n.

º 7_DEZEMBRO_2010
ENCONTROS E SOCIEDADES CIENTÍFICAS
 ÍNDICE

3.
Editorial
João Varela
FICHA TÉCNICA
4.
?
?
COORDENAÇÃO CIENTIFICA
7.
João Varela (CCMAR, U. Algarve) ?
?
EQUIPA EDITORIAL
10.
Francisco Ambrósio (IBILI, U. Coimbra) ?
Graça Soveral (REQUIMTE, U. Lisboa)
?

Leonor Cancela (CCMAR, U. Algarve) 12.

Claúdio Soares (ITQB, UNL) ?
Nuno Santos (FM, U. Lisboa)
?

14.
DESIGN GRÁFICO E PAGINAÇÃO ?
?
Paulo Simão

(paulosimao@yahoo.com) 15.
?
TIRAGEM ?
Versão electrónica
21.
?
PERIODICIDADE

Quadrimestral

PROPRIETÁRIO

Sociedade Portuguesa de Bioquímica

E-MAIL

canalbq@spb.pt

URL

www.canalbq.spb.pt

2. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010
 EDITORIAL

João Varela

Graças ao convite do director cessante e actual presidente da Sociedade Portuguesa de Bioquímica, e com a
aprovação da direcção da SPB, foi me dada a oportunidade de continuar o projecto editorial da SPB, designado
por Canal bq. Esta oportunidade é, sem dúvida, um desafio e traz grandes responsabilidades. Canal bq — daí o
seu nome — foi concebido para ser um canal de comunicação da comunidade que ensina, investiga e negoceia
no grande mundo que é a bioquímica e campos afins, que vão desde a biotecnologia até à medicina. Desde o
início que um dos objectivos deste canal de comunicação é expandir a bioquímica para além da academia e uni-
dades de I&D e abraçar a Sociedade, explicando os impactos que a bioquímica tem e pode ter no “Mundo Real”.

Com este novo número, pretendo iniciar um rumo um pouco diferente dos anteriores, privilegiando mais os
artigos de revisão científica, e menos as entrevistas e os artigos de opinião, embora estes não sejam excluídos
completamente da politica editorial do Canal bq. Porém, tenho a firme intenção de manter o carácter temático
de cada número. Deste modo, este número é dedicado a um tema actual que, embora potencialmente polémico
oferece grandes promessas para o futuro, nomeadamente na área da medicina regenerativa: células estaminais.

É muito provável que a maioria de vós já tenha ouvido falar sobre células estaminais, mas talvez desconheça as
várias propriedades que as caracterizam, aplicações, funções, interacções com a bioengenharia e nanotecno-
logia, e o número de grupos que trabalham em Portugal com este tipo de células. Com este número do Canal
bq, pretende-se não só divulgar alguns grupos portugueses que realizam I&D sobre células estaminais, mas
também explicar o que elas são, para que servem, e como são (ou poderão ser) cultivadas. Os primeiros dois
artigos (Bragança et al. e Correia & Bragança) são propositadamente introdutórios ao tema, sendo escritos em
português. Os restantes, escritos em português ou em inglês, são mais específicos e aprofundam o tema. Esta
variedade de tratamentos científicos, relativamente acessíveis a estudantes e a profissionais que se interessam
por ciência, não deixam de sumarizar o melhor que se faz em Portugal e no mundo. De modo a potenciar a
compreensão dos artigos deste número, pedi aos autores que escrevessem um glossário com definições de
termos chave, introduzidos a negrito.

Espero, sinceramente, que este número seja uma importante contribuição para uma melhor compreensão das
potencialidades das células estaminais, mas também das consequências éticas a elas associadas. O modo
como as células estaminais embrionárias humanas são obtidas tem repercussões muito semelhantes às levan-
tadas pela Interrupção Voluntária da Gravidez (vulgo “aborto”), pois para as obter é necessário a destruição de
blastocistos, um estádio do desenvolvimento que antecede a formação do embrião e a placenta. Porém, neste
número são apresentadas alternativas muito promissoras às células estaminais embrionárias, que não impli-
cam a desagregação de blastocistos, resolvendo, em larga medida, este problema bioético.

Por fim, desejo agradecer aos autores que contribuíram com o produto do seu esforço, tanto na forma de textos,
como figuras e diagramas, que foram concebidas propositadamente para este número.

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 3.
 Células estaminais
e medicina regenerativa
Um admirável mundo novo
José Bragança 1,2, Álvaro Tavares 1,2 e José A. Belo 1,2

1 Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina. Universidade do Algarve, Campus de

Gambelas, 8005-139 Faro, Portugal
2 IBB-Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centro de Biomedicina Molecular e Es-
trutural, UAlg.
RESUMO
O progresso da investigação no domí- Correspondência: jebragança@ualg.pt
nio das células estaminais mostrou o
seu enorme potencial como fonte de
células ou de tecidos para terapias re- INTRODUÇÃO manas que, dada a sua capacidade de auto-
generativas, terapias génicas, desco- As células estaminais definem-se por duas renovação e diferenciação, têm um elevado
berta de novos fármacos, e identifica- propriedades básicas: a capacidade de se potencial para uso em terapia celular [1, 2]
ção dos mecanismos de aparecimento auto-renovarem indefinidamente num es- (Fig. 2, Tabelas 1 e 2).
e desenvolvimento de doenças. Nesta tado indiferenciado e a possibilidade de se
revisão, apresentamos os diversos ti- diferenciarem num ou mais tipos de células Para além das células estaminais embrio-
pos de células estaminais com as suas especializadas (Fig. 1 e Tabela 1). O traba- nárias, há ainda as células estaminais ‘’adul-
características especificas, destacando lho com células estaminais embrionárias tas’’, que servem para manter as funções dos
algumas das suas aplicações em me- (células ES, Embryonic Stem cells) de ra- tecidos e órgãos onde estão presentes, bem
dicina regenerativa e terapia celular. tinho tem sido uma ferramenta inestimável como reparar lesões nos tecidos em caso de
na compreensão dos processos do desen- trauma [1, 2] (Fig. 2). A diminuição da popula-
volvimento embrionário inicial, bem como ção de células estaminais é característica de
no estabelecimento das bases moleculares algumas doenças, por exemplo, em defeitos
da pluripotência e da auto-renovação celula- da medula óssea, devido à malignidade das
res. Para além disso, por permitir a criação células estaminais hematopoiéticas (resul-
de animais transgénicos (knock-outs) atra- tando em leucemias e linfomas) ou a defeitos
vés de recombinação homóloga, estas são genéticos nas próprias células estaminais
determinantes no estudo da função gené- hematopoiéticas (anemia de Fanconi, por
tica in vivo. Não menos importante, os es- exemplo). Outras doenças envolvem a des-
tudos das células ES de ratinho abriram o truição de tecidos que não podem ser rege-
caminho à investigação das células ES hu- nerados robustamente a partir da população

Figura 1. Propriedades das células estaminais. As células estaminais são células não especializadas que são capazes de se auto-renovar
indefinidamente, e assim dar origem a novas células estaminais não especializadas (em fundo verde), mas também têm a possibilidade
de se diferenciar em um ou múltiplos tipos de células especializadas sob condições definidas (em fundo amarelo).

4. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010
Tabela 1 – Características das células estaminais.

necessário mais investigação para se definir

protocolos de diferenciação mais eficientes,
em que seja garantida a pureza e estabilida-
de das células diferenciadas que viabilize a
sua utilização clínica.

Neste artigo de revisão, apresentamos a ter-

minologia básica, definições e conceitos da
biologia de células estaminais e destacamos
residual de células estaminais, como por caso de as células transplantadas estarem algumas das suas aplicações em medicina
exemplo a diabetes tipo 1 (devida à destruição contaminadas com células indiferenciadas, regenerativa e terapia celular (Figs. 2 e 3,
auto-imune das células pancreáticas beta). e (iii) risco de rejeição imunológica quando Tabela 2). Parecem ser inúmeras as opor-
Em alguns casos, estas doenças podem ser transplantadas em pacientes imunologica- tunidades para o uso de células estaminais
tratadas por transplante do órgão em falên- mente incompatíveis (Tabela 1). Contudo, desde a terapia celular, terapia genética, en-
cia (para tratar insuficiências cardíacas, he- em 2009, a Food Drug Administration (FDA) genharia e regeneração de tecidos, rastreio
páticas ou pancreáticas, por exemplo), ou por permitiu a realização do primeiro ensaio de novos fármacos e testes toxicológicos, até
substituição da população de células estami- clínico com células estaminais humanas à compreensão de processos do desenvolvi-
nais (como no caso de transplante de medula para o tratamento de pacientes com lesão mento embrionário precoce. As células es-
óssea). No entanto, o transplante de órgãos da medula espinal. taminais abrem o caminho a novas áreas de
apresenta várias limitações, a maior sendo investigação em ciência fundamental, trans-
a falta de dadores de órgãos e de tecidos, Recentemente foi descrita a criação de cé- lacional e em medicina.
com a dificuldade acrescida de restrições de lulas estaminais pluripotentes induzidas (iPSC,
compatibilidade entre dador e receptor. Hou- induced pluripotent stem cells) a partir de
ve, por isso, na década passada, um grande células somáticas humanas ou de ratinho ORIGEM E FONTES DE CÉLULAS ESTAMINAIS
interesse em usar células estaminais clini- através da expressão forçada de factores de Durante a embriogénese inicial, observa-
camente de modo a gerar células ou tecidos transcrição definidos como essenciais para se uma limitação gradual do potencial de
para reconstituir a população de células es- a manutenção do estado de pluripotência diferenciação das células constituintes do
taminais e para reparar os órgãos, respecti- das células ES [3-9]. De acordo com os úl- embrião (Fig. 2). O zigoto (oócito fecundado)
vamente (Fig. 2, Tabelas 1 e 2). Finalmente, timos dados, as iPSC possuem proprieda- e os blastómeros (células que constituem
uma limitação importante ao transplante de des de auto-renovação e de pluripotência a mórula no estado de 2 a 8 células) são as
órgãos tem sido a barreira imunológica, exi- semelhantes às células ES, e foram já di- únicas células totipotentes — isto é, células
gindo tratamentos de imunossupressão de ferenciadas in vitro com sucesso em vários com capacidade de originar todas as células
modo a evitar a rejeição do enxerto. A possi- tipos celulares. Em alguns casos, as células diferenciadas do organismo adulto, incluindo
bilidade de efectuar o transplante de células diferenciadas foram utilizadas para corrigir a parte fetal da placenta, o cordão umbilical
ou tecidos derivados de células estaminais deficiências de patologias humanas em ani- e as membranas extra-embrionárias. Após
adultas isoladas do próprio paciente (células mais modelo. Assim, a reprogramação de alguns ciclos de divisão celular adicionais,
autólogas) reduz essa limitação. iPSC permite a obtenção de células com as estas células totipotentes formam o blasto-
propriedades únicas das células ES, a partir cisto, uma estrutura embrionária na qual as
Muito embora as células ES humanas te- de células diferenciadas adultas do próprio células começam a especializar-se, e a per-
nham um enorme potencial para terapia paciente. Por isso, as iPSC são promissoras der o potencial de se diferenciarem em todas
celular, o seu uso clínico imediato tem sido para futuras terapias celulares tendo des- as linhagens do organismo adulto. O blasto-
dificultado por (i) considerações éticas, (ii) pertado a atenção generalizada de investiga- cisto é uma esfera oca composto por uma
risco de originarem células indesejáveis no dores e médicos (Tabela 1). No entanto, será parede de células externas (trofoblasto) que

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forma uma cavidade (blastocélio) e que en-
cerra num dos pólos um agregado de células
denominada botão embrionário. As células
do trofoblasto só são capazes de dar origem
aos tecidos extra-embrionários tal como a
placenta, ao contrário das células do botão
embrionário que vão dar origem ao epiblas-
to, precursor do embrião propriamente dito,
e que são o primórdio das três camadas ger-
minais do embrião das quais derivam todos
os tecidos e órgãos. Assim, as células do
botão embrionário são consideradas pluripo-
tentes e contêm células estaminais embrioná- Figura 2. Fontes de células estaminais embrionárias e adultas. O desenvolvimento embrionário e fetal, a manutenção da homeostase dos
órgãos e tecidos adultos ao longo da vida, e respostas do organismo a lesões são governados por vários tipos de populações de células
rias (ES) com capacidade de formar todos os estaminais. A temporização de alguns estádios do desenvolvimento (zigoto, mórula, blastocisto, embrião) em termos de horas e dias
após a fecundação do oócito estão indicados em caixas com fundo azul para seres humanos. Caixas com fundo cinzento indicam tem-
220 tipos de células que constituem um or- pos equivalentes no ratinho, quando estes diferem dos primeiros. Até ao estádio de mórula as células são totipotentes, mas começam
gradualmente a perder a capacidade de diferenciação ao longo do desenvolvimento. As células da massa celular interna do blastocisto
ganismo adulto, menos a placenta e tecidos
pré-implantado (células verdes) podem ser isoladas e cultivadas in vitro, e assim dar origem a células estaminais embrionárias (células
extra-embrionários. Por outras palavras, cé- ES) capazes de se auto-renovar. Estas células são pluripotentes, ou seja apresentam um potencial elevado de diferenciação, originando
todos os tipos celulares de um organismo adulto. As células estaminais do epiblasto (EpiSC) isoladas de blastocistos pós-implantados
lulas pluripotentes não podem dar origem a de ratinhos (indicadas em caixa com fundo laranja) têm uma capacidade restrita de diferenciação em comparação com as células ES,
mas ainda são pluripotentes e podem dar origem a células das três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme) e a
um indivíduo de maneira independente. células derivadas dessas camadas (indicadas nos quadros com fundo branco). As células ES humanas têm propriedades semelhantes
às que foram enumeradas para as EpiSC de ratinho. As células germinais embrionárias são também células pluripotentes derivadas
de células primordiais germinais, isoladas a partir de gónadas embrionárias. Muitos tecidos dos organismos adultos contêm células
As células ES isoladas e cultivadas in vitro imaturas que são referidas como células estaminais adultas ou somáticas e que servem para recompor as células perdidas por morte
celular normal do tecido ou para reparar o tecido danificado após uma doença ou lesão. Exemplos destas células estão indicados em
podem ser propagadas como linhagens de caixas de fundo roxo com os tecidos que geram referidos por baixo (a preto), bem como as patologias para as quais têm potencial tera-
pêutico (a verde). As células estaminais somáticas têm menor plasticidade em comparação com as células ES ou EpiSC, e são apenas
células estaminais embrionárias pluripo- multipotentes (ou por vezes unipotentes). As células estaminais dos tecidos fetais (neuronais, sangue do cordão umbilical ou líquido
amniótico, por exemplo) têm propriedades intermédias entre as células estaminais embrionárias e adultas em termos de potência
tentes que têm a capacidade de proliferar (indicadas em caixas com fundo azul com algumas linhagens que geram referidas por baixo a preto, e as patologias para as quais têm
indefinidamente em cultura num estado potencial terapêutico, a verde).

indiferenciado (auto-renovação)[10-13]. Es-

tabeleceu-se recentemente que, para além um blastocisto hospedeiro e contribuir para Nos tecidos e órgãos adultos dos vertebra-
das células ES habitualmente isoladas do o desenvolvimento e formação do embrião, dos superiores existem células estaminais
epiblasto antes da implantação do blasto- mas são capazes de se diferenciar em múl- adultas capazes de se auto-renovar e com
cisto no útero, também se podem derivar tiplos tipos celulares e de formar teratomas uma capacidade de diferenciação restrita a
células estaminais pluripotentes a partir do se injectadas em ratinhos adultos [14, 15]. linhagens de células específicas dos tecidos
mesmo logo a seguir à implantação (Fig. 2), As EpiSC de ratinho também se distinguem ou órgãos onde estão localizadas [1, 2] (Fig.
chamando-se-lhes células estaminais do epi- das células ES pelos genes que expressam e 2). As células estaminais adultas são ditas
blasto (Epiblast stem cells ou EpiSC) [14-16]. pelas vias de sinalização necessárias para as multipotentes e provavelmente dão origem
As células ES mantêm propriedades do epi- manter pluripotentes em cultura; vias idên- a células progenitoras de linhagens de cé-
blasto inicial, o que lhes permite contribuir ticas às necessárias para o crescimento de lulas pós-mitóticas distintas que contribuem
para a formação dum embrião quando mi- células ES humanas no estado pluripotente para a homeostase e funções específicas
cro-injectadas num blastocisto hospedeiro em cultura. Além disso, as EpiSC de ratinho do órgão. No entanto, também existem nos
e consequentemente dar origem a qualquer e as células ES humanas têm perfis de ex- testículos neo-natais ou adultos de ratinho,
das células necessárias ao desenvolvimen- pressão génica e capacidades de diferencia- e por extrapolação em seres humanos, vá-
to e formação do organismo adulto [17-20]. ção semelhantes, sugerindo que as células rios tipos de células estaminais germinais
Ao contrário das células ES, as EpiSC não ES humanas tenham também uma origem pluripotentes ou multipotentes. Finalmente,
são capazes de colonizar de maneira eficaz epiblástica pós-implantação. existem ainda as células estaminais de cancro

6. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010
 ável ao longo da vida adulta. Por exemplo, as
células estaminais neurais do sistema ner-
voso central residem no ventrículo lateral
na zona subventricular ao longo da vida pós-
natal e no giro dentado do hipocampo [25,
26]. No entanto, noutros casos a localização
das células estaminais pode ser muito mais
dinâmica, como por exemplo as células do
Figura 3. Células estaminais e terapia. Para utilização de células estaminais em terapia celular, é necessária a expansão de um grande sistema hematopoiético que em condições
número de células em cultura. As células estaminais embrionárias (ES), adultas e fetais e as iPS derivadas de células somáticas têm
a capacidade de proliferar e de se auto-renovar em cultura. As células ES são as que proliferam melhor em cultura e que dão origem quiescentes (steady-state) residem na me-
a todos os tipos de células derivados das três camadas germinativas do embrião. As células ES são células já isoladas e estabelecidas
que não são derivadas do paciente, e por isso, estas células têm um grande potencial para utilização terapêutica alogénica. As células
dula óssea e ocupam nichos facultativos,
estaminais fetais, tal como células as estaminais adultas ou somáticas contidas em muitos tecidos dos organismos adultos, podem ser
dispersos na superfície trabecular do osso
usadas para fins terapêuticos autólogos quando derivadas e usadas no próprio paciente. Estas células adultas também podem servir
para terapias de outros pacientes, neste caso sendo para transplantes alogénicos. No entanto, a capacidade de proliferação em cultura [23]. Por isso, as células estaminais hema-
destas células fetais e adultas é variável e mais limitada do que a capacidade das células estaminais embrionárias. As iPS são células
pluripotentes que poderiam ser originadas do próprio paciente e por isso seriam para fins terapêuticos autólogos e transplantes alo- topoiéticas estão constantemente em cir-
génicos. Depois da expansão das células estaminais em cultura, é preciso gerar tipos específicos de células diferenciadas, tais como
células musculares cardíacas, células do sangue ou células nervosas, através de, por exemplo, protocolos que modificam as condições culação de um compartimento da medula
de cultura e a composição química dos meios de cultura. Uma vez diferenciadas, estas células de tipos específicos ou as estruturas
que estas células formam poderiam ser transplantadas nos pacientes de maneira autóloga ou alogénica para substituir, reparar ou
óssea para outro (por exemplo, do fémur
melhorar as funções de tecidos ou órgãos danificados. à tíbia). Este movimento de um nicho para
outro permite a manutenção de células es-
que resultam da transformação de células das células estaminais [23] (Fig. 4). Este taminais hematopoiéticas em vários locais,
adultas capazes de originar e manter a mas- microambiente tridimensional influencia e e permite também uma mais eficiente ex-
sa celular de tumores [21, 22]. controla a expressão dos genes que defi- pansão do número de células estaminais
nem as propriedades estaminais, ou seja, a hematopoiéticas em resposta a estímulos. O
Finalmente, foram recentemente repro- auto-renovação ou a diferenciação [24]. Até baço e o fígado também contêm células es-
gramadas células estaminais pluripotentes recentemente, os nichos eram um conceito taminais hematopoiéticas, e, em condições
induzidas (iPSC) a partir de células somá- teórico apoiado na observação de que as normais ocorre apenas diferenciação limita-
ticas humanas ou de ratinho através da ex- células estaminais transplantadas sobrevi- da nesses órgãos. No entanto, a ocorrência
pressão forçada de factores de transcrição viam e cresciam somente em locais espe- de estímulos que induzem a hematopoiese
definidos [3-9]. As iPSC possuem as pro- cíficos, presentes em números limitados pode provocar níveis elevados de formação
priedades únicas (auto-renovação e pluri- e saturáveis, nos tecidos transplantados. de células sanguíneas no baço e no fígado,
potência) das células ES que lhes conferem No entanto, tais estruturas foram recente- indicando que estes órgãos são capazes de
um enorme potencial para futuras terapias. mente caracterizadas em diversos tecidos activar nichos facultativos que apoiam a
de invertebrados e permitiram estabelecer manutenção das células estaminais hema-
princípios que provavelmente regem o com- topoiéticas e hematopoiese a longo prazo.
NICHO DAS CÉLULAS ESTAMINAIS portamento de nichos noutros organismos. Esta capacidade de activação de nichos fa-
Por “nichos” entende-se estruturas celu- É provável que, nos organismos adultos, a cultativos não se limita ao sistema hema-
lares em tecidos e órgãos formando mi- maior parte das células estaminais estejam topoiético; por exemplo, a lesão da pele de
croambientes que fornecem sinais extrín- num estado quiescente, mas que possam um adulto pode levar à formação de novos
secos (sejam moléculas de sinalização ser activadas por factores exógenos, en- folículos capilares, que são depois coloniza-
intercelulares, ou interacções entre células trando em divisão e diferenciação e assim dos por células estaminais [27]. Foi também
estaminais e células vizinhas, ou ainda in- contribuam para a renovação de tecidos/ demonstrado que a complexidade da organi-
teracções com a matriz extracelular) que, órgãos ou para a reparação após lesão. Em zação espacial das células estaminais em-
em combinação com factores intrínsecos, alguns casos, as células estaminais ocupam brionárias em culturas, em conjunto com os
determinam o comportamento e o destino um nicho único, que é espacialmente invari- factores exógenos (LIF, FGF e TGF-β, célu-

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 7.
 Tabela 2. Aplicações terapêuticas potenciais de células para o tratamento de diversas patologias humanas adaptado da revisão feita por
Mimeault e colegas [59].

las de suporte) cria nichos ou microambien-

tes heterogéneos que influenciam o destino
das células estaminais embrionárias [28].

