.

The results demonstrate that an increasingly viscous matrix, due to increasing the
concentration of thickener, results in increasingly clustered bacterial distribution. By
consequence, the heterogeneity of the enumeration results, affected by the clustered
bacterial spatial distribution, also appeared to be driven by matrix viscosity. In the field
of metal production, in which metallic particles are added before solidification, the
distribution of such particles is critical and can affect the quality of the final product. It
was shown that viscosity, among other factors, influences metal particle distribution in
the matrices (Hashim et al. 2002). In an agar-based food model system, Wimpenny et
al. (1995) also stated that the distribution of bacteria is affected by agar concentration.
The structure of emulsions, especially droplet size, may also play a role in bacterial
spatial distribution. Brocklehurst et al. (1995) studied the spatial distribution of Listeria
monocytogenes and Yersinia enterocolitica in a hexadecane/water emulsion. They
showed that droplet size correlates with viscosity: the smaller the droplet size, the
higher the emulsion viscosity, and thus the greater the bacterial immobilization.
Furthermore, Jongenburger, Reij, et al. (2012) simulated homogeneous and

97
heterogeneous distribution of bacterial contaminants in batches of powdered infant
formula and they showed that a low level of contamination and a heterogeneous
bacterial distribution lead to a higher variability of bacterial enumeration.

Besides viscosity of the matrix, our results also show that increasing S. aureus surface
hydrophobicity induces increasing clustered spatial distribution. These observations
are in accordance with those of Ly, Vo, et al. (2006), who demonstrated the existence
of physicochemical interactions between bacteria and the constituents of food
matrices. They highlighted the role of the surface hydrophobicity of lactic-acid bacteria
showing that the LLD18 strain, with a highly hydrophobic surface, interacts more with
lipids and hydrophobic compounds than a hydrophilic strain (LLD16). Another study
showed that hydrophobic bacteria can stabilize oil-in-water emulsions by adhering to
the interface and preventing droplets from coalescing, whereas hydrophilic bacteria
cannot (Dorobantu et al. 2004). The emulsified matrix used in our study consisted of a
65% hydrophilic phase and a 35% lipophilic phase. Our hypothesis is that the
hydrophobic S. aureus strain was more highly trapped at the surface of the
hydrophobic droplets than the two other strains, which led to a more heterogeneous
distribution of the bacteria. This shows that the choice of the bacterial strain can have
a strong impact on bacterial spatial distribution and thus on the results of
enumerations after sampling.

Interactions between bacteria and emulsions can also be affected by the surface charge
of the bacteria cell wall. Li et al. (2001) studied interactions between E. coli and emulsion
droplets (hexadecane/water). E. coli and these droplets having opposite surface
charges, the bacteria were attracted to the surface of the droplets and destabilized the
emulsion. However, in our study, the S. aureus strains showed no difference in
electrophoretic mobility at an ionic strength of 1 mM. The negative charge was the
smallest at a pH of 5 to 6. Moreover, at these pHs, the negative charge of the droplets
of the emulsified matrices, with or without acrylate copolymer, was very low. By
consequence, in this study, the bacterial surface charge cannot explain the difference
of bacterial distribution between strains.

98
 2.6 - Conclusion

M-CLSM is a rapid and relevant technique to characterize the bacterial spatial

organization in complex emulsified systems. Both matrix viscosity and bacterial surface
hydrophobicity were shown to affect the S. aureus spatial distribution in cosmetic
matrices. The method could be used to quickly determine the ability of a formula to
allow or not regular bacterial distribution and thus to classify cosmetic matrices upon
this parameter. This will be helpful for increasing the reliability of challenge-tests by
adapting the sampling plans to the class of matrices. The proposed M-CLSM
methodology could also be used to analyze spatial patterns of microbial contamination
in food matrices or medical functional biogels.

Acknowledgments

The zeta potential measurements were performed at the DIVVA platform (AgroSup
Dijon, Université de Bourgogne–Franche-Comté. We thank Elena Exposito-Garcia and
Aurelie Trainoy (Laboratoires CLARINS) for their expertise in cosmetic formulation and
Julien Deschamps (INRAE, Micalis Institute) for his support in the CLSM analyses.

Conflict of interest

This study has received raw materials and funds from Laboratoires CLARINS. V. Poulet
and C. Ngari are employed by the company Laboratoires CLARINS. The remaining
authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial
relationships.

99
 CHAPITRE III :

Évaluation et prévision de l’action

antimicrobienne dans les formules

cosmétiques

100
I - Synthèse de l’étude

Pour assurer la sécurité microbiologique des produits cosmétiques, plusieurs stratégies

de conservation peuvent être mises en place. L’une des plus courantes consiste en
l’utilisation de conservateurs qu’ils soient synthétiques ou naturels. Comme présenté
précédemment, l’évaluation de la conservation d’une formule cosmétique est
généralement effectuée par un challenge-test, réglementé par la norme NF EN ISO
11930. Cependant, les challenge-tests sont chronophages et requièrent une grande
mobilisation des opérateurs en laboratoire. De plus, le dénombrement bactérien sur
milieux gélosés de microorganismes spécifiques inoculés dans la formule devant être
réalisé à 7 jours, 14 jours puis 28 jours, il faut alors attendre environ 30 jours au total
pour obtenir une validation de l’efficacité de la conservation d’une formule. C’est dans
ce contexte que nos travaux ont eu pour objectif de mettre au point une méthode
rapide d’évaluation de la capacité de protection d’une formule. Cette méthode est
basée sur l’enregistrement de l’évolution de la population bactérienne dans la formule
sur un temps court par MCBL et sur la prévision de la régression bactérienne après
plusieurs jours, grâce à l’utilisation de modèles primaire et secondaire d’inactivation
bactérienne. Cette méthode permet ainsi d’évaluer et de comparer le comportement
des conservateurs dans des matrices complexes. Ce travail fait l’objet d’un article
intitulé « Rapid assessment and prediction of preservative efficiency in cosmetic
products using HCS-CLSM ».

Afin de suivre l’inactivation bactérienne sur des temps courts, une suspension de
S. aureus a été inoculée selon les spécifications du challenge-test dans des matrices
cosmétiques modèles formulées avec différentes concentrations de conservateurs.
Deux conservateurs ont été testés : la chlorphénésine ou 3-(4-chlorophenoxy)-1,2-
propanediol et l’alcool benzylique. La base modèle émulsionnée de forme huile dans
eau (h/e) utilisée dans cette étude est composée de 20 % de phase grasse et de 80 %
de phase aqueuse (20/80 h/e%), ce qui est représentatif de la plupart des produits
cosmétiques de type crème ou lait. Cette matrice modèle a été choisie car la
distribution spatiale des bactéries y est homogène.

Grâce à l’utilisation d’un marqueur de viabilité fluorescent, la calcein-AM, il a été

possible de suivre l’augmentation de la mortalité bactérienne, corrélée à la perte de
fluorescence, au cours du temps grâce à un module de MCBL appelé HCS pour « High
Content Screening » ou criblage à haut débit (CHD). Ce module permet de programmer
automatiquement la platine du microscope où se trouve l’échantillon préalablement

101
déposé dans une microplaque, pour passer automatiquement de puits en puits à des
intervalles spécifiés et ce jusqu’à 17h en continu. C'est un réel avantage pour éviter le
photoblanchiment. Une fois les images acquises, les images sont traitées et analysées
par une macro automatique créée sous ImageJ afin d’extraire le nombre de bactéries
comptées sur chaque image. Nous avons alors pu vérifier que le dénombrement des
bactéries dans une formule cosmétique par « HCS-CLSM » était corrélé avec leurs
dénombrements sur milieux gélosés pour un niveau de population supérieur au seuil
de détection de la technique de microscopie (6 x 106 bactéries/g). Grâce à ces valeurs
de dénombrements, nous avons alors obtenu les cinétiques d’inactivation bactérienne
pour chaque concentration de conservateur. Le temps de réduction logarithmique a
ensuite pu être calculé pour chaque concentration de conservateur grâce à l’application
d’un modèle linéaire d’inactivation sur les cinétiques. Puis, nous avons pu modéliser
l’effet de la concentration sur le temps de réduction décimale grâce l’application de
deux modèles semi-log, dérivés de celui de Mafart et al. (2001) et ayant des paramètres
de forme différents.

