BIOQUÍMICA - CICLO DE KREBS E EFEITO WARBURG

William S. Rangel Jr. - Medicina – 2015.1

Introdução
-Em presença de oxigênio, o piruvato gerado pela glicólise sofre descarboxilação
oxidativa formando acetil CoA.
-O ciclo não funciona somente como uma via energética, mas também como
importante fonte de precursores para os blocos de construção de muitas outras moléculas.
O oxaloacetato, componente do ciclo, é também um precursor da glicose.
-A função do ciclo do ácido cítrico é colher elétrons de alta energia de moléculas
energéticas.
-O oxaloacetato, com quatro carbonos, se condensa com uma acetil CoA, com dois
carbonos, formando um ácido tricarboxílico com seis carbonos. Esse composto sofre duas
descarboxilações, liberando dois CO2, dando origem a uma nova molécula com quatro
carbonos, que será processada para regenerar o oxaloacetato, podendo assim dar início a
um novo ciclo.

A piruvato desidrogenase une a glicólise ao ciclo do ácido cítrico

-Na falta de O2, o piruvato é convertido em lactato ou etanol. Já em condições
aeróbias, o piruvato é transportado para dentro das mitocôndrias por uma proteína
carreadora localizada na membrana interna da mit. Na matriz mitocondrial, o piruvato sofre
descarboxilação oxidativa pelo complexo de piruvato desidrogenase, formando acetil CoA.
Esta reação irreversível é o elo entre glicólise-ciclo de krebs, pois a acetil CoA é a
fonte de energia para o ciclo do ácido cítrico.
Piruvato + CoA + NAD+ → acetil CoA + CO + NADH + H+
-O complexo de piruvato desidrogenase é um integrado de três enzimas.
 -A síntese de acetil CoA necessita da participação de três enzimas e cinco coenzimas
(tiamina pirofosfato - TPP-, ácido lipóico, FAD, CoA e NAD+). Esta reação ocorre em três
fases: descarboxilação oxidativa do piruvato, transferência de acetila à CoA e regeneração
da forma oxidada da lipoamida.

O ciclo de krebs oxida unidades de dois carbonos

-A citrato sintase forma citrato a partir de oxaloacetato e acetil CoA. O oxaloacetato
se condensa com a acetil CoA, formando citril CoA. Esta é hidrolisada a citrato e CoA.
A citrato sintase exibe uma cinética ordenada sequencial, pois o oxaloacetato se liga
primeiro, e depois, a acetil CoA. Isso ocorre porque a ligação com o oxaloacetato induz um
rearranjo na enzima, tornando possível o contato enzima-acetil CoA. A recém formada citril
CoA possibilita uma nova alteração estrutural, clivando a molécula e liberando citrato e CoA.
Com a saída desses produtos, a enzima volta à sua conformação inicial.
-O citrato é isomerizado a isocitrato. A hidroxila do citrato não está favoravelmente
localizada no citrato para as descarboxilações oxidativas que acontecerão. Por isso, a
aconitase transforma citrato em isocitrato. Essa reação em duas fases: uma desidratação,
formando o cis-aconitato, e uma hidratação, originando o isocitrato. Ou seja, o que
acontece é a inversão da posição da hidroxila e do hidrogênio de carbonos vizinhos,
colocando a hidroxila mais próxima do final da cadeia.
-O isocitrato é oxidado e descarboxilado a alfa-cetoglutarato. Essa é a primeira das
quatro reações de oxirredução do ciclo de krebs. A descarboxilação oxidativa do isocitrato é
catalisada pela isocitrato desidrogenase.
Isocitrato + NAD+ → alfa-cetoglutarato + CO2 +NADH
-A succinil CoA é formada pela descarboxilação oxidativa do alfa-cetoglutarato. Esta
reação é catalisada pelo alfa-cetoglutarato desidrogenase, enzima homóloga ao complexo
da piruvato desidrogenase.
Alfa-cetoglutarato + NAD+ + CoA → Succinil CoA + CO2 + NADH
-Um composto de alto potencial de transferência de fosforila é gerado a partir da
succinil CoA. A clivagem da ligação tioéster da succinil CoA é acoplada à fosforilação de um
nucleosídeo difosfato de purina, normalmente um GDP. Esta reação é catalisada pela
succinil CoA sintetase. Esta é a única etapa que origina diretamente um composto de alto
potencial de transferência de fosforila.
 Succinil CoA + Pi + GDP → Succinato + CoA + GTP
-O oxaloacetato é regenerado pela oxidação do succinato. Esta reação ocorre em
três etapas: uma oxidação, uma hidratação e uma segunda oxidação. Não somente é
regenerado o oxaloacetato, mas também mais energia é extraída na forma de FADH2 e
NADH.
-O succinato é oxidado a fumarato pela succinato desidrogenase, o aceptor de
hidrogênio é o FAD, porque a variação de energia é insuficiente para reduzir o NAD +. Essa
enzima difere das outras do CK por ser parte integrante da membrana interna da
mitocôndria, além de estar diretamente ligada à cadeia transportadora de elétrons. O
FADH2 produzido pela oxidação do succinato não se dissocia da enzima, seus dois elétrons
são transferidos diretamente ais aglomerados Fe-S da enzima, que por sua vez passa os
elétrons para a coenzima Q (um membro importante da cadeia transportadora, que passa
elétrons para o último aceptor, o oxigênio molecular.
-A etapa seguinte é a hidratação do fumarato, formando L-malato. Essa reação é
catalisada pela fumarase.
-Finalmente, o malato é oxidado, formando oxaloacetato. Esta reação é catalisada
pela malato desidrogenase.
Malato + NAD+ → Oxaloacetato + NADH

