chromatographie

Technique biochimique
chromatographie
Plan:
*Définition
*Différents types de chromatographies
*Terminologie générale de la chromatographie
*Chromatographie liquide
*Principales grandeurs de chromatographie
Définition:
Étymologiquement, la chromatographie signifie l'image en couleur et
c’est une technique qui permet la purification et la caractérisation des
molécules C’est une technique qui met en jeu deux phases: une phase
mobile et une phase stationnaire.
C’est une méthode de séparation des constituants d un mélange par
entraînement de la phase mobile (liquide ou gaz) le long d’une phase
stationnaire (solide ou liquide fixé).
Chaque molécule à séparer est soumise à deux forces:
Force de rétention: qui correspond à l affinité du soluté pour la phase
fixe .
Force de mobilité ou d’entraînement de soluté par la phase mobile:
La résultante des deux forces est différente, ce qui permet une
migration différentielle des molécules.
Différents types de chromatographie:
Selon la nature de la phase mobile, nous distinguons la phase mobile
liquide ou gazeuses.
Si la phase mobile est liquide: chromatographie en phase liquide
Si la phase mobile est un gaz: chromatographie en phase gazeuse.
1) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE:
Selon la nature de la phase stationnaire, nous distinguons différents types
1.1) La phase stationnaire est un liquide c’est une chromatographie
liquide-liquide
1.2) La phase stationnaire est un solide c’est une chromatographie
liquide-solide: 5 possibilités
*CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITÉ:
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est un solide sur le quel est greffé des effecteurs qui
présentent une affinité Ac-Ag, enzyme –substrat, hormerecepteur.
*Chromatographie adsorption phase inversée:
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est solide poreux portant des groupements non
polaires.
*Chromatographie adsorption phase normale :
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est solide poreux portant des groupements
polaires.
*CHROMATOGRAPHIE GEL FILTRATION,EXCLUSION DIFFUSION,
TAMISAGE MOLÉCULAIRE, PERMÉATION SUR GEL:
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est solide poreux La séparation s’effectue en fonction
de la taille des particules. Les grosses seront exclues et sortiront en premier
Les plus petites diffusent dans le pores du gel et sortiront les dernières .
*CHROMATOGRAPHIE SUR ÉCHANGEURS D IONS:
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est une résine porteuse de groupement ionisé (-) ou
(+). Les interactions sont du type électrostatiques .
2) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG)
La phase mobile est un gaz vecteur Si la phase stationnaire est solide
c’est la CHROMATOGRAPHIE GAZ –SOLIDE .
Si la phase stationnaire est liquide c’est la CHROMATOGRAPHIE
GAZ –LIQUIDE.
TERMINOLOGIE GÉNÉRALE DE LA CHROMATOGRAPHIE.
Chromatographie d’élution:
la phase mobile parcourt en permanence la phase stationnaire afin que les
solutés introduits à une extrémité de celle-ci sortent à l’extrémité opposée.
Dans cette méthode, la phase mobile est inerte vis-à-vis de la phase
stationnaire.
1) Colonne chromatographique :
C’est un tube cylindrique vertical de diamètre et longueur variable, en
verre, métal, ou autre substance. Rempli de la phase stationnaire à
l’intérieur duquel s’opèrent les séparations chromatographiques.
2) Phase stationnaire:
C’est le produit qui, par ses affinités avec les solutés, va permettre leur
séparation quand la phase mobile les déplacera .
3) Phase mobile ou éluant :
une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui déplace les solutés dans la
phase stationnaire, jusqu’à ce qu’ils sortent de celle-ci .
4) Eluat :
Il correspond à la solution recueillie.
5) Elution :
C est l’opération de récupération de soluté sous l’effet d’ un solvant ,
éluant ou phase mobile .
6) Chromatogramme liquide:
Ensemble de fractions récupérées après élution .
7)Courbe d’élution:
C’est la représentation graphique de la concentration du soluté dans
l’éluat en fonction du temps de rétention ou volume de rétention .
Procédure de chromatographie liquide:
Elle peut se faire soit: SUR UNE SURFACE PLANAIRE comme couche
mince ou papier (DEUST) SUR UNE COLONNE.
Phase mobile coule par gravité ou pression ambiante Phase mobile coule
sous pression imposée.
Grandeurs chromatographiques:
*le rapport de distribution K :
Représente la constante d'équilibre de la réaction ou de constante de
distribution, coefficient de distribution et coefficient de partage.
K est égal au rapport des concentrations du soluté A dans les deux phases
K = CS / CM
•CS : concentration en mol/l à l'équilibre, du soluté dans la phase
stationnaire.
•CM : concentration en mol/l à l'équilibre, du soluté dans la phase mobile
VOLUME D'ÉLUTION D'UN COMPOSÉ :
(Ve ) : Ve = Vm + K.Vs
• Vm : volume mort de la colonne
• VS : volume de la phase stationnaire
• K : Rapport de distribution du composé entre la phase stationnaire et la
phase mobile
Volume d'élution d'un composé (Ve ) :
Ve= Vm + K.Vs
avec K = Ve -Vm/Vs et on sait que K = CS / CM
D’ou
K = CS / CM = (Ve - Vm) / Vs
•CS : concentration en mol/l à l'équilibre, du soluté dans la phase
stationnaire.
•CM : concentration en mol/l à l'équilibre, du soluté dans la phase mobile.
Chromatogramme ou courbe d’élution:
c’est la représentation graphique de la concentration des solutés en
fonction de des valeurs de rétentions (temps ou volume ) C est un trace sur
un papier enregistreur des réponses successives du détecteur, au cours de
l’élution des solutés hors des colonnes.
Valeurs de rétention:
Sont le temps ou volume de rétention, qui permettent de chiffrer l’action
d’une phase stationnaire donnée sur un soluté donné Si un composé n'est
pas du tout retenu: Il sort dans le volume de la phase mobile contenu dans
la colonne, Vm (appelé encore volume mort de la colonne). Lorsque un
composé est retenu, Le volume de rétention, Vr, correspondant au
maximum (au sommet) du pic d'élution.
Le volume ou le temps de rétention :
Le volume et le temps sont reliée par la formule du débit.
Vm(ml)= Tm(sec)D(ml/sec)
Avec V: volume mort
t:temps de rétention
D:débit de la phase mobile
Vr(ml)=Tr(sec) D(ml/sec)
Temps de rétention réduit:
tr’= tr –tm
tr: temps de rétention du soluté.
tm : temps mort.
Le facteur de capacité ou facteur de rétention K ou K’
c’est un facteur sans dimension Ne dépend pas du débit ni de la longueur
de la colonne
Donne une idée sur la distance entre les sommets de deux pics
consécutifs .
Le coefficient de sélectivité ou de rétention relative :
Ce facteur de sélectivité ou de séparation, sans dimension,
Le facteur de sélectivité exprime la position relative de 2 pics sur le

