MAKALAH ANALISIS FARMASI

‘’KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ,KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI DAN

KROMATOGRAFI GAS

NAMA : ASRINO J

NIM : O1A118051

KELAS :A

DOSEN : ARI SARTINAH.,S.Si M.Sc.

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARNMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2020
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR

BAB 1 : PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
B. RUMUSAN MASALAH
C. TUJUAN MASALAH

BAB 2: PEMBAHASAN

BAB 3 : PENUTUP

A. KESIMPULAN
B. SARAN

DAFTAR PUSTAKA
 KATA PENGANTAR

Assalamualiakum warahmutullahi wabarakatuh

puji syukur atas kehadirat Allah swt. Yang memberikan kesempatan pada penulis
untuk menyelesaikan makalah ini.atas rahmat dan hidayahn-ya lah para penulis dapat
menyelesaikan makalah ini ,dan salawat serta salam kepada baginda Rasulullah S.A.W
atas usaha,tetesan keringat dan darah Rasulullah sehingga agama Islam ini sampai kepada
kita.

Saya sebagai penulis mengucapakan banyak – banyak terima kasih kepada Dosen
matakuliah analisis Farmasi yang telah memberikan tuags ini sehingga dapat menambah
dan memperluas wawasan penulis dan pembaca sehingga menjadi suatu bekal ilmu yang
sangat bermanfaat kedepanya.
 IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN FENOL DARI EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH HIJAU (PIPER
BETLE LINN.) DENGAN METODE KLT-SPEKTROFOTODENSITOMETRI

PENGEMBANGAN METODE PENETAPAN KADAR METIL PREDNISOLON DALAM SEDIAAN DRY

INJECTION DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

OPTIMASI PENENTUAN KADAR METANOL DALAM DARAH MENGGUNAKAN GAS

CHROMATOGRAPHY

BAB 1

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Kimia analisi adalah studi pemisah dan kuantifikasi komponen kimia dalam bahan

alam maupun buatan.[1] Analisis kualitatif memberikan indikasi identitas spesies kimia di
dalam sampel. Sedangkan analisis kuantitatif menentukan jumlah komponen tertentu dalam
suatu zat. Pemisahan komponen sering kali dilakukan sebelum melakukan analisis.Metode
analisis dapat dibagi menjadi klasik dan instrumental. [2] Metode klasik (dikenal juga
sebagai metode kimia basah) menggunakan pemisahan seperti pengendapan, ekstraksi,
dan distilasi serta analisis kualitatif berdasarkan warna, bau, atau titik leleh (organoleptis).
Analisis kuantitatif klasik dilakukan dengan menentukan berat atau volum. Metode
instrumental menggunakan suatu peralatan untuk menentukan kuantitas fisik suatu analit
seperti serapan cahaya, fluoresensi, atau konduktivitas. Pemisahan dilakukan menggunakan
metode kromatografi, elektroforesis atau fraksinasi aliran medan.Kimia analisis juga fokus
pada peningkatan rancangan percobaan, kemometri, dan pembuatan alat ukur baru agar
dapat menyediakan informasi kimia yang lebih baik. Kimia analisis telah diaplikasikan di
bidang forensik, bioanalisis, analisis klinik, analisis lingkungan, dan analisis bahan.

kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan komponen dalam

sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fase yaitu fase diam dan
fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang dilapiskan pada padatan atau
gel. Metoda kromatografi banyak digunakan dalam bidang biokimia, kimia organik maupun
kimia anorganik, kimia analisa, kimia bahan pangan dan bidang lainnya. Pada
perkembangan selanjutnya, kromatografi telah dilengkapi dengan perangkat canggih seperti
komputer dan alat bantu lain sehingga memperluas pemanfaatannya dalam berbagai disiplin
ilmu yang lain. Kromatografi terus berkembang dengan lahirnya berbagai jenis
kromatografi antara lain kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS), kromatografi cair
tekanan tinggi (HPLC) serta kromatografi ion.

