FERNANDA DE LACERDA GOMARA

ESTUDO DE PERMEAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO DO ÁCIDO KÓJICO

Dissertação apresentada como requisito parcial à

obtenção do grau de Mestre, pelo Programa de
Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, do
Setor de Ciências da Saúde, do Departamento de
Farmácia da Universidade Federal do Paraná.

Orientador: Prof. Dr. Roberto Pontarolo

Co-orientador: Prof a. Dr a. Mayumi Eliza O

Sato

CURITIBA
2003
 Programa de Pós-graduaçáo em Ciências Farmacêuticas

PARECER

A Comissão Examinadora indicada pelo Colegiado do Programa de

Pós-graduação èm Ciências Farmacêuticas para julgar e avaliar a
dissertação de mestrado "Estudo de permeação cutânea in vitro do ácido
kójico", de autoria da pós-graduanda FERNANDA DE LACERDA GOMARA,
composta pelos Professores Dr. Roberto Pontarolo
(Orientador/Presidente) Dra.Lígia Maria Moreira de Campos
(Universidade Federal de Minas Gerais) e o Titular Cid Aimbiré de Moraes
Santos (Universidade federal do Paraná).
A Comissão Examinadora aprova a dissertação com
nota . conceito A e recomenda sua publicação após as
correções sugeridas, que serão conferidas pelo orientador.

Curitiba, 27 de junho de 2003.

Prof ___ v dor/Presidente)

Profa Dra.Ltáía Maria jyfdféira de Campos - UFMG

Prof.Tit. Cid Aimbiré de Moraes Santos - UFPR

Dedico este trabalho aos meus pais
Francisco José de Lacerda Gomara e
Leslie Suzete Caron de Lacerda
Gomara, responsáveis pela realização
de todos os meus sonhos.
AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo amparo e cuidado a mim dedicado.

Ao Prof. Dr. Roberto Pontarolo, pela orientação, estímulo, amizade e confiança em

mim depositada.

À Prof a. Dr a . Mayumi Elisa Otsuka Sato, pela amizade, paciência e participação no

desenvolvimento do trabalho.

Ao Prof. Itamar Francisco Andreazza pelo estímulo ao estudo e à pesquisa e as suas

valiosas colaborações, que tornou possível a realização deste trabalho.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Departamento de

Farmácia, UFPR, que possibilitou o desenvolvimento da pesquisa.

Ao Prof. Dr. Cid Aimbiré de Moraes Santos, pelo empréstimo de materiais

indispensáveis à execução deste trabalho.

À Prof. D ra. Iara Maria Pereira Machado, pela colaboração na execução das fotos.

À Valeska Pereira, pela participação ativa no decorrer do trabalho.

Ao matadouro Basso, pela doação das orelhas de porco utilizadas neste trabalho.

À toda minha família pela presença constante e incentivo sempre.

Ao Emerson pela compreensão, amizade, dedicação, carinho e por me fazer sempre

acreditar que os sonhos podem se tornar realidade.

A todos aqueles que diretamente ou indiretamente colaboraram no desenvolvimento

deste trabalho.
SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS............................................................................................................................. viii

LISTA DE FIGURAS............................................................................................................................... x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS.................................................................................... xi
RESUMO ................................................................................................................................. xii
ABSTRACT............................................................................................................................................ xiii
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS......................................................................................................................................... 3
2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................................................... 3
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................................................ 3
3 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................................... 4
3.1 A PELE.............................................................................................................................................. 4
3.1.1 Anatom ia........................................................................................................................................ 4
3.1.1.1 Epiderme.................................................................................................................................... 5
3.1.1.2 D erm e......................................................................................................................................... 5
3.1.2 Funções da P e le ............................................................................................................................ 6

3.1.2.1 Funções gera is........................................................................................................................... 6

3.1.2.2 Funções específicas.................................................................................................................. 7

3.1.2.2.1 Função m elanogênica............................................................................................................ 7
3.1.2.2.1.1 M elanina............................................................................................................................... 7
3.1.2.2.1.2 Funçõesda m elanina.......................................................................................................... 9
3.1.2.2.1.3 Origem da m elanina...................................................................................................... 10
3.1.2.2.1.4 Síntese da m elanina........................................................................................................... 10
3.2 HIPERPIGMENTAÇÃO................................................................................................................ 14
3.2.1 Classificação das Hipercromias.................................................................................................. 15
3.2.1.1 Melasma ou cloasm a................................................................................................................ 15
3.2.1.2 Sardas ou efélides..................................................................................................................... 16
3.2.1.3 Lentigens................................................................................................................................... 16
3.2.1.4 Lentigensactíneas.................................................................................................................... 16
3.2.1.5 Lentigens senis ou de luz s o la r................................................................................................ 17
3.1.2 .6 Melanoses por fotossensibilizantes......................................................................................... 17
3.1,2.7Melanoses tóxico- m edicamentosas........................................................................................ 18
3.1.2.8 Melanose pós-infamatória ou melanodermias residuais....................................................... 18
3.1.2.9 Nevus......................................................................................................................................... 19
3.3. DESPI GMENTANTES.................................................................................................................... 19
3.3.1 Conceito........................................................................................................................................ 19
3.3.2 Classificação................................................................................................................................. 19
3.3.3 Agentes Clareadores............. 19
3.3.3.1 Ácido kójico.......................................................................................................................... 19
3.3.3.2 Ácido glicólico...................................................................................................................... 21
3 .3.3.3 Ácido retinóico..................................................................................................................... 21

3.3.3.4 Hidroquinona....................................................................................................................... 22
3.3.3.5 Ácido ascórtoico.................................................................................................................... 23
3.3.3.6 A rbu tina .............................................................................................................................. 23
3.3.3.7 Melawhite®.......................................................................................................................... 24
3.3.3 .8 VC -PM G ® ......................................................................................................................... 24
3.3.3.9 Antipollon H T ® ..................................................................................................................... 24
3.3.3.10Ácidoazeláico.................................................................................................................... 25
3.3.3.11 Extratos vegetais............................................................................................................... 25
3.3.3.12 M elfade®............................................................................................................................ 25
3.3.3.13 Ácido fitic o .......................................................................................................................... 26
3.4 FORMAS FARMACÊUTICAS SEMI-SÓLIDAS........................................................................ 26
3.4.1 Emulsões................................................................................................................................. 27
3.5 ESTUDOS IN VITRO DE PERMEAÇÃO CUTÂNEA................................................................ 34
3.5.1 Terminologias......................................................................................................................... 34
3.5.2 Aparelhos Utilizados nos Testes in v itrv ................................................................................ 35
3.5.3 Membranas Utilizadas nosTestes in vitro ............................................................................. 39
3.5.4 Soluções Receptoras Utilizadas nos Testes in v itro ............................................................. 43
3.6 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS.............................................................................. 45
3.6.1 Exatidão................................................................................................................................... 46
3.6.2 Precisão................................................................................................................................... 47
3.6.3 Especificidade......................................................................................................................... 47
3.6.4 Limite de Detecção................................................................................................................. 48
3.6.5 Limite de Quantificação.......................................................................................................... 48
3.6.6 Linearidade e Faixa de T rabalho........................................................................................... 48
3.6.7 Robustez.................................................................................................................................. 49
3.6.8 Sensibilidade........................................................................................................................... 49
4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................................. 50
4.1 MATERIAL.................................................................................................................................. 50
4.1.1 Matéria-Prima e Reagentes................................................................................................... 50
4.1.2 Equipamentos......................................................................................................................... 50
4.2 MÉTODOS.................................................................................................................................. 51
4.2.1 Desenvolvimento de Forma Farmacêutica........................................................................... 51
4.2.2 Avaliação das Características Organolépticas dos Veículos............................................... 52
4.2.3 Avaliação Preliminar da Estabilidade da Formulação Escolhida........................................ 52

v
4.2.4 Espectrofotometria no Ultravioleta........................................................................................ 53
4.2.4.1 Curva padrão ácido kqico por espectrofotometria no ultravioleta................................... 53
4.2.4.2 Linearidade.......................................................................................................................... 53
4.2.4.3 R obustez.............................................................................................................................. 54
4.2.4.3.1 Influência do pH................................................................................................................ 54
4.2.4.3.2 Influência do tempo de leitura......................................................................................... 55
4.2.4.3.3 Influência da tem peratura................................................................................................ 56
4.2.4.4 Exatidão................................................................................................................................ 56
4.2.4.5 Precisão................................................................................................................................ 56
4.2.5 Espectrofotometria no Visível pelo Cloreto Férrico............................................................. 57
4.2.5.1 Determinação da influência da concentração de cloreto férrico na intensidade de cor
na solução com ácido kójico............................................................................................................. 57
4.2.5.2 Espectro de absorção do ácido kójico em presença de cloreto férrico............................ 58
4.2.5.3 Curva padrão do ácido kójico por espectrofotometria no visível pelo cloreto férrico 58
4.2.5.4 Linearidade.......................................................................................................................... 59
4.2.5.5 Robustez............................................................................................................................... 59
4.2.5.5.1 Influência do p H ................................................................................................................ 60
4.2.5.5.2 Influência do tempo de le itu ra ......................................................................................... 60 -
4.2.5.5.3 Influência da tem peratura................................................................................................ 60
4.2.5 .6 Exatidão................................................................................................................................ 61
4.2.5.7 Precisão................................................................................................................................ 61
4.2.6 Avaliação da Qualidade da Matéria-Prima............................................................................ 62
4.2.7 Avaliação da Qualidade da Formulação............................................................................... 63
4.2.8 Permeação Cutânea In Vitro do Ácido Kój ic o ....................................................................... 63
4.2.8.1 Célula de d ifu são................................................................................................................. 63
4.2.8.2 M em brana............................................................................................................................ 64
4.2.8.3 Ensaio de permeação cutânea in vitro do ácido kójico na form ulação............................ 65
4.2.8.4 Ensaio de permeação cutânea in vitro do ácido kójico em solução tampão fosfato pH
7.4 ...................................................................................................................................................... 66

4.2.9 Determinação da quantidade de ácido kójico retido na pele da orelha de porco.............. 66

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................... 68

5.1 OBTENÇÃO DA FORMA FARMACÊUTICA............................................................................. 68

5.1.1 Emulsão................................................................................................................................... 68

5.1.2 Avaliação das Características Organolépticas das Formulações Prévias.......................... 70

5.1.3 Avaliação Preliminar da Estabilidade da Formulação F 4 ................................................. 72
5.2 ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA................................................................. 73
5.2.1 Curva Padrão do Ácido Kójico por Espectrofotometria no Ultravioleta............................... 74
5.2.2 Sensibilidade............................................................................................................................ 75

vi
5.2.3 Linearidade....................................................................................
5.2.4 Robustez....................................................................................................................................... 76

5.2.4.1 Influência do p H ........................................................................................................................ 77

5.2.4.2 Influência do tempo de le itu ra ................................................................................................. 80

5.2.4.3 Influência da tem peratura ..........................................................
5.2.5 Exatidão........................................................................................................................................ 81
5.2.6 Precisão........................................................................................................................................ 83
5.3 ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO FÉRRICO...................................... 84
5.3.1 Determinação da Influência da Concentração de Cloreto Férrico na Intensidade de Cor
na Solução com Ácido Kójico................................................................................................................ 86

5.3.2 Curva Padrão do Ácido Kójico por Espectrofotometria no visível pelo Cloreto Férrico 88

5.3.3 Sensibilidade................................................................................................................................ 89
5.3.4 Linearidade............................................................................................................................. 89
5.3.5 Robustez.................................................................................................................................. 90
5.3.5.1 Influência do p H ................................................................................................................... 90
5.3.5.2 Influência do tempo de le itu ra ................................................................................................. 91
5.3.5.3 Influência da tem peratura................................................................................................... 92
5.3.6 Exatidão................................................................................................................................... 93
5.3.7 Precisão................................................................................................................................... 94
5.4 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS DEDOSEAMENTO DO ÁCIDO KÓJICO 95
5.5 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA MATÉRIA-PRIMA.............................................................. 96
5.6 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA FORMULAÇÃO.................................................................. 99
5.7 PERMEAÇÃO CUTÂNEA..................................... ’.................................................................... 99
5.8 RETENÇÃO CUTÂNEA............................................................................................................. 107
6 CONCLUSÃO.................................................................................................................................... 111
REFERÊNCIAS.................................................................................................................................... 113
ANEXOS................................................................................................................................................ 124

v ii
LISTA DE TABELAS

TABELA 1 -ELEMENTOS NECESSÁRIOS PARA VALIDAÇÃO............................................. 46

TABELA 2 - FORMULA DAS EMULSÕES O/A NÃO IÔNICAS................................................. 52
TABELA 3 - OBTENÇÃO DE SOLUÇÕES PADRÃO DE ÁCIDO KÓJICO 20 (ig/ml EM
DIFERENTES VALORES DE pH............................................................................... 54
TABELA 4 - SOLUÇÕES TAM PÃO ............................................................................................ 55
TABELA 5 - SISTEMAS UTILIZADOS PARA DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA
CONCENTRAÇÃO DE CLORETO FÉRRICO NA INTENCIDADE DE COR NA
SOLUÇÃO COM ÁCI DO KÓJ IC O .............................................................................. 57
TABELA 6 - PREPARO DOS SISTEMAS PARA OBTENÇÃO DA CURVA PADRÃO DO
ÁCIDO KÓJICO POR ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO
FÉRRICO..................................................................................................................... 59
TABELA 7 - PREPARO DOS SISTEMAS PARA VERIFICAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO pH
NA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDO KÓJICO POR
ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO FÉRRICO................. 60
TABELA 8 - PREPARO DOS SISTEMAS PARA DETERMINAÇÃO DA PRECISÃO DO
MÉTODO COLORIMÉTRICO COM CLORETO FÉRRICO ..................................... 62
TABELA 9 - CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DAS FORMULAÇÕES PRÉVIAS.... 71
TABELA 10 -FO RM ULAÇÃO ........................................................................................................ 72
TABELA 11 - AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA ESTABILIDADE DA FORMULAÇÃO F 4 .......... 72
TABELA 12 - VALORES DE ABSORVÁNCIA OBTIDOS POR ESPECTROFOTOMETRIA DE
ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA PARA CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO
DE ÁCIDO KÓJICO..................................................................................................... 74
TABELA 13 - VALORES DE ABSORVÁNCIA E PORCENTAGEM DE RECUPERAÇÃO
OBTI DOS NO TESTE DE EXATIDÃO....................................................................... 83
TABELA 14 - VALORES DE ABSORVÁNCIA OBTIDOS NA AVALIAÇÃO DA VARIAÇÃO
INTRA-DIA................................................................................................................... 83
TABELA 15 - VALORES DE ABSORVÁNCIA OBTIDOS NA AVALIAÇÃO DA VARIAÇÃO
INTER-DIAS................................................................................................................ 84
TABELA 16 - VALORES DE ABSORVÁNCIA DE SISTEMAS CONTENDO 100 DE
ÁCIDO KÓJICO PADRÃO E DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE CLORETO
FÉRRICO..................................................................................................................... 87
TABELA 17 - VALORES DE ABSORVÁNCIA E PORCENTAGEM DE RECUPERAÇÃO
OBTIDOS NO TETE DE EXATIDÃO.......................................................................... 94
TABELA 18 - VALORES DE ABSORVÁNCIA OBTIDOS NA AVALIAÇÃO DA VARIAÇÃO
INTRA-DIA................................................................................................................... 94
TABELA 19 - VALORES DE ABSORVÁNCIA OBTIDOS NA AVALIAÇÃO DA VARIAÇÃO
 INTER-DIAS................... 954
TABELA 20 - COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS DE DOSEAMENTO DO ÁCIDO
KÓJICO........................................................................................................................ 96
TABELA 21 - PARÂMETROS DE QUALIDADE PARA A MATÉRIA-PRIMA.............................. 97
TABELA 22 - PARÂMETROS DE QUALIDADE PARA A FORMULAÇÃO F 4 .......................... 99
TABELA 23 - RESULTADOS DE PERMEAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO DOÁCIDO KÓJICO
ATRAVÉS DA PELE DA ORELHA DE PORCO........................................................... 103
TABELA 24 - PARÂMETROS CINÉTICOS DAS CURVAS DE PERMEAÇÃO IN VITRO DO
ÁCIDO KÓJICO NAS FORMULAÇÕES EM ESTUDO................................................ 106
TABELA 25 - RETENÇÃO CUTANEA DO ÁCIDO KÓJICO DA FORMULAÇÃO F 4 ............... 108
TABELA 26 -RETENÇÃO CUTÂNEA DO ÁCIDO KÓJICO DA SOLUÇÃO TAMPÃO
FOSFATO ISOTÔNICA pH 7,4................................................................................... 108

ix
LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - A PELE E SEUS APÊNDICES................................................................................ 4

FIGURA 2 - POSSÍVEIS ROTAS DE PENETRAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS PELA
MEMBRANA DO ESTRATO CÓRNEO...................................................................... 7
FIGURA 3 ETAPAS QUÍMICAS E RESPECTIVOS REGULADORES ENVOLVIDOS NA VIA
MELANOGÊNICA........................................................................................................ 12
FIGURA 4 -ESTRUTURA DO ÁCIDO KÓJICO.......................................................................... 20
FIGURA 5 - MODELOS DE CÉLULAS DE DIFUSÃO PARA ESTUDOS DE LIBERAÇÃO
eoU PERMEAÇÃO DE FÁRMACOS CONTIDOS EM PRODUTOS
DERMATOLÓGICOS.................................................................................................. 36
FIGURA 6 -CÉLULA DE DIFUSÃO UTILIZADA NO PRESENTE TRABALHO..................... 64
FIGURA 7 - DISSECAÇÃO DA PELE DA ORELHA DE PORCO.............................................. 65
FIGURA 8 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA DA SOLUÇÃO DO ÁCIDO
KÓJICO PADRÃO 25 jjg/ml EM ÁGUA (pH 6 ,0 )....................................................... 73
FIGURA 9 - CURVA PADRÃO DE ÁCIDO KÓJICO OBTIDA POR
ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA........................ 75
FIGURA 10 - DETERMINAÇÃO DA LINEARIDADE DO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DO
ÁCIDO KÓJICO POR ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA............... 76
FIGURA 11 - INFLUÊNCIA DO pH NA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDO KÓJICO
POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA.............. 77
FIGURA 12 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA DA SOLUÇÃO PADRÃO
DE ÁCIDO KÓJICO 25 ng/ml EM TAMPÃO H3 BO3 .KCI - NaOH (pH 9 ,0 )............. 78
FIGURA 13 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA DA SOLUÇÃO DE ÁCIDO
KÓJICO 25 ng/ml EM TAMPÃO ACETATO (pH 3 ,0 )................................................ 79
FIGURA 14 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA DA SOLUÇÃO PADRÃO
DE ÁCIDO KÓJICO 25 pg/ml EM ÁGUA (pH 6 ,0 ).................................................... 79
FIGURA 15 - INFLUÊNCIA DO TEMPO DE LEITURA NA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
ÁCIDO KÓJICO POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO
ULTRAVIOLETA.......................................................................................................... 80
FIGURA 16 - INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
ÁCIDO KÓJICO POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO
ULTRAVIOLETA.......................................................................................................... 81
FIGURA 17 - ESTRUTURA DO P-HIDROXI-METILPARABENO............................................... 82
FIGURA 18 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA DA SOLUÇÃO AQUOSA
DE METILPARABENO 25 (ig /m l................................................................................. 82
FIGURA 19 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO ÁCIDO KÓJICO (25 ng/ml) POR

x
 ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO FÉRRICO.................. 85
FIGURA 20 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO CONSERVANTE METILPARABENO
(NIPAGIN ®) POR ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO
FÉRRICO..................................................................................................................... 86
FIGURA 21 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MAIS ADEQUADA DE CLORETO
FÉRRICO PARA OS SISTEMAS............................................................................... 88
FIGURA 22 - CURVA PADRÃO DO ÁCIDO KÓJICO OBTIDA POR
ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO FÉRRICO................. 89
FIGURA 23 - DETERMINAÇÃO DA LINEARIDADE DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DO
ÁCIDO KÓJICO POR ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO
FÉRRICO..................................................................................................................... 90
FIGURA 24 - INFLUÊNCIA DO pH NA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDO KÓJICO
POR ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO FÉRRICO 91
FIGURA 25 - INFLUÊNCIA DO TEMPO DE LEITURA NA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
ÁCIDO KÓJICO POR ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO
FÉRRICO..................................................................................................................... 92
FIGURA 26 - INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
ÁCIDO KÓJICO POR ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PELO CLORETO
FÉRRICO..................................................................................................................... 93
FIGURA 27 - ESPECTROS DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO DO ÁCIDO KÓJICO
PADRÃO E DA MATÉRIA-PRIMA............................................................................. 98
FIGURA 28 - ESPECTROS DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA DO ÁCIDO KÓJICO
PADRÃO E DA MATÉRIA-PRIMA............................................................................. 98
FIGURA 29 - CURVA PADRÃO DO ÁCIDO KÓJICO EM SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO pH
7 ,4 102
FIGURA 30 - PERFIL DOS FLUXOS DE PERMEAÇÃO DO ACIDO KÓJICO ATRAVÉS DA
PELE DA ORELHA DE PORCO................................................................................. 104
FIGURA 31 - DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE LATÊNCIA DA PERMEAÇÃO DO ÁCIDO
KÓJICO NAS FORMULAÇÕES................................................................................. 105
FIGURA 32 - CURVA PADRÃO DO ÁCIDO KÓJICO EM METANOL......................................... 107
FIGURA 33 - QUANTIDADE DE ÁCIDO KÓJICO RETIDO NA PELE DA ORELHA DE
PORCO APÓS OITO HORAS DE CONTATO COM OS VElCULOS...................... 109

xi
A - absorvância
ACTH - hormônio adrenocorticotrópico
A/O - água em óleo
BHT - butilhidroxitolueno
BPF - boas práticas de fabricação
DHI - 5, 6 - dihidroxiindol
DHICA - 5, 6 - dihidroxiindol - 2 - ácido carboxílico
DOPA - 3, 4 - diidroxifenilalanina
DPR - desvio padrão relativo
EDTA- Na2 - ácido etilenodiaminotetracético dissódico
F. BRAS. IV - Farmacopéia Brasileira 4a. edição
FDA - Food and Drug Administration
HLB - equilíbrio hidrófilo-lipófilo
MSH - hormônio melano estimulante
O/A - óleo em água
% - porcentagem
r - coeficiente de correlação
rpm - rotações por minuto
TRP - tyrosine - related - protein
SD - desvio padrão
USP - United States Pharmacopoeia
UV - ultravioleta
RESUMO

Desordens no processo melanogênico podem causar as hiperpigmentações, sendo

a de maior freqüência o melasma. O ácido kójico é um dos despigmentantes tópicos
utilizados no tratamento destas hipercromias. A ação de um produto dermatológico
deve ser tópica, não devendo atingir níveis sistêmicos. Um dos fatores que pode
definir o nível de ação, tópica ou sistêmica, é o veículo. Neste contesto, o presente
trabalho teve por objetivo avaliar o grau de permeação cutânea in vitro, célula de
FRANZ modificada, de uma formulação em relação a uma solução tampão pH 7,4,
ambas contendo ácido kójico. A primeira parte do trabalho consistiu no
desenvolvimento e validação de duas metodologias para a quantificação do ácido
kójico na matéria-prima e na formulação. Tanto o método espectrofotométrico no
ultravioleta quanto o método espectrofotométrico no visível pelo cloreto férrico
apresentaram os parâmetros de validação (sensibilidade, faixa de linearidade,
robustez, exatidão e precisão) satisfatórios, sendo o primeiro é mais sensível e por
isso o mais adequado para o estudo de permeação, embora o método
espectrofotométrico no visível pelo cloreto férrico tenha se mostrado mais adequado
para a determinação do teor de ácido kójico na formulação. O estudo in vitro mostrou
que a absorção do ácido kójico da formulação apresentou cinética de pseudo 1a.
ordem (no intervalo de 1 a 8 horas) e conseqüentemente menor fluxo através da
membrana natural (pele da orelha de porco) e maior retenção cutânea, enquanto
que o ácido kójico da solução tampão pH 7,4 apresentou cinética de ordem zero e
conseqüentemente maior fluxo e menor retenção. Este resultado indicou que a
formulação desenvolvida mostrou-se adequada para a veiculação do ácido kójico,
tendo em vista, que o órgão alvo é a pele.
ABSTRACT

Disorder of the tirosinase biosynthesis process can result on hiperpigmentations, like

the frequently found melasma. The kojic acid is one of the depigmenting topic agent
utilized in the handling of these hipercromies. The action of a dermatologic product o
should be topic, should not reach systemic levels. One of the factors that is able to
defined the level of action, topic or systemic, is the vehicle. In this contest, the
present work had for objective evaluate the rank of in vitro cutaneous permeation, in
the cell of FRANZ modified, of a formulation regarding a buffered solution 7,4, both
containing kojic acid. The first part of the work consisted of the development and
validation of two methodologies for the quantification of the kojic acid in the raw
material and in the formulation. Both methods, the spectrophotometric in the
ultraviolet and the spectrophotometric the visible, presented the parameters of
validation (sensibility, streak of linearity, robustness, accuracy and precision)
satisfactory, being the first one more sensible and by that the most adequate for the
permeation study, although the spectrophotometric method in the visible have shown
adequate for the determination of the content. The in vitro study showed that the
absorption of kojic acid from the formulation presented kinetic of pseudo 1st. order (in
the break from 1 to 8 hours) and consequently smaller stream through the natural
membrane (skin from the ear of pig) and bigger cutaneous retention, while the kojic
acid from the buffered solution pH 7,4 presented kinetic of zero order and
consequently bigger stream and smaller retention. This result indicated that the
formulation developed can be used like vehicle of kojic acid, having in mind that the
organ aim is the skin.

xiv
 1

1 INTRODUÇÃO

Em um mundo cada vez mais globalizado e competitivo, a aparência física

tornou-se um aspecto de grande importância na sociedade contemporânea.
As manchas da pele, principalmente as faciais, são inestéticas e causam
alguns transtornos que dificultam o bem-estar do indivíduo no âmbito psicosocial.
As hiperpigmentações são, em geral, distúrbios caracterizados pelo aumento
de melanina e outros pigmentantes na pele. Os principais desencadeadores são as
radiações solares, os hormônios sexuais e agentes externos, fontes de radicais
livres.
Neste contexto, tanto as indústrias de cosméticos quanto farmacêuticas têm
crescido a cada ano, diversificando suas matérias-primas e ampliando suas linhas
de produtos disponíveis ao consumidor.
Atualmente a Tecnologia Farmacêutica tem dado especial atenção à
avaliação da eficácia terapêutica do produto acabado, Um produto estável e com
dosagem correta, pode proporcionar uma ação medicamentosa inadequada. Vários
fatores podem ser responsáveis por esta falha na atividade do produto, como por
exemplo, os fatores fisiológicos, os quais dependem, na maioria das vezes, do
paciente ou do substrato biológico da medicação. Nesta situação, o farmacêutico
formulador não possui condições de atuar diretamente. Entretanto, existem vários
fatores inerentes ao próprio fármaco, à forma farmacêutica, à formulação e ao
processo tecnológico de fabricação, que influem, quase sempre de forma direta e
expressiva, na disponibilidade dos medicamentos. Nestes casos, o papel do
formulador é fundamental e sua responsabilidade indeclinável.
A determinação, a interpretação e a modulação da biodísponibilidade dos
medicamentos, através de suas formulações, constituem os principais objetivos de
uma ciência galênica denominada Biofarmácia, que é extremamente difundida e
praticada por pesquisadores farmacotécnícos. A prática da biofarmácia requer, como
conhecimento fundamental, uma formação farmacocinética básica, um
conhecimento profundo dos mecanismos de liberação e absorção dos fármacos,
bem como da modificação destes processos mediante meios físico-químicos e
tecnológicos.
 2

Nos produtos dermatológicos, a formulação que contém o principio ativo

influencia de maneira significativa na ação final do medicamento. Isto porque, várias
interações entre princípio(s) ativo(s) e veículo(s) são estabelecidas, interações estas,
que podem modificar, por exemplo, o coeficiente de partição do(s) fármaco(s) entre o
veículo e a pele. Podem, também, alterar a integridade do estrato córneo e, nesta
situação, a solubilidade do fármaco na camada cómea e/ou a facilidade com que ele
se difunde através deste tecido, encontram-se afetadas.
A absorção de princípios ativos na pele envolve dois passos consecutivos: a
liberação dessa substância pelo veículo e sua subseqüente absorção cutânea. Os
princípios ativos incorporados em veículos inadequados podem ser pouco ou nada
absorvidos pela pele. Com base neste fato, pode-se considerar que os estudos de
liberação medicamentosa proporcionam dados valiosos sobre as particularidades
estruturais do veículo e a capacidade deste em liberar os componentes ativos
(CHOWHAN, PRITCHARD, 1975).
As características de liberação de um fármaco a partir de um veículo
dermatológico podem ser avaliadas determinando-se o coeficiente de partição
óleo/água. Entretanto, estudos de liberação in vitro e in vivo proporcionam dados
mais significativos. Durante a fase de desenvolvimento de produtos dermatológicos é
adequado empregar procedimentos de liberação in vitro para selecionar veículos
que possam proporcionar uma atividade terapêutica adequada.
Inúmeros são os veículos e adjuvantes empregados em dermatologia, porém,
a tendência atual é desenvolver bases dermatológicas que funcionem como
sistemas adequados de liberação de fármacos, associados a alteradores de
permeabilidade cutânea, que sejam biocompatíveis com as membranas celulares
(BAE, KIM, 1993).
Com base nas colocações acima e na importância das substâncias
despigmentantes em dermatologia, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver
uma metodologia para o doseamento do ácido kójico, validá-la e desenvolver uma
preparação dermatológica adequada para veiculação desse fármaco, fazendo uso
de metodologia in vitro para avaliação da liberação e penetração transcutânea.
 3

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

• Avaliar a absorção percutânea in vitro do ácido kójico, despigmentante, em
uma forma farmacêutica semi-sólida de uso tópico.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Desenvolver uma forma farmacêutica, estável, do tipo emulsão para veicular o
ácido kójico.

