Imunoprecipitação

Imunoprecipitação
A imunoprecipitação é uma técnica que utiliza anticorpos monoclonais para uma

proteína com o objetivo de removê-las da solução. Os complexos da anticorpo-proteína
são precipitados fora da solução com a adição de um formulário insolúvel de proteínas
obrigatórias do anticorpo. Os exemplos incluem a proteína A, a proteína G, o Zysorbin,
o Immunoprecipitin, ou a adição de um segundo anticorpo à solução.
As amostras podem então ser lavadas após a precipitação e a centrifugação. Os

precipitates podem então ser funcionados em geles de SDS-PAGE com amortecedor da
amostra da proteína. Geralmente as amostras da proteína são radiolabeled antes do lysis
da pilha. Isto é feito geralmente adicionando ácidos aminados radiolabeled às pilhas.
Isto faz coisas simples enquanto a proteína está detectada então facilmente na película
quando funcionada em um gel como o ponto se emitirá a película da radioactividade e
da exposição. Você pode então avaliar para o tamanho da proteína (no peso molecular
com a comparação para fazer sob medida padrões), e a quantidade (comparando
amostras tratadas ou a um padrão das quantidades).
Além disso, o procedimento da imunoprecipitação igualmente permite a concentração

de proteínas que não são muito abundantes ou difíceis de detectar usando o borrão
ocidental. Com essa técnica é possível concentrar proteínas até a dobra 10.000 enquanto
pode tomar grandes volumes de lysates da pilha e concentrar sua proteína do interesse
em um precipitate pequeno que possa então ser usado para a análise ocidental do borrão
ou os outros métodos.
Aplicações da imunoprecipitação:
1) Determinação do peso molecular e da quantidade de proteína immunoprecipitated por

SDS-PAGE.
2) A imunoprecipitação é usada para avaliar para interações da proteína-proteína. Isto é

feito a imunoprecipitação para uma proteína, e então pela mancha para uma outra
proteína.
3) Quantificação da taxa de síntese de uma proteína nas pilhas determinando a proteína

radiolabeled da quantidade feita durante uma quantidade de tempo específica.
4) A imunoprecipitação permite à concentração de proteínas que são de outra maneira

difíceis de detectar.
O método da imunoprecipitação pode ser dividido em diversas etapas:
1. Preparação da amostra e lysis da pilha

2. Preclearing da solução
3. Incubação com anticorpo e formação de complexos do anticorpo-antígeno
4. Precipitação do complexo do interesse
5. Lavagem dos complexos do anticorpo-antígeno para remover as proteínas e os
contaminadores não específicos.
6. Análise dos complexos/antígeno do interesse por SDS-PAGE
Protocolos da Diretório do Pesquise Aprenda sobre

imunoprecipita protocolo da defeitos a a
imunoprecipita imunoprecipitaç
ção imunoprecipita
ção ão
ção (ligações
externas)

Preparação da amostra da imunoprecipitação e Lysis da pilha
Amortecedores do Lysis da imunoprecipitação
Dependendo da aplicação da imunoprecipitação ou do IP, você quererá usar

amortecedores diferentes do lysis. A escolha do amortecedor do lysis é importante e é
dependente das características da proteína do interesse.
Se queira estudar o phosphorylation das proteínas ou das interações da proteína-

proteína, você deve tentar Np-40.
Se você está estudando níveis da proteína total de uma proteína, você deve tentar RIPA.
O amortecedor de RIPA dá um mais baixo fundo na imunoprecipitação. Entretanto,

RIPA pode desnaturar algumas proteínas. Se você está conduzindo a imunoprecipitação
experimenta para estudar as interações da proteína-proteína, RIPA não deve ser usada
enquanto pode interromper a proteína: interações da proteína.
O amortecedor NP-40 tem um nível deanturing mais baixo, e é usado assim para
experiências do phosphorylation tais como a vista da atividade da quinase. NP-40 é
usado igualmente para interações da proteína-proteína. NP40 é um detergente non-ionic,
e é o detergente o mais de uso geral em amortecedores do lysis da pilha para a
imunoprecipitação e o borrão ocidental.
Pre-esclarecimento para a imunoprecipitação
A etapa preclear é executada geralmente para a imunoprecipitação porque abaixa a

quantidade de proteínas não específicas no lysate da pilha. Além disso, o pre-
esclarecimento igualmente remove as proteínas que podem ter interações não
específicas possíveis e uma afinidade elevada para a proteína A, proteína G,
Immunoprecipitin, Zysorbin, ou os o que formulário insolúvel de proteína obrigatória
do anticorpo você está usando a pull-down seu anticorpo. Alguns investigadores
encontram esta etapa desnecessária e saltam esta etapa. Pre-esclarecimento da tentativa
a primeira vez que você tenta a imunoprecipitação. Se seus resultados são
completamente desobstruídos, tente saltar a experiência seguinte do pre-esclarecimento
e veja como despeja.
IP: Anticorpo da incubação e formação de complexos do Anticorpo-

