20221209_Préparation du Concentré prot pois bambara

PREPARATION DU CONCENTRE DE PROTEINES POIS BAMBARA
I. POIS BAMBARA MADAGASCAR
1) Dépéliculation de la graine
- Trempage pendant 24 h pour fragiliser l’enveloppe
- Elimination de la pellicule à la main
2) Préparation des farines

- Séchage des graines dépelliculées à l’étuve à 50°C pendant 24 h
- Broyage pendant 5 min avec broyeur à lame
- Conservation dans des pot de 100 mL

- Stockage à 4°C
3) Delipidation
- Peser environ 40 g de poudre ;
- Ajouter 120 mL d’hexane ;
- Homogénéiser pendant 1 heure ;
- Décanter/centrifuger 2000 g 10 min pour accélérer la séparation des phases.
- Récupérer le surnageant lipidique hexanique dans un pot de 500 mL
- Re-suspendre le culot dans de l’hexane (deux fois)
- Regrouper les surnageant dans un pot de 500 mL
- Utiliser le culot restant pour la préparation de la solution protéique
4) Préparation de l’extrait protéiques

- Ajouter NaCl 0,5 M (pH 6,1 non ajusté) pour un ratio de 1:10 (p/v) ; soit environ 400
mL.
- Homogénéiser pendant 1 heure à 4 °C ;
- Centrifuger at 4°C, 10000 g, 20 min ; récupérer le surnageant 1
- Reprendre le culot et homogénéiser dans du NaCL 0,5 M et centrifuger à 4°C, 10000
g, 20 min ; et récupérer le surnageant 2
1
- Reprendre le culot et homogénéiser dans de l’eau millipore et centrifuger à 4°C, 10000
g, 20 min ; et récupérer le surnageant 3
- Regrouper les surnageants 1, 2 et 3 pour la dialyse.
5) Dialyse (à compléter par Joelle)

- Laver la membrane avec de l’eau millipore ;
- Membrane de dialyse Visking code DTV12000.13.15,
MWCO 12-14000 daltons, diamètre 50.8mm ;
- Environ un mètre de membrane de dialyse est découpé(1.5L correspond environ à une
hauteur de 740mm, prévoir 2*20cm pour les nœuds de fermeture) ;
- L’échantillons est transféré dans la membrane et celle-ci est plongée dans un bain
d’eau osmosée ajusté à environ 35 litres. La dialyse est réalisée en chambre froide à
6°C ;
- Le bain de dialyse est changé 2 fois par jour, le matin et le soir, pendant 3 jours afin
d’éliminer le NaCl;
6) Lyophilisation (à compléter par Joelle)

- En fin de dialyse, le contenu de la membrane est transféré dans un plateau inox afin
d’être congeler à -20°C en chambre congelante.
- L’échantillon est lyophilisé à l’aide d’un lyophilisateur CRYOTEC pilotcompact sur un
week-end (procédure 69h).
7) Résultats
Masse/volume
Farine de pois bambara départ 40 g
Farine de pois bambara délipidée 36,63 g
Volume d’extrait de protéine pour dialyse 1100 mL
Pois protéine pois bambara purifié 7,8 g
Rendement 19,5%
II. POIS BAMBARA DU CAMEROUN (Patrick LESSI)

1) Dépelliculation des graines
- Concassage
- Soufflage
2) Préparation des farines et mise à l’équilibre

- Broyage pendant 5 min avec broyeur à lame
- Mise dans des pots de 100 mL
- Mise à l’équilibre dans des dessiccateurs contenant solution saturée de MgCl2
2
3) Delipidation
- Peser environ 11-15g de poudre ;
- Ajouter 35-45 mL d’hexane ;
- Homogénéiser pendant 1 heure ;
- Centrifuger 2000 g/10 min. Récupérer le surnageant dans un pot de 25 ml et
redissoudre le culot dans 35-45 ml d’hexane (bis)
- Laisser le culot sous la hotte pendant toute la nuit pour évaporer l’excès de solvant.
Echantillons Masse avant délipidation Masse après délipidation

Pois Bambara 20 jours 11,5056 10,4583
4) Préparation de l’extrait protéiques (suite par Joelle)