Kromatografi bekerja dengan prinsip dasr yaitu jumlah zat terlarut yang berbeda
untuk masing-masing komponen pada waktu tertentu saat kesetimbangan terjadi antara fase
diam dan fase geraknya. Pemisahan dengan metode kromatografi dapat terjadi apabila suatu
molekul maupun senyawa memiliki sifat yang berbeda, di antaranya adalah:
1.Memiliki kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut.
2.Memiliki sifat kelarutan atau sifat untuk berikatan yang berbeda satu sama lain dengan
fase diamnya.
3.Memiliki sifat mudah menguap (volatil) pada temperatur yang berbeda.
Sifat-sifat dari komponen penyusun senyawa tersebut akan menentukan apakah
komponen-komponen tersebut mampu bergerak bebas (berinteraksi lemah) atau
berinteraksi kuat dalam fase diamnya. Bila semua komponen-komponen yang ada tidak
dapat bergerak dalam fase diam, maka proses pemisahan tidak mungkin dapat berlangsung.
Apabila dapat bergerak, pemisahan akan bergantung pada sejauh mana kecepatan bergerak
di antara komponen-komponen tersebut maupun perbedaan kecepatannya dengan kecepatan
fasa gerak yang dipakai pada sistem tersebut.Oleh karena itu pada metoda kromatografi
perlu dilakukan pemilihan fase gerak sedemikian rupa sehingga semua komponen dapat
bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda sehingga proses pemisahan dapat terjadi.
Secara umum dapat dikatakan bahwa kromatografi adalah proses migrasi diferensial
dimana komponen-komponen sampel ditahan secara selektif oleh fase diam.
B.RUMUSAN MASALAH

1.Apa itu kromatografi lapis tipis(KLT),kromatografi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(HPLC / KCKT) dan Kromatografi Gas

2. Bagaiamana prosedur kerja kromatografi lapis tipis(KLT),kromatografi Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (HPLC / KCKT) dan Kromatografi Gas

3.Bagaimana hasil penelitian atau pengamatan menggunakan kromatografi lapis

tipis(KLT),kromatografi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC / KCKT) dan
Kromatografi Gas

C. TUJUAN MASALAH

1.Untuk mengetahui tentang kromatografi lapis tipis(KLT),kromatografi Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (HPLC / KCKT) dan Kromatografi Gas

2.Untuk mengetahui tentang prosedur kerja kromatografi lapis tipis(KLT),kromatografi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC / KCKT) dan Kromatografi Gas

3.Untuk mengetahui tentang hasil pengamatan atau penelitian kromatografi lapis

tipis(KLT),kromatografi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC / KCKT) dan
Kromatografi Gas
 BAB 2

PENBAHASAN

A.Kromatografi Lapis Tipis ,Kromatografi Cair KInerja Tinggi dan Kromatografi Gas

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapisan tipis (KLT) adalah suatu teknik kromatografi yang

digunakan untuk memisahkan campuran yang tidak volatil. [1] Kromatografi lapisan tipis
dilakukan pada selembar kaca, plastik, atau aluminium foil yang dilapisi dengan lapisan
tipis bahan adsorben, biasanya silika gel, aluminium oksida, atau selulosa. Lapisan tipis
adsorben diketahui sebagai fasa stasioner (atau fasa diam). KLT merupakan metode
sederhana yang dapat digunakan untuk mendapatkan fingerprint suatu senyawa, dimana
dengan metode ini akan didapatkan parameter fingerprint yaitu nilai Rf, Spektrum,
Kromatogram dan penampakan bercak pada plat KLT yang menunjukkan kandungan
senyawa yang terkandung dalam ekstrak.

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara

sampel dengan pelarut yang digunakan.[1] Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari
bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin
dipisahkan.[1] Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen.[1] Semakin
dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase
gerak tersebut.

Aktivitas farmakologi obat herbal sangat tergantung dari kandungan fitokimia yang
ada di dalamnya, sehingga dibutuhkan standardisasi untuk memperoleh pemastian kualitas,
pofil fitokimia, dan aktivitas farmakologi yang konsisten dari obat herbal tersebut (Liang et
al., 2004). Senyawa fenol merupakan kandungan terbesar dalam daun sirih yang merupakan
penentu aktivitas farmakologisnya, sehingga perlu dilakukan identifikasi untuk mengetahui
profil standar senyawa tersebut. Metode standar yang digunakan untuk standardisasi bahan
baku obat herbal atau produk herbal menurut WHO adalah fingerprint. Penentuan
fingerprint kandungan kimia suatu tanaman merupakan metode yang dapat digunakan
untuk menjamin integritas, kesamaan, dan menentukan perbedaan profil kandungan kimia
dari suatu tanaman.

Identifikasi kandungan kimia dalam daun sirih dilakukan dengan sistem KLT: fase
diam silika gel 60 F254 dan fase gerak toluen: etil asetat atau dengan fase diam HPTLC
silika gel 60 GF254 dan fase gerak campuran toluen: etil asetat: asam formiat

2.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC / KCKT)

Kromatografi cair berperforma tinggi ((Inggris): high performance liquid

chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang
biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC
berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap
zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya
merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa
senyawa sekaligus karana setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam
tertentu dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan
mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu
senyawa. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam
dalam bentuk kromatogram.