• Desenvolver e validar um método de doseamento para o ácido kójico.

• Determinar o teor de ácido kójico na matéria-prima e na forma farmacêutica

utilizada como veículo.

Determinar o grau de absorção percutânea in vitro do ácido kójico.

 4

3 REVISAO DA LITERATU RA

3.1 A PELE
3.1.1 Anatomia
A pele e o maier 6rgao do corpo humane, sua superficie total oscila entre
2500 cm2 em urn recem-nascido a 18000 cm 2 em urn adulto e pesa
aproximadamente 4,8 kg em urn homem. Em cada centimetre quadrado podem ser
encontrados 10 foliculos pilosos, 100 glandulas sudoriparas, 15 glandulas sebaceas,
tres vases sanguineos, 360 em de nerves e 3 X 106 celulas (BARRY, 1983).
A pele e composta por diferentes tecidos, mas que sao interdependentes: a
epiderme pluricelular, estratificada e avascular, e a derme de tecido conectivo. A
hipoderme, uma camada adiposa subcutanea, encontra-se abaixo da derme (Figura
1).

ESQUEMA DE UM CORTE DE PELE

EPIDERME-:: ~~~=:M:':~~~:-----.--,..,.-4~~~--,....
~~~

DERME
I
\
/
HIPODERME

"'
GLANDULA SEDACEA FOLICULO PILOSO GLANDULA SUDORJPARA

Figura 1: A pele e seus apendices (BARRY, 1983).

 5

3.1.1.1 Epiderme
A epiderme consta de várias camadas. A estratificação é resultado da
produção de queratinócitos pela camada basal fazendo com que as células mais
antigas migrem à superfície e se desprendam. A espessura da epiderme varia de
acordo com a região do corpo, sendo mais espesso nas palmas das mãos e planta
dos pés e mais fina ao redor dos olhos.
As camadas formadas são:
• Camada basal: localiza-se na junção dermo-epidermal. É uma camada
unicelular que dá origem a todos os queratinócitos por mitose para renovação da
epiderme. Entre estas células estão presentes os melanócitos, células responsáveis
pela produção de pigmentos da pele.
• Camada espinhosa: tem-se nesta camada 6 a 20 fileiras de
queratinócitos em forma globulosa, poliédricas e aderidas entre si por espessamento
da membrana (desmossomas) dando-lhe a aparência espinhosa.
• Camada granulosa: são 3 a 4 fileiras de queratinócitos achatados com
núcleo basófilo e protoplasma contendo granulações de queratohialina. As células
estão perdendo as características vitais.
• Camada lúcida: está presente nas palmas das mãos e nas plantas dos
pés. São regiões pobres em hialina, formando uma fina e translúcida linha logo
acima da camada granulosa.
• Estrato córneo: composto por várias camadas de células achatadas
mortas que contêm pequenas bolsas de queratina. Constituem a camada mais
superficial da epiderme. É recoberta pela emulsão fisiológica epicutânea e encontra-
se em constante processo de desprendimento.
Representa uma região importante no controle da absorção de fármacos. A
permeabilidade seletiva desta estrutura é o fator principal de muitos aspectos
biofarmacêuticos de medicamentos tópicos. É nesta camada que algumas
substâncias podem ficar depositadas e não atingirem a derme (ROUGIER et al.,
1983).

3.1.1.2 Derme
A derme é uma camada mais espessa que a epiderme. Sua principal
constituição é uma matriz de tecido conectivo formado por proteínas (75% de
 6

colágeno, 4 % de elastina e 0,4 % de reticulina) envolvidas em mucopolissacarídeo.

Na derme são encontrados vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e os apêndices
cutâneos (glândulas sebáceas e sudoríparas, folículos pilosos e unhas).

3.1.2 Funções
A pele, como órgão, desempenha diversas funções, algumas gerais e outras
específicas (BARRY, 1983).

3.1.2.1 Funções gerais

As funções gerais são descritas a seguir.
a) Função barreira: proteger contra a entrada de microorganismos, substâncias
químicas, radiação, calor e choque mecânico.
b) Função de percepção: receber estímulos externos, como o tato, calor e dor.
c) Função termorreguladora.
d) Função de sintetizar e metabolizar substâncias.
e) Função secretora: suor, sebo, hormônios.
f) Função reguladora da pressão sanguínea.

No desenvolvimento de produtos dermatológicos, a função barreira é a que

mais merece atenção, porque várias substâncias medicamentosas são veiculadas
no local. A pele regula a entrada destas substâncias externas no organismo. A
entrada de fármacos pela pele pode ocorrer das três maneiras descritas a seguir
(BARRY, 1983).
■ Via transepidérmica intracelular.
■ Via transepidérmica intercelular.
■ Via apêndices: folículos pilosos, glândulas sebáceas e poros.

Para o fármaco penetrar na pele é necessário que ocorra primeiro a difusão e

liberação do veículo, bem como sua partição nas diversas camadas da pele. A
Figura 2 mostra, esquematicamente, as rotas de penetração de substâncias
utilizadas em dermatologia (BARRY, 1983; RIEGER, 2000).
 7

Figura 2: Representação esquemática da membrana do estrato córneo, ilustrando

as possíveis rotas de penetração de substâncias (RIEGER, 2000).

3.1.2.2 Funções específicas

As funções específicas da pele são, por sua vez, as seguintes.
a) Sudoral: produção do suor.
b) Sebácea: produção de sebo.
c) Queratogênica; produção de queratinócitos.
d) Melanogênica: produção de melanina.

Para compreender a ação de substâncias despigmentantes é necessário

conhecer, principalmente, a função melanogênica.

3.1.2.2.1 Função melanogênica

Ainda que a cor da pele dependa da hemoglobina dos vasos sanguíneos e
dos carotenóides amarelos da gordura hipodérmica, o principal determinante é a
melanina.

3.1.2.2.1.1 Melanina
A melanina é um termo genérico para descrever grupo de biopolímeros
heterogêneos, pigmentados, polifenólicos de alto peso molecular. As melaninas
possuem origem, composição química e propriedades físicas diversas, apesar de
possuírem precursores semelhantes (DAMONTE et al., 1995). São encontradas em
praticamente todos os tecidos vivos na forma insolúvel (PEREIRA, 1993).
Nos seres humanos a melanina é produzida por células dendríticas
especializadas, os melanócitos, e é responsável pela coloração da pele, cabelos e
olhos (PENTAFARMA, 1997a).
A melanina é capaz de absorver a luz visível e ultravioleta (UV), protegendo a
pele de danos provocados por elas (PAWELEK et al., 1992). As principais radiações
emitidas pelo sol na região do ultravioleta são: UVC (200 - 290 nm), UVB (290 -320
nm) e UVA (320 - 400 nm). As radiações UVA provocam um bronzeado efêmero,
pois penetram mais profundamente na derme, sendo responsáveis pela
pigmentação direta a partir de um precursor da melanina. As radiações UVB
apresentam menor penetração na pele do que as UVA, elas são denominadas
eritematosas e promovem a pigmentação indireta e um bronzeado duradouro
(ORTONE, 1990). A grande parte das radiações UVC são absorvidas pela camada
de ozônio.
Na atualidade sabe-se que as radiações ultravioletas podem acelerar o
processo de envelhecimento cutâneo e causar câncer de pele.

A melanina é classificada em eumelanina, feomelanina e citocromos.

EUMELANINA
A eumelanina é um biopolímero com estrutura indol, produzido pela co-
polimerização da dopa-oxidase e de seus produtos de ciclização, principalmente 5,6-
dihidroxiindol e 5,6-dihidroxiindol-2-ácido carboxílico (DHICA), ou seja, é uma
substância resultante da polimerização oxidativa de compostos indólicos derivados
da dihidroxifenilalanina (DOPA) (DAMONTE, 1995; VIGLIOGLIA, 1989). É um
pigmento insolúvel, de coloração variando de marrom a preto, contendo pequena
quantidade de enxofre.

FEOMELANINA
É um pigmento heterogêneo sintetizado a partir de tirosina e císteína,
resultante da polimerização da cistenildopa e produtos de ciclização, particularmente
 9

1,4-benzotiazina (DAMONTE, 1995; VIGLIOGLIA, 1989). Apresenta coloração

variável de amarelo a marrom avermelhado e é facilmente degradada pela radiação
UV, sendo menos fotoestável do que a eumelanina (NORDLUND et al., 1989).

CITOCROMOS
Os citocromos são constituídos por unidades de benzotiazinas, pertencentes
ao grupo das feomelaninas e são encontrados nos cabelos ruivos (VIGLIOGLIA,
1989).
A diferente tonalidade de cores que ocorrem na natureza é explicada pelo fato
que raramente a eumelanina e a feomelanina são encontradas na forma isolada.
Durante a melanogênese formam-se ambas as melaninas em diferentes proporções
(HUNTet al., 1995; OZEKI, ITO, WAKAMATSU, 1996).
Além destes tipos de melaninas, CHEDEKEL e ZEISE (1996) citam outros
como as alomelaninas, presentes em fungos, bactérias e plantas; e a neuromelanina
presente em neurônios de núcleos cerebrais como, por exemplo, a substância nigra.

3.1.2.2.1.2 Funções da melanina

A principal função da melanina é a proteção solar do genoma celular contra
os efeitos nocivos da radiação UV. Também é responsável pela neutralização de
radicais livres e superóxidos (DAMONTE, 1995; ITO, CRIPPA, 1985; PEREIRA,
1997; SEARLY et al., 1980), termorregulação em alguns animais, proteção contra
afecções actínicas, prevenção do câncer de pele, minimização do impacto de
radiações solares e regulação da síntese de vitamina D (CHARLET, 1996).
A maior incidência de câncer em pessoas de pele clara pode ser explicado
por estes indivíduos possuírem baixo conteúdo melânico na superfície cutânea, ou
seja, pouca melanina atuando como filtro solar (STEINER, 1996).

3.1.2.2.1.3 Origem embriológica da melanina

A melanina é produzida em células especializadas chamadas de
melanócitos.
Os melanócitos são células dendríticas (STEINER, 1996), encontradas em
todos os mamíferos (PENTAFARMA, 1997b). Originam-se da crista neural como
precursores não diferenciados, melanoblastos, de onde migram no 21°. dia da
 10

embriogênese para diferentes partes do organismo (ERICKSON, 1993; PROTA,

1996). São observados na pele, bulbo capilar, sistema nervoso central, globo ocular
(trato uveral e retina), na cóclea e sistema vestibular do ouvido interno, sendo que
estas últimas três retêm a melanina por toda a vida (NORDLUND et al., 1989;
PEREIRA, 1997; PROTA, 1996).
Os melanócitos localizados na camada basal da epiderme e folículo pilo-
sebáceo produzem e secretam, continuamente, a melanina para os queratinócitos
(STEINER, 1996b). Esta atividade é diminuída com o envelhecimento do indivíduo
(VIGLiOGLIA, 1989).
Na camada basal da epiderme, o número de melanócitos varia de 2000 a
2500 por mm2 nas regiões expostas à luz e genitais e no resto do corpo de 1000 a
1500 por mm2 (QUIROGA, GUILLOT, 1986).
Os melanócitos constituem 5 a 10% do total da população celular da
epiderme (STEINER, 1996b). Junto com os queratinócitos e células de Langerhans
formam a unidade melanocitária (PAWELEK et al., 1992); geralmente a unidade
epidérmica da melanina é constituída por trinta e seis queratinócitos para um
melanócito (ELLIS, TAN, ELLIS, 1995; STEINER, 1996b).

3.1.2.2.1.4 Síntese da melanina

A síntese da melanina nos melanócitos é realizada em organelas
denominadas melanossomos a partir de um precursor comum, a tirosina (MASUDA,
SUZUKI, 1996; PEREIRA, 1997). A síntese melânica é estimulada principalmente
pela radiação UV.
A melanogênese envolve diversos passos, sendo regulada pela enzima
tirosinase e por uma família de enzimas relacionadas a tirosinase como a TRP-1
(“tyrosine-related-protein-1”) ou DHICA oxidase (5,6-dihidroxiindol-2-ácido
carboxílico oxidase) e a TRP-2 (“tyrosine-related-protein-2”) ou dopacromo
tautomerase (BERND et al., 1994). Além destas enzimas, fatores não enzimáticos
interferem na síntese do pigmento, tais como pH, concentrações de tióis e íons
metálicos (PEREIRA, 1997) ou oligoelementos como, por exemplo, o cálcio
(NORDLUND et al., 1996).
A síntese da melanina é uma reação enzimática oxidativa que ocorre em
aerobiose (QUIROGA, 1986).
 11

O início da síntese ocorre com a hidroxilação da tirosina a DOPA (3,4 -

dihidroxifenilalanina), etapa lenta em pH igual ou superior a 6,8. Há evidências de
que em pH abaixo deste valor a reação é muito mais rápida (NORDLUND et al.,
1996). Em seguida a DOPA é oxidada a dopaquinona. A tirosinase participa de
ambas reações. Após estas etapas a via pode seguir dois caminhos distintos em
função do tipo de melanina a ser formada.
Na síntese da eumelanina, a dopaquinona sofre uma rápida ciclização a
leucoDOPAcromo (PROTA, 1996) e oxidação espontânea a dopacromo que pode
sofrer descarboxilação espontânea ou ser rearranjado pela dopacromo tautomerase
(TRP-2) (BERND et al., 1994) gerando dois monômeros altamente reativos, o DHl
(5,6-dihidroxiindol) e o DHICA (5,6-dihidroxiindol-2-ácido carboxílico). O primeiro se
polimeriza com auxílio da tirosinase e o segundo da DHICA oxidase (TRP-1),
levando ambas reações à formação da eumelanina. Uma maior proporção de DHICA
produz uma eumelanina marrom clara solúvel, ao invés da marrom escura insolúvel
(PEREIRA, 1997) (Figura 3).
A produção da feomelanina ocorre, não enzimaticamente, devido à
combinação da dopaquinona com compostos sulfídricos, cisteína e glutationa,
levando á formação de cistenildopa. Esta, por oxidação espontânea, dá origem a
derivados da benzotiazina que se polimerizam formando o pigmento (PEREIRA,
1997; VIGLIOGLIA, 1989) (Figura 3).
 12

[O]
Feom elanina

D erivados de
benzotiazína

C isteinildopa

A
- Cisteína

CO O H COOH
02
NH2
NH2
Dopa Dopaquinona

Cisteína

Tirosinase
C OOH

Leucodopacromo

5,6-Dihidroxiindol-
2-áddo carboxílico
(DHICA)

Figura 3: Etapas químicas e respectivos reguladores envolvidos na via

melanogênica (OZEKI, ITO, WAKAMATSU, 1996).
 13

A tirosinase é uma cuproproteína que contém uma fração glicídica (ácido

neurâmico e galactose) que controla o processo melanogênico (VIGLIOGLIA, 1989).
É sintetizada na superfície do retículo endoplasmático rugoso e depois transferida
para o complexo de Golgi associada com o lisossomo, onde é ativada pela adição
de uma cadeia de açúcar, antes de ser secretada em vesículas. Um pré-
melanossomo liberado do complexo de Golgi funde-se com a vesícula para formar o
melanossomo (NORDLUND et al., 1996).
Os melanócitos geralmente transferem os melanossomos para os
queratinócitos que recebem estas organelas de forma ativa (STEINER, 1996), onde
serão metabolizadas durante o processo de queratinização (MASUDA, SUZUKI,
1996), desaparecendo com a escamação da pele (PROTA, 1996). É provável que as
citocinas estejam envolvidas na comunicação entre estas células (PAWELEK et al.,
1992).
Os melanossomos passam por quatro estágios. No primeiro são esféricos,
contendo tirosina em grande quantidade. No segundo são ovais, sem melanina. No
terceiro apresentam intensa atividade enzimática e início da produção de melanina e
no quarto apresentam forma oval, atividade enzimática baixa e grande quantidade
de melanina (STEINER, 1996b).
A transferência dos melanossomos para os queratinócitos é explicada pelos
seguintes mecanismos: por um processo de citofagocitose, injeção direta de
melanossomos no citoplasma dos queratinócitos ou liberação dos melanossomos no
espaço extracelular seguido de sua incorporação aos queratinócitos. A degradação
dos melanossomos ocorre no interior do fagolisossomo através dos
intraqueratinocitários por ação das enzimas lisossomais, em particular as
fosfolipases ácidas. A eliminação da melanina ocorre pelo processo natural de
escamação e outra parte, via linfática, através da derme (VIGLIOGLIA, 1989).
Além do estímulo das radiações UV que leva a um aumento de tamanho dos
melanócitos e da atividade da tirosinase (STEINER, 1996b), foi evidenciada a
participação do hormônio melanócito estimulante (MSH) na síntese da melanina. O
MSH é classificado em alfa, beta e gama (STEINER, 1996b), e é constituído por uma
estrutura peptídica contendo 12 a 18 aminoácidos. A produção deste hormônio
ocorre na glândula pituitária, mas existem fortes evidências de sua produção na pele
e outros tecidos (PAWELEK et al., 1992). Além do melanócito, foi também verificada
 14

a presença de receptores do MSH nos queratinócitos, mas o seu mecanismo de

ação nestas últimas células ainda não está muito bem esclarecido. A injeção de
MSH em cobaias estimulou a síntese de melanina de maneira similar à exposição à
radiação UV. Verificou-se, além disso, que a exposição a estas radiações aumentou
o nível de circulação de MSH em humanos e cobaias (PAWELEK et al., 1992).
STEINER (1996b) cita outros hormônios que interferem na pigmentação da
pele como hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), estrógeno e progesterona.
A cor da pele está relacionada a influências genético-raciais. Na pele negra,
os melanossomos são maiores, mais numerosos, não se agrupam, possuem alta
concentração de melanina e sofrem degradação mais lenta, chegando quase intacto
nas camadas mais externas da epiderme principalmente na camada córnea,
diferentemente de peles mais claras onde esta degradação é maior nestas camadas,
ficando a melanina restrita a camadas mais internas da epiderme. Os albinos
possuem melanócitos, mas não produzem melanina devido à ausência da tirosinase
(PENTAFARMA, 1997b; STEINER, 1996b).
Complementando os tópicos apresentados, NORDLUND e colaboradores
(1989) revisaram a história da biologia da célula pigmentar. Inicialmente eles
relataram a presença das cores na natureza, nas manifestações artísticas e nos
diferentes grupos étnicos. Analisaram as descobertas e estudos feitos nos períodos
de 1900 a 1950, de 1950 a 1975, de 1975 a 1987, abordando sempre questões
como: nome da célula pigmentar, origem embriológica, produção de melanina, via
metabólica, estrutura, transferência, degradação, excreção, regulação da função
melanocitária, proliferação, doenças, função do melanócito e interação celular.

3.2 HIPERPIGMENTAÇÃO
Discromias são modificações na coloração normal da pele por diferenças
quantitativas de pigmentos (FONSECA, SOUZA, 1986).
Hipercromias são distúrbios caracterizados pelo aumento da concentração de
melanina, acumulação de hemossiderina ou hipercarotenia na pele. As manchas
melânicas ocorrem, em geral, devido a um aumento de pigmentação local, em certos
casos devido a um aumento do número de melanócitos como nas lentigens
(CHARLET, 1996).
 15

Segundo CASTRO e colaboradores (1997), vários fatores induzem a

hiperpigmentação: envelhecimento, gravidez, distúrbios endócrinos, tratamentos
com hormônios sexuais e queimaduras de sol, sendo que as radiações solares,
seguidas pelos hormônios e/ou agentes externos como os radicais livres são
considerados os principais fatores.

3.2.1 Classificação das Hipercromias

AMINI e HERNÁNDEZ (1995) dividem as hiperpigmentações em primárias e
secundárias. No primeiro caso mencionam: lesões névicas, lentigens, efélides,
melasma (cloasma gravídico), manchas café com leite, melanose periorbitária
hereditária, melanose dérmica (mancha mongólica, nevo de oito, nevo de toa e nevo
azul), nevo de Becker e melanoma.
Como secundárias, citam: hiperpigmentações residuais pós-inflamatórias
devido a enfermidades do tipo eczematosas, bolhosas, autoimune, infecciosa,
papulo-escamosa: associadas aos fatores endócrinos, transtornos metabólicos,
carências nutricionais, agentes químicos e farmacológicos, fotodermatites, doenças
neoplásicas, tatuagens e às enfermidades congênitas.

3.2.1.1 Melasma ou cloasma

Pigmentação caracterizada por manchas em tom castanho na face, quase
sempre simétrica que ocorre na testa e maçãs do rosto, aparecendo com freqüência
em mulheres morenas (TUROVELZKY, 1992). Histologicamente demonstra aumento
da concentração da melanina na camada basal e suprabasal e às vezes,
macrófagos repletos de melanina na derme (DUGGAN, 1989).
O melasma é estimulado pela exposição solar e, particularmente quando
ocorre em mulheres grávidas, é chamado cloasma (TUROVELZKY, 1992). Aparece
no primeiro mês de gravidez acentuando-se progressivamente devido ao enorme
aumento de estrógeno e hormônios melanoestimulantes (MSH e ACTH). Pode
também ocorrer em mulheres que fazem uso de anovulatórios, apresentando
mecanismo semelhante. A ocorrência em mulheres jovens e homens não é muito
freqüente, mas pode ocorrer no último caso principalmente naqueles que fazem
tratamento de câncer de próstata a base de estrógeno (BEZERRA, REBELLO, 1996;
BOYLE, KENNEDY, 1986).
 16

A ocorrência desta hiperpigmentação pode ser classificada como dérmica,

epidérmica ou mista (CHARLET, 1996).
Outros fatores que influenciam a formação do melasma: transtornos
ginecológicos, tireoideanos ou da suprarenais, menopausa, carência vitamínica,
cirrose hepática e radiação (VIGUOGLIA, 1989).

3.2.1.2 Sardas ou efélides

Manchas castanhas claras de 1 - 2 mm de diâmetro, que aparecem na
infância após exposição solar. Possuem caráter hereditário autossômico dominante,
característico de pessoas ruivas ou de olhos azuis, onde ocorre um aumento de
melanina na epiderme e não do número de melanócitos (BEZERRA, REBELLO,
1996; CHARLET, 1996; STEINER, 1996a).

3.2.1.3 Lentigens
Manchas escuras de coloração uniforme, isoladas ou agrupadas, encontradas
em qualquer parte do corpo e que ocorrem devido ao aumento do número de
melanócitos da camada basal (CHARLET, 1996).

3.2.1.4 Lentigens actínicas (melanoses actínicas)

Manchas de 0,5 a 2 cm que ocorrem nas mãos, rosto e colo após os 40 anos,
principalmente em peles muito claras, devido a uma hiperpigmentação dos
queratinócitos basais e aumento do número de melanócitos (STEINER, 1996a).

3.2.1.5 Lentigens senis ou de luz solar

Hiperpigmentações melânicas, marrons em várias tonalidades, que ocorrem
em regiões da camada basal da epiderme. Aparecem em indivíduos com mais de 50
anos, no rosto, parte externa do braço e antebraço, com histórico de exposição
solar. Algumas manchas são chamadas queratoses, diferenciando-se das solares
com relação ao toque (BEZERRA, REBELLO, 1996, CHARLET, 1996).
 17

3.2.1.6 Melanoses por fotossensibilizantes

- Melanose de Riehl
Descrita em 1917 por Riehl. Conhecida também como eritrose atrofiante da
face de Pautrier. Surge, muitas vezes, após a exposição ao sol, aparecendo
primeiramente eritema com prurido, a que segue a pigmentação. Toda pele da face
pode ser atingida, bem como o pescoço (FONSECA, SOUZA, 1986; VIGLIOGLIA,
1989).
Uma característica freqüentemente observada é o aspecto reticulado da
pigmentação principalmente nas áreas temporais e no pescoço, onde a pele pode
tornar-se atrófica. A histopatologia caracteriza acúmulo de melanina na derme,
sobrecarga melânica, acompanhada de reação inflamatória (FONSECA, SOUZA,
1986).

- Melanodermite de Hoffmann - Habermann

Descrita em 1918 por Hoffmann e Habermann sob o nome de melanodermite
linquenóide e bolhosa. É uma pigmentação que atinge, sobretudo as mãos e
antebraços. Ocorre ceratose folicular, bem como pápulas linquenóides, pequenas
bolhas e discreta atrofia. Surgem devido ao manejamento por longos períodos de
óleos minerais, alcatrões, petróleos e outros hidrocarbonetos (FONSECA, SOUZA,
1986; VIGLIOGLIA, 1989).

- Poliquilodermia de Civette
Verifica-se principalmente em mulheres de peles claras, de meia idade, pré ou
pós-menopausa, com ocorrência nos dois lados e no vão do pescoço, pigmentação
tênue, reticulada, com telangiectasia e atrofia de grau variado, vinculado a
fotossensibilização por cosméticos (VIGLIOGLIA, 1989).

- Fitodermatoses
Sensibilização por psoralenos que são encontrados em frutas cítricas e
algumas plantas. Produz-se uma pigmentação na zona de contato, pode ser
provocada, também, por perfumes que apresentam essência de bergamota
(VIGLIOGLIA, 1989).
 18

3.2.1.7 Melanoses tóxico-medicamentosas

Provocadas pela ingestão de alguns medicamentos como: pirazolonas,
fenolftaleína, anfetaminas, anti-histamínicos, barbitúricos, cloroquina, codeína,
dietilbestrol, ergotamina, fenotiazina, hidantoína, hidrazina, meprobamato, reserpina,
sulfonamidas e quase todos os antibióticos.
Caracterizam-se por manchas arredondadas, bem delimitadas, únicas ou
múltiplas, ocorrem preferencialmente em regiões genitais podendo ocorrer também
em qualquer parte do corpo, normalmente acompanhadas de pruridos e em algumas
ocasiões com bolhas (FONSECA, SOUZA, 1986; VIGLIOGLIA, 1989).

3.2.1.8 Melanose pós-inflamatória ou melanodermias residuais

Ocasionadas por traumatismos cronicamente repetidos, queimaduras,
infecções cutâneas, eczemas, dermatite de contato não fotoalergênica, dentre
outros. Ocorrem principalmente em pessoas de pele mais escura com conseqüente
hiperpigmentação da epiderme e derme (FONSECA, SOUZA, 1986; VIGLIOGLIA,
1989).

3.2.1.9 Nevus (pigmentações lunares)

Manchas escuras, circunscritas, pequenas, congênitas, ou adquiridas
tardiamente, ocorrendo em quase todas as pessoas (CHEDEKEL, ZEISE, 1996).

3.3 DESPIGMENTANTES
3.3.1 Conceito
São produtos destinados a clarear certos pontos ou regiões da pele com
finalidade estética, sendo normalmente indicados para prevenção ou tratamento de
hipercromias (PENTAFARMA, 1997a).

3.3.2 Classificação
De acordo com seu mecanismo de ação (LEE, KIM, 1995; MASUDA, TEJIMA,
SUZUKI, 1996; PROTA, 1996), os clareadores são agrupados em dez categorias:
1- Inibição direta da atividade da tirosinase.
2- Inibição competitiva e não competitiva da tirosinase.