Reação global do ciclo do ácido cítrico

Acetil CoA + FAD + GDP + Pi + 2 H2O + NAD+ → 2 CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + 2 H+
+ CoA
 A entrada no ciclo de krebs e no metabolismo através dele é controlada
-O complexo de piruvato desidrogenase sofre regulação alostérica e por fosforilação
reversível. A glicose pode ser formada a partir do piruvato. Contudo, a formação da acetil
CoA a partir do piruvato é uma etapa irreversível nos animais e, portanto, eles são incapazes
de converter a acetil CoA de volta à glicose. Altas concentrações dos produtos das reações
do complexo inibem a enzima (NADH, acetil CoA e até ATP).
O principal mecanismo da regulação do complexo é a modificação covalente. A
fosforilação do componente da piruvato desidrogenase por uma cinase (uso de ATP)
específica interrompe a atividade do complexo. A desativação é revertida pela ação de uma
fosfatase.
ADP e piruvato ativam a desidrogenase por inibir a cinase. Além disso, a fosfatase,
que ativa a piruvato desidrogenase, é estimulada por Ca2+, o mesmo sinal que inicia a
contração muscular.
A fosfatase também pode ser estimulado por hormônios. No fígado, a epinefrina se
liga a um receptor adrenérgico alfa, iniciando a via do fosfatidil inositol, causando um
aumento na concentração de Ca2+, ativando a fosfatase. Em tecidos capazes de sintetizar
ácidos graxos, como o hepático e o adiposo, a insulina, hormônio que denota saciedade,
estimula a fosfatase, aumentando a conversão de piruvato em acetil CoA (que é um
precursor para a biossíntese de ácidos graxos).
-O ciclo de krebs é controlado em vários pontos. O primeiro deles é a isocitrato
desidrogenase. A ligação de ADP, isocitrato, NAD+ e Mg2+ aumentam a afinidade com o
substrato. Ao contrário, ATP e NADH inibem a enzima. A inibição desta leva a um aumento
de citrato, pois a interconversão de isocitrato em citrato é prontamente reversível em
condições intracelulares. O citrato, então, pode ser transportado para o citoplasma, onde
sinaliza a fosfofrutocinase a parar a glicólise e onde ele serve como fonte de acetil CoA para
a síntese de ácidos graxos.
O segundo ponto de controle é a alfa-cetoglutarato desidrogenase. Esta enzima é
inibida por succinil CoA (seu produto), NADH e ATP. Torna-se evidente, portanto, que a
velocidade do ciclo geralmente é reduzida quando a célula tem um alto nível de ATP.
 O ciclo de krebs é uma fonte de precursores de biossínteses
-Os intermediários do ciclo de krebs têm de ser repostos, se forem retirados para
biossínteses. Por exemplo, se muito oxaloacetato for transformado em aminoácidos e a
célula aumentar sua necessidade energética, mais oxaloacetato será formado pela
carboxilação do piruvato, em uma reação catalisada pela piruvato desidrogenase. Essa
enzima é ativa na presença de acetil CoA.
Efeito Warburg

(Essa parte eu fiz por último e fiquei com preguiça, mas achei muito interessante,
então fiz um compilado do que achei na web)

-Células tumorais realizam muita glicólise.