Par la suite, nous avons cherché à prédire le nombre de réductions logarithmiques qui
seraient obtenues sur des temps longs (jusqu’à 7 jours). Pour cela, grâce au modèle
secondaire le plus pertinent, nous avons calculé le temps de réduction décimale
correspondant à chacune des concentrations de conservateurs testées. Puis nous avons
appliqué deux modèles primaires d’inactivation, le modèle linéaire de Bigelow et le
modèle non-linéaire IQ pour calculer le nombre de réductions décimales attendues à
des temps longs (1-7 jours) pour chaque concentration. Nous avons alors comparé les
valeurs de régressions prédites avec les valeurs réelles obtenues par dénombrements
sur milieu gélosé, et nous avons constaté que le modèle IQ s’ajustait mieux que le
modèle linéaire à nos données expérimentales, avec une différence moins marquée
pour l’alcool benzylique. Le paramètre caractéristique du modèle IQ, le coefficient Q,
donne une indication du niveau d’inhibition ou « quenching » du conservateur dans la
matrice (Lambert and Johnston 2000). Ainsi, il s’avère que la chlorphénésine subit une
perte d’efficacité non négligeable par « quenching » dans la matrice, ce qui n’est pas
le cas de l’alcool benzylique.

Ainsi, cette étude permet de proposer une méthode automatisée et rapide par « HCS-
CLSM », permettant d’évaluer et de prédire l’action antimicrobienne des conservateurs
ainsi que leur comportement dans des formules cosmétiques émulsionnées.

102
II - Article 2 « Rapid assessment and prediction of preservative efficiency in cosmetic products using High Content Screening – Confocal Laser Scanning Microscopy »

« Rapid assessment and prediction of preservative efficiency in cosmetic products

using High Content Screening – Confocal Laser Scanning Microscopy »

Running title: Assessment and prediction of preservative efficiency by HCS-CLSM

Samia Almoughrabiea, Chrisse Ngarib, Laurent Guillierc, Romain Briandeta, Valérie

Pouletb, and Florence Dubois-Brissonneta#
a
Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Micalis Institute, 78350 Jouy-en-Josas,
France
b
Laboratoires Clarins, 5 Rue Ampère, 95300 Pontoise, France
c
ANSES, Agence nationale de sécurité de l’alimentation, de l’environnement et du
travail, Direction de l’évaluation des risques, 94700, Maisons-Alfort, France

1 - Abstract

Most cosmetic products are susceptible to microbiological spoilage due to

contaminations during manufacturing or consumer use. Their composition must
guarantee efficient bacterial inactivation all along with the product shelf life which is
assessed by challenge-tests. These consist in inoculating specific bacteria,
including Staphylococcus aureus, in the formula and in investigating the bacterial log
reduction over time. The main limitation of this method is relative to the time-
consuming protocol and the necessary delay for obtaining results (30 days). In this
study, we proposed a rapid alternative method coupling High Content Screening -
Confocal Laser Scanning Microscopy (HCS-CLSM), image analysis and modeling. It
consists in acquiring real-time S. aureus inactivation kinetics on short-time periods
(typically 4h) and in predicting the preservation efficiency of preservatives on longer
scale periods (up to 7 days). The action of two preservatives, chlorphenesin and benzyl
alcohol, against S. aureus was first characterized at several concentrations in a cosmetic
matrix. From these datasets, we compared two secondary models to evaluate the
logarithm reduction time (Dc) for each concentration of preservative. Furthermore, we
predicted the log reductions for up to 7 days using two primary inactivation models
and compared them to the observed log reductions. The IQ model better fits datasets
and the Q value gives information about the matrix level of interference.

103
Keywords: bacterial inactivation; model; cosmetic matrix; preservative; fluorescence;
CLSM.

2 - Introduction

Each year around the world, official authorities in Europe (Rapid Alert System for Non-
Food Products) or USA (US Consumer Product Safety Commission) notified many
recalls of cosmetic products due to microbiological contamination (SGS 2020; Lundov
and Zachariae 2008; ANSM 2020). Cosmetic formulas are complex and are susceptible
to microbiological spoilage due to their composition rich in water and nutrients such
as lipids, polysaccharides, proteins…(Herrera 2004). They can be contaminated during
their fabrication but also because of consumer’s repetitive manipulation. The main
pathogens frequently found in cosmetic formulas are Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Burkholderia cepacia, Candida albicans,
Klebsiella oxytoca, Enterobacter gergoviae, and Serratia marcescens (Lundov et al.
2009; Hugbo et al. 2005; Lundov and Zachariae 2008; Halla et al. 2018). S. aureus has
been found in various cosmetic products such as shaving cream, moisturizing cream,
face care cream and depilatory cream (Birteksoz Tan et al. 2013; Tran et al. 1994;
Campana et al. 2006). It is a Gram-positive bacteria present on human skin and mucous
membranes in 30% of the population (Ryu et al. 2014). Many S. aureus strains produce
exfoliative toxins secreted on the skin that cause a wide range of clinical infections,
including abscesses, furuncles or impetigo (Findley and Grice ; Lowy 1998; Tong et al.
2015; Bukowski et al. 2010).

Each cosmetic product has a different level of microbiological risk according to the
standard ISO 29621:2017, which depends on several parameters such as the formula
composition (preservative, ethanol, aw, pH) or the type of packaging (unidose, airless
pump, pots) (Berthele et al. 2014). Preservatives that can be used in cosmetic products
are listed in Annex V of the European Regulation No. 1223/2009. Among them are
listed chlorphenesin and benzyl alcohol, which have been tested in this study.
Chlorphenesin or 3-(4-chlorophenoxy)-1,2-propanediol is an antifungal and
antibacterial agent (active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria). It
can be used at a maximum concentration of 0.32% in rinse-off products and up to 0.30
% in leave-on products (Johnson et al. 2014). Benzyl alcohol can be used in various
cosmetic formulations as a preservative, but also as a solvent, a fragrance or a viscosity
controlling agent. Its maximum in-use concentration is 1% (Nair 2001).

104
The preservation efficiency of a given product is evaluated by proceeding to a
challenge-test, as defined in the European standard EN ISO 11930:2019. During this
procedure, specific microorganisms including S. aureus, are inoculated in the product
at a final concentration between 1 x 105 and 1 x 106 CFU.ml-1 for bacteria, and 1 x 104
and 1 x 105 CFU.ml-1 for molds or yeast. After inoculation, the microbial population is
evaluated at defined time intervals by enumerating the survivors at 7, 14 and 28 days.
A preservative system is considered as efficient against bacteria if the formula
composition leads to a bacterial logarithm reduction ≥ 3 seven days after inoculation
and without the growth of bacteria after 14 and 28 days. Challenge-test, as described
in the European standard involves numerous steps including sampling, neutralization,
serial dilutions, bacterial plating in duplicate, incubation time and colony counting. The
reliability of challenge-tests can depend on several parameters such as the
manipulation errors (pipetting and serial dilutions) (Hedges 2002), the type of plating
method (spiral or pour plating), the level of bacterial enumeration (Augustin and Carlier
2006), and on the ability of stressed microorganisms to recover and growth on agar
plates (Stephens and Mackey 2003). It also relies on the efficiency of the neutralization
step which consists of stopping the antimicrobial activity of preservatives by diluting
the surviving population in a quenching solution (Johnston et al. 2002). Nevertheless,
the main limitation of the challenge-test procedure is relative to the time-consuming
protocol (inoculation, sampling, counting) and to the duration of the whole test (last
sample analyzed on day 28).

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) allows in-situ 3-D visualization of

microbial consortia thanks to various fluorescent markers. It is commonly used to
investigate complex microbial spatial organizations such as biofilms (Bridier et al. 2010),
to analyze interactions between bacteria and oil droplets (Dorobantu et al. 2004) to
evaluate bacterial distribution in food systems (Doherty et al. 2010; Auty, Gardiner, et
al. 2001; Jeanson et al. 2011). Moreover, CLSM was previously used to study the
spatiotemporal action of biocide in biofilms (Davison et al. 2010; Bridier et al. 2010;
Bridier et al. 2011; Karampoula et al. 2016; Takenaka et al. 2008). This method enables
a real-time and in situ visualization of the bacterial inactivation kinetics after biocide
addition. Typically, alive cells are stained with an esterasic viability marker, such as cFDA
or calcein-AM, and after subsequent biocide addition, the fluorescence is lost due to
the leakage of the fluorescent marker out of the cell when the cell membrane is altered.

105
In this study, we used CLSM and image analysis for acquiring datasets of bacterial
inactivation kinetics upon a very short period (4h) in model cosmetic matrices
containing various concentrations of preservatives and intended to accurately predict
the number of bacterial log reductions on longer periods similar to challenge-test
times.

3 - Materials and Methods

3.1 - Chemicals and materials

Cetearyl glucoside and glyceryl stearate were purchased from SEPPIC (Puteaux, France),
carbomer from Gattefossé (Lyon, France), glycerin from Oleon (Ertvelde, Belgium),
cetearyl isononanoate from BASF France (Lyon, France), tocopheryl acetate from DSM
(Heerlen, the Netherlands), tromethamine from Azelis (Heusden, Belgium),
chlorphenesin and benzyl alcohol from Thor (Compiegne, France). Eugon LT 100
supplemented broth was purchased from Indicia production (Saint Genis l’Argentière,
France).

