LABORATORIUM KIMIA ANALITIK II

POLITEKNIK NEGERI LHOKSEUMAWE

SEMESTER GANJIL 2023-2024

“HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

(HPLC)”

NAMA : ARIEL AKMAL

NIM : 2022244010002

KELAS / KELOMPOK : 2A / D

TANGGAL PRAKTIKUM : 04 DESEMBER 2023

DOSEN PENGASUH : Reza Fauzan, ST., M.Sc.

KEMENTRIAN PENDIDIKAN, KEBUDAYAAN,

RISET DAN TEKNOLOGI

2023-2024
 HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I. TUJUAN PERCOBAAN

Setelah melakukan percobaan ini diharapkan mahasiswa dapat:

1. Mengoperasikan alat LC 20AD Prominence Shimadzu dengan benar

2. Membuat larutan kalibrasi dari zat padat kafein

3. Membuat kurva kalibrasi dengan alat LC 20AD Prominence Shimadzu

4. Menentukan konsentrasi kafein dalam sampel larutan

II. MSDS BAHAN YANG DIGUNAKAN

HPLC menggunakan pelarut organik yang mudah menguap, gunakan masker sebagai
pelindung tambahan selain jas lab, sarung tangan dan kaca mata. Semua larutan yang digunakan
harus bebas dari partikel yang dapat menghambat kerja pompa, sehingga persiapan penyaringan
dengan membran yang disertai sonifikasi harus dilakukan sebelum pengoperasian alat.
Perhatikan dengan seksama SOP (standard operating porocedur) alat.

III. PROSEDUR KERJA

3.1 PEMBUATAN LARUTAN INDUK DAN LARUTAN KALIBRASI

1. Timbang dengan teliti standar kafein 0,050g

2. Larutkan dengan metanol dalam gelas kimia
3. Pindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar 100mL dan tepatkan sampai tanda
batas (larutan standar induk). Hitung konsentrasi larutan.
4. Pipet masing-masing 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mL larutan standar induk ke dalam labu
takar 10 \ mL, tambahkan metanol sampai tanda batas. Hitung konsentrasi masing-
masing larutan kalibrasi.

3.2 START UP HPLC :

 1. Siapkan fase gerak yang akan digunakan (metanol solvent B- akuabides solvent A)
2. Nyalakan alat HPLC secara berurutan: pompa (A), kolom (B) dan detektor (C)
3. Setelah ketiga lampu “remote” pada alat ABC nyala, nyalakan komputer (PC).
Tunggu sampai muncul menu utama windows
4. Klik Lab Solution
5. Ketik Admin untuk user ID, klik OK
6. Klik Instrument: klik LC/HP-PC 2kali
7. Terdengar bunyi “beep” yang menandakan koneksi instrument HPLC dengan PC.
Akan muncul menu Real Time Analysis 8. Sebelum memulai analisa, lakukan
“purging” fase gerak masing-masing pompa untuk membersihkan selang dari
gelembung udara (± 10 menit)

CARA PURGING

 Buka tombol DRAIN ke arah kiri, pilih Instrumen parameter view (Data aquisition) lalu
klik Normal
 Isi data : laju alir 1 ml/menit Solvent B 0% (untuk purging dengan aquabides). Download
 Tekan “purge” dan tunggu sampai proses purging selesai
 Ulangi langkah di atas dengan data yang sama tetapi Solvent B 100% (untuk purging
dengan metanol). Ulangi langkah di atas dengan data yang sama tetapi Solvent B 90%
(untuk purging dengan aquabides 10% dan metanol 90%).
 Setelah proses purging selesai, tutup kembali tombol DRAIN agar pompa aktif.