Metil prednisolon adalah obat kortikosteroid atau glukokortikoid sintetis. Seperti

kebanyakan adrenokortikal steroid, metil prednisolon biasanya digunakan sebagai obat anti
inflamasi. penetapan kadar metil prednisolon menggunakan KCKT dengan pelarut sampel
maupun larutan baku menggunakan kloroform : asam asetat glasial (97:3) dengan eluen
butil klorida : butil klorida jenuh air : tetrahidrofuran : metanol dan asam asetat glasial
(95:95:14:7:6) menggunakan detektor UV 254 nm, kolom L3 4 mm x 25cm, kecepatan alir
1,0 ml/min. Menurut Farmakope Indonesia Edisi V penetapan kadar metil prednisolon
menggunakan KCKT dengan eluen air : tetrahidrofuran : dimetilsulfoksida : butanol
(149:40:10:1) dan pelarut sampel maupun larutan baku yaitu campuran air : tetrahidrofuran:
asam asetat glasial (72:25:3)

3.Kromatografi Gas (KG).

Kromatografi gas (KG) merupakan jenis kromatografi yang umum digunakan

dalam analisis kimia untuk pemisahan dan analisis senyawa yang dapat menguap tanpa
mengalami dekomposisi. Penggunaan umum KG mencakup pengujian kemurnian senyawa
tertentu, atau pemisahan komponen berbeda dalam suatu campuran (kadar relatif komponen
tersebut dapat pula ditentukan). Dalam beberapa kondisi, KG dapat membantu
mengidentifikasi senyawa. Dalam kromatografi preparatif, KG dapat digunakan untuk
menyiapkan senyawa murni dari suatu campuran. Dalam kromatografi gas, fasa
gerak berupa gas pembawa, biasanya gas inert seperti helium atau gas yang tidak
reaktif seperti nitrogen. Fasa diam berupa lapisan cairan mikroskopik atau polimer di
atas padatan pendukung fasa diam, yang berada di dalam tabung kaca atau logam yang
disebut kolom. Instrumen yang digunakan untuk melakukan kromatografi gas disebut
dengan gas kromatograf (atau "aerograf" atau "pemisah gas"). kromatografi
gas memiliki prinsip kerja yang didasari dari pemisahan fisik senyawa organik pada suhu
tertentu, di mana senyawa tersebut dibawa oleh suatu gas pembawa menuju kolom partisi.
Setiap senyawa akan memiliki kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom sesuai
dengan nilai kepolaran.

Kegunaan dari gas chromatography adalah untuk identifikasi semua jenis senyawa
organik yang mudah menguap dan juga dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif senyawa dalam suatu campuran (McNair & Miller, 2009). Analisis kuantitatif
dengan gas chromatography menggunakan metode standar internal. Metode ini digunakan
karena terdapat ketidakpastian yang disebabkan injeksi sampel dan kecepatan aliran.
Metode ini seringkali digunakan untuk sampel yang tidak sesuai atau tidak mungkin
diinjeksi langsung pada gas chromatography.
Metanol adalah senyawa kimia dengan rumus kimia CH3OH (Hikmah dan Zuliyana, 2010).
Metanol relatif memiliki toksisitas rendah. Efek toksik muncul akibat hasil metabolisme
metanol di hati yaitu asam format yang bersifat toksik. Metanol diubah menjadi
formaldehid di hati oleh enzim alkohol dehidrogenase. Formaldehid dioksidasi oleh
bantuan enzim formaldehid dehidrogenase menjadi asam format. Metabolisme asam format
tergantung pada kadar tetrahidrofolat yang akan membentuk 10-formyl tetrahydrofolate
yang dapat mengubah asam format menjadi karbon dioksida (CO2) dan air (H2O)

Penentuan metanol di dalam tubuh, seperti darah dapat dianalisis menggunakan gas
chromatography. Sampel darah terlebih dahulu dipreparasi untuk menghilangkan pengotor.
Pada penelitian ini sampel darah akan dipreparasi untuk menentukan kadar metanol dalam
darah menggunakan gas chromatography.

B.Metode Kerja Kromatografi Lapis Tipis,Kromatogarafi Cair Kinerja Tinggi, dan

Kromatografi Gas

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Metode kerja atau prosedur kerja KLT pada Identifikasi Senyawa Golongan Fenol
Dari Ekstrak Etanol Daun Sirih Hijau (Piper Betle Linn.) Dengan Metode Klt-
Spektrofotodensitometri.yaitu :