3- Supressão da síntese ou maturação da tirosina.
 19

4- Toxicidade melanocitária seletiva.

5- Esfoliante.
6- Adsorção de melanina pré-formada.
7- Inibição indireta da tirosinase via quelação de oligoelementos.
8- Agentes redutores.
9- Estimulação da eliminação da melanina dos queratinócitos.
10- Inibição da síntese da tirosinase.

3.3.3 Agentes clareadores

3.3.3.1 Ácido kójico
O ácido kójico, comumente chamado de 5-hidroxi-2-(hidroximetil)-4-pirona
apresenta fórmula molecular C6H60 4 e peso molecular 142.11 (THE MERK INDEX,
1983). A estrutura do ácido kójico está demonstrada na Figura 4.

Acido Kójico

Figura 4: Estrutura do ácido kójico (THE MERCK INDEX, 1983).

Apresenta-se como um pó cristalino branco amarelado. O seu pKa é de 7,9 a

8,03. Miscível em água, etanol 95°GL e acetona, muito pouco solúvel em éter,
acetato de etila e clorofórmio (THE MERCK INDEX, 1983).
O ácido kójico é um antibiótico produzido por muitas espécies de Aspergillus e
Penicillium, em aerobiose, em meio contendo alto teor de fonte de carbono, a partir
da fermentação do arroz (CASTRO, PIMENTA, DORANE, 1997; LEONARDI, MAIA
CAMPOS, 1997; PEREIRA, 1993). MAEDA e FUKKA (1996) citam o ácido kójico
como obtido a partir da fermentação do fungo Koji mold. O ácido kójico quela o íon
cobre e suprime a tautomerização do dopacromo a 5,6-dihidroxiindol-2-ácido-
carboxílico, inibindo a ação da tirosinase (CABANES et al., 1994).
 20

ELLIS, TAN e ELLIS (1995) sugeriram a aplicação do ácido kójico a 2 %, em

formulações, juntamente com os ácidos salicílico, cítrico e lático no tratamento de
hiperpigmentações.
O ácido kójico induz a redução da eumelanina e de seu monômero precursor
chave; possui ação antiirritante, é hidrossolúvel, estável no intervalo de pH 3,0 - 5,0
e compatível com bases não iônicas, podendo ser associado ao ácido glicólico
(MAIA CAMPOS, 1995).
GARCIA e FULTON (1996) associaram ácido glicólico com hidroquinona e
ácido kójico para o tratamento clínico de melasma e testaram em 39 pacientes. Os
resultados obtidos não foram estatisticamente diferentes. A formulação com ácido
kójico foi mais irritante, mas ambas foram eficientes.
Recomenda-se usar quelantes, evitar ésteres e adicionar tampões com ácido
cítrico nas formulações (CHARLET, 1996; LEONARDI, MAIA CAMPOS, 1995). A
concentração usual é de 1 a 3 %.
O ácido kójico não apresenta efeitos colaterais podendo ser usado durante o
dia e não é citotóxico (BEZERRA, REBELLO, 1996; PEREIRA, 1993). Há evidências
de boa tolerância a longo prazo (CASTRO, PIMENTA, DORANE, 1997).

3.3. 3. 2 Ácido glicólico

Esfoiiante (BOYLE, KENNEDY, 1986), melhora os transtornos da
pigmentação, como manchas actínicas e melasmas. É empregado diariamente na
concentração de 8 a 12 % ou 5 a 10 %, agindo sinergicamente com outros
despigmentantes como hidroquinona e ácido kójico (ARCHIPRE, 1996; BOYLE,
KENNEDY, 1986).

3.3.3.3 Ácido retinóico

Esfoiiante (BOYLE, KENNEDY, 1986; PEREIRA, 1993), dispersa os grânulos
de melanina nos queratinócitos, aumenta a renovação celular e diminui a ação da
colagenase. Atua em melasma e em hiperpigmentações pós-inflamatórias. Estudos
com a tretinoína a 0,1 % demonstraram a redução de manchas pigmentares
fotoinduzidas. Quando utilizada na dose de 0,01 a 0,1 %, deve-se empregar filtro
solar após sua aplicação (PEREIRA, 1993). Durante a sua utilização e dependendo
da concentração podem ocorrer reações, como eritema, prurido, descamação e
 21

sensação picante (CHARLET, 1996). A tretinoína pode ser associada a substâncias

ativas despigmentantes com a finalidade de promover a esfoliação e facilitar a
penetração das substâncias associadas (MAIA CAMPOS, 1995) ocasionando leve
clareamento da pele.
FOX (1995; 1996) revelou novos usos para o ácido retinóico no tratamento da
hiperpigmentação em peles escuras e abordou aspectos sobre a segurança do uso
da hidroquinona. Segundo o autor, a concentração máxima da substância ativa não
deverá exceder 1 % em fomulações aquosas de uso breve, descontínuo, seguido de
enxágüe da região.
BULENGO-RANSBY e colaboradores (1993) utilizaram tretinoína tópica 0,1 %
no tratamento de hiperpigmentações pós-inflamatórias em pacientes negros. Os
resultados obtidos foram bastante significativos.

3.3.3.4 Hidroquinona
A hidroquinona é um composto dihidroxifenólico que inibe a atividade da
tirosinase, evitando a sua oxidação a DOPA; além disso, diminui a melanina cutânea
através da sua toxicidade melanocitária (CHARLET, 1996; MENTER et al., 1993;
PEREIRA, 1993), o que acelera a degradação dos melanossomos.
Pelo fato de ser irritante, deve-se evitar a utilização próxima à área dos olhos,
em regiões com lesões cutâneas ou com queimaduras solares, em crianças
menores de 12 anos e ainda, durante o dia (LEONARDI, MAIA CAMPOS, 1997;
PEREIRA, 1993).
CASTRO e colaboradores (1997) sugerem uso de filtro solares concomitante
ao tratamento.
As concentrações usuais da hidroquinona empregadas nas formulações são
de 2 a 5 %, apresentando eficácia na melanose solar, efélides e melasma
(PEREIRA, 1993). Não é eficaz nas hipermelanoses dérmicas a não ser quando
associadas a um componente epidérmico. Em produtos cosméticos pode ser usado
em uma concentração máxima de 2 % (BEZERRA, REBELLO, 1996). A ação da
hidroquinona é aumentada pela associação com ácido lático e retinóico (CHARLET,
1996).
LOWER (1995) sugeriu o uso de hidroquinona 2 % com 8% de ácido glicólico
para cosméticos étnicos.
 22

FONSECA e PRISTA (1984) sugeriram o uso de hidroquinona em solução

alcoólica a 5 %, em pomada ou creme na concentração de 2 a 10% na presença de
antioxidantes, aplicada três vezes ao dia, durante quatro a seis meses. Os autores
advertem, no entanto, que há possibilidade do aparecimento de dermatite de contato
ou sensibilização.
Vários efeitos colaterais já foram observados na utilização da hidroquinona,
como por exemplo, a irritação dérmica, principalmente nas concentrações de 5 a
10 %. Entretanto neste intervalo foram obtidos os melhores resultados
despigmentantes. Efeitos colaterais como dermatite de contato, fotossensibilização,
ocronoses, pseudo milium colóide, hiperpigmentações transitórias no início do
tratamento, despigmentação em confete nas regiões anteriormente tratadas, eritema
e despigmentação irreversível, também foram verificados (BEZERRA, REBELLO,
1996).
A hidroquinona se oxida com facilidade alterando a cor de marrom claro para
marrom escuro (PEREIRA, 1993). Sistemas antioxidantes eficazes devem ser
utilizados nas formulações (BEZERRA, REBELLO, 1996).

3.3.3.5 Ácido L - Ascórbico

O ácido L - ascórbico reduz o intermediário necessário para a síntese da
melanina (MASUDA, TEJIMA, SUZUKI, 1996), mantendo-o na forma reduzida e
incolor. A inativação da tirosinase é interrompida até a transformação oxidativa da
tirosina em DOPA. Possui ação anti-radicais livres, oxida-se facilmente,
apresentando baixa penetração em veículos aquosos.

3.3.3.6 Arbutina
A arbutina é um heterosídeo da hidroquinona, presente em várias plantas da
família das Ericáceas (PEREIRA, 1993; ROUGIER et al., 1983); obtida a partir do
extrato de Uva-ursi (MASUDA, TEJIMA, SUZUKI, 1996). Apresenta citotoxicidade
100 vezes menor do que a hidroquinona e reduzida irritabilidade com pequena
possibilidade de hipopigmentação irreversível (CHARLET, 1996; MAEDA, FUKURA,
1996; PEREIRA, 1993).
A arbutina inibe a atividade da tirosinase (MASUDA, TEJIMA, SUZUKI, 1996),
competindo com a DOPA em seu sítio receptor, inibindo sua ação (PEREIRA, 1993).
 23

Apresentou resultados satisfatórios em efélides, melanoses solares e melasma

(PEREIRA, 1993).
As concentrações empregadas freqüentemente são de 0,5 a 3,0 %
(BEZERRA, REBELLO, 1996) e é aconselhável empregar quelantes nas
formulações (LEONARDI, MAIA CAMPOS, 1997).

3.3.3.7 Peptideos selecionados e fracionados (Melawhite®)

É uma solução clara, amarelada, contendo peptideos seletivamente
fracionados. O Melawhite® é considerado inibidor específico e competitivo da
tirosinase (PENTAFARMA, 1997b). Minimiza a formação de manchas na pele devido
a sua ação no estágio inicial de melanogênese. A concentração usual é de 2 a 5 %
(BOYLE, KENNEDY, 1986).

3.3.3.8 Fosfato de ascorbil magnésio (VC-PMG®)

Penetra na pele liberando ácido ascórbico que inibe a ação da tirosinase,
sendo estável em soluções aquosas e valores de pH acima de 7,0 (LEONARDI,
MAIA, 1997). Tem melhor penetração do que o ácido ascórbico livre, apresentando
melhores resultados em melasmas, melanose solar, efélides e lentigo senil
(PEREIRA, 1993). A concentração empregada usualmente nas formulações
contendo VC-PMG® é de 1 a 3 % podendo chegar a 15 %. Além dos efeitos citados,
estimula a síntese de colágeno e fibroblastos e inibe a ação dos radicais livres
(PEREIRA, 1993). O ácido ascórbico age como potente redutor estimulando a
redução da velocidade das reações, principalmente na primeira etapa de oxidação
DOPA a DOPAquinona (TAKENOUCH et al., 1994).
O VC-PMG® possui também ação anti-radicais livres (BOYLE, KENNEDY,
1986). KAMEYAMA e colaboradores (1996) avaliaram o efeito inibidor, in vitro e in
vivo, do VC-PMG® na melanogênese e concluíram que o ingrediente ativo
apresentou-se como efetivo despigmentante em alguns pacientes.

3.3.3.9 Silicato de alumínio sintético (Antipollon HT®)

Este composto apresenta atividade despigmentante gradual, e é indicado no
tratamento de cloasma (CHARLET, 1996). Seu efeito clareador é devido à adsorção
 24

da melanina pré-formada. Não é irritante, nem sensibilizante, podendo ser usado

durante o dia (LEONARDI, MAIA, 1997; PEREIRA, 1993). Estável em valores de pH
de 4,0 a 10,0. Sua associação a ácidos graxos não é recomendada (LEONARDI,
MAIA, 1997). A concentração usualmente empregada nas formulações é de 1 a 4 %
(BEZERRA, REBELLO, 1996).

3.3.3.10 Ácido azeláico (ácido 1,7 - dicarboxílico nítrico nonadióico)

Obtido pela oxidação do ácido oléico pelo ácido nítrico, possui atividade anti-
tirosinase, inibidor das enzimas de óxido redução e ação antioxidante. Usado no
tratamento de despigmentações pós-inflamatórias e melasma em concentrações de
2 a 9 %. Não apresenta toxicidade, teratogenicidade e mutagenicidade (CHARLET,
1996; DUGGAN, 1989; PATHAK et al., 1985).
PATHAK e colaboradores (1985) avaliaram a efetividade do ácido azeláico
como despigmentante e quimioterápico e concluíram que este composto não é
seletivamente citotóxico para melanócitos normais e proliferativos e também não
apresenta aparente efeito inibidor do processo de formação da melanina.

3.3.3.11 Extratos vegetais

Os compostos extraídos da Rheum officinale (ruibarbo) mostraram inibição
competitiva da tirosinase e inibição da biossíntese da melanina (LIDA et al., 1995).
Da Achillea millefolium (achillea mil folhas) e da Cynara scolymus (alcachofra)
é extraida a melanolisina, constituída pela luteolina e seus heterosídeos. Esta
substância produz perda da relação espacial entre melanócitos e queratinócitos,
sendo indicada nos tratamentos de melasma, efélides, melanose solar e certas
melanodermías pós-inflamatórias. Recomenda-se tratamento de manutenção
(PEREIRA, 1993).
Outro extrato vegetal com propriedades despigmentantes, que provém da
casca da raiz de Paper mulberry (amora) além de inibir a melanogênese apresentou
ação anti-radicais livres (LAWRENCE, COX, BROADY, 1997).
MATSUDA, NAKAMURA e KUBO (1994) verificaram o efeito inibidor de
melanina de várias plantas do gênero Prunus e sugeriu a Prunus zippeliana (ameixa)
como importante agente clareador da pele em hiperpigmentação.
 25

3.3.3.12 Extrato aquoso de Uva-ursi (MELFADE®)

Nome comercial do extrato aquoso de Uva-ursi (Arctosphylos uva-ursi L.
Spreng). Este produto possui várias propriedades como a de inibir o escurecimento
da pele, de diminuir a pigmentação existente, de interferir nas etapas enzimáticas de
síntese da melanina, de degradar a melanina existente, alterar a membrana das
organelas dos melanócitos e de acelerar a degradação dos melanossomos
(CHARLET, 1996).

3.3.3.13 Ácido fítico (hexafosfato de inositol)

Obtido a partir das sementes de cereais como aveia, arroz, gérmen de trigo,
etc. Antioxidante, quelante potente de metais como ferro e cobre, inibidor da
tirosinase. Ideal para hiperpigmentações de diversas etiologias e para as peles
sensíveis (MENE et ai., 1996; TELLES, 1997). Nas formulações pode ser
empregado a 0,5 % associado ao ácido glicólico a 8 % (MENE et al., 1996).
Além destes despigmentantes, outros são citados na literatura como: água
oxigenada a 20 volumes, monometil éter de hidroquinona, 4-isopropil catecol e p-
caroteno (PEREIRA, 1993), 2-aril-1,3-tiazolinas (NAPOLITANO et al., 1991),
mercaptominas, tais como cloreto de n-dimetil-amina (2-mercaptoetila) e cloreto de
P-caroteno-etilamina. Estes compostos, no entanto, podem apresentar efeitos
colaterais irritantes e citotóxicos. CASTRO e colaboradores (1997) citaram também
as nanotalasferas de p-caroteno e os flavonóides da classe citrus, que apresentaram
atividade inibidora da tirosinase devido a sua estrutura fenólica e antioxidante
(CHARLET, 1996).

3.4 FORMAS FARMACÊUTICAS SEMI-SÓLIDAS

As formas farmacêuticas semi-sólidas são preparações designadas para
exercerem atividade local quando aplicados sobre a pele e mucosas acessíveis ao
meio externo. São também denominadas de medicamentos tópicos e apresentam-se
basicamente nas formas de pomadas, pastas, cremes e géis. Para que haja o efeito
terapêutico é necessário, inicialmente, que ocorra a aderência do medicamento no
local de ação, formando um filme para que, posteriormente, por uma força externa
possa deformar-se e fluir. Devem ser aplicados em quantidades tal que, mantenham
 26

uma concentração efetiva no sitio de ação. O tratamento local é orientado por vários
fatores como: pela causa, composição sintomática (tipo de sintomas subjetivos),
complicações e extensão da afecção cutânea. Este conjunto de fatores apresenta
variações próprias a cada afecção, portanto, deve-se evitar o uso irracional de
fórmulas pré-estabelecidas. Não há esquema terapêutico que possa ser indicado,
sistemática e indiscriminadamente, a todos os casos do mesmo problema. Os
medicamentos devem ser escolhidos de acordo com o efeito que se deseja, com
veículos ou bases adequadas, compondo a fórmula, respeitando o limite de
lesividade dos agentes (BECHELLI, CURBAN, 1988).

3.4.1 Emulsões

Emulsões são preparações farmacêuticas obtidas pela dispersão de duas

fases líquidas imiscíveis ou praticamente imiscíveis. De acordo com a hidrofobia ou
lipofilia da fase dispersante classificam-se os sistemas em óleo em água (O/A) ou
água em óleo (A/O) (FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV, 1988).
Na fase aquosa são dissolvidos componentes hidrossolúveis como
umectantes, princípios ativos, conservantes, corantes, espessantes, etc. Assim, a
água é um veículo importante na fabricação e aplicação das emulsões. Tem ainda a
função de manter a elasticidade e juventude da epiderme, com o auxílio dos
emolientes, umectantes e emulsionantes adequados, mantendo a pele hidratada.
Exerce também funções indispensáveis ao equilíbrio físico-químico da emulsão e do
agente umectante. Preferencialmente deve ser usada água destilada ou deionizada,
isenta de sais minerais e produtos orgânicos e microbiologicamente pura. A
presença de íons e sais de cálcio constitui um elemento perturbador da estabilidade
das emulsões (SANCTIS, 1999).
A fase oleosa constitui-se de componentes oleosos ou emolientes,
responsáveis por características importantes como espalhamento, absorção,
viscosidade, controle de umidade, sensação lubrificante e toque na pele. São
também veículos para a incorporação de antioxidantes, vitaminas e ativos
lipossolúveis, conservantes, agentes de consistência, etc. Os critérios para a
classificação e seleção dos emolientes podem ser definidos de acordo com a sua
composição química (hidrocarbonetos petroquímicos, triglicerídeos animais e
 27

vegetais, ésteres de ácidos e álcoois graxos), propriedades físico-químicas (ponto de

fusão, turvação, polaridade, estabilidade á hidrólise ácida ou alcalina) e quanto à
aplicação na pele (espalhamento, toque oleoso ou seco, grau de absorção,
comedogenicidade e toxicidade). Grande parte destas propriedades são atribuídas a
estrutura química dos emolientes (SANCTIS, 1999). Além disso, o tipo de função
química permite estabelecer previsões sobre a estabilidade à hidrólise química, tanto
em meio ácido como em meio alcalino. Deve-se analisar ainda em nível de estrutura,
o comportamento do produto quanto a ponto de turbidez e solidificação. Através
deste estudo preliminar pode-se selecionar emolientes que influenciam a emulsão de
maneira totalmente dirigida e controlada em todos os princípios técnicos, sensoriais
ou mercadológicos (SAMPAIO, 1997).
Dependendo dos componentes, a viscosidade das emulsões pode variar
muito, tornando-as líquidas ou semi-sólidas. As emulsões de uso externo aplicáveis
sobre a pele, podem ser preparadas na forma A/O ou O/A, dependendo da natureza
dos agentes terapêuticos incorporados, necessidade de um emoliente na fórmula e
situação da superfície cutânea. A irritação causada por certos fármacos sobre a pele
tem o efeito minimizado quando esses estão presentes na fase interna de uma forma
emulsionada e não na fase externa, o que tornaria mais direto o contato com a pele.
Naturalmente, a miscibilidade ou a solubilidade em óleo e em água da substância
ativa que será utilizada, determinará em grande parte, o veículo no qual deverá estar
presente, e sua natureza indicará a fase da emulsão que deverá converter-se à
preparação resultante. As emulsões A/O também são mais emolientes para a pele,
pois resistem mais a secagem e à retirada pela água. Por outro lado, se o objetivo
for a obtenção de uma fórmula removível da pele pela água, deve-se dar preferência
às emulsões O/A (ANSEL, POPOVICH, ALLEN, 2000).
Na elaboração de uma emulsão estável, é necessário um terceiro
componente, constituído por emulsionantes (tensoativos), são substâncias que
atuam sobre a tensão superficial de líquidos imiscíveis, facilitando a obtenção e
estabilização (LACHMAN, LIEBERMAN, KANIG, 2001).
A principal preocupação na seleção dos emulsionantes para uso em produtos
para a pele é conseguir o máximo de efeitos de emusificação, solubilização e
dispersão provocando, ao mesmo tempo, o mínimo de reações desfavoráveis com
as estruturas das células epidérmicas. Os efeitos danosos dos tensoativos sobre a
 28

pele manifestam-se como ressecamento, aspereza e descamação. Além disso,

podem surgir sintomas de inflamação (vermelhidão e inchaço). Nos casos graves,
ocorre a destruição total do tecido (necrose). A pele perde as gorduras devido à
propriedade (mais ou menos pronunciada) dos tensoativos de emulsificar os lipídios
e assim remover, parcial ou totalmente, a película superficial destes. Isto resulta em
perturbação da função barreira da pele, levando ao aumento da permeabilidade às
substâncias químicas e a perda de água. Além disso, existe a perda de
componentes hidrofílicos de baixo peso molecular, que colaboram para a
manutenção da flexibilidade e extensibilidade da pele. Para a população em geral, o
uso normal de tensoativos em produtos de consumo não provoca problemas
cutâneos sérios (IDSON, 1997).
Uma classificação usual dos emulsionantes é em função da estrutura
molecular que considera a natureza dos seus grupos polares.
Aniônicos:quando em solução aquosa sofrem dissociação onde a parte polar
da molécula é aniônica. Os cátions presentes geralmente são íons inorgânicos como
sódio e cálcio, íon amónio e alcanolamina. São exemplos: sabões, alquil sulfatos,
alquil éter sulfatos, alquil sulfonatos, sulfossuccinatos, etc. São, via de regra,
superiores aos demais quanto ao poder de espuma e na capacidade detergente,
sendo também bons emulsionantes. O grupo apoiar é constituído por cadeia
alifática, ramificada, linear. Alquil sulfatos são compostos empregados no preparo de
emulsões O/A, como por exemplo, o cetilsulfato de sódio. Os fosfatos, de introdução
recente, possuem semelhança com os fosfolipídeos, constituintes do estrato córneo
da membrana celular e produzem emulsões contendo gotículas pequenas e
homogêneas. Melhor estabilidade é obtida com o emprego dos ésteres do ácido
ortofosfórico em combinações com outros tensoativos não iônicos. Derivados dos
ácidos graxos ou álcoois graxos formam uma fase líquida cristalina, contribuindo
para aumentar o poder de oclusividade e, conseqüentemente, maior retenção de
água. Os mais utilizados são os ésteres ortofosfóricos dos ácidos graxos
polietoxilados, na forma de mono e diésteres (SANCTIS, 2000).
Catiônicos: quando em solução aquosa sofrem dissociação, onde a parte
polar é catiônica e a parte apoiar formada por uma cadeia alifática, linear e
ramificada. São exemplos os sais quaternários de amónio (sais de alquil trimetil
amónio, sais de dialquil dimetil amónio e sais de alquil dimetil benzil amónio) e
 29

imidazolinas. Proporcionam sistemas estáveis com álcoois graxos e formam

emulsões O/A ou A/O. Possuem propriedades bactericidas, mas são irritantes em
concentrações elevadas, instáveis em meio alcalino. Amplamente utilizados em
condicionadores de cabelo (JATO, 2000).
Anfóteros: o poder tensoativo e emulsificante são dependentes do pH do
meio. No ponto isoelétrico estes compostos possuem comportamento não iônico e
dependendo do pH do meio em que estão dispersos, exibem as propriedades do
grupo polar catiônico ou aniônico. A solubilidade, atividade tensoativa e poder
emulsificante são menores que dos compostos aniônicos e catiônicos. São exemplos
as betaínas e os aminoácidos. Atuam como co-tensoativos para bases detergentes
proporcionando efeito de espessamento, incremento e estabilidade de espuma,
condicionamento e de redução da irritabilidade à pele e aos olhos, usual em xampus
e sabonetes líquidos (JATO, 2000).
Não iônicos: quando em solução aquosa não sofrem ionização, possuem
grupo polarizado, mas não ionizável. A solubilidade em água é devida à hidratação
dos grupos hidrofílicos, via pontes de hidrogênio. A porção hidrofóbica pode ser um
grupo alquil ou alquil aril e a porção hidrofílica representada por grupos álcool,
glicerol, sorbitol, amidoglicol, poliglicol, polietilenoglicol, polipropilenoglicol e
alcanolamidas. São exemplos os alquil aril etoxilados, alcanolamidas de ácido graxo
de coco, ésteres de glicerol, ésteres de glicóis, ésteres de polietilenoglicóis, ésteres
de sorbitano, álcoois graxos etoxilados e aminas etoxiladas. Os emulsionantes não
iônicos são os mais empregados atualmente (SILVA, SOARES, 1996). Os álcoois e
ésteres polioxietilênicos, cuja fração lipofílica é representada pelos ácidos
esteáricos, palmíticos, oléico e ricinoléico, são os não iônicos mais empregados
atualmente e considerados os menos irritantes para a pele, pois não desnaturam as
proteínas. Os derivados de lanolina, frações ricas em esteróis etoxilados são
emulsionantes primários não iônicos complexos quimicamente e apresentam boas
propriedades eudérmicas (PRISTA, ALVES, MORGADO, 1991).
Demais componentes da emulsão:
Para regular a viscosidade da fase aquosa quando esta é externa,
empregam-se hidrocolóides derivados da celulose e polímeros hidrófilos. Quando a
fase contínua é de natureza oleosa, recorre-se ao emprego da lanolina ou outros
corpos gordurosos e com características plásticas. Os espessantes, normalmente
 30

são hidrossolúveis, agem como auxiliares emulsificantes, aumentando a viscosidade

da fase externa evitando possíveis coalescências. Os produtos mais empregados
para tais finalidades são as gomas, como a arábica, caraia e xantana, polímeros
carboxivinílicos, derivados da celulose, etc. Deve-se evitar as possíveis
incompatibilidades entre estes compostos e outras matérias-primas, substâncias
iônicas e variações de pH (SILVA, SOARES, 1996).
Os umectantes impedem ou retardam a formação de cristais nas emulsões
por evaporação da fase aquosa e a cristalização de algumas substâncias menos
solúveis após a secagem da preparação. A glicerina, sorbitol e propilenoglicol são os
umectantes mais empregados e possibilitam melhor aplicação, dada a ação
lubrificante e suavizante que apresentam (PRISTA, ALVES, MORGADO, 1991).
Os silicones representam um grupo de substâncias com um sensorial
plenamente aceitável, principalmente para peles oleosas. Com seu toque seco e
suave, proporcionam efeito sensorial superior aos hidrogéis tradicionalmente
empregados para tratamento de peles oleosas. Espalham-se facilmente, com boa
distribuição por toda a pele e não deixam resíduos após a evaporação. Os
ciclometicones são fáceis de serem incorporados em emulsões que sejam O/A ou
A/O. Os dimeticones apresentam solubilidade ou dispersibilidade em água, devido à
combinação de cadeias carbônicas etoxiladas ligadas às cadeias principais de
