MEDICINA DI LABORATORIO: MICROBIOLOGIA CLINICA

Giovanni Di Bonaventura, PhD Universit G. DAnnunzio di Chieti-Pescara

tel 0871 541519 (541509) e-mail: gdibonaventura@unich.it

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA CLINICA

Compito principale della Microbiologia Clinica, nellambito della Medicina di Laboratorio, quello di porre diagnosi eziologica, ossia identificare lagente patogeno responsabile di una malattia infettiva allo scopo di suggerire un appropriato trattamento terapeutico. Altri obiettivi sono: - valutare lefficacia della terapia - valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio in comunit)
Il Laboratorio di Microbiologia fornisce: sostanziale supporto alla diagnosi, al trattamento ed alla prevenzione della patologia da infezione, sia quella sostenuta da patogeni primari (in soggetti normoreattivi) che quella sostenuta da patogeni opportunisti o condizionati (in soggetti con difese compromesse)

Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive

Esigenza di utilizzare metodologie scientificamente valide ed eseguibili in tempi accettabili

Necessit di acquisire in tempi rapidi informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia

La Qualit del servizio diagnostico dipender dallequilibrio:

Consapevolezza delle urgenti necessit cliniche

Capacit tecniche Risorse finanziarie disponibili

FASE PRE-ANALITICA in MICROBIOLOGIA

Rappresenta un momento cruciale nellambito del processo di Laboratorio, durante la quale si compie il 46% degli errori Rappresenta un fondamentale momento di interfaccia tra il laboratorio e le altre parti interessate al processo Significa occuparsi di come il laboratorio in grado di rispondere ai bisogni di chi vi si rivolge

FASE PRE-ANALITICA in MICROBIOLOGIA

1. 2. 3. 4. 5. Richiesta del Clinico (scelta degli esami) Informazione e Preparazione del Paziente Raccolta del campione Identificazione del campione Trasporto del campione

FASE ANALITICA

Quali strumenti ci possono aiutare a gestire la qualit nella fase pre-analitica?

Una richiesta congua rispetto al quesito diagnostico (scheda ottica, informazioni varie..) Un campione appropriato alla richiesta e rappresentativo della patologia sulla quale si indaga La conformit del prodotto in entrata che si realizza attraverso luso di protocolli (istruzioni su esami effettuati, modalit di prelievo, trasporto e conservazione)

Appropriatezza della fase pre-analitica

Lappropriatezza di tutta la fase preanalitica si traduce in maggiore qualit del servizio diagnostico e maggiore sicurezza delloperatore Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure coinvolte a diverso titolo nellindagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato con la decisione di richiedere le indagini fino al momento dellutilizzo dei referti) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure pu assicurare la piena valorizzazione dellindagine microbiologica.

Responsabilit del Clinico

Raccogliere il campione in maniera corretta Identificare adeguatamente il campione Compilare in maniera adeguata il modulo di richiesta Inoltrare tempestivamente il campione al Laboratorio o, qualora non fosse possibile, conservarlo con modalit idonee

Responsabilit del Microbiologo Clinico

Definire precise linee guida sulle modalit di prelievo, conservazione e trasporto specifiche per ogni tipo di campione Monitorare la loro osservanza e applicazione Le tabelle di prelievo e di conservazione dei campioni per indagini batteriologiche", devono essere utili ai fini di assicurare la "qualit" dei campioni destinati ad indagini microbiologiche, con lobiettivo di qualificare lindagine microbiologica e il suo contributo alla cura del paziente. Tutti gli operatori assicurano comunque la loro disponibilit a fornire ulteriori chiarimenti o le indicazioni che, di volta in volta, si dovessero rendere necessarie, in particolare per:
indicazioni nella scelta delle indagini, modalit di raccolta, interpretazione dei risultati, informazioni epidemiologiche.

FASE PRE-ANALITICA 1. Richiesta degli esami di laboratorio

Il Laboratorio fornisce supporto indispensabile alla pratica clinica. Il ricorso ad esso deve essere comunque e sempre ragionato. Nella pratica clinica indispensabile procedere alla: inquadramento clinico-epidemiologico dellinfezione individuazione dellorgano o degli organi interessati formulazione del sospetto diagnostico scelta del materiale patologico da inviare al laboratorio La limitazione delle risorse economiche gi condiziona e condizioner sempre pi in futuro gli interventi medici. Dunque, la valutazione del rapporto costo-beneficio dovr essere tenuta in sempre maggiore considerazione dal medico in ogni sua scelta ivi inclusa quella concernente il ricorso allausilio laboratoristico.

FASE PRE-ANALITICA 1. Richiesta degli esami di laboratorio

La richiesta di accertamenti microbiologici giustificata: nella patologia infettiva ad etiologia definita, per diagnosi di forme clinicamente atipiche o iniziali, per la determinazione della sensibilit ai farmaci. nelle sindromi polietiologiche, per indicazioni terapeutiche (sempre, se in assenza di specifiche informazioni epidemiologiche). nella patologia infettiva del paziente immunocompromesso, per indicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie). in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per lo studio della circolazione dei microrganismi e la identificazione dei fattori di rischio, ladozione di idonee misure preventive, la definizione di un corretto approccio diagnostico e terapeutico.

Lo studio della Microbiologia Clinica deve essere pertanto finalizzato alla:

Acquisizione di conoscenze sulle complessive potenzialit diagnostiche del laboratorio di microbiologia e sulla possibilit che esso fornisca indicazioni per la realizzazione di una terapia mirata delle malattie da infezione e per la messa a punto di adeguate strategie di prevenzione. Valutazione del ruolo e della incidenza dei singoli microrganismi nella eziopatogenesi delle diverse malattie da infezione, della loro circolazione in situazioni ambientali differenti, della loro capacit di esibire resistenze ai farmaci antimicrobici, della circolazione - nelle popolazioni microbiche dei determinanti genetici di resistenza, con acquisizione, in questo caso, di indicazioni per la realizzazione di una terapia ragionata che eviti, quando non richiesto, il ricorso al laboratorio diagnostico di microbiologia, o che comunque possa essere adottata in attesa delle sue risposte.