3.2 - Bacterial strain and culture conditions

The strain used in this study is Staphylococcus aureus CIP 4.83 recommended by the
EN ISO 11930:2012 standard for cosmetic-product challenge tests. It was stored in
cryovials at -80°C and resuscitated by two successive subcultures in tryptic soy broth
(TSB, Biomérieux, Marcy-l’étoile, France) before each experiment. Cultures were grown
at 30°C until the end of the exponential growth phase.

3.3 - Preparation and characterization of the emulsified model matrix

The aqueous phase was first prepared with 0.25% carbomer in water and heated to
75°C before glycerin (moisturizer, 9%) was added. The oil phase is composed of 28.8%
cetearyl isononanoate (emollient), 3.5% cetearyl glucoside (emulsifier), 0.2% tocopheryl
acetate (antioxidant), and 2.5% glyceryl stearate (co-emulsifier). It was heated to 75-
80°C before it was blended with the aqueous phase (20/80 o/w %) at 1,800 rpm using
a rotor-stator homogenizer (Rayneri 33/300P, Group VMI) to obtain an emulsion.
Benzyl alcohol and chlorphenesin at 7 different concentrations (respectively from 1.00
to 1.85 % and from 0.30 to 0.60 %) were respectively pre-mixed with glycerin or water
at 40°C. Tromethamine (base, 0.15%) was finally added. The viscosity is measured using
a penetrometer (PNR10, PetroMesures). A specific cone was released in 300 g of matrix

106
and the penetration depth measured (in mm ± 0.1 mm) after 5 s. The penetrometry
measured on each batch in triplicate is 33.06 mm ± 1.33 mm. The pH, measured using
pH-meter (SI Analytics, Lab 870) on each batch in triplicate, is 5.76 ± 0.03.

3.4 - Bacterial staining and matrix inoculation

Bacterial cells were harvested by centrifugation at 1,575 g for 10 min and washed twice
in 150 mM NaCl. The bacterial suspension was calibrated to 1 x 1010 to 1 x 1011 CFU.ml-
1
in 150 mM NaCl to observe at least 10-100 bacteria per CLSM image (290.6 x 290.6 x
1.6 µm3). 300µl of bacterial suspension were labeled with 13µl calcein-AM (53.55µM in
DMSO, Invitrogen by Thermofisher Scientific), incubated in the dark for 1h30 at 37°C
and inoculated in 30 g of model cosmetic matrix which was vortexed for 30 s. The
average of the bacterial concentration in the matrix is 1 x 108 to 1 x 109 bacteria/g.
Calcein-AM is a viability marker that penetrates passively into a cell where it is cleaved
by cytoplasmic esterases and leads to green fluorescence. Each experiment was
performed respectively two or three times from independent cultures for benzyl
alcohol and chlorphenesin.

3.5 - Enumeration of the bacterial population by drop-plate method

For each enumeration, 1 g of inoculated matrix was dispersed in 9 ml of neutralization

solution (Eugon LT 100 supplemented broth). After 30 minutes, the bacterial population
is enumerated by serial dilution in 150 mM NaCl on tryptone soya agar (TSA,
Biomérieux) using the drop-plate method (Chen et al. 2003). Plates were incubated at
30°C for 24 to 48 h before counting. Bacterial enumeration is processed every twenty
minutes for four hours after inoculation and then at least once every day until seven
days. Each enumeration was performed at least in duplicate.

3.6 - Acquisition of bacterial inactivation curves by High Content

Screening - Confocal Laser Scanning Microscopy (HCS-CLSM)

The evolution of bacterial population was acquired upon a short time (typically 4h) for
7 different concentrations in duplicate for benzyl alcohol and in triplicate for
chlorphenesin. To obtain one inactivation curve, the inoculated matrix containing a
specific concentration of a preservative was dropped into several wells of polystyrene
96-well microtiter plates (Greiner Bio-One, France) and CLSM acquisition was achieved
in each well at a specific time to avoid photobleaching. Thanks to the HCS- CLSM, the

107
stage was programmed to move automatically to the next well every 15 min during 4h
or every hour during 13h for low concentrations.

Image acquisition was performed using a Leica SP8 AOBS Confocal Laser Scanning
Microscope (Leica Microsystems, France) at the MIMA2 imaging platform
(https://doi.org/10.15454/1.5572348210007727E12). Calcein-AM is excited at 488 nm
and the emitted fluorescence collected in the range 498 to 560 nm. Images size were
290.6 x 290.6 x 1.6 µm3 (512 x 512 pixels) and were acquired at 600 Hz using a 40x air
objective (N.A. = 0.85) and a hybrid detector. The HCS-CLSM control software was
programmed to take a mosaic of 10 x 10 images per well, corresponding to a volume
of 1.3 x 10-5 ml. The number of bacteria by mosaic was counted by binarizing each
image using the MaxEntropy algorithm in an automatic macro executed in ImageJ
software (National Institutes of Health, USA) (Schneider et al. 2012). The obtained
number of bacteria per ml was converted per g according to the matrix density (1.15
g/ml). In our experimental conditions, we consider that our threshold value is at 1
bacteria per image or 100 bacteria per mosaic, which corresponds to 6 x 106 bacteria/g.

3.7 - Primary models for bacterial inactivation

Two different models were used to describe the inactivation of the bacterial population
as a function of time. The log-linear model of Bigelow et al. (Bigelow and Esty 1920) is
described in equation (1).
'
/.J3% (@) = /.J3% (@% ) − (4 (eq.1)

where N0 is the initial bacterial population, N is the bacterial population at the sampling
time, Dc is the decimal reduction time and t is the time (min).

The intrinsic quenching model (Lambert and Johnston 2000) was constructed with the
hypothesis that the disinfection concentration decreases during the test period and
can be described by the equation (2).
53&6 -..! 7
/.J3% (@) = /.J3% (@% ) − 8.(0
(eq.2)

where N0 is the initial bacterial population, N is the bacterial population at the sampling
time, Dc is the decimal reduction time, t is the time (min) and Q is the quenching
coefficient. Q was the estimated parameter.

Both log-linear and IQ models were used to predict the reduction of the bacterial
population on longer periods (up to 7 days).

108
 3.8 - Secondary model for estimation of the Dc-value according to the
concentration

We fitted the log-linear model fitted to each CLSM inactivation curve, with GinaFiT, a
freeware add-in for Microsoft Excel (Geeraerd et al. 2005), and we obtained the
corresponding Dc values. We applied a factor of correction to Dc according to the
correlation between CLSM enumeration and plate enumeration. We obtained a dataset
of Dc, each of them corresponding to a specific concentration of one preservative.

From these datasets of Dc, the Dc values were fitted according to concentration using
a semi-log approach, derived from Mafart et al. (2001) (Mafart et al. 2001), and
expressed in equation 3.
;&; ∗ <
/.J3% (K1) = /.J3% (K1 ∗ ) − G -0
I (eq. 3)

where Dc is the decimal reduction time for the concentration C, Dc* is the decimal
reduction time for the reference concentration C*, zc is the increase of concentration
which leads to a ten-fold reduction of the decimal reduction, n is a shape parameter
which can be set to 1 (model #1, linear model) or 2 (model #2, second-degree model).
Dc* and zc were the estimated parameters.

The model parameters were fitted with nls R function according to the minimization of
the residual sum of square errors (RRS). Confidence intervals of fitted parameters were
assessed by bootstrap using nlsBoot function from nlsMicrobio R package (Baty et al.
2015). The two models were compared according to the Bayesian information criterion
(BIC) (equation 4). The lower the BIC, the better the model fits the dataset.
=>>
LMN = 6. OP G $
I + R. OP(6) (eq. 4)

Where p is the number of experimental points and k the number of parameters of the
model.

3.9 - Prediction of the log-reduction of the bacterial population over a

period of several days

To predict the log reduction of the bacterial population over several days, we first
predict Dc with model #2 at some tested concentrations of preservative. Afterward,
thanks to primary models, namely log-linear model (eq 1) or IQ model (eq 2), we
calculated the logarithm reduction of the population that should be obtained after a
defined time, from 1 to 7 days. To optimize and validate the model, a dataset of log-
reductions of the bacterial population was acquired by plate enumeration on the

109
corresponding periods (1 to 7 days) for 7 concentrations of each preservative, as
described before.

The model parameters were fitted with nls R function according to the minimization of
the residual sum of square errors (RRS). Confidence intervals of fitted parameters were
assessed by bootstrap using nlsBoot function from nlsMicrobio R package (Baty et al.
2015).

4 - Results

4.1 - Correlation between enumeration by CLSM and plate counting

Model cosmetic matrices were formulated with different concentrations of

chlorphenesin or benzyl alcohol. Bacterial enumeration of S. aureus was achieved at
several contact times (between 10 min and 4h) by both plate counting (log CFU/g) and
CLSM enumeration (log bacteria/g). Figure 25 gives the relationship between both
techniques. The relationship between both techniques is linear (y =1.530x – 5.342; R2
= 0.907) for a level of population over the detection threshold of the technique (6 x 106
bacteria/g).