-Uma fração da glicólise captada pelo tumor segue uma via alternativa (via das
pentoses), formando blocos de construção (ác. nucleico) para a replicação da célula.
Obs.: A via das pentoses é uma via alternativa da oxidação da glicose-6-fosfato, que leva à
produção de 3 compostos: CO2, NADH e ribose-5-fosfato.

-O tumor cria uma região de baixo pH (protege contra o sistema imune).

-Em células tumorais, a PDH cinase está muito ativa, inibindo a produção de acetil
CoA e aumentando a produção de lactato e alanina.

-http://blog.projetosafira.org/2012/12/04/a-enzima-pkm2-ativa-o-banquete-de-
acucar-do-qual-dependem-as-celulas-de-cancro/

Há muito tempo que se sabe que as células de cancro consomem grandes

quantidades de açúcar para permanecerem vivas. Enquanto as células saudáveis geram
energia utilizando algum açúcar e muito oxigênio, as células de cancro utilizam virtualmente
nenhum oxigênio e muito açúcar para produzirem energia. Desde os anos 30 que sabemos
que o açúcar está intimamente relacionado com o metabolismo das células de cancro. Na
realidade, a glicose é a matéria prima que serve de base para o combustível de todas as
células, saudáveis ou não. Mas a forma como as células de cancro obtém energia a partir
dela é diferente. O biólogo Otto Warburg ganhou em 1931 o Prêmio Nobel da Medicina por
descobrir que o metabolismo dos tumores está inteiramente dependente do consumo de
glicose. Enquanto as células saudáveis produzem energia (ATP) a partir da oxidação da
glicose, utilizando para isso o oxigênio disponível, as células de cancro fazem-no através da
fermentação, excluindo assim a necessidade de oxigênio do processo. Por ser um processo
menos eficaz para a obtenção de energia isso significa que vão precisar de mais quantidade
de glicose para produzir a mesma energia. Este mecanismo conhecido por glicólise foi aliás
explorado para servir de base para o exame PET (tomografia por emissão de positrões).
Após a introdução de glicose devidamente preparada, a máquina do exame consegue
detectar quais as regiões do corpo que consomem mais glicose. Se uma das áreas se
destacar a causa mais provável é tratar-se de cancro.

A glicólise é um sistema muito menos eficaz do que a respiração celular para se

obter energia. Através deste último mecanismo a célula produz 30 ATP’s, ao contrário da
glicólise que consegue produzir apenas 2 ATP’s com a mesma quantidade de glicose. No
entanto, muito provavelmente este sistema traz vantagens metabólicas às células que
procurem proliferar rapidamente:

● Uma vez que a glicólise acontece fora da mitocôndria, esta é

desativada interferindo assim com a apoptose.
● O ácido lático produzido durante o processo da glicólise
aumenta a acidez e diminui a eficácia no local do sistema imunitário em
identificar as células de cancro e eventualmente destruí-las. Além disso, esta
substância aumenta a capacidade do tumor invadir tecidos circundantes.
 ● O metabolismo das células de cancro está adaptado para
produção de constituintes necessários à criação de uma nova célula.

As células
de cancro, ao
produzirem
energia através da
glicólise,
conseguem
utilizar a glicose
para produzir
novas células. O
açúcar é assim
utilizado como
matéria-prima para proliferar e gerar mais células-filhas. Para conseguirem obter energia a
partir da glicose, todas as células utilizam uma enzima chamada piruvato quinase. Estudos
recentes mostram que as células de cancro passam a utilizar uma outra forma desta enzima,
a piruvato quinase M2 (PKM2), a qual utiliza a glicose para produzir mais moléculas além de
energia. Este processo metabólico modificado parece ser um aspecto fundamental de vários
cancros. Revertê-lo representa uma promissora oportunidade de tratamento.