CÉLULAS ESTAMINAIS PLURIPOTENTES

Células estaminais embrionárias
As células pluripotentes encontram-se ape-
nas transitoriamente nos embriões porque
rapidamente se diferenciam em células so-
máticas ao longo do desenvolvimento (Fig. com as espécies, que existem entre as célu- factores de transcrição Nanog, Oct4 e Sox2,
2). Ainda assim, conseguiu-se pela primeira las ES de ratinho e humanas, e também ao os factores chave para manter as células
vez em 1981 derivar células estaminais em- uso de meios de cultura baseados nos uti- estaminais pluripotentes e que são necessá-
brionárias (células ES) pluripotentes do botão lizados para células de ratinho que não se rios para repressão da expressão de genes
embrionário de blastocisto de ratinho antes adequaram a cultura de células ES huma- promotores da diferenciação [14-16].
da implantação no útero [12, 13, 29]. As cé- nas. De facto, ao contrário das células ES de
lulas ES derivadas de uma célula única têm ratinho que se mantêm pluripotentes na pre- Células estaminais pluripotentes induzidas
a capacidade de formar todos os 220 tipos sença de LIF, a derivação de células ES hu- A clonagem da ovelha Dolly demonstrou ser
de células que constituem um organismo manas usando meio suplementado com soro possível, em mamíferos, alterar o estado
adulto, e de formar teratomas quando in- e LIF resultou em linhas celulares instáveis epigenético de um núcleo diferenciado pela
jectadas em ratinhos. Células ES de rati- que passavam rapidamente para um estado sua integração num oócito enucleado, sen-
nho foram também obtidas por isolamento diferenciado. Para a derivação a partir do do esta célula híbrida uma célula totipotente
de blastómeros individuais de embriões em botão embrionário, e para o sustento das contendo o genoma da célula diferenciada
estado de duas a oito células [30, 31]. As pri- células ES humanas em cultura, foi neces- original [35]. Propôs-se imediatamente que
meiras células ES isoladas foram cultivadas sário usar os factores de crescimento bFGF esta técnica de transferência de núcleo so-
sobre camadas de fibroblastos inactivados (basic Fibroblast Growth Factor) e Activin/ mático (SCNT, de somatic cell nuclear trans-
mitoticamente, mas ainda capazes de pro- /Nodal/TGFβ (Tumor Growth Factor beta) fer em inglês) fosse usada para a produção
duzir e secretar os factores de crescimento que permitem a activação de vias de sinali- de células estaminais (autólogas) específicas
necessários para manter as capacidades de zação necessárias à auto-renovação e proli- de pacientes para fins terapêuticos. No en-
proliferação e de pluripotência das células feração destas células em cultura [29]. Mais tanto, a aplicação de SCNT para material
ES. Estudos realizados para identificar os recentemente, foram estabelecidas linhas humano revelou-se difícil. Apenas muito re-
componentes secretados pelos fibroblastos de células estaminais pluripotentes deriva- centemente a reprogramação de células hu-
inactivados e que permitiam às células ES das a partir do epiblasto (EpiSC) de embriões manas por esta técnica resultou em células
de ratinho proliferar em cultura sem se dife- de ratinho em fase de pós-implantação (Fig. capazes de se desenvolverem até ao estado
renciar, conduziram à identificação do factor 2). Estas EpiSC diferem significativamente de blastocisto em cultura [36]. Um aspecto
inibidor de leucemia (LIF), uma citocina que das células ES de ratinho, mas no entanto positivo destes trabalhos foi a indicação que
em complemento com o soro ou com BMP partilham propriedades chave com células a reprogramação de células somáticas pode
(Bone Morphogenetic Protein, outra molé- ES humanas, tais como a derivação e a auto- ser alcançada mediante a acção de factores
cula de sinalização), é capaz de manter as renovação, que necessitam da activação das externos e por isso alguns grupos de inves-
propriedades das células ES [32, 33]. vias de sinalização FGF e Activin/Nodal, mas tigação continuaram a desenvolver rastreios
As primeiras células ES humanas só foram não da presença de LIF ou BMP [14, 15]. Em para identificação de factores proteicos ca-
derivadas em 1998 [34]. Este atraso deveu- todo o caso, as células ES de ratinho e hu- pazes de reprogramar células somáticas.
se principalmente a diferenças relacionadas manas, tal como as EpiSC, expressam os Em 2006, publicou-se o primeiro trabalho

8. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010
 equivalentes de ratinho e mostraram-se
significativamente diferentes das células de
carcinoma embrionário ratinho. Por exem-
plo, a proteína SSEA-1, um marcador de su-
perfície específico das células CE de ratinho,
está ausente nas células CE humanas que
por sua vez expressam as proteínas SSEA-3,
Figura 4. Nicho das células estaminais adultas. Os nichos formam microambientes fornecendo sinais extrínsecos (tal como moléculas SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81 [48-50]. Além
de sinalização intercelulares, interacções entre as células estaminais com a matriz extracelular, e com as células vizinhas) que em
combinação com os factores intrínsecos das células estaminais determinam o comportamento e o destino das células estaminais. disso, ao contrário das células de ratinho, as
As condições externas (temperatura, pH, componentes do soro, factores de crescimento, hormonas, glicose e oxigénio, por exemplo)
também podem influenciar o destino das células estaminais. células CE humanas são altamente aneu-
plóides, o que provavelmente é responsável
que demonstrou a possibilidade de induzir Células de carcinoma embrionário pela incapacidade destas células humanas
a reprogramação de fibroblastos de ratinho Os teratocarcinomas são tumores malignos de se diferenciarem numa ampla gama de
em células pluripotentes (iPSC) com pro- de grande raridade compostos por uma mis- tipos de celulares somáticos. No entanto,
priedades semelhantes às das células ES. A tura de células de carcinoma embrionário algumas células CE humanas foram já dife-
reprogramação obteve-se por expressão for- (CE) indiferenciadas e de células diferen- renciadas em neurónios, que foram depois
çada de quatro factores de transcrição: Oct4, ciadas que podem incluir as três camadas utilizados para tratamento de pacientes que
Sox2, Klf4 e c-Myc [5]. Depois dessa primei- germinais. Alguns trabalhos desenvolvidos tinham sofrido acidentes vasculares cere-
ra reprogramação, outros grupos já usaram em ratinhos demonstraram que as células brais (AVCs) [12], indicando um potencial das
com sucesso os mesmos factores, ou outras CE indiferenciadas funcionam como célu- células de CE humanas para terapia.
combinações, para reprogramar uma gran- las estaminais para originar as outras cé-
de variedade de células somáticas de ratinho lulas que constituem o tumor. Assim, uma Células germinais primordiais
ou humanas [29, 37, 38]. Além disso, conse- célula CE indiferenciada única é capaz de Apesar de evidências obtidas na década
guiu-se diferenciar iPSC in vitro, numa varie- auto-renovação ilimitada e diferenciação 1952-1962 de que as células germinais pri-
dade de tipos celulares que por sua vez fo- em linhagens celulares múltiplas, o que mordiais poderiam dar origem a teratocar-
ram utilizadas na correcção de deficiências também serviu para estabelecer a noção de cinomas, só em 1992 foram derivadas com
em modelos animais de patologias humanas pluripotência [42], e demonstrar a existência sucesso células embrionárias germinais (EG)
[39]. O avanço em células humanas tem sido de células estaminais de cancro. As células [51, 52]). As células EG, que são também célu-
grande e conseguiu-se, a partir de pacientes CE de ratinho expressam antigénios e prote- las estaminais pluripotentes, requerem uma
com várias doenças, reprogramar diversas ínas similares aos que estão presentes nas combinação de Stem Cell Factor (SCF), LIF e
iPSC [40]. Deste modo foi possível corrigir in células do botão embrionário de blastocistos FGF, e a presença de uma camada de células
vitro defeitos de células estaminais hemato- [43, 44]. Esta observação levou ao conceito suporte para a derivação inicial em cultura.
poiéticas de pacientes com anemia de Fan- de que as células CE são a contrapartida in As células EG de ratinho em cultura são mor-
coni [41]. As iPSC têm assim um potencial vitro das células pluripotentes presentes no fologicamente indistinguíveis das células ES
prometedor para aplicações clínicas, porque botão embrionário [45]. Algumas linhas ce- e à semelhança destas expressam SSEA-1
poderiam ser reprogramadas a partir de cé- lulares CE quando são injectadas em blas- e Oct4, e quando injectadas em blastocistos
lulas autólogas expandidas em massa e di- tocistos de ratinho, podem contribuir para contribuem para o desenvolvimento de rati-
ferenciadas no tipo celular necessário para vários tipos de células somáticas do ratinho nhos quiméricos, incluindo células germinais
a terapia do paciente (Fig. 3 e Tabela 1). No [46], embora a maioria das linhas de células [53, 54]. No entanto, ao contrário das célu-
entanto, antes da utilização clínica das iPSC CE tenham um potencial muito limitado de las ES, as células EG mantêm algumas ca-
é necessário melhorar ainda os processos contribuição ao desenvolvimento de ratinhos racterísticas originais das células germinais
de reprogramação e de diferenciação destas quiméricos [47]. As células CE humanas fo- primordiais, tal como a inteira desmetilação
células. ram derivadas posteriormente às células do genoma, a remoção do imprinting genómi-

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 9.
 CÉLULAS ESTAMINAIS ADULTAS E FETAIS uma rede complexa de factores de cresci-
De forma geral, a cada tipo de tecido cor- mento e de citocinas controla a transição en-
responde um dado tipo de célula estaminal tre o estado quiescente e o estado activado
adulta, e a lista de tecidos e órgãos dos das células EH na medula óssea. A migração
quais foram isoladas células estaminais destas células activadas da superfície en-
adultas cresce constantemente e inclui a dosteal para os nichos vasculares, permite
co, e a reactivação dos cromossomas X [53, medula óssea, o sangue periférico, o cére- a libertação rápida das células EH na micro-
55, 56]. Mais recentemente derivaram-se, de bro, a medula espinal, a polpa dentária, os vasculatura sanguínea da medula óssea, an-
testículos do ratinho neo-natal ou adulto, vá- vasos sanguíneos, o músculo esquelético, tes da migração destas células para a circu-
rios tipos de células estaminais pluripotentes o epitélio da pele e do sistema digestivo, lação periférica em condições fisiológicas e
ou multipotentes germinais com morfologia a córnea, a retina, o coração, o fígado e o patológicas. As células EH derivadas da me-
e marcadores celulares específicos típicos de pâncreas, entre outros. As células esta- dula óssea e células derivadas das células
células ES. Estas células germinais também minais adultas estão também presentes EH foram localizadas na pele, músculo, pul-
se podem diferenciar em várias linhagens de em tecidos fetais, na placenta e no cordão mões, baço, fígado, tecidos do sistema ner-
células in vitro, formar teratomas, e contri- umbilical. Nesta secção apresentamos al- voso e gastrointestinais, sugerindo que estas
buir para a formação de ratinhos quimeras, gumas fontes principais de células esta- células podem participar na regeneração de
inclusivamente na constituição de células minais adultas e fetais com potencial tera- tecidos periféricos, promovendo o sistema
germinais, quando injectadas no blastocisto. pêutico (Fig. 2, Tabelas 1 e 2). imunológico, por fusão celular adquirin-
No entanto, estas células germinais têm um do assim propriedades das células com as
estado epigenético distinto das células ES e Células estaminais hematopoiéticas quais fusionam, ou por transdiferenciação em
das células EG [57-59]. As células estaminais adultas melhor ca- células envolvidas na reparação dos tecidos
A derivação de células EG humanas foi rea- racterizadas são as células estaminais he- danificados, apesar deste último mecanismo
lizada pela primeira vez em 1998 [57], mas matopoiéticas (EH), que originam todas as não estar solidamente demonstrado [60].
o potencial de proliferação destas células a células sanguíneas tais como os eritrócitos, Durante os últimos 50 anos, as células EH
longo prazo parece ser limitado [58]. No en- linfócitos e plaquetas. As células EH estão foram extensivamente usadas para trans-
tanto, as células humanas EG com poucas sobretudo localizadas na medula óssea, no plante alogénico e para tratamento de uma
passagens em cultura apresentam a capaci- sangue periférico, mas também em alguns variedade de doenças imunes hereditárias
dade de se diferenciar in vitro em múltiplas órgãos (baço e fígado, por exemplo), e ainda ou adquiridas, tal como talassemias, anemia
linhagens celulares. As células humanas EG no sangue do cordão umbilical e na placenta falciforme, anemia de Fanconi, erros inatos
têm uma morfologia muito distinta das célu- [59]. Os monócitos e macrófagos, neutrófi- do metabolismo, anemia aplástica severa,
las ES humanas e expressam o marcador de los, basófilos, eosinófilos, eritrócitos, mega- imunodeficiência combinada severa (SCID),
superfície SSEA-1, que está ausente nas cé- cariócitos e plaquetas, e células dendríticas e outras deficiências imunológicas primárias
lulas ES humanas, mas presente nas células são gerados a partir da linhagem miéloide, (Fig. 2 e Tabela 2). O transplante de células
germinais humanas precoces [29]. Até agora, enquanto a linhagem linfóide dá origem aos EH é também amplamente utilizado para o
nenhuma das linhas de células EG humanas linfócitos T e B, e às células NK. As células tratamento de doenças hematológicas ma-
isoladas possui capacidades de formação de EH são caracterizadas pela expressão de lignas, como leucemias mielóides e linfói-
teratomas e necessitam factores de cres- marcadores de superfície celulares especí- des, outros síndromes mielo-proliferativos,
cimento diferentes daqueles necessários ficos que permitem também o isolamento doenças mielo-displásicas, linfomas, mie-
às células ES humanas, o que as distingue destas células. As células EH imaturas e lomas, e tumores sólidos, como cancro de
assim claramente das células ES. O poten- quiescentes estão localizadas na superfície células renais, cancro da mama, carcinomas
cial das células EG para terapia ainda está endosteal do osso (fina camada de células do ovário e neuroblastomas. No entanto, en-
muito pouco explorado, mas estudos recen- que reveste a cavidade medular de um osso), contrar um dador histocompatível continua
tes em modelos animais demonstraram que onde podem interagir através da formação a ser um problema para muitos pacientes
as células germinais testiculares de ratinho de junções aderentes com os osteoblastos que necessitam deste tipo de procedimento
podem ser transplantadas em animais reci- que regulam as funções das células EH [59]. terapêutico.
pientes estéreis e regenerar a espermato- As células EH também se co-localizam com
génese, indicando que estas células têm um células endoteliais na microvasculatura si- Células estaminais mesenquimais
grande potencial para tratamento de infertili- nusoidal da medula óssea. Sob estímulos As células estaminais mesenquimais (EM)
dade masculina. específicos, tais como lesões de tecidos, são células adultas multipotentes, capazes

10. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

de originar vários tipos celulares por dife- regenerativa (Figs. 2 e 3; Tabela 2), embora
renciação, incluindo condrócitos, miócitos, as propriedades de diferenciação ainda não
células adiposas, células do tecido conectivo estarem demonstradas in vivo. Além, disso
e osteoblastos. As células EM encontram-se as células EM poderam ainda ser transplan-
geralmente presentes nos tecidos conjunti- tadas nos pacientes de maneira autóloga.
vos de quase todos os órgãos, mas para fins Muito recentemente, em 2008, realizou-se
terapêuticos, são mais convenientemente o primeiro transplante de um tecido huma- estaminais neurais (EN) derivadas do sis-
isoladas da medula óssea e do sangue do no produzido a partir de células estaminais tema nervoso capazes de auto-renovação.
cordão umbilical. No entanto, embora mor- adultas mesenquimais e epiteliais do próprio Estas células são multipotentes, podendo
fologicamente semelhantes, as células EM paciente [62]. O procedimento cirúrgico foi dar origem às três principais linhagens
isoladas de diversas fontes podem ser fun- efectuado numa paciente cujo brônquio es- de células do sistema nervoso (neurónios,
cionalmente diferentes. As células EM pos- querdo tinha entrado em processo de falên- oligodendrócitos e astrócitos; Fig. 2). Em
suem uma grande capacidade de expansão cia após uma infecção de tuberculose. Con- modelos de lesão cerebral, as células EN
em cultura podendo ser estimuladas para droblastos diferenciados a partir de células proliferam nessas regiões neurogénicas,
adquirir propriedades específicas. Atra- estaminais adultas mesenquimais e células a partir de onde são capazes de migrar
vés de secreção de factores solúveis (IL-6, epiteliais retiradas da mucosa brônquica da para o local de lesão [59, 61]. A expres-
TGF-β1, factor de crescimento hepatócito, paciente foram capazes de gerar uma estru- são específica de marcadores neurais, tal
sintase induzível de óxido nítrico e prosta- tura celular à volta de uma matriz cartilagi- como a nestina, permite isolar e purificar
glandinas, por exemplo) e de interacções di- nosa obtida da traqueia de um dador (limpa células EN e progenitores neurais a partir
rectas com células do sistema imunológico, de todas as suas células originais). As cé- de embriões, tecidos de cérebro fetais ou
as células EM têm propriedades anti-infla- lulas epiteliais e estaminais mesenquimais adultos, para serem expandidas em cultu-
matórias e imunomoduladoras, suprimindo adultas (isoladas a partir da medula óssea ra. Evidentemente, para uma terapia celu-
a actividade de células T citotóxicas, células da paciente) depositadas sobre a compo- lar autóloga baseada em células EN, estas
B e células NK. Dadas essas propriedades, nente cartilaginosa entraram num processo fontes de células EN são de utilização pou-
as células EM estão a ser testadas no tra- de maturação e diferenciação e formaram co conveniente. No entanto, foram também
tamento de pacientes com lúpus eritema- um tubo brônquico em cultura. Uma sec- encontradas células EN na polpa dentária,
toso sistémico, esclerose múltipla, doença ção desse tubo brônquico foi transplantada no periodonto [63, 64] (tecidos que rodeiam
de Crohn, esclerose lateral amiotrófica e para substituir a parte atrofiada do brônquio e suportam os dentes) e na mucosa olfac-
diabetes de tipo 1, que são doenças inflama- esquerdo da paciente e consequentemente tiva, que já foram facilmente recolhidas por
tórias auto-imunes. Além das propriedades ajudar a paciente na recuperação de funções meio de biopsias nasais. Os neurónios da
anti-inflamatórias e imunomoduladoras, respiratórias. Este ensaio clínico, único até mucosa olfactiva têm uma regeneração rá-
mostrou-se que as células EM têm efeitos agora, demonstra que a conjugação da dife- pida e contínua, de modo que constituem
benéficos sobre a regeneração de órgãos renciação de células estaminais adultas com uma fonte ideal de células EN para reparar
(tal como o fígado e coração), provavelmen- biomateriais apropriados poderá, a médio lesões da medula espinal e do cérebro. O
te através de efeitos parácrinos, criando um prazo, gerar soluções terapêuticas funcio- transplante de células de tipo neural que
ambiente favorável à recuperação funcional nais na área da medicina regenerativa que promovem o crescimento e regeneração
das células endógenas dos órgãos e tecidos, não eram possíveis até agora. Terapias des- dos axónios olfactórios (Olfactory Enshea-
promovendo também a angiogénese e limi- te tipo também eliminam o risco de rejeição thing Cells) isoladas da mucosa olfactiva,
tando a remodelação cardíaca [59, 61]. Em dos novos tecidos por parte dos pacientes, e no local de lesão de pacientes com lesões
condições específicas de cultura, foi ainda evitando assim a necessidade de utilização da medula espinal — as quais resultam
demonstrada a capacidade destas células de de imunossupressores cujos efeitos secun- muitas vezes em deficiências motrizes
se diferenciarem em outros tipos celulares, dários podem ser graves (como a hiperten- permanentes, para- ou tetraplegia, e defi-
tais como cardiomiócitos, células neuronais, são arterial, insuficiência renal e mesmo ciências sensoriais, ou ambas — contribuiu
células pulmonares, células beta das ilhotas aparecimento de tumores). para o melhoramento do estado clínico de
pancreáticas e células epiteliais, por exem- alguns pacientes [65].
plo. Por esses motivos, as células EM têm Células estaminais neurais As células EN têm também um grande
um grande potencial para terapias diver- A zona subventricular dos ventrículos late- potencial para tratamento de várias do-
sas e são cada vez mais testadas para um rais e a zona subgranular do giro dentado enças neurológicas e neurodegenerativas
número maior de aplicações em medicina do hipocampo contêm nichos com células até agora incuráveis, tal como a doença