Figure 25 : Correlation between bacterial enumeration by plating (log10 CFU/g) and

bacterial enumeration by CLSM imaging (log10 bacteria/g).

4.2 - Inactivation of S. aureus according to the concentration of the

preservative

Figure 26 shows the kinetics of bacterial reduction obtained by CLSM during four hours
for seven different concentrations of chlorphenesin (Figure 26A) or benzyl alcohol

110
(Figure 26B). According to the correlation between enumeration by CLSM and plate
counting (Figure 25), we only took into account data in the range of population above
6 x 106 (maximum 2.5 log10 reductions).

Figure 26 : S. aureus inactivation kinetics obtained by HCS-CLSM in cosmetic model

matrices with several concentrations of chlorphenesin (A) and benzyl alcohol (B).
Example of the loss of bacterial fluorescence assessed by HCS-CLSM over time for two
concentrations of chlorphenesin (C).
The higher the concentration of preservative, the higher the slope of inactivation and
the lower the Dc. For chlorphenesin, 0.3% is the smallest concentration for which Dc is
measurable (17.89 h ± 1.12) on a CLSM kinetics (maximum 17h). For the range between
0.40 and 0.50%, Dc varies between 10.05 h ± 0.44 and 3.55 h ± 1.04. For the range
between 0.55 to 0.60%, Dc varies between 1.48 h ± 0.10 and 0.45 h ± 0.07. For benzyl
alcohol, Dc for the smallest concentration 1% is 28.09 h ± 7.50. From 1.5% Dc
increasingly decreases to reach 1.07 h ± 0.05 at 1.85 %.

111
To obtain similar log reductions of S. aureus with both preservatives, it can be noted
that higher concentrations of benzyl alcohol are needed in comparison to
chlorphenesin. For example, we obtained one log reduction in 0.45 h ± 0.07 with 0.6%
chlorphenesin whereas 1.07 h ± 0.05 is necessary with 1.85% benzyl alcohol. Figure 26C
illustrates the fluorescence loss of S. aureus in a model matrix with 0.3% and 0.6%
chlorphenesin over time. With 0.3% chlorphenesin, the number of fluorescent bacteria
decreases very slowly over time. At 4 h, the slight decrease of fluorescent bacteria
number corresponds to a bacterial reduction of about 0.2 log bacteria/g (Figure 26A).
In contrast, with 0.6% chlorphenesin, the fluorescent bacteria number decreased
rapidly in 1h and it corresponds to about 5 x 102 bacteria/g (Figure 26A). After 2h, no
bacteria was visible anymore.

4.3 - Estimation of Dc value according to the preservative concentration

Semi-log models were used to fit datasets of Dc values upon the preservative
concentration. The shape parameter was set at 1 in model #1 (linear-model, Figure 27
A and C) or model#2 (second-degree model, Figure 27 B and D).

Figure 27 : Relation between the Dc value and the concentration of chlorphenesin (A,
B) and benzyl alcohol (C, D) by fitting of model#1 (A and C) and model#2 (B and D).

Model parameters of the two models, which are Dc* and zc, are given in Tableau 9
together with the BICs for both preservatives. Second-degree model allows the lowest
BIC for both preservatives, meaning that the shape parameter is significant.

112
Accordingly, to the BIC, model #1 does not fit well and was not used for the following
prediction.
Tableau 9 : Estimated parameters (and their 95% CI intervals) and performance criteria
of both secondary models.
Chlorphenesin Benzyl alcohol

model#1 model#2 model#1 model#2

n 1 2 1 2

Number of data 21 21 14 14

C* 0.25 0.25 0.95 0.95

1.96 1.54 1.98 1.65
log (Dc*)
[1.76-2.16] [1.47 – 1.62] [1.70 – 2.22] [1.44 – 1.78]
0.18 0.27 0.51 0.71
zc
[0.15-0.21] [0.26 – 0.28] [0.41 – 0.65] [0.64 – 0.79]
RSS 0.76 0.20 0.72 0.60

BIC -63.49 -91.48 -36.22 -38.86

4.4 - Prediction of bacterial log reduction on long periods

Dc values at specific concentrations were first estimated from model #2. The logarithm
reduction of the bacterial population was then calculated for specific times (from 1 to
7 days) using the Bigelow linear-model (eq. 1) or the IQ model (eq. 2).

Figure 28 presents the relationships between predicted and experimental bacterial

reductions.

Figure 28 : Correlation between the observed bacterial log-reductions and the

predicted ones using Bigelow linear-model (white dots) or IQ model (black dots) for
chlorphenesin (A) and benzyl alcohol (B).

113
For both preservatives, the best combination is obtained when using IQ model for log-
reduction estimation. For chlorphenesin (Figure 28A), the IQ model prediction for log-
reduction datasets is far better than the linear model. The Q coefficient is optimized at
0.0141 (CI 95% 0.0124 – 0.0156) and the slope of regression curve is 1.12 (R2=0.906).
Linear models is less relevant with a slope around 0.55 and lower R2. For benzyl alcohol
(Figure 28B), predictions with both models are less different. The Q coefficient is
optimized at 0.0043 (CI 95% 0.0022 – 0.0076) and the slope of the regression curve
with the IQ model is 0.93 (R2=0.796). One could note that the prediction is relevant
only for maximum 5 log-reductions because of the initial level of contamination and
the experimental protocol used to obtain the observed datasets. Figure 29 shows the
prediction of the evolution of bacterial enumerations over seven days for 4 tested
concentrations of chlorphenesin (Figure 29A) or benzyl alcohol (Figure 29B) with
Bigelow linear-model (dotted lines) or IQ model (plain lines). These curves could be
generated for any concentrations in the range of 0.3 to 0.6 % of chlorphenesin and 1
to 1.9 % for alcohol benzyl from model #2 and IQ model with respective Q to 0.014 for
chlorphenesin and 0.003 for benzyl alcohol.

Figure 29 : Illustration of the possible prediction of the evolution of the bacterial

population over seven days for four concentrations of chlorphenesin (A) or benzyl
alcohol (B) with Bigelow linear-model (dotted lines) or IQ model (plain lines).

5 - Discussion

Challenge-tests are necessary to assess the efficiency of preservation in cosmetic

products. Nevertheless, the procedure of the challenge-test is time-consuming due to
the numerous enumerations by plate-counting necessary and to the results that are
available only 48h after the last assessment point (day 28). By consequence, the
challenge-test method lacks reactivity and flexibility for optimizing the preservation of

114
a formula. In this study, we propose a new alternative method allowing the prediction
of the log reduction of a bacterial population in long-term preservation by acquiring
data on a short-time period. This method relies on the acquisition of CLSM kinetics of
bacterial inactivation in the presence of several concentrations of preservatives during
4h (and till 13h for very low concentrations). Bacteria are first stained with a viability
fluorescent marker, calcein-AM. This marker is widely used to assess bacterial viability
by CLSM or by flow cytometry (Chitarra et al. 2006; Davison et al. 2010). Its precursor
diffuses passively into the cytoplasm, where it is cleaved by intracellular esterases into
green-fluorescent calcein (Kaneshiro et al. 1993). This non-permeant fluorescent dye is
released out of the cell when the membrane is altered (dead cell).

We have first shown that the enumeration obtained by CSLM and dedicated image
analysis can be correlated to bacterial plate-counting during the action (10 min to 4h)
of the preservative (chlorphenesin or benzyl alcohol at specific concentrations). Our
detection threshold by CLSM imaging is 6 x 106 bacteria/g which is lower than the one
obtained by CLSM by Auty et al. (Auty, Gardiner, et al. 2001) (1 x 108 bacteria/ml). This
is probably because we increased the observed surface to a mosaic of 100 CLSM
images. Here, bacterial CLSM enumeration is always higher (between 0.5 and 1 log)
than the enumeration by plate counting. Auty et al. (Auty, Gardiner, et al. 2001) also
compared enumeration by CLSM and plate counting before they assess the viability of
human probiotic strains in dairy products. They used Live/Dead Baclight marker and
also underlined an overestimation of the CLSM enumeration of about 1 log. They
suggested that this might be due to the bacterial clumping on plates. Indeed, the
accuracy of enumeration by plate counting is usually estimated in the range of 0.3 to
0.7 log (Augustin and Carlier 2006; Afssa 2007). However, we can notice that the
difference between both techniques gets higher when enumeration decreases. Lower
enumerations correspond to populations that remain after action of the preservative.
The stressed bacteria thus probably constitute a higher fraction of the population. They
could not have the ability to recover and growth on agar plates while they are still
stained by the viability marker by CLSM (Stephens and Mackey 2003).