Um estudo recente reforça a importância que a PKM2 tem no desenvolvimento do

cancro, em particular no cancro do cérebro (glioblastoma multiforme). Investigadores do
MD Anderson Cancer Center no Texas descobriram que quando a PKM2 alcança o núcleo da
célula, ativa processos metabólicos relacionados com a utilização da glicose dos quais os
tumores cerebrais dependem. Segundo um dos autores, Zhimin Lu, a PKM2 está muito ativa
durante a infância, quando é necessário um crescimento rápido das células, tornando-se
inativa quando já não é necessária. As células de cancro ativam de novo a PKM2. A presença
de PKM2 no núcleo ativa uma série de genes envolvidos na divisão celular. Este estudo
mostra como igualmente ativa a glicólise do qual os cancros dependem. Zhimin Lu diz que
“o PKM2 tem de chegar ao núcleo para ativar os genes envolvidos na proliferação das
células e o efeito de Warburg. Se conseguirmos impedir que a enzima alcance o núcleo,
poderíamos impedir esses dois mecanismos promotores de cancro”.

Num outro estudo

recentemente publicado,
uma equipa de
investigadores da
Massachusetts Institute of
Technology (MIT), identificou
compostos que inibem a
formação de tumores em
modelo animal, interferindo
com a expressão da enzima PKM2, responsável pela forma como as células de cancro
utilizam a glicose e os seus metabolitos. No estudo os autores descrevem como estes
componentes corrigem a forma como as células de cancro utilizam a glicose, inibindo o
desenvolvimento do tumor e diminuindo o tamanho do tumor em animais. O entusiasmo
pelo avanço na compreensão do metabolismo do cancro reflete-se nas palavras de
Christopher P. Austin: “os últimos anos trouxeram uma avalanche de novas descobertas que
começam a explicar um fenómeno de alteração do metabolismo das células de cancro,
descrito pela primeira vez há quase 90 anos (Otto Warburg)”. Um dos autores, o oncologista
Matthew Vander Heiden conclui dizendo que “todos os cancros têm PKM2 e compreender o
básico do metabolismo das células de cancro é essencial. Eu estou cautelosamente otimista
com o facto que conforme aprendermos sobre o metabolismo das células de cancro, assim
possamos identificar medicamentos que interfiram com o PKM2 ou outras enzimas
metabólicas a serem testados em cancros humanos”. Uma família de

Um dos fitoquímicos presentes nas uvas pretas, o resveratrol, parece interferir na

expressão do PKM2, além de agir sobre outros importantes mecanismos biológicos do
cancro tais como: indução da produção de enzimas de tipo II, paragem do ciclo celular,
indução da apoptose, inibição da angiogénese e efeitos anti-inflamatórios. Segundo um
estudo recente, o resveratrol inibe a expressão do PKM2, inibindo assim o metabolismo das
células de cancro, uma vez que esta enzima como vimos tem um papel central na regulação
do metabolismo da glicose por estas células. As células neste estudo tratadas com
resveratrol viram a sua expressão de PKM2 diminuida, e consequentemente uma
diminuição do consumo de glicose e produção de ácido láctico. Dessa forma a proliferação
destas células também se viu inibida. O estudo conclui dizendo que os resultados obtidos
estabeleceram uma ligação entre o resveratrol e a PKM2. Dessa forma ampliou o potencial
terapêutico deste componente. Os resultados sugerem que o resveratrol pode ser um
agente anticancerígeno promissor através da inibição da PKM2.

-http://www.isaude.net/pt-BR/noticia/23389/ciencia-e-tecnologia/pesquisadores-
norte-americanos-resolvem-misterio-do-efeito-warburg
Understanding Cancer Energetics

Johns Hopkins researchers solve mystery of Warburg effect

It's long been known that cancer cells eat a lot of sugar to stay alive. In fact, where
normal, noncancerous cells generate energy from using some sugar and a lot of oxygen,
cancerous cells use virtually no oxygen and a lot of sugar. Many genes have been implicated
in this process and now, reporting in the May 27 issue of Cell, researchers at the Johns
Hopkins University School of Medicine have discovered that this so-called Warburg effect is
controlled.