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 metabólicas hereditárias, anemias e imu- adultos [70]. O isolamento das células da
nodeficiências). O potencial terapêutico das MCU pode ser facilmente efectuado a partir
células ECU foi também confirmado em do estroma ou da matriz do cordão umbili-
modelos animais de diabetes, doenças car- cal, bem como do subendotélio da veia do
díacas (enfarte do miocárdio), doenças ce- cordão umbilical. Microscopicamente estas
rebrovasculares e neuronais (AVC e doença células podem ser identificadas através
de Parkinson (degeneração progressiva dos de Alzheimer, por exemplo), mas a utilidade da sua morfologia característica (parecida
neurónios produtores de dopamina, um neu- clínica destas células em pacientes huma- com os fibroblastos que crescem aderen-
rotransmissor que tem como função estimu- nos ainda se encontra em análise, e neste tes a uma superfície) e pela identificação
lar o sistema nervoso central). A “levodopa”, momento decorrem vários ensaios clínicos de marcadores específicos presentes na
que é convertida em dopamina no cérebro, para testar o seu efeito regenerativo. membrana destas células. No entanto, a
é a base actual do tratamento da maioria característica mais importante, para fins
dos pacientes com a doença de Parkinson, As células do Sangue do Cordão Umbilical terapêuticos, das células EM do cordão
mas a maior parte destes pacientes acaba (SCU) contêm essencialmente células es- umbilical, em relação ás células EM iso-
por perder a capacidade de resposta a este taminais hematopoiéticas com capacidade ladas em tecidos já adultos, é não possu-
tratamento. Por outro lado, o transplante de de se diferenciar em células sanguíneas írem um Complexo Maior de Histocompa-
neurónios diferenciados, produtores de do- (glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e tibilidade completo, uma vez que os genes
pamina no cérebro, não é uma opção viável plaquetas, tal como as células homologas do subgrupo II e um gene do subgrupo I
uma vez que s ó uma pequena percentagem adultas), células vasculares (endoteliais e (HLA-DR) estão ausentes. Esta caracterís-
de neurónios sobrevivem à transplanta- do músculo liso) bem como em outras linha- tica é extremamente importante quando se
ção. Por isso o transplante de progenito- gens não directamente ligadas ao sistema trata da compatibilidade entre o dador e o
res neurais primários (isolados de tecidos hematopoiético [59, 69]. A baixa incidência receptor para transplantes alogénicos (Fig.
ou órgãos) derivados por diferenciação de de rejeição das células do SCU por parte dos 3), porque assim, mesmo não havendo uma
outras células estaminais (células ES, iPS, pacientes transplantados, em comparação histocompatibilidade completa entre o da-
por exemplo) constituem o futuro para trata- com transplantes de células corresponden- dor e o paciente receptor, a probabilidade
mento de doenças neurodegenerativas [65]. tes dos organismos adultos (isoladas a par- de ocorrer rejeição por parte do receptor é
As células EN fetais humanas, isoladas do tir da medula óssea ou sangue periférico), praticamente nula.
mesencéfalo geram neurónios dopaminér- apresenta uma grande vantagem para utili- O esforço actual para se estabelecerem
gicos funcionais após transplante no estria- zação do sangue do cordão umbilical como bancos públicos de células de sangue do
do de pacientes com a doença de Parkinson fonte de células fetais EH para terapia. Esta cordão umbilical caracterizadas irá permi-
[66-68]. Além disso, as células EN fetais têm propriedade permite, ainda, a utilização de tir uma disponibilização mais fácil e mais
uma capacidade imuno-activadora e tumo- células do SCU, em transplantes, com uma rápida de células EH e EM para transplan-
rogénica pouco elevada. maior disparidade em termos do Complexo tes e futuras terapias celulares.
Maior de Histocompatibilidade (HLA) relati-
Células estaminais fetais do cordão umbilical vamente às células EH da medula óssea. No Células estaminais de cancro
As células estaminais do cordão umbilical entanto, o número pouco elevado de células As células estaminais de cancro, inicial-
(ECU) são células que, consoante a sua EH presente nas células SCU limita a utili- mente identificadas a partir de leucemias
proveniência, têm o potencial de se dife- zação destas células em pacientes adultos, mielóides agudas, apresentam marcadores
renciar em células da linhagem hemato- para o tratamento dos quais é preciso com- de superfície distintos das outras células
poiética e mesenquimal. As células ECU binar células obtidas de fontes diferentes ou tumorais também presentes no mesmo or-
multiplicam-se mais rapidamente em cul- expandir as células ex vivo. ganismo e com potencial de proliferação
tura do que as células homólogas isoladas As outras células estaminais principais do mais limitado [71]. Propôs-se então que as
da medula óssea em organismos adultos. cordão umbilical que estão presentes na células leucémicas estaminais resultariam
Para além disso, as ECU possuem grande Matriz do Cordão Umbilical (MCU) são cé- da transformação de células estaminais
plasticidade pelo que são promissoras para lulas estaminais mesenquimais (EM) que hematopoiéticas, tornando-se malignas. As
terapias celulares. Estas células têm sido constituem uma população de células va- células leucémicas estaminais encontram-
utilizadas no tratamento de doenças malig- riada, precursora de células de osso, carti- se em quantidades reduzidas nos pacientes,
nas (leucemias, linfomas, tumores sólidos) lagem, tecido adiposo e fibroso conjuntivo, são resistentes à quimioterapia e radiotera-
e não malignas (por exemplo, deficiências tal como as células EM dos organismos pia, e são capazes de recapitular leucemias

12. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

mielóides agudas quando transplantadas tuem um organismo, apresentam grandes
para ratinhos com deficiência imunológica potencialidades para o desenvolvimento de
combinada. Além do mais, foram já carac- novas terapias celulares. Assim, sob con-
terizadas outras células estaminais de can- dições específicas, as células ES poderiam
cro em tumores sólidos tal como o cancro ser utilizadas para formação de tecidos em
de mama, glioblastomas, cancro do pulmão, laboratório que serviriam consequente-
cancro dos ovários, cancro da próstata e can- mente para transplante em pacientes com ça hereditária que afecta a área central da
cro gástrico epitelial [69-75]. Com base nes- tecidos ou órgãos danificados. No entanto, retina (mácula) e que conduz à cegueira.
sas observações, foi proposto um modelo de além dos problemas técnicos ligados às Embora estes ensaios clínicos baseados em
formação do cancro baseado na existência condições de manutenção e de diferencia- células ES estejam apenas na fase inicial,
de células estaminais. Segundo este concei- ção eficiente das células ES para os tipos ou seja, são ensaios desenhados para tes-
to, a grande maioria das células num tumor celulares pretendidos, subsistem problemas tar não a eficácia das células pigmentadas
teriam um potencial de proliferação limitado éticos que têm atrasado o estudo e o desen- mas sim a segurança de tal intervenção, eles
mas a pequena população de células esta- volvimento de metodologias para aplicações constituem um passo essencial em medicina
minais de cancro possui capacidade de auto- clínicas destas células. A primeira aprovação regenerativa. Esta nova abordagem terapêu-
renovação e de proliferação. Deste modo, pela FDA (U.S. Food and Drug Administration) tica é particularmente atractiva em doenças
as células estaminais de cancro poderiam para a fase I de ensaios clínicos com células originadas pela destruição e/ou falta de re-
originar e manter a massa de células que derivadas de células ES humanas foi apenas generação de células que constituem alguns
formam o tumor. Neste modelo, o cancro é consentida em Janeiro 2009 para tratamento tecidos (tais como as doenças de Alzheimer
uma doença que envolve a desregulação da de lesões da medula espinal, em pacientes e Parkinson, diabetes, enfarte do miocárdio
auto-renovação das células estaminais nor- com lesões de menos de duas semanas. ou degeneração da retina) para as quais não
mais por mutações oncogénicas e outros Esta aprovação surgiu após um trabalho de existe actualmente nenhuma cura.
defeitos genéticos e epigenéticos [72]. As cé- investigação que mostrou que o transplante
lulas estaminais de cancro resistentes a qui- de células ES humanas em ratos com lesões No entanto, a utilização de células estaminais
mioterapia explicam ainda as recorrências da medula espinal induz a recuperação loco- adultas em medicina está mais adiantada,
de tumores e até as metástases, podendo motora desses animais[74]. No entanto, este certamente dado ao facto que a utilização de
expandir-se formando tumores secundários ensaio está suspenso desde Agosto 2009 células estaminais adultas levantou menores
[73]. Procura-se agora identificar marca- pela FDA, devido a cistos microscópicos que problemas éticos do que a utilização de célu-
dores de superfície celular específicos das foram observados em alguns dos animais las ES. A menor plasticidade e capacidade de
células estaminais tumorais que permitam transplantados. Mais recentemente, o trans- proliferação das células estaminais adultas é
o seu isolamento e expansão em cultura de plante de células do epitélio pigmentar da uma desvantagem comparativamente às cé-
modo a poder-se proceder ao seu estudo e retina, derivadas de células ES humanas, no lulas embrionárias, limitando a possibilidade
a compreender-se as diferenças existentes espaço sub-retinal dos olhos de ratos com de expansão ex vivo que garanta a obtenção
nas vias de sinalização de células estaminais degeneração gradual do epitélio pigmentar de bancos de células necessários para tera-
normais e tumorais. Espera-se que um co- da retina, resultou na recuperação da visão pias celulares. Mas esta limitação pode tam-
nhecimento aprofundado dessas vias condu- de todos os animais transplantados. Os ratos bém ser um factor positivo, evitando os pro-
za à identificação de fármacos visando a des- foram injectados com as células derivadas blemas de formação de tumores inerentes as
truição selectiva de células tumorais sem das células ES humanas antes da degenera- células ES. Infelizmente, a maior parte das
afectar as células normais, o que seria um ção da retina ser iniciada, mostrando a capa- células estaminais adultas estão presentes
avanço importante para terapias anti-cancro cidade das células humanas transplantadas em pequenas quantidades e são difíceis de
mais adaptadas às necessidades específicas em preservar os fotoreceptores cuja dege- isolar e caracterizar pelo que a viabilização
de cada paciente. neração acontece inevitavelmente nos ani- do uso deste tipo de células está dependente
mais não tratados[75, 76]. Estes resultados do orgão-fonte. Finalmente, a possibilidade
promissores para tratamento de cegueiras de isolamento de certas células estaminais
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO causadas por degeneração da retina levaram adultas do paciente, permite o seu uso em
As células ES, com a capacidade de pro- a FDA aprovar, no início de 2010, o segundo condições autólogas, limitando por isso a ne-
liferar de maneira eficaz em cultura e a ensaio clínico baseado em células derivadas cessidade de imunossupressão.
possibilidade única de dar origem a todas de células ES humanas para tratamento da As células estaminais isoladas da medula
células e a todos os tecidos que consti- distrofia macular de Stargardt, uma doen- óssea apresentam actualmente uma maior

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 13.

 taminais adultas humanas com potencial iPSC podem também ajudar a prevenção e
terapêutico, tais como as células de tecidos gestão de doenças de forma personalizada
adiposo e polpa dentária [77]. para o paciente, permitindo revelar meca-
A reprogramação de células somáticas em nismos sobre o desenvolvimento da doença
iPSC, que têm um potencial semelhante ao e assim definir os fármacos mais apropria-
das células ES, superaram quase todas as dos para combater a doença. Podem ainda
prevalência de utilização em terapia, por se- preocupações éticas ligadas à origem em- permitir a correcção de defeitos genéticos
rem células mais facilmente identificadas, brionária das células ES humanas, e deram in vitro, antes de serem usados para trans-
isoladas, e capazes de proliferar relativa- um impulso novo à investigação para a uti- plante autólogo ou alogénico.
mente bem em cultura. No entanto, nos úl- lização de células pluripotentes em terapia. Em conclusão, as células estaminais, prin-
timos anos, as células estaminais do sangue As iPSC oferecem também a possibilidade cipalmente células estaminais adultas e
do cordão umbilical tornaram-se uma fonte de novos tratamentos terapêuticos autó- fetais, já estão a ser utilizadas em diver-
alternativa, e por vezes preferida, de células logos com células reprogramadas a partir sas terapias. A reprogramação das células
estaminais hematopoiéticas para pacientes de células somáticas do próprio paciente. adultas em iPSC vai certamente contribuir
sem dadores de medula óssea compatíveis e No entanto, vários obstáculos importantes para um rápido progresso na utilização de
para crianças. Estas células, bastante plás- devem ser ultrapassados antes das iPSC células estaminais pluripotentes em tera-
ticas e menos imunogénicas do que as es- poderem ser usadas em aplicações clíni- pias futuras. No entanto, a possibilidade de
taminais hematopoiéticas da medula óssea, cas. A maioria dos métodos actuais de re- utilização terapêutica das células estami-
são facilmente isoladas a partir do cordão programação são baseados na expressão nais está ainda sub-explorada, devido à fal-
umbilical, que foi durante muito tempo um exógena de proteínas (factores de transcri- ta de conhecimentos fundamentais sobre
tecido desaproveitado e considerado apenas ção) com potencial oncogénico através de os mecanismos moleculares e biológicos
como um excedente do parto. Por esta razão, vectores retrovirais integrativos, que eles que regem as propriedades de prolifera-
estão agora a ser armazenadas e conserva- próprios podem causar cancro quando se ção e de diferenciação destas células e,
das por criopreservação em bancos de insti- integram no genoma e perturbam a expres- mais recentemente, da reprogramação de
tuições públicas e privadas, para possibilitar são de genes endógenos. Porém, já foram células adultas. Porém, os esforços actu-
e facilitar o uso destas células de sangue desenvolvidos alguns métodos alternativos ais para compreender esses mecanismos,
do cordão umbilical em terapias. Conside- de disseminação dos factores de reprogra- para estabelecer métodos mais seguros e
rando a variabilidade genética existente na mação, como a utilização de adenovírus mais eficazes para o isolamento, a purifi-
população portuguesa, estima-se que 8 mil (não integrativos) ou plasmídios, com ou cação e a caracterização das células es-
amostras seriam suficientes para abranger sem o uso de pequenas moléculas incenti- taminais ou células derivadas das células
a diversidade desta população. Em Portu- vadoras. Recentemente até foi conseguida estaminais vão contribuir, nos próximos
gal, foi criado o Banco Público de Células do com sucesso a reprogramação de células anos, para o desenvolvimento de terapias
Cordão Umbilical nas instalações do Centro somáticas com proteínas recombinantes celulares cada vez mais audaciosas e com-
de Histocompatibilidade do Norte (Despacho produzidas e purificadas em bactérias. plexas. A grande promessa a alcançar com
n.º 14879/2009. DR 126 SÉRIE II), tendo sido Foi também demonstrado que, consoante este domínio da tecnologia das células es-
já recolhidas e preservadas 1400 dádivas de o tipo de células utilizadas para reprogra- taminais será o tratamento de doenças e
cordão umbilical. Em Março de 2009 Portu- mação e a adição de compostos químicos, lesões incuráveis até agora.
gal fez a transposição para a ordem jurídica menos de quatro factores podem ser sufi-
interna das Directivas nºs 2004/23/CE, do cientes para a reprogramação das iPSC.
Parlamento Europeu e do Conselho, de 31 de GLOSSÁRIO
Março, 2006/17/CE (Lei n.º 12/2009. DR n.º Além do potencial das iPSC para uso directo Alogénico – Relativo a tecidos, células ou
60, Série I) em que a Assembleia da Repúbli- em terapias celulares, a reprogramação de proteínas originados ou derivados de dado-
ca estabelece o regime jurídico da qualidade células somáticas de pacientes que sofrem res que não são o próprio paciente (receptor).
e segurança relativa à dádiva, colheita, análi- de doenças multi-factoriais complexas Aneuplóide – Relativo a células que sofre-
se, processamento, preservação, armazena- (como o diabetes mellitus tipo 1 juvenil e a ram alterações do seu material genético,
mento, distribuição e aplicação de tecidos e doença de Parkinson) oferece uma oportu- contendo um número de cromossomas di-
células de origem humana. Noutros países, nidade única para estudar e modelizar os ferente do normal.
estão a ser desenvolvidas a criopreservação acontecimentos e mecanismos molecula- Antigénio – Partículas ou moléculas capa-
e a criação de bancos de outras células es- res envolvidos no desenvolvimento da. As zes de provocar uma resposta imune.

14. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

Autólogo – Relativo a tecidos, células ou lar interna que se diferencia para formar
proteínas que foram originados ou deriva- as três camadas germinais do embrião das
dos do próprio paciente, sendo este dador quais derivam todos os tecidos e órgãos.
e receptor. Hematopoiético – Relativo às células do
Auto-renovação – A capacidade das células sangue.
estaminais de passar por diversos ciclos de Imprinting genómico – Mecanismo (epi)ge-
divisão celular e manter o estado indiferen- nético pelo qual certos genes são expres- têm capacidade de dar origem a todas as
ciado. sos somente por um alelo, enquanto o outro células diferenciadas do organismo adulto,
Blastocisto – Estrutura embrionária precoce está inactivado por metilação do DNA. Por incluindo a parte fetal da placenta, o cordão
esférica formada por uma camada externa exemplo, as células germinais masculinas umbilical e as membranas extra-embrio-
de células (trofoblasto), que irá dar origem à e femininas de mamíferos têm padrões de nárias.
placenta, e que encerra no seu interior uma imprinting genómico diversos mas comple- Transdiferenciação – Alteração de um tipo
população de células internas denominada mentares. de célula diferenciada para outro tipo de
massa celular interna, a partir do qual se In vitro, In vivo e Ex vivo – Termo que des- célula com forma e função diferente.
derivam as células estaminais embrionárias. creve um processo que ocorre num tubo de Unipotente – Propriedade de células capa-
Células estaminais adultas ou somáticas – ensaio em bioquímica, que também é usa- zes de se diferenciarem num único tecido.
Células estaminais localizadas em vários do pelos biólogos para se referir às célu- Zigoto ou Ovo – Célula diplóide que contém
tecidos do organismo adulto que se man- las que crescem em cultura em condições reservas nutritivas e que,resulta da união
têm num estado indiferenciado, ou não controladas (in vitro) fora de um organismo dos núcleos do óvulo e do espermatozóide.
especializado, com capacidade de auto- (in vivo). O termo ex vivo, refere-se a expe- O zigoto dá origem a um novo indivíduo (em-
renovação e de se diferenciar para originar rimentações ou medições feitas em tecidos brião) através de várias divisões mitóticas.
todos os tipos de células especializadas do ou células num ambiente artificial fora do
tecido onde estão presentes. organismo com o mínimo de alteração das
Células estaminais de cancro – Células can- condições naturais. AGRADECIMENTOS
cerosas presentes nos tumores ou cancros Multipotente – Propriedade das células que Os autores desejam reconhecer o apoio do
hematológicos com características asso- podem dar origem a um número limitado Departamento de Ciências Biomédicas e
ciadas às células estaminais normais, e de tipos de células. Medicina durante a sua recente instalação
que têm a capacidade de dar origem a to- Nicho – Microambiente (in vivo ou in vitro) na Universidade do Algarve, bem como o das
dos os tipos celulares formando o tumor das células estaminais, que interage com suas Instituições anteriores, nomeadamente
onde estão presentes. as células estaminais para controlar o des- o ITQB/IBET, IST-UTL e IGC/FCG. O apoio fi-
Células estaminais embrionárias (ES) – Cé- tino das células estaminais. nanceiro ao Curso de Medicina e “Programa
lulas indiferenciadas originadas da massa Pluripotência – Potencial das células esta- de Investigação em Medicina Regenerativa”
celular interna do blastocisto do embrião minais embrionárias de dar origem a todos da Universidade do Algarve, concedido pelo
antes da implantação no útero, que têm o os tipos de célula diferenciada que consti- Ministério Ciência, Tecnologia e Ensino Su-
potencial de auto-renovação e de se dife- tuem um organismo adulto, excluindo as perior através da UMIC, I.P. – Agência para
renciar em todos os tipos de célula do orga- células de placenta e anexos embrionários. a sociedade do conhecimento, e da FCT, I.P.
nismo adulto, excepto a placenta. Pluripotente - Propriedade de células ca- – Fundação para a Ciência e Tecnologia. Os
Células estaminais do epiblasto – Células pazes de diferenciar se em todos os tecidos autores agradecem Dr Lino Ferreira (Centro
estaminais pluripotentes derivadas a partir do organismo adulto, excluindo a placenta de Neurociências e Biologia Celular, Univer-
de epiblastos de blastocistos logo a seguir e anexos embrionários. sidade de Coimbra), o Dr João Facucho-Oli-
à implantação com capacidade de auto- Teratocarcinoma – tumor maligno de célu- veira (IBB/CBME, Universidade do Algarve) e
renovação. las germinais geralmente localizadas nas o Dr João Varela (CCMAR, Universidade do
Células estaminais pluripotentes induzidas gónadas, constituído por elementos de Algarve) pela revisão crítica do manuscrito.
(iPSC) – Células somáticas reprogramadas tecido de uma ou mais das três camadas José Bragança agradece a Câmara Muni-
em células com propriedades semelhan- germinais, e derivado de células germinais cipal de Oeiras pela atribuição do prémio
tes às das células estaminais embrionárias pluripotentes. «Professor António Xavier 2009» e a Funda-
através da expressão forçada de factores de Teratoma – forma benigna de teratocarci- ção Merck Sharp & Dhome - Portugal pela
transcrição. noma. contribuição ao desenvolvimento do projecto
Epiblasto – Tecido derivado da massa celu- Totipotente – Propriedade de células que “miPS: reprogramming mouse adult cells”.

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 15.

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canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 17.