3.3 PEMMBUATAN METODE PENGUKURAN

1. Pilih File: Klik New methode file untuk membuat metode baru

Klik Open mehode file untuk mengukur sampel dengan metode

yang sudah ada

2. Pilih Instrument parameter view:

Klik Normal (untuk menampilkan parameter yang harus diisi)

Klik Advance (untuk menampilkan parameter lebih detail)

  Pada tab Data Acquisition:

Masukkan lama waktu analisa pada kolom:

LC stop time 5 menit, klik Apply to All aquisition time untuk menyesuaikan

End time secara otomatis.

 Pada tab Pump:

Pilih Low pressure gradien (menggunakan lebih dari 1 solven). Pilih isokratik

(jika menggunakan 1 fase gerak)

Total flow : 1,0 ml/menit

Pump B : 90% (fase gerak metanol 90% : aquabides 10%)

Pump C : 0

Pump D : 0

 Pada tab Detector:

Cell temperature : 400C.

Wave length : 273 nm (untuk kafein)

 Pada tab Column Oven: Temp. Column: Oven temp : 40 0C

3. Kirim data ke alat HPLC dengan cara klik Download

4. Simpan metode yang telah dibuat:

Klik File, save methode file as : beri nama metode: buat folder, tanggal, nama

methode: (contoh: 020919, kafein, methode), klik SAVE.

5. Aktifkan instrument dengan cara klik Icon instrument active/inactive di menu

bar. Tunggu sampai alat READY (suhu oven sudah tercapai, pressure pompa

sudah stabil)

3.4 BASELINE CHECK.

1. Klik Methode
2. Klik Baseline check parameter Isi data: Centang Noise start 0 end 3 Threshold 50
 Centang Drift start 0 end 3 Theshold 5.000

Max time 15 menit, lalu Klik OK

Untuk melihat proses Baseline check: klik Toggle (centang) baseline check, tunggu
sampai hasil menunjukkan [Pass]. Jika keluar “Fail Baseline”, ulangi Baseline check sampai
“Pass”. Instrumen siap untuk analisa/injeksi

3.5 INJEKSI LARUTAN STANDAR DAN SAMPEL

1. Pilih icon Single start: Start single run

2. Isi parameter pada tab single run: nama sampel, ID, methode file (klik kanan, cari folder,
klik 2x, isi tanggal kafein 20 ppm) OK Akan muncul di layar: Start Putar tuas injektor ke
atas, Injek larutan standard sebanyak 20µl (tanpa gelembung udara) Turunkan tuas ke
bawah, instrument akan start otomatis
3. Ulangi langkah yang sama untuk standard lainnya
4. Ulangi langkah yang sama untuk injeksi sampel 5. Setelah semua larutan diinjeksikan,
lakukan pencucian kolom minimum 10 menit dengan metanol.

3.6 PENCCUCIAN KOLOM DAN SHUTDOWN

1. Pencucian dengan metanol: Pilih methode Cuci methanol, Download Putar tuas ke atas,
turunkan kembali untuk Start
2. Selesai pencucian kolom, matikan PC dengan cara klik Toggle active/inactive instrument
pada menu bar.
3. Tutup layar Real Time Analysis
4. Matikan instrumen HPLC secara berurutan :Detector (C), Kolom (B), Pompa (A).