 Ekstraksi senyawa golongan fenol dari daun sirih hijau dilakukan menggunakan
pelarut etanol 96% dengan metode refluks pada suhu 60 0C selama 2 jam.
 Fase gerak yang digunakan untuk memisahkan senyawa golongan fenol dari daun
sirih hijau adalah campuran toluen: etil asetat = 93: 7 v/v (fase gerak I) dan
campuran toluen: etil asetat: asam formiat (3:3:0,2) v/v (fase gerak II).
 Masing-masing bercak diidentifikasi dengan pereaksi warna FeCl3 dan
FolinCiocalteau. Evaluasi pemisahan yang baik dilihat dari nilai Rs (Resolusi) dan
Tf (Tailing Factor) dari masing-masing fase gerak.
  Fase gerak terbaik digunakan untuk tahap selanjutnya untuk menentukan profil
fingerprint sampel. Sampel dielusi dengan fase gerak terpilih, yaitu fase gerak yang
memenuhi persyaratan nilai Rs dan Tf. Identifikasi senyawa golongan fenol
dilakukan dengan penampak bercak menggunakan pereaksi warna, yaitu FeCl3 dan
FolinCiocalteau.
 Kromatogram dan hasil reaksi yang diperoleh diamati dan tentukan bercak yang
positif senyawa golongan fenol ekstrak etanol daun sirih. Puncak kromatogram
yang positif senyawa golongan fenol dipindai untuk melihat bentuk spektrum
senyawa fenol.

2.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC/ KCKT)

Metode kerja atau prosedur kerja HPLC pada Pengembangan Metode Penetapan
Kadar Metil Prednisolon Dalam Sediaan Dry Injection Dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (Kckt) yaitu :

 Pembuatan Larutan Induk Metil Prednisolon

Sebanyak 50,0 mg baku pembanding metil prednisolon ditimbang seksama

kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 50 ml. Dilarutkan dalam campuran pelarut asam
asetat glasial : kloroform (3:97) kemudian disonifikasi selama 15 menit dan ditambah lagi
pelarut asam asetat glasial : kloroform (3:97) dan ditandabataskan.

 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum untuk Analisis

Serapan ultraviolet larutan standar metil prednisolon dalam asam asetat glasial :
kloroform (3:97) pada panjang gelombang 200 – 400 nm dipindai menggunakan
Spektrofotometer UV untuk menentukan panjang gelombang maksimumnya.

 Optimasi Fase Gerak

Larutan standar metil prednisolon diinjeksikan sebanyak 20 µL pada komposisi fase

gerak asetonitril : metanol pada perbandingan (80:20); (70:30); (60:40) ; (50:50); (45:55);
(40:60) dengan kecepatan alir 0,8 – 1,0 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang
maksimum kemudian dicatat data mengenai waktu retensi, luas puncak, jumlah plat teoritis,
resolusi, faktor kapasitas dan asimetrisitasnya.

 Uji Kesesuaian Sistem

Larutan standar metil prednisolon diinjeksikan sebanyak 20 µL ke alat KCKT

dengan fase gerak yang telah ditentukan, diulangi sebanyak 6 kali. Kemudian dihitung
jumlah plat teoritis, resolusi, faktor kapasitas, asimetrisitas, dan % RSD.

 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas

Larutan blanko dibuat menggunakan pelarut asam asetat glasial: kloroform (3:97)
dan deret larutan standar metil prednisolon dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10, 12 bpj (b/v).
Kemudian dipreparasi sesuai prosedur kemudian diinjeksikan ke alat KCKT. Dilakukan
analisis regresi linier luas puncak terhadap konsentrasi deret larutan standar dan dibuat
kurva kalibrasinya dengan persamaan garis regresi linier (y = bx + a).

 Limit Deteksi (LoD) dan Limit Kuantitasi (LoQ)

Larutan sampel metil prednisolon pada sediaan dry injection dipreparasi seperti
prosedur uji kesesuaian sistem. Kemudian 20 µL larutan sampel diinjeksikan pada alat
KCKT. Setelah itu dianalisis berdasarkan persamaan kurva kalibrasi larutan standar metil
prednisolon sebanyak 6 kali penginjeksian sampel.

 Uji Selektivitas

Setelah diketahui panjang gelombang maksimum dari hasil penentuan panjang

gelombang maksimum untuk larutan metil prednisolon yaitu 243 nm. Selanjutnya, dibuat
larutan baku dan larutan uji metil prednisolon. Kemudian diinjeksikan ke alat KCKT
sebanyak 20µl dan dicatat waktu retansinya. Hasil kromatogram metil prednisolon larutan
baku dan larutan uji harus menunjukkan waktu retensi yang sama.
  Akurasi dan Presisi

Untuk keperluan uji akurasi dibuat larutan sampel metil prednisolon pada
sediaan dry injection dengan konsentrasi 100 mg (80%), 125 mg (100%) dan 150 mg
(120%). Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur uji kesesuaian sistem. Larutan sampel
tersebut diambil 20 µL dan diinjeksikan ke dalam alat KCKT kemudian diulangi sebanyak
6 kali. Hasil yang diperoleh dihitung persentase akurasi dan perolehan kembali dari
masing-masing larutan tersebut. Nilai ratarata % akurasi disyaratkan ≤ 2%. Sedangkan nilai
perolehan kembali dihitung dengan rumus:

% Perolehan Kembali = Konsentrasi sampel diperoleh /Kosentrasi sebenarnya X 100 %

Untuk keperluan uji presisi dibuat larutan sampel metil prednisolon pada sediaan
dry injection dengan menimbang sampel sebanyak 6 kali. Setelah itu dipreparasi sesuai
prosedur uji kesesuaian sistem. Larutan sampel tersebut diambil 20 µL dan diinjeksikan ke
dalam alat KCKT. Kemudian dihitung % RSD dari masing-masing konsentrasi dengan
syarat batas nilai % RSD ≤ 2%.

 Penetapan Kadar Metil Prednisolon

pada Sediaan Dry Injection Sampel metil prednisolon ditimbang 125 mg

dimasukkan ke corong pisah dan ditambahkan 20 ml pelarut kloroform : asam asetat glasial
(97:3). Kemudian dikocok selama 3 menit dan didiamkan hingga terbentuk 2 fase. Setelah
itu diambil fase bawah dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Proses ekstraksi dalam
corong pisah diulangi 2 kali hingga sampel larut sempurna. Larutan sampel dalam labu
takar 100 ml ditambah pelarut kloroform : asam asetat (97:3) hingga tanda garis batas dan
dihomogenkan. Kemudian dilakukan pengenceran 25 kali dengan memipet dengan seksama
1,0 ml larutan sampel dimasukkan ke dalam tabu takar 25 ml dan ditambahkan pelarut
hingga tanda garis batas. Setelah itu dilakukan pengenceran 5 kali dengan memipet dengan
seksama 5,0 ml dimasukkan labu takar 25 ml dan ditambahkan pelarut hingga tanda garis
batas lalu disaring dengan mikrofilter 0,45 µm.
3.Kromatografi Gas (KG)

Metode kerja atau prosedur kerja KG pada Optimasi Penentuan Kadar Metanol
dalam Darah Menggunakan Gas Chromatography yaitu :

 Sampel diambil sebanyak 1 mL menggunakan pipet volume, kemudian ditambah 10

mL aquades, dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Didistilasi menggunakan
distilasi sederhana selama 15 menit, dengan suhu dijaga sekitar ± 97oC (titik didih
n-propanol). Distilat dimasukkan ke dalam vial plastik. Distilat dianalisis
menggunakan GC-FID
 Sampel diambil sebanyak 1 mL menggunakan pipet volume dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, kemudian ditambah kloroform 1 mL, dan disentrifuse selama 2 menit
dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan dipipet dan dimasukkan ke dalam vial
plastik. Supernatan dianalisis menggunakan GC-FID
 Digunakan tabung SPE NT3, bagian bawah dilapisi dengan kertas saring whatman,
kemudian ditambah Florisil® sampai tanda batas tabung dan dilapisi kembali
dengan kertas saring whatman. Pengkondisian dilakukan dengan penambahan
pelarut kloroform, dengan ditambah pelarut kloroform sebanyak 2 mL sampai
menetes. Tabung SPE NT3 dikondisikan selama 24 jam dalam keadaan tertutup.
Sampel dimasukkan sebanyak 1 mL, dan dielusi dengan pelarut kloroform sebanyak
1 mL. Larutan analit hasil dari ekstraksi fase padat-cair dimasukkan ke dalam vial
plastik. Larutan analit dianalisis menggunakan GC-FID
 Optimasi terhadap kondisi gas chromatography dilakukan sebelum melakukan
pengukuran kadar sampel berdasarkan prosedur yang telah dimodifikasi yaitu suhu
injektor 250oC, suhu detektor 300oC dengan split rasio 1:50, suhu awal kolom
50oC ditahan selama dua menit pada suhu tersebut, ditingkatkan secara bertahap
sebesar 10oC/menit sampai suhu mencapai 200oC dan ditahan selama lima menit.
Laju alir helium dari kolom yang terpilih adalah 1,2 mL/menit, laju alir nitrogen 30
mL/menit, laju alir gas hidrogen 35 mL/menit, dan laju udara sebagai pengoksida
350 mL/menit. Sampel diinjeksikan secara urut sebanyak 1,0 µL
C. Hasil Penelitian atau pengamatan Kromatografi Lapis Tipis ,Kromatografi Cair KInerja
Tinggi dan Kromatografi Gas

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Hasil penelitian KLT pada Identifikasi Senyawa Golongan Fenol Dari Ekstrak
Etanol Daun Sirih Hijau (Piper Betle Linn.) Dengan Metode Klt-
Spektrofotodensitometri.yaitu :

Berdasarkan evaluasi hasil pemisahan, maka fase gerak yang terpilih adalah fase
gerak I yaitu campuran toluen: etil asetat (93: 7 v/v). Evaluasi hasil pemisahan dilihat dari
nilai Rs dan Tf masing-masing fase gerak. Nilai Rs dan Tf dari fase gerak I telah memenuhi
persyaratan, yaitu Rs > 1,5 dan nilai Tf berada pada rentang 0,9-1,4 (Tabel 1).