FASE PRE-ANALITICA 2. Informazione e preparazione del Paziente

Il Paziente deve essere adeguatamente istruito sulle corrette modalit di prelievo, conservazione e trasporto del campione biologico Esempio: Prelievo urine tecnica del mitto intermedio Prelievo dellespettorato

FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico

Campione clinico: materiale biologico da esaminare per verificare la presenza o assenza di specifici microrganismi patogeni Pu essere prelevato da:
siti sterili (sangue, midollo, liquido cefalo-rachidiano (liquor), liquido pleurico/pericardico/peritoneale/articolare, vie respiratorie inferiori, urine, tessuti profondi) ogni isolamento ha significato eziologico siti contaminati da flora autoctona (bocca, naso, vie respiratorie superiori, feci, espettorato, tratto gastro-intestinale, tratto genitale femminile, terzo distale delluretra, cute) i risultati vanno interpretati a seconda del caso necessaria una richiesta mirata del clinico, volta alla ricerca di uno o pi specifici patogeni nel contesto dellabbondante flora contaminante

Ad ogni campione associato un potenziale rischio biologico per la salute degli operatori sanitari

Flora microbica residente

Tutte le superfici corporee esposte (a contatto con lambiente circostante) (bocca, naso, intestino, cute, vie genitali femminili, uretra) sono colonizzate da una flora autoctona
Svantaggi pu contaminare i campioni pu causare malattia Vantaggi in grado di proteggere dalle infezioni prevenendo la colonizzazione delle superfici epiteliali da parte dei patogeni (resistenza alla colonizzazione) la riduzione (o rimozione) della flora normale mediante impiego di antibiotici pu causare superinfezioni, generalmente sostenute da microrganismi resistenti

Tipologie di campione clinico

Campione prelevato da una zona in cui coesistono patogeni e flora residente (tampone) Campione INDIRETTO: prelevato previo passaggio in una zona con flora residente (lavaggio bronco-alveolare) Campione DIRETTO: il patogeno localizzato in un sito normalmente sterile ed una barriera (la cute, generalmente) deve essere superata per la sua raccolta (liquor, ago-aspirato) Campioni INUTILI a fini diagnostici: non vanno prelevati in quanto non forniscono alcuna indicazione (vomito, aspirato gastrico, contenuto intestinale, etc.)

INSERIRE FIG 1/TAB 3 PAG 41 (CEVENINI)

FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico

Lattendibilit dellesame batteriologico dipende da vari fattori, tra i quali molto importante ladeguata raccolta (appropriatezza) del campione. In particolare, il campione dovrebbe essere: A. raccolto nel momento giusto; B. prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della patologia infettiva; C. prelevato in quantit sufficiente da poter effettuare i tests diagnostici necessari; D. raccolto in maniera da evitare contaminazioni.

FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico

APPROPRIATEZZA del campione: QUANDO A. Il campione dovrebbe essere prelevato nel momento giusto nella fase acuta della malattia (carica microbica maggiore) prima dellinizio di una terapia antimicrobica, quando possibile, o a distanza di almeno 48 h dalla sua sospensione gli antibiotici interferiscono con la crescita microbica e influiscono sullesito dei test di laboratorio per cui se non possibile interrompere il trattamento necessario segnalarlo al laboratorio, indicando anche lo schema terapeutico.

FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico

APPROPRIATEZZA del campione: DOVE B. Il campione deve essere prelevato da un distretto corporeo rappresentativo dellarea infetta.

Esempio: La febbre tifoide ha un caratteristico decorso bimodale: una fase precoce (1 e 2 settimana), caratterizzata da febbre e costipazione, durante la quale la emocoltura positiva nel 90100% dei casi, mentre la coprocoltura frequentemente negativa; una seconda fase (3 settimana), spesso diarroica, durante la quale Salmonella typhi pu essere isolata pi frequentemente dalle feci e con minore frequenza dal sangue.
Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla conoscenza della storia naturale di questa malattia infettiva, suggerisce, pertanto, la ricerca del microrganismo nel sangue durante la 1 e 2 settimana e nelle feci nella 3 e 4 settimana.

FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico

APPROPRIATEZZA del campione: QUANTO C. Il campione deve essere prelevato in quantit sufficiente per poter effettuare i tests diagnostici necessari. Esempio: Le batteriemie sono generalmente pauciparassitemiche. La sensibilit dellesame emocolturale , quindi, influenzata dalla quantit del campione prelevato e dalla frequenza di prelievo (max 3 prelievi/die)
Two blood culture sets (10 mL in both aerobic and anerobic bottles) before administration of antibiotics is 98% sensitive (J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 657-661)

Nel tifo e nella brucellosi la batteriemia continua e, quindi, il momento del prelievo meno critico

FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico

APPROPRIATEZZA del campione: COME D. Il campione deve essere raccolto in maniera da evitare contaminazioni Se il prelievo non viene eseguito con modalit rigorosamente
asettiche, altri microorganismi (flora autoctona) non responsabili della patologia potrebbero contaminare i campioni e falsare cos il risultato delle indagini microbiologiche

Esempi: - La ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata a mezzo di un tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con lorofaringe. - Nella raccolta di un campione endometriale, si deve cercare di limitare la contaminazione con la flora vaginale.

FASE PRE-ANALITICA 4. Identificazione del campione

Il contenitore deve essere opportunamente contrassegnato e confezionato prima del suo trasporto. I contenitori inviati in laboratorio debbono essere identificati con l'etichetta riportante il relativo codice a barre ed accompagnati da un foglio di richiesta indicante:
Identificativo del paziente (nome, cognome, et, sesso) Provenienza anatomica del campione Nominativo del prelevatore Data ed ora di campionamento (informazione critica !) Diagnosi clinica presuntiva (eventuale) Schema del trattamento antibiotico in corso

FASE PRE-ANALITICA 5. Trasporto del campione

Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il campione deve essere trasportato:
in adeguati contenitori sterili, per assicurare la corretta esecuzione delle indagini microbiologiche e consentire il corretto trasporto e manipolazione dal campione; rapidamente: il trasporto del campione frequentemente causa una riduzione della vitalit dei microrganismi in esso presenti; in adeguati terreni di trasporto, se necessario (es. tamponi), al fine di mantenere inalterata la facies microbica del campione, conservandone le caratteristiche possedute al momento del prelievo; Terreni liquidi o semisolidi (agarizzati) a temperatura controllata:generalmente a +4 C, occasionalmente a temperatura ambiente