We used CLSM enumeration technique to follow the action of two preservatives at

different concentrations in model cosmetic matrices. The bacterial inactivation kinetics
was assessed by acquiring the calcein-AM loss of fluorescence for the order of a few
hours. These acquisitions were only possible thanks to the HCS-module of the CLSM.
The automated high content screening (HCS) system is an emerging software solution

115
that allows a CLSM to acquire automatically high content images for analysis of
numerous samples thanks to an automatically xyz-positioning in multiple wells as a
function of time (Canette et al. 2019). Automatic movements from well to well allows
to acquire images of one same sample over time using several wells which allows to
lighten a specific well only once. This is a real advantage to avoid photobleaching.
Moreover, we can also investigate several preservative concentrations on the same
lapse of time.

The CLSM method used during this study is very well suited to evaluate the efficiency
of preservatives that cause membrane permeabilization. Chlorphenesin is a phenol
ether with a chlorine atom and it belongs to the class of organo-halogen organic
compounds. Phenols disrupt the cytoplasmic membrane and induce leakage of
potassium ions of the cytosol and the halogenation is known to improve their
antibacterial activity (Al-Adham et al. 2013). Benzyl alcohol is an organic aromatic
alcohol. Alcohols are known to damage cell membranes and denature bacterial
proteins that are essential to the metabolism cell which leads to the cell lysis (Al-Adham
et al. 2013).

Chlorphenesin seems to be more effective than benzyl alcohol against S. aureus in the
model cosmetic matrix. We observed that obtaining the same logarithm reduction
needed lower concentrations of chlorphenesin than benzyl alcohol. According to the
literature, the partition coefficient (logP) can be a parameter influencing bacterial
inactivation (Pernin et al. 2018). The higher the logP, the higher the antibacterial
activity. Chlorphenesin could have a better ability than benzyl alcohol to intercalate
into the bacterial membrane of S. aureus because its logP is higher (1.713) than the
one of benzyl alcohol (1.100) (The Good Scents Compagny information system ; The
Good Scents Compagny information system).

In this study, we were able to predict the number of log reductions at any time for one
preservative at any concentration in a specific range from inactivation datasets
obtained over short-term times. We fitted the datasets with two models describing the
effect of the concentration on the log reduction time. These models derived from
Mafart models (Mafart et al. 2001) can take several forms by setting the shape
parameter at 1 (linear model#1) or 2 (second-degree model#2). Mafart et al. (2001)
compared these two first semi-log models for describing the effect of pH on the heat
resistance of spores (reduction time DT) and showed that second-degree model
presents a better safety than the linear one. From our side, we used the BIC calculation

116
for choosing the most relevant model while adjusting the minimum number of
parameters. BICs of models#2 are better than model#1 for both chlorphenesin and
benzyl alcohol (Tableau 9). The linear model is thus discarded for the following
prediction. This indicates that the preservative concentration and the contact time do
not have a similar impact on the reduction time. As noticed by Mafart et al. (2001) for
the effect of pH on the resistance of spores, we can hypothesize that the relationship
between Dc and the preservative concentration is more complex than that of the effect
of temperature on heat resistance. We have also tried log-log Chick-Watson and Hom
models used by Lambert et al. (2001) to model the relationship between effective time
and concentration of quaternary ammonium compounds (data not shown). These
models badly fitted to our datasets and were not selected for the following predictions.

The next step was to predict, from the Dc values calculated with model#2, the log
reduction of the bacterial population on longer times (up to seven days) using two
primary models, the Bigelow linear model and the IQ model. The Q coefficient is the
characteristic parameter of the IQ model. It indicates the level of quenching of the
preservative in the matrix (Lambert et al 2000). Below 0.005, which appears to be the
case of benzyl alcohol, the level of quenching is very low and the inactivation curves
are quite similar to linear log-survivor curves. On the contrary, the Q coefficient for
chlorphenesin is 0.014 which indicates a quenching of the preservative in the matrix.
The level of quenching increases over time as it is demonstrated by the comparison
between the predictions of linear-model and IQ models (Figure 29). As it is not similar
for both preservatives, we can hypothesize that it is influenced by the interactions
between the antimicrobial and the matrix. As the model cosmetic matrix used here is
an emulsion, we can hypothesize that chlorphenesin which has a higher log P (1.713)
than benzyl alcohol (1.100) could progressively partition into the hydrophobic droplets,
thus losing its preservative efficiency. Pernin et al. (2019) studied the antimicrobial
activity of two natural phenolic compounds, ferulic acid and eugenol, against Listeria
monocytogenes in a model oil-in-water emulsion. They showed that eugenol, which
have the highest logP, loses its antibacterial efficacy in emulsified systems, in contrast
of ferulic acid. The authors suggest that once in the emulsion, the more hydrophobic
antimicrobial agent would preferentially partition in the lipid droplets and thus being
in too small concentration in the aqueous phase for inhibiting microorganisms (Pernin,
Bosc, et al. 2019). Polarity, antimicrobial charge, and environmental conditions such as
temperature, ionic strength, and pH can also play a major role in the effectiveness of

117
an antimicrobial (Weiss et al. 2015). Electrostatic and hydrophobic interactions between
antimicrobials and the matrix constituents, such as lipids, proteins and charged
polysaccharides, could interfere with the antimicrobial activity (Weiss et al. 2015). For
example, the addition of bovine meat proteins decreases the antimicrobial activity of
phenolic compounds (Bouarab-Chibane, Forquet, et al. 2018; Juven et al. 1994). Some
gelling agents, such as hydroxypropylmethylcellulose, may be associated with the loss
of effectiveness of preservatives (Scholtyssek 2005). Emulsifiers can also participate in
the reduction of antimicrobial activity by sequestering antimicrobial molecules in
micelles (Kirk–Othmer 2013; Pernin, Bosc, et al. 2019; Shimamoto and Mima 1979).

Nevertheless, from the estimations of Dc with model#2 and then of the log-survivors
from IQ model, we propose here a method of prediction of the efficiency of two
preservatives. The log-reduction of S. aureus population could be estimated at any
concentration and after any time in a period of a few days for both tested preservatives.

This prediction is matrix- and preservative- dependent because the Q is characteristic

of the interactions between them. This method should be challenged for many other
couples of preservatives and matrices before it can be used for industrial prediction
purposes. Moreover, some other microorganisms should be tested besides S. aureus,
notably environmental strains isolated from contaminated cosmetic products. Indeed,
some strains could have efflux pumps that release the fluorescence outside the alive
bacteria and prevent cell visualization (Joux and Lebaron 2000). To limit these pump
interferences, it was suggested to add sodium azide in the staining solution (Joux and
Lebaron 2000) as used for the observation of biofilms (Bridier et al. 2011).
Unfortunately, we cannot add this molecule in cosmetic matrices because it could
modify the structure and composition of the formula. However, other impermeant
fluorescent dyes should be evaluated.

6 - Conclusions

We propose here a rapid HCS-CLSM method associated with modeling to predict the
preservative efficacy in a cosmetic matrix. This method could provide a quick evaluation
of preservative efficiency and save a lot of time by replacing many microbiological
analyses. It could be beneficially used for screening preservatives or for optimizing the
formulation of a cosmetic product.

118
Acknowledgments

We thank Elena Exposito-Garcia and Aurélie Trainoy (Laboratoires CLARINS) for their
expertise in cosmetic formulation, Julien Deschamps (INRAE, Micalis Institute) for his
support in the HCS-CLSM analyses and Roza Mohammedi (INRAE, Micalis Institute) for
her technical assistance during her internship.

Author contributions

Conceived and designed the experiments: SA FDB CN VP. Performed the experiments:
SA. Analyzed the data and performed the modeling: SA LG FDB. Contributed
reagents/materials: CN VP. Wrote or revise the manuscript: SA FDB RB CN.

119
 Discussion générale et perspectives
Une évaluation du système de conservation est systématiquement réalisée avant la
mise sur le marché d’un produit cosmétique grâce au challenge-test. Comme dit
précédemment, les challenge-tests présentent certaines limites notamment du fait de
la lourdeur des expérimentations et du délai d’obtention des résultats d’environ 1 mois.
De plus, la fiabilité de ces tests peut dépendre de différents facteurs notamment de la
galénique des produits et des nombreuses étapes dues aux dénombrements des
microorganismes sur milieux gélosés. C’est dans ce contexte que nous avons pu définir
l’objectif général de cette thèse qui est de mieux comprendre, d’évaluer, de prévoir et
d’optimiser le fonctionnement des systèmes conservateurs au sein de matrices
cosmétiques avec deux volets, le premier, visant à comprendre les déterminants de la
répartition des microorganismes dans les formules cosmétiques et leur impact sur les
Challenge-tests, et le deuxième, visant à mettre au point une méthode rapide
d’évaluation et de prévision de l’activité antibactérienne des conservateurs dans les
formules cosmétiques.