- Ajouter NaCl 0,5 M pour un ratio de 1 :10 (p/v), soit environ 140 mL ; (mesurer le pH
juste après)
- Homogénéiser pendant 1 heure à 4 °C sous agitation magnétique;
- Centrifuger à 10000 g, 4°C, 20 min ; récupérer le surnageant 1 dans un flacon de
500 mL
- Reprendre le culot et homogénéiser à nouveau 1h à 4°C dans du NaCL 0,5 M et
centrifuger à 10000 g, 4°C, 20 min ; et récupérer le surnageant 2 dans le même
flacon que surnageant 1.
- Reprendre le culot et homogénéiser 1h à 4°C dans de l’eau millipore, puis centrifuger
à 4°C, 10000 g, 20 min ; et récupérer le surnageant 3 dans le même flacon que
surnageant 1 et 2.
Echantillons Echt n° Masse après Volume solvant

délipidation (g) extraction (ml
x3)
Pois Bambara 20 jours 1 10,4583 105
Un aliquote de chaque échantillon est conservé pour une analyse en électrophores LDS-
PAGE.
*préparation de 2 litres de solution NaCl 0.5M soit 58.44g dissout dans une fiole de 2
litres, mesure du pH à 6.3 (18°C) ;
*dispersion des poudres délipidées et extraction protéique en 3 étapes (cf ci-dessus);
* pool des 3 surnageants obtenu pour chaque échantillon.
3
Extraits protéiques en présence de NaCl 0.5M.
1 : 20jours ; 2 : 30jours ; 3 : 40jours ; 4 : 50jours ; 5 : 59 jours
5) Dialyse
mise en dialyse des surnageants obtenus contre de l’eau osmosée à 6°C:
- Membrane de dialyse Visking code DTV12000.13.15,
MWCO 12-14000 daltons, diamètre 50.8mm, lavée à l’eau avant utilisation ;
- 5 longueurs de membrane de dialyse sont découpées (0.5L correspond environ à une
hauteur de 250mm, prévoir 2*20cm pour les nœuds de fermeture) ;
- Les échantillons sont transférés dans chaque membrane et celles-ci sont plongée dans
un même bain d’eau osmosée ajusté à environ 35 litres. Les dialyses sont réalisées en
chambre froide à 6°C ;
- Le bain de dialyse est changé 2 fois par jour, le matin et le soir, pendant 3 jours afin
d’éliminer le NaCl;
Extraits protéiques fin de dialyse contre de l’eau osmosée.
6) Lyophilisation
- En fin de dialyse, le contenu des membranes sont transféré dans des plateaux inox
afin d’être congeler à -20°C en chambre congelante.
- Les échantillons sont lyophilisés à l’aide d’un lyophilisateur CRYOTEC pilotcompact
(procédure 69h).
- Les culots conservés lors de l’extraction protéique sont également lyophilisés sans
être dialysés.
4
7) Caractérisations
RENDEMENT
Echantillons Masse avant Masse après Masse Rendement

Extraits protéiques délipidation délipidation lyophilisat Lyophilisat/initial
(g) (g) (g) %
Pois Bambara 20 jours 11,5056 10,4583 1,02 8.9
ELECTROPHORESE LDS-PAGE en condition dénaturante, non réduit et réduit
Dispersion une nuit à 2mg/ml en tampon laemmli puis dilution à 1mg/ml:

non réduit: sont prélevé 50ul auquel est ajouté 50ul de tp laemmli
réduit: sont prélevé 50ul auquel est ajouté 50ul de bleu à 16% Mercapto
5
6

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I. POIS BAMBARA MADAGASCAR

2) Préparation des farines

- Conservation dans des pot de 100 mL

4) Préparation de l’extrait protéiques

5) Dialyse (à compléter par Joelle)

6) Lyophilisation (à compléter par Joelle)

II. POIS BAMBARA DU CAMEROUN (Patrick LESSI)

2) Préparation des farines et mise à l’équilibre

Echantillons Masse avant délipidation Masse après délipidation

4) Préparation de l’extrait protéiques (suite par Joelle)

Echantillons Echt n° Masse après Volume solvant

Extraits protéiques fin de dialyse contre de l’eau osmosée.

Echantillons Masse avant Masse après Masse Rendement

ELECTROPHORESE LDS-PAGE en condition dénaturante, non réduit et réduit

Dispersion une nuit à 2mg/ml en tampon laemmli puis dilution à 1mg/ml:

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