Trasporto in sistemi dedicati, come nel caso della ricerca di germi anaerobi

FASE PRE-ANALITICA 5. Trasporto del campione

Linvio deve inoltre avvenire garantendo la sicurezza nel trasporto e lisolamento del campione, per evitare dispersione del materiale biologico e leventuale contaminazione di altri materiali, di attrezzature e del personale che dovr manipolare il campione stesso
trasportare il campione nelle apposite buste di plastica a due scomparti: uno per il campione biologico, laltro per il modulo di richiesta debitamente compilato

Nel caso in cui fosse impossibile inviare immediatamente il campione al Laboratorio, la conservazione dello stesso deve avvenire secondo le indicazioni fornite dal Microbiologo: Ad esempio: feci e urine (+4C per max 6-8 ore) Qualora ci fosse la necessit di inviare campioni in orario diverso, bene prendere accordi con il Laboratorio prima della sua raccolta ed invio

Criteri per definire un campione non idoneo per una diagnosi microbiologica
(non conformit nella fase pre-analitica)
Campione non identificabile: Modulo di richiesta esame mancante od incompleto Contenitore impropriamente identificato od anonimo Campione contaminato da flora orofaringea Impropria conservazione e/o trasporto (tempo, temperatura, contenitore) contenitore non sterile contenitore non perfettamente chiuso o danneggiato (rischio biologico per tutti gli operatori: per chi preleva, chi trasporta e chi analizza il materiale) trasporto ritardato (urine: > 1h a RT; campioni per gonorrea: >1h non in terreno di trasporto) Campione inviato in quantit insufficiente (ricerca micobatteri) o non idoneo (prelevato in paziente antibiotizzato; saliva vs escreato)

Riflessioni sulla fase pre-analitica

Il contributo di chi richiede e preleva i campioni alla qualit degli esami di laboratorio dipende sia dalla consapevolezza del fenomeno che nella capacit di attenersi a quella serie di norme che permettono di ridurre al minimo i fattori che possono modificare il risultato finale delle analisi. Un campione non idoneo pu infatti causare il mancato isolamento del microorganismo responsabile dellinfezione. Inoltre, si evitano in tal modo "dispersioni" di germi patogeni, specie quelli resistenti (MRSA, Pseudomonas spp), che vanno indirettamente ad incrementare l'incidenza delle infezioni nosocomiali. Il risultato dell'esame batteriologico sar qualitativamente valido e pi rapido.

In ultima analisi, gli operatori coinvolti nella fase pre-analitica sono responsabili della qualit del percorso diagnostico del paziente almeno fino allarrivo del campione in Laboratorio !

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dellagente patogeno mediante: A. Esame microscopico (batterioscopico) B. Esame colturale (isolamento) C. Ricerca di antigeni D. Ricerca di sequenze geniche

Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico

Campioni a fresco oppure fissati (al calore o chimicamente) La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente: microscopia in campo oscuro
il condensatore illumina obliquamente loggetto in modo che le strutture cellulari riflettano la luce verso locchio delloperatore, a differenza dellambiente circostante. Ricerca di spirochete (T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide.

microscopia in contrasto di fase

Le differenze nellindice di rifrazione nei campioni sono convertite in differenze nella intensit della luce nellimmagine. Consente la visualizzazione di strutture in campioni non colorati (funghi e parassiti, ma anche batteri).

microscopia in fluorescenza
le molecole fluorescenti assorbono luce ad una e la riemettono ad una pi lunga. Tale differenza viene rilevata dallimpiego di filtri. Utile per lidentificazione di batteri e funghi.

Spesso si utilizzano colorazioni dedicate Gram, alcool-acido resistenza (Ziehl Nielsen)

Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico (a fresco)

Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente colorabili con le tecniche disponibili, evidenziabili invece in campo oscuro:

ricerca di Spirochete (Treponema, Borrelia)

ricerca di Leptospire

Osservazione in campo oscuro: Treponema pallidum

Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico (previa colorazione)

Campioni fissati (al calore o chimicamente) Fornisce indicazioni riguardo:
Idoneit del campione (espettorato: neutrofili / cellule squamose) Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili Presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti)

Colorazione del campione con tecnica di Gram:

morfologia (cocchi, bastoncelli,cocco-bacilli, lanceolata) disposizione (catenelle, clusters, diplococchi) quantit assoluta di batteri presenti percentuale relativa di Gram+ e Gramlocalizzazione in sede intra- od extra-cellulare colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti) verde malachite (endospore batteriche) colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina) colorazione di Leifson (flagelli)

Specifiche colorazioni:

Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico previa colorazione

Colorazioni SEMPLICI, che prevedono limpiego di un solo colorante: cristalvioletto fucsina basica blu di metilene Colorazioni DIFFERENZIALI, che prevedono limpiego di pi di un colorante: Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen

Le colorazioni in microbiologia
Allestimento di un preparato (fissazione)
La fissazione garantisce che: i) il materiale venga disteso ed essiccato non venga allontanato dal vetrino nel corso dei successivi lavaggi; ii) le cellule vengano uccise per coagulazione (sicurezza biologica e maggiore penetrazione ai coloranti)

(1 di 2)

Partendo da una sospensione batterica (brodocoltura) centro di un vetrino pulito Se si preleva il materiale (colonie) da terreno agarizzato, aggiungere una goccia di soluzione tampone (PBS) al campione

Le colorazioni in microbiologia
Allestimento di un preparato (fissazione)
Aiutandosi con unansa,

(2 di 2)

stemperare il campione nel tampone/brodo e stenderlo fino a coprire circa la met della superficie del vetrino (preparazione dello smear) Lasciare essiccare il preparato allaria o forzatamente (bunsen). Fissare il preparato esponendo il vetrino (lato non contenente il campione) per 4-5 volte direttamente alla fiamma

Hans Christian Joachim Gram

Nato a Copenhagen il 13 Settembre1853. Batteriologo danese. Nel 1884 mise a punto la colorazione omonima nel tentativo di differenziare Klebsiella pneumoniae dagli pneumococchi

Colorazione di Gram
Tecnica
1. 2.
3.