"It turns out to be a feed-forward mechanism, where protein A turns on B, which in

turn goes back and helps A do more," says Gregg Semenza, M.D., Ph.D., the C. Michael
Armstrong Professor of Medicine, director of the vascular program at Johns
Hopkins'Institute for Cell Engineering and a member of the McKusick-Nathans Institute of
Genetic Medicine. "PKM2 normally functions as an enzyme involved in the metabolism of
glucose, but in this case we have demonstrated a novel role in the control of gene
expression in cancer cells."

Nearly 20 years ago, Semenza's research team discovered that HIF-1 can turn on a
number of genes that that help cells survive when oxygen levels fall too low. In addition to
genes that contribute to building new blood vessels, HIF-1 also turns on genes involved in
the metabolic process that turns glucose into energy. One of those genes, pyruvate kinase
M2 or PKM2, catalyzes the first step of this metabolic process and is present only in cancer
cells.

To figure out whether and if HIF-1 and PKM2 interact, the team first engineered cells
to have or lack HIF-1. They kept them in high or low oxygen for 24 hours and found that cells
starved of oxygen, but containing HIF-1, had more PKM2 than cells without HIF-1,
suggesting that HIF-1 controls the production of PKM2.

The team then asked if HIF-1 and PKM2 physically interact with each other by
isolating one of the two proteins from cells; they found that pulling one out also resulted in
the other coming along for the ride, showing that the two proteins do in fact bind to each
other.

Knowing that the primary function of HIF-1 is to bind DNA and turn on specific genes,
Semenza's team next asked whether PKM2 somehow helped HIF-1 do that. They examined
genes known to be activated by HIF-1 in low oxygen after the removal of PKM2 and found
that without PKM2, less HIF-1 was bound to DNA.

Now armed with evidence that PKM2 helps HIF-1 turn on genes, the team looked at
the activity of genes directly involved in the metabolic pathway that burns so much sugar in
cancer cells and compared genes known to be activated by HIF-1 with those not affected by
HIF-1. Removing PKM2 from cells had no effect on genes not controlled by HIF-1 but
reduced the activity of HIF-1-controlled genes.

"These results were really astounding," says Semenza. "In addition to solving the
long-standing mystery of the Warburg effect, we also discovered that PKM2 may play a far
broader role in promoting cancer progression than has been appreciated before."
 -
http://www.hopkinsmedicine.org/news/media/releases/cancer_cells_reprogram_energy_n
eeds_to_grow_and_spread_study_suggests
Cancer Cells "Reprogram" Energy Needs to Grow and Spread, Study Suggests

Release Date: May 7, 2007

Studying a rare inherited syndrome, researchers at Johns Hopkins have found that
cancer cells can reprogram themselves to turn down their own energy-making machinery
and use less oxygen, and that these changes might help cancer cells survive and spread.

The Hopkins scientists report that the loss of a single gene in kidney cancer cells
causes them to stop making mitochondria, the tiny powerhouses of the cell that consume
oxygen to generate energy.

Instead, the cancer cells use the less efficient process of fermentation, which
generates less energy but does not require oxygen. As a result, the cancer cells must take in
large amounts of glucose. The appetite of cancer cells for glucose is so great that it can be
used to identify small groups of tumor cells that have spread throughout the body.

Although changes in mitochondria have been described in many cancers, the

Hopkins study shows for the first time how a cancer-causing mutation can block their
production.

“There must be a strong advantage to cancer cells to stop using a highly efficient
process in favor of one that generates much less energy,” says Gregg Semenza, M.D., Ph.D.,
professor of pediatrics and director of the vascular biology program in theInstitute for Cell
Engineering at Johns Hopkins.

But turning down the “thermostat” in a sense, may give the cancer cell a survival
edge. Reporting in the May 8 issue of Cancer Cell, Semenza and his colleagues found that if
they reversed the switch and forced kidney cancer cells to start making mitochondria again,
the cells produced increased amounts of free radicals, which can cause cells to stop dividing
or even die.

Semenza’s team uncovered the mitochondrial mechanism in a study of Von Hippel-

Lindau (VHL) syndrome, caused by a single gene mutation and characterized by the
tendency to develop tumors in many parts of the body, including the kidney, brain and
adrenal glands.