 Células estaminais
adultas em medicina
Ricardo Correia 1 e José Bragança 1,2

1 Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina. Universidade do Algarve, Campus de

RESUMO Gambelas, 8005-139 Faro, Portugal
Todos os tecidos e órgãos presentes 2 IBB-Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centro de Biomedicina Molecular e Es-
no nosso organismo são constituídos trutural. Universidade do Algarve, Campus de Gambelas, 8005-139 Faro, Portugal
por células especializadas, que se di-
ferenciaram a partir de células menos Correspondência: jebragança@ualg.pt
especializadas do embrião, as chama-
das células estaminais. É também com
elas que contamos, para a regeneração INTRODUÇÃO As células estaminais adultas possuem as
dos nossos órgãos e tecidos ao longo da Propriedades das Células Estaminais Adultas mesmas características básicas de todas as
vida. As células estaminais responsáveis As células estaminais são células capazes de células estaminais, como a capacidade de se
pela manutenção dos nossos tecidos e se auto-renovarem e de se diferenciarem em auto-renovarem e de se diferenciarem em al-
órgãos são as chamadas células esta- diferentes tipos de células ou tecidos, duran- guns tipos de células especializadas. A prin-
minais adultas ou somáticas. As células te o desenvolvimento e na idade adulta [1]. As cipal função das células estaminais adultas
estaminais adultas são classificadas em células estaminais podem ser classificadas é a manutenção e reparação dos tecidos es-
inúmeros tipos, dado cada tipo de tecido em dois grandes grupos, relativamente à sua pecíficos e órgãos onde se encontram. Elas
ou órgão ter uma população caracterís- origem: células estaminais embrionárias e cé- constituem um repositório celular que é usa-
tica de células estaminais adultas. lulas estaminais adultas. do constantemente na renovação dos vários
Muitos dos estudos pioneiros com célu- As células estaminais embrionárias têm uma tecidos e pontualmente na reparação dos
las estaminais adultas, incidiram, prin- origem embrionária e são isoladas a partir mesmos, aquando de qualquer episódio que
cipalmente, na sua identificação e isola- da massa interna de blastócitos pré-implan- interfira com o seu normal funcionamento [4,
mento a partir da enorme variedade de tados [2]. Têm um potencial de diferenciação 5]. O seu potencial de diferenciação é, intrin-
tecidos e órgãos que constitui o nosso quase ilimitado, podendo originar quase to- secamente, mais reduzido, comparativamen-
organismo. Para além da compreensão dos os tipos celulares, salvo algumas excep- te às células estaminais embrionárias [4].
dos mecanismos celulares associados ções, não podendo, por exemplo, originar cé- Normalmente, as células estaminais adul-
às células estaminais adultas, durante lulas da placenta, e são consideradas células tas, em processo de diferenciação, geram
o desenvolvimento, renovação celular estaminais pluripotentes [1]. A maioria das um tipo de célula transitória antes de atin-
e resposta aos mais diversos traumas células estaminais embrionárias foi isolada a gir o seu estádio final de diferenciação. Es-
celulares, o conhecimento da sua bio- partir de blastócitos excedentários dos pro- sas células intermediárias são chamadas de
logia, bem como a nossa capacidade de cessos de fertilização in vitro e que acabam células precursoras ou progenitoras e são
delas tirarmos partido, tem vastíssimas por ser doados para fins de pesquisa cien- células parcialmente diferenciadas que, por
aplicações terapêuticas na área da me- tífica com o consentimento informado dos divisão celular, originam apenas células dife-
dicina, quer através da sua utilização dadores. renciadas (Fig. 1).
terapêutica em várias patologias e epi- As células estaminais adultas estão presen-
sódios de trauma ou na descoberta de tes nos órgãos e tecidos fetais e adultos, e Identificação e Isolamento
novos fármacos e análise experimental assim correspondem a um grupo hetero- A Identificação de células estaminais adul-
de doenças. géneo composto por células de diferentes tas é actualmente efectuada numa enorme
proveniências, desde as isoladas a partir do variedade de tecidos e órgãos e efectua-se
sangue do cordão umbilical e da placenta através de vários critérios histológicos, mor-
até às provenientes de tecidos maduros [3]. fológicos e bioquímicos. Em condições fisio-

18. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

 são normalmente proteínas que estão pre-
sentes na superfície celular, particularmen-
te proteínas da membrana, como por exem-
plo receptores membranares. Cada tipo de
célula tem um certo arranjo de receptores à
sua superfície, que a torna distinta de outros
tipos celulares. Os cientistas tiraram depois camente no seio do tecido ou órgão original.
partido dessa idiossincrasia biológica nos Para além das técnicas acima referidas,
processos de identificação estaminal. muitas outras técnicas de biologia molecu-
Moléculas fluorescentes, muito comum- lar são utilizadas no processo de identifica-
mente anticorpos específicos capazes de ção de células estaminais adultas como por
reconhecer e aderir de forma específica exemplo a reacção em cadeia da polimerase
aos receptores característicos das células em tempo real (RT-PCR), análises northern e
a isolar são usados para marcar as células. western ou a utilização de genes repórteres.
Os marcadores fluorescentes que emitem
energia luminosa (quando activada por uma Plasticidade, Diferenciação e Transdiferen-
fonte de energia, como uma luz ultravioleta ciação
Figura 1. Características distintivas das células estaminais adultas ou feixe de laser) permitem a visualização As células estaminais adultas apresentam
e células progenitoras. Uma célula estaminal adulta é uma célula
capaz de se auto-renovar e diferenciar em células mais especia- das células estaminais alvo (Fig. 2). dois tipos de divisão celular: a divisão celu-
lizadas. A divisão celular de uma célula estaminal adulta resulta
sempre em pelo menos uma célula estaminal adicional com as O facto de cada tipo de célula estaminal ter lar simétrica e a divisão celular assimétrica.
mesmas características. Uma célula progenitora é também ou
parcialmente uma célula não especializada mas por divisão celular
marcadores característicos em conjugação É através da divisão celular simétrica, que
produz apenas duas células especializadas. Um exemplo de uma com a utilização de moléculas fluorescentes as células estaminais garantem a sua ca-
célula progenitora é a células mielóide que por divisão celular ori-
gina apenas células diferenciadas como leucócitos ou eritrócitos. (fluorocromos) permite a identificação das pacidade de auto-renovação e mantêm o
mesmas através de duas técnicas principais: seu repositório celular, já que este tipo de
lógicas normais, as células estaminais adul- triagem de células activada por fluorescên- divisão origina duas células filhas idênticas
tas existem nos vários tecidos em pequenos cia (FACS; do inglês fluorescence-activated e que mantêm as propriedades estaminais
nichos celulares, sendo por isso de difícil cell sorting) e microscopia de fluorescência. da célula estaminal progenitora. As célu-
isolamento [6]. A dimensão das suas popu- Na técnica FACS, uma suspensão de células las estaminais exibem este tipo de divisão
lações celulares é muito reduzida, podendo às quais foram adicionados moléculas fluo- celular durante vários ciclos celulares até
nalguns casos, como por exemplo as células rescentes, que reconhecem marcadores es- ao momento que recebem instruções de
estaminais hematopoiéticas, existirem em taminais, passa sob pressão através de um diferenciação celular por parte do ambien-
proporções de uma célula estaminal para orifício suficientemente estreito que permite te celular onde se encontram. Após a re-
cem mil células diferenciadas [7]. a passagem de uma única célula de cada vez. cepção desses estímulos de diferenciação
Na maioria das vezes, as células estaminais Ao sair do orifício, as células passam então as células estaminais deixam de dividir-se
adultas são morfologicamente idênticas ou individualmente através de uma fonte de luz, simetricamente e passam a exibir uma di-
muito semelhantes às células dos tecidos geralmente um laser, e em seguida, através visão celular assimétrica que conduzirá à
onde se encontram, o que torna o seu isola- de um campo eléctrico. As células estami-
mento microscópico impossível. A resposta nais pretendidas correspondem a células
a este problema de identificação estaminal, fluorescentes que vão ser carregadas com
baseia-se na utilização de marcadores bio- uma carga eléctrica, enquanto as células
químicos para células estaminais. As pro- não fluorescentes não são carregadas, sen-
teínas ou factores de transcrição que são do as mesmas depois separadas de acordo
característicos de células estaminais, ou es- com a sua carga (Fig. 3).
pecíficos para um determinado tipo de célula Por sua vez, a microscopia de fluorescência
estaminal adulta, são usados como marca- utiliza moléculas fluorescentes capazes de
dores citológicos nos processos de identifi- reconhecer os marcadores característicos
cação e posteriormente, ou em simultâneo, das células estaminais alvo (que após acti-
nos processos de isolamento estaminal. vação por uma fonte luminosa emitem flu-
Figura 2. Identificação de marcadores estaminais através da ligação
Os marcadores estaminais mais recorrentes orescência) para identificá-las microscopi- de moléculas florescentes à molécula sinalizadora.

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 19.

sua diferenciação em células mais espe-
cializadas. Acredita-se que é a segregação
diferencial das proteínas membranares en-
tre as células filhas que estará na origem
da passagem das divisões celulares simé-
tricas para assimétricas e consequente-
mente da diferenciação celular [6].
Apesar da capacidade de diferenciação
ser menor nas células estaminais adultas,
sob condições especiais, especialmente in
vitro, as mesmas podem gerar linhas de
células que não gerariam em condições fi-
siológicas normais. Esse processo celular é
induzido através da cultura das células es-
taminais em meios de crescimento diferen-
tes daqueles que seriam expostas in vivo
ou quando as mesmas são transplantadas
para um órgão ou tecido ou órgão diferente
do qual foram isoladas originalmente [8]. Figura 3. Representação esquemática da triagem de células activada por fluorescência.

Tipos de Células Estaminais Adultas As células estaminais hematopoiéticas po- As células estaminais neurais encontram-
A lista que dos tecidos e órgãos dos quais dem originar todos os elementos sanguíne- se, predominantemente, nas zonas sub-
foram isoladas células estaminais adultas os, quer eritrócitos, quer linfócitos e plaque- ventriculares cerebrais e zona sub-granu-
cresce constantemente e inclui a medula ós- tas. Encontram-se, sobretudo, na medula lar do hipocampo e originam neurónios,
sea, o sangue periférico, o cérebro, a medula óssea, mas também no sangue circulante, oligodendrócitos e astrócitos [11].
espinhal, a polpa dentária, os vasos sanguí- bem como no sangue do cordão umbilical As células estaminais epiteliais originam
neos, o músculo-esquelético, o epitélio da e na placenta. Tipicamente origina dois ti- todas a células epiteliais do nosso organis-
pele e do sistema digestivo, a córnea, a re- pos de células progenitoras: a mielóide e mo, desde as que constituem as superfícies
tina, o fígado e o pâncreas, entre outros [9]. linfóide. Da linhagem linfóide são gerados externas (como a pele e as mucosas) até às
Dado que de uma forma geral, a cada tipo monócitos, macrófagos, neutrófilos, basófi- que delimitam o tubo digestivo e as vias
de tecido corresponde um dado tipo de cé- los, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos / respiratórias, bem como todos os vasos,
lula estaminal adulta, para além dos mui- plaquetas e células dendríticas. Da linhagem glândulas e outras cavidades [2].
tos tipos de células estaminais já identifi- linfóide são derivados linfócitos T e B e B e
cados, pensa-se que existirão muitos mais, células NK [2]. Células Estaminais Adultas versus Embrio-
dado que teoricamente, em cada tecido As células estaminais mesenquimais origi- nárias
específico existirá uma pequena população nam por diferenciação condrócitos, miócitos, Muito do interesse emergente no uso de
estaminal característica. As células esta- células adiposas, células do tecido conectivo células estaminais adultas em medicina,
minais adultas estão também presentes e osteoblastos e encontram-se geralmente deve-se ao facto da sua utilização levantar
em tecidos fetais, na placenta e no cordão em tecidos conectivos, em especial na me- menores questões éticas do que as levan-
umbilical [3]. As células estaminais adultas dula óssea, tecido adiposo e no sangue do tadas pela utilização de células estaminais
mais estudadas e usadas são as células es- cordão umbilical e encontram-se entre as embrionárias, já que a mesma pode ser
taminais hematopoiéticas, mesenquimais, células estaminais adultas mais fáceis de considerada, embora de forma simplificada,
neurais e epiteliais [2]. isolar [10]. como apenas um mero transplante.

20. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

Para além da ausência de problemas éticos, tipos de células diferenciadas, através do
a menor plasticidade e capacidade prolifera- uso de factores de crescimento e outras
tiva das células estaminais adultas, compa- moléculas reguladoras.
rativamente às embrionárias, é paradoxal-
mente também um factor positivo. Apesar Aplicações Clínicas
das células estaminais embrionárias se Há mais de 40 anos que são usadas células
apresentarem, aparentemente, como uma estaminais adultas em medicina, nomea- las diferenciadas in vitro a partir de células
solução mais vantajosa, dado a sua pluripo- damente células estaminais hematopoié- estaminais ou através da estimulação da di-
tência natural, capacidade proliferativa e ao ticas e mais recentemente células estami- ferenciação das células estaminais adultas
facto de, teoricamente, possuírem uma gama nais isoladas a partir do sangue do cordão presentes nos tecidos ou órgãos danificados.
de aplicações mais extensa do que as células umbilical, em doenças como a leucemia e
estaminais adultas, a sua enorme plasticida- anemia aplástica ou em linfomas [13]. Transplante de Órgãos
de e capacidade proliferativa são propensas A comunidade médica e científica pre- Para além da utilização de células estami-
à formação de tumores no local alvo ou pe- vê que num futuro próximo, será possível nais na reposição celular de tecidos danifi-
rifericamente sob a forma de metástases. O utilizar células estaminais no tratamento cados, as mesmas podem ser utilizadas na
uso das células estaminais embrionárias é de cancro, diabetes, doença de Parkinson, produção ex vivo de tecidos e órgãos com
também limitado pelas dificuldades técnicas doenças auto-imunes, insuficiência cardía- posterior transplante. Para além da supres-
em conduzir a sua diferenciação para o tipo ca, traumas musculares e até em pertur- são dos problemas associados à escassez de
celular pretendido [12]. bações neurológicas entre muitas outras órgãos e tecidos nos bancos de transplante,
Para além de serem menos propensas à for- patologias [14-22]. É no entanto necessário os tecidos e órgãos gerados por diferencia-
mação de tumores, as células estaminais que se saiba mais sobre a biologia das cé- ção estaminal eliminam os riscos de rejeição
adultas têm ainda outros pontos a seu favor, lulas estaminais bem como sobre os me- e os seus efeitos colaterais [13].
como por exemplo o facto de já estarem pro- canismos das patologias que queremos Em 2008 foi realizado o primeiro transplan-
gramadas para originar células diferenciadas tratar, até que a utilização das células es- te de um órgão humano produzido a partir
o que potencia regenerações ou integrações taminais seja uma prática clínica comum. de células estaminais adultas [23]. O pro-
mais eficazes. Por outro lado, apresentam cedimento cirúrgico foi efectuado numa
algumas desvantagens, como a sua menor Reposição Celular paciente, em que um dos brônquios tinha
capacidade de proliferação em relação às A utilização de células estaminais na repo- entrado em colapso, devido a uma tuber-
células estaminais embrionárias e o facto sição celular, em tecidos ou órgãos danifi- culose, o que conduziria inevitavelmente à
de poderem conter um maior número de er- cados, é um procedimento terapêutico utili- falência do pulmão por ele arejado.
ros genéticos (devido a possíveis exposições zado com sucesso há vários anos e que tem O transplante brônquico não é medicamen-
a agentes mutagénicos ou erros durante a como expoente máximo o transplante de te recomendado, dados os brônquios se-
replicação) e são de mais difícil identificação medula óssea. As células estaminais adul- rem dos órgãos mais propensos à rejeição
e isolamento (visto existirem em pequenas tas hematopoiéticas, utilizadas nos trans- imunológica, mas o Professor Macchiarini
populações celulares no seio dos tecidos e plantes de medula óssea, após proliferação e colaboradores decidiram avançar com
órgãos de interesse) [12]. e diferenciação, restabelecem os níveis um pioneiro transplante brônquico autólogo
normais de todos os elementos sanguíneos [23]. Um tubo brônquico híbrido foi produzi-
em pacientes com anemias aplásticas ou do a partir de uma componente cartilagino-
TERAPIA ESTAMINAL leucemias leucemias [19]. sa acelular de um dador, de condroblastos
Produção A utilização de outros tipos de células esta- (diferenciados a partir de células estaminais
O facto das células estaminais adultas exis- minais é também cada vez mais uma opção adultas mesenquimais da paciente) e de cé-
tirem sob a forma de pequenas populações clínica, dados os bancos de órgãos ou tecidos lulas epiteliais (retiradas da mucosa brôn-
celulares no seio de tecidos muitas vezes destinados a transplante serem insuficientes quica da paciente). Foi colhida uma secção
complexos, como por exemplo o cérebro, e os mesmos terem um potencial limitado de traqueia de um dador, da qual foi remo-
dificulta em grande medida a sua identifi- em órgãos mais complexos como o cérebro. vida toda a componente celular pertencente
cação, isolamento e produção. De um modo A reposição celular por células estaminais ao dador e apenas permaneceu a compo-
geral, após a sua identificação é necessá- efectua-se, basicamente, através de três nente cartilaginosa. Foram então deposita-
rio seleccioná-las, expandi-las in vitro e processos distintos: por injecção directa nos das células epiteliais e células estaminais
promover a sua diferenciação nos diversos tecidos afectados, por transferência de célu- mesenquimais adultas (isoladas a partir da

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 21.

 te usam-se vírus como vectores de inserção dos os tipos de células hematológicas [25].
genética. Embora a terapia genética seja Porém, a potencial utilização de células es-
uma tecnologia recente, ela tem sido utiliza- taminais adultas, em terapia genética, não se
da com sucesso em alguns campos da medi- limita apenas a doenças do foro hematológi-
cina humana [24, 25]. co. Estudos de terapia genética recentes, em
As células estaminais adultas apresentam ratinhos, com células estaminais mesenqui-
medula óssea da paciente) sobre essa com- um enorme potencial no âmbito da tera- mais e neurais, mostram resultados anima-
ponente cartilaginosa e procedeu-se duran- pia genética devido às suas capacidades de dores em alguns tipos de distrofias muscula-
te quatro dias a um processo de maturação e auto-renovação, inclusão histológica e pos- res e em gliomas, respectivamente [28].
diferenciação in vitro. O novo tubo brônquico terior diferenciação. Essas características As células estaminais mesenquimais isola-
foi depois transplantado, substituindo com celulares torna-as vectores muito apetecí- das a partir da medula óssea, após diferen-
sucesso o brônquio esquerdo da paciente, veis em terapia genética, já que o número de ciação em mioblastos in vitro, incorporam-se
com a consequente recuperação da função processos de inserção genética poderia ser muito bem por injecção no tecido muscular,
respiratória no pulmão esquerdo (Fig. 4). reduzido e a sua acção amplificada ao longo diferenciam-se em miócitos maduros e asso-
A conjugação da diferenciação de células do tempo devido aos mecanismos de prolife- ciam-se perfeitamente às fibras musculares
estaminais adultas e os biomateriais apro- ração estaminal adulta [12]. originais. Estas células estaminais poderão
priados, poderá a médio prazo gerar solu- A primeira utilização, com sucesso, de cé- facilmente ser modificadas geneticamente e
ções terapêuticas funcionais na área dos lulas estaminais adultas em terapia genéti- ser usadas como ferramenta de terapia ge-
transplantes de tecidos e órgãos. Para além ca com humanos ocorreu em 1992, quando nética através da expressão de genes causa-
da eliminação dos riscos de rejeição por par- Bordignon realizou o primeiro procedimento dores de miopatologias, como por exemplo a
te pacientes dos novos tecidos, esta prática de terapia genética clínica, utilizando células distrofina na distrofia de Duchenne [29].
elimina a necessidade de utilização de imu- estaminais hematopoiéticas como vectores Recentemente, foram também utilizadas cé-
nossupressores cujos efeitos secundários de entrega de um gene para a adenosina lulas estaminais neurais em terapia genética
podem ser graves, tais como: hipertensão ar- desaminase em crianças com a síndrome no tratamento de gliomas. As células esta-
terial, insuficiência renal e mesmo tumores. de imunodeficiência combinada severa [26]. minais foram modificadas in vitro de modo
Este trabalho culminou em 2002, com a pu- a expressarem uma enzima que catalisa a
Terapia Genética blicação do processo como acto terapêutico formação de uma substância tóxica para as
A terapia genética baseia-se na inserção de da mesma síndrome [27]. células tumorais e que despoleta a sua morte
genes em células ou tecidos de modo a tratar As células estaminais adultas hematopoié- celular [30].
as mais diversas patologias. Geralmente um ticas apresentam-se como as células esta-
gene normal é inserido em células ou tecidos minais de eleição em terapia genética, dado Descoberta de Fármacos e Análise de Doenças
nos quais a expressão do gene é anormal e serem facilmente isoladas do sangue e, após Duas das valências das células estaminais
origina uma patologia específica, como por modificação genética, serem de fácil inser- adultas, potencialmente importantes para a
exemplo em doenças hereditárias nas quais ção nos pacientes através de transplantes medicina, são a sua utilização em processos
um alelo mutante e pernicioso é substituído autólogos. Elas oferecem ainda a possibilida- de descoberta de novos fármacos e na aná-
por um alelo funcional [8]. A inserção do gene de de corrigir defeitos em todas as linhagens lise de doenças. Os investigadores poderão
pode ser de difícil execução e frequentemen- hematopoiéticas, dado poderem originar to- usar as células estaminais adultas como

A Uma traqueia é removida dum dador B Remoção da componente celular da traqueia do dador C Deposição de células epiteliais e células estaminais
mesenquimais adultas (da paciente) sobre a componente
cartilaginosa do dador e processo de maturação e diferen-
ciação in vitro 4 Inserção do novo brônquio na paciente.

Figura 4. Transplante brônquico autólogo.

22. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

“tubo de ensaio” para testar a segurança e ceiro ao Curso de Medicina e “Programa
qualidade de novos medicamentos. de Investigação em Medicina Regenerativa”
Populações homogéneas de células diferen- da Universidade do Algarve, concedido pelo
ciadas, a partir de células estaminais adul- Ministério Ciência, Tecnologia e Ensino Su-
tas, poderão ser usadas para testar os efei- perior através da UMIC, I.P. – Agência para
tos farmacológicos, específicos para cada a sociedade do conhecimento, e da FCT, I.P.
tipo de tecido, sob o efeito de um extenso nú- – Fundação para a Ciência e Tecnologia. José 14. Totey S & Pal R (2009) Adult stem cells: a clinical upda-

mero de compostos químicos. Essas popula- Bragança agradece a Câmara Municipal de te. J Stem Cells 4, 105-21.

ções celulares poderão também ser criadas Oeiras pela atribuição do prémio «Professor 15. Ferrari M et al. (2007) Adult stem cells: perspectives for

a partir de células isoladas de pacientes que António Xavier 2009» e a Fundação Merck therapeutic applications. Vet Res Commun 31 Suppl 1, 1-8.

padeçam de uma determinada doença e se- Sharp & Dhome - Portugal pela contribuição 16. Coulombel L (2007) [Adult stem cells: their scientific

rem usadas na descoberta de novos fárma- ao desenvolvimento do projecto “miPS: re- interest and therapeutic future]. Gynecol Obstet Fertil 35,

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canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 23.

 no contexto geral da saúde dos cidadãos
europeus. As doenças do sistema nervoso
representam 35% dos problemas de saú-
de da Europa, e no total são mais dispen-
diosas que o conjunto “cancro e diabetes”.
No entanto, a União Europeia só atribuiu
ao cérebro 8% do orçamento disponível

Células estaminais
para financiar as ciências da vida, relati-
vamente ao V Programa Quadro, o que re-
presentou menos de 0,01% do custo total

neurais das doenças do cérebro no período 1998-

2002.

A caminho da reparação cerebral?