4.

5. 6. 7. 8. 9.

Fissare gli strisci al calore Coprire con cristalvioletto per 1-2 min Lavare con acqua. Non asciugare Coprire con la soluzione iodio-iodurata di Lugol per 12 min Lavare con acqua. Non asciugare Decolorare per 10 sec con alcool-acetone Lavare con acqua. Non asciugare Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min Lavare con acqua e lasciare asciugare

Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale

Colorazione di Gram
Principio

Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita allinterno della cellula. Il decolorante condensa, per disidratazione, la struttura peptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene catturato dalla parete cellulare. Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna della parete cellulare, permettendo cos il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

Colorazione di Gram
Osservazione microscopica

I batteri Gram+ (Staphylococcus spp, Streptococcus spp, etc) appaiono colorati in blu

(Staphylococcus epidermidis)

I batteri Gram- (E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.) appaiono colorati in rosso
(Escherichia coli)

Colorazione di Gram
Casi particolari

Batteri Gram+ possono apparire come Gram- in presenza di colture vecchie, quando morti, od in presenza di danni alla parete per azione di antibiotici Trichomonas vaginalis (protozoo) Gram+ Candida albicans (lievito), Aspergillus fumigatus (muffa) sono Gram+ Occasionalmente, anche Mycobacterium tuberculosis

Colorazione di Gram
Utilit clinica

(1 di 2)

Idoneit del campione da sottoporre a coltura Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)

meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene

Suggerire la necessit di attuare tecniche di coltivazione non routinarie

anaerobi, funghi angina di Vincent (spirochete, fusobatteri) paziente antibiotizzato infezioni poli/mono-microbiche

Ausilio nella interpretazione dellesame colturale

Informazioni sulla natura dellinfezione

Colorazione di Gram
Utilit clinica
Quindi:

(2 di 2)

La conoscenza del risultato di una colorazione di Gram pu salvare una vita !

La colorazione di Gram non deve essere effettuata su campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena non pu essere differenziata da quella commensale La colorazione di Gram non utile per la rilevazione di:

Tuttavia:

Legionella spp. (immunofluorescenza) bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (ZiehlNeelsen)

Colorazione di Gram
Leccezione

La colorazione di Gram non applicabile a tutti i batteri. Mycobacterium tuberculosis, M. leprae

incapacit di colorare la cellula per la natura cerosa dellinvolucro esterno, altamente impermeabile ai coloranti colorazione di Ziehl-Nielsen

Mycobacterium spp.
Parete cellulare

Composizione:

Grosse quantit di glicolipidi:

acido micolico (60%) complessi lipidi-arabinogalattani lipoarabinomannani

Scarso petidoglicano Condiziona la forma e previene la lisi osmotica (peptidoglicano) Inibisce ingresso composti chimici

Funzioni:

crescita lenta maggiore resistenza agli agenti chimici maggiore resistenza alla fagocitosi

Mediante lacido micolico, induce la sintesi di citochine (TNF- )

Ziehl-Neelsen, Kinyoun

Colorazioni:

Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica
Step 1:
versare la fucsina fenicata (fucsina basica in acqua, alcool e fenolo)

(1 di 2)

Step 2:
fare evaporare il colorante alla fiamma per 5 min lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica
Step 3:

(2 di 2)

Decolorare (2 min, circa) con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante Lavare con acqua

Step 4:

Contrastare con blu di metilene per 1-2 min Lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-Neelsen
Osservazione microscopica

Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

Le colorazioni in Microbiologia
Colorazioni speciali
La colorazione negativa consiste nella colorazione di sottofondo con un colorante acido (nero nigrosina). Viene usata quando un organismo od una sua struttura non viene colorata facilmente (esempio, la capsula).
La colorazione delle spore richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante (verde di malachite, fucsina fenicata) attraverso gli involucri sporali. La colorazione dei flagelli impiega un mordenzante (precipitazione dei sali dellacido tannico) per evidenziare la struttura flagellare altrimenti invisibile (d: 12-30 nm)

Le colorazioni in Microbiologia
Colorazione di flagelli

Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori (da: Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997)

Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico

Le informazioni desunte dallesame microscopico possono consentire una diagnosi presuntiva e, comunque, risultano importanti per orientare liter diagnostico (es. scelta dei terreni colturali per lisolamento) TUTTAVIA: Lesame microscopico pu fornire precise indicazioni diagnostiche qualora si esamini: un materiale normalmente sterile o comunque proveniente da zone non in comunicazione con lesterno (liquido cefalorachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materiale purulento proveniente da raccolte chiuse) un materiale nella cui popolazione batterica normale non siano compresi batteri con i caratteri morfologici e/o tintoriali del batterio osservato

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dellagente patogeno mediante: A. Esame microscopico (batterioscopico) B. Esame colturale (isolamento) C. Ricerca di antigeni D. Ricerca di sequenze geniche

Diagnosi DIRETTA B. Esame colturale (isolamento)

Quasi tutti i batteri di interesse medico possono essere coltivati in sistemi artificiali (in vitro) denominati terreni di coltura. I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico: LIQUIDI (brodo). Composizione del brodo normale:
peptone (digestione parziale di proteine animali) 0,5% estratto di carne 0,3% NaCl (per rendere isotonico il terreno) tampone fosfato (PBS; pH 7,0) H2O polisaccaride acido (70% agarosio, 30% agaropectina) estratto da alghe rosse del genere Gelidium addizionato al brodo in quantit pari a 1,5-2% liquido a temperature 80 C, gelifica a 42-47 C non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri

SOLIDI (brodo normale solidificato con agar). Lagar:

Diagnosi DIRETTA B. Esame colturale (isolamento)

I terreni di coltura si distinguono in base allo stato chimico: Composizione DEFINITA: molto costosi, utilizzati esclusivamente per lidentificazione di batteri con particolari esigenze nutrizionali Composizione INDEFINITA: contengono sostanze naturali quali peptone, siero, liquido ascitico, sangue, estratto di lievito etc.