chromatogramme Donne idée sur l’efficacité de séparation entre deux pics
voisins
Coefficient de résolution de 2 pics (R) :
La résolution est la capacité de séparer des composés qui ont des volumes
(temps) de rétention proches. R Exprimée en termes de volume de rétention
ou temps de rétention, la résolution est définie selon la formule suivante :
Conclusion:
Chromatographie liquide à haute performance (hplc):
La chromatographie HPLC est une technique d’analyse qualitative

et quantitative qui permet l'identification, la séparation et le dosage
de composés chimiques dans un mélange liquide, même à l’état de
traces. L’échantillon à analyser contenant une ou plusieurs espèces
est entraîné par un courant de phase mobile au contact d'une phase
stationnaire. Chaque espèce présente migre à une vitesse qui
dépend de ses caractéristiques et de celles des deux phases en
présence. La technique chromatographique est très utilisée dans
plusieurs domaines de la science; en particulier: - Industrie des
produits pharmaceutique et vétérinaires - Domaine
environnementale (Pesticides, Hydrocarbures…) - Dans la
biologie -Analyse des mycotoxines
Chaine HPLC comprend: - Une
pompe quaternaire - Un injecteur
manuel - Trois détecteurs:
Fluorescence, UV, Réfractomètre-
Une colonne C18 phase inverse -
Un logiciel VARIAN Wspermet
l’acquisition, l’analyse et le
traitement des résultats.

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