polidimetil-siloxano. São produtos inócuos, seguros e suaves, não causam ardência
ou possuem qualquer papel alergênico. Além disso, podem ser excelentes
carreadores ou veículos para os princípios ativos (GOMES, 1999).
Os estabilizantes são os antioxidantes, os tampões, os sequestrantes e os
corretivos de pH. Os conservantes devem estar sempre presentes para a proteção
contra o desenvolvimento de microorganismos, responsáveis por alterações dos
cremes e por problemas que envolvem a sanidade cutânea (PRISTA, ALVES,
MORGADO, 1991).
De modo geral os constituintes da emulsão devem apresentar segurança
toxicológica, ausência de compostos alergênicos, sensibilizantes e irritantes (SILVA,
SOARES, 1996).
A emulsão geralmente apresenta coloração branca com aparência translúcida
e cintilante, sendo esta a que agrada o consumidor, pois, emulsões opacas e sem
brilho podem induzir à idéia de pobreza de composição ou de qualidade, ou ainda
 31

problemas de processamento. Bolhas de ar também conferem um aspecto negativo

às emulsões. Basicamente o que determina a aparência é o tamanho das partículas
da fase interna que está relacionada, principalmente, com o tipo e quantidade de
emulsionante, diferença de densidade entre as fases e condições de processo de
agitação, temperatura e técnica de emulsificação.
Os mecanismos básicos de instabilidade das emulsões perceptíveis são
descritos a seguir (RIEGER, 2000; SCHUELLER, ROMANOWSKI, 2000).
• Cremagem (cremosidade): com ou sem agregação e aumento do tamanho
das partículas, sob a influência da gravidade, as partículas suspensas ou as
gotículas tendem a sobrenadar ou sedimentar dependendo das diferenças das
densidades específicas entre as fases dispersa e dispersante. A emulsão resultante
fica com duas seções, uma delas tendo maior quantidade da fase interna e outra
com maior quantidade de fase externa. Caso fiquem suspensas formam uma
camada oleosa na superfície da emulsão sendo que esse fenômeno pode ser
revertido por agitação.
• Floculação: durante esse processo as gotículas da fase interna formam
uma associação fraca e reversível. Esse fenômeno é causado por uma carga
inadequada sobre as micelas, o que reduz a força de repulsão entre elas. As duas
partículas permanecem distintas na forma de bolhas, apenas se tocam e não há
alterações nas dimensões. Essa associação pode ser facilmente rompida pela
remoção de uma das partículas. A floculação pode ser revertida por meio da
agitação do sistema, sendo um problema de pouca gravidade.
• Coalescência: quando duas gotículas da fase interna se aproximam o
suficiente, e se unem para formar uma gotícula maior. Esse processo de
crescimento das partículas é um problema sério para a estabilidade por ser
irreversível. Quando um número grande de partículas coalesce, o resultado é uma
separação completa das duas fases.
• Inversão: a separação é uma das conseqüências do processo de
desestabilização da emulsão e a inversão de fase é outra conseqüência. Quando
ocorre uma inversão de fase, a fase externa torna-se fase interna e vice-versa. Uma
alteração dessa natureza é normalmente indesejável, porque as características
físicas da emulsão resultante diferem da original.
 32

• Química: devida à hidrólise dos tensoativos, destruição microbiana ou

processos fotoquímicos.
• Outros fatores: temperaturas elevadas de armazenagem aceleram a
desestabilização, ao passo que temperaturas baixas retardam.
Em algum grau, qualquer emulsão é susceptível a cada um dos processos de
desestabilização. O impacto de tais processos sobre os diferentes tipos de emulsões
pode ser variado. Diferentes métodos podem ser aplicados para determinar o grau
de desestabilização, o mais importante é o da observação direta e determinação do
pH (SCHUELLER; ROMANOWKI, 2000).
Uma emulsão estável é aquela que mantém os constituintes da fase oleosa
dispersa na fase contínua, ou vice-versa, mesmo quando submetida a tensões
decorrentes de temperatura, agitação e gravidade. Durante o desenvolvimento do
produto farmacêutico, após a definição da formulação, toma-se difícil para
determinar o prazo de validade do produto e avaliar a compatibilidade da emulsão
com a embalagem. Dessa forma, os testes de estabilidade acelerada tornam-se uma
ferramenta útil, sendo os mais comuns utilizados para emulsões descritos a seguir.
• Centrifugação: normalmente na velocidade de 2500 rpm por 1 hora ou
4000 rpm por 30 minutos. Baixos níveis de afloramento ou sedimentação podem até
ser aceitáveis. Nessas condições, pode-se prever uma estabilidade para a emulsão
de 16 semanas em repouso. A separação de água no fundo do tubo indica a
necessidade de espessamento da fase aquosa com polímeros; a separação de fase
oleosa na superfície indica a necessidade do acerto do equilíbrio hidrófilo - lipófilo
(HLB) ou da quantidade de emulsionante.
• Variação da temperatura: geralmente realizado em estufas a 45°C, 40°C,
temperatura ambiente e geladeira. Temperaturas elevadas diminuem a viscosidade
da fase oleosa e alteram a solubilidade relativa dos emulsionantes em ambas as
fases.
• Testes microbiológicos: o controle microbiológico durante o
desenvolvimento do produto é realizado na forma de desafio microbiano com
determinado número de microorganismos (bactérias e fungos), por 28 dias, a fim de
avaliar a efetividade do sistema conservante empregado.
 33

• Presença da luz: o produto é submetido à luzdireta do sol quando em

embalagens transparentes. Alguns equipamentos, tais como lâmpadas de
infravermelho, simulam a luz do sol. Formulações espessadas com polímeros
orgânicos podem sofrer redução na viscosidade devido ao contato com a luz durante
a estocagem, o que é contornado utilizando-se protetores solares (LACHMAN,
LIEBERMAN, KANIG, 2001).

3.5 ESTUDOS IN VITRO DE LIBERAÇÃO E PERMEAÇÃO CUTÂNEA DE

FÁRMACOS
Os métodos in vitro possibilitam entender os fenômenos que ocorrem entre a
administração do produto e o efeito medido farmacológica ou clinicamente, de
maneira prática, rápida, sem a interferência de fatores biológicos. Geralmente, nos
procedimentos in vitro para estudo de produtos dermatológicos, o principio ativo
difunde-se através de uma membrana artificial ou natural para uma solução
receptora, onde é feita a determinação analítica do conteúdo de princípio ativo
liberado ao longo do tempo.

3.5.1 Terminologias
Antes do relato de trabalhos realizados por vários autores, faz-se necessário
esclarecer e uniformizar várias terminologias que são encontradas em diversos
artigos científicos e livros, e, que também serão empregadas ao longo deste
trabalho.
SHAH et al. (1992a) publicaram um interessante artigo no qual discorreram
sobre os princípios e critérios para o desenvolvimento e otimização de produtos
dermatológicos. Esses autores atentaram para o problema da mistura de termos que
têm sido utilizados na designação dos processos que ocorrem nos estudos de
liberação in vitro de medicamentos tópicos. Algumas definições foram estabelecidas.

a)Produto dermatológico: o local de ação é a pele. Deve apresentar uma alta

retenção do fármaco na pele e pequeno fluxo através da mesma.
b) Produto de ação transdérmica: o efeito desejado é sistêmico. Deve apresentar
baixa retenção do fármaco na pele e grande fluxo através da mesma.
 34

c) Fluxo de uma substância na pele: quantidade de substância que atravessa a pele

em uma determinada área de superfície durante um intervalo de tempo.
d)Permeação e absorção transcutânea ou percutânea: transporte de substância
através da pele. Está relacionada com produtos transdérmicos.
e) Retenção cutânea: localização de substâncias na pele.
f) Permeável: capaz de ser atravessada ou capaz de atravessar a pele.
g)Retentiva: capaz de aprisionar substâncias na pele ou capaz de ser aprisionada
na pele.
h) Permeabilidade: grau com que a pele é capaz de ser atravessada por uma
substância.
i) Retentividade: grau com que a pele é capaz de aprisionar uma substância,
j) Permeante: substância que atravessa a pele.

3.5.2 Aparelhos utilizados nos testes in vitro

A literatura mostra que uma grande variedade de aparelhos, nos mais
diferentes modelos, têm sido empregada em estudos de cinética de liberação e/ou
permeação dos fármacos contidos em produtos de ação transdémica e
dermatológicos (BUSSE et al., 1969; DURRHEIM et al., 1980; FRANZ, 1975;
GASCO, GALLARTE, PAPTARINO, 1991; GASCO, GALLARTE, PATTARINO, 1988;
GUMMER, HINZ, MAIBACH, 1987; HADGRAFT, BEUTNER, WOLFF, 1993;
HADGRAFT & RIDOUT, 1985).
Os aparelhos dos testes in vitro podem ser denominados de “células de
liberação ou difusão”, cujos modelos e funcionamento são os mais variados. De
maneira geral, as células de difusão funcionam por dois sistemas:
a) Fluxo contínuo: onde a solução receptora é bombeada continuamente.
b) Fluxo estático: onde o volume da solução receptora é o mesmo durante todo o
experimento.
TOJO (1987) esquematizou os modelos mais comuns de difusão, conforme
mostra a figura 5.
O modelo A representa um sistema de difusão horizontal, podendo ser
fabricado para pequenos (3-4 ml) ou grandes volumes (140-290 ml), sendo que, a
área de difusão (área da membrana disponível para a difusão) é proporcional a
estes volumes. O modelo B mostra uma típica célula de difusão vertical projetada
 35

por FRANZ (1975), e, que tem sido utilizada freqüentemente em estudos de cinética
de liberação e absorção percutãnea. Já o modelo C, representa uma típica célula de
difusão de FRANZ modificada, a qual foi elaborada para solucionar os problemas
que a anterior apresentava quanto à homogeneidade de mistura no compartimento
receptor. O modelo D esquematiza uma célula de difusão vertical com disco rotativo
acoplado a um copo de dissolução de um litro da Farmacopéia Norte-Americana
(THE UNITED..., 1990).
 36

A)

B) AR

Agua 37 C

Agua 37 C

Figura 5: Modelos de células de difusão para estudos de liberação e/ou

permeação de fármacos contidos em produtos dermatológicos (TOJO, 1987).
 37

C)

AR

D)

Copo da Dissolução

Solução Recap cora

Pr ep ar aç ão

Me m b r a n a
 38

GUMMER et al. (1987) atentaram para o problema da diferença no

desempenho das diversas células utilizadas nos estudos in vitro de liberação e
permeação cutânea. Estes autores realizaram um estudo comparativo com diversas
células de difusão quanto à uniformidade de agitação no compartimento receptor,
bem como, o volume da fase receptora. Com base nos resultados obtidos foram
selecionadas duas células de difusão de fluxo contínuo, as quais apresentaram as
seguintes especificações: pequeno volume, agitação instantânea, possibilidade de
variação da área de superfície da membrana, e, também, compatibilidade com os
aparelhos de agitação comumente utilizados em laboratório.
BRONAUGH et al. (1981) verificaram a absorção percutânea da
N-nitrodietanolamina (impureza presente em produtos cosméticos) empregando uma
célula de difusão semelhante à de FRANZ. Neste estudo os autores utilizaram três
veículos diferentes e pele humana dissecada.
O aparelho projetado por OLSZEWSKI e KUBIS (1969) para estudo da
liberação de princípios ativos contidos em bases de pomadas permitiu o
acompanhamento do processo de liberação continuamente, pois este era provido de
um sistema de coleta de fração. Os testes realizados com pomadas contendo
sulfatiazol mostraram-se adequados, apresentando resultados com boa
reprodutibilidade.
KNECZKE et al. (1986) utilizaram uma célula de difusão estática para o
estudo da liberação do ácido salicílico em vaselina sólida. Através deste estudo foi
possível obter informações sobre a influência da concentração de ácido salicílico,
bem como da viscosidade e da cristalinidade daquele veículo, na liberação do
fármaco em questão.
Uma interessante célula de difusão automatizada foi projetada por ROLLAND
et al. (1992) para estudar a influência da formulação, solução receptora, e oclusão
na liberação in vitro de fármacos contidos em formas farmacêuticas de uso tópico. O
sistema era provido de bomba peristáltica, através da qual a solução receptora era
constantemente bombeada para um detector e retornava para o compartimento
receptor. Um sistema de fluxo diferente foi adaptado a uma célula de difusão
proposta por BRONAUGH e STEWART (1985), onde a solução receptora entrava
em contato com a membrana de difusão através de perfusão, e as diversas
amostras eram obtidas por meio de coletor de fração.
 39

SCHEUPLEIN et al. (1969) estudaram os mecanismos de absorção

percutânea por meio de uma pequena célula de difusão, a qual era composta por
duas metades unidas por meio de uma presilha. Essas duas metades ficavam
separadas por um disco perfurado que suportava uma membrana epidermal. Por
meio deste aparelho, os autores verificaram a permeabilidade do estrato córneo a
álcoois de diferentes pesos moleculares.
Um simples equipamento para estudo de liberação em sistema estático foi
projetado por TURAKKA et al. (1983). Tal aparelho consistia de um béquer onde era
colocada a solução receptora. Uma membrana de diálise era presa em uma das
extremidades de um cilindro de vidro e inserida no béquer para que a membrana
ficasse em contato com a fase receptora. O sistema todo era mantido a 37°C e as
amostras coletadas periodicamente para posterior análise da quantidade de fármaco
liberada.
A avaliação da cinética de absorção cutânea in vitro, considerando a
viabilidade e o metabolismo da pele, pôde ser efetuada através de interessante e
complexo aparelho construído por HOLLAND et al. (1984). Neste equipamento as
condições bioquímicas de uma membrana natural (pele dissecada de camundongo)
foram mantidas por meio de fluxo de meio estéril, o qual era gaseificado com 95 %
de oxigênio e 5 % de dióxido de carbono. Nestas condições os autores verificaram a
permeação cutânea do benzopireno, bem como, o metabolismo cutâneo deste
composto.

3.5.3 Membranas utilizadas nos estudos de liberação in vitro de princípios ativos

contidos em produtos dermatológicos
Alguns experimentos de liberação in vitro são conduzidos na ausência de
membrana e constituem, basicamente, na verificação da cinética de liberação de um
fármaco presente em uma formulação para uma fase imiscível, a qual supõe possuir
propriedades semelhantes às da pele. As limitações desses métodos recaem no fato
de que não são consideradas as complexidades anatômicas, biológicas e físico-
químicas da pele humana. BUSSE et al. (1969) estudaram a liberação do
17-valerato de betametasona contido em pomadas, utilizando um sistema com uma
fase oleosa líquida (a pomada) contendo o corticosteróide, flutuando sobre uma
solução hidroalcoólica, representando a pele. Abaixo dessa solução estava uma fase
 40

clorofórmica que simulava a circulação sanguínea. As três camadas eram agitadas e

a quantidade de corticosteróide liberada dosada na fase clorofórmica.
Os estudos de liberação in vitro se aproximam mais das condições in vivo
quando se utilizam sistemas com membranas. Devido às amostras de pele humana
serem de difícil obtenção e variarem quanto a sua permeabilidade, muitos
pesquisadores usam outros materiais para simulá-la. A membrana de acetato de
celulose tem sido utilizada como uma membrana com características hidrófilas em
células de difusão para estudos de liberação in vitro. TURAKKA et al. (1983)
verificaram a influência de diversos tensoativos na liberação dos ácidos orto-, meta-,
e para-hidroxibenzóicos contidos em bases triglicérides, utilizando uma membrana
de éster de celulose em uma célula de difusão.
Um estudo comparativo da liberação do ácido salicílico de uma microemulsão
e de emulsão A/O, foi realizado por STUPAR et al. (1986). Foi observada a
influência do tipo de membrana na quantidade de ácido salicílico liberada. Atingiu-se
uma maior liberação quando uma membrana lipófila (nitrato de celulose) foi
empregada, e, uma menor liberação quando se associou tal membrana com outra de
celulose regenerada.
SHAH et al. (1992b) utilizaram uma membrana composta por uma mistura de
ésteres de celulose (acetato e nitrato de celulose) no estudo de liberação in vitro de
cremes contendo 17-valerato de betametasona. O fluxo da liberação deste fármaco
através da membrana foi calculado, e as curvas de liberação em regressão linear
apresentaram ótimos coeficientes de correlação.
No estudo da liberação da prednisona, a partir de microemulsões O/A,
GASCO et al. (1988) empregaram membrana hidrófila impregnada com dodecanol.
Esta membrana tratada foi pressionada sobre uma membrana hidrófila formando
assim, um sistema com características hidrófilas e lipófilas.
Um sistema de membrana em multicamada foi projetado por NEUBERT et al.
(1991) para ser empregado em estudos de penetração de fármacos na pele. O
referido sistema funciona, segundo os autores, como receptor e pode simular a
penetração de substâncias na pele humana dissecada.
As membranas de dimetil-polissiloxano têm sido extensamente utilizadas em
estudos de transporte de fármacos por serem hidrófobas, de fácil preparo e
permeação (BOTTARI et al., 1977; CAPPEL, KREUTER, 1991; GASCO, TROTTA,
 41

CARLOTTI, 1982; KNECZKE, 1986; KUROSAKI et al., 1991; NEUBERT et al.,1991;

ROLLAND et al., 1992).
KUROSAKI et al. (1991) realizaram um estudo comparativo da permeação do
ácido flufenâmico em três modelos de membranas: pele abdominal de rato,
membrana de silicone e estrato córneo isolado de pele de cobaia. Foi possível
verificar que os modelos de membranas hidrófobas, como as de silicone, são
inadequados para avaliar o aumento da permeação cutânea de fármacos a partir de
formas farmacêuticas contendo veículos que atuam no estrato córneo.
HATANAKA et al. (1992) desenvolveram um sistema de membrana artificial
composto por membrana de silicone e de poli-(2-hidroxietilmetacrilato), para estudos
in vitm da permeabilidade cutânea de fármacos. Foi determinada a permeabilidade
da membrana para vários fármacos, com diferentes propriedades físico-químicas e
esta, comparada com a pele dissecada de rato sem pêlo. Os resultados obtidos
mostraram que a membrana desenvolvida apresentou uma propriedade barreira
similar ao modelo de pele animal utilizado.
Dentre as membranas de origem natural, a pele humana é insubstituível nos
estudos de penetração e permeação cutânea. Entretanto, devido às dificuldades na
aquisição destas membranas, as peles de animais, como ratos (BRONAUGH,
STEWART, 1983; HADGRAFT, BEUTNER, WOLFF, 1993; MASINI et al., 1993;
SATO, SUGIBAYASHI, MORIMOTO, 1991; SCOTT, WALKER, DUGARD, 1986),
camundongos com e sem pêlo (BRONAUGH, STEWART, 1986; DURRHEIM et al.,
1980; FLYNN, DURRHEIM, HIGUCHI, 1981; GHOSH, CHIAO, GOKHALE, 1993;
HORI et al., 1991; OKAMOTO, HASHIDA, SEZAKE, 1991; REIFENRATH et al.,
1984; SATO, SUGIBAYASHI & MORIMOTO, 1991), coelhos (DE VOS et al., 1991),
cobaias e cricetos (KUROSAKI et al., 1991; OKAMOTO, HASHIDA, SEZAKE, 1991;
SURBER, WILHELM, MAIBACH, 1991), porcos (REIFENRATH et al., 1984; SATO,
SUGIBAYASHI, MORIMOTO, 1991), cães sem pêlo (REIFENRATH et al., 1984),
macacos (SURBER, WILHELM, MAINBACH, 1991; WESTER, MAIBACH, 1976) tem
sido empregadas como membranas naturais.
A pele humana pode ser obtida pela dissecação de cadáveres (BRONAUGH,
CONGDON, SCHEUPLEIN, 1981; FRANZ, 1975; ROY, ROOS, SHARMA, 1994;
SCHUMANN, 1991; SETHI, AG HA, 1993) ou cirúrgicas (MOLLGAARD,
HOELGAARD, 1983). Vários procedimentos são utilizados no tratamento de
 42

amostras de pele humana. SCHUMANN (1991) utilizou pele humana da região

abdominal, obtida 24 horas post mortem e mantida em refrigerador por um período
máximo de 12 horas. Foi possível verificar, por testes in vitro, que o
butilhidroxianisol, adjuvante presente em várias formulações tópicas, penetra nas
diversas camadas da pele. Foram considerados fatores como quantidade aplicada,
área da pele exposta aos produtos, bem como metabolismo do referido fármaco na
pele.
FRANZ (1975) obteve ótimas correlações entre os dados de absorção
percutânea, obtidos por métodos in vitro e in vivo, de 12 compostos orgânicos.
Segundo o autor, a utilização de amostras de pele humana armazenada em
congelador, por um período de três meses, não alterou as características de
permeabilidade desta membrana natural.
A penetração de substâncias em pele dissecada pode ser verificada utilizando
somente a camada epidérmica. BRONAUGH et al. (1981) aqueceram amostras de
pele abdominal humana, em água a 60°C, por alguns segundos, removeram a
epiderme, e a utilizaram nos estudos in vitro de penetração percutânea da
N-nitrodietanolamina, eventualmente contida em veículos cosméticos.
O limitado número de amostras de pele humana, bem como a deterioração da
sua função barreira durante a armazenagem são fatores limitantes, durante a
execução de numerosos experimentos. REGNIER et al. (1993) propuseram a
obtenção de uma epiderme reconstituída a partir de queratinócitos humanos. As
medidas da absorção percutânea do ácido benzóico, da testosterona e da
hidrocortiosona revelaram que, sob as mesmas condições experimentais, a
epiderme reconstituída exibiu uma função barreira com propriedades qualitativas
similares a da pele humana normal, ou seja, as substâncias hidrófilas penetram mais
rapidamente do que as hidrófobas.
No sentido de verificar a validade dos resultados in vitro de absorção
percutânea, através da pele humana e em vários modelos animais, PRIBORSKY e
MUHLBACHOVÁ (1990) realizaram um estudo comparativo com pele de rato,
cobaias, coelho, porco, camundongo e pele humana. A absorção percutânea de
soluções de erioglaucina (Azul Brilhante) foi verificada em todas essas amostras de
pele, sendo que o modelo animal que mais se aproximou à pele humana foi a
cobaia.
 43

WESTER e MAIBACH (1989) encontraram boa correlação nos dados de

absorção percutânea do ácido benzóico, da testosterona e da hidrocortisona em
experimentos in vivo com macaco Rhesus e com humanos.
A pele de camundongo sem pêlo foi empregada em alguns estudos e
apresentou-se adequada para substituir a pele humana (DURRHEIM et al., 1980).
No entanto, a utilização de pele de camundongo sem pêlo em estudos in vitro de
absorção cutânea, deve ser feita de maneira cautelosa, uma vez que, este tecido
parece ser susceptível a algumas alterações quando comparados com a pele de
cadáver humano. O aumento da permeabilidade da camada córnea da pele desses
animais pode ocorrer devido à excessiva hidratação, ao tratamento com acetona e
com promotores de penetração (BARRY, 1987).
Em extenso estudo realizado por BONAUGH et al. (1982) foram determinadas
as características de pele humana e de diferentes espécies de animais, tais como
espessura das camadas da pele, densidade e tamanho dos folículos pilosos, e
constante de permeabilidade a diferentes compostos. Os autores concluíram através
dos dados obtidos e da literatura, que a escolha do modelo animal é dependente das
características físico-químicas da substância que se pretende verificar a absorção
percutânea.
Alguns autores estudaram o uso de pele de cobra (Elaphe obsoleta) como
modelo de membrana natural para estudos de permeação. A facilidade de obtenção
desta pele e o fato de não ser necessário sacrificar o animal são fatores vantajosos
em relação à pele de cadáveres humanos (TORUAN-PURBA, TABIBI, MENDES,
1993).

3.5.4 Soluções receptoras utilizadas nos testes in vitro

A escolha da solução receptora colocada nas células de difusão in vitro deve
ser feita criteriosamente, objetivando garantir o sucesso do experimento. Em muitos
estudos, prefere-se a solução isotônica tamponada a pH 7,4 como fase receptora
(CHOWHAN, PRITCHARD, 1975; MICHNIAK, CHAPMAN, SEYDA, 1993; SASAKI et
al., 1991). Entretanto, sempre é necessário garantir “sink conditions”, ou seja,
atividade termodinâmica do fármaco no fluido receptor não deve exceder 10 % da
sua solubilidade de saturação para, assim, ser garantida uma permeação favorável,
e, assegurar uma eficiente coleta do permeante (WESTER, MAIBACH, 1989).
 44

Substâncias hidrófobas, que podem ser definidas como substâncias com

baixa solubilidade em água, solúveis em solventes orgânicos e com altos valores de
coeficiente de partição O/A, apresentam uma dificuldade em se partilhar para um
meio receptor aquoso. Assim, o uso de meios não aquosos ou tampões isotônicos
contendo solubilizantes parece ser uma alternativa.
BRONAUGH e STEWART (1983) verificaram a absorção cutânea de dois
princípios aromáticos de natureza hidrófoba através de metodologia in vitro.
Soluções receptoras lipófilas substituíram a solução fisiológica, objetivando tentar
melhorar a absorção e aproximar com os resultados obtidos in vivo. Assim, o soro de
coelho e diluições aquosas de albumina de soro bovino, solventes orgânicos e
quatro tensoativos não iônicos, foram empregados como solução receptora. A
solução aquosa de polietilenoglicol-20-oleil-éter a 6 %, foi a que apresentou
melhores resultados, uma vez que os seguintes fatores foram associados: boa