Antígeno
Que anticorpo deve você usar para a imunoprecipitação? Os anticorpos geralmente

Polyclonal são usados para o immunoprecipation.
Imunoprecipitação - precipitação do complexo do interesse
Os complexos do anticorpo-antígeno não são insolúveis sós, IE. a imunoprecipitação,

não é uma idéia completa. Os anticorpos e seu emperramento aos antígenos são solúveis
no sangue, amortecedores, e durante a experiência da imunoprecipitação. O que é usado
para precipitar para fora estes complexos é proteínas obrigatórias do anticorpo
insolúvel. As proteínas A e G, foram isoladas das bactérias, e do ligamento à região
constante do anticorpo.
Os exemplos das proteínas obrigatórias do anticorpo insolúvel usadas para precipitar

complexos na imunoprecipitação são:
 Proteína A
 Proteína G
 Zysorbin
 Immunoprecipitin
Imunoprecipitação - etapas de lavagem
Lavar os complexos é feito usando RIPA, PBS, IP-lava o amortecedor, ou os outros

amortecedores dependendo do que você gostaria de analisar após o IP. O amortecedor
de RIPA é mais estrito visto que PBS é menos estrito.
Receita do amortecedor da lavagem do IP
 10mM Tris; Ajuste ao pH 7.4

 o EDTA de 1mM
 1mM EGTA; pH 8.0
 NaCl de 150mM
 1% Triton X-100
 ortho-vanadate do sódio de 0.2mM
 cocktail do inibidor de protease
Notas finais para a imunoprecipitação
O sucesso da imunoprecipitação é dependente da afinidade do anticorpo para seu

antígeno. Um bom anticorpo da imunoprecipitação dar-lhe-á o baixo fundo quando
você analisa as amostras usando outras técnicas após o IP. As proteínas anticorpo-
obrigatórias insolúveis usadas são igualmente muito importantes. Os anticorpos
Polyclonal são os melhores anticorpos para usar anticorpos monoclonais entretanto
purified podem igualmente ser usados. Verific seu vendedor do anticorpo para ver se
seu anticorpo monoclonal foi testado para a imunoprecipitação.
Pontas para a imunoprecipitação
 Use os tubos de 2 mL para a imunoprecipitação como precipitates mais facilmente são

lavados e resuspended
 Tente saltar a etapa do pre-esclarecimento para ganhar o tempo
 Em vez do lavagem com IP-lave a tentativa PBS do amortecedor
 Se você já tem o baixo fundo e seu anticorpo é grande, tente o IP que lava 2X em vez
de 5X
 Certifique-se de você remover tanto líquido dos tubos do eppendorf quando lavagem
da imunoprecipitação

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Imunoprecipitação

A imunoprecipitação é uma técnica que utiliza anticorpos monoclonais para uma

As amostras podem então ser lavadas após a precipitação e a centrifugação. Os

Além disso, o procedimento da imunoprecipitação igualmente permite a concentração

1) Determinação do peso molecular e da quantidade de proteína immunoprecipitated por

2) A imunoprecipitação é usada para avaliar para interações da proteína-proteína. Isto é

3) Quantificação da taxa de síntese de uma proteína nas pilhas determinando a proteína

4) A imunoprecipitação permite à concentração de proteínas que são de outra maneira

O método da imunoprecipitação pode ser dividido em diversas etapas:

1. Preparação da amostra e lysis da pilha

Protocolos da Diretório do Pesquise Aprenda sobre

Preparação da amostra da imunoprecipitação e Lysis da pilha

Amortecedores do Lysis da imunoprecipitação

Dependendo da aplicação da imunoprecipitação ou do IP, você quererá usar

Se queira estudar o phosphorylation das proteínas ou das interações da proteína-

O amortecedor de RIPA dá um mais baixo fundo na imunoprecipitação. Entretanto,

A etapa preclear é executada geralmente para a imunoprecipitação porque abaixa a

IP: Anticorpo da incubação e formação de complexos do Anticorpo-

Que anticorpo deve você usar para a imunoprecipitação? Os anticorpos geralmente

Imunoprecipitação - precipitação do complexo do interesse

Os complexos do anticorpo-antígeno não são insolúveis sós, IE. a imunoprecipitação,

Os exemplos das proteínas obrigatórias do anticorpo insolúvel usadas para precipitar

Imunoprecipitação - etapas de lavagem

Lavar os complexos é feito usando RIPA, PBS, IP-lava o amortecedor, ou os outros

Receita do amortecedor da lavagem do IP

 10mM Tris; Ajuste ao pH 7.4

Notas finais para a imunoprecipitação

O sucesso da imunoprecipitação é dependente da afinidade do anticorpo para seu

Pontas para a imunoprecipitação

 Use os tubos de 2 mL para a imunoprecipitação como precipitates mais facilmente são

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