(a) = Fase Gerak I (Toluen: Etil Asetat = 93:7 v/v); (b) = Fase Gerak II (Toluen: Etil
Asetat: Asam Format = 3:3:0,2 v/v); (A) = Kromatogram pada Panjang Gelombang 210
nm; (B) = Pengamatan Bercak Kromatogram Sampel Ekstrak Etanol Daun Sirih; (I) = Sinar
Tampak; (II) = UV 254; (III) = sinar tampak setelah dicelup dengan pereaksi FeCl3; (IV) =
sinar tampak setelah disemprot dengan pereaksi Folin-Ciocalteau; (1), (mP1), (S1) =
Puncak senyawa golongan fenol 1; (2), (mP2), (S2) = Puncak senyawa golongan fenol 2;
(3), (mP3), (S3) = Puncak senyawa golongan fenol 3

Identitas fingerprint ditunjukkan dengan pengamatan warna bercak kromatogram

pada plat dan dilengkapi dengan pola puncak kromatogram yang merupakan profil
fingerprint yang lebih objektif. Hasil identifikasi dengan pereaksi warna menunjukkan
terdapat tiga spot yang positif senyawa golongan fenol. Spot-spot tersebut teridentifikasi
disekitar Rf 0,19 (mP1); 0,42 (mP2); dan 0,62 (mP3). Hal ini menunjukkan, dalam ekstrak
daun sirih yang diteliti, terdapat tiga senyawa golongan fenol dengan polaritas yang
berbeda, ditunjukkan dengan adanya tiga posisi bercak dengan urutan polaritas mP1> mP2
> mP3. Setiap puncak kromatogram yang diduga positif senyawa golongan fenol dipindai
kembali untuk mengetahui bentuk spektrum senyawa fenol.
 Berdasarkan hasil pengukuran spektrum masing-masing puncak kromatogram,
ketiga puncak yang teridentifikasi senyawa golongan fenol menghasilkan intensitas
maksimum pada panjang gelombang 283 nm, yang menunjukkan ketiga senyawa tersebut
miliki struktur elektronik yang sama sehingga memberikan serapan maksimum pada daerah
pangjang gelombang yang sama.

3.Kromatografi Gas

Hasil penelitian KG pada Optimasi Penentuan Kadar Metanol dalam Darah

Menggunakan Gas Chromatography yaitu :

a.Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan menggunakan larutan standar

metil prednisolon dengan konsentrasi 10 µg/ml (b/v). Hasil pengukuran serapan maksimum
menunjukkan bahwa metil prednisolon memberikan serapan maksimum pada panjang
gelombang 243 nm sebagaimana yang ditunjukn oleh Gambar 1. Pengukuran serapan
maksimum dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri UV. Metil prednisolon dapat
diukur dengan spektrofotometer UV karena memiliki gugus kromofor yaitu hidroksil (-OH)
dan karbonil (C=O) sebagaimana terlihat pada Gambar 2. Pada alat spektrofotometer diatur
rentang panjang gelombang 200 – 400 nm kemudian dimasukkan blanko dan larutan
standar. Setelah itu dilakukan pemindaian spektrum. Serapan sampel yang diukur pada
panjang gelombang maksimum berada pada rentang serapan antara 0,2 – 0,8.

b.Optimasi Fase Gerak

Fase gerak merupakan parameter penting dalam pemisahan dengan kromatografi

terutama KCKT. Penentuan fase gerak yang digunakan berdasarkan pertimbangan sifat
kepolaran sampel yang akan dipisahkan. Sistem pemisahan yang biasa digunakan pada
analisis metil prednisolon dengan KCKT adalah fase terbalik. Fase diam yang digunakan
yaitu kolom C18 yang bersifat non polar. Eluen yang digunakan memiliki selektivitas
berlainan dalam fungsinya sebagai fase gerak. Metode elusi yang digunakan untuk
pengoptimuman fase gerak menggunakan metode elusi isokratik. Interaksi yang cukup
rendah antara asetonitril dan metanol dengan fase diam disebabkan oleh sifat semi polar
kedua fase gerak tersebut berdasarkan nilai indeks kepolaran yaitu metanol 5,1 dan
asetonitril 5,8. Sebaliknya, interaksi relatif lebih kuat kedua pelarut tersebut dengan
komponen sampel menyebabkan seluruh komponen sampel keluar bersamaan dengan
pelarut dalam waktu yang relatif cepat.