Estes números são bem exemplificativos
do enorme desfazamento entre o peso
real das doenças do sistema nervoso (so-
João O. Malva e Liliana Bernardino cial e económico) e o investimento na sua
investigação nas sociedades europeias.
Neuroprotecção e Neurogénese na Reparação Cerebral, Centro de Neurociências e Biologia Muitos factores contribuem para este des-
Celular, Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra, 3004-504 Coimbra, Portugal. fazamento. O desconhecimento da Socie-
dade no que respeita à base fisiológica do
Correspondência: jomalva@fmed.uc.pt funcionamento do cérebro contribui para
o estigma social das doenças cerebrais.
Devido à abrangência de disciplinas bio-
AS DOENÇAS DO CÉREBRO – A URGÊNCIA DA para uma grande dependência dos seus lógicas que estudam o cérebro criou-se
REPARAÇÃO CEREBRAL familiares, cuidadores e profissionais de uma área interdisciplinar de estudo do
As doenças do cérebro na Europa saúde. cérebro designada Neurociência que en-
As doenças do cérebro representam um Um estudo da European Brain Council globa diversas especialidades científicas
dos principais problemas de saúde com concluiu que em 2004 as doenças do Siste- e clínicas, nomeadamente, neurologia,
que se debatem as Sociedades moder- ma Nervoso foram responsáveis pelo con- psicologia, psiquiatria, neuroendocrinolo-
nas. No seu conjunto, constituem uma das sumo de 386 biliões de euros, numa po- gia, entre outras. Para este cenário muito
principais fontes de sofrimento tanto para pulação de 466 milhões de habitantes, em contribui a grande diversidade de mani-
os doentes como para os seus familiares 28 países da Europa. Estes números per- festações que vão desde predominante-
e são responsáveis pelo consumo de uma mitem concluir que em média o custo das mente físicas até quase exclusivamente
parte muito significativa do orçamento da doenças do sistema nervoso é de 829 eu- neuropsicológicas. Entre as principais
União Europeia para o sector da saúde [1]. ros por habitante, repartidos pelos gastos doenças do cérebro encontram-se: ansie-
As doenças do sistema nervoso atingem com os cuidados de saúde, os transportes, dades, enxaquecas, depressões, toxicode-
cerca de 35% da população europeia e re- serviços de acção social, baixas médicas pendências, demências, epilepsias, esqui-
presentam a principal causa de incapaci- e aposentações antecipadas. Este estudo zofrenia, doença de Parkinson, acidentes
dade e a segunda causa de mortalidade na indica ainda que os custos económicos, vasculares cerebrais, traumatismos,
União Europeia. Além do impacto directo com este grupo de doenças, irão aumen- esclerose múltipla e tumores cerebrais.
das doenças do sistema nervoso no pa- tar fortemente nos próximos anos, devido Esta diversidade de patologias, com todos
ciente, mais ou menos profundo e mais ou sobretudo ao aumento da prevalência das os custos sociais e económicos associa-
menos incapacitante, estas doenças ainda diversas doenças do sistema nervoso com dos, deveria contribuir para mobilizar a
são muito pouco compreendidas e desper- o aumento da esperança de vida [1]. sociedade e os decisores políticos para a
tam sentimentos que levam à rejeição so- Verifica-se que o investimento europeu urgência de compreender o cérebro e de-
cial. Por outro lado, as pessoas afectadas na investigação do “cérebro”, tratamen- senvolver tratamentos eficientes para as
por este grupo de doenças tornam-se fre- to e apoio aos doentes e seus familiares suas doenças. No entanto, a diversidade
quentemente doentes crónicos, o que po- é claramente insuficiente face ao peso nem sempre contribui para a eficiência.
tencia o sofrimento do paciente e contribui que as doenças do sistema nervoso têm Bons exemplos (pela positiva) de eficiência

24. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

 cirúrgicas mais eficientes e menos debili-
tantes. Neste conjunto de técnicas cirúrgi-
cas podemos destacar a estimulação ce-
rebral profunda, pela robustez de efeitos
e pelos seus efeitos secundários mínimos.
No entanto, como referimos anteriormen-
te, a comunidade científica e médica conti-
nua a não dispôr de boas estratégias para
curar o sistema nervoso doente.

Medicina Regenerativa do cérebro – espe-

Figura 1. Neurogénese no cérebro adulto. (A) Representação ilustrativa de um corte sagital do cérebro adulto de roedor mostrando a
rança para o futuro?
localização dos nichos neurogénicos: região subventricular (SVZ) e região subgranular (SGZ) do giro dentado no hipocampo. As células A falta de tratamentos eficientes para as
estaminais/progenitoras presentes na SVZ dão origem a novos neurónios que migram pela via rostromigratória (RMS) em direcção ao
bolbo olfactivo (OB) onde se diferenciam em interneurónios e se integram nos circuitos neurais pré-existentes. Fotografias representati- doenças do cérebro contribui muito signi-
vas de microscopia confocal de novos neurónios (identificados a verde ou vermelho pelo marcador DCX - “doublecortin”) no giro dentado
do hipocampo (B), na região SVZ (C) e na via rostromigratória (D). ficativamente para o seu impacto na So-
ciedade, uma vez que a maior parte das
e unidade na transmissão de mensagens, terapêuticas curativas para a maioria das terapias existentes está muito mais voca-
e de “lobby” positivo eficiente, encontram- doenças do sistema nervoso. Numa pers- cionada para o alívio de sintomas do que
se na área do cancro ou da SIDA. Nestes pectiva histórica, as doenças do cérebro para a sua cura propriamente dita. Por ou-
casos o foco ajuda à transmissão da men- foram inicialmente tratadas com recurso tro lado, estas doenças são muito desco-
sagem e claramente favorece positiva- a técnicas cirúrgicas ou químicas agres- nhecidas tanto do ponto de vista das suas
mente o “lobby” e a colheita de dividendos sivas e pouco eficientes que provocavam causas primárias como do ponto de vista
no que respeita ao maior investimento re- efeitos secundários incapacitantes para os da eficácia terapêutica.
lativo que estas áreas da ciência recebem doentes. Com o aumento do conhecimento Assim, é essencial desenvolver novas
em comparação com o cérebro. sobre os mecanismos bioquímicos envol- terapias para reparar o tecido nervoso
A European Brain Council e os movimentos vidos na comunicação entre as células do lesado, o que poderá constituir um ele-
nacionais emergentes, com a constituição cérebro foram criadas condições para o mento central no desenvolvimento futuro
de grupos de acção ou de conselhos nacio- desenvolvimento racional da neurofarma- das Neurociências. Neste contexto, no-
nais para o cérebro, procuram reforçar o cologia. As companhias farmacêuticas co- vas estratégias neuroprotectoras, com
“lobby” social e político do “cérebro”, jun- locaram grande esforço de investigação e capacidade de prevenir a morte neuro-
tando profissionais, doentes, familiares e desenvolvimento em novos fármacos mais nal resultante da agressão do cérebro, e
companhias farmacêuticas dedicadas ao robustos e selectivos, que permitiram o desenvolvimento de novas estratégias
estudo do cérebro. Através de acções edu- controlar vários sintomas das doenças reparadoras do tecido nervoso afectado,
cativas concertadas procura-se desmisti- do sistema nervoso. O desenvolvimento recorrendo a células estaminais, poderão
ficar o cérebro e aumentar o investimento de novos fármacos com acção no sistema contribuir determinantemente para a futu-
em investigação científica e em cuidados nervoso teve particular importância na ra terapia do cérebro doente.
de saúde dedicados ao sistema nervoso. segunda metade do século XX e continua A ideia dogmática de que o cérebro é des-
uma actividade relevante no início do Sé- provido de capacidade regenerativa mu-
O tratamento das doenças do cérebro – es- culo XXI. Paralelamente com o desenvol- dou drasticamente nos últimos anos com
tado actual vimento de novos fármacos e com a evo- a descoberta de nichos de células estami-
O conhecimento científico insuficiente so- lução de técnicas de imagiologia cerebral nais neurais com capacidade de gerar no-
bre o funcionamento do cérebro contribui funcional a comunidade médica contribuiu vos neurónios no cérebro adulto de mamí-
de forma determinante para a ausência de com o desenvolvimento de novas técnicas feros, incluindo nos Humanos. A presença

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 25.

 para as zonas de lesão. Esta neurogénese um processo de neurogénese constitutiva.
estimulada pela lesão contém um enorme Este nicho neurogénico ladeia os ventrí-
potencial reparador do cérebro e lança um culos laterais e é o local de formação de
desafio importante aos neurocientistas: o neuroblastos que migram para os bolbos
aproveitamento deste potencial reparador olfactivos, onde se diferenciam e integram
para desenvolver novas estratégias tera- como novos neurónios funcionais. O nicho
de células estaminais e progenitoras pêuticas para as patologias que afectam o neurogénico da SVZ está organizado em
residentes no cérebro adulto, e o avanço sistema nervoso [5-7]. rosetas celulares constituídas por três ti-
vertiginoso no conhecimento sobre o seu pos distintos de células. As células B que
funcionamento e manipulação, alimentam Neurogénese no hipocampo são as células com propriedades estami-
a esperança do desenvolvimento futuro de Na camada subgranular do giro dentado nais, e fenótipo próximo dos astrócitos.
novas estratégias para a eficiente repara- existem células estaminais neurais e cé- Estas células proliferam lentamente e
ção cerebral. Em particular, é necessário lulas progenitoras que se diferenciam em são muito ramificadas, o que lhes permi-
desenvolver esforços para compreender astrócitos e em células granulares do giro te entrar em contacto com os outros par-
os processos de modulação do desen- dentado. Nesta estrutura o nicho neuro- ceiros celulares e moleculares do nicho
volvimento, diferenciação e migração das génico inclui células estaminais e célu- neurogénico, que inclui a lâmina basal da
células imaturas, de modo a obter um pro- las progenitoras do tipo 1, do tipo 2 e do vasculatura sanguínea da SVZ. As células
cesso de substituição de neurónios mor- tipo 3, com capacidade proliferativa e que B possuem ainda um prolongamento es-
tos e integração funcional de novas célu- apresentam marcadores de imaturidade/ pecial em forma de cílio que atravessa o
las nos circuitos neuronais [2]. célula estaminal como a nestina, Sox2 e espaço apertado entre as células ependi-
GFAP (“Glial Fibrillary Acid Protein”). Os mais, ciliadas, que revestem a parede do
Neurogénese no cérebro adulto progenitores do tipo 3 encontram-se em ventrículo lateral. Através desta estrutura
A neurogénese no cérebro adulto é um pro- fase proliferativa mas começam a perder as células B têm acesso directo ao líquido
cesso que ocorre continuamente ao longo a os marcadores de imaturidade e adquirem cefalorraquidiano dos ventrículos laterais.
vida. Em nichos restritos do sistema nervo- características fenotípicas da linha neu- As células B dão origem às células C que
so existem células estaminais neurais e cé- ronial (PSA-NCAM, “Poly-Sialated Neural são células com grande capacidade proli-
lulas progenitoras que proliferam continu- Cell Adhesion Molecule”), num proces- ferativa e que são responsáveis pela gran-
amente e que produzem células do sistema so que leva à diferenciação funcional de de dinâmica proliferativas da SVZ. As célu-
nervoso, que se integram funcionalmente neurónios jovens. O nicho neurogénico las C dão origem às células A que saem do
em circuitos neurais. Este processo de dife- está intimamente associado a lâmina ba- ciclo celular e formam neuroblastos que
renciação constitutiva de novos neurónios, sal da vasculatura que fornece contacto se organizam em cadeias migratórias em
astrócitos e oligodendrócitos ocorre em físico e químico essencial à manutenção direcção ao bolbo olfactivo. Estas cadeias
duas regiões principais: a região subventri- do estado de imaturidade estaminal. Os de neuroblastos são rodeadas por estru-
cular, que ladeia os ventrículos laterais, e neuroblastos resultantes da divisão assi- turas tubulares formadas por astrócitos
a camada subgranular do giro dentado do métrica dos progenitores saem do ciclo de que saem da SVZ e se juntam na região
hipocampo [2-4] (Figura 1). divisão celular e migram localmente para anterior da SVZ formando a via rostromi-
Este processo de renovação e integração a camada granular do giro dentado, onde gratória. As cadeias migratórias de neuro-
de novas células no sistema nervoso cen- se integram funcionalmente como novos blastos (células A) da via rostromigratória
tral, e mais especificamente no cérebro, neurónios granulares. Este processo de organizam-se intimamente com uma rede
ocorre de modo constitutivo, produzindo neurogénese constitutiva desempenha muito rica de vasos sanguíneos. Assim,
células que desempenham um papel acti- um papel muito importante na renovação para que ocorra a migração dos neuro-
vo na fisiologia do tecido nervoso. Por ou- da arquitectura sináptica do hipocampo blastos através da via rostromigratória
tro lado, a neurogénese também pode ser e provavelmente desempenha um papel parece ser muito importante o suporte fí-
estimulada em resposta à agressão cere- importante na formação e recordação de sico e químico (que inclui sinalização pelo
bral. O tecido cerebral danificado produz memórias armazenadas [3,8]. factor neurotrófico BDNF - “Brain derived
um ambiente permissivo para a neurogé- neurotrophic factor”) fornecido pelos as-
nese, estimulando a produção de novas Neurogénese na região subventricular trócitos e pelos vasos sanguíneos. Além
células neurais e facilitando a migração A região subventricular (SVZ) do cérebro disso, parece haver um gradiente químico
de progenitores das zonas neurogénicas adulto é um local onde ocorre activamente na via rostromigratória com propiedades

26. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

repulsivas com origem na SVZ e quimio- um processo benéfico. Assim, o estudo da
atractivas com origem no bolbo. Actuan- neurogénese no hipocampo em condições
do em conjunto, estes factores forçam a de epilepsia é um bom exemplo para as
migração rostral dos neuroblastos em di- enormes dificuldades que se vislumbram
recção ao bolbo olfactivo. Ao chegarem ao para a Medicina Regenerativa do cérebro
bolbo olfactivo os neuroblastos abando- [3,15-17]. No giro dentado do hipocampo
nam a sua migração tangencial e migram verifica-se que as crises epilépticas poten- berta constitui em si um facto espantoso,
radialmente para as diferentes camadas ciam a diferenciação de novos neurónios e além disso promete novos e fascinantes
celulares do bolbo, onde se diferenciam granulares. No entanto, nestas condições desenvolvimentos científicos. Estas célu-
como neurónios granulares e glomerula- as células apresentam uma menor com- las, já descritas por Ramón e Cajal, pe-
res. Este processo de neurogénese cons- pactação e inserção na camada granular maneceram “adormecidas” para a neuro-
titutiva do bolbo olfactivo é muito impor- do giro dentado, e formam sinapses aber- ciência durante décadas revelando agora
tante para a discriminação de odores em rantes que contribuem para o fenómeno o seu potencial “estaminal”, que inclui a
roedores [2,9-11]. de “sprouting” das fibras musgosas, bem associação física à rede vascular angio-
descrito em modelos animais e humanos génica da zona de lesão. Se a comunidade
Neurogénese e lesão cerebral de epilepsia do lobo temporal. científica desenvolver estratégias farma-
Vários estudos publicados recentemente Os nichos neurogénicos do cérebro, espe- cológicas ou genéticas de manipulação
indicam que há uma estimulação da di- cialmente a região SVZ, não fornecem ex- dos astrócitos reactivos para que estes
ferenciação de neurónios e de oligoden- clusivamente neurónios para o parênqui- adquiram propriedades de diferenciação,
drócitos em várias patologias do sistema ma cerebral. Há, de facto, uma produção nos fenótipos celulares de interesse para
nervoso. Esta neurogénese tem potencial muito activa de células que expressam cada patologia particular, então o próprio
“reparador” pois pode vir a constituir uma GFAP e que constituem uma reserva de cérebro já resolveu um grande problema
fonte regeneradora do tecido cerebral; células imaturas e de diferenciação em aos neurocientistas… como colocar célu-
assim os neurocientistas aprendam a ma- astrócitos. Por outro lado, verificou-se las reparadoras na zona de lesão!
nipular os processos de controlo de dife- que em modelos animais de doenças des- No entanto, como acontece em tantos fe-
renciação, migração, integração e sobre- mielinizantes há diferenciação de novas nómenos biológicos, também o potencial
vivência de novas células no parênquima células da linha oligodendrocítica, o que estaminal do cérebro apresenta a sua du-
cerebral [7]. pode revelar o carácter bipotente da dife- pla face de Janus. Dados recentes indicam
Em resposta a agressões isquémicas ce- renciação de células SVZ (na linha neuro- que os nichos neurogénicos além de re-
rebrais há uma estimulação da prolifera- nial e oligodendrocítica) [5]. A estimulação presentarem uma fonte de produção cons-
ção de células nos nichos neurogénicos e de diferenciação de novos oligodendróci- titutiva e fisiológica de células neurais, e
posterior migração de neuroblastos para tos em doenças desmielinizantes tem uma ainda uma fonte de células com potencial
regiões onde a neurogénese não é cons- importância acrescida no corpo caloso e reparador, podem também ser uma fonte
titutiva como no córtex cerebral ou no pode vir a revelar-se uma linha de inves- de problemas e contribuirem directa ou
estriado. Esta migração “atípica” de neu- tigação de importância crescente para fu- indirectamente para a geração de alguns
roblastos parece ser favorecida por mo- turas abordagens reparadoras do cérebro tipos de tumores cerebrais, especialmen-
dificações do parênquima cerebral lesado em pacientes com esclerose múltipla [12]. te gliomas. As células tumorais cerebrais
(incluindo resposta inflamatória) que se Recentemente ganhou força uma nova apresentam muitas características seme-
torna permissivo à migração e diferencia- ideia que lança enorme esperança sobre lhantes às células imaturas/estaminais
ção de neurónios. Por outro lado, foi de- o verdadeiro potencial reparador do cé- do cérebro. Estas características incluem
monstrado que a migração de neuroblas- rebro adulto doente. Verificou-se que em autorenovação e grande capacidade pro-
tos para as zonas de lesão cerebral ocorre áreas de lesão cerebral existem astrócitos liferativa; elevada associação funcional à
em estreita associação com a diferencia- reactivos que apresentam marcadores fe- lâmina basal da vasculatura sanguínea;
ção de novos vasos sanguíneos, que po- notípicos de imaturidade, como marcação marcação fenotípica de imaturidade que
derão fornecer substrato físico e químico para nestina ou Sox-2. Além disso, verifi- inclui nestina, Sox-2, CD133; sinalização
para a migração de neuroblastos [12-14]. cou-se que é possível reprogramar gene- por EFG (“Epidermal Growth Factor”) e
No entanto, é muito importante ter em ticamente estas células para adquirirem PDGF (“Platelet-derived Growth Factor”);
mente que a adição de mais neurónios às a capacidade de se diferenciar em neuró- pluripotência (revisto por Agasse et al. [2]).
redes neuroniais não é necessariamente nios com diferentes fenótipos. Esta desco- Por outro lado, têm sido identificados ca-

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 27.

sos clínicos em que os gliomas parecem
ter uma localização estreitamente asso-
ciada com os nichos neurogénicos, es-
pecialmente em SVZ. Em conjunto, estes
dados levam a supôr que em determina-
das circunstâncias, favorecidas por sus-
ceptibilidade genética, a desregulação do
ambiente químico ou físico do nicho neu-
rogénico pode ser um elemento determi-
nante na desregulação do controlo do ciclo
celular das células imaturas e levá-las a
adquirir propriedades cancerosas.
No laboratório desenvolvemos uma me-
todologia que nos p ermite identificar
funcionalmente, em tempo real, uma di-
Figura 2. Cultura de células estaminais neurais. As células espaminais neurais e progenitoras de roedores (pós-natal) podem ser cultiva-
versidade de tipos celulares derivados de das em laboratório. Suspensões celulares são isoladas a partir de fatias coronais de cérebro de onde se extraem as células da região
adjacente aos ventrículos laterais (região subventricular - SVZ).
culturas de células estaminais neurais da As células com potencial mitório proliferam em cultura (na presença de factores de crescimento como EGF e FGF-2) e originam agre-
SVZ (Figura 2). Desenvolvemos um proto- gados clonais designados neurosferas. As neurosferas derivadas das células da SVZ têm grande potencial proliferativo e podem atingir
muitas dezenas de células no espaço de uma semana. Numa segunda fase, é possível inibir a proliferação das células e promover a
colo de estimulação das culturas SVZ que sua diferenciação. Para isso, retiram-se os factores de crescimento e depositam-se as neurosferas sobre uma lamela de vidro revestida
com substrato adequado como poli-lisina ou laminina. Nestas condições, as neurosferas aderem ao substrato e um conjunto de células
nos permite induzir e registar alterações migra radialmente para fora da neurosfera, formando uma pseudo-monocamada de células que diferencia (A e B). Nesta pseudo-
monocamada é possível identificar uma diversidade de células que incluem: células imaturas, progenitores, astrócitos, oligodendrócitos
de cálcio intracelular em células individu- e neurónios (B).
ais. Esta plataforma permite associar fun-
ção a fenótipo, célula a célula, e revela-se que nos levarão a aplicações clínicas con- da equipa de investigação do grupo “Neu-
de grande importância para estudos far- cretas. roprotecção e Neurogénese na Reparação
macológicos e consequentemente para a Ainda há poucas centenas de anos quem Cerebral”. Agradecimento especial para
descoberta de novos alvos terapêuticos de iria imaginar que o homem poderia cruzar Fabienne Agasse, Sofia Grade, Alexandra
doenças do cérebro (Figura 3). Oceanos em máquinas voadoras? Há pou- Rosa, Maria Francisca Eiriz, Sara Xapelli,
cas dezenas de anos quem poderia ima- Tiago Santos e Bruno Silva pelo seu en-
O futuro… ginar que o Homem poderia reprogramar volvimento na concepção e execução dos
Neste artigo não se pretende concluir que fibroblastos, de tecido adulto, vindo estes trabalhos que permitiram optimizar pro-
a utilização de recursos neurogénicos en- a adquirir propriedades de células pluri- cedimentos e técnicas experimentais e so-
dógenos do cérebro ou que terapias celu- potentes? Em ambos os casos, a ciência lidificar um grupo de investigação. Finan-
lares recorrendo ao transplante de outras desafia constantemente a nossa imagi- ciado por PTDC/SAU-NEU/68465/2006,
fontes de células estaminais/progenitoras nação impelindo-nos para esta missão PTDC/SAU-NEU/104415/2008 e FEDER.
irão resultar, a curto e médio prazo, em científica, cívica e cultural, que se projecta
avanços concretos da Medicina com apli- para além das fronteiras do conhecimento
cação em doenças do Sistema Nervoso actual e nos ajuda a moldar e a construir REFERÊNCIAS
humano. No entanto, não é menos verda- o futuro.
de que a grande dinâmica da investigação 1. Olesen J, Baker MG, Freund T, di Luca M, Mendlewi-

científica nesta área, e o enorme avanço cz J, Ragan I and Westphal M (2006) Consensus docu-

no conhecimento que daqui resulta, per- AGRADECIMENTOS ment on European brain research. J Neurol Neurosurg

mite alimentar esperanças, bem funda- Os autores agradecem a colaboração Psychiatry 77 (suppl 1): i1-i49.

mentadas, para novos desenvolvimentos sempre activa e generosa dos membros 2. Agasse F, Bernardino L and Malva JO (2007) Subven-

28. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

 9. Kohwi M, Galvão RP and Alvarez-Buylla A (2006)

Birth, migration and function of SVZ-der ived neurons

in the adult brain in: Mammalian subventricular zones;

pp. 84-116; Edited by SW Levison; Springer, New York.

