²

HYGIENE DU PERSONNEL 1
 PCR
Polymerase Chaine Reaction
ou réaction de polymérisation en chaine

2
1976  Chien et al. découvrent l’ADN polymérase thermophile
1985  Kerry Mullis met au point la technique de PCR (Prix nobel en 1993)
1988  Saïki et al. utilisent la Taq polymérase

Probablement la technique la plus puissante mise

au point depuis les 20 dernières années

3
“ Polymerase Chain Reaction ”

 C’est une technique qui a été mise au point en 1985 par Mullis K.

 Son principe de base est d’extraire une séquence d’ADN spécifique,

présente une seule fois dans un mélange complexe de séquences, en
multipliant son nombre de copies

PCR

4
“ Polymerase Chain Reaction ”

 Elle consiste à amplifier in vitro de l’ADN en tirant partie du mode normal

de synthèse de l’ADN in vivo : chacun des 2 brins de l’ADN sert de matrice
pour la synthèse d’un brin complémentaire

 Une molécule-mère donne donc naissance à deux molécules-filles

des n
ion s atio
i
t
x a rc e éris
n
tio F o lym
ur
a am Po
a t
n
Dé

Séquence-cible

5
Composants de la réaction

 Les composants d’une réaction PCR sont :

 ADN ( 50 ng à 1 µg )
 Amorces oligonucléotidiques ( 0.1 à 200 µM )
 Désoxynucléotides ( 20 à 200 µM )
 Enzyme thermostable ADN polymérase ( 1 à 2.5 u )
 Milieu réactionnel d’amplification

ADN
5’ 3’

Amorce Sens
dNTPs ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP )

Amorce Reverse

3’ 5’

ADN polymérase
6
Cycles de la réaction

 Un cycle de réaction se compose de 3 étapes :

 Etape de dénaturation
Température : 94 à 95°C
Durée : 1 min maximum

 Etape d’hybridation
Température : 3 à 5°C en dessous du Tm ( 40 à 70°C )
Durée : 30 sec à 1 min

 Etape d’élongation
Température : 72°C
Durée : 30 sec à + min ( fonction de la taille )

7
Cycles de la réaction

e
ial
t
ini
ion

ion
tio
at

t
ra

ra
ur

tu

ion

ion
u
at

at
na

at
n

t
n
Température

ga
Dé

Dé

Dé
ng
ion

ion

n
Elo

Elo
t

t
ida
94°C 94-95°C 94-95°C

ida
br

br
72°C 72°C
Hy

Hy
 
40-70°C  40-70°C 
 

5-10mn 1mn 30s-1mn + mn 1mn 30s-1mn + mn

Temps
8
Cycles de la réaction

 Les 3 étapes Dénaturation-Hybridation-Elongation constituent un cycle au

cours duquel la quantité d’ADN cible est doublée

 Le nombre de cycles d’une PCR varie entre 20 et 50, selon la quantité de

cible de départ et le but escompté

 Les composants de la réaction sont mélangés dans un microtube qui est

ensuite placé dans un “Thermocycler”

 Le thermocycler est un appareil qui assure de manière automatique les

variations cycliques de température préalablement programmées

9
Cycles de la réaction

 Théoriquement, le nombre de copies augmente exponentiellement de telle

manière qu’au bout de n cycles, 2n copies sont obtenues

...
Séquence cible
Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle 4 n cycles

2n copies

1 = 20 2 = 21 4 = 22 8 = 23 16 = 24 copies
Cycles de la réaction

 La PCR est une amplification exponentielle d’une séquence cible de départ,

mais elle atteint rapidement un plateau au bout d’un certain nombre de
cycles

 En effet, au bout de 35 cycles, 235 = 34 milliards de copies seraient

obtenues

 Cela voudrait dire que si la quantité d’ADN de départ était de 100 ng, on
obtiendrait une quantité de 3.4 kg

Cela
n’arrive
jamais !
Effet “ plateau ”

 Réaction enzymatique de base :

 Matrice ADN
 Amorce Sens
 Amorce Reverse
 Tampon de réaction
 dNTPs
 ADN polymérase
 H2O

Stabilité à la chaleur Qualité des amorces

Dénaturation incomplète de la matrice

Mauvaise utilisation des substrats (dNTPs, amorces)
Production de pyrophosphates
Production de produits non spécifiques
12
PCR “ multiplex ”

 Une PCR multiplex est une PCR simultanée de 2 ou + séquences cibles (en
utilisant +ieurs couples d’amorces) dans une même réaction d’amplification