3.7 PENGOLAHAN DATA (POSTURN)

1. Klik Lab Solution; Klik Postrun

2. Panggil data analisis, pilih data pertama yang akan diedit dengan cara “drag” ke kanan
atau klik 2x pada nama data: tanggal kafein standar 20 ppm, klik WIZARD
3. Integrasi data 20 ppm, dengan cara mengatur minimum area (untuk membersihkan
puncak pengotor), klik Next
4. Centang Select, klik Next, Next, Next
 5. Tulis Nama sampel, Konsentrasi masing-masing larutan standard yang sudah
diinjeksikan, misal 20-100 ppm pada masing-masing kolom.
6. Klik Finish
7. Apply to methode
8. Conteng QA/QC parameter, klik OK
9. Klik Main; Klik Postrun Batch
10. Buat Batch Table : Panggil data satu persatu atau drag in dari larutan standard 20 ppm dst
sampai semua sampel
11. Tulis nama sampel misalnya Kafein, Klik sample type, klik standard, untuk std 1 pilih
initialize calibration curve, OK
12. Ubah Sample Type data standard 2-5 dengan Standard, klik OK
13. Ubah Sample Type data sampel menjadi Unknown, klik OK
14. Ubah Methode File sesuai dengan methode yang sudah diedit Contoh: 020919 kafein
post. Kopi ke bawah dengan cara klik kanan, Fill Down
15. Isi Level# dengan std 1, 2, 3, 4, 5 dan 0 untuk sampel, pindahkan kursor ke kolom
Sampel Name kiri atas
16. Klik Start Postrun Batch, simpan data misal 020919 kafein post batch, Save, Yes, OK

3.7 FORMAT LAPORAN

1. Untuk mencetak data kurva kalibrasi: Klik Main; klik Reeport Format
2. Klik toggle Cal curve; Klik satu kali (drag in) ke format laporan
3. Klik File, klik Browse, ambil data larutan standard konsentrasi larutan paling besar;
apply; OK
4. Besarkan grafik kurva kalibrasi di format laporan
5. Untuk mencetak data sampel: Klik toggle Summary (Compound); Klik satu kali (drag in)
ke format laporan
6. Klik File; Klik Add; ambil data sampel (klik 2x); Klik Apply; OK
7. Besarkan kromatogram sampel di format laporan
8. Lakukan hal yang sama untuk sampel berikutnya 9. Lengkapi format dengan Judul
laporan (klik A, klik text, ketik judul laporan dll) 10. Print, Simpan dalam bentuk PDF
IV. DATA PERCOBAAN

4.1 KONSENTRASI LARUTAN STANDAR KAVEIN

1. V1 . M2 = V2 . M2
10 ml . M2 =0,4 ml . 500 ppm
M2 = 0,4 ml . 500 ppm / 10 ml
M2 = 20 ppm

2. V1 . M2 = V2 . M2
10 ml . M2 =0,8 ml . 500 ppm
M2 = 0,8 ml . 500 ppm / 10 ml
M2 = 40 ppm

3. V1 . M2 = V2 . M2
10 ml . M2 = 1,2 ml . 500 ppm
M2 = 1,2 ml . 500 ppm / 10 ml
M2 = 60 ppm

4. V1 . M2 = V2 . M2
10 ml . M2 = 1,6 ml . 500 ppm
M2 = 1,6 ml . 500 ppm / 10 ml
M2 = 80 ppm

5. V1 . M2 = V2 . M2
10 ml . M2 = 2,0 ml . 500 ppm
M2 = 2,0 ml . 500 ppm / 10 ml
M2 = 100 ppm
4.2 KURVA KALIBRASI

4.3 LUAS AREA PUNCAK SAMPEL

V. PEMBAHASAN DAN KESIMPULAN

5.1 PEMBAHASAN

Praktikum HPLC dilakukan untuk menentukan konsentrasi kafein dalam sampel

larutan.Prinsip analisa HPLC ini yaitu pemisahan komponen senyawa dalam suatu sampel yang
dibawa oleh fase gerak berupa campuran pelarut berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat
padat tertentu dalam kolom yang disebut fase diam.Analisa kualitatif HPLC didasarkan pada
nilai waktu retensi sebagai identifikasi komponen yang aad dalam sampel.

Sebelum melakukan analisa, terlebih dahulu membuat larutan kalibrasi dari zat padat
kafein dengan masing masing volume larutan standar yaitu 0,4.0,8.1,2.1,6.2,0.dan konsentrasi
masing-masing larutan standar yaitu 20 ppm,40 ppm, 60 ppm,80 ppm dan 100 ppm.

Berdasarkan data kurva hasil percobaan, konsentrasi sampel berbanding lurus dengan
area kontak sampel,artinya semakin tinggi konsentrasi sampel, maka semakin tinggi pula nilai
luas area kontak sampel.