10. Lledo P-M (2008) Adult neurogenesis in the olfactory

bulb in: Adult Neurogenesis; pp. 425-444; Edited by F

Gage, G Kempermann and H Song; Cold Spring Harbor

Laboratory Press, New York.

11. Lim DA, Huang Y-C and Alvarez-Buylla A (2008) Adult

subventricular zone and olfactory bulb neurogenesis in:

Adult neurogenesis; pp. 176-206; Edited by F Gage, G

Kempermann and H Song; Cold Spring Harbor Labora-

tory Press, New York.

12 . Nait-Oumesmar B, Decker L, Picard-Riera N and

Evercooren AB (2006) Responses of the SVZ to de-

myelinating diseases in: Mammalian subventricular

zones; pp. 260-280; Edited by SW Levison; Springer,

New York.

Figura 3. Imagiologia de cálcio intracelular em células individuais: associação fenótipo-função. No laboratório desenvolvemos uma metodo- 13. Lie DC and Götz M (2008) Adult neurogenesis: simi-
logia que nos permite identificar funcionalmente, em tempo real, uma diversidade de diferentes tipos celulares derivados de culturas
de células estaminais neurais. Recorrendo a imagiologia de cálcio intracelular em célula individual, usando para isso a sonda fluores- larities and differences in stem cell fate, proliferation,
cente “Fura-2”, desenvolvemos um protocolo de estimulação das culturas SVZ que nos permite induzir e registar respostas celulares
migration, and differentiation in distinct forebrain re-
selectivas. Através do recurso a lamelas de vidro marcadas com uma micro-grelha pudémos localizar conjuntos de células submetidos
às experiências de cálcio intracelular em célula individual e, posteriormente, as mesmas células são tratadas para experiências de gions in: Adult Neurogenesis; pp. 227-266; Edited by F
imunocitoquímica e o seu fenótipo é revelado. Esta plataforma permitiu optimizar um método que nos permite identificar em tempo
real, e no espaço de cerca de 15 minutos, o fenótipo funcional de cerca de centena e meia de células, que incluem: células imaturas, Gage, G Kempermann and H Song; Cold Spring Harbor
astrócitos, progenitores, oligodendrócitos, neuroblastos e neurónios. Esta plataforma tecnológica mostra-se particularmente robusta
para estudos funcionais e farmacológicos pois tira partido de células vivas e permite revelar o seu fenótipo – assim, abrem-se novas Laboratory Press, New York.
oportunidades para a descoberta de novos fármacos selectivos para alvos moleculares restritos a linhagens celulares que derivam de
14. Lindvall O and Kokaia Z (2008) Neurogenesis follo-
células estaminais neurais.
wing stroke affecting the adult brain in: Adult Neuroge-

tricular zone cells as a tool for brain repair in: Interac- 444; Edited by JO Malva, AC Rego, RA Cunha and CR nesis; pp. 549-570; Edited by F Gage, G Kempermann

tion between neurons and glia in aging and disease; pp. Oliveira; Springer, New York. and H Song; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New

81-108; Edited by JO Malva, AC Rego, RA Cunha and CR 6. Deierborg T, Li J-Y and Brundin P (2007) Adult neu- York.

Oliveira; Springer, New York. rogenesis in neurodegenerative diseases in: Interac- 15. Bernardino L, Ferreira R, Cristóvão AJC, Sales F

3. Gray WP and Laskowsky A (2007) Glia and hippocam- tion between neurons and glia in aging and disease; and Malva JO (2005) Inflammation and Neurogenesis in

pal neurogenesis in the normal, aged and epileptic brain pp. 445-460; Edited by JO Malva, AC Rego, RA Cunha Temporal Lobe Epilepsy. Current Drug Targets – Cen-

in: Interaction between neurons and glia in aging and and CR Oliveira; Springer, New York tral Nervous System & Neurological Disorders 4: 349-

disease; pp. 375-390; Edited by JO Malva, AC Rego, RA 7. Galvão RP, Álvarez-Buylla A and García-Verdugo 360.

Cunha and CR Oliveira; Springer, New York. JM (2008) Adult neural stem cells: prospects for 16. Jessberger S and Parent JM (2008) Epilepsy and

4. Ma DK, Ming G-I, Gage FH and Song H (2008) Neu- brain repair in: Cell Therapy; pp.309-336; Edited by D adult neurogenesis in: Adult Neurogenesis; pp. 535-

rogenic niches in the adult mammalian brain in: Adult García-Olmo, JM García-Verdugo, J Alemany and JA 548; Edited by F Gage, G Kempermann and H Song; Cold

neurogenesis; pp. 207-226; Edited by F Gage, G Kem- Gutiérrez-Fuentes. Mc Graw Hill, Madrid. Spring Harbor Laboratory Press, New York.

permann and H Song; Cold Spring Harbor Laboratory 8. Kempermann G, Song H and Gage FH (2008) Neuro- 17. Sperk G, Drexel M, Tasan R and Wieselthaler A (2007)

Press, New York. genesis in the adult hippocampus in: Adult neuroge- Epilepsy, brain injury and cell death in: Interaction be-

5. Bruce CC, Franklin RJM and Relvas JB (2007) Remye- nesis; pp. 159-174; Edited by F Gage, G Kempermann tween neurons and glia in aging and disease; pp. 365-

lination of the central nervous system in: Interaction and H Song; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 376; Edited by JO Malva, AC Rego, RA Cunha and CR

between neurons and glia in aging and disease; pp. 427- New York. Oliveira; Springer, New York.

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 29.

 Bioengineering
strategies for stem
cell expansion
and differentiation
Margarida Serra 1,2, Catarina Brito 1,2, Paula M. Alves1,2*
ABSTRACT
Human stem cells, with their unique 1 Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa, Oeiras, Portugal
characteristics for indefinite prolifera- 2 Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Oeiras, Portugal;
tion and multi-lineage differentiation,
are an appealing source for cell re- *Corresponding author: Paula Marques Alves
placement therapies, tissue engineer- ITQB-UNL/IBET, Apartado 12, 2781-901 Oeiras, Portugal (Phone: +351 21 446 94 12; FAX: +351 21 442 11 61;

ing, drug discovery and in vitro toxicol- e-mail: marques@itqb.unl.pt; website address: http://tca.itqb.unl.pt)

ogy. For the clinical implementation of

these cells, there is the need for trans-
lating the culture protocols developed INTRODUCTION plications, it is critical to exactly direct stem
at research laboratories into validated The search for effective therapies for a myr- cell differentiation to the desired lineage; in-
bioprocesses that can guarantee re- iad of degenerative diseases considered in- creasing differentiation efficiency, population
producibility, scalability, standardiza- curable, such as Parkinson’s disease and purity and improving cell functionality are the
tion, robustness and safety. Type I diabetes, has been a long-lasting chal- major technological challenges.
The success of stem cell utilization relies lenge for the scientific community. In the last This review will address current develop-
on the i) development of scalable and decade, the potential of stem cell therapy has ments in stem cell bioprocessing. We will
robust bioreactor devices, ii) design of become well established and it is envisioned focus on the identification of the essential
flexible culture strategies and iii) moni- that in a near future stem cells will be used requirements for the successful transition of
torization and control of the culture en- as a new source of neurons or insulin produc- stem cells into cell therapy and industrial ap-
vironment. This article provides an over- ing cells to replace the degenerating tissues plications. The impact of the stem cell source
view of current bioengineering strategies and/or impaired cells. as well as of the culture conditions, including
that could be used to generate large In addition to cell therapy applications, stem bioreactors, culture strategies and operation
numbers of stem cells and/or their de- cell technology platform holds enormous parameters, for controlling stem cell fate de-
rivatives with potential application in re- prospective for the development of novel cisions will be discussed.
generative medicine and drug discovery. strategies in tissue engineering, drug screen-
ing and in vitro toxicology [1-4]. Stem Cell Sources
In order to fulfill such promise large numbers There are several classes of stem cells in-
of high quality cells are needed. This demand cluding embryonic and adult stem cells, and
for stem cells requires, on a first approach, more recently induced stem cells, each one
the implementation of scalable and afforda- presenting its own benefits, limitations and
ble culture systems for the production of pure challenges in bioprocess development (Fig.
populations of undifferentiated cells without 1). All of them share as common features
compromising their stem cell characteris- the ability to proliferate indefinitely (unlimited
tics (self-renewal ability and differentiation self-renewal capacity) and vary in their differ-
potential). In the next step, consisting in gen- entiation potential.
erating particular cell types for specific ap- Human embryonic stem cells (hESCs), iso-

30. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

 clinical applications, circumventing the ethi-
cal concerns regarding the use of embryos.
Additionally, iPSCs present the benefit of be-
ing patient-derived cells, avoiding immune
rejection in cell therapy applications. iPSC
research is expanding rapidly, including mod-
eling complex diseases in vitro and pursuing
novel therapeutics [14]. Currently, the pos-
sibility of reprogram somatic cells into less
immature developmental stages that could
be more directly applicable to therapeutic ap-
plications is being intensely explored [15-17].

Bioreactors for stem cell cultivation

Traditionally, culture of stem cells is per-
formed on flat two-dimensional (2D) surfaces
(well-plates and tissue culture flasks) (Fig. 2)
due to their simplicity, low cost and easy han-
dling. However, scale-up through the gener-
ation of multiple, parallel manual processes
is unattractive because of the high labor cost
and potential variability of output; rather, the
Figure 1. Stem cell sources and characteristics (Adapted from Placzek et al., 2009). use of more efficient, robust and scalable
culture configurations is highly desirable to
lated from the inner cell mass of blastocysts contributing to the regeneration/repair of the generate cells on a scale suitable for clinical/
(Thomson et al, 1998), are pluripotent cells, tissue/organ where they reside [10]. Depend- /industrial applications. Stem cell bio-
i.e., they can differentiate into all cell types ing on the source, ASCs can be isolated with processing will require the use of specialized
that compose an adult body, derived from relative ease. However, they presently have devices that facilitate mass/gas transport,
the three germ layers — e.g. cardiomyocytes, major limitations, such as the difficulty in ob- environment monitorization and control, as
neurons, pancreatic islets, hepatocytes, and taining pure populations, their limited expan- well as able to support high cell densities.
chondrocytes [5-9]. However, hESCs are dif- sion capacity and the restricted differentia- Moreover, automation and the use of repro-
ficult to control with respect to their stem cell tion potential, as they are often committed to ducible platforms are imperative for the cre-
fate, and elicit ethical considerations, requir- their original cell lineage (multipotent cells). ation of cell-based products.
ing the manipulation of human embryos. For One of the most promising achievements in An optimal and universal stem cell culture
clinical applications, these cells still present the stem cell field was the reversion of so- system does not exist so far; however biore-
limitations related with immune rejection and matic cells (e.g. fibroblasts, keratinocytes) to actor development throughout the last dec-
the possibility of teratoma formation. a state of pluripotency using defined repro- ades has brought technological advances into
On the other hand, adult stem cells (ASCs) do gramming strategies [11-13]. The creation of the field. Microfluidic devices, rotary cell cul-
not present immunogenic complications on these induced pluripotent stem cells (iPSCs) ture (RCC) systems and stirred culture ves-
implantation since they can be isolated direct- elicited an explosion of scientific curios- sels have been the main bioreactors explored
ly from the patient. ASC exist in specific nich- ity and industrial interest. This is mainly be- in this field (Table 1) and are described in de-
es in the different organs (e.g. bone marrow, cause iPSCs are similar to ESCs [11,12] and tail in the following sections. There is howev-
peripheral blood, pancreas, lung, brain, liver) thereby could potentially replace ESCs for er, a large range of designs available, which

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 31.

include fluidized bed, packed bed, airlift and
disposable wave bioreactors (revised in [18].

Microfluidic culture systems

Microfluidic devices, or micro-bioreactors, Figure 2. 2D and 3D strategies for cultivation of human embryonic stem cells.

are efficient small-scale systems mainly

used for the optimization of culture condi- brane. Rotary cell culture systems have been characterized, enable culture homogeneity
tions for cell growth and differentiation while used for expansion of aggregates of differen- and easy non-invasive sampling for continu-
also providing the precise control over the tiated cells formed by hESC (human embry- ous culture monitorization. In particular, fully
cell microenvironment [19,18]. Arrays of mi- oid bodies – hEB) and for multiple ASC using controlled stirred tank bioreactors provide an
cro-bioreactors have been developed to study scaffolds [27-29]. Amongst the main disad- automated control of the environment (tem-
growth and differentiation of hESC and ASC vantages of RCC are the limited control of ag- perature, pH and dissolved oxygen) manda-
in a three dimensional (3D) perfusion system gregate size and nutrient/gas concentrations tory for reproducible stem cell cultivation.
[20-26]. The microenvironment can be con- throughout the vessel. This may result in the These bioreactors are highly flexible as they
trolled by adjusting specific operating param- formation of necrotic centers, leading to cell can operate in different culture operation
eters such as the perfusion rate, resulting in death inside the aggregates, and uncontrolled modes (batch, fed-batch, perfusion), can
a high-throughput system for evaluating the microenvironments, caused by the concen- be adapted to different type of bioprocesses
effects of concentration gradients of soluble tration gradients resulted from mass transfer (stem cell expansion and/or differentiation)
factors on various cell processes. However, limitations. In addition the working volume and can be accommodated to different 3D cell
the main limitations of these culture systems of these bioreactors is still low, thus limiting culture strategies (cell aggregates, microcar-
are the high shear stress associated to per- their use in a clinical and/or larger scale. riers, encapsulated cells), presenting wide-
fusion as well as and the continuous removal spread potential in stem cell bioengineering
of important factors secreted by the cells that Stirred culture vessels [15,30-32]. The main limitation of stirred
could ultimately compromise stem cell per- Stirred culture vessels including spinner culture vessels is the hydrodynamic stress
formance. vessels and stirred tank bioreactors have promoted by stirring. In addition, the minimal
been widely used in research laboratories volume required to set up the experiments is
Rotary cell culture systems and industries for the scale up of animal very high (approximately 50 mL), demanding
Developed by NASA, RCC bioreactors are cells for the production of recombinant pro- higher starting cell numbers, increasing the
composed by a rotating 3D chamber in which teins, enzymes, vaccines, antibodies, virus. costs associated to optimization studies and
cells remain suspended in near free-fall, The knowledge cumulated from this previ- compromising the use of stirred bioreactors
simulating microgravity conditions. These low ous experience facilitated their transition to for high-throughput applications.
shear stress bioreactors can provide a well stem cell bioengineering, in which the cells As discussed below, the combination of
mixed environment for cell growth as well as are the main products. Stirred culture ves- stirred tank bioreactor technology with 3D
efficient gas transfer through a silicon mem- sels are scalable and hydrodynamically well culturing approaches has demonstrated sig-

Table 1. Culture systems for stem cell expansion and differentiation (Adapted from Placzek et al. [18] and Azarin and Palecek [19]).

32. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

nificant advances in stem cell bioprocessing most robust method for generating differenti-
by increasing the yields of stem cell expan- ated cell from ESCs is through the formation
sion, enhancing differentiation efficiency and of EBs, where ESC cultured in suspension
improving cell functionality. self-aggregate and spontaneously differenti-
ate into multiple tissues [42]. EB differentia-
3D cell culture strategies tion has been shown to recapitulate aspects
ESCs and ASCs are traditionally cultured in of early embryogenesis, including the for- Cultivation of stem cells in microcarriers
2D systems. In particular, hESCs are usually mation of a complex 3D arrangement where A microcarrier is a support matrix allowing
propagated as colonies on a top of a feeder cell-cell and cell-matrix interactions are for the growth of anchorage-dependent cells
layer of inactivated fibroblasts (Fig. 2). The thought to support the development of three in suspension systems. Microcarrier cultures
inherent variability, lack of control and low embryonic germ layers and their derivatives are characterized by high surface-to-volume
cell production yields associated to these [43,44]. The main limitation of this system is, ratio, accommodating higher cell densities
methodologies make them unattractive and in fact, the lack of control in directing stem than those obtained in static cultures; the area
unsuitable for a clinical or industrial scale. cell differentiation towards a specific lineage, available for cell growth can be adjusted eas-
Therefore, moving stem cell culture protocols thus resulting in a mixture of different cell ily by changing the amount of microcarriers,
from 2D cell monolayers to 3D cultures is fun- types. This drawback demands the need of which further facilitates the process scale-up.
damental to enhance their performance and efficient integrative downstream approaches From industrial/commercial/clinical points of
fully exploit their potential. The general rec- to further purify the culture outcome into a view, this feature has a tremendous impact in
ognition of the importance of the spatiotem- desired cell type population. reducing the costs of cell manufacturing by
poral cell environment for cell behavior has Results from our lab have shown that the reducing the amount of media, growth factors
contributed for acceptance that 3D provides a differentiation process of human embryonal and other expensive supplements required in
cellular context closer to what actually occurs teratocarcinoma stem cells (NT2 cells – cell stem cell cultivation. For each stem cell type
in vivo. Mechanical and chemical properties, model system of hESCs) into neurons is high- and bioprocess it is important to optimize
such as surface tension, gravity, cell adhesion ly improved when cells are cultivated as 3D specific parameters including microcarrier
and movement are key players in determining aggregates using stirred bioreactors. In fact, type, concentration and inoculum density.
cell/tissue/organ functions, as cells integrate when compared to 2D protocol the effect is A wide range of microcarrier types are com-
external signals, including those from cell- striking - by integrating both expansion and mercially available today; supports can be
cell direct interaction, secretion/exchange of differentiation steps in a controlled bioproc- porous or non-porous, composed by gela-
soluble factors and/or metabolites. Extracel- ess, we were able to increase significantly tin, glass, collagen, cellulose, presenting
lular matrices (ECM) provide not only a physi- the neuronal differentiation efficiency by 10- dimensions within the range of 170 to 6000
cal support for cell growth and maintenance fold while reducing drastically, by 30%, the µm. In addition, these microcarriers can be
but are also critical for cell-cell communica- time required for the differentiation process functionalized with different coating materi-
tion within the 3D microstructures, improving [1,31,45]. als (ECM proteins, small molecules) in order
cell behavior, identity and function [33-35]. In the last two years, many efforts were done to further improve cell culture performance
Thus, engineered 3D microstructures have to develop of 3D aggregate systems for con- (attachment and growth). Thus, microcarrier
the potential to provide a higher degree of ef- trolled expansion of undifferentiated hESCs technology allows the flexibility of culturing
ficiency, robustness, consistency and more [46-48] and their directed differentiation into the cells in different conformations and on
predictive cultures. A variety of microstruc- functional cell types, such as neurons [49] different matrixes.
tures have today been established. Examples and cardiomyocytes [30]. Cells cultured in macroporous beads (e.g.
are self-aggregated spheroids (3D cell ag- The cultivation of ASCs as 3D aggregates has Cytopore2, CultisphereS) are cultured in 3D,
gregates), microcarriers and more complex also been explored. For instance, the efficient protected from the shear stress, although the
scaffolds based on natural, non-animal poly- expansion of human neural stem cells as diffusion of oxygen and nutrients within the
mers such as gels and sponges, like alginate neurospheres [4, 50-51] and neonatal porcine bead could be limited. These systems have
and cellulose microfibers or synthetic mate- pancreatic cells as islet-like tissue [52] rep- been used for the expansion and differentia-
rials [36-41] (Fig. 2). resents a significant milestone towards cell tion of mouse embryonic stem cells [53,54]
therapy applications by providing sufficient and for propagation of mesenchymal stem
Culture of stem cells as aggregates numbers of functional cells required to treat cells [55]. In non-porous microcarriers (e.g.
The cultivation of ESCs as 3D aggregates is neurodegenerative diseases (such as Parkin- Cytodex 1 and Cytodex 3), cells are attached
usually associated with differentiation; the son’s disease) and Type 1 diabetes. to the surface of the beads, assuming a simi-

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 33.

 similar to those of native tissues. Within this in regulation of cell behavior, providing sur-
context, several scaffolds have been used in vival, proliferation and differentiation signals.
stirred bioreactors to enhance the formation Thus perfusion mode has been preferentially
of 3D structures and the differentiation of adopted in the majority of stem cell bioproc-
stem cells to myocardium [62], hepatocytes esses since it assures the continuous renew-
[37,38], pancreatic islets [63,40], bone [64], al of nutrients and other factors as well as
lar configuration to that of 2D monolayers. cartilage [65], hematopoietic cells [66], neu- the continuous removal of metabolic byprod-
In this case, cells are equally exposed to the ronal cells [67] and vascular grafts [68]. ucts [62,31].
bulk medium avoiding the existence of diffu- Another benefit of encapsulating cells is the The interactions between growth factors and
sion gradients in the cell culture. Adult stem possibility to circumvent the harmful effects other process parameters are not fully un-
cells including mesenchymal and pancreatic associated to shear stress. derstood. It is therefore critical to quantify
stem cells demonstrated higher expansion It is important to highlight that encapsula- and clarify these effects and their interac-
yields while keeping their phenotype and dif- tion technology will also contribute for the tions in order to design the culture process
ferentiation potential on non-porous micro- success of transplantation tests. In contrast for optimal production of a specific cell type
carriers [32,56]. One of the challenges that to cells in suspension, encapsulated tissue population.
still need to be addressed is the optimization constructs are less susceptible to immu- Finally, the propagation and differentiation
of cell harvesting protocols after expansion/ norejection, their delivery is better target and of stem cell cultures have also been found to
differentiation process, to guarantee efficient the in vivo degradation kinetics can be tuned be dependent of physiochemical conditions
cell-bead separation and high cell recovery permitting a more efficient and functional in- including temperature, pH and dissolved oxy-
yields without compromising their viability, tegration of cells in the host organ [67,39]. gen (pO2). Up to now few studies have been
potential and/or functionality. conducted on the effect of temperature and
Results from our laboratory as well as from Bioprocess parameters pH in stem cell culture. For instance, it has
other teams have shown that human hESCs Successful stem cell bioprocessing, in terms been shown that mesenchymal stem cell dif-
exhibit improved cell growth and retain their of expansion and differentiation, depends ferentiation is enhanced at lower tempera-
differentiation potential when cultured on on the control of key process variables: (i) tures (32ºC) than in 37ºC conditions [70] while
dextran or cellulose-based microcarrier sup- nutrients and metabolites concentration, high temperatures (39ºC) demonstrated to
ports, coated with matrigel or denatured col- (ii) growth factors composition and (iii) the enhance megakaryopoiesis in CD34- en-
lagen [57-61]. Seeding hESC as single cells physiological environment, i.e, temperature, riched cord blood cells [71]. Concerning pH, it
into microcarriers avoided formation of EBs pH and oxygen. was shown that high values (pH 7.60) enhance
and the consequent uncontrolled differentia- The concentration of nutrients and metabo- differentiation and maturation of megakaryo-
tion. Furthermore, after microcarrier coloni- lites should be strictly monitored and con- cyte progenitors [72] whereas low pH values
zation, there is the formation of hESC-micro- trolled during cultivation since it affects cell (7.1) increase their expansion capacity [73].
carriers aggregates in culture (Fig. 2). This growth, viability and differentiation. The out- Oxygen is a critical factor in hESC culture [18]
3D cell growth results in additional increase come of stem cell culture depends on the and there is emerging evidence suggesting
in cell yields, when compared to 2D culture presence/concentration of growth factors that reducing oxygen concentration towards
systems. These cells retained the ability to which provide survival, proliferation, differen- low levels [74,75] is beneficial for the in vitro
differentiate into cells of the 3 germ layers tiation signals to the cells. maintenance of pluripotent hESCs, support-
[59,61]. In order to enhance stem cell metabolism ing self-renewal, reducing spontaneous dif-
and further improve culture performance ferentiation and maintaining karyotypic integ-
Cultivation of encapsulated stem cells different operation modes can be adopted, rity, [76,77] in contrast to normoxia conditions
Cell encapsulating strategies offer the pos- including fed-batch and perfusion. The fed- (20%). Within this context, we recently devel-
sibility of customizing/designing the scaffold batch strategy is often considered the most oped a robust strategy for the mass produc-
environment with specific biomaterials (ex: suitable for tuning and optimizing cell me- tion of undifferentiated hESC using pO2-con-
alginate, poly lactic-co-glycolic acid, poly tabolism; by providing nutrients in a rational trolled bioreactors [61]. In this work, a 12-fold
L-lactic acid, hyaluronic acid), thus creating manner, their uptake and consumption are improvement in the expansion yield was ob-
microenvironments that may be suitable for energetically more efficient leading to re- served, over the standard 2D protocols, when
the self-renewal of stem cells or for direct- duced accumulation of metabolites in culture dissolved oxygen was controlled at low levels.
ing their differentiation along with promoting supernatant [31,69]. However, in the case of Overall, these developments highlight the fact
the organization of cells in 3D configurations stem cells, growth factors play a crucial role that process variations in the culture environ-

34. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

ment could be strategically applied to direct CT-2004-500039; Clinigene Network of Excel-
and manipulate stem cell behavior in vitro. lence, LSHB-CT-2006-018933; HYPERLAB
- high yield and performance stem cell lab,
223011).
CONCLUSION
Along with the opportunities offered by ESCs,
ASCs and iPSCs, together with the tremen- GLOSSARY Reprogramming – A process by which a dif-
dous advances in manipulating their pluripo- ASC – Adult stem cells: undifferentiated cells, ferentiated cell reverts to a pluripotent state
tency and differentiation, many technological found in tissues or organs of the body after Self-renewal – The capacity of a cell to divide
issues remain to be solved. Culturing stem embryonic development, that are capable of into cells that are identical to the original
cells relies still on both “science and art” self-renewal and differentiate into special- stem cell.
and defining the optimal and robust cultiva- ized cells to replenish dying cells and regen- Teratoma – A tumor which is made up of a
tion strategies and culture conditions to ma- erate damaged tissues. heterogenous mixture of tissues, such as
nipulate stem cell fate decisions are yet to Bioreactor – Devices or systems used to grow bone, cartilage, muscle, neuronal cells, etc.
be determined. The definition of engineering large quantities of biochemical cultures, as to Totipotent – The ability of the cell to give rise
principles and practices towards achieve- produce enzymes, antibiotics, virus, vaccines to all cell types of the body. The zygote is
ment of control, automation, standardization, or cells (bacteria, yeast, animal and vegetal totipotent.
validation, reproducibility and safety of the cells as well as stem cells). Unipotent – The ability of a cell to develop into
process and the product will be critical for Differentiation – A process by which a pluripo- only one type of cell or tissue.
implementation of therapeutic and industrial tent or multipotent stem cell becomes a
applications. more specialized cell type.
An optimal/universal stem cell-based bio- EB – Embryoid body: aggregate of cells de- REFERENCES
process capable of embracing all the appli- rived from embryonic stem cells. Upon ag-
cations of these cells does not exist so far. gregation, the cells spontaneously differenti- 1. Davila JC, Cezar GG, Thiede M, Strom S, Miki T & Trosko

Nonetheless, the knowledge gained during ated into multiple cell types derived from the J (2004) Use and application of stem cells in toxicology.

the last years, in which the quantitative char- three germ layers, recapitulating embryonic Toxicol Sci 79, 214-23.

acterization of expansion and differentiation development. 2. Jensen J, Hyllner J & Bjorquist P (2009) Human em-

processes is included, provides important in- ESC – Embryonic stem cells: undifferentiated bryonic stem cell technologies and drug discovery. J Cell

sights for the implementation of such univer- cells derived from a preimplantation embryo Physiol 219, 513-519.

sal stem cell production platforms. (inner cell mass of blastocyst) that are ca- 3. Krtolica A, Ilic D, Genbacev O & Miller RK (2009) Hu-

Over the next few years, we anticipate sig- pable of self-renewal, and can develop into man embryonic stem cells as a model for embryotoxicity

nificant developments in this field, that will cells and tissues of the three primary germ screening. Regen Med 4, 449-59.

include innovative culture systems that al- layer. 4. Nirmalanandhan VS & Sittampalam GS (2009) Stem

low the integration of sophisticated monitor- iPSC – Induced pluripotent stem cells: stem cells in drug discovery, tissue engineering, and regenera-

ing platforms in order to ensure continuous cells generated from somatic cells differen- tive medicine: emerging opportunities and challenges. J

culture evaluation at a cellular level. These tiation by the induced expression of specific Biomol Screen 14, 755-68.

advances in stem cell bioprocessing will for reprogramming factors. 5. Hay DC, Zhao D, Ross A, Mandalam R, Lebkowski J & Cui

sure contribute to the implementation of nov- Microcarriers – Bead matrix that supports at- W (2007) Direct differentiation of human embryonic stem

el therapies and fulfill at least the expecta- tachment and growth of anchorage depend- cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.

tions posed by stem cells. ent cells in suspension culture. Cloning Stem Cells 9, 51-62.

Multipotent – The ability of cell to develop into 6. Kroon E, Martinson LA, Kadoya K, Bang AG, Kelly OG,

more than one cell type of the body. Multipo- Eliazer S, Young H, Richardson M, Smart NG, Cunningham

ACKNOWLEDGMENTS tent cell types in the body comprise lineage- J, Agulnick AD, D’Amour KA, Carpenter MK & Baetge EE

The authors acknowledge the financial sup- committed progenitors, including organ- (2008) Pancreatic endoderm derived from human embry-

port received from the Portuguese Foun- specific adult stem cells. onic stem cells generates glucose-responsive insulin-se-

dation for Science and Technology (PTDC/ Pluripotent – The ability of a cell to give rise creting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-52.

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canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 35.

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canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 37.

 Stem cell research
meets nanotechnology
Ricardo Pires das Neves, 1,2 e Lino Ferreira 1,2
SUMMARY
The recent application of nanotechnolo- 1 CNC - Center of Neurosciences and Cell Biology, University of Coimbra, Portugal
gies into the stem cell field promises to 2 Biocant - Center of Innovation in Biotechnology, Cantanhede, Portugal
open new avenues in regenerative medi-
cine. Nanotechnologies can be a valu- Corresponding Author Contact: lino@biocant.pt
able tool to track and image stem cells,
to drive their differentiation into specific
cell lineages, and ultimately to under- INTRODUCTION and other nanomaterials with sizes down to
stand their biology. This will hopefully The existence of a multipotent hematopoi- 10 nm. In 1959, Richard Feynman launched
lead to stem cell-based therapeutics for etic stem cell was demonstrated for the first the foundation of the nanotechnology field.
the prevention, diagnosis, and treatment time by Till and McCulloch in 1961. They Since then, several extraordinary discover-
of human diseases. Despite these op- demonstrated that a single hematopoietic ies have been made: Richard Smalley dis-
portunities, nanotechnologies also pose stem cell could (i) give rise to a mixed popu- covered fullerenes in 1985, Sumio Iijima
several risks since they can be cytotoxic lation of blood cells (granulocytes, macro- discovered carbon nanotubes in 1991, and
and affect the differentiation program of phages, red blood cells, etc…) and (ii) had Louis Brus the quantum dots in 1996.
stem cells. Here, we discuss the future the ability to self-renew [1]. The isolation The intersection of nanotechnologies with
opportunities and challenges that face of mouse embryonic stem cells by Martin stem cell research is recent and has been re-
this young field of research. Evans in 1981, human embryonic stem cells viewed by us elsewhere [2, 3]. In this work we
by James Thompson in 1998, and inducible will review the current research topics in this
pluripotent stem cells by Shinya Yamanaka area: stem cell microenvironment and tissue
in 2006, propelled the scientific community engineering, stem cell tracking and imaging,
to understand the properties of these cells stem cell transfection, isolation and sorting,
and evaluate their therapeutic effect in the and molecular detection (Fig. 1). When ap-
context of the regenerative medicine. propriate, we will describe some examples
The first observation of nanomaterials was about the research that we are conducting
made by Richard Adolf Asigmondy in 1914. at Centre for Neuroscience and Cell Biology
He performed a detailed study of gold sols (CNC) and Biocant in this research area.

Figure 1. Nanotechnology applications in Stem Cell Biology and Medicine. Nanodevices can be used in stem cell tracking and imaging but also
in isolation and sorting of stem celis, both for basic science and translational medicine. Stem cell fate can be modulated by internalization
of nanocarriers with biological molecules or by external cues given by biomimetic scaffolds. Stem cell transfection and molecular detection
make use of nanodevices for intracellular access but also for intelligent delivery and sensing of biomolecules. These technologies have a
great impact in stem cell microenvironment and tissue engineering studies and have a great potential for biomedical applications.

38. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

Modulation of stem cell-fate by the microen- the following aspects: (i) Laser fabricated
vironment nanogrooves to study cell-cell interactions;
Stem-cell biology has been studied mainly (ii) nanowires to study intra- and intercel-
in vitro with cells cultured on flat substrates lular biological processes; (iii) nanophase
coated, for example, with collagen or lam- thin film to study cell adhesion and pro-
inin, or in co-culture systems where feed- liferation; (iv) Lab-on-a-chip with nano-
er-cell layers are used to support stem cell reservoir to study environmental cues; (v) ters in a given tissue is critical in deter-
growth. These culture conditions are very Self-assembly peptides and nanofibers to mining how cells behave within that tissue.
different from the environment that stem mimic ECM; (vi) Nanoliter-scale synthesis The ECM can be reproduced in vitro by the
cells experience in the body. For example, of arrayed biomaterials; (vii) Micro/nanopat- use of 3D scaffolds. For that purpose, sev-
the extracellular matrix (ECM) is difficult to terned surface to study stem cell response eral natural (fibrin, collagen, hyaluronic
mimic in plastic dishes; most frequently to topography and mechano-transduction; acid, etc…) or synthetic (polyethylene
stem cells are cultured in rigid polystyrene and (viii) Nanoparticles to control release glycol, poly(lactic acid-co-glycolic acid),
tissue-culture plastic where cells are ex- growth factors and biochemicals. poly(glycerol sebacate) etc…) biomaterials
posed to soluble factors in liquid media. It is clear from this previous list that bio- can be used. Recently, we have prepared
This is different in the body where the ECM material design for stem cell applications a hyaluronic acid-based gel to create a 3D
creates a soft microenvironment where is progressively abandoning the strategy microenvironment for the self-renewal of
these molecules are anchored in close of developing an inert mechanical sup- human embryonic stem cells [5].
proximity to cell surfaces. This much more port and adopting the notion that this type When a greater control over the properties
constrained three-dimensional (3D) niche of cells need a more dynamic substrate of the material is required the best option
is a unique microenvironment that has a capable of directing interactions at the is to produce synthetic bioactive scaffolds.
prominent role in the maintenance and dif- cell-material interface and may stimulate Issues like immunogenicity, pathogen
ferentiation of stem cells. This micro-envi- and commit cell behaviour through physi- transmission and purification difficulties
ronment is formed by different components cal forces, biochemical interactions or to- have encouraged this option. An example
including cell-cell interactions, extracellu- pography. This interaction of biomaterials of a synthetic scaffold is (polyethylene gly-
lar matrix, mechanical properties and se- with the chemical and physical features of col) (PEG) gels which can be chemically
creted factors. Collectively, they constitute stem cells occurs at the micro- and nano modified to incorporate a compendium of
a complex microenvironment that is diffi- scales. bioactive molecules [6]. Immobilization
cult to recapitulate in vitro. Stem cell niche Cell-cell interaction studies generally rely seems to increase the stability of the mol-
research uses nanotechnologies to mimic on co-culture strategies where the effects ecules, promote persistent signalling and
this microenvironment in order to deter- of particular molecules are hidden in the induce receptor clustering [7]. It was re-
mine what are the mechanisms underlying great complexity of the culturing system. cently shown that the covalent attachment
the conversion of a stem cell into different It is therefore difficult to discern the role of fibroblast growth factor 2 (FGF2) to a
cell types. On the other hand, these biomi- of soluble or tethered molecules in terms synthetic nanofibrillar surface composed
metic approaches to create synthetic mi- of cell-cell interactions. In tissues, the of a network of polyamide nanofibers re-
croenvironments are very challenging be- ECM contains many macromolecules such sulted in the stabilization of the growth
cause there is much we do not understand as proteoglycans, collagens, laminins, factor and increased its potency 100-fold
about the natural stem cell niche. Several fibronectin and sequestered growth fac- relative to FGF2 in solution. In response to
researchers believe that it may be possible tors. This molecular repertoire is respon- the tethered FGF2, embryonic stem cells
to create synthetic stem cell niches that are sible for the bioactivity of the ECM. For exhibited increased proliferation through
more bioinspired than biomimetic and po- example, the sequences of many ECM pro- activation of mitogenic pathways [8]. An-
tentially more efficient than those observed teins or receptor ligands are presented to other example that illustrates the impor-
in nature. Therapeutically, it may be more stem cells and are recognized by dimeric tance of ligand presentation in stem-cell
useful to take this bioinspired approach in cell-surface receptors known as integrins. fate and function is the immobilization of
the design of the synthetic niche so that it Binding of integrins to these molecules leukaemia inhibitory factor (LIF), which led
acts on the stem cells in an unnatural way can trigger a cascade of signalling events to more efficient and prolonged activation
to achieve a therapeutic goal [4]. that will impact the gene expression pat- of LIF targets and maintenance of embry-
Current research efforts in both biomimetic tern of the stem cell. Therefore, the type of onic stem cells in an undifferentiated state
and bioinspired strategies are focussing in ECM molecules that a stem cell encoun- when compared with soluble LIF [9].

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 39.

 ness has a primary role in stem cell line- factors, and small chemicals present an
age specification. This study reported that excellent tool to control the differentia-
human mesenchymal stem cells (MSCs) tion of stem cells. Some of these biomol-
were able to differentiate into tissues that ecules/chemicals have (i) poor solubil-
had their mechanical properties more ity, (ii) can be quickly cleaved by cellular
closely mimicked by the polyacrylamide enzymes, (iii) and have side effects when
A major challenge in tissue engineering is substrate upon which they were cultured. administered systemically. Therefore, bio-
to vascularise the transplanted tissue con- Thus, MSCs that were cultured on rigid degradable and biocompatible nanoparti-
structs to meet the metabolic demands of (bonelike) gels differentiated into osteob- cles able to target stem cells and release
recovery and integration into the organism. lasts, those that were cultured on medium the payload in their cytoplasm with conse-
Therapeutic application of the main vas- stiffness (muscle-like) gels differentiated quent activation of signalling cascades will
cular signalling molecules (e.g. vascular into muscle cells, and those that were cul- be of great interest. Recently, we have re-
endothelial growth factors (VEGFs), FGFs, tured on more elastic gels (neural-like) ported the successful delivery of vascular
TGFs, angiopoietins, ephrins and various differentiated into neural cells [12]. The growth factors into hESCs, by incorporat-
chemokines) can be a promising approach acknowledgment that matrix mechanical ing growth factor-release particles in hu-
to enhance blood supply and neovasculari- properties impact on stem-cell fate led to man embryoid bodies (EBs) [15]. These bio-
sation processes around the transplanted the exploration of further links between degradable nanoparticles are compatible
tissue. For example, the immobilization of stem cell behaviour and matrix elasticity. with cell viability and proliferation and are
VEGF onto a metal substrate using a bio- Since then, several studies have reported extremely effective in terms of differentia-
mimetic polymer film was able to promote that substrate stiffness modulates the tion. In some cases, the effect on vascu-
the survival and proliferation of endothe- proliferation and differentiation of em- lar differentiation of particles containing
lial cells and to induce the differentiation bryonic stem cells and certain types of growth factors was superior to the one ob-
of hMSCs into endothelial cells[10]. adult stem cells. For example, adult neu- served by exposing EBs to large extrinsic
In order to discover novel biomaterials that ral stem cells cultured on a relatively soft doses of the same growth factors. Moreo-
have effects on stem cells, high-through- matrix to mimic brain tissue gave origin to ver, nanoparticles were taken up by human
put approaches are likely needed. Recent more neurons than cells grown on a stiffer embryonic stem cells and accumulated in
efforts have used acrylate-based poly- synthetic matrix, where glial cells were the perinuclear region indicating that they
mers spotted in arrays composed of hun- predominant [13]. Another study found that could constitute a delivery platform not
dreds of different polymer combinations the rate of adult skeletal-muscle stem- only for growth factors but also for other
and found several platforms that could cell proliferation increased with substrate type of biomolecules [15].
promote embryonic stem cell attachment, stiffness [14]. We predict that more stud-
proliferation and differentiation [11]. Simi- ies will show that the physical properties Stem Cell Engineering
lar studies must be conducted this time of culture substrate have a major impact Various micro-/nanofabrication technolo-
aiming at incorporating many other bio- on stem-cell fate. With time different cul- gies have been used to design scaffolds
physical and biochemical parameters in ture platforms based on soft biomaterials able to drive the differentiation of stem
this type of high throughput approaches. are likely to largely replace those made of cells into specific cell lineages. For ex-
Different matrices, natural and/ or syn- the standard, rigid, tissue-culture plastic ample, nanofibers are able to provide an
thetic, can be produced to generate cell- in order to specifically modulate differen- in vivo-like extracellular scaffolding to
culture substrates with defined physical tiation into different fates. promote regeneration of specific tissues.
characteristics like rigidity (stiffness) and Usually stem cell cultures are presented Nanopatterned or nanostructured scaf-
topography. Unlike regular tissue culture with soluble growth factors and biochemi- folds are designed to trigger stem cells to
plastic substrates, they provide diffusion of cals in their culture media. This approach become specific cell types comprising the
soluble molecules to the basal surface, as may not always be possible due to specific tissues and organs in the body.
well as the apical surface. They are espe- chemical properties of the molecules to Current research efforts in nanotechnol-
cially interesting in the context of studies be delivered. Instead, it may be more ben- ogy applications in tissue engineering are
of homeostatic and disease-related matrix eficial to deliver these molecules directly focussing in the following aspects: (i) Mi-
stiffness impact on stem-cell behaviour. inside the cell to better control their bio- cro/nano structured scaffolds for tissue
A groundbreaking study by Engler and availability. Nanoparticles that can carry engineering; (ii) magnetic nanoparticles
collaborators [12] found that matrix stiff- molecular payloads of proteins, growth for magnetic force-based tissue engineer-

40. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

ing; (iii) nanocomposites for bone tissue timing and delivery methods, etc…It is of
engineering; and (iv) micro/nanoencapsu- utmost importance to demonstrate the
lation for cell therapy long-term safety of these cell-based ther-
The ultimate goal of tissue engineering is apies. For example, studies in mice have
to recreate the right conditions to support showed that stem cells injected into the
the massive growth, physical folds and heart following myocardial infarction gave
twists and cellular and molecular events origin to mineralized tissue [17]. This was and ECM derived from the pericardium
of great complexity that occur during re- possibly due to the reaction of the trans- of horses can be used as a reconstruc-
generation or replacement of a tissue. The planted cells to the stiffer mechanical en- tive material in the dura mater layer of the
general strategy is to grow cells in a scaf- vironment of the scar tissue that was not brain meninges following a craniotomy.
fold engineered to define the geometry of appropriate to induce cardiogenesis. In a recent development, it was possible
the replacement tissue and provide the Stem cell based therapy is in hand when to engineer a bioartificial heart through
right environmental cues that promote tis- compared with the major challenge that a decellularization process with deter-
sue regeneration. is replacing an entire organ with a com- gents to produce a biocompatible cardiac
Stem cell research has been showing that plex repertoire of cell types carefully or- ECM scaffold with a perfusable vascular
stem cells or at least progenitor cells can ganized to maximize its functional output. tree, patent valves and a four-chamber-
be isolated from almost every tissue in Self-organization seems to be an intrinsic geometry template for biomimetic tissue
the body. With the appropriate conditions characteristic of cells; cells will cluster engineering. These researchers man-
it may be possible to stimulate these cells and communicate with cells that express aged to populate this ECM scaffold with
to form new tissue. Several studies have the same cellular adhesion molecules and an appropriate cell composition, and the
tried to use this biologic intrinsic regener- under the right conditions can form com- maturation of this construct developed a
ative potential. Stevens and collaborators plex structures like the sprouting tubular nascent pump function [19]. Almost at the
have injected alginate gels or modified hy- networks formed by endothelial cells lining same time another group reported the
aluronic acid gels into an artificial space blood vessels. Simple artificial cell adhe- transplant of a tissue engineered airway
between the tibia and the periosteum (the sions have been engineered using biotin confirming that this approach can in fact
outer lining of the bone). This stimulated conjugated to cell surfaces and the addition produce whole-organ tissue engineering
bone and cartilage formation from resi- of avidin to trigger the assembly of multi- products that are clinically relevant [20].
dent progenitor cells in the inner layer of cellular clusters due to the biotin-avidin in- The scaffold in this case was a decellular-
the periosteum [16]. This is an example of teraction in order to aid in the development ized human donor trachea that was seeded
how simple biomaterials can support the of more complex cellular interactions [18]. with the patient’s own bone marrow cells
generation of complex tissue by using the Communication between cells in the tis- that had been differentiated into cartilage
body as a bioreactor and without the need sue is essential but a lot of information is cells. In contrast with traditional trans-
of exogenous cell transplants. In situa- also coming to cells from their extracel- plant surgery, the decellularization proc-
tions where the regenerative potential is lular environment; the scaffold that sur- ess solved the problem of tissue rejection
low due to different factors like age, trau- rounds and separates cells within a tissue because it removed human leukocyte an-
ma, scarring or inflammation like the ones is a complex material called the Extracel- tigen traces that are major determinants
that follow myocardial infarction or brain lular Matrix (ECM). Tissue engineering in tissue compatibility with the advantage
stroke for example, biomaterial interven- takes lessons from the characterization that the patient did not need any immuno-
tions that include cells of external origins of natural bioactive scaffolds in order to suppressive drugs [20].
must be included. construct artificial ones. When possible, a Both decellularized tissues and synthetic
Several clinical studies with stem cell- very efficacious strategy is to use cadaver- scaffolds offer distinct and important
based therapies are currently being per- or animal-derived decellularized ECM be- benefits for tissue engineering. Typically,
formed worldwide. Despite the consider- cause these products have an inherent bi- biomaterials-engineering approaches fo-
able knowledge gathered in the last years oactivity to induce regeneration. This type cus on chemical and/ or physical mecha-
in stem cells biology, further pre-clinical of approach has found clinical applications nisms by which the ECM influences cells
and clinical studies are needed to clarify in routine medical procedures and in life- and try to reproduce those effectively for a
what is the best stem cell source for cer- saving scenarios. Products derived from given tissue. For instance, it may be some-
tain medical applications, the mechanism the small intestinal submucosa of pigs are times necessary to work the anisotropic
underlying their regenerative effect, the used routinely in reconstructive surgery, features of the culturing system to better