Le premier objectif de cette thèse a été d’identifier les déterminants de la distribution

spatiale des microorganismes dans les matrices cosmétiques émulsionnées de forme
huile dans eau (h/e). Il est en effet indispensable de s’assurer que la répartition des
bactéries est bien homogène dans la matrice pour que les résultats de challenge-test
soient fiables. Pour initier l’identification des déterminants de la distribution spatiale
des bactéries dans les matrices cosmétiques, nous avons tout d’abord testé la
distribution spatiale de Staphylococcus aureus dans diverses formules cosmétiques
commerciales de natures variées, en utilisant la microscopie confocale à balayage laser
(MCBL) associée à l’utilisation de marqueurs fluorescents. Nous avons ainsi identifié
certaines formules ne permettant pas une distribution homogène des bactéries. Par
analyse de la composition des formules et grâce à la fabrication de matrices modèles
de composition ajustable, nous avons pu préciser le rôle de la matrice (composition et
structure) et des propriétés de surface des bactéries dans la distribution spatiale des
bactéries en mettant en évidence deux facteurs clés : la viscosité des matrices et
l’hydrophobicité de surface des bactéries. Plus la viscosité augmente et/ou plus
l’hydrophobicité de surface bactérienne augmente, plus la distribution spatiale est
hétérogène.

120
Le deuxième objectif de cette thèse a été de mettre en place une méthode permettant
d’évaluer et de prédire l’efficacité des conservateurs dans les formules cosmétiques, ce
que nous avons pu faire en combinant l’acquisition de cinétiques d’inactivation
bactérienne par microscopie confocale à balayage laser et l’utilisation de modèles de
microbiologie prévisionnelle. La perte de viabilité a pu être suivie grâce l’utilisation d’un
marqueur de viabilité, la calcéine-AM, dont la fluorescence est libérée dans la cellule
par les estérases puis relarguée à l’extérieur après perméabilisation de la membrane
par l’agent antimicrobien. Il est intéressant de souligner qu’il est courant dans ce genre
d’analyse de faire face à des problèmes de photostabilité des fluorochromes. En effet,
chaque molécule fluorescente peut être excitée un nombre de fois précis avant sa
dégradation; par exemple, la fluorescéine peut subir environ 104 à 105 excitations,
sachant qu’en moyenne le passage du laser sur l’échantillon pour former un pixel d’une
image induit quelques centaines d’excitations (Brown and Poujol 2006). Afin de pallier
ce problème, nous avons utilisé un module appelé HCS (High Content Screening) ou
criblage à haut débit (CHD) associé à la MCBL, ce qui a permis le déplacement
automatique de la platine de puits en puits d’une plaque 96 puits (Canette et al. 2019).
Ce module permet ainsi l’acquisition de centaines d’images dans plusieurs puits
différents et à des intervalles de temps personnalisés limitant ainsi le phénomène de
photobleaching. Grâce aux traitements et à l’analyse d’images automatisés par une
macro-instruction créée sous « ImageJ », cette approche de microscopie nous a permis
d’acquérir des cinétiques d’inactivation bactériennes sur des durées courtes de 4 à 17h,
dans des matrices cosmétiques modèles formulées avec différents types de
conservateurs à différentes concentrations. Nous avons tout d’abord démontré qu’il
était possible par cette méthode « HCS-CLSM », de dénombrer les bactéries
directement dans une formule. À partir des données de cinétiques obtenues et
l’utilisation de modèles mathématiques d’inactivation bactérienne primaire et
secondaire, nous avons pu observer la réduction logarithmique au cours du temps et
modéliser l’effet de la concentration des conservateurs sur le temps de réduction
décimale. Nous avons ensuite pu obtenir la prévision, à partir de ces données obtenues
sur un temps court, de l’action antimicrobienne des conservateurs sur des temps plus
longs, équivalents à ceux testés lors des challenge-tests. De plus, grâce à l’utilisation
du modèle IQ, nous avons pu mettre en évidence un phénomène de « quenching » de
la chlorphénésine mais pas de l’alcool benzylique dans la matrice cosmétique. Cette
inhibition peut résulter d’interactions entre le conservateur et diverses autres matières
premières présentes dans la matrice (Chapitre I-IV-2).

121
Plusieurs perspectives s’ouvrent suite à ce travail et de nouvelles questions peuvent se
poser :

La méthode Mosaic-MCLB serait-elle utile à l’optimisation d’un nouveau protocole de

mélange des bactéries dans les matrices cosmétiques de forte viscosité ?

La méthode de caractérisation de la distribution spatiale que nous avons utilisé dans

cette étude est une méthode rapide permettant de classer les matrices cosmétiques
selon le niveau d’homogénéité du mélange bactéries-matrice obtenu suite au
protocole d’inoculation. Actuellement, la norme NF EN ISO11930 explicitant le
protocole à effectuer pour les challenge-tests stipule de « bien mélanger de façon à
obtenir une répartition homogène de l’inoculum » mais il ne décrit ni les conditions de
mélange (type d’homogénéisateur, vitesse, temps d’homogénéisation) ni la
méthodologie permettant de vérifier l’homogénéité de la répartition des
microorganismes dans la formule. Pour les formules cosmétiques les plus visqueuses,
cette étape cruciale peut interférer avec la bonne réalisation des tests d’évaluation de
la protection antimicrobienne. Il serait alors intéressant de mettre en place des moyens
plus efficaces de mélange des bactéries dans les matrices cosmétiques les plus
visqueuses. On pourrait par exemple utiliser un homogénéisateur de paillasse muni
d’un embout avec des palles à usage unique. Il est à noter que les systèmes d’agitation
ne doivent pas être trop violents car la structure émulsionnée doit être préservée. La
méthode proposée ici pourrait permettre de tester rapidement de nouveaux
protocoles.

La charge bactérienne a-t-elle un impact sur la distribution spatiale des bactéries dans
les matrices cosmétiques de forte viscosité ?

Du fait des caractéristiques des souches avec lesquelles nous avons travaillées, nous
n'avons pas pu évaluer l’impact de la charge des bactéries sur leur distribution spatiale.
L’étude mériterait donc d’être poursuivie par l’étude de ce facteur car d’autres études
ont montré que la charge pouvait jouer un rôle, notamment lorsque l’émulsifiant utilisé
a une charge opposée à celle de la surface des bactéries (Li et al. 2001; Ly, Naitali-
Bouchez, et al. 2006; Ly et al. 2008). Il serait alors intéressant de faire varier la charge
des conservateurs et des émulsifiants en analysant la répartition de microorganismes
ayant des charges différentes afin de comprendre les interactions possibles et
d’identifier celles qui peuvent être néfastes à la fiabilité des tests d’évaluation de
l’efficacité des conservateurs.

122
Comment approfondir la connaissance sur les interactions
matrice/conservateur/bactérie pour optimiser la conservation des formules
cosmétiques ?

L’association de la MCBL, du HCS et de la microbiologie prévisionnelle pourrait

permettre aux entreprises cosmétiques de gagner un temps non négligeable dans
l’évaluation de l’efficacité d’un système de conservation. La méthode HCS-MCBL
pourrait être une alternative ou être complémentaire aux challenge-tests. Cependant,
avant de pouvoir être utilisée à des fins industrielles, il serait pertinent de tester cette
méthode avec d’autres conservateurs ajoutés séparément puis ensemble afin
d’observer des effets synergiques ou antagonistes entre conservateurs. Il serait
également judicieux d’appliquer cette méthode dans d’autres matrices modèles
émulsionnées de compositions en phase grasse et en phase aqueuse différentes, ou
même avec des galéniques différentes, et à termes dans des formules cosmétiques plus
complexes de type industriel. De plus, grâce à l’utilisation du modèle IQ, il serait
intéressant de classer des couples de conservateur ou des couples de conservateur-
matrice selon leur coefficient Q afin de connaitre les couples compatibles ou
incompatibles et ainsi d’aider dans l’amélioration des systèmes de conservation.
Cette méthode pourrait également permettre de tester d’autres microorganismes que
ceux cités dans la réglementation cosmétique par exemple des souches
environnementales isolées des sites de fabrication ou de produits cosmétiques
contaminés, tels que Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca, Enterobacter gergoviae,
et Serratia marcescens (Lundov et al. 2009; Hugbo et al. 2005; Lundov and Zachariae
2008; Halla et al. 2018).

Quel est l’impact de l’hydrophobicité de surface des bactéries sur l’activité

antibactérienne des conservateurs ?