Séquence cible 1 Séquence cible 2

Dénaturation-Hybridation

E l o n g a t i o n

n cycles

13
Paramètres critiques de la PCR

 Matrice d’ADN

 La PCR amplifie toujours de l’ADN

 La matrice d’ADN peut être de l’ADN génomique ou de l’ADN cloné

 Pour amplifier un fragment à partir d’ARN, il faut d’abord synthétiser

le cDNA par transcription reverse

 On utilise généralement de 50 ng à 1 µg d’ADN lors d’une PCR

 La tendance est de réduire la quantité d’ADN, si bien que souvent les

PCRs sont réalisées avec 50 ng d’ADN

 La diminution de la quantité d’ADN permet d’augmenter le rendement

de l’amplification et de diminuer les amplifications parasites

14
Paramètres critiques de la PCR

 Une quantité croissante d’ADN matrice permet d’obtenir une quantité

croissante de produits d’amplification, surtout en PCR multiplex
Paramètres critiques de la PCR

 Choix des amorces oligonucléotidiques

 Les amorces sont déterminées selon leur Tm :
Tm (°C) = 4°C x (G+C) + 2°C x (A+T)

 Choix d’un Tm voisin pour les 2 amorces

 Composition en bases équilibrée ( G+C/A+T ~40-60% )

 Absence d’auto-complémentarité pour chaque amorce (extrémité 3’)

 Absence de complémentarité entre les amorces (extrémités 3’) (dimères)

 Taille des amorces (18 à 35 nucléotides)

 Absence de formation de structures secondaires

 Choix optimum des amorces se fait généralement à l’aide de programmes

informatiques
16
Paramètres critiques de la PCR

Ex: En utilisant 8 couples d’amorces différentes, certaines combinaisons

permettent une meilleure amplification que d’autres
Paramètres critiques de la PCR

 En réactions indépendantes, les amplifications peuvent

être bonnes, alors qu’en PCR multiplex, on peut obtenir de
mauvaises amplifications

 Généralement, les PCRs multiplex réalisées avec des

amorces de 30 à 35 nucléotides permettent d’avoir de
bonnes amplifications

18
Paramètres critiques de la PCR

 Complémentarité des amorces à la matrice

 Pour la grande majorité des applications de la PCR, les amorces sont

choisies pour être exactement complémentaires à la matrice

 La spécificité des amorces est vérifiée dans les banques de données

 Pour certaines applications, des mésappariements peuvent cependant

être intentionnellement créés :

- Production de mutations
- Création de sites de restriction (PCR-RSI)
...

19
Paramètres critiques de la PCR
a

Les flèches indiquent le produit d’amplification spécifique

Ex: En testant 34 couples d’amorces différentes sur un ADN génomique,

certains ne sont pas suffisamment spécifiques (25, 28 et 33)
20
Paramètres critiques de la PCR

 La concentration des amorces (hautes ou basses) peut inhiber ou être

insuffisante pour obtenir une amplification correcte

~ 200 nM ~ 60 nM

Ex: En réalisant des PCRs multiplex avec plusieurs couples d’amorces équimolaires, les
concentrations d’amorces utilisées diffèrent selon la PCR
21
Paramètres critiques de la PCR

 Amplifications non spécifiques

 Les amorces utilisées lors de la PCR sont toujours courtes

 La possibilité qu’elles s’hybrident autre part qu’à la cible est possible

 Les amplifications parasites ne sont pas prévisibles et dépendent de la

séquence des amorces utilisées

 Un moyen de diminuer ces amplifications non spécifiques est d’augmenter

la stringence, le plus souvent en augmentant la température de manière
progressive jusqu’à disparition des bandes contaminantes

22
Paramètres critiques de la PCR

 Amplifications parasites
 Un autre moyen consiste à réaliser 2 PCRs successives en utilisant des couples
d’amorces différents, le 2ème couple encadrant une séquence incluse dans celle
qui est amplifiée par le 1er couple d’amorces

 Cette technique est appelé “ Nested PCR ” ( PCR “nichée” )

ADN cible

Dénaturation-Hybridation
1er couple d’amorces Elongation

rces tion
le d’ Hybrida

Elongation n cycles
amo
-
2 ème turation
coup
a
Dén
Paramètres critiques de la PCR

 Désoxyribonucléotides

 La concentration des dNTPs est généralement de l’ordre de 20-200 µM

 Leur concentration influence la fidélité de l’ADN polymérase :