Sampel dilarutkan menggunakan pelarut sampel campuran kloroform dan asam

asetat yang berfungsi untuk menarik metil prednisolon. Penggunaan asam asetat juga
diketahui dapat meningkatkan waktu retensi dan resolusi. Peningkatan waktu retensi
menyebabkan komponen sampel keluar dari kolom tidak bersamaan dan secara langsung
akan meningkatkan resolusi dari puncak yang dihasilkan (Johnson dan Stevenson, 1991).
Pada penelitian ini diperoleh fase gerak optimum untuk analisis metil prednisolon dengan
KCKT adalah asetonitril : metanol dengan perbandingan 45:55 (v/v) dengan laju alir 1,0
ml/menit, volume injeksi 20 µl pada panjang gelombang 243 nm.
c.Uji Kesesuaian

Sistem Uji Kesesuaian sistem dilakukan dengan penggunaan larutan standar metil
prednisolon 10 bpj (b/v) dengan pengulangan 6 kali penginjeksian pada alat KCKT. Pada
uji kesesuaian sistem terdapat parameter untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum
analisis meliputi jumlah plat teoritis, resolusi, tailing factor, faktor kapasitas dan nilai
koefisien variasi dari serangkaian injeksi. Syarat utama suatu sistem dinyatakan sesuai
adalah % RSD dari luas area yaitu ≤ 2% (Gandjar dan Rohman, 2007). Berikut adalah data
hasil pengujian kesesuain sistem yang disajikan pada Tabel 3.

Jumlah plat teoritis (N) adalah banyaknya distribusi keseimbangan dinamis yang
terjadi di dalam suatu kolom. Dalam proses pemisahan diharapkan menghasilkan harga N
yang besar. Pada umumnya efisiensi kolom KCKT meningkat dengan semakin kecilnya
ukuran partikel yang ada di dalam kolom (Gandjar dan Rohman, 2007). Hasil rata-rata
perhitungan jumlah plat teoritis diperoleh 2645,669 yang memenuhi syarat uji kesesuaian
sistem yaitu > 2500 sehingga dihasilkan pemisahan yang lebih baik
d.Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas

Dari larutan baku metil prednisolon 2,4,6,8,10,12 bpj (b/v) disaring dengan membran filter
0,45 µm kemudian masing-masing larutan baku tersebut diinjeksikan ke dalam alat KCKT
sehingga diperoleh luas area. Setelah pengukuran diperoleh data luas area standar metil
prednisolon pada Tabel 4.

Dari kurva kalibrasi diperoleh persamaan regresi linier y = 260580x + 4031480 dan
nilai koefisien relasinya (r) = 0,9969. Nilai koefisien relasi (r) yang diperoleh mendekati 1
sehingga kurva kalibrasi yang dihasilkan baik karena hubungan antara luas area (y) dengan
konsentrasi (x) linier.
e.Penentuan Nilai Batas Limit Deteksi (LoD) dan Batas Limit Kuantitasi (LoQ)

Uji batas deteksi dan batas kuantitasi dilakukan untuk mengetahui batas deteksi dan
kuantitasi terendah dari sampel yang masih dapat menghasilkan data dengan akurasi dan
presisi yang baik Batas deteksi yang diperoleh dari hasil pengujian sebesar 0,9873 µg/ml
dan batas kuantitasi 3,2909 µg/ml.

f.Penentuan Uji Selektivitas

Uji selektivitas dilakukan dengan penyuntikan 6 kali standar metil prednisolon

dengan konsentrasi 10 bpj (b/v) dan 6 kali larutan sampel dengan konsentrasi 10 bpj. Syarat
untuk uji selektivitas adalah jika hasil kromatogram larutan standar metil prednisolon
memiliki waktu retensi yang hampir sama dengan larutan sampel. Dari hasil pengujian
selektivitas diperoleh hasil sebagaimana pada Tabel 5.