TERRENI DI COLTURA
Terreni minimi
Contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto forma di sali inorganici, aggiunti in concentrazione nota

Terreni di arricchimento Caratterizzati dallaggiunta di: sangue siero estratto di lievito infusi di cuore e cervello carboidrati amminoacidi Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni particolarmente esigenti dal punto di vista nutritivo

TERRENI DI COLTURA
Terreni selettivi
Contengono agenti selettivi quali: coloranti (cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica) antibiotici, con attivit batteriostatica/battericida nei confronti dei microrganismi contaminanti (flora autoctona) Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni che si isolano in campioni contaminati da flora microbica residente (cute, faringe, naso, intestino, vagina)

TERRENI DI COLTURA
Terreni differenziali
Contengono carboidrati (zuccheri) ed indicatori di pH (rosso fenolo, blu di bromofenolo), che consentono di distinguere tra microrganismi in grado di fermentare specifici carboidrati, in base alla colorazione delle colonie e alla loro morfologia. Esempio: agar sale mannite o terreno di Chapman. Contengono sangue (5%, di montone o di cavallo) utilizzato per evidenziare la capacit emolitica di alcuni batteri: -emolisi = emolisi parziale, con formazione di un alone verde intorno alla colonia (degradazione di bilirubina a biliverdina) -emolisi = emolisi completa, con formazione di un alone trasparente intorno alla colonia -emolisi = mancanza di emolisi

TERRENI DI COLTURA
Terreni differenziali
Mannitol Salt Agar (agar sale-mannite, Chapman agar): terreno selettivo (per gli stafilococchi) e differenziale (S. aureus fermentante vs Staphylococcus spp non fermentanti).

Agar sangue (5% sangue di montone) (sheep blood agar, SBA): evidente -emolisi.

Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica; R. Cevenini, V.Sambri ; Piccin

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

TEMPERATURA

Psicrofili
Mesofili Termofili

-10C a +20C (L. monocytogenes, 5-8C)

+10 a +50 C +40 a +70 C

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

OSSIGENO
Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di
ossigeno; crescono bene in atmosfera addizionata di CO2

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

OSSIGENO
Aerobi obbligati Aerobi facoltativi Anaerobi obbligati Anaerobi facoltativi Microaerofili

CRESCITA IN ANAEROBIOSI

I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido, depositandosi sul fondo come sedimento.

Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali.

Terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici (tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con lossigeno atmosferico fino ad esaurirlo. Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche (bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono umidificate, producono CO2 e H2 e successivamente H2O con scomparsa dellossigeno.

Crescita in anaerobiosi

Cappa (camera) per anaerobiosi

Giara per anaerobiosi

Figure 6.5

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

pH Acidofili:
crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 6, generalmente) funghi e lieviti (pH 5 - 6) crescono tra pH 6 8 maggior parte dei batteri
crescono a pH > 8 (pH 8 9.5, generalmente)

Neutrofili:

Alcalofili:

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

PRESSIONE OSMOTICA
I microrganismi replicano generalmente meglio in un terreno con concentrazione osmotica pi bassa della propria, in quanto questa condizione permette la penetrazione dellacqua allinterno della cellula. La pressione osmotica del terreno pu essere modificata in base alla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio Alofili: crescono ad elevate [saline] (generalmente 1 M), tollerando elevate pressioni osmotiche (es. stafilococchi)

CRESCITA BATTERICA IN TERRENO LIQUIDO

Gran parte dei batteri patogeni ha un tempo di duplicazione nellordine dei 40-60 min. In particolare: Escherichia coli (in vitro) 20-30 min Escherichia coli (in vivo) 12 ore Mycobacterium tuberculosis (in vitro) 18 ore Treponema pallidum (in vitro) 33 ore

ISOLAMENTO BATTERICO
E necessario tenere conto del sito di provenienza del campione: pus liquido cefalo rachidiano sangue generalmente contengono un solo tipo di microrganismo

materiale fecale tamponi oro-faringei altri materiali biologici generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al patogeno o ai patogeni responsabili dellinfezione

ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE

Utilizzare terreni solidi (agarizzati) preparati in piastre di Petri Deporre una piccola quantit di materiale patologico da esaminare al margine della piastra (se il materiale molto denso stemperarlo con soluzione fisiologica o brodo sterile) Mediante lutilizzo di una spatola o di unansa, distribuire il materiale sulla superficie del terreno in modo da avere la formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina e colonie isolate nellultimo tratto Successivamente, prelevare sterilmente i batteri di una colonia isolata (formata cio da una sola cellula batterica iniziale) ed allestire una coltura pura

Tecnica di semina per isolamento

Semina per isolamento

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI DIRETTA: IDENTIFICAZIONE Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni solidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate si procede alla identificazione: ID PRESUNTIVA caratteri microscopici
colorazioni (forma, organizzazione)

caratteri macroscopici
aspetto coloniale

ID FINALE (DEFINITIVA) biochimica immunologica molecolare

ID presuntiva dei microrganismi

Aspetto macroscopico delle colonie

Forma
puntiforme circolare filamentosa rizoide irregolare
irregolare, a filo intrecciato irregolare, ramificata d < 1 mm

(1 di 2)

Rilievo
effuso piatto sopraelevato convesso umbonato

sottile, allungato

ID presuntiva dei microrganismi

Aspetto macroscopico delle colonie

Superficie Margine
intero
ondulata

(2 di 2)

liscia rilevata radiata concentrica rugosa

anelli concentrici raggrinzita

ondulato eroso filamentoso arricciato

Aspetto macroscopico coloniale: diversi fenotipi

DIAGNOSI DIRETTA Identificazione dei microrganismi

1.

Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)

Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen

2.

Caratteristiche macroscopiche (colturali)

tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilit), etc. crescita su terreni selettivi

3. 4. 5.

Caratteristiche biochimiche Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) Identificazione molecolare

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
La determinazione di microrganismo in esame di: specie si basa sulla capacit del

metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per via fermentativa (via anaerobica) produrre specifici enzimi produrre specifici prodotti metabolici

Utilizzo di metodi manuali od automatizzati. Identificazione possibile in tempi rapidi (4 - 6 h).

ID BIOCHIMICA
Metodo manuale: API (BioMrieux) Identification System
La fermentazione degli zuccheri e lutilizzazione di altri substrati (ureasi, indolo, gelatina, etc.) viene evidenziata da un indicatore di pH responsabile della reazione colorimetrica.