 > 200 µM  Risque d’augmenter les erreurs d’incorporation

 < 50 µM  Diminution du rendement de la réaction d’amplification

 Théoriquement, 20 µM de chaque dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, DCTP) est

suffisant pour synthétiser 2.6 µg d’une séquence d’ADN de 400 pb

 En pratique, on réalise un mélange équimolaire de chacun des dNTPs

Paramètres critiques de la PCR

 dNTPs < 50 µM  Diminution de l’efficacité de la PCR

 dNTPs > 400 µM  Forte inhibition de la PCR
Paramètres critiques de la PCR

 Enzyme d’amplification
 La première enzyme utilisée en PCR était le fragment Klenow de l’ADN
polymérase I

 Cette enzyme présentait cependant des inconvénients :

 Thermo-sensibilité (nécessité de rajouter de l’enzyme à chaque cycle)

 Température d’hybridation des amorces n’excédant pas 37°C (survenue
d’hybridations non spécifiques)

 L’utilisation d’une polymérase thermostable extraite à partir de Thermus

aquaticus a levé ces inconvénients

 A une température de 72°C, la vitesse de polymérisation de la Taq

polymérase est de l’ordre de 1.000 nucléotides / minute

 La Taq polymérase a pourtant une limite de thermostabilité puisque la

demi-vie de l’enzyme est de 45 mn à 95°C
Paramètres critiques de la PCR

 Taq < 2 u  Absence de bandes ou faible intensité

 Taq > 2 u  Augmentation des produits aspécifiques et du “bruit de fond”
Paramètres critiques de la PCR

 Autres ADN polymérases utilisées en PCR

 Stoffel Fragment (Thermus aquaticus)

- 2x plus thermostable que Taq polymerase
- Particulièrement utile pour l’amplification de régions riches en GC

 Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus)

- Résistante aux composants sanguins (inhibiteurs potentiels de l’enzyme)
- Utile pour détecter l’expression des gènes (activité reverse transcriptase)

 Vent polymerase (Thermococcus litoralis)

- Grande thermostabilité (conserve son activité 2 h à 100°C)
- Capacité de polymérisation élevée (jusqu’à 13 kb)
- Utilisée pour le séquençage de l’ADN

 Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus)

- Excellente thermostabilité
Paramètres critiques de la PCR

 Fidélité de l’enzyme d’amplification

 Le taux d’erreurs introduites par l’enzyme est de l’ordre de 10 -4

 Pour la plupart des applications, ces erreurs ne sont pas gênantes, si les
paramètres analysés sont la taille ou la présence du produit amplifié

 Lorsque le fragment amplifié est analysé pour la recherche de mutations

ou utilisé pour le sous-clonage, toute erreur peut fausser les résultats

 On peut essayer de minimiser ces erreurs en ajustant la concentration

des désoxynucléotides, la quantité d’ADN, ...

 On peut aussi utiliser des enzymes fidèles (ex: Vent polymerase, Pfu
DNA polymerase)
29
Paramètres critiques de la PCR

 Milieu ou tampon réactionnel

 La réaction d’amplification nécessite un tampon adéquat

 Ce milieu d’amplification est tamponné avec du Tris-HCl à 10-50 mM

(avec un pH de 8.3-8.9)

 La modification du pouvoir tamponnant du milieu réactionnel permet

parfois d’augmenter la quantité d’ADN amplifié

 Les tampons d’amplification contiennent aussi des sels, dont les plus
importants sont le KCl et le MgCl2

 Ces sels influencent la spécificté et l’efficacité de la réaction PCR

Paramètres critiques de la PCR

KCl

 [KCl] forte (> 2.4x)  Amplification des fragments de petite taille favorisée
 [KCl] faible (< 1.2x)  Amplification des fragments de grande taille favorisée
Les meilleures conditions sont obtenues à une concentration d’~ 2x ( 50 mM )
Paramètres critiques de la PCR

MgCl2

 C’est un co-facteur des ADNs polymérases qui affecte l’activité de l’enzyme, mais aussi
l’hybridation des amorces et la fusion de l’ADN (Tm)
 La concentration en MgCl2 peut varier de 1.0 à 5.0 mM
 Une concentration élevée en MgCl2 augmente la spécificité de la réaction, mais diminue
l’efficacité de l’amplification (disparition de la bande, apparition de fragments parasites)
32
Paramètres critiques de la PCR

 Adjuvants de la PCR

 Afin d’améliorer la spécifité et le rendement de la réaction

d’amplification par PCR, quelques adjuvants sont souvent
ajoutés au milieu réactionnel comme:

 Glycérol (  5% )

 L’effet de ces adjuvants est cependant variable

33
Paramètres critiques de la PCR

 Programme d’amplification

 Dénaturation

 Une première étape de dénaturation de l’ADN de 2-5 mn à 94-96°C

est réalisée, avant le début des cycles, pour accomplir la séparation
des brins de la matrice d’ADN

 La technique dîte “ Hot start ” (“démarrage à chaud”), consistant à

ne rajouter l’enzyme de polymérisation dans les tubes d’amplification
que lorsque la température a atteint 94-96°C, est parfois utilisée
dans le but de ménager l’activité de la polymérase, mais surtout
d’éviter la génération de produits non spécifiques

 Les étapes de dénaturation incluses dans les cycles sont courtes, de

l’ordre de 30 s à 1 mn, car des temps longs finissent par dénaturer
l’enzyme
34
Paramètres critiques de la PCR

 Programme d’amplification

 Hybridation des amorces

 La température d’hybridation des amorces est critique pour la

spécificité de la PCR

 Elle conditionne également le rendement de l’amplification

 Elle est fonction du Tm et est déterminée expérimentalement

 Un temps d’hybridation des amorces de 30 s à 1 mn par cycle

est classiquement utilisé

 Des temps plus longs peuvent augmenter la quantité de produits

aspécifiques

35
Paramètres critiques de la PCR

 Programme d’amplification

 Polymérisation ou synthèse d’ADN ou “extension à partir des amorces”

 La température optimale de polymérisation est de 68 à 72°C selon

la polymérase utilisée

 Le temps de polymérisation est fonction de la taille du fragment à

amplifier

 Ce temps de polymérisation (incorporation des désoxynucléotides) est

d’environ 1 mn / 1.000 pb

 Si le fragment à amplifier est de petite taille (<100 pb), cette étape

du cycle peut être supprimée car la polymérisation se fait pendant la
transition entre les températures d’hybridation et de dénaturation
36
Paramètres critiques de la PCR

 Temps d’élongation de 1 mn : Les fragments de petite taille sont favorisés alors que
ceux de grande taille sont défavorisés
 Temps d’élongation de 4 mn : Inversement
37
Paramètres critiques de la PCR

 Programme d’amplification

 Nombre de cycles

 Le nombre de répétitions des 3 étapes Dénaturation-Hybridation-

Elongation varie selon la quantité de la cible de départ

 Un nombre classique de 30-40 cycles est généralement utilisé

 En dessous de ces valeurs, l’amplification risque d’être insuffisante

 Au dessus de ces valeurs, certains produits de la réaction peuvent

être épuisés et il n’y a pas d’amélioration du rendement

38
 Paramètres critiques de la PCR

 En dessous d’une 30aine de cycles, l’amplification de la séquence cible est insuffisante

 Au dessus d’une 40aine de cycles, il n’y a pas d’amélioration du rendement

39
Paramètres critiques de la PCR

 Contaminations
 Compte tenu du principe même de la PCR, qui consiste à amplifier de l’ADN
à partir d’infimes sources de matrice, les contaminations d’ADN étranger
sont un problème majeur parfois difficiles à maîtriser

 Il est impossible de s’affranchir entièrement de ce problème, mais certaines

précautions permettent de le minimiser considérablement :

 Exposition des matériels et consommables aux UV avant utilisation

 Manipulations stériles pour éviter la contamination par des nucléases

 Utilisation de cônes munis de coton protecteur

 Aliquotage en petis volumes de tous les composants de la PCR

 Distribution de l’ADN en dernier.

40
“ Polymerase Chain Reaction ”

 Règle 1

“ Il n’existe pas de protocole standard de PCR ”

 Règle 2

Il faut mettre au point chaque nouvelle PCR en optimisant

toutes les conditions d’amplification (composants et cycles)

41
Applications de la PCR

Diagnostic de maladies génétiques

(mutations, réarrangements)

Clonage et sous-clonage de gènes Mutagénèse (délétions,

insertions, substitutions)
Identification de nouveaux gènes
Séquençage de l’ADN
Identification de
polymorphismes génétiques PCR quantitative
PCR
(RT-PCR) Cartographie du génome

Détection d’agents
pathogènes (bactéries,
Fabrication de sondes (radioactives ou virus) (organismes, eau)
froides) (Southern, Northern, ...)

Empreintes génétiques Phylogénie

(détermination de filiation) (ARNr, ADN momie)

42
Merci de m’avoir prêté attention

43