Dari hasil tersebut maka metode ini dinyatakan selektif terhadap senyawa yang
ditetapkan kadarnya. Uji ini dilakukan untuk memperoleh kepastian tidak terjadinya
gangguan oleh senyawa lain yang terdapat pada sampel metil prednisolon sehingga
memberikan hasil pengukuran yang terbebas dari pengaruh matriks.
g.Penentuan Uji Akurasi

Uji akurasi dilakukan pada 3 konsentrasi sampel yaitu 8 µl/ml (80%), 10 µl/ml
(100%), dan 12 µl/ml (120%). Kemudian dihitung pula nilai perolehan kembali (%
recovery). Hasil perhitungan pengujian rata-rata akurasi diperoleh range perolehan kembali
(%recovery) antara 100,38% – 101,17% sebagaimana terlihat pada Tabel 6.

h.Penentuan Uji Presisi

Uji presisi dilakukan pada 6 kali penimbangan sampel dengan konsentrasi 10 bpj
(b/v). Pengujian dilakukan intra day yaitu dalam 1 hari dan inter day (selama 3 hari
berturut-turut). Syarat hasil uji presisi adalah simpangan baku relatif (% RSD) ≤ 2
(Harmita, 2004). Hasil uji ratarata presisi intra day dan inter day diperoleh % RSD sebesar
0,12%. Hasil ini memenuhi syarat yaitu ≤ 2 sehingga hasil analisis dinyatakan presisi.
i.Penetapan Kadar Metil Prednisolon dalam Sampel Sediaan Dry Injection

Dari hasil penetapan kadar metil prednisolon dalam sediaan dry injection diperoleh
hasil sebagaimana pada Tabel 7.

BAB 3
 BAB 3

PENUTUP

A.Kesimpulan

Adapun kesimpulan dari makalah ini yaitu :

1.Profil fingerprint senyawa golongan fenol ekstrak etanol daun sirih (Piper betle Linn.)
ditunjukkan pada Rf 0,19; 0,42; dan 0,62. Bercak yang positif senyawa golongan fenol
berwarna hitam berdasarkan identifikasi dengan pereaksi FeCl3 dan biru tua dengan
pereaksi Folin-Ciocalteau dan panjang gelombang maksimum senyawa golongan fenol
adalah 283 nm.

2.Optimasi metode analisis metil prednisolon diperoleh hasil bahwa metil prednisolon pada
sediaan dry injection dapat dianalisis menggunakan kolom Phenomenex C18 dengan
kondisi optimum fase gerak asetonitril : metanol (45:55) dengan laju alir 1,0 ml/menit
pada panjang gelombang 243 nm. Pengembangan metode analisis baru ini dinyatakan
valid dengan dipenuhinya syarat-syarat pada validasi metode. Bila akan dilakukan
pengujian lebih lanjut, disarankan untuk lebih memastikan validitas metode baru dengan
pengujian ulang menggunakan material standar pembanding terserfifikasi (SRM)
fluorometolon untuk mengetahui kadar metil prednisolon ester (17-metil prednisolon
hemisuksinat) dan metil prednisolon bebas sehingga dapat dihitung kadar metil
prednisolon on the dried basis (ODB).

3.Metode distilasi, ekstraksi cair-cair, dan ekstraksi fase padat dalam penentuan kadar
metanol dalam darah yang diuji menggunakan gas chromatography memiliki pengaruh
dan memberikan hasil yang paling optimum terdapat pada metode distilasi. Berdasarkan
nilai dari %RSD dan %recovery, metode distilasi menghasilkan %RSD sebesar 2,16%
dan %recovery sebesar 98,37%.
B.Saran

Semoga dengan rangkaian dan susunan materi makalah ini dapat menambah
,memperluas dan wawasan pembaca, saya menyadari bahwa susunan maklah ini masih
belum sempurna untuk saya meminta kritik dan saran yang membangun sehingga
kedepannya dapat menulis atau menyusun sesuai kreteria susunan karya ilmiah pada
umumnya.
 DAFTAR PUSTAKA

Ni Made Pitri Susanti, Luh Putu Mirah Kusuma Dewi, Harlina Setiawati Manurung, Made
Agus Gelgel Wirasuta.2017. Identifikasi Senyawa Golongan Fenol Dari Ekstrak
Etanol Daun Sirih Hijau (Piper Betle Linn.) Dengan Metode Klt-
Spektrofotodensitometri. Jurnal Metamorfosa IV (1): 108-113 (2017)

Dewi Kurnia1 , Eny Tri Pujilestari1 , Indro Pamudjo1 1Prodi Sarjana Farmasi, Sekolah
Tinggi farmasi Bandung.2019. Pengembangan Metode Penetapan Kadar Metil
Prednisolon Dalam Sediaan Dry Injection Dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (Kckt). Analit: Analytical and Environmental Chemistry Volume 4, No.
01, April 2019

Edy Cahyono ,Hartias Rizalina , Sri Mursiti , Bowo Nurcahyo , dan Supartono.2018.
Optimasi Penentuan Kadar Metanol dalam Darah Menggunakan Gas
Chromatography. Indonesian Journal of Chemistry Science 7 (3) (2018)