Il existe une grande variété d’agents antimicrobiens agissant sur différentes cibles
cellulaires des microorganismes telles que les membranes cytoplasmiques, les
systèmes enzymatiques, les acides nucléiques et les ribosomes. Une fois l’agent
antimicrobien dans la matrice, la surface externe des bactéries est la première barrière
rencontrée par les antimicrobiens (Maillard 2002). L’hydrophobicité d’un agent
antimicrobien dépend de la structure même de la molécule. Dans ce travail de thèse,
l’action de deux conservateurs, la chlorphénésine (logP(o/w) = 1,713) et l’alcool
benzylique (logP(o/w) = 1,100), a été étudiée sur une souche de Staphylococcus aureus.
D’après la littérature, le coefficient de partage (logP) permettant de déterminer si une

123
molécule est hydrophile (logP<0) ou hydrophobe (logP>0), peut être un déterminant
de l’efficacité antimicrobienne (Pernin et al. 2018). Jusqu’à un certain seuil, Plus le logP
est élevé, plus l'activité antibactérienne est élevée. La chlorphénésine ayant un logP
plus élevé que celui de l'alcool benzylique, elle aurait une meilleure capacité à
s'intercaler dans la membrane bactérienne de S. aureus (CIP 4.83) qui a de plus une
hydrophobicité de surface élevée (95% d’affinité avec l’hexadécane). Il serait intéressant
par la suite d’évaluer l’action antimicrobienne d’autres souches de S. aureus ayant des
niveaux d’hydrophobicité plus faibles, afin de déterminer l’impact de l’hydrophobicité
de surface des bactéries sur l’action des conservateurs. Il serait notamment judicieux
de tester les deux souches de S. aureus (ATCC 292312 et ATCC 27217) utilisées dans la
première partie de cette thèse pour l’étude de la distribution des bactéries (Chapitre
II).

Quel est l’impact de la concentration de l’inoculum bactérien sur l’efficacité des

conservateurs ?

Dans notre étude, nous avons inoculé les matrices cosmétiques à de fortes
concentrations bactériennes soit à 1 x 108 et 1 x 109 CFU/g de formule afin d’observer
suffisamment de bactéries par champ au microscope confocal à balayage laser. En
comparaison, les niveaux d’ensemencement lors des challenge-tests industriels selon
la norme ISO 11930 sont plus bas, à des niveaux de 1 x 105 et 1 x 106 CFU.g-1. Nous
pouvons ainsi nous poser la question de l’impact du niveau de concentration
bactérienne sur l’efficacité antibactérienne. Karabit (1990) a montré dans une étude sur
S. aureus que la concentration microbienne jusqu'à 1 x 106 bactéries.ml-1 n'affecte pas
l'activité antimicrobienne d'un conservateur de type phénol. Cependant, au-delà de
cette limite, le temps de réduction décimale augmente avec la concentration de
l'inoculum. Une autre étude a également montré qu'à partir de 1 x 107 bactéries.ml-1,
une augmentation de la concentration bactérienne entraine une réduction de
l’efficacité de la désinfection (Lambert and Johnston 2001). De plus, Johnston et al.
(2000) montrent que l’ajout de bactéries mortes dans une suspension vivante de
S. aureus influence l’efficacité antibactérienne d’un désinfectant, le sulfate de sodium
et de dodécyle (SDS) : plus la concentration de bactéries mortes est importante et plus
la valeur de la réduction logarithmique diminue. Par exemple, pour un ajout de 1 x 108
bactéries mortes/ml dans une suspension de 1 x 108 bactéries vivantes/ml, en présence
de SDS, il est observé une réduction logarithmique d’environ 1,5 log contre 5 log
lorsque 3.13 x 106 bactéries mortes/par ml sont ajoutées. Les auteurs font l’hypothèse

124
que les structures microbiennes (même non viables) seraient capables d’interagir avec
les antimicrobiens et de limiter leur efficacité. Ce serait le cas des composants
membranaires des bactéries mortes tels que la phosphatidyléthanolamine et les
triacylglycérols présents dans le milieu, du fait de leur structure similaire à celle des
agents émulsifiants tels que le tween et la lécithine utilisés comme agents neutralisants
(Johnston et al. 2000). Il serait alors intéressant de réaliser des acquisitions de
cinétiques bactériennes en faisant varier la concentration de l’inoculum afin d’évaluer
son impact sur l’efficacité des conservateurs dans les formules cosmétiques par
dénombrement bactériens sur milieux gélosés. Il sera probablement difficile d’utiliser
la méthode de MCBL développée ici à cause du seuil de détection, à moins d’analyser
un nombre de puits beaucoup plus élevé que celui utilisé dans ce travail afin
d’augmenter le volume d’échantillon observable.

Quel est l’impact de la composition des émulsions sur la distribution des conservateurs
dans les formules cosmétiques et sur leur efficacité ?

Pour être actifs, les conservateurs doivent être présents au contact des
microorganismes dans la phase aqueuse. Donsì et al. (2012) montrent par exemple,
que l’activité antimicrobienne de composés naturels d’huiles essentielles (cavacrol,
limonène et cinnamaldéhyde), est corrélée avec la concentration de la molécule active
dans la phase aqueuse (Donsì et al. 2012). Johnston et al. (2000) montre également que
plus la quantité de désinfectant (sulfate de sodium et de dodécyle) libre dans le milieu
diminue, plus le taux de réduction de la population bactérienne diminue (Johnston et
al. 2000). Dans le cas de matrices cosmétiques, il est possible d’émettre l’hypothèse
que la coexistence de plusieurs phases induise une distribution hétérogène des
conservateurs, ce qui pourrait alors induire des biais lors de l’évaluation de la
conservation par les challenge-tests. Il a été montré que les propriétés
d’hydrophobicité des molécules antimicrobiennes peuvent jouer un rôle dans leur
distribution au sein d’une émulsion constituée d’une phase hydrophobe et d’une phase
hydrophile. Selon leur affinité pour la phase hydrophobe, qui peut notamment être
caractérisée par leur coefficient de partage (logPoctonol/water (o/w)), les molécules
antimicrobiennes se localisent préférentiellement dans la phase aqueuse, dans la phase
lipidique ou encore à la surface des gouttelettes d’émulsion (Pernin, Bosc, et al. 2019;
Bouarab-Chibane, Oulahal, et al. 2018). Une étude montre également qu’il est possible
d’avoir des interactions hydrophobes entre certains agents antimicrobiens et des
composés présents dans le milieu, tels que les protéines, ayant pour conséquence une

125
diminution de l’activité antimicrobienne (Bouarab-Chibane, Oulahal, et al. 2018). Au
cours de ce travail de thèse, nous avons été confrontés à un problème d’interaction
entre la chlorphénésine et un co-émulsionnant, le monostéarate de glycérol (GMS)
(données non montrées dans le manuscrit car manque de répétitions des expériences).
La matrice cosmétique modèle sans ce co-émulsionnant et contenant 0,6% de
chlorphénésine ajouté dans la phase aqueuse avant l’émulsification induisait une
réduction bactérienne d’environ 3 log en une heure. Le co-émulsionnant a ensuite été
rajouté dans la phase lipidique afin d’améliorer la stabilité de la formule. Nous avons
alors observé que la réduction logarithmique n’était plus que de 0.5 log en une heure
à la même concentration de chlorphénésine. Pour éviter les interactions possibles entre
les deux composés lors de la formation de l’émulsion, nous avons alors incorporé la
chlorphénésine après l’émulsification, ce qui a permis de rétablir l’activité
antimicrobienne initiale soit 3 log de réduction bactérienne en une heure. Une
hypothèse pour expliquer ce résultat pourrait être que lorsque la chlorphénésine rentre
en contact avec la phase lipidique contenant le GMS pendant l’émulsification, des
interactions de type hydrophobe interviendraient entre la chlorphénésine et les
gouttelettes lipidiques de l’émulsion, ce qui entrainerait le piégeage du conservateur
dans ces gouttelettes. De la même façon, ces interactions pourraient aboutir également
au piégeage de la chlorphénésine dans des micelles de GMS lors de l’émulsification.
Afin d’optimiser la protection antimicrobienne des formules cosmétiques, il serait
intéressant par la suite, d’étudier ces interactions notamment en étudiant les équilibres
de partition des conservateurs dans des systèmes complexes tels que les émulsions.
On pourrait imaginer par exemple doser le ou les conservateurs dans chacune des
phases par analyse chromatographique (Collinge and Noirfalise 1981; Salvador and
Chisvert 2011). La résonance magnétique nucléaire (RMN) pourrait également être une
technique intéressante qui nous permettrait de caractériser les interactions possibles
entre le monostéarate de glycérol et la chlorphénésine. En effet, cette technique
permet d’accéder à la structure moléculaire d’un composé chimique et d’identifier les
possibles interactions entre différents groupes fonctionnels chimiques grâce à
l’analyse spectrale du déplacement chimique d’un atome après avoir appliqué un
champ magnétique (Chaghi et al. 2010).

Quelles sont les alternatives à l’utilisation des conservateurs ?