5.2 KESIMPULAN

 Dapat menggunakan alat HPLC dengan benar sesuai dengan prosedur yang ada.
 Dapat membuat larutan standar kafein dengan volume masing-masing 0,4.0,8.1,2.1,6.2,0
ml.
 Diperoleh data kurva kalibrasi seperti yang dicantumkan pada data pengamatan.
 Konsentrasi masing –masing larutan standar yaitu 20 ppm,40 ppm, 60 ppm,80 ppm dan
100 ppm.
VI. PERTANYAAN
1. Jelaskan prinsip kerja HPLC ?
Jawab : Prinsip Kerja HPLC: HPLC bekerja berdasarkan prinsip pemisahan senyawa-
senyawa dalam suatu campuran berdasarkan laju pergerakan mereka melalui suatu kolom
pemisahan. Komponen-komponen dalam sampel diinjeksikan ke dalam sistem HPLC dan
dibiarkan melewati kolom yang diisi dengan fase pemisah (biasanya fase gerak cair).
Senyawa-senyawa berinteraksi dengan fase pemisah dan memiliki laju pergerakan yang
berbeda, menyebabkan pemisahan. Detektor kemudian mendeteksi keluarnya senyawa-
senyawa tersebut, dan data yang dihasilkan digunakan untuk analisis.

2. Sebutkan bagian-bagian penting pada alat HPLC ?

Jawab :
 Kolom Pemisahan: Tempat terjadinya pemisahan senyawa-senyawa.
 Pompa HPLC: Bertanggung jawab atas pergerakan cairan (fase gerak) melalui
sistem.
 Injektor: Tempat di mana sampel diinjeksikan ke dalam sistem.
 Detektor: Mendeteksi senyawa-senyawa yang keluar dari kolom.
 Komputer dan Perangkat Lunak: Digunakan untuk mengendalikan instrumen dan
menganalisis data.

3. Data apa yang didapat sebagai analisis kualitatif pada HPLC ?

Jawab : Kromatogram: Grafik yang menunjukkan waktu retensi versus intensitas sinyal.
Kromatogram ini memberikan informasi kualitatif tentang jumlah dan jenis komponen
dalam sampel. Pola puncak pada kromatogram dapat digunakan untuk mengidentifikasi
senyawa-senyawa tersebut.

4. Data apa yang didapat sebagai analisis kuantitatif pada HPLC ?

Jawab : Area di Bawah Kurva (AUC): Representasi matematis dari luas area di bawah
puncak pada kromatogram. AUC berkorelasi dengan konsentrasi senyawa, sehingga
dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Dengan menggunakan standar kalibrasi yang
dikenal, AUC dapat dikonversi menjadi konsentrasi yang tepat.

5. Mengapa perlu dilakukan “purging” sebelum analisa dengan HPLC ?

Jawab : Sebelum melakukan analisis dengan HPLC, sistem perlu dipurging untuk
menghilangkan udara atau gas yang mungkin terperangkap dalam sistem. Udara yang
terperangkap dapat mempengaruhi akurasi dan presisi analisis. Purging juga membantu
memastikan bahwa fase gerak cair berada dalam kondisi optimal sebelum analisis
dimulai, sehingga kinerja sistem HPLC dapat dioptimalkan. Proses ini membantu
mencegah gangguan dalam pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa dalam sampel.

DAFTAR PUSTAKA
Day, RA & Underwood, AL. 1990. Quantitative Analysis. New Delhi: Prentice

Hall.

Hendayana, Sumar, dkk. 1994. Kimia Analitik Instrumen. Edisi Kesatu.

Semarang:IKIP Semarang Press.

Johnson, Edward L, dkk. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB

Bandung.

Shimadzu Corporation. 2010. Instruction Manual Operation Guide High

Performance Liquid Chromatography Shimadzu. Kyoto. Japa