correlação com o teste in vivo, e, pequena danificação na membrana (pele
dissecada de rato) usada no teste in vitro.
A solubilidade do fánmaco na solução receptora e o fato desta não alterar a
forma farmacêutica por difusão através da membrana, foram os fatores que
ROLLAND et al. (1992) levaram em consideração na escolha da solução receptora
em seus experimentos. Foi empregada uma substância lipófila (derivado do ácido
naftóico), uma membrana de silicone, duas fases receptoras (/7-octanòl e solução
aquosa de Polissorbato 80 a 0,25 %), bem como quatro bases tópicas. A solução
aquosa de tensoativo apresentou-se mais adequada, uma vez que o
n-octanol atravessou a membrana e dissolveu algumas das formas farmacêuticas
utilizadas.
SUBER et al. (1991) verificaram que a adição de 3 % de polietilenoglicol 20
ou 3 % de albumina, na fase receptora, aumentou o fluxo da acitretina através da
pele de macaco nos experimentos in vitro.
No sentido de aproximar os resultados in vitro com as situações in vivo,
SCOTT e RAMSEY (1987) testaram diferentes soluções receptoras para avaliar in
vitro, a absorção percutânea através da pele de rato de um inseticida piretróide. As
soluções aquosas de etanol a 50 % de polietilenoglicol-20 cetiléter (Cetomacrogol
1000) a 6 % e soro de carneiro, apresentaram-se adequadas para o estudo.
 45

3.6 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

O conceito de validação apareceu pela primeira vez na revisão das Boas
Práticas de Fabricação (BPF), pelo FDA, em 1976, com o objetivo de adequar os
requerimentos visando a garantia da qualidade.
A validação objetiva garantir, por meio de estudos experimentais, que o
método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a
confiabilidade dos resultados. Para tanto, é fundamental que os equipamentos e
materiais estejam calibrados e os analistas devidamente qualificados e treinados
(ICH, 1995). Leite (2002) descreveu que o objeto da validação é desafiar o método e
determinar limites de variabilidade permitida para as condições requeridas para o
método.
Segundo CHASIN et al. (1998), o desenvolvimento de um método analítico
envolve a definição das características e requerimentos que um método deve
satisfazer, a definição dos parâmetros de adequação que garantem a boa
performance do sistema durante as análises e a validação, que permite conhecer a
confiabilidade do método.
É importante destacar que não há um método único para efetuar a validação.
A grande variedade de substâncias, aliada às suas complexidades e a diversidade
de métodos, tornam impossível estabelecer um sistema de validação universal.
Portanto, é importante um bom planejamento onde sejam avaliados os
requerimentos legais e o método analítico escolhido (CHASIN et al., 1998).
Os parâmetros analíticos típicos considerados em um processo de validação
são: precisão, exatidão, especificidade, limite de detecção, limite de quantificação,
linearidade, faixa de trabalho, reprodutibilidade, robustez e sensibilidade (GREEN,
1996).
Considerando a grande variedade de métodos analíticos, diferentes
esquemas de validação são requeridos (USP, 1999) (Tabela 1).
• Categoria I - métodos analíticos para determinação quantitativa das matérias-
primas ou dos princípios ativos nas especialidades farmacêuticas.
• Categoria II - métodos analíticos para determinação de impurezas em matérias-
primas ou produtos de degradação em especialidades farmacêuticas. Incluem-se
aqui determinação quantitativa e ensaios limites.
 46

• Categoria III - métodos analíticos para determinação de características de

performance.
• Categoria IV - testes de identificação.

Tabela 1 - Elementos necessários para a validação.

CATEGORIA II

PARÂMETROS CATEGORIA ENSAIOS CATEGORIA CATEGORIA

QUANTITATIVOS
VERIFICADOS 1 LIMITES III IV
* *
Exatidão Sim Sim Não
Precisão Sim Sim Não Sim Não
Especificidade *
Sim Sim Sim Sim
Limite de *
Não Não Sim Não
detecção
Limite de *
Não Sim Não Não
quantificação
*
Linearidade Sim Sim Não Não
Faixa de * ★
Sim Sim Não
trabalho

FONTE: USP, 1999.

NOTA: * Pode ser necessário conforme a natureza do teste.

3.6.1 Exatidão
O parâmetro exatidão pode ser definido como o grau de concordância entre
os resultados encontrados e o valor verdadeiro, e é calculado como porcentagem
de recuperação da quantidade incorporada (USP, 1999).
A determinação da exatidão em um doseamento de matéria-prima pode ser
feita pela aplicação do método analítico a um analito de pureza conhecida ou
comparando o resultado com aquele de um segundo método bem caracterizado
(USP, 1999).
No caso de produto acabado, pode-se incorporar quantidades conhecidas do
produto à sua matriz (placebo). Quando não é possível obter-se um placebo (matriz
sem analito), pode-se adicionar quantidades conhecidas do analito em uma matriz
que já contenha alguma quantidade do fármaco. Pode-se também comparar os
resultados com aqueles de um método cuja exatidão tenha sido previamente
 47

determinada. Para um doseamento, deve-se incorporar, 50, 75, 100, 125 e 150 %
da concentração utilizada em um doseamento normal (LEITE, 2002).
Para impurezas, deve-se incorporar quantidades conhecidas do produto a ser
determinado. Recomenda-se realizar os testes para determinação da exatidão em
3 concentrações diferentes com 3 replicatas cada (USP, 2000; LEITE, 2002).

3.6.2 Precisão _
SHAP (2000), descreve a precisão como o grau de concordância entre os
resultados de análise individuais, quando o procedimento é aplicado repetidamente
a múltiplas análises de uma mesma amostra homogênea, sendo geralmente
expressa como o desvio padrão ou desvio padrão relativo dos resultados obtidos.
A precisão pode ser dividida em 3 tipos: repetibilidade, precisão intermediária
e reprodutibil idade. A repetibilidade é a precisão de um método medida nas
mesmas condições de operação em um curto período de tempo, por exemplo,
múltiplas medidas de uma mesma amostra por um mesmo analista. A precisão
intermediária é a concordância de resultados quando um mesmo método é
aplicado muitas vezes dentro de um mesmo laboratório, em diferentes dias, por
diferentes analistas. A reprodutibilidade, por sua vez, examina o grau de
concordância dos resultados originados de análises em diferentes laboratórios
(CHASIN et al., 1998).

3.6.3 Especificidade
SHAP (2000) define especificidade como a habilidade do método de analisar
a substância de interesse, em presença de outras substâncias, tais como impurezas,
produtos de degradação e componentes da matriz, sem que estas interfiram no
resultado. Assegurar a especificidade é o primeiro passo no desenvolvimento e
validação de um método (LEITE, 2002).
A especificidade pode ser avaliada incorporando a matéria-prima ou produto
acabado em exame com níveis apropriados de impureza ou excipientes e
demonstrando que o resultado não é afetado pela presença destes compostos.
Outra maneira é comparar os resultados do teste com aquele de um segundo
método validado e bem caracterizado.
 48

3.6.4 Limite de detecção

A ICH (1995) conceitua o limite de detecção como a menor concentração do
analito que produz uma resposta mensurável.
Para métodos não-instrumentais, o limite de detecção é determinado pela
análise de amostras com concentrações conhecidas, estabelecendo o nível mínimo
no qual o analito pode ser seguramente detectado (USP, 1999).
Para métodos cromatográficos, o limite de detecção corresponde à
concentração cujo pico é duas a três vezes maior que o ruído observado no
cromatograma (LEITE, 2002).

3.6.5 Limite de quantificação

GREEN (1996), define o parâmetro limite de quantificação como a mais baixa
concentração da substância em exame que pode ser determinada com precisão e
exatidão aceitáveis nas condições normais de trabalho, sendo expresso como a
concentração da substância na amostra (por exemplo, ppm, ppb).
O limite de quantificação pode ser determinado para métodos não-
instrumentais analisando amostras com concentrações conhecidas do analito e
estabelecendo o nível mínimo no qual este pode ser quantificado com exatidão e
precisão. Para métodos cromatográficos, o limite de quantificação pode ser definido
como aquela concentração onde o pico é 10 vezes maior que o ruído observado
(USP, 2000).

3.6.6 Linearidade e faixa de trabalho

O parâmetro linearidade é demonstrado quando os resultados de um teste
são diretamente, ou por uma transformação matemática bem definida, proporcionais
à concentração da substância em exame (GREEN, 1996).
A faixa de trabalho é o intervalo entre a maior e a menor concentração do
analito (incluindo estes valores) que demonstram ser determinados com adequados
níveis de precisão, exatidão e linearidade (USP, 1999).
A linearidade pode ser determinada, inicialmente por uma análise visual após
plotar as respostas obtidas como função da concentração do analito. Se ocorrer uma
relação linear, o resultado deve ser estabelecido por um método adequado (USP,
1999). A inclinação da reta, o intercepto e o coeficiente de correlação são, então
 49

determinados. Valores de coeficiente de correlação de cerca de 0,98 são aceitáveis

para um método (LEITE, 2002).
A faixa de trabalho, por sua vez, pode ser determinada verificando se o
método origina precisão, exatidão e linearidade quando aplicado a amostras do
analito no extremo e dentro da faixa (USP, 1999).
Para o doseamento de um fármaco, a linearidade deve ser testada nas
concentrações de 80 a 120 % da concentração de trabalho. Para uniformidade de
conteúdo deve-se avaliar a linearidade na faixa de 70 a 130 % da concentração
teórica e para impureza, de 50 a 120 % do valor especificado (USP, 1999).

3.6.7 Robustez
É a habilidade do resultado de um método permanecer inalterado por
pequenas mudanças de parâmetros operacionais e ambientais. A robustez pode ser
determinada através da análise individual ou simultânea dos parâmetros mais
sujeitos à variação (ICH, 1995).

3.6.8 Sensibilidade
A sensibilidade é definida como a capacidade de um método distinguir, com
determinado nível de segurança, duas concentrações próximas. A sensibilidade é
utilizada como um parâmetro comparativo entre dois métodos, onde o método com
maior sensibilidade apresenta curva padrão com maior inclinação (ICH, 1995).
 50

4 MATERIAL E MÉTODOS

As matérias-primas utilizadas nas formulações atendiam a especificação de

grau farmacêutico e os reagentes e solventes eram todos P. A..

4.1 MATERIAL
4.1.1 Matérias-Primas e Reagentes
Ácido etilenodiaminotetracético dissódico (EDTA -N a2)
Ácido kójico - padrão - Sigma Aldrich Chem. Co.
Ácido kójico (98 a 102 %) - matéria-prima SP-Farma
Álcool etílico
Butilhidroxitolueno (BHT)
Cera auto emulsionante não iônica - Emulgade Wax ®
Cera auto emulsionante não iônica - Polawax ®
Cloreto férrico (FeCI3)
Triglicerídeo do ácido cáprico e caprílico - Crodamol GTCC ®
Diestearato de macrogol 150 - Cutina DSP 6B ®
Dipropilenoglicol
Hidroxietilcelulose - Natrosol ®
Metanol
Metilparabeno - Nipagin ®
Solução de acetato de sódio 2 M
Solução de ácido acético 2 M
Solução de ácido clorídrico 0,1 M
Solução de cloreto de potássio 0,2 M
Solução de fosfato de potássio 0,1 M
Solução de hidróxido de sódio 0,1 M

4.1.2 Equipamentos
Aparelho de ponto de fusão - Quimis
Balança analítica - Mettler Toledo - AG 245
 51

Banho Maria - Nova Técnica

Câmera fotográfica - kodak
Centrífuga 5000 rpm - Excelsa Baby - Fanem
Célula para estudos de permeação cutânea in vitro
Embalagem primária: potes plásticos de polietileno com parede dupla
Espectrofotômetro - UV-visível Shimadzu - U V 1601
Espectrômetro - IV- Perking Elmer
Estufa para secagem de material - De Leo
Filme fotográfico - Kodak ASA 400
Material de acondicionamento - frascos de vidros e potes plásticos
Potenciômetro digital - PG 2000 - Gehaka
Ultra-som - Elma - Transsonic 460/H
Ultra Turrax - Ika

4.2 MÉTODOS
4.2.1 Desenvolvimento da Forma Farmacêutica
Foram preparadas emulsões O/A não iônicas, com espessantes graxos e
poliméricos. Na elaboração destas formulações as fases aquosas e oleosas foram
aquecidas a 75°C, separadamente, sendo o espessante polimérico dispersado
previamente na fase aquosa e, posteriormente, as fases foram emulsificadas, sob
agitação. Durante o resfriamento efetuou-se uma etapa de homogeneização,
cuidando-se para que a emulsão mantivesse um movimento constante evitando a
formação do “cone de agitação” e aeração.
Na tabela 2 estão listadas as formulações, numeradas de F 1 a F 10, que
foram previamente avaliadas por suas características organolépticas.
 52

Tabela 2. Formula das emulsões O/A não iônicas.

FORMULAÇOES
MATÉRIA-PRIMA
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
Agua deionizada q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s.

Natrozo! 2 5 0 HHR ® - - - 0 ,2 % 0 ,5 % - - - 0 ,2 % 0 ,5 %

Propiienoglicol 8 ,0 % 8 ,0% 8 ,0 % 8 ,0 % 8 ,0 % 8 ,0 % 8 ,0 % 8 ,0 % 8 ,0 % 8 ,0 %

Nipagin ® 0 ,2 % 0 ,2 % 0 ,2 % 0 ,2 % 0 ,2 % 0 ,2 % 0 ,2 % 0 ,2 % 0 ,2 % 0 ,2 %

Crodam ol G T C C ® 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10%

Cutina D S P 6B ® - 5% 10% - - - 5% 10% - -

Polaw ax G P 2 0 0 ® - - - - - 15% 15% 15% 15% 15%

Em ulgade W a x ® 15% 15% 15% 15% 15% - - - - -

EDTA dissódico 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2%
BHT 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2%

F O N TE : O A U T O R

4.2.2 Avaliação das Características Organolépticas dos Veículos

As formulações F 1 a F 10, da Tabela 2 foram submetidas a avaliações das
suas características organolépticas e valores de pHapós 24 horas em repouso.
As características organolépticas observadas foram: aspecto, cor, odor,
homogeneidade.
As determinações de pH foram efetuadas em potenciômetro digital.

4.2.3 Avaliação Preliminar da Estabilidade da Formulação Escolhida

A formulação selecionada, em função dos parâmetros organolépticos, foi
submetida aos ensaios de estabilidade. Após repouso de 48 horas (T zero), foi
submetida às seguintes condições:
• ciclo de resfriamento (2°C/24horas) e de aquecimento (40°C/24horas), por três
vezes consecutivos.
• estufa a 40°C/24 horas.
• centrifugação a 4000 rpm/30min.

Ao término dos ensaios acima citados, foram observadas: características

organolépticas - aspecto, cor, odor, homogeneidade e valores de pH.
 53

4.2.4 Espectrofotometria no Ultravioleta

Os espectros de absorção do ácido kójico (solução aquosa 25 ng/m\) e do
metilparabeno, Nipagin®, (solução aquosa 25 ng/ml) foram obtidos em
espectrofotômetro UV-Visível Shimadzu - UV 1601 na faixa de 200 a 400 nm,
utilizando cubetas de quartzo de 1,0 cm de espessura e água como branco, para
ajuste do zero do aparelho antes da leitura da amostra. O experimento foi realizado
à temperatura ambiente.

4.2.4.1 Curva padrão do ácido kójico por espectrofotometria no ultravioleta

A curva padrão foi construída com cinco pontos. Foram feitas 3 pesagens, em
dias diferentes, para o preparo da solução padrão concentrada (25 mg/100 ml) e
estas soluções foram diluídas em triplicata (n = 9). As soluções finais tinham
concentrações de 5, 10, 15, 20 e 25 p.g/ml.
As leituras das absorvâncias foram feitas no comprimento de onda de
269 nm, utilizando-se água como branco. A curva foi construída graficamente
relacionando os valores de absorvância obtidos em função da concentração das
soluções. O valor do coeficiente de correlação (r) e a equação da reta foram
determinados, por meio dos mínimos quadrados. Os valores de DPR em cada ponto
da curva foram calculados aplicando-se as equações indicadas a seguir:

DPR = S. 100% / X

onde:
n = número de amostras
S = desvio padrão
Xi = valor de cada unidade testada
X = média dos valores testados

4.2.4.2 Linearidade
A curva padrão para determinar a linearidade do método de doseamento do
ácido kójico por espectrofotometria de absorção no ultravioleta foi construída com 19
 54

pontos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 ng/ml). Foram
feitas duas pesagens, em dias diferentes, para o preparo da solução padrão de
ácido kójico concentrada (25 mg/100 ml). Estas soluções foram diluídas em triplicata,
obtendo-se seis soluções para cada ponto (n = 6).

4.2.4.3 Robustez
Para determinar se o método de quantificação do ácido kójico por
espectrofotometria no ultravioleta apresenta robustez foram analisados três
parâmetros: influência do pH, da temperatura e do tempo de leitura.

4.2.4.3.1 Influência do pH
A partir de uma solução padrão de 25 mg/100 ml de ácido kójico, foram
obtidas 10 soluções a 20 ng/ml cada, em diferentes valores de pH (Tabela 3).
Os diferentes valores de pH foram obtidos utilizando as soluções tampão
mostradas na tabela 4.
Neste experimento foram preparadas três soluções iniciais e as leituras foram
realizadas em triplicata, obtendo-se um n=9. A leitura das absorvâncias foi realizada
a 269 nm, em temperatura de 20°C e utilizando como branco a solução tampão
correspondente isenta de ácido kójico.

Tabela 3. Soluções padrão de ácido kójico 20 (ig/ml em diferentes valores de pH.

VOLUME DE SOLUÇÃO PADRÃO VOLUME DAS CONCENTRAÇAO pH DA

SOLUÇÕES CONCENTRADA (ml) SOLUÇÕES TAMPÃO (ng/ml) SOLUÇÃO
(ml)
1 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 1
2 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 2
3 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 3
4 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 4
5 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 5
6 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 6
7 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 7
8 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 8
9 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 9
10 4 ,0 4 6 ,0 2 0 ,0 10

F O N TE . O A U T O R
 55

Tabela 4. Soluções tampão.

PH Solução Tampão Utilizada

1 - Clark-Eubs (KCI-HCI)
2 - Clark-Eubs (KCI-HCI)
3 - McLLavaine (Na2HP04 - NaOH)
4 - McLLavaine (Na2 HP0 4 - NaOH)
5 - McLLavaine (Na2HP04 - NaOH)
6 - Sõrensen (Na2HP04 - KH2P04)
7 - Sõrensen (Na2HP04 - KH2P04)
8 - Sõrensen (Na2HP04 - KH2P04)
9 - H3 BO3 . KCI - NaOH
10 - H3 BO3 . KCI - NaOH

Foram preparadas soluções de ácido kójico com concentração final de

25 ng/ml em tampão acetato (pH 3,0), em água (pH 6,0) e em tampão H 3BO 3. KCI -
NaOH (pH 9,0). Os espectros destas soluções foram obtidos em espectrofotômetro
UV-Visível Shimadzu - UV 1601 na faixa de 200 a 400 nm, utilizando cubetas de
quartzo de 1 cm de espessura e utilizando como branco as respectivas soluções
tampão isentas de ácido kójico.

4.2.4.3.2 Influência do tempo de leitura

A partir de uma solução padrão de ácido kójico (25 mg/100 ml) foram obtidas
soluções aquosas (pH 6,0) de 10 jig/ml cada. Neste experimento foram preparadas
três soluções iniciais e as leituras foram feitas em triplicata (n=9).
A leitura das absorvâncias foi realizada a 269 nm, em temperatura de 20°C,
nos tempos zero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, e 8 horas após o preparo das soluções.
 56

4.2.43.3 Influência da temperatura

A partir de uma solução padrão de ácido kójico (25 mg/100 ml) foram obtidas
soluções aquosas (pH 6,0) de 10 jj.g/ml cada. Neste experimento foram preparadas
três soluções iniciais e as leituras foram feitas em triplicata (n=9).
A leitura das absorvâncias foi realizada a 269 nm, logo após o preparo nas
temperaturas de 5°C, 20°C e 35°C.

4 2 .4.4 Exatidão
Foi preparada, em triplicata, solução padrão de ácido kójico na concentração
de 20 fig/ml.
Ao veículo (formulação F 4), isento de conservante, foi incorporado ácido
kójico padrão, para a obtenção de amostras de emulsão contendo 0,5 %; 1 %; e 2 %
do ativo.
Uma tomada de amostra de 1 g de cada preparação foi transferida para balão
volumétrico de 100 ml e o volume foi completado com água. Estas soluções foram
filtradas em papel de filtro qualitativo, desprezando os primeiros 5 ml. Uma fração de
cada um dos filtrados foi diluída com água até obter solução de concentração de
20 ng/ml.
A concentração do ácido kójico foi determinada por espectrofotometria no
ultravioleta como já descrito e foi calculada a porcentagem de recuperação do
método. Este experimento foi realizado em triplicata (n = 9).

4.2.4.5 Precisão
Para verificação da precisão intradia foram preparadas soluções de ácido
kójico nas concentrações de 5, 10, 15, 20 e 25 (ig/ml. A leitura das absorvâncias foi
realizada a 269 nm e foi calculado o DPR com os resultados obtidos. Este
experimento foi realizado em triplicata (n = 3).
Para verificação da precisão intermediária foram preparadas soluções de
ácido kójico, em dois dias diferentes, nas concentrações de 5, 10, 15, 20 e 25 ^g/ml.
A leitura das absorvâncias foi realizada a 269 nm, em dias diferentes, em aparelhos
diferentes e por analistas diferentes e foi calculado o DPR com os resultados
obtidos. Este experimento foi realizado em triplicata (n = 6).
 57

4.2.5 Espectrofotometria no Visível pelo Cloreto Férrico

4.2.5.1 Determinação da influência da concentração de cloreto férrico na intensidade

de cor na solução com ácido kójico.
Foram preparados 32 sistemas, com volume final de 10 ml, contendo todos
1 ml da solução padrão de ácido kójico 0,1 mg/ml, e variando a concentração de
cloreto férrico no sistema, conforme mostrado na Tabela 5.

Tabela 5. Sistemas utilizados para determinação da influência da concentração de

cloreto férrico na intensidade de cor na solução com ácido kójico.

Solução de ácido Solução de Cloreto Agua Volume final do Concentração de

kójico padrão Férrico 4,5 mg/ml (ml) Deionizada (ml) sistema (ml) Cloreto Férrico
100 |ig/ml (ml) (ug/ml)
1 .0 0 ,2 8 ,8 10 90
1 ,0 0 ,4 8 ,6 10 180
1 .0 0 ,6 8 ,4 10 270
1 ,0 0 ,8 8 ,2 10 360
1 ,0 1 ,0 8 ,0 10 450
1 ,0 1 ,2 7 ,8 10 540
1 ,0 1 ,4 7 ,6 10 630
1 ,0 1 ,6 7 ,4 10 720
1 ,0 1 ,8 7 ,2 10 810
1 ,0 2 ,0 7 ,0 10 900
1 ,0 2 ,2 6 ,8 10 990
1 ,0 2 ,4 6 ,6 10 1080
1 ,0 2 ,6 6 ,4 10 1160
1 ,0 2 ,8 6 ,2 10 1260
1 ,0 3 ,0 6 ,0 10 1350
1 ,0 4 ,0 5 ,0 10 1800
1 ,0 4 ,2 4 ,8 10 1890
1 ,0 4 ,4 4 ,6 10 1980
1 ,0 4 ,6 4 ,4 10 2070
1 ,0 4 ,8 4 ,2 10 2160
1,0 5 ,0 4 ,0 10 2250
1 ,0 5 ,2 3 ,8 10 2340
1 ,0 5 ,4 3 ,6 10 2430
1 ,0 5 ,6 3 ,4 10 2520
1 ,0 5 ,8 3 ,2 10 2610
1 ,0 6 ,0 3 ,0 10 2700
1 ,0 6 ,2 2 ,8 10 2790
1 ,0 6 ,4 2 ,6 10 2880
1 ,0 6 ,6 2 ,4 10 2970
1 ,0 6 ,8 2 ,2 10 3060
1 ,0 7 ,0 2 ,0 10 3150
1 ,0 7 ,2 1 ,8 10 3240

F O N TE : O A U T O R
 58

As absorvâncias destes sistemas foram determinadas por espectrofotometria

em 503 nm, à temperatura ambiente, utilizando como branco sistemas com iguais
concentrações de cloreto férrico e isentos de ácido kójico. Os valores de
absorvâncias obtidos em função da concentração de cloreto férrico foram
representados graficamente.

4.2.5.2 Espectro de absorção do ácido kójico em presença de cloreto férrico.

Para o sistema, com volume final de 10 ml, contendo 2,5 ml da solução
padrão de ácido kójico (0,2 mg/ml), 6 ml da solução de cloreto férrico (4,5 mg/ml) e
1,5 ml de água deionizada (pH 5,8) e para o sistema contendo 2,5 ml da solução de
metilparabeno, Nipagin ® (0,2 mg/ml), 6 ml da solução de cloreto férrico (4,5 mg/ml)
e 1,5 ml de água deionizada foram traçados espectros de absorção em
espectrofotômetro UV-Visível Shimadzu - UV 1601 na faixa de 200 a 800 nm,
utilizando cubetas de quartzo de 1 cm de espessura. Como branco foram utilizados
sistemas com iguais concentrações de cloreto férrico, isentos de ácido kójico e
metilparabeno.

4.2.5.3 Curva padrão do ácido kójico por espectrofotometria no visível pelo cloreto
férrico.
A curva padrão foi construída com seis pontos. A partir de uma solução
padrão de ácido kójico de 100 fig/ml foram elaborados sistemas, com volumes finais
de 10 ml, contendo 6 ml da solução de cloreto férrico (4,5 mg/ml) e concentrações
de ácido kójico de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 fxg/ml, conforme mostra a tabela 6. Os
sistemas foram preparados em triplicata.
 59

Tabela 6. Preparo dos sistemas para obtenção da curva padrão do ácido kójico por
espectrofotometria no visível pelo cloreto férrico.

SOLUÇÃO DE ACIDO SOLUÇÃO DE CLORETO AGUA CONCENTRAÇAO

KÓJICO PADRÃO 100 FÉRRICO 4,5 mg/ml (ml) DEIONIZADA FINAL
ug/ml (ml) (ml) ug/ml
0 ,5 6 ,0 3 ,5 5
1 ,0 6 ,0 3 ,0 10
1 ,5 6 ,0 2 ,5 15
2 ,0 6 ,0 2 ,0 20
2 ,5 6 ,0 1 ,5 25
3 ,0 6 ,0 1 ,0 30

F O N TE : O A U T O R

As leituras das absorvâncias foram feitas, em triplicata (n = 9) em

comprimento de onda de 503 nm, utilizando-se como branco um sistema com igual
concentração de cloreto férrico isento de ácido kójico. O resultado foi representado
graficamente e foram determinados o valor do coeficiente de correlação (r) e a
equação da reta, por meio dos mínimos quadrados. Os valores de DPR foram
calculados para cada ponto da curva.

4.2.5.4 Linearidade
Para avaliação da linearidade do método de doseamento do ácido
kójico por espectrofotometria no visível pelo cloreto férrico foi construída uma curva
padrão com 15 pontos (1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 ug/ml).
Foram feitas duas pesagens, em dias diferentes, para o preparo da solução padrão