Semenza and colleagues measured mitochondria content and oxygen use in kidney
cancer cells that contain no VHL protein and in the same cells with VHL “engineered” back
in. Restoring VHL caused the cells to make two to three times more mitochondria and use
two to three times more oxygen.

VHL normally blocks the action of HIF-1, a protein that the Hopkins group discovered
in 1992. Cells normally make HIF-1 only under low oxygen conditions, when fermentation is
necessary to make energy. However, in the absence of VHL, HIF-1 is active even when
oxygen is plentiful and switches on genes that help a cell take up more glucose.

This current work shows that excess HIF-1 counteracts a protein called MYC, which
normally stimulates cells to make mitochondria. “Because MYC is turned on in many other
cancers, these results suggest that shutting down the mitochondria must be a very
important event in kidney cancer,” Semenza notes.

There is currently no treatment available for patients with advanced kidney cancer.
Scientists at pharmaceutical companies, the National Cancer Institute, and laboratories at
Hopkins and other universities are investigating whether drugs that inhibit HIF-1 may be
useful for cancer therapy.
 -
http://www.hopkinsmedicine.org/news/media/releases/need_oxygen_cells_know_how_to
_spend_and_save
Need Oxygen? Cells Know How to Spend and Save

Release Date: April 5, 2007

Researchers at Johns Hopkins have discovered how cells fine-tune their oxygen use
to make do with whatever amount is available at the moment.

Too little oxygen threatens life by compromising mitochondria that power it, so
when oxygen is scarce, cells appear to adjust by replacing one protein with an energy-
efficient substitute that “is specialized to keep the motor running smoothly even as it begins
to run out of gas,” says Gregg Semenza, M.D., Ph.D., a professor of pediatrics and director of
the vascular biology program in the Institute for Cell Engineering at Hopkins. “This is one
way that cells maintain energy production under less than ideal conditions.” A report on the
work is in the April 6 issue of Cell.

“Cells require a constant supply of oxygen,” Semenza says, “so it’s vital for them to
quickly react to slight changes in oxygen levels.” The protein-swap is how they do it.

In the mitochondria, the tiny powerhouses found in every cell, energy is produced by
passing electrons through a series of relay stations called cytochromes until they eventually
join with oxygen to form water. This final step is directed by the protein cytochrome c
oxidase, or COX for short. If electrons react with oxygen before reaching COX, they generate
“free radicals” that can damage or destroy cells. The mitochondria are designed to produce
energy without excess free radical production at normal oxygen levels.

Semenza’s team noticed that one particular component of the COX protein complex,
COX4, comes in two different forms, COX4-1 and COX4-2. Under normal oxygen conditions,
the cells’ mitochondria contain mostly COX4-1. The researchers suspected that COX 4-2
might be the active protein under stressful, low-oxygen conditions, which the researchers
refer to as hypoxia.

To test the idea, the team compared the growth of human cells in normal oxygen
conditions (what’s generally present in normal room air) compared to cells grown in
hypoxia. In low oxygen, liver, uterus, lung and colon cells all made COX4-2. The researchers
then exposed mice to hypoxia for a few weeks and found that they too showed increased
levels of COX4-2.

In 1992, Semenza’s team had discovered a protein which they called HIF-1 (for
hypoxia-inducible factor 1) that cells make in response to hypoxia. HIF-1 turns on genes that
help cells survive when oxygen is low, such as during a heart attack or stroke. The
researchers set out to figure out if the sensor protein HIF-1 triggers the COX-swapping.

By examining the gene control regions of COX4, they found that the HIF-1 sensor
switched on COX4-2 activity when oxygen is low. And they learned that because COX4-1
already is in the mitochondria, the swap for COX4-2 occurs when the sensor turns on yet
another gene that produces an enzyme to specifically chew up COX4-1. Engineering human
cells to lack this enzyme and subjecting them to low oxygen, the scientists found the cells
unable to rid themselves of COX4-1.

“It’s remarkable that the one-celled yeast also swap COX subunits in response to
hypoxia, but because they lack HIF-1, they accomplish the swap in a completely different
way,” says Semenza. “This suggests that adapting mitochondria to changes in oxygen levels
may be a major challenge for most organisms on Earth.”