Anaerobes (Rapid ID 32 A) Enterobacteriaceae (ID 32 E) Gram Negative Rods (ID32 GN) Staphylococci (ID32 STAPH ) Streptococci (Rapid ID32 STREP) Yeasts (ID32 C)

ID BIOCHIMICA
Metodo automatizzato: VITEK (BioMrieux)

Due tipologie di card: per la identificazione (30 pozzetti/card contenenti dei substrati biochimici in forma disidratata) e lantibiogramma. Non sono richiesti reagenti addizionali, riducendo cos il rischio di omissione o di errore. Il database del VITEK copre oltre 300 specie sia di origine clinica che industriale. Possibilit di generare reports statistici epidemiologici (es. frequenza di antibiotico-resistenze)

Gram-positives (GP) Gram-negatives (GN) Yeasts (YST) Bacillus spp. (BCL) Anaerobes, Corynebacterium (ANC) Neisseria, Haemophilus (NH)

Identificazione batterica:
Flow charts contenenti dati derivanti dallosservazione Gram e dai tests biochimici importanti nella identificazione di specie.

Identificazione dei microrganismi

1.

Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)

Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen

2.

Caratteristiche macroscopiche (colturali)

tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilit), etc. crescita su terreni selettivi

3. 4. 5.

Caratteristiche biochimiche Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) Identificazione molecolare

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
Ha come obiettivo finale quello di ricerca ANTIGENI microbici direttamente nel campione biologico esaminato.
Le tecniche di identificazione sierologica che prevedono limpiego di anticorpi comprendono: A. Reazione di agglutinazione B. Reazione di immunofluorescenza C. Tecniche immunoenzimatiche (ELISA) D. Western blot

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
A. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE
Agglutinazione su vetrino Prevede limpiego di anticorpi, ottenuti in un animale immunizzato, messi a contatto con il batterio o con suoi antigeni solubili Agglutinazione al lattice (AL) Utilizzato per evidenziare gli antigeni polisaccaridici della capsula batterica, costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri in grado di legare gli anticorpi in pi punti. Per il test si utilizzano anticorpi legati (adsorbiti) a particelle di lattice (adsorbimento in fase solida). Tecniche immunologiche rapide vengono frequentemente utilizzate per la ricerca di antigeni batterici (S. pneumoniae, H. influenzae, E. coli, N. meningitidis) nel liquor (o sul suo centrifugato).

Un campione di fluido cerebrospinale viene sottoposto a ricerca di Haemophilus influenzae. Il campione viene mescolato con una sospensione di particelle di lattice ricoperte di anticorpi specifici, diretti contro la capsula di H. influenzae. Linterazione tra antigene e anticorpi causa unimmediata agglutinazione di particelle (epifenomeno) visibile ad occhio nudo.

negativo

positivo

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA
Il fluorocromo (ad es. fluoresceina) che quando viene eccitato da una luce ad una certa lunghezza donda (UV) emette una luce ad una lunghezza donda maggiore (nel visibile). I fluorocromi possono essere legati ad anticorpi modificando la loro capacit di legarsi ad uno specifico antigene: Anticorpi monoclonali (MAb) Prodotti da cellule di ibridoma Riconoscono un singolo epitopo Due tipi di immunofluorescenza: diretta e indiretta
Il limite della tecnica rappresentato dalla

necessit di una adeguata consistenza

(concentrazione) del batterio ricercato.

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA Si utilizza un anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato, che sia specifico per lantigene in esame. IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

Si utilizza un anticorpo specifico per lantigene in esame ma non coniugato, che viene riconosciuto da un secondo anticorpo coniugato e diretto contro regioni costanti delle immunoglobuline della specie in cui stato prodotto il primo anticorpo.

Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e lidentificazione di antigeni microbici (o tessutali) o di anticorpi diretti contro entrambi. Nel test diretto, lanticorpo marcato con colorante fluorescente applicato su una sezione di tessuto contenente lantigene, quindi lanticorpo in eccesso viene lavato e lanticorpo rimasto legato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza. Nel test indiretto, lantigene rilevato mediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con un anti-anticorpo marcato con una sostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo umano, il secondo anticorpo sar un anticorpo contro le immunoglobuline umane, prodotto in una specie diversa da quella umana).

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA
A B

A) Treponema pallidum; B) Chlamydia trachomatis; C) Helicobacter pylori

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
C. TEST IMMUNOENZIMATICO (ELISA: enzyme-linked immunodsorbent assay)
Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpi specifici contro lantigene.
Si aggiunge lantigene che viene poi evidenziato da anticorpi, anchessi contro lantigene ricercato, legati covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, -galattosidasi) (sandwich ELISA) La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso la valutazione dellintensit del colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica del relativo substrato cromogeno. La reale concentrazione dellantigene viene determinata per confronto con diluizioni standard dellantigene stesso.

ELISA test

Saggio immunologico su fase solida (test immunoenzimatico, ELISA). (a) Lantigene test e aggiunto allanticorpo-1 in fase solida ed il legame e evidenziato aggiungendo un secondo anticorpo marcato con lenzima e valutando lenzima legato (ad esempio perossidasi o fosfatasi alcalina) attraverso una reazione colorimetrica o luminometrica. (b) Lanticorpo da saggiare viene aggiunto allantigene in fase solida ed e rilevato aggiungendo unanti-immunoglobulina marcata con enzima che usa unantiimmunoglobulina fluorescente per rilevare lanticorpo legato. Il marcatore nei saggi ELISA pu essere una sonda fluorescente piuttosto che un enzima.

ELISA test

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
D. WESTERN BLOT
Separazione degli antigeni su gel di poliacrilammide in base al peso molecolare (elettroforesi) Trasferimento degli antigeni (bande elettroforetiche) su membrana di nitrocellulosa Incubazione degli antigeni con lanticorpo specifico

Esposizione ad un anticorpo secondario (anti-anticorpo primario) marcato con un enzima (perossidasi)

La formazione di immunocomplessi (e quindi la presenza dellantigene ricercato) viene evidenziata dallaggiunta di un substrato sul quale agisce lenzima, che provoca la precipitazione di colorante

Western blot

Identificazione dei microrganismi

1. 2. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)
colorazione di Gram colorazione di Ziehl-Neelsen

Caratteristiche macroscopiche (colturali)

tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilit), etc. crescita su terreni selettivi

3. 4. 5.