de ácido kójico 0,1 mg/ml. Em tubos de ensaio contendo 6 ml da solução de cloreto
férrico (4,5 mg/ml) recém preparada foram acrescentados diferentes volumes da
solução padrão de ácido kójico e água, obtendo-se sistemas com volume final de 10
ml. Estes sistemas foram preparados em triplicata, obtendo-se seis soluções para
cada ponto (n = 6).

4.2.5.5 Robustez
Para determinar se o método de quantificação do ácido kójico por
espectrofotometria no visível pelo cloreto férrico apresenta robustez foram
analisados três parâmetros: influência do pH, da temperatura e do tempo de leitura.
 60

4.2.5.5.1 Influência do pH
Foram preparados, em triplicata, sistemas contendo 6 ml da solução de
cloreto férrico (4,5 mg/ml), 1 ml de solução padrão de ácido kójico (200 jig/ml) e 3 ml
de uma das diferentes soluções (água deionizada, HCI 0,1M, tampão acetato pH 4,0)
resultando em soluções de diferentes valores de pH, conforme mostra a tabela 7.
A leitura das absorvãncias foi realizada em 503 nm, a temperatura de 20°C,
utilizando como brancos sistemas idênticos isentos de ácido kójico. Foram
calculados os valores de DPR para os valores de absorvância dos diferentes valores
de pH.

Tabela 7. Preparo dos sistemas para verificação da influência do pH na

determinação do teor de ácido kójico por espectrofotometria no visível pelo cloreto
férrico.
SOLUÇÃO SOLUÇÃO AGUA ACIDO TAMPAO PH
DE CLORETO DE ÁCIDO DEIONIZADA CLORÍDRICO ACETATO FINAL
FÉRRICO KÓJICO (ml) 0,1 M (ml) pH 4,0
4,5 mg/ml 200 (ig/ml (ml)
(ml) (ml)
6 ,0 1 ,0 - 3 ,0 - 2,0
6 ,0 1 ,0 - - 3 ,0 3,0
6 ,0 1 ,0 3 ,0 - - 5,8

F O N TE : O A U T O R

4.2.5.5.2 Influência do tempo de leitura

Foram feitas 3 pesagens para o preparo da solução padrão de ácido kójico
100 ng/ml e a partir destas foram preparados nove sistemas (n = 9), sendo que cada
sistema continha 2 ml da solução de ácido kójico, 6 ml da solução de cloreto férrico
(4,5 mg/ml) e 2 ml de água deionizada.
A leitura das absorvãncias foi realizada em 503 nm, a temperatura de 20°C,
logo após o preparo dos sistemas e em intervalos de 1 hora até completar o período
de 8 horas. Como branco foi utilizado um sistema idêntico isento de ácido kójico.

4.2.5.5.3 Influência da temperatura

Foram feitas 3 pesagens para o preparo da solução de ácido kójico padrão
100 ng/ml e a partir destas foram preparados 9 sistemas (n=9), sendo que cada
 61

sistema continha 2 ml da solução de ácido kójico, 6 ml da solução de cloreto férrico

4,5 mg/ml e 2 ml de água deionizada.
Três sistemas foram submetidos a banho-maria (35°C). Outros três sistemas
foram submetidos a resfriamento em geladeira (5°C) e os três últimos sistemas
ficaram a temperatura de 20°C em banho-maria.
A leitura das absorvâncias foi realizada em 503 nm, utilizando como branco
um sistema idêntico isento de ácido kójico. O DPR foi calculado para cada
temperatura.

42=5,6 Exatidão
Para controle positivo foi preparado um sistema contendo 2 ml da solução
padrão de ácido kójico (100 ng/ml), 6 ml da solução de cloreto férrico (4,5 mg/ml) e
2 ml de água deionizada.
Como branco foi preparado um sistema contendo 6 ml da solução de cloreto
férrico (4,5 mg/ml) e 4 ml de água deionizada.
Ao veículo (formulação F 4), isento de conservante, foi incorporado ácido
kójico padrão, para a obtenção de amostras de emulsão contendo 0,5 %; 1 % e 2 %
do ativo,
Uma tomada de amostra de 1 g de cada uma foi transferida para balão
volumétrico de 100 ml e o volume foi completado com água. Estas soluções foram
filtradas em papel de filtro qualitativo, desprezando os primeiros 5 ml. Uma fração de
cada um dos filtrados foi adicionada a tubos contendo 6 ml da solução de cloreto
férrico (4,5 mg/ml) e diferentes volumes de água até obter sistemas com
concentração de 20 ^g/ml de ácido kójico. O teor de ácido kójico foi determinado por
espectrofotometria no visível pelo cloreto férrico, como já descrito, e foi calculada a
porcentagem de recuperação do método.

4.2.5.7 Precisão
Foram preparados sistemas, em triplicatas, com concentrações finais de ácido
kójico de 5, 10, 15, 20 e 25 (ig/ml, conforme mostra a Tabela 8. Como branco foi
preparado um sistema isento de ácido kójico.
A leitura das absorvâncias foi realizada em 503 nm e foi calculado o DPR com
os resultados obtidos (n = 3).
 62

O procedimento foi efetuado num segundo dia (n = 6) e os resultados foram

comparados.

Tabela 8. Preparo dos sistemas para determinação da precisão do método

espectrofotométrico no visível pelo cloreto férrico.

SISTEMA SOLUÇÃO DE SOLUÇÃO DE AGUA CONCENTRAÇÃO

ÁCIDO KÓJICO CLORETO FÉRRICO DEIONIZADA FINAL (ng/ml)
100 jig/ml (ml) 4,5 mg/ml (ml) (ml)
1 0 ,5 6 ,0 3 ,5 5
2 1 ,0 6 ,0 3 ,0 10
3 1 .5 6 ,0 2 ,5 15
4 2 ,0 6 ,0 2 ,0 20
5 2 ,5 6 ,0 1 ,5 25
Branco 0 ,0 6 ,0 4 ,0 0

FON TE: O AU TO R

4.2.6 Avaliação da Qualidade da Matéria-Prima

A matéria-prima foi submetida a ensaios quanto à identificação, solubilidade,
características organolépticas, ponto de fusão e teor.
A identificação foi realizada por espectrometria no infravermelho e no
ultravioleta e por ensaio de coloração com cloreto férrico.
A identificação por espectrometria no infravermelho foi realizada em
espectrofotômetro IV - Perking Elmer. O espectro da matéria-prima foi comparado
com o do padrão.
Para identificação por espectrofotometria no ultravioleta foi obtido espectro de
solução aquosa de ácido kójico - matéria-prima na concentração de 25 ^ig/rnl,
conforme descrito no item 4.2.4. O espectro da matéria-prima foi comparado com o
do padrão, obtido nas mesmas condições. Na identificação por ensaio de coloração
com cloreto férrico foram preparados sistemas, com matéria-prima e padrão, com
concentração final de 25 p.g/ml. A coloração dos sistemas foi comparadas.
A solubilidade do ácido kójico foi avaliada em água, etanol 96%, acetona,
éter, clorofórmio, HCI 0,1M e NaOH 0,1M segundo a classificação descrita na
Farmacopéia Brasileira IV (1988).
 63

Os pontos de fusão da matéria-prima e padrão foram determinados em

aparelho Quimis. As amostras foram colocadas em capilares e a temperatura foi
determinada com termômetro, sendo realizadas três determinações.
A determinação do teor de ativo na matéria-prima foi obtida por
espectrofotometria no ultravioleta e por espectrofotometria no visível pelo cloreto
férrico, como já descrito. Estes ensaios foram realizados com quatro soluções (n=4).

4.2.7 Avaliação da Qualidade da Formulação F 4 com Ácido Kójico

A formulação F 4 contendo 2 % de ácido kójico foi submetida a ensaios
quanto às características organolépticas, aspecto, pH, homogeneidade e teor.
As características organolépticas, o aspecto e a homogeneidade foram
avaliados por meio da observação macroscópica do produto, depois de repouso de
48 horas após o preparo da formulação. O pH foi determinado em potenciômetro
digital.
O teor da formulação foi obtido por espectrofotometria pelo método do cloreto
férrico. Para este ensaio 1 g da formulação foi diluída com água em balão
volumétrico (1:100). Esta solução foi homogeneizada e depois filtrada em papel de
filtro qualitativo. A solução resultante foi utilizada para a obtenção do sistema com
cloreto férrico, conforme item 4.2.5.2. A absorvância deste sistema foi determinada,
em triplicata, a 503 nm.

4.2.8 Permeação Cutânea In Vitro do Ácido Kójico

4.2.8.1 Célula de difusão in vitro
A célula de difusão in vitro foi confeccionada em vidro PIREX, apresentando
um compartimento receptor de 7 ml, uma área disponível para a difusão de
1,76625 cm2, com sistema de agitação magnético (Figura 6). O sistema de difusão é
estático e acoplado a um banho-maria com circulação externa para a manutenção
da temperatura do sistema.
 64

Figura 6: Celula de difusao in vitro utilizada no presente trabalho.

4.2.8.2 Membrana
Foi empregada uma membrana natural (pele dissecada da orelha de porco)
no estudo in vitro de permea9ao cutanea.
As membranas foram obtidas por dissecayao da pele da orelha de porcos,
ap6s o sacrificio do animal. A superficie da pele foi limpa com algodao embebido em
agua deionizada, os pelos foram cortados com tesoura e a pele foi retirada com
auxilio de bisturi e pin9a para dissecayao. Em seguida foram removidos os tecidos
subcutaneo e gorduroso presentes abaixo da derme, e certificou-se da integridade
da pele. Foram selecionadas peles integras, ou seja, livres de qualquer tipo de lesao
ou alterayoes (Figura 7). As amostras de pele dissecadas e integras foram
embrulhadas em folhas de papel aluminio e filme plastico e depois congeladas.
Quando necessarias essas amostras de pele foram descongeladas naturalmente a
temperatura ambiente, e colocadas nas celulas de difusao in vitro para realiza9ao de
ensaios de permea9ao.
 65

Figura 7: Pele da orelha de porco em processo de disseca9ao.

4.2.8.3 Ensaio de permea9ao cutanea in vitro do acido k6jico na formula9ao

A solu9ao receptora, tampao fosfato isot6nico pH 7,4, foi colocada no interior
das celulas de difusao, evitando-se a forma9ao de bolhas. Sobre a extremidade das
celulas foram esticadas as membranas cuidando para que o lado inferior da derrne
ficasse em contato com a solu9ao receptora. Ligou-se o banho-maria com circula9ao
externa e quando a temperatura da celula foi equilibrada a 3rC, espalhou-se
uniformemente sobre toda a area da membrana 2 g do produto formulado contendo
2 % de acido k6jico.
0 sistema de agita9ao foi acionado e amostras de 1 ml da fase receptora
foram coletadas nos tempos de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360,
420, 480, 540, 600, 660 e 720 minutos para a determina9ao do conteudo de acido
k6jico permeado. Para manter o volume constante, a cada coleta adicionou-se ao
sistema 1 ml de solu9ao receptora nova. 0 experimento foi realizado em triplicata e
como controle foi realizado urn branco contendo 2 g de formula9ao isenta de acido
k6jico.
0 teor de acido k6jico permeado foi determinado por espectrofotornetria no
ultravioleta (269 nm) a partir de uma curva padrao de acido k6jico em tampao fosfato
isot6nico pH 7,4 construida com 9 pontos (1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e 25 )lg/ml),
 66

conforme o item 4.2.4.1. Para esta análise as alíquotas das soluções receptoras
foram diluídas (1:5) com tampão fosfato isotônico pH 7,4.
Os dados de permeação cutânea foram utilizados para calcular os parâmetros
cinéticos tempo de latência (tempo U\G) e fluxo (J) do ácido kójico através da
membrana. Para determinar a cinética foram utilizados o modelo cinético de
HIGUCHI (pseudo 1a. ordem), o modelo cinético dela. ordem e o modelo cinético de
ordem zero. O modelo HIGUCHI (MICHNIAK, CHAPMAN, SEYDA, 1993) relaciona a
quantidade de fármaco permeado por área versus a raiz quadrada do tempo, o
modelo cinético de 1a. ordem relaciona o log da quantidade de fármaco permeado
por área versus o tempo e o modelo cinético de ordem zero relaciona a quantidade
de fármaco permeado por área versus o tempo. O modelo que apresenta o
coeficiente de correlação linear mais próximo de 1 corresponde ao modelo cinético
da permeação do ativo. A interceptação no eixo das abscissas desta curva, em
regressão linear, representa o tempo LAG em minutos. O fluxo (J) é dado pela
inclinação da curva (ROY, ROOS, SHARMA, 1994). O parâmetro LAG foi expresso
em minutos e J foi expresso em ng/crrf/minutos.

4.2.8.4 Ensaio de permeação cutânea in vitro do ácido kójico em solução tampão

fosfato isotônico pH 7,4
O ensaio foi realizado conforme descrito no item anterior, sendo que o
produto formulado contendo ácido kójico foi substituído por 2 ml de uma solução
tampão fosfato isotônica pH 7,4 com ácido kójico na concentração de 20 fig/ml. As
amostras foram coletadas e analisadas nos tempos de 5,10,15, 20, 25, 30, 60,120,
180, 240, 300, 360, 420 e 480 minutos.

4.2.7.5 Determinação da Quantidade de Ácido Kójico Retido na Pele da Orelha de

Porco
A extração do ácido kójico retido na pele animal foi baseada no método
proposto por SASAKI et al. (1991) e TAUBER et al. (1976). Decorridas 12 horas de
permeação in vitro, a pele da orelha de porco foi retirada do aparelho de difusão. A
superfície da pele sobre a qual foi depositada a formulação foi limpa por meio de
algodão embebido em metanol, para retirar o excesso de produto da pele. Após este
procedimento recortou-se a área da pele exposta à difusão e em seguida foi pesada
 67

e picotada. Os fragmentos obtidos foram transferidos para um tubo de plástico

contendo 25 ml de metanol. Estes foram triturados em homogeneizador de tecidos
(Ultraturex) até a total dilaceração da pele. A suspensão resultante foi submetida à
sonicação em ultra-som de alta freqüência durante 45 segundos, em intervalos de
15 segundos, para ocorrer o rompimento das células. O produto obtido foi filtrado em
papel de filtro para um balão volumétrico de 50 ml e o volume foi completado com
metanol.
A quantidade de ácido kójico presente nesta solução foi determinada por
espectrometria de absorção no ultravioleta (269 nm). Para esta quantificação foi feita
uma curva padrão de ácido kójico em metanol nas concentrações de 5, 10, 20, 30,
40, 50, 60 e 70 jig/ml, conforme item 4.2.4.1.
 68

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

õ.i OBTENÇÃO DA FORMA FARMACÊUTICA

5.1.1 Emulsão
A escolha de um sistema adequado para incorporação dos princípios ativos é
de fundamental importância para a estabilidade, para a disponibilidade no local de
aplicação e, conseqüentemente, para a obtenção dos efeitos esperados. Aliados a
estes fatores, deve-se levar em consideração que a aceitação da forma farmacêutica
(emulsão) por parte do consumidor depende, principalmente, da sua eficácia e
qualidades estéticas, além da sensação agradável. Se o consumidor não sentir bem-
estar, dificilmente a usará por dias consecutivos interrompendo neste caso, o
tratamento (CAMPOS, 1994).
Alguns veículos podem ser usados para obter as características físicas e
químicas desejadas do produto ou para melhorar a aparência e as propriedades
sensoriais (CAMPOS, 2001).
As emulsões são os veículos mais comuns de sistemas de liberação em
produtos de uso tópico. Através delas é possível veicular uma ampla gama de
substâncias que serão liberadas de maneira rápida e conveniente. As emulsões
apresentam características distintas, condicionadas aos tipos de matérias incluídas
tanto na fase oleosa quanto na fase aquosa, bem como a concentração de cada um
deles e do emulsionante utilizado (SCHUELLER; ROMANOWSKI, 2000).
Além de atender as exigências do consumidor, as emulsões devem
apresentar compatibilidade com o princípio ativo a ser incorporado. Para a
veiculação do ácido kójico foi necessário o desenvolvimento de emulsões com bases
não iônicas, pois estas são próprias para produtos com pH ácido (PALUDETTI,
1995). Em adição a isto, as bases não iônicas são em geral inócuas, não
apresentando propriedades alergênicas e possuindo deste modo boa
compatibilidade com a pele (CARMIN; KURAHASSI, 1995). As bases não iônicas
escolhidas para obtenção das formulações são bases auto emulsionantes
(Emulgade Wax ® e Polawax ®) que formam redes de cristais líquidos pela formação
de uma série de bicamadas lamelares de moléculas de emulsificante ao redor das
gotículas de óleo. Esta estrutura evita a coalescência das gotículas melhorando a
estabilidade do produto, acredita-se que isso ocorra devido a redução a valores
 69

bastante baixos das forças de atração de Van der Waals entre duas gotículas de
óleo, além disso os cristais líquidos conferem poder hidratante às formulações, por
mimetizarem as bicamadas lamelares das membranas celulares (DAHMAS, 1991).
Tais cristais mistos lamelares podem intumescer em função do conteúdo total de
água, isto é, parte da água é interlamelarmente ligada. Em geral pode ser
estabelecido que, com o crescimento do comprimento da cadeia polioxietilênica, a
capacidade de retenção de água interlamelar de uma emulsão O/A também
aumenta. Esta água interlamelar está em equilíbrio dinâmico com a água do sistema
(água não ligada), isto é, quando a água do sistema evapora, a água ligada
interlamelarmente se transforma em água do sistema, prolongando a hidrofilia
destas formulações, o que é benéfico para o consumidor (SAMPAIO, 1998).
Apesar das ceras auto emulsionantes apresentarem em sua composição os
agentes de consistência, muitas vezes há a necessidade de adição extra de agentes
de consistência com a finalidade de melhorar a estabilidade e a aplicabilidade. Os
agentes de consistência usualmente empregados são de natureza graxa ou
polimérica (SANCTIS, 2000).
Deste modo em algumas formulações (Tabela 2) optou-se pela incorporação
de um derivado de celulose grau farmacêutico, a hidroxietilcelulose, conhecida
comercialmente como Natrosol ® 250 (AQUALON). Optou-se por este polímero pelo
seu caráter não iônico compatível com o caráter também não iônico das ceras auto-
emulsionantes. Em outras formulações (Tabela 2) adicionou-se um agente de
consistência graxa, especificamente a cutina DSP 6B ® (ICPQ; 1999) que
corresponde ao diestearato de polietilenoglicol 6000; suas principais características
são o caráter não iônico, propriedades espessantes e emulsionantes, excelente
compatibilidade com a epiderme e mucosas, bem como a capacidade de diminuir o
potencial de irritação dos tensoativos aniônicos.
Como emoliente, fase oleosa, foi empregado em todas as formulações o
Crodamol GTCC ® (CRODA; 2001) que se constitui de uma mistura de triglicerídeos
de cadeia média, principalmente dos ácidos cáprico e caprílico, derivados do óleo de
coco, saturados, possuindo baixa viscosidade. Como resultado esses óleos fluídos
adquirem importantes propriedades de espalhamento e emoliente proporcionando
seu uso como alternativa aos óleos minerais e vegetais. Além disso, segundo
 70

SANCTIS (2000), estes óleos fluídos apresentam composição lipídica semelhante à

da pele humana, reforçando seu emprego nas formulações (Tabela 2).
Quando a experiência ou os outros estudos de armazenagem indicam que é
necessário um conservante sua seleção baseia-se no cruzamento de muitas
considerações, entre outras, as seguintes: o conservante deve ser efetivo para
prevenir o crescimento de microorganismos considerados contaminantes mais
prováveis da preparação; deve ser suficientemente solúvel em água para atingir as
concentrações adequadas na fase aquosa em sistemas com duas ou mais fases,
além de apresentar características de lipossolubilidade; a concentração necessária
do conservante não deve afetar a segurança ou o conforto do paciente quando a
preparação é administrada pela via determinada, isto é, não irritante, não
sensibilizante e não tóxico; deve ter a estabilidade adequada para manter-se nas
concentrações em que é eficaz; deve ser completamente compatível com todos os
excipientes da formulação, sem que haja interferências mútuas. Os conservantes
usualmente utilizados incluem dentre outros o metilparabeno, que apresenta
atividade antifúngica (ANSEL, POPOVICH, ALLEN, 2000). Para as formulações em
estudos foi utilizado o metilparabeno na concentração de 0,2 %.
Com a finalidade de evitar o ressecamento das formulações e evitar a perda
de água da pele, adicionou-se como agente umectante o propilenoglicol,
tradicionalmente empregado com esta finalidade (SANCTIS, 2000).
Os processos de oxidação foram prevenidos com a adição de antioxidantes
tradicionais, empregando-se deste modo nas formulações o butilhidroxitolueno
(BHT), e agentes sequestrantes também usuais, o ácido etilenodiaminotetracético
(EDTA), na forma dissódica, sendo que o uso destes agentes potencializa a ação do
conservante pela quelação de metais essenciais ao crescimento de
microorganismos (PRISTA, ALVES, MORGADO, 1991).

5.1.2 Avaliação das Características Organolépticas das Formulações Prévias

A avaliação das características organolépticas das emulsões, numeradas de
F 1 a F 10 (Tabela 9), foram efetuadas 48 horas após o preparo.
 71

Tabela 9. Características organolépticas das formulações prévias.

FORMULAÇOES_______________ CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS*______________

F1 - branca, brilhante, inodora, homogênea, com baixa consistência e pH 4,56
F2 - branca, opaca, inodora, homogênea, com boa consistência e pH 4,69
F3 - branca, opaca, inodora, homogênea, com alta consistência e pH 4,71
F4 - branca, brilhante, inodora, homogênea, com boa consistência e pH 4,92
F5 - branca, brilhante, inodora, homogênea, com alta consistência e pH 4,89
F6 - branca, brilhante, inodora,homogênea, com baixa consistência e pH 5,23
F7 - branca, opaca, inodora, homogênea, com boa consistência e pH 5,47
F8 - branca, opaca, inodora, homogênea, com alta consistência e pH 5,38
F9 - branca, brilhante, inodora, homogênea, com boa consistência e pH 5,17
FIO_______ - branca, brilhante, inodora, homogênea, com alta consistência e pH 5,11

FONTE: O AUTOR
NOTA: ENCONTRAM-SE EM NEGRITO AS CARACTERÍSTICAS NÃO DESEJADAS NA FORMULAÇÃO.

Para a escolha da formulação mais adequada avaliaram-se as características

organolépticas das formulações da tabela 2, conforme item 4.2.2 da metodologia. As
formulações F 1 e F 6, que não receberam agentes espessantes, apresentaram
baixa consistência (loção); as formulações F 2, F 3, F 8 e F 9, que receberam agente
espessante graxo, apresentam-se opacas; as formulações F 5 e F 10, que
receberam 0,5 % de agente espessante polimérico, apresentaram alta consistência e
as formulações F 4 e F 9, que receberam 0,2 % de agente espessante polimérico,
apresentaram-se adequadas para o uso; conforme mostra a Tabela 9. A formulação
escolhida para a incorporação do ácido kójico foi a formulação F 4 (Tabela 10) tendo
em vista a disponibilidade da base auto emulsionante Emulgade Wax ® para a
realização do trabalho.
 72

Tabela 10. Formulação escolhida para a incorporação do ácido kójico.

COMPONENTE CONCENTRAÇÃO FUNÇÃO

(%)
FASE 1 (OLEOSA)
Álcool cetoestearilico e álcool cetoestearílico etoxilaclo,
estearato de sorbitano e monooleato de sorbitano etoxilado 15,0 Emulsionante
(200E) - Emulgade Wax ®
Triglicerídeo do ácido cáprico e caprílico - Crodamol GTCC ® 10,0 Emoliente
Butilhidroxitolueno 0,20 Antioxidante
FASE 2 (AQUOSA)
Hidroxietilcelulose - Natrosol 250 HHR ® 0,20 Espessante
EDTA dissódico 0,20 Ag. séquestrante
p-hidroxibenzoato de metila - Nipagin ® 0,20 Conservante
Propilenoglicol 8,00 Umectante
Ácido kójico 2,00 Princípio ativo
Água deionizada q.s.p. 100g Veiculo

FONTE: O AUTOR

5.1.3 Avaliação Preliminar da Estabilidade da Formulação F 4

Para avaliação preliminar da estabilidade da formulação F 4, escolhida para
incorporação do ácido kójico, estabeleceu-se como parâmetro as análises efetuadas
48 horas após o preparo da formulação, denominado tempo zero. Conforme se
observa na Tabela 11, a formulação F 4 não apresentou nenhum ponto de
instabilidade, no tempo zero e após submetida às condições aceleradas descritas
em 4.2.3.

Tabela 11. Avaliação preliminar da estabilidade da formulação F 4 sob diversas

condições aceleradas.

CARACTERÍSTICA ESTABILIDADE
Tempo zero A/R Estufa 40°C Centrifugação
Cor branca, brilhante branca, brilhante branca, brilhante branca, brilhante
Odor inodoro inodoro inodoro inodoro
Homogeneidade presente presente presente presente
pH entre 4,5 e 5,5 entre 4,5 e 5,5 entre 4,5 e 5,5 entre 4,5 e 5,5
FONTE: O AUTOR
NOTA: A/R = AQUECIMENTO/RESFRIAMENTO (40°C / 2°C)

Cabe ressaltar que esses ensaios prévios de estabilidade foram realizados

apenas com a finalidade de selecionar a formulação e não visando a determinação
do prazo de validade da mesma, porque para este haveria a necessidade de
 73

submetê-la a outras condições, conforme citações de LACHMAN,

LIEBERMAN e KANIG (2001).
Para o desenvolvimento dos ensaios de permeação cutânea do ácido kójico é
imprescindível que haja um método de quantificação para esta substância. Pelo fato
de não ter sido encontrada na literatura uma metodologia analítica validada para
este fim, uma das etapas do trabalho foi desenvolver e validar um método analítico
que permitisse quantificar o ácido kójico na matéria-prima e na formulação.

5.2 ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA

Pela observação das características da estrutura química do ácido kójico
(Figura 4) nota-se a presença de insaturações alternadas e pares de elétrons não
ligantes, arranjo eletrônico este que caracteriza um cromóforo que, possivelmente,
absorve na região ultravioleta do espectro eletromagnético. Portanto, foi verificado
se estas características possibilitavam o desenvolvimento de um método analítico de
quantificação por espectrofotometria no ultravioleta.
Para a confirmação da presença de um cromóforo que absorva no ultravioleta
foi realizado um espectro de varredura de solução aquosa de ácido kójico na região
de 200 a 400 nm. A Figura 8 evidencia a existência de uma banda de absorção na