Certaines matières premières utilisées dans une formule cosmétique peuvent avoir des
propriétés antimicrobiennes. C’est le cas par exemple du caprylyl glycol et du caprylate

126
de glycéryle qui déstabilisent la membrane bactérienne. Ce type d’ingrédient est de
plus en plus recherché par les industries cosmétiques qui tendent à remplacer
définitivement les conservateurs controversés (Halla et al. 2018). D’autres ingrédients
tels que l’éthanol et la glycérine, peuvent également limiter la prolifération
microbienne. De plus, plusieurs études montrent qu’il peut être possible d’assurer la
conservation des formules cosmétiques en ajustant et en adaptant certaines conditions
physicochimiques des formules cosmétiques, tel que le pH ou l’aw (Berthele et al. 2014;
Halla et al. 2018; Ghalleb et al. 2015; Enigl and Sorrells 1997). En perspective de ce
travail de thèse, la méthode de MCBL développée pourrait permettre d’examiner
l’efficacité antimicrobienne de ces ingrédients non reconnus par la réglementation
cosmétique comme étant des conservateurs, mais aussi de plusieurs conditions
physico-chimiques tel que le pH et l’aw.

Par ailleurs, les potentiels effets synergiques entre ingrédients et conservateurs dans
des matrices cosmétiques pourront être étudiés en utilisant par exemple la méthode
Fractional Concentration Index pour déterminer si les effets antimicrobiens cumulés
entre conservateurs, ingrédients et paramètres physico-chimiques sont synergiques,
indifférents, additifs ou antagonistes (Stanojevic et al. 2009). La méthode de
microscopie développée dans ces travaux de thèse pourrait donc être un moyen plus
rapide que les challenge-tests pour évaluer l’effet antimicrobien de ces ingrédients et
de ces paramètres et permettrait d’optimiser rapidement les formules en utilisant leurs
propriétés antimicrobiennes intrinsèques tout en baissant les doses de conservateur.

En conclusion, nos travaux présentent une avancée majeure dans l’évaluation rapide
de la conservation des formules pour l’industrie cosmétique et pourrait également
fournir un outil à plus large échelle pour le criblage de nouvelles molécules à effet
antimicrobien.

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Yamashita (eds.), Cosmetic Science and Technology (Elsevier: Amsterdam).

142
 Valorisation de la thèse

Publications soumises dans des revues à comité de lecture :

Article 1 : Samia Almoughrabie, Chrisse Ngari, Romain Briandet, Valérie Poulet, and
Florence Dubois-Brissonnet, Mosaic-CLSM assessment of bacterial spatial distribution
in cosmetic matrices according to matrix viscosity and bacterial hydrophobicity. Publié
le : 11 mai 2020.

Article 2 : Samia Almoughrabie, Chrisse Ngari, Laurent Guillier, Romain Briandet, Valérie
Poulet, and Florence Dubois-Brissonnet, Rapid assessment and prediction of
preservative efficiency in cosmetic products using High Content Screening – Confocal
Laser Scanning Microscopy. Accepté le : 29 juin 2020.

Communications orales :

Samia Almoughrabie, Chrisse Ngari, Valérie Poulet, and Florence Dubois-Brissonnet.

Spatial distribution of S. aureus in emulsified complex matrices relies on the thickener
concentration. 5th International ISEKI- Food, PhD Workshop, 3-5 July 2018, Stuttgart,
Germany.

Samia Almoughrabie, Chrisse Ngari, Valérie Poulet, and Florence Dubois-Brissonnet.

Impact of bacterial surface properties of Staphylococcus aureus on bacterial spatial
distribution in emulsified cosmetic matrices: consequences on challenge-tests. 9th
Doc'MICALIS Seminar - MICALIS doctoral students day, 16 May 2019, INRAE Jouy-en-
Josas, France.

Communications par poster :

Samia Almoughrabie, Chrisse Ngari, Valérie Poulet, and Florence Dubois-Brissonnet.

Impact of bacterial surface properties on spatial distribution of S. aureus in complex
emulsified matrices. 8th Congress of European Microbiologists – FEMS 2019, 7-11 July
2019, Glasgow, Scotland.

Samia Almoughrabie, Chrisse Ngari, Valérie Poulet, and Florence Dubois-Brissonnet.

Impact des propriétés de surfaces des bactéries sur la distribution spatiale de
Staphylococcus aureus dans des matrices complexes émulsionnées. 15ème congrès
national de la Société Française de Microbiologie, 30 septembre - 2 octobre 2019, Paris,
France.

143
 Titre : Évaluation et prévision de l’activité antimicrobienne des conservateurs dans des formulations cosmétiques.

Mots clés : distribution spatiale des bactéries, Challenge-tests, inactivation bactérienne, conservateurs, microscopie confocal à balayage
laser.

Résumé : La plupart des produits cosmétiques sont sensibles à la artificiellement inoculés dans des formules cosmétiques, grâce
prolifération microbienne, notamment du fait de leur composition à une méthode associant la microscopie confocale à balayage
riche en eau, de leur conservation à température ambiante et de laser (MCBL) et l’analyse d’images. Nous avons pu montrer que
leur utilisation en plusieurs fois. La gamme de conservateurs plus la viscosité des formules et/ou de l’hydrophobicité des
utilisables se réduisant, notamment à cause du durcissement de la bactéries augmentent, plus la distribution spatiale des bactéries
réglementation, il devient indispensable de déterminer avec est hétérogène. De plus, nous avons mis en évidence qu’une
précision la capacité de conservation des formules cosmétiques distribution spatiale hétérogène pouvait induire une variabilité
pour prévoir leur durée de vie. Ainsi, l’objectif de cette thèse est des résultats de dénombrement lors des Challenge-tests.
de mieux comprendre, de prévoir et d’optimiser le fonctionnement Une méthode rapide a ensuite été développée pour évaluer et
des systèmes conservateurs au sein des matrices cosmétiques. Il prédire l’action des conservateurs dans les formules
s’agira tout d’abord de comprendre le rôle de la matrice cosmétiques. Cette méthode est basée sur l’acquisition de
(composition et structure) sur la répartition spatiale des données d’inactivation bactérienne obtenues sur des temps
microorganismes dans les formules cosmétiques, puis de mettre courts par MCBL et sur la mise en place de modèles
en place une méthode permettant d’évaluer et de prédire l’action mathématiques d’inactivation. Elle a permis de prédire le
des conservateurs au sein de ces matrices. Le Challenge-test est nombre de réductions logarithmiques des populations
aujourd’hui encore la méthode de référence pour l’évaluation de bactériennes sur des temps longs, de même ordre de grandeur
la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique mais il que les temps définis dans les challenge-tests. Cet outil devrait
présente cependant un certain nombre de limites, notamment du ainsi permettre aux industries cosmétiques de gagner du temps
fait de la lourdeur des expérimentations et du délai d’obtention dans l’optimisation de la protection antimicrobienne des
des résultats. Nous avons tout d’abord cherché à identifier les formules cosmétiques.
déterminants de la distribution spatiale de Staphylococcus aureus,

Title : Evaluation and prediction of antimicrobial activity of preservatives in cosmetic formulas.

Keywords : bacterial spatial distribution, Challenge-tests, bacterial inactivation, preservatives, confocal laser scanning microscopy.

Abstract: Most cosmetic products are susceptible to We demonstrated that the higher the viscosity of the formula
microbiological spoilage, which is particularly due to the high- and / or the higher the bacterial hydrophobicity, the more
water content in its composition, to the room temperature storage heterogeneous the bacterial spatial distribution. The
and to the consumer usage. The range of usable preservatives is heterogeneity of the spatial bacterial distribution of the formula
reduced, in particular because of the tightening of the regulation. can induce variability in the enumeration results during
The objective of this PhD is thus to better understand, predict and Challenge-tests.
optimize the efficiency of the preservation systems in cosmetic A rapid method was then developed to assess and predict the
formulas. Moreover, we aimed to understand the role of the matrix action of preservatives in cosmetic formulas. This method is
(composition and structure) on the spatial distribution of based on both the acquisition by CLSM of bacterial inactivation
Staphylococcus aureus in cosmetic matrices, and to implement a datasets over short periods of time and the implementation of
rapid method able to predict the action of the preservatives within mathematical inactivation models.
these matrices. The Challenge-test is the referenced method for Thus, it was possible to predict the number of bacterial
evaluating the antimicrobial protection of a cosmetic product but logarithmic reductions on long times that are relevant to
it has a main limitation which is relative to the time-consuming challenge-test duration. This tool should allow the cosmetic
protocol and to the duration of the whole test. industries to save time in optimizing the antimicrobial
Hence, we first identified the determinants of the spatial protection of cosmetic formulas.
distribution of Staphylococcus aureus artificially inoculated in
cosmetic formulas using a method combining confocal laser
scanning microscopy (CLSM) and image analysis.

Université Paris-Saclay
Espace Technologique / Immeuble Discovery
Route de l’Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France