Caratteristiche biochimiche Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) Identificazione molecolare

Tests molecolari
Le biotecnologie hanno fornito strumenti diagnostici molto potenti per: la ricerca rapida e lidentificazione di patogeni umani la tipizzazione dei microrganismi a fini epidemiologici la ricerca di microrganismi non coltivabili oppure a lenta crescita la determinazione dellantibiotico-sensibilit lindagine diagnostica su campioni negativi allesame colturale

IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE: SONDE MOLECOLARI

Sonde specifiche a DNA per geni che identificano uno specifico patogeno Le sonde legano il DNA complementare presente nel campione (ibridazione), indicando la presenza del patogeno Permettono di individuare anche esigue quantit di acidi nucleici (elevata sensibilit) La reazione di ibridazione pu essere condotta su diverse tipologie di campioni: colonie batteriche preparazioni di DNA purificato campioni clinici

<

La digestione del DNA per mezzo di enzimi di restrizione, seguita da ibridazione con differenti sonde geniche genera patterns speciespecifici (ossia caratteristici di una specie microbica).

Principali tecniche di ibridazione degli acidi nucleici

Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamente immobilizzato su un supporto solido (p. es., membrana di nitrocellulosa) ed ibridato con una specifica sonda a DNA a singolo filamento marcata, per facilitarne la successiva rivelazione (dot blot). In alternativa, differenti frammenti di DNA con diverso peso possono essere separati attraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti su membrane per libridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Se si utilizzano molecole di RNA separate con elettroforesi si parla di Northern blot.

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI DIRETTA: ANTIBIOGRAMMA Una volta eseguita lidentificazione del microrganismo in esame, si procede alla determinazione della sensibilit/resistenza dellisolato agli antibiotici (antibiogramma).

Tests di antibiotico-sensibilit

Obiettivo dei tests per la determinazione della antibioticoS di predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica. I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici. I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilit dei risultati. I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dellantibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e lesperienza professionale.

Tests di antibiotico-sensibilit
Definizioni
MIC (Concentrazione Minima Inibente) una misura quantitativa dellattivit di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la pi bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) pubblica i criteri per la interpretazione dei risultati dei tests di sensibilit (categorie interpretative). Categorie Interpretative (Sensibilit, S Intermedia, Resistenza) individuate da valori di MIC detti breakpoints (soglia, limite)

Interpretazione dei risultati BREAKPOINTS

I breakpoints vengono individuati dalla NCCLS in base a:

Livelli raggiunti in vivo (sangue, tessuti) dallantibiotico Correlazione tra risultati in vitro (MIC) ed in vivo (risoluzione del caso clinico)

Sensibilit Una infezione sostenuta dal ceppo batterico isolato pu essere trattata appropriatamente con il dosaggio usuale dellantibiotico testato e raccomandato per il tipo di infezione clinica.

Sensibilit Intermedia Gli isolati batterici mostrano MIC corrispondenti a livelli sierici e tessutali di antibiotico per i quali lefficacia potrebbe essere pi bassa di quella registrata per gli isolati sensibili. Questa categoria suggerisce lefficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici sono fisiologicamente concentrati (chinoloni nelle urine) o quando lantibiotico pu essere utilizzato a concentrazioni pi alte di quelle normali ( -lattamici). Resistenza Questa categoria predice il possibile fallimento dellantibiotico testato. I ceppi resistenti non sono inibiti dalle normali concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo dallantibiotico in seguito a somministrazione di dosi normali.

Tecniche per la determinazione in vitro dellantibiotico-sensibilita

Brodo diluizione (micro- e macrometodo) Diffusione in agar (Kirby-Bauer) Agar diluizione Sistemi Automatizzati

ANTIBIOGRAMMA
Metodo della brodo diluizione
Preparare una soluzione madre di antibiotico Allestire diluizioni seriali 2-fold dellantibiotico in brodo MuellerHinton

Preparare un inoculo a DO uguale a 0.125 (0.5 McFarland)

Seminare ogni standardizzato diluizione di antibiotico con linoculo

Incubare a 37 C per 16-18 ore Seminare un pozzetto controllo (senza antibiotico)

MC-FARLAND STANDARDS
La scala degli standards di Mc-Farland rappresentata da una serie di fiale contenenti BaSO4, di opacit differenti, che permettono la valutazione della densit delle sospensioni batteriche La densit di una sospensione batterica valutata per confronto con una sospensione di opacit nota contenuta in una fiala dello stesso diametro

MC-FARLAND STANDARD
Standard 0.5 1 2 3 4 5
1

Concentrazione batterica 1 x 106 150 300 600 900 1200 1500

Densit ottica teorica 2 a 550 nm 0.125 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25

La concentrazione batterica varia secondo le dimensioni dei microrganismi I valori corrispondono alle densit ottiche delle sospensioni batteriche e non a quelle delle particelle di BaSO4

Minima Concentrazione Inibente (MIC) Minima Concentrazione Battericida (MBC).

Brodo diluizione
NCCLS-breakpoints
ANTIBIOTICO Piperacillina Cefazolina Cefotaxime Cefpodoxime Imipenem Vancomicina Gentamicina S 16 8 8 2 4 4 4 I 32-64 16 16-32 4 8 8-16 8 R 128 32 64 8 16 32 16

S = Sensibilit, I = Sensibilit Intermedia, R = Resistenza

Tecniche per la determinazione in vitro dellantibiotico-sensibilita

Brodo diluizione (micro- e macrometodo) Diffusione in agar (Kirby-Bauer) Agar diluizione Sistemi Automatizzati

ANTIBIOGRAMMA
Tecnica di Kirby-Bauer
Sospendere 4-5 colonie in 4 ml di brodo

Incubare a 37 C per 18 ore

Immergere un tampone nella brodocoltura e scaricarlo contro la parete della provetta Strisciare il tampone sulla piastra in modo uniforme ruotando la piastra di 60 Applicare i dischi a distanza maggiore di 25 mm dal bordo della piastra e ad distanza tra i centri dei dischi non inferiore a 24 mm Capovolgere la piastra ed incubarla a 37 C per 16-18 ore

Misurare gli aloni di inibizione

Diffusione in agar (Kirby-Bauer)

1. Allestimento brodocoltura da coltura pura 2. Semina brodocoltura

3 4 5

3. Apposizione dischetti antibiotizzati 4. Incubazione (37C, 18-24h) 5. Misurazione diametro alone di inibizione

Diffusione in agar
Risultati

Attivit battericida di un antibiotico

Infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi Focolaio di infezione situato in distretti anatomici difficilmente accessibili allantibiotico Concentrazione Minima Battericida (MBC): La pi bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica di almeno il 99.9% (1 germe su 1.000 elude lazione antibiotica) della popolazione iniziale.