faixa de 260 a 305 nm, com absorção máxima em 269 nm, o que possibilita o uso da
espectrofotometria no ultravioleta para a quantificação do ácido kójico.

200.0 250.0 300.0 350.0 400.0

W a v e te n g lh (nm.)

Figura 8: Espectro de absorção no ultravioleta da solução aquosa de ácido

kójico padrão 25 ng/ml.
 74

O desenvolvimento e validação do método consistiram na definição e

avaliação de parâmetros como: faixa de linearidade, sensibilidade, robustez,
exatidão e precisão.

5.2.1 Curva Padrão do Ácido Kójico por Espectrofotometria no Ultravioleta

A faixa de linearidade e a sensibilidade do método foram verificadas através
da construção de uma curva padrão do ácido kójico, em solução aquosa, em
diferentes concentrações.
Os valores de absorvâncias destas soluções, obtidas em 269 nm, estão
demonstrados na Tabela 12 e a representação gráfica desta curva pode ser
visualizada na Figura 9.

Tabela 12. Valores de absorvância obtidos por espectrofotometria de absorção no

ultravioleta para construção da curva padrão de ácido kójico.

CONCENTRAÇAO (ug/ml) 5 10 15 20 25
P esagem 1 A 1 0,296 0,559 0,894 1,201 1,543
A2 0,294 0,600 0,893 1,202 1,543
A3 0,296 0,600 0,893 1,203 1,543
P esagem 2 A 1 0,297 0,597 0,895 1,218 1,544
A2 0,299 0,599 0,897 1,221 1,547
A3 0,299 0,599 0,894 1,206 1,549
P esagem 3 A 1 0,293 0,601 0,893 1,212 1,547
A2 0,293 0,602 0,892 1,220 1,542
A3 0,292 0,603 0,893 1,215 1,543
ABS Média 0,2947 0,6000 0,8938 1,2109 1,5446
DPR% 0,88 0,30 0,17 0,66 0,16

FONTE: O AUTOR
 75

1,6 1
1,44 -
1,28 -
1,12 -

0,96 -
A 0,8 -
0,64 -
0,48 -
0,32 -
0,16 -
0 - n ----------------------------------- 1------------------------------------1----------------------------------- 1------------------------------------1----------------------------------- 1

0 5 10 15 20 25 30

FONTE: O AUTOR
Legenda: A = Absorvãncia; C = Concentração de ácido kójico (ng/ml); n = 9; X= 269 nm; Branco = água
deionizada.

Figura 9: Representação gráfica da curva padrão de ácido kójico obtida por

espectrometria de absorção no ultravioleta (269 nm).

A curva padrão do ácido kójico apresentou um coeficiente de correlação

(r=0,9994), próximo de 1, demonstrando que há correlação linear entre as
concentrações e os valores de absorvãncia, na faixa de 5 a 25 |ag/ml.

5.2.2 Sensibilidade
A sensibilidade do método é obtida pela inclinação da curva padrão e sua
análise deve sempre ser feita comparativamente com outro método. A inclinação
obtida neste método foi de 0,06244.

5.2.3 Linearidade
A linearidade do método foi também avaliada em concentrações abaixo de
5 ng/ml e acima de 25 ng/ml, como pode ser observado na Figura 10.
 76

I) D)

o o
C
C

FONTE: O AUTOR
NOTA: I) LIMITE INFERIOR DA LINEARIDADE; II) UMITE SUPERIOR DA LINEARIDADE
Legenda; A = Absorvância; C = Concentração de ácido kójico (ng/ml); n = 6; X = 269 nm; Branco = água
deionizada

Figura 10: Representação gráfica para determinação da linearidade do método de

quantificação do ácido kójico por espectrofotometria de absorção no ultravioleta.

A curva padrão do ácido kójico obtida por espectrofotometria no ultravioleta

apresenta linearidade entre os valores de 1 e 60 ng/ml de ácido kójico, sendo esta a
faixa onde os resultados gerados são proporcionais à concentração do fármaco em
análise. São considerados satisfatórios resultados com um coeficiente de
determinação de cerca de 0,98 (CHASIN et al., 1998).

5.2.4 Robustez
É a habilidade do resultado de um método permanecer inalterado por
pequenas mudanças de parâmetros operacionais e ambientais. A robustez de um
método pode ser determinada através da análise individual ou simultânea dos
parâmetros mais sujeitos à variação.
 77

5.2.4.1 lnfluencia do pH
Em pH alcalino, a medida que aumenta o valor do pH ha uma diminuit;:ao nos
valores de absorvancias (figura 11). Esta diminuit;:ao esta de acordo com o que se
observa no espectro do ultravioleta em pH alcalino (9,0), onde pode se observar urn
deslocamento batocromico com maximo de absort;:ao em 312 nm, conforme mostra
a Figura 12.

0 ,9
0,8
0,7
0 ,6
A 0,5 **
0,4
***
0,3
0 ,2 ***
0,1
0 ~-L~~~~~~-,~~~~J-~~~~~~~

2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

FONTE: 0 AUTOR
NOTA: ** p<0,05 e *** p< 0,001
Legenda: A = Absorvfmcia; pH = pH da solucao 20 JlQ/ml de acido k6j ico; n = 9 (Media ± SD); A. = 269 nm;
Brancos = soluyoes tampao isentas de acido k6j ico.

Figura 11: Representat;:ao grafica da influencia do pH na determinat;:ao do teor de

acido k6jico por espectrofotometria de absort;:ao no ultravioleta.
 78

200.0 250.0 300.0 350.0 400.0

W ô v e le n g th ( rm )

Figura 12: Espectro de absorção nú ultravioleta da solução padrão de ácido kójico

25 n.g/ml em tampão H3BO3 KCI - NaOH (pH 9,0).

Como o ácido kójico apresenta pKa = 7,9; próximo ao pKa do fenol que é 8,2
(THE MERCK INDEX, 1983), uma possível explicação para o deslocamento
observado em pH básico seria a ionização da hidroxila enólica do ácido kójico, onde
a forma ionizada apresenta estrutura eletrônica distinta da forma não ionizada e
portanto os espectros de absorção no ultravioleta resultantes são diferentes.
Outra possível explicação para este deslocamento pode ser devido a uma
reação de adição nucleofilica a dupla ligação do carbono carbonilico que é
característico de aldeídos e cetonas. A disposição plana triangular dos grupos em
torno do átomo de carbono da carbonila significa que este está relativamente aberto
aos ataques por cima ou por baixo. A carga positiva no átomo de carbono
carbonilico significa que ele é especialmente susceptível ao ataque por um
nucleófilo. A adição nucleofilica de um reagente nucleófilo forte converte o aldeído
ou a cetona, planos triangulares em um produto tetraédrico. O aspecto importante
desta etapa é a capacidade de o átomo de oxigênio carbonilico acomodar o par de
elétrons da dupla ligação carbono-oxigênio (SOLOMONS.1994).

Os espectros do ácido kójico em pH 3,0 e pH 6,0 (Figuras 13 e 14,

respectivamente) são semelhantes, apresentando máximo de absorção em 269 nm.
 79

O método sofre influência dos valores de pH do meio, sendo por tanto mais
estável em valores de pH menores que 7,0. Em todos os experimentos de validação
desta metodologia trabalhou-se em uma faixa de pH entre 5,0 e 6,0, resultante da
solução aquosa de ácido kójico.

2GOO 2 5 0 ,0 3 0 0 ,0 3 5 0 .0 4 0 0 ,0
W a v e ie n g t h (nm .)

Figura 13: Espectro de absorção no ultravioleta da solução padrão de ácido

kójico 25 (ag/ml em tampão acetato (pH 3,0).

Figura 14: Espectro de absorção no ultravioleta da solução padrão de ácido

kójico 25 ng/ml em água (pH 6,0).
 80

5.2.4.2 lnfluemcia do tempo de leitura

A estabilidade da leitura foi tambem avaliada em funyao do tempo ap6s o
preparo da soluyao. Como pode ser observado na Figura 15, nao houve alterayao
nos valores de absorvancias lidos no periodo de ate oito horas, evidenciando que o
acido k6jico e uma substancia estavel (MAEDA, 1996).

0,65
0,585 r- r- r- r- r- r- r- r- r-
0,52
0,455
0,39
A 0,325
0,26
0,195
0,13
0,065
0
0 2 3 4 5 6 7 8
T

FONTE: 0 AUTOR
Legenda : A = Absorvancia; T = tempo de leitura da solu~o de acido k6jico 20 ~g/ml (horas); n = 9 (Media± SD);
A.=269 nm; Branco = agua deionizada.

Figura 15: Representayao grafica da influencia do tempo de leitura na determinayao

do teor de acido k6jico por espectrofotometria de absoryao no ultravioleta.

5.1.4.3 lnfluencia da temperatura

Foi avaliada a estabilidade das leituras de absorvancia nas temperaturas de 5,
20 e 35°C.
Os valores de absorvancia mostraram-se estaveis frente a estas diferentes
temperaturas (Figura 16).
 81

0,72
0,64
0,56
_T'
.... -....
0,48
A 0,4
0,32
0,24
0,16
0,08
0
5 20 35
T

FONTE: 0 AUTOR

Legenda: A = Absorvancia; T = temperatura da solucao de acido k6jico 20 J.lQ/ml (•C); n = 9 (Media ± SO);
A. = 269 nm; Branco = agua deionizada.

Figura 16: Representa9ao grafica da influemcia da temperatura na determina9ao do

teor de acido k6jico por espectrofotometria de absor9ao no ultravioleta.

Atraves da analise destes tres parametres (pH , tempo de leitura e

temperatura) pode-se dizer que 0 metoda de doseamento do acido k6jico por
espectrofotometria no ultravioleta e robusto desde que se tenha controle sabre os
valores de pH e que este esteja preferencialmente abaixo de 7,0.

5.2.5 Exatidao
A exatidao do metoda para quantifiCa9aO do acido k6jico por
espectrofotometria no ultravioleta foi verificada atraves do ensaio de recupera9ao.
Em urn primeiro momenta os resultados obtidos nao se apresentaram de
acordo com o esperado, pois a porcentagem de recupera9ao era maior do que a
adicionada a formula9ao. Devido a este fato, foi necessaria pesquisar se havia
interferencia de algum componente do veiculo na leitura das absorvancias no
comprimento de onda de 269 nm.
0 constituinte, metilparabeno (Figura 17) e o que apresenta maior
semelhan9a eletronica com o acido k6jico por possuir insatura9oes e pares de
eletrons nao ligantes, sendo o provavel interferente no ensaio de recupera9ao. 0
espectro de varredura desta substancia (Figura 18) mostra uma banda de absor9ao
na mesma faixa espectral (250 a 300 nm) que o acido k6jico, mostrando que o
 82

mesmo interfere nos valores de absorvâncias, não sendo possível a quantificação do

ácido kójico por espectrofotometria no ultravioleta quando estas duas substâncias
estão presentes no mesmo sistema.

ÇOOCH3

OH

Figura 17: Estrutura do metilparabeno (THE MERCK INDEX, 1983)

200X1 250JD 300.0 350.0 400.0

Wavetength (nm.)

Figura 18: Espectro de absorção no ultravioleta da solução aquosa do conservante

metilparabeno (Nipagin®) 25 ^g/ml.

Para a realização do ensaio de exatidão por recuperação do ativo foi utilizado

o veiculo sem o conservante, tendo em vista que os demais componentes não
mostraram absorção na região do espectro utilizada para a quantificação do ácido
kójico e por tanto não interferem neste ensaio.
 83

O método de quantificação do ácido kójico por espectrofotometria no

ultravioleta mostrou-se exato, tendo em vista que as porcentagens de recuperação
obtidas neste ensaio estão próximas de 100 % (98,33 %, 98,75 % e 99,04%) e situa-
se dentro do limite, que é considerado aceitável, de 98 % a 102 % (Tabela 13)
(Leite, 2002).

T a b e la 1 3 . Valores de absorvância e porcentagem de recuperação obtidos no teste

de exatidão

AMOSTRAS AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA

INCORPORADA 0,5% INCORPORADA 1% DE INCORPORADA 2% DE
DE PADRÃO PADRÃO PADRÃO
1,193 1,197 1,199
Absorvâncias 1,190 1,193 1,203
1,189 1,197 1,196
A Média 1,1907 1,1957 1.1993
DPR 0,17 0,19 0,29
Porcentagem de
recuperação 98,33 98,75 99,04

FONTE: O AU TO R

5.2.6 Precisão
A precisão foi avaliada através da repetibilidade e da precisão intermediária,
não sendo analisada a reprodutibilidade do método, tendo em vista que não foi
realizada uma triagem de medidas interlaboratoriais.
Os resultados do ensaio de repetibilidade apresentou valores de desvios
padrão relativo inferiores a 1 %, valor normalmente aceito, indicando que o método
apresenta boa precisão intra-dia (Tabela 14).

T a b e la 1 4 . Valores de absorvâncias obtidos na avaliação da variação intra-dia.

CONCENTRAÇAO (ug/ml) 5 10 15 20 25
A1 0,302 0,600 0,893 1,202 1,543
A2 0,301 0,603 0,895 1,200 1,542
A3 0,305 0,598 0,892 1,197 1,546
A Média 0,3027 0,6003 0,8933 1,1997 1,5437
DPR 0,69 0,43 0,17 0,21 0,13

FONTE: O A U TO R
 84

Os valores de DPR encontrados para avaliação da variação inter-dias (Tabela

15) demonstram que o método apresenta boa precisão quando realizado em dias
diferentes, por diferentes analistas e em diferentes equipamentos, tendo em vista
que os valores de DPR abaixo de 2,0% são aceitáveis (CHASIN et al., 1998).

T a b e la 15. Valores de absorvância obtidos na avaliação da variação inter-dias.

CONCENTRAÇAO (nQ/ml) 5 10 15 20 25
Dia 1 A 1 0,302 0,600 0,893 1,202 1,543
A2 0,301 0,603 0,895 1,200 1,542
A 3 0,305 0,598 0,892 1,197 1,546
Dia 2 A 1 0,307 0,602 0,899 1,207 1,551
A2 0,305 0,604 0,897 1,206 1,549
A3 0,307 0,604 0,897 1,206 1,548
A Média 0,3045 0,6018 0,8955 1,2030 1,5465
DPR 0,82 0,40 0,30 0,33 0,23

FONTE: O AUTOR

Embora tenha sido demonstrado que o procedimento é estável para a

quantificação do ácido kójico (doseamento) na matéria-prima, há limitações para a
aplicação do mesmo quando se trata de formulações contendo metilparabeno como
conservante ou outro composto que tenha um cromóforo que absorva na faixa de
200 a 300 nm.
Uma vez que um dos objetivos do trabalho era determinar o teor de ácido
kójico na forma farmacêutica, buscou-se um outro método que apresentasse maior
especificidade em relação aos componentes da formulação. Não é sempre possível
demonstrar que um procedimento analítico é especifico para um analito particular,
Neste caso a combinação de dois ou mais procedimentos analíticos é recomendada
para alcançar o nível necessário de discriminação (ICH, 1995).

5.3 MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO NO VISÍVEL PELO CLORETO

FÉRRICO
Analisando a estrutura do ácido kójico observa-se a presença de grupos com
pares de elétrons não ligantes e características estereoquímicas que guardam
algumas semelhanças com outros compostos que se têm conhecimento de que
formam compostos de coordenação com o íon férrico. Devido a isto, investigou-se a
 85

possibilidade de uma metodologia de quantificação do ácido kójico pela reação com

o cloreto férrico.
O sistema reagente contendo cloreto férrico e ácido kójico apresenta uma
banda de absorção na faixa de 400 a 600 nm, com pico máximo em 503 nm (Figura
19). Como nem a solução aquosa de cloreto férrico nem a solução aquosa de ácido
kójico absorvem nesta faixa do espectro, a banda de absorção resultante
provavelmente depende da interação destas duas substâncias.

200.0 400.0 • 600X1 800.0

W a v e le n g th (nm.)

Figura 19: Espectro de absorção do ácido kójico padrão (25 (ig/ml) pelo método do
cloreto férrico.

Quando o sistema reagente contendo cloreto férrico e metilparabeno é

submetido ao espectro de varredura, observa-se que não há nenhuma absorção na
mesma faixa do que o sistema contendo ácido kójico (400 a 600 nm), o que indica
que a presença deste conservante não interfere na medida da absorção produzida
pelo sistema contendo ácido kójico e cloreto férrico (Figura 20). Devido a isto, a
quantificação do ácido kójico utilizando esta metodologia pode ser feita tanto nas
matérias-primas quanto nas formulações farmacêuticas em que o metilparabeno
esteja presente como conservante.
 86

200.0 400.0 600.0 800.0

W a v e le n g th ( rm )

Figura 20: Espectro de absorção do metilparabeno (25 jag/ml) pelo método do

cloreto férrico.

Para que o método proposto fosse desenvolvido e validado foi realizada a

definição e a avaliação de parâmetros como: determinação da concentração de
cloreto férrico a ser utilizado, faixa de linearidade, sensibilidade, robustez, exatidão e
precisão.

5.3.1 Determinação da Influência da Concentração de Cloreto Férrico na Intensidade

de Cor na Solução com o Ácido Kójico

Com o objetivo de definir a concentração da solução de cloreto férrico mais

adequada para a obtenção de uma coloração estável com 10 0 |ig de ácido kójico, foi
efetuada a leitura das absorvâncias de diversos sistemas contendo concentrações
distintas de cloreto férrico (Tabela 16).
 87

Tabela 16. Valores de absorvãncia de sistemas contendo 10 0 ^g de ácido kójico

padrão e diferentes concentrações de cloreto férrieo.

cloreto
férrieo 90 180 270 360 460 540 630 720 810 900 990 1080 1160 1260 1360 1800
(ng/ml)
ABS 1 0,077 0,100 0,119 0,125 0,133 0,141 0,144 0,151 0,153 0,156 0,161 0,161 0,166 0,168 0,167 0,169
AB S 2 0,081 0,101 0,119 0.126 0,135 0,142 0,146 0,151 0,153 0,157 0,161 0,163 0,167 0,167 0,167 0,168

ABS 3 0,079 0,102 0,116 0,124 0,137 0,140 0,148 0,148 0,156 0,158 0,159 0,162 0,165 0,169 0,166 0,169

Média 0,079 0,101 0,118 0,125 0,135 0,141 0,146 0,15 0,154 0,157 0,160 0,162 0,166 0,168 0,167 0,169

DPR 2,53 1,00 1,47 0,46 1,48 0,71 1,37 1,15 1,12 0,64 0,72 0,62 0,60 0,60 0,35 0,34

cloreto 1890 1980 2070 2160 2250 2340 2430 2620 2610 2700 2790 2880 2970 3060 31S0 3240
férrieo
(nfl/ml)
ABS 1 0,168 0,169 0,167 0,168 0,169 0,170 0,168 0,169 0,167 0,169 0,169 0,167 0,169 0,168 0,168 0,169

ABS 2 0,169 0,169 0,168 0,168 0,168 0,168 0,169 0,167 0,168 0,167 0,169 0,168 0,170 0,168 0,167 0,169

ABS 3 0,168 0,168 0,169 0,169 0,169 0,169 0,169 0,169 0,169 0,168 0,168 0,168 0,169 0,167 0,168 0,168

Média
0,166 0,168 0,168 0,168 0,168 0,169 0,169 0,168 0,168 0,168 0,169 0,168 0,169 0,168 0,168 0,169
DPR 0,34 0,34 0.6 0,34 0,34 0.6 0,34 0,68 0,6 0.6 0,34 0,34 0,34 0,34 0,34 0,34

FONTE: O AUTOR

A curva obtida (Figura 21) demonstra que a concentração mínima de cloreto

férrieo que produz uma cor estável com 10 0 ng de ácido kójico é de 1160 ng/ml e
que um excesso de cloreto férrieo não interfere na medida das absorvâncias geradas
pelos sistemas. Com base nesta evidência, utilizou-se em todos os sistemas
avaliados concentração de cloreto férrieo de 2700 (ag/ml, garantindo desta maneira
que os sistemas apresentassem a coloração máxima que são capazes de adquirir.
 88

0 ,1 7 6 i
0 ,1 6 -
0 ,1 44 -
0 ,128 -
0,112 -

. 0 ,0 96 -
A
0 ,0 8 -
0 ,064 -
0,048 -
0,032 -
0,016 -
0-
0 360 720 1080 1440 1800 2160 2520 2880 3240 3600

FONTE: O A U TO R

Legenda: A = Afasorvância; C = concentração de cloreto férrico (ng/m l); n = 9; X = 5 0 3 nm; Branco = Sistem as

isentos de ácido kójico.

Figura 21: Representação gráfica da curva obtida para determinação da

concentração mais adequada de cloreto férrico para reagir com 10 0 jxg de ácido
kójico padrão.

5.3.2 Curva Padrão do Ácido Kójico por Espectrofotometria no visível pelo Cloreto
Férrico
A construção de uma curva padrão, por espectrofotometria no visível pelo
cloreto férrico, com sistemas contendo concentrações de ácido kójico na faixa de 5 a
30 jxg/ml permitiu verificar que este método analítico apresentou linearidade neste
intervalo, com coeficiente de correlação de 0,999541 (Figura 22)
 89

FONTE: O AUTOR
Legenda: A = Absorvância; C = concentração de ácido kójico (ng/ml); n = 9; X = 503 nm; Branco = Sistema isento
de ácido kójico.

Figura 22: Representação gráfica da curva padrão do ácido kójico obtida por
espectrofotometria no visível pelo cloreto férrico.

5.3.3 Sensibilidade
O valor da inclinação da curva padrão do ácido kójico por espectrofotometria
no visível pelo cloreto férrico é de 0,008331. Como este valor é menor que o
encontrado na curva padrão do ácido kójico no ultravioleta, para as mesmas
concentrações, pode-se afirmar que a metodologia de quantificação por
espectrofotometria no visível pelo cloreto férrico é menos sensível, e por isso não é
tão capaz de diferenciar pequenas concentrações do ativo (CHASIN et al., 1998).

5.3.4 Linearidade
A linearidade foi também avaliada em concentrações abaixo de 5 (ig/ml e
acima de 30 |ig/ml (Figura 23).
Verifica-se que o método apresenta linearidade no intervalo de concentração
de 5 a 60 jj.g/ml. Quando as absorvâncias dos valores extremos (maior que 60 ^g/ml
e menor que 5(ig/ml) são considerados, o coeficiente de correlação linear encontra-
se abaixo do valor de referência aceito que é de 0,98 (LEITE, 2002).
 90

D n)

0 0

FONTE: O AUTOR
NOTA: I) LIMITE INFERIOR DA LINEARIDADE; II) LIMITE SUPERIOR DA LINEARIDADE
Legenda: A = Absorvància; C = Concentração de ácido kójico (ng/ml); n = 6; X = 269 nm; Branco = água
deionizada.

Figura 23: Representação gráfica para determinação da linearidade do método

espectrofotométrico no visível pelo cloreto férrico.

5.3.5 Robustez
A robustez do método foi avaliada através da verificação da influência do pH,
do tempo de leitura e da temperatura nos valores de absorvâncias.

5.3.5.1 Influencia do pH
A influência do pH foi verificada apenas em pH ácido, pois o cloreto férrico em
meio alcalino, forma precipitado, o que inviabiliza a utilização do cloreto férrico para
esta aplicação.
Através da Figura 24 pode-se observar que não há diferença significativa
(p>0,05) nos valores de absorvància nos diferentes valores de pH. O pH de escolha
é o do sistema contendo a mistura reacional de cloreto férrico e ácido kójico em
água (pH 5,8), dispensando desta forma a utilização de um sistema tamponante.
 91

0,18
0,162 T
1. _I_ T
0,144
J. 1.
0,126
0,108
A 0,09
0,072
0,054
0,036
0,018
0
2 3 5,8
pH

FONTE: 0 AUTOR
Legenda: A = Absorvancia; pH = pH do sistema; n =9 (Media ± SD); /... = 503 nm; Branco = Sistemas
tamponados isentos de acido k6jico.

Figura 24: Representac;ao grafica da influencia do pH na determinac;ao do teor de

acido k6jico por espectrofotometria no visivel pelo cloreto ferrico .

5.3.5.2 lnfluencia do tempo de leitura

A estabilidade da leitura foi tambem avaliada em func;ao do tempo ap6s o
preparo dos sistemas. Como pode ser observado na Figura 25, nao houve alterac;ao
significativa nos valores de absorvancia lidos no periodo de ate oito horas.
 92

0,2
0,18
0,16 r-
rn ~ r% r- ,z ~
~ r%
0,14
0,12
A 0,1 '
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 2 3 4 5 6 7 8
T

FONTE: 0 AUTOR
Legenda : A = Absorvfmcia ; T = tempo de leitura do sistema com 20 119/ml de acido k6jico (horas); n = 9 (Media ±
SD); A. = 503 nm; Branco = Sistema isento de acido k6jico.

Figura 25: Representacao grafica da influencia do tempo de leitura na determinacao

do teor de acido k6jico por espectrofotometria no visivel pelo cloreto ferrico.

5.3.5.3 lnfluencia da temperatura

Nos valores de temperaturas testadas (5°C, 20°C e 35°C) nao foi observada
diferenca significativa nos valores de absorvfmcias, o que sugere que este
parametro, no intervale de temperatura analisado, nao influencia nesse ensaio
(Figura 26).
 93

0,18
0,16 r--
0,14
0,12
A 0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0 +-~--~----~--~--~~--~~

5 20 35
T

FONTE: 0 AUTOR
Legenda: A = Absorvancia; T = temperatura do sistema com 20 JlQ/ml de acido k6jico (•C) ; n = 9 (Media ± SD);
A. = 503 nm; Branco= Sistema isento de acido k6jico.

Figura 26: Representa9ao grafica da influencia da temperatura na determina9ao do

tear de acido k6jico por espectrofotometria no visivel pelo cloreto ferrico.

5.3.6 Exatidao
A exatidao do metoda para quantifiCa9aO do acido k6jico por
espectrofotometria no visivel pelo cloreto ferrico foi verificada atraves do ensaio de
recupera9ao.
Este metoda mostrou-se exato tendo em vista que as porcentagens de
recupera9ao de acido k6jico incorporada na formula9ao F 4 estao pr6ximas de
100% (99,1 %, 99,7% e 99,7 %) e encontram-se situados dentro do limite aceito,
que e de 98% a 102 %, conforme mostra a Tabela 17 (LEITE, 2002).
 94

T a b e la 17. Valores de absorvância e porcentagem de recuperação do ácido kójico

obtidos no teste de exatidão.

AMOSTRAS AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA

INCORPORADA 0,5% INCORPORADA 1% DE INCORPORADA 2% DE
DE PADRÃO PADRÃO PADRÃO
0,334 0,334 0,335
Absorvâncias 0,332 0,335 0,335
0,332 0,334 0,334
A Média 0,3326 0,3346 0,3346
DPR 0,34 0,17 0,17

Porcentagem de
recuperação 99,1% 99,7% 99,7%

FONTE: O AUTOR

5.3.7 Precisão
A precisão foi avaliada através da repetibilidade e da precisão intermediária,
não sendo analisada a reprodutibilidade do método, tendo em vista que não foi
realizada uma triagem de medidas interlaboratoriais.
Os resultados de repetibilidade e precisão intermediária apresentaram
desvios padrão relativos (máximo de 0,68 para a repitibilidade e menores que 0,91
para a precisão intermediária) dentro dos limites de valores aceitáveis, ou seja,
inferior a 1 % em análises realizadas no mesmo dia e inferiores a 2 % em análises
realizadas em dias diferentes, por analistas diferentes e em aparelhos distintos
(CHASIN, 1998). Estes resultados mostram que o método apresenta boa precisão
intra-dia e inter-dias (Tabela 18 e 19).

T a b e la 18. Valores de absorvância obtidos na avaliação da variação intra-dia

CONCENTRAÇAO (fig/ml) 5 10 15 20 25
A 1 0,041 0,085 0,124 0,168 0,208
A2 0,041 0,084 0,125 0,168 0,209
A3 0,042 0,085 0,125 0,167 0,209
A Média 0,0413 0,0846 0,1246 0,1676 0,2086
DPR 0,4 0,68 0,46 0,34 0,28

FONTE: O AUTOR
 95

T a b e la 19. Valores de absorvância obtidos na avaliação da variação inter-dias.

CONCENTRAÇAO (ug/ml) 5 10 15 20 25
Dia 1 A 1 0,041 0,085 0,124 0,168 0,208
A2 0,041 0,084 0,125 0,168 0,209
A 3 0,042 0,085 0,125 0,167 0,209
Dia 2 . A 1 0,041 0,084 0,125 0,167 0,210
A2 0,040 0,083 0,126 0,168 0,209
A 3 0,041 0,083 0,125 0,167 0,209
A Média 0,041 0,084 0,125 0,1676 0,209
DPR 0,91 0,74 0,69 0,61 0,56

FONTE: O AUTOR

Este método de quantificação mostrou-se satisfatório ao objetivo inicial de

permitir a quantificação do ácido kójico matéria-prima e na formulação, mesmo na
presença do conservante metilparabeno. Porém, cabe salientar que outras
formulações, diferentes da estudada, podem apresentar outros componentes que
venham interferir no método. Por tanto, é aconselhável que um método analítico seja
testado e, se necessário, adaptado para cada situação diferente daquela para qual o
método foi validado.

5.4 COMPARAÇÃO ENTRE OS DOIS MÉTODOS DESENVOLVIDOS

Comparando as duas metodologias de quantificação do ácido kójico

desenvolvidas e validadas (Tabela 20) os valores de inclinação da reta (0,06244 na
espectrofotometria no ultravioleta e 0,008331 no método espectrofotométrico no
visível pelo cloreto férrico) sugerem que o método espectrofotométrico no ultravioleta
é o mais sensível. No entanto, este apresenta a limitação de não poder ser utilizado
quando a formulação apresenta metilparabeno ou outro composto que absorva no
mesmo comprimento de onda que o ácido kójico.
 96

T a b e la 20. Comparação entre os métodos de quantificação do ácido kójico.

ULTRAVIOLETA CLORETO FÈRRICO

\^JjrtÉTO D O

PARÂMETROS
Interferência do metilparabeno Sim Não
Linearidade (|ug/ml) 1 -6 0 5 -6 0
Sensibilidade* 0,06244 0,008331
Influência do pH Sim Sim
Influência do tempo de leitura Não Não
Influência da temperatura Não Não
Exatidão Sim Sim
Precisão intra-dia Sim Sim
Precisão inter-dias Sim Sim

FON TE: O AU TO R

NO TA: * S E N S IB IL ID A D E O B T ID A P E L A IN C L IN A Ç Ã O D A C U R V A P A D R Ã O .

O pH do meio não é um fator de diferenciação dos dois métodos porque o

primeiro apresenta interferência quando o pH do meio é maior que 7,0, e o segundo
método não pode ser realizado em meio alcalino pois ocorre precipitação do
reagente.
Embora, nos parâmetros avaliados, ambos os métodos atendam os requisitos
necessários, sendo por tanto adequados, a escolha do método para a quantificação
do ácido kójico depende do sistema ou material onde o ativo está presente e da
concentração, tendo em vista que a principal diferença entre eles é a sensibilidade.

5.5 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA MATÉRIA-PRIMA

Para avaliação da qualidade da matéria-prima foram realizados ensaios de

identificação, solubilidade, ponto de fusão e determinação do teor. Os resultados
foram comparados com a especificação fornecida pelo certificado de análise do
produto e por dados na literatura (Tabela 21).
 97

Tabela 21. Parâmetros de qualidade para a matéria-prima.

PARAMETROS ESPECIFICADO RESULTADO

Características - Pó cristalino, branco-amarelado, insípido e
Organolépticas e Aspecto inodoro (1 e 2) De acordo
1. Infravermelho, com característica De acordo
semelhante ao padrão.

2. Ultravioleta, com característica De acordo

Identificação semelhante ao padrão.

3. Reação com cloreto férrico: cor rósea

De acordo
característica, semelhante ao sistema
contendo padrão.
- Solúvel em: água, HCI 0,1 M e NaOH De acordo
0,1 M.

Solubilidade - Ligeiramente solúvel em; etanol 96 % e De acordo

acetona.

De acordo
- Pouco solúvel em: éter e clorofórmio (1)
Ponto de Fusão 153°C - 154°C (2) 153,3°C
a) 98,70%
Teor 9 8 % - 1 0 2 % (2)
b) 98,93%

FONTE: O A U TO R

NOTA: (1 ) C O N F O R M E T H E IN D E X M E R C K , 1983

(2) C O N F O R M E C E R T IF IC A D O D E A N Á L IS E (A N E X O )

Legenda: a) m étodo espectrofotom étrico no ultravioleta; b) m étodo espectrofotom étrico no visível pelo cloreto

férrico.

O espectro no infravermelho do ácido kójico padrão e da matéria-prima

(Figura 27) mostraram bandas de absorção características em regiões semelhantes.
Entre essas bandas pode-se destacar: hidroxila em 3100 cm -1; CH alifático (sp3) em
2900 cm - 1 e carbonila em 1650 cm -1.
 98

102.5

95
90

85
80
75

70

65

o/oT 60

55
50
I Materia-prima
45
40 I Padrao
35

30

25
21.1
3500.0 3000 2000 1500 1000 650.0
em- I

FONTE: 0 AUTOR

Figura 27: Espectros de abson;ao no infravermelho do acido k6jico padrao e da

materia-prima.

0 espectro no ultravioleta (Figura 28) tambem mostra que a materia-prima eo

padrao apresentam pico maximo de absor9ao no mesmo comprimento de onda.
Estes resultados indicam que a materia-prima e o padrao sao a mesma substancia .

...
b
$

1 .000

O. OOOL-_ _ _ _ _...___ _ _ _ _...._-==~--........_--------1

2 00.0 250 . 0 300.0 350.0 400. 0
Wavelength (nm. )

Figura 31: Espectro de absor9ao no ultravioleta do acido k6jico padrao e da materia

prima nas concentra96es de 25 ~g/ml, em agua.
 99

5.6 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA FORMULAÇÃO F 4

A formulação F 4 foi analisada quanto suas características organolépticas,
aspecto, pH, homogeneidade e teor para avaliação da sua qualidade, conforme a
Tabela 22.

T a b e la 22. Parâmetros de qualidade para a formulação F 4.

PARAMETRO DESEJADO RESULTADO

Características
Organolépticas e Amarelo claro, brilhante e inodoro De acordo
Aspecto
Homogeneidade Sem floculação, cremação e inversão de fase De acordo
PH 5 ,0 - 6 ,0 5,37
Teor Cerca de 2 % 1,92 % *

FONTE: O AUTOR
NOTA: * OBTIDO PELO MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO NO VISÍVEL PELO CLORETO FÉRRICO.

A formulação F 4 apresentou todos os parâmetros analisados de acordo com

o desejado para que seja uma formulação adequada para veicular o ácido kójico
(Tabela 2 2 ).

5.7 PERMEAÇÃO CUTÂNEA

Ao longo da última década, inúmeros pesquisadores foram atraidos a realizar
criteriosos estudos, objetivando determinar e entender os fatores farmacinéticos,
fisico-químicos e farmacotécnicos, os quais envolvem a ação de produtos
dermatológicos.
Uma vez que a administração de produtos medicamentosos pela via cutânea
destina-se a obtenção, tanto de uma ação tópica como também sistêmica, é
primordial que se tenha uma concreta definição de qual destas ações é desejada,
visto que, os critérios para avaliação destes produtos são conceitualmente
diferentes. Um produto dermatológico é destinado a liberar o(s) princípio(s) ativo(s)
na pele para o tratamento de patologias cutâneas, assim, a pele é o órgão alvo. Do
produto dermatológico, portanto, exige-se uma máxima atuação na pele e mínima
exposição sistêmica, ou seja, é ideal que se tenha uma ótima retenção do fármaco
na pele, com pequeno ou inexistente fluxo através dela (SHAH et al., 1992b).
 100

Nos últimos anos, o ácido kójico tem ocupado uma posição de destaque entre
as substâncias usadas para o clareamento de vários tipos de hipercromias cutâneas
(ELLIS, TAN, ELLIS, 1995). Entretanto, ao lado da atividade tópica, não existem
estudos demonstrando efeitos sistêmicos e colaterais decorrentes de sua absorção
através da pele.
Na avaliação de produtos de ação dermatológica e transdérmica, testes
clínicos podem ser precedidos, e em algumas vezes substituídos, por testes in vitro.
Estes testes, devido as suas peculiaridades, permitem entender alguns fenômenos
que ocorrem entre a aplicação do produto e o efeito medido farmacologicamente, de
maneira prática, rápida e sem a interferência de fatores biológicos (WESTER,
MAIBACH, 1989).
As colocações feitas acima levaram a avaliação da formulação F 4 (Tabela
10 ) quanto à capacidade de proporcionar disponibilidade adequada do princípio ativo
em nível cutâneo, ou seja, maior retenção cutânea e menor fluxo do mesmo através
da peie.
Para tanto, foi utilizada a célula de difusão baseada no modelo de Franz
(Figura 6 ), usualmente empregada em estudos de permeação in vitro de produtos
tópicos. Neste ensaio manteve-se a temperatura constante (37°C) e agitação
magnética suficientemente vigorosa para minimizar as camadas de difusão na
interface da membrana, fato este que promoveria uma resistência adicional à difusão
do fármaco para a solução receptora (SMITH, HAIGH, 1989), e evitando a obtenção
de concentrações localizadas de fármacos.
A eleição de uma solução receptora para os experimentos in vitro depende da
solubilidade do fármaco. Com substâncias de baixa solubilidade em água pode-se
obter falsos resultados. Como o ácido kójico é muito solúvel em água, as soluções
receptoras mais indicadas são soluções tampão isotônicas com valores de pH em
torno de 7,4 e a manutenção de “sink conditions” é necessária para garantir a
obtenção de resultados efetivos (WESTER, MAIBACH, 1989).
A membrana é outro fator crítico na condução dos experimentos de
permeação in vitro. As membranas sintéticas, como as de acetato de celulose, são
indicadas para verificação das características de liberação que o veículo proporciona
ao fármaco. No entanto, trata-se de uma membrana hidrófila que não possui as
propriedades anatômicas e fisiológicas da pele. Assim, o ideal é realizar estes
 101

estudos com membranas naturais (pele humana e de animais). A pele humana

decididamente é a mais adequada para estudos in vitro. Entretanto, a dificuldade na
aquisição deste tecido e a variação biológica levaram ao emprego de peles de
animais (BRONAUGH, STEWART, 1986).
A pele da orelha de porco tem sido muito utilizada nos experimentos in vitro,
apesar de apresentar algumas diferenças anatômicas quando comparada com a
pele humana. A viabilidade de aquisição, a melhor uniformidade das amostras, bem
como a facilidade de dissecação e separação do tecido subcutâneo, contribuíram
para a eleição desta pele da orelha de porco como modelo de membrana para os
estudos de permeação (REIFENRATH ET AL., 1984).
Segundo SHAH et al. (1992) quando o material a ser empregado é semi-
sólido o espalhamento de uma quantidade finita deste produto dificilmente produziria
uma camada uniforme sobre a membrana, por isso nestas situações é aconselhável
o uso de uma “dose infinita”, ou seja, um excesso de produto.
AMERONGEN et al. (1992) utilizaram dose infinita em seus estudos de
permeação in vitro da budesonida contida em cremes e verificaram que acima de 0,9
mm de espessura de produto sobre a membrana, o perfil de permeação do fármaco
não apresentou diferença. Com base nessa evidência, o estudo de permeação foi
realizado com doses infinitas.
Para os ácidos fracos com pKa maiores que 7,5 e bases com pKa menores
que 5, a absorção cutânea é independente do pH (PRISTA, BAHIA, VILAR, 1992).
Deste modo o pKa do ácido kójico é de 7,9 a 8,03 e possivelmente o pH do meio
não influi na permeação.
A base dos experimentos in vitro de permeação cutânea é determinar as
pequenas quantidades de fármaco que atravessam as membranas ou que ficam
retidos nas mesmas. A utilização de um método analítico sensível o qual viabilizasse
o experimento foi de extrema importância. Entre os dois métodos analíticos
desenvolvidos para a quantificação do ácido kójico o método espectrométrico no
ultravioleta mostrou-se mais sensível que o método colorimétrico por cloreto férrico.
No entanto, como já discutido, o método espectrométrico no ultravioleta não é
adequado quando a formulação apresenta o conservante metilparabeno em sua
constituição. Para evitar que os resultados obtidos fossem equivocados foi utilizada
a formulação F 4 isenta de conservante no estudo de permeação in vitro.
 102

Definida a metodologia de quantificação do ácido kójico, o estudo de

permeação foi conduzido.
Para a determinação da quantidade de ácido kójico permeada foi utilizada
uma curva padrão de ácido kójico em tampão fosfato isotônico pH 7,4, obtida em
comprimento de onda de 269 nm, conforme pode ser observada na Figura 29.

FONTE: 0 AUTOR
Legenda: A = Absorvânda; C = Concentração de ácido kójico (ng/ml); n = 9; X ~ 269 nm; Branco = Solução
tampão fosfato isotônica pH 7,4.

Figura 29: Representação gráfica da curva padrão de ácido kójico em solução

tampão fosfato isotônica pH 7,4.

A Tabela 23 mostra os resultados da permeação do ácido kójico através da

pele da orelha de porco.
 103

T a b e la 2 3 . Resultados de permeação cutânea do ácido kójico através da pele da

orelha de porco.

Tempo de Permeação Formulação F 4 Solução Tampão Fosfato pH 7,4

(minutos) Quantidade Permeada/Área (ng/cm2) ± Desvio Padrão
0 0+0 0±0
5 0 ±0 15,0356 ± 8,9724
10 4,4943 ±2,3264 42,8048 ±23,8467
15 12,5078 ± 6,0947 66,8175 ±24,4639
20 24,1347 ±13,6789 87,6331 ±38,0251
25 34,8878 ±18,8362 115,3157 ± 47,0367
30 48,0875 ±29,3153 165,3106 ± 63,8456
60 104,8198 ± 52,3485 342,1763 ±136,4563
120 125,2495 ± 68,5456 603,8286 ±272,5783
180 146,0940 ±72,0042 771,8388 ± 308,0936
240 167,7364 ±83,0926 999,1512 ±361,4658
300 189,6518 ±91,6132 1260,1063 ±424,7352
360 206,6426 ±100,6478 1518,7368 ±535,3562
420 206,0733 ±101,8948 1694,9661 ±556,4768
480 205,9968 ± 102,7346 1945,3784 ±553,3520
540 206,2944 + 101,0283
600 206,5078 ±101,0127
660 206,5259 ± 103,99 64
720 205,5469 ± 98,8677

F O N TE : O A U T O R

A quantidade de ácido kójico permeado através da membrana foi

significativamente maior na solução tampão fosfato pH 7,4 do que na formulação F 4
(Tabela 23). Isto ocorre por que o perfil de permeação existente no sistema é
diferente para cada produto (Figura 30).
Apesar do perfil de permeação do ácido kójico presente na formulação F 4
demonstrar que o fluxo estabilizou após 360 minutos (6 horas), caracterizando um
produto dermatológico, ou seja, à medida que a concentração do ativo diminui, o
fluxo tende a diminuir também. Pode-se verificar que a quantidade de fármaco
permeado é muito pequena em relação ao conteúdo da formulação, indicando que
não houve esgotamento do fármaco no produto (Figura 30).
 104

2700
2600
2500
2400
2300
2200
2100
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
Q/A 1300 • Formula<;ao F 4
1200
1100
1000 Solu<;ao Tampao
900 pH 7.4
800
700
600
500
400
300
200
100
0

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840
T

FONTE: 0 AUTOR
Legenda: T =Tempo (minutes); Q/A = Quantidade de acido k6jico permeado por area (l!glcm\ n =4 (Media ±
SO) .

Figura 30: Perfil do fluxo de permeac;ao do acido k6jico atraves de pele da orelha de
porco.

Estas alterac;oes no fluxo possivelmente estejam ocorrendo devido a uma

diferenc;a na cedemcia do ativo. Provavelmente ocorre maior permeac;ao do farmaco
que esta em contato direto com a membrana e permeac;ao diferente do que nao esta
em contato com ela.
No perfil de permeac;ao do acido k6jico presente na formulac;ao observa-se
que o fluxo permanece continuo, demonstrando que existe quantidade infinita sendo
fornecida a membrana e que a velocidade de cedemcia do ativo provavelmente se
mantem constante (Figura 30).
Como as velocidades de cedencia, e consequentemente de permeac;ao,
variam de acordo com as caracteristicas da formulac;ao, foi observado urn aumento
 105

no tempo necessaria para que o fluxo se equilibre (tempo LAG) da emulsao F4 em

relac;ao a soluc;ao tampao fosfato isotonica pH 7,4 (Figura 31) (SHAH et al., 1992).
0 tempo LAG da formulac;ao F 4 foi de 8 minutos enquanto que a soluc;ao
tampao demorou apenas 3 minutos para atingir urn fluxo constante (Figura 31). A
partir do inicio da permeac;ao uniforme e possivel definir a cinetica de permeac;ao
cutanea do produto (BRONAUGH, MAIBACH, 1999).

500
• Formul at;:ao
450
Solut;: ao
400

350

300

250
Q/A
200

150

100

50

0 ~~~~~~~~~,-~----.--.--.-~--.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
-50

FONTE: 0 AUTOR
2
Legenda: T = Tempo (minutos); Q/A = Quantidade de acido k6jico permeado por area (l!g/cm ), n=4 (Media ±
SD).

Figura 31: Representac;ao grafica para determinac;ao do tempo LAG do acido k6jico
na formulac;ao F 4 e em soluc;ao tampao fosfato isotonica pH 7,4 nos ensaios de
permeac;ao cutanea.

A Tabela 24 relaciona os parametros cineticos de permeac;ao cutanea in vitro

do acido k6jico presente nas duas formula¢es em estudo atraves do modelo de
HIGUCHI (pseudo 1a. ordem) , do modelo de cinetica de 1a. ordem e do modelo de
cinetica de ordem zero.
 106

Tabela 24. Parâmetros cinéticos das curvas de permeação in vitro do ácido kójico
nas formulações em estudo.

Formulação Modelo Higuchi Cinética de ordem Cinética de 1a.

____________ _________________ zero________________ ordem______
___________ __________ J (ng/ml/cm2) r J (ng/ml/cm2) r J (ng/ml/cm2) r
F 4 - até 1 hora 14,8622 0,962952 1,196353 0,989118 0,064947 0,9570
F 4 - d e 1 a 8 horas 81,591 0,994313 29,7171 0,930774 0,27098 0,70399
Solução tampão 0,101 0,970742 4,03904 0,998334 876,1946 0,98892
Fosfato pH 7,4__________________________________________________________________

FONTE: O AUTOR
Legenda: J = Fluxo; r = coeficiente de correlação linear.

Como pode-se verificar o modelo cinético de ordem zero apresentou um

maior coeficiente de correlação (r = 0,989118) para a formulação F 4, no período de
até 1 hora, indicando que o fluxo, neste intervalo, independe da concentração do
ativo. Este modelo cinético é característico de formulações com doses infinitas
(WESTER, MAIBACH, 1989).
Porém, após a primeira hora o sistema sofreu uma alteração na cinética,
passando a ser de pseudo 1a. ordem (modelo de HIGUCHI), conforme mostra o
coeficiente de correlação (r = 0,994313) na Tabela 24. Este modelo cinético, comum
em suspensões, determina que o fluxo depende da concentração do ativo
disponível, deste modo verifica-se que ocorreu um esgotamento do fármaco em
contato com a membrana, passando a permear o fármaco em suspensão na
formulação (CHOW, KAKA, WANG, 1984).
Em relação à solução tampão, observa-se que esta apresenta coeficiente de
correlação (r = 0,998334) maior para a cinética de ordem zero (Tabela 24). Este
resultado condiz com a quantidade de fármaco presente na solução tampão e com o
fato deste estar solúvel no meio (FLYNN, 1989), não alterando o fluxo com o
decorrer do tempo (Figura 31).
Nos estudos in vitro de produtos dermatológicos é importante considerar que
as concentrações de fármacos na solução receptora, por si só, não refletem a
influência da formulação na atividade do produto. Assim, a determinação da
quantidade de fármaco retido na membrana leva a dados mais concretos, os quais
podem elucidar o grau de atividade tópica do produto (MASINI et ai., 1993).
 107

5.8 RETENÇÃO CUTÂNEA

A determinação por espectrometria no ultravileta do ácido kójico retido na pele
da orelha de porco foi realizada após a extração direta com metanol. Este
procedimento apresentou-se adequado uma vez que o ativo é solúvel em metanol e
os componentes da pele, que por sua vez foram extraídos, não interferiram no
método analítico.
A curva padrão do ácido kójico em metanol, representada na Figura 32, foi
obtida a 269 nm, para a determinação do teor de ácido kójico retido.

FONTE: O AUTOR
Legenda: A = Absorvância; C = Concentração de ácido kójico (jig/ml); n = 6; Branco = metanol

Figura 32: Representação gráfica da curva padrão do ácido kójico em metanol.

As tabelas 25 e 26 mostram os valores de retenção cutânea do ácido kójico

por grama de pele na formulação F 4 e na solução tampão fosfato isotônica pH 7,4.
 108

Tabela 25. Retenção cutânea do ácido kójico da formulação F 4.

Quantidade Peso da pele Quantidade Retida (\ig)l g

Pele Média (ng/g) ± SD
Retida (^g) (g) de peie

1 1367,5 0,033 41439,39

2 1422,0 0,037 38432,43 39852,51 ± 1510,40
3 1389,0 0,035 39685,71

FONTE: O AUTOR
NOTA: COMO BRANCO FOI UTILIZADA UMA FORMULAÇÃO ISENTA DE ÁCIDO KÓJICO

Tabela 26. Retenção cutânea do ácido kójico da solução tampão fosfato isotônico
pH 7,4.

Quantidade Peso da pele Quantidade Retida (ng)/ g

Pele Média (|ig/g) ± SD
Retida (^g) (g) de pele

1 495,29 0,035 14151,14

2 489,00 0,036 13583,33 13643,95 ± 479,77
3 501,50 0,038 13197,37

FONTE: O AUTOR
NOTA: COMO BRANCO FOI UTILIZADA UMA SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATO ISOTÔNICA pH 7,4 ISENTA DE
ÁCIDO KÓJICO

A formulação F 4 promoveu uma maior retenção cutânea que a solução

tampão, como pode ser observado na Figura 33.
 109

45000 **
.,...
40500
36000
....
3 1500
27000

QR/P moo
18000
13500
9000
4500

Soluc;ao Tampao Formulac;ao F 4

Veiculos

FONTE: 0 AUTOR
NOTA:** p< 0,01
Legenda: QRIP = Quantidade de acido k6jico retido I grama de pele (Jlg/g), n=9 (Media ± SD); A. = 269 nm.

Figura 33: Quantidade de acido k6jico retido na pele da orelha de porco ap6s oito
horas de contato com os veiculos.

A solugao tampao fosfato pH 7,4 apresentou uma retengao cutfmea menor

(Figura 33) possivelmente devido ao fato desta nao possuir nenhuma lipofilia,
dificultando a interagao do produto com os lipidios presentes na pele (SETHI, AGHA,
1993).
No entanto, com a formulagao F 4 houve retengao cutanea significantemente
maior em comparagao a solugao tampao fosfato pH 7,4. lsto ocorreu provavelmente
porque os componentes de uma emulsao, por exemplo os tensoativos e os lipidios,
apresentam afinidade e/ou interagao com os constituintes da membrana,
demonstrando as vantagens deste tipo de formulagao para produtos de uso
dermatol6gico (PRISTA, BAHIA, VILAR, 1992).
A contribuiyao do estudo de permeagao in vitro na avaliagao de
propriedades farmacocineticas de formulagoes e no desenvolvimento farmacotecnico
e inquestionavel, pois representa urn procedimento pratico, rapido e de baixo custo.
Os estudos in vitro tambem encontram aplicagao no controle de qualidade de
uniformidade de lotes de produtos dermatol6gicos na industria farmaceutica .
 110

Entretanto, deve-se ter a cautela quanto à extrapolação dos resultados obtidos para
situações in vivo. Com a metodologia in vitro pode-se fazer uma seleção prévia das
formulações antes da realização de testes clínicos.
 111

6 CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos neste trabalho pode-se concluir:

• A metodologia de quantificação do ácido kójico por espectrofotometria no

ultravioleta apresentou linearidade, sensibilidade, exatidão, precisão intra-
dia e inter-dias e robustez para soluções aquosas com pH abaixo de 7,5.

• A metodologia de quantificação do ácido kójico por espectrofotometria no

visível pelo cloreto férrico apresentou linearidade, sensibilidade, exatidão,
precisão intra-dia e inter-dias e robustez. Porém, não pode ser utilizada em
pH alcalino, pois ocorre precipitação do ferro na forma de Fe(OH)3.

• O método espectrofotométrico no visível pelo cloreto férrico apresentou

menor sensibilidade que o método espectrométrico no ultravioleta. Porém,
este tem limitações de uso quando o ativo e o conservante metilparabeno
são utilizados concomitantemente na forma farmacêutica, pois apresentam
absorções características na mesma faixa de comprimento de onda.

• O ácido kójico matéria-prima satisfez todos os parâmetros de qualidade

analisados, quando comparados ao especificado na literatura e/ou pelo
certificado de análise do fornecedor.

• A formulação F 4 apresentou dois comportamentos cinéticos. No período de

até 1 hora há um fluxo com característica cinética de ordem zero e no
período de 1 a 8 horas cinética de pseudo 1a. ordem. Isto possivelmente
ocorreu porque em um primeiro momento o ativo encontra-se em contato
direto com a membrana e nas horas subsequentes o fluxo é dependente
também da difusão do ativo na própria formulação.
 112

• Em solução tampão pH 7,4, o ácido kójico apresentou um fluxo pela

membrana característico de cinética de ordem zero. Isto provavelmente
ocorreu porque todo o ativo está solubilizado no meio e conseqüentemente
disponível para a permeação.

• Comparando as cinéticas da formulação F 4 com a da solução tampão pH

7,4 verifica-se a vantagem do uso da formulação F 4 devido a permeação
desta ser menor.

• A formulação F 4 apresentou maior retenção cutânea em comparação com

a solução tampão pH 7,4, possivelmente devido a maior interação de seus
componentes com a membrana.

• A formulação F 4 mostrou-se adequada para veicular o ácido kójico, pois

apresentou as características desejáveis de um produto para uso tópico, ou
seja, uma grande retentividade e uma pequena permeabilidade.
 113

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 Pedido : 74150
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Origem : CHINA Validade : 01/03/2002
Fabric. : 01/09/2000 DCB/DCI :
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Teste Realizado Especificação Resultado Obtido
S o lu b ilid a d e L iv re s o lu b lid a d e em água, e ta n o l, C o n fo rm e
le ve m e n te s o lú v e l em a cetona.
P o n to de fu sã o 1 5 2 - 155°C 155°C
Perda p o r secagem 2,0% m á xim o 0,15%
R e sid u o a p ó s ig n iç ã o 0,1% m á xim o 0
T eor 98,0 - 102,0% 98,63% - HPLC

Análises Realizadas pelo Fabricante

Teste Realizado Especificação Resultado Obtido
S o lu b ilid a d e L iv re s o lu b lid a d e em água, e ta n o l, C o n fo rm e
le ve m e n te s o lú v e l em a ce ton a .
P o n to de fu s ã o 1 5 2 - 155°C 153- 154°C
M etais P esados 20 p p m m áxim o C o n fo rm e
A rs è n io 2 p p m m áxim o C o n fo rm e

Perda p o r secagem 2,0% m áxim o 0,2%

R esíduo a p ó s ig n iç ã o 0,1% m áxim o 0,03%
T eor 98,0 - 102,0% 99,2%

AR M A Z E N A R EM RECIPIENTE HER M E TIC AM EN TE FECHADO

M ANTER EM LO C A L SECO E FRESCO
F a to r de C o rre çã o :

Cristiane B. Rombesso Letícia Rita Rezende

Química da Qualidade Farmacêutica Resp. CRF : 16114-SP
Data de Emissão : 11/01/2002
M antenha este C e rtific a d o em se u s a rq u iv o s p a ra fa c ilita r c o n s u lta s e ve n tu a lm e n te n e cessárias,
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