Minima Concentrazione Inibente (MIC) Minima Concentrazione Battericida (MBC).

MIC/MBC test (Brodo diluizione)

MBC/MIC killing quotient

Tasso di uccisione = MBC / MIC

1-4 per antibiotici battericidi (beta-lattamici, chinoloni)

>4 per antibiotici batteriostatici (sulfamidici, tetracicline)

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI INDIRETTA = volta a rilevare una risposta immune umorale specifica dellospite allagente infettivo: A. Reazione di fissazione del Complemento B. Reazione di agglutinazione C. Test immunoenzimatico (ELISA) D. Saggio in immunofluorescenza E. Saggio radioimmunologico

Diagnosi INDIRETTA
La diagnosi INDIRETTA , ovviamente, pi tardiva di quella DIRETTA in quanto si pu ricorrere ad essa soltanto quando si sia sviluppata gi la reattivit immunitaria dellospite. Ci non sempre possibile, come nel caso di pazienti anergici. Le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico, pertanto, soltanto quando lisolamento del microrganismo sia difficoltoso, fallito, o non possibile. Laccertamento indiretto non comportando lisolamento del germe, preclude la possibilit di saggiare la sensibilit dellagente etiologico verso i farmaci antimicrobici.

Diagnosi INDIRETTA
A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
PRINCIPIO: capacit del Complemento di legarsi agli immunocomplessi METODICA: - il siero del paziente viene scomplementato (privato del Complemento) (30 min, 56 C) - il siero (diluizioni del-) inattivato viene cimentato con lantigene , in presenza di Complemento fresco (di coniglio) aggiunto in quantit nota - se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano allantigene ed il Complemento si lega allimmunocomplesso. - si aggiunge, quindi, un sistema rivelatore (eritrociti di montone + anticorpi anti-eritrociti di montone): se il siero del paziente positivo (cio contiene anticorpi contro lantigene) gli eritrociti rimangono integri, in quanto il Complemento si legato al primo immunocomplesso se il siero del paziente negativo (cio non contiene anticorpi contro lantigene) gli eritrociti vengono lisati, in quanto il Complemento si lega allimmunocomplesso eritrocita+anticorpo anti-eritrocita La reazione si evidenzia con liberazione di emoglobina Un classico esempio applicativo della FC la reazione di Wassermann, per la diagnosi di sifilide

Diagnosi INDIRETTA
A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

Diagnosi INDIRETTA
A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

Nella reazione FC la lisi del globulo rosso indica una reazione negativa, lassenza di lisi e un test positivo per la presenza di anticorpi. Questa figura mostra una reazione FC per evidenziare anticorpi verso Coxiella burnetii (agente eziologico della polmonite atipica). Nella linea superiore usando diluizioni di un siero in fase acuta, il complemento e stato fissato solo nei primi 5 pozzetti (il titolo dellanticorpo e 1/32), mentre con il siero convalescente nella seconda linea non ce lisi dei globuli rossi per tutte le diluizioni di siero e quindi il titolo dellanticorpo e uguale o maggiore di 1/512. Questo dimostra che un aumento di 4 volte nel titolo del siero tra la fase acuta e di convalescenza e indicativo dellinfezione da Coxiella burnetii.

Diagnosi INDIRETTA B. TEST DI AGGLUTINAZIONE

Lantigene corpuscolato consiste di una sospensione di microrganismi, celule (emazie) o particelle uniformi (lattice) sulle quali siano adsorbiti gli antigeni Diluzioni scalari (2-fold) del siero vengono cimentate con una quantit fissa di antigene In presenza di siero positivo, ossia contenete gli anticorpi specifici, si formano aggregati di complessi immuni che risultano visibili

Diagnosi INDIRETTA B. TEST DI AGGLUTINAZIONE

Titolo anticorpale = reciproco della pi alta diluizione positiva allagglutinazione

Diagnosi INDIRETTA C. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

IF INDIRETTA: Sul vetrino viene fissato lantigene noto ed il siero, opportunamente diluito, viene messo ad incubare con lantigene. Successivamente si aggiungono anticorpi anti-immunoglobuline umane, prodotti in animali e coniugati con isotiocianato di fluoresceina. IF DIRETTA: Sul vetrino viene fissato lantigene noto marcato con un fluorocromo (isotiocianato di fluorescina) ed il siero, opportunamente diluito, viene messo ad incubare con lantigene. Se il campione positivo, allosservazione al microscopia a fluorescenza esso risulter fluorescente grazie alla formazione dellimmunocomplesso marcato (fluorocromo associato allantigene).

D. Test immunoenzimatico
(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)
Si impiega lantigene fissato su una superficie di plastica (piastra) per catturare e separare lanticorpo specifico dagli altri anticorpi presenti nel siero del paziente. Lanticorpo fissato viene poi evidenziato da un anticorpo anti-IgG umane legato covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, -galattosidasi). La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso la valutazione dellintensit del colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica del relativo substrato cromogeno. La reale concentrazione dellanticorpo viene determinata per confronto con diluizioni standard dellanticorpo stesso

E. SAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO (Radioimmunoassay, RIA) Marcatura dellanticorpo (antigene) Rivelazione del corrispondente antigene (anticorpo) Competizione tra molecole marcate e non Un antigene purificato marcato con un radioisotopo compete con un antigene standard non marcato per il legame con lanticorpo Viene misurata la quantit di radioattivit associata allanticorpo