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 41.

 teraction of cells with these nanogrooved electrophysiological application; and (iv)
surfaces was recently analysed by live cell photothermal nanospectroscopy to identify
imaging [23]. These studies have shown stem cells in the body.
that cells acquire elongated morphologies Nanotechnology enables labelling stem
on a surface with nanogrooved patterns and cells using magnetic, genetic or fluores-
align along that pattern. In this study, the cent probes which can be monitored by
mimic the tissue. Nanogrooves induced by dynamic behaviours of living mesenchymal magnetic resonance imaging (MRI) or fluo-
laser irradiation are an example of this type stem cells on a nanogroove substrate with rescence imaging. For example, super-
of approach in bone differentiation studies. a 200 nm groove depth, an 870 nm ridge paramagnetic iron oxide (SPIO) nanopar-
The alignment of bone cells and collagen width and a 670 nm groove width were ob- ticles can be used to label stem cells and
matrix is closely related to the mechani- served using time-lapse microscopy. These analyse their fate in transplantation assays
cal properties of bone. Scaffolds that are researchers found that filopodia moved by MRI. In fact, several SPIO nanoparticle
able to promote osteoblast differentiation as if they were probing the surroundings formulations (e.g., Feridex/ Endorem and
and modulate their orientation to generate of the cell protrusion, and then some cell Ferucarbotran) have FDA (United States
mineralization in a preferred direction are protrusions invaded the probed areas. Cell Food and Drug Administration) approval
essential for the generation of biomimetic protrusions that extended perpendicular to for human use as MRI contrast agents.
bone tissue. Bangshang Zhu and collabora- the nanogroove direction tended to retract The development of nanoparticles for cell
tors, used nanogrooves to induce alignment more rapidly than those that were parallel tracking is a multidisciplinary task that
of rabbit mesenchymal stem cell (MSC)-de- to it. From these observations, the authors needs highly skilled biological, physical
rived osteoblast-like cells and collagen fi- hypothesize that the retracting phase of and chemical expertise. In most cell types,
bres. Nanoscale groove–ridge patterns (300 cell protrusions play a role in cell align- the nanoparticles are taken up through
nm in periodicity, 60–70 nm in depth) on the ment along the nanogroove patterns. Fur- endocytosis during in vitro cell cultiva-
surface of polystyrene were made by polar- ther studies using similar live cell imaging tion and accumulate in the endosomes. Al-
ized laser irradiation. The cells and actin strategies are required to clearly elucidate though, some cell types are easier to label
stress fibbers were aligned and elongated the role of filopodia-mediated cell align- than others, one has to take into account
along the direction of the nanogrooves. The ment in these nanopatterned substrates. the biological features of the cells to be la-
results suggested that nanoscale fibrous belled and sometimes use chemical tricks
cues in the longitudinal direction might Stem Cell Tracking and Imaging to promote the internalization of the nano-
contribute to the aligned formation of bone To better understand stem cell biology particles; e.g. mononuclear blood cells are
tissue [21]. A recent study has shown that and realize the full potential of stem cell easier to label because by their nature they
osteoblasts are responsive to nanopatterns therapy, it is essential to monitor the traf- are primed for internalization of other cells
down to 75 nm in width and 33 nm in depth. ficking of labelled stem cells by molecular or molecules by phagocytosis. Also, quite
Nanotexture-driven mineral deposition is and cellular imaging. Monitorization and often the internalization of nanoparticles
induced and responsive to even smaller na- tracking of these cells inside an organism requires the use of excipients, which may
nopatterns of 50 nm in width and 17 nm in is a difficult task. This is why stem cells include peptides and cationic agents [2].
depth. In addition, gene expression of os- are usually tracked invasively by immuno- The labelling of stem/ progenitor cells and
teoblast specific markers is upregulated by histochemistry after removal of tissues or their transplantation and tracking inside
nanogrooves [22]. These studies indicate organs from small animals. On the other the organism may enlighten the dynam-
that nanogrooves can be a very promising hand, for pre-clinical and clinical trials, ics of stem cell differentiation, migration
tool to direct the bone response at the in- it will be fundamental to track stem cells and therapeutic benefit in several disease
terface between an implant and the bone noninvasively in order to assess their graft- scenarios like myocardial infarction, cancer
tissue, which can benefit the installation of ing and therapeutic effect. Research in this and neurological conditions. In fact, not so
implants in compromised patients. area is focussing on the development of the long ago, Lewis and collaborators succeed-
Although various models have been pro- following nanotechnologic approaches: (i) ed in demonstrating that stem/progenitor
posed for how this alignment of cells in Superparamagnetic iron oxide nanoparti- cells labelled with magnetic nanoparticles
response to nanopatterns occurs, much cles for stem cell labelling and diagnostics; when injected in the blood stream of small
remains to be clarified. Studies with fixed (ii) quantum dots and fluorophore nanoc- animals can later be isolated by magnetic
cells do not lend themselves to answering rystals for stem cell tracking and imaging; separation after in vivo migration to study
these questions. The dynamics of the in- (iii) nanoprobes for stem cell detection and the differentiation of the cells exposed to a

42. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

biological environment [24]. Although fea- row emission and broad excitation spec-
sible these type of studies are still limited trum which allows simultaneous analysis
by technical challenges. In some cases, it of multiple cell targets by using a single
is difficult to distinguish SPIO-labelled cells wavelength activation [27]. Qdot conjuga-
from other hypointense regions on MRI im- tion has been used to follow biomolecules
ages. Such signals can arise from regions like growth factor receptors, integrins,
containing blood hemoglobin, or blood phospholipids, and enzymes among oth- to pluripotent embryonic stem cells. Also,
clots/trombi [25]. The development of new ers, when stem cells are exposed to differ- the long-term effects of these nanopar-
nanoparticle formulations based on probes ent environments or soluble factors [28]. ticles and their degradation products on
other than iron oxide will be of great inter- In vivo, small animal-tracking of delivered stem cells should be also assessed at
est for stem cell applications. Some exam- stem cells has been difficult due to tech- gene and protein level. Indeed, qdots may
ples have been recently reported based on nical limitations in terms of labelling but induce cytotoxic effects due to release of
nanoparticles containing fluorine or man- also due to the autofluorescent nature of cadmium triggered by their oxidative deg-
ganese [26]. animal tissues. With imaging platforms radation [32]. This metal can bind to the
Stem cell differentiation programs are highly like Caliper’s IVIS it is now possible to do sulfhydryl groups of critical mitochondrial
regulated processes that may be sensitive qdot-tracking in whole animals. Rosen proteins and induce the production of re-
to nanoparticle internalization. Therefore, it and collaborators (2007) have reported active oxygen species, leading to mito-
will be essential to evaluate the long-term the optimization and validation of a qdot chondrial dysfunction and ultimately cell
effects of these nanomaterials in the biology long-term tracking technique of labelled death [33]. However, it might be possible to
of stem cells. It is possible that the intracel- mesenchymal stem cells (MSCs) in the coat qdots in a way that circumvents their
lular degradation of the nanoparticles pro- mammalian heart. These researchers in vivo degradation.
duces molecules that are bioactive and have found that bright qdot crystals were able
potential to activate signalling cascades that to illuminate MSCs in histological sections Stem Cell Transfection
can change the differentiation program of for at least 8 weeks following delivery Efficient gene delivery systems are re-
the stem cells. The prospect of tracking stem enabling the complete three-dimensional quired to fully manipulate stem cell be-
cells with nanoparticle labelling technolo- reconstruction of the locations of all stem haviour. This ability is essential for studies
gies is dependent on a careful evaluation of cells following injection into the heart [29]. of gene function, control of stem cell dif-
their impact on stem cell biology and solving The use of these nanocrystals for stem ferentiation, cellular labelling and purifi-
issues like dilution of nanoparticle content cell-labelling depends on their origin and cation, and cellular secretion of therapeu-
(and consequent decrease of signal) during surface modification, mode of internaliza- tic drugs. Viral methods have been widely
cell division and release by exocytosis. There- tion and type of stem cells used [30]. Stem used and have good transduction efficien-
fore, complementary techniques like fluores- cells are labelled with qdots in several cies; however they integrate into the ge-
cence must be developed to validate the MRI ways, including receptor-mediated up- nome of the host cell. Because of safety
results. Our group is developing nanoparticle take, lipofection, electroporation, or pas- issues, non-viral gene delivery systems
formulations that escape the endosome and sive loading. Under appropriate conditions, are preferred for stem cell transfection.
combine fluorescent and magnetic labelling qdots are effective at labelling stem cells The key challenge in this case is to deliver
to circumvent these issues. without affecting their self-renewal and genes to stem cells with high efficiency and
Other nanoparticles that are increas- differentiation potentials. For example, low cytotoxicity. Nanotechnology provides
ingly used in cell biology are quantum dots hMSCs labelled with qdots (0.250 to 16 nM) invaluable tools for stem cell transfection.
(qdots). These are another class of nano- maintained their osteogenic differentiation The main efforts in this area are focuss-
materials usually in the size range of 2-10 potential[30]. Also, intravenous injection of ing on: (i) Nanomaterials for in vivo gene
nm that can be used for long-term label- Qdots-labelled mesenchymal stem cells delivery; (ii) nanowires for gene delivery to
ling of stem cells. Qdots have become a into NOD/SCID mice (1×106 cells) showed stem cells; and (iii) micro/nanofluidic de-
commercial success because they exhibit an accumulation after 24 h in the lungs, vices for stem cell electroporation.
a brighter fluorescent signal, have higher liver and spleen, but not in the heart, brain Nanoparticles have been shown to be ef-
photostability (hours) and large stokes or kidneys [31]. At the moment, most stud- fective vectors for gene transfection. Green
shift (difference between excitation and ies were dedicated to labelling multipotent and collaborators developed a class of pol-
emission wavelengths) than organic dyes mesenchymal stem cells. Therefore, it ymers (poly(B-amino esters)) that are able
and fluorescent proteins. They have nar- will be important to extend these studies to condense DNA into nanoparticles that

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 43.

 These nanodevices are helical structures a ferromagnetic matrix and is placed in a
of approximately 1–30 nm in diameter with MACS Separator. The separator contains a
lengths >100 nm [39], that are able to strong permanent magnet creating a high-
encapsulate drugs and genetic material. gradient magnetic field in the magnetisable
These CNTs are internalized by an endocy- column matrix. Labelled target cells are
tosis independent way and reach the peri- retained in the column via magnetic force,
facilitate cellular uptake and endosomal nuclear region after a few hours of contact whereas unlabeled cells flow through. By
escape. These particles can be coated for with the cells [40]. After 24 h, a significant simply rinsing the column with buffer, the
ligand-specific delivery, are biodegradable number of CNTs have been observed at the entire untouched cell fraction can be eluted.
and have low toxicity [34]. Another approach cell nucleus of mesenchymal stem cells 3) Elution of the labelled cell fraction: after re-
used specific recognition of cell surface [41]. Recent advances on this type of strat- moving the column from the magnetic field
molecules coupled to an organic-inorganic egy have produced a novel platform for in- of the MACS Separator, the retained labelled
hybrid carrier where carbonate apatite na- tracellular delivery of genetic material and cells can easily be eluted with buffer.
noparticles were coated electrostatically nanoparticles, based on vertically aligned The entire procedure can be performed in
with fibronectin and E-cadherin producing carbon nanosyringe arrays of controllable less than 30 min, and both cell fractions,
an efficient gene delivery system for embry- height. Using this technology, Park and magnetically labelled and untouched cells,
onic stem cells [35, 36]. These studies with collaborators have shown that plasmid are immediately ready for further use, such
nanoparticles reported higher efficiencies and quantum dots can be efficiently deliv- as flow cytometry, molecular analysis, cell
for gene delivery and expression than the ered to the cytoplasm of cancer cells and culture, transfer into animals, or clinical cell
ones obtained with the leading commer- human mesenchymal stem cells [42]. therapy applications.
cially available transfection agent, Lipo- MACS MicroBeads are superparamagnetic
fectamine 2000 [34-36]. Stem Cell Isolation and Sorting particles made of an iron oxide core and a
Nucleic acids (DNA and RNA) can be deliv- A key challenge in stem cell research is to dextran coating. They are nano-sized, rang-
ered in the cytoplasm by the nanoparticles identify and isolate stem cells from a hetero- ing between 20 and 150 nm in diameter, and
in a gradual release profile or suddenly, geneous cell population by a low cost, fast form colloidal solutions, i.e., they remain
depending if the genetic modulation is in- and easy procedure. Magnetic or fluorescent dispersed [43]. Superparamagnetism means
tended to be sustained in time or not. This is nanoparticles can be used to label stem cells that in a magnetic field the iron oxide cores
of great advantage when compared with the followed by magnetic force or flow cytometry magnetize strongly like ferromagnetic mate-
commercially available options. Indeed, na- sorting. In the stem cell biology research field rial, but when removed from the magnetic
noparticles with covalently immobilized DNA the MACS® technology, briefly described field the particles do not retain any residual
or siRNA were shown to be a very effective below, is the leading commercial brand and magnetism. The dextran coating of the Mi-
strategy to regulate gene expression [37,38]. has made the separation of certain stem and croBeads permits chemical conjugation of bi-
Rosi and collaborators have shown that progenitor cells a routine procedure. omolecules. Numerous highly specific mAb,
DNA-gold nanoparticles can have effective The MACS® System is characterized by the fluorochromes, oligonucleotides and various
intracellular target recognition and binding use of nano-sized superparamagnetic parti- other moieties have all been covalently linked
and can be used for antisense gene regula- cles (approx. 50 nm in diameter), cell sepa- to MicroBeads, thereby transferring addi-
tion on stem cells [37]. For somatic cells, it ration columns, and MACS Separators which tional biochemical and physical properties to
has been reported that these systems have provide the required strong magnetic field them [43]. The nano-sized iron-dextran parti-
high resistance to nuclease degradation and [43]. Magnetic cell separation is performed cles confer several unique features on MACS
high cellular uptake as a result of their oligo- in three steps: Technology. MACS MicroBeads are biode-
nucleotide functionalization. These nanopar- 1) Labelling: cell preparation and labelling gradable and do not alter cell function. Ef-
ticle systems offer exciting opportunities for methods are similar to those used in flow cy- fects on the functional status of cells by mag-
gene expression regulation and the control of tometry. Each target cell in a cell suspension netic labelling with MicroBeads are primarily
stem cell fate. Our research group has sev- is immunomagnetically labelled using MACS dependent on the target cell surface antigen
eral projects in this area aiming to modulate MicroBeads, which typically are covalently and on the degree of crosslinking by mAb or
the differentiation of pluripotent stem cells conjugated to a monoclonal antibody (mAb) ligands conjugated to the MicroBeads, but
by the use of nanomaterials. or to a ligand specific for a certain cell type. not on the MicroBeads themselves. Cells la-
Other good delivery strategies to transfect 2) Separation: the cell suspension is passed belled with MicroBeads have been used for
stem cells are carbon nanotubes (CNTs). through the separation column that contains numerous functional in vitro assays, experi-

44. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

mental transfers into animals, and therapeu- the fluorescence-quenching beacon [44].
tic transplantations in humans. Other examples include pH nano-sensors
[45] and nanoparticles able to quantify enzy-
Molecular Detection and Biosensors matic activities [46]. A recent study reported
In addition to detect labelled stem cells, it the preparation of polymeric nanoparticles
is of paramount importance to detect par- bearing a kinase peptide substrate and near-
ticular molecules in the stem cell pathway at infrared fluorophore chemically coupled to 2. Ferreira L, Karp JM, Nobre L & Langer R (2008) New

the cellular level. Nanotechnology provides the nanoparticle. In the nonphosphorylated opportunities: the use of nanotechnologies to manipu-

advanced probes and devices for molecular state, these nanoparticles have low levels of late and track stem cells. Cell Stem Cell 3, 136-146.

detection. For example, (i) carbon nanotube fluorescence because of the short distance 3. Ferreira L (2009) Nanoparticles as tools to study and

optical probes for single molecule detection between each fluorescence probe in the na- control stem cells. J Cell Biochem 108, 746-752.

in living cells; (ii) carbon nanotube nanoelec- noparticle. Upon kinase phosphorylation of 4. Fisher OZ, Khademhosseini A, Langer R & Peppas NA

trode array for deep brain stimulation; (iii) the phosphate groups that are incorporated (2010) Bioinspired materials for controlling stem cell

nanoparticles for neurochemical detection into the peptide substrate the polymeric na- fate. Acc Chem Res 43, 419-428.

and biosensors; (iv) nanowires for molecu- noparticles dissolve due to charge unbalance 5. Gerecht S, Burdick JA, Ferreira LS, Townsend SA,

lar detection in stem cells; (v) self-assem- and the fluorescence is recovered [46]. Langer R & Vunjak-Novakovic G (2007) Hyaluronic acid

bly polymeric micelle-based bioassays; (vi) hydrogel for controlled self-renewal and differentiation

nanoarrays in mass spectrometry for pro- of human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA

teomic and metabolomic applications; (vii) CONCLUSION 104, 11298-11303.

nanofluidic device for single cell genomic This report identifies challenges and op- 6. Kraehenbuehl TP, Ferreira LS, Zammaretti P, Hubbell

analysis on a chip. portunities where nanotechnology can be JA & Langer R (2009) Cell-responsive hydrogel for encap-

The aim of these tools is to monitor biomol- utilized to advance stem cell research. Al- sulation of vascular cells. Biomaterials 30, 4318-4324.

ecules in real time without using invasive though stem cell nanotechnology is still a 7. Irvine DJ, Hue KA, Mayes AM & Griffith LG (2002) Sim-

or endpoint procedures. Currently, most young discipline, it is already contributing ulations of cell-surface integrin binding to nanoscale-

strategies to analyse intracellular biochemi- for new discoveries in stem cell research clustered adhesion ligands. Biophys J 82, 120-132.

cal processes rely on several steps of cell- and the development of better stem cell 8. Nur EKA, Ahmed I, Kamal J, Babu AN, Schindler M

processing like fixation, permeabilization technology. This survey of research topics & Meiners S (2008) Covalently attached FGF-2 to three-

and labelling, which are time consuming and in stem cell nanotechnology will allow non- dimensional polyamide nanofibrillar surfaces demon-

expensive when scale-up or high through- nano-experts to realize the impact that na- strates enhanced biological stability and activity. Mol

put screening is needed. Nanoparticles can notechnology is having in both basic stem Cell Biochem 309, 157-166.

be an appropriate solution for “bio-sensing” cell biology and in translational applica- 9. Alberti K, Davey RE, Onishi K, George S, Salchert K,

inside stem cells. Sensors are usually com- tions of stem cell research into medicine. Seib FP, Bornhauser M, Pompe T, Nagy A, Werner C &

posed of two parts: one that recognizes and Zandstra PW (2008) Functional immobilization of sign-

binds the target molecule and another that aling proteins enables control of stem cell fate. Nature

signals the binding event. One way of doing ACKNOWLEDGEMENTS Methods 5, 645-650.

this is to immobilize the recognition mol- We acknowledge the support of Crioes- 10. Poh CK, Shi ZL, Lim TY, Neoh KG & Wang W (2010)

ecule to the surface of a nanoparticle. This taminal, MIT- Portugal Program, Marie Cu- The effect of VEGF functionalization of titanium on en-

type of approach was used by Hwang and rie Reintegration Grant, and FCT funding dothelial cells in vitro. Biomaterials 31, 1578-1585.

collaborators to monitor neuronal differen- (PTDC/SAU-BEB/098468/2008; PTDC/CTM/ 11. Anderson DG, Levenberg S & Langer R (2004) Nano-

tiation in vivo using a molecular beacon [44]. 099659/2008; PTDC/SAU-ENB/113696/2009). liter-scale synthesis of arrayed biomaterials and appli-

They have generated a quencher-based fluo- cation to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol

rescent beacon system to sense the neuron- 22, 863-866.

specific miR124a expression. Moreover this REFERENCES 12. Engler AJ, Sen S, Sweeney HL & Discher DE (2006)

beacon was built upon a cobalt ferrite mag- Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.

netic core which enables the dual-imaging 1. Weissman IL & Shizuru JA (2008) The origins of the Cell 126, 677-689.

nanoparticle beacon system to be used for identification and isolation of hematopoietic stem cells, 13. Saha K, Keung AJ, Irwin EF, Li Y, Little L, Schaffer

in vivo cellular tracking by magnetic reso- and their capability to induce donor-specific transplan- DV & Healy KE (2008) Substrate modulus directs neural

nance as well as for monitoring the changes tation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood stem cell behavior. Biophys J 95, 4426-4438.

in the expression of intracellular targets with 112, 3543-3553. 14. Boonen KJ, Rosaria-Chak KY, Baaijens FP, van der

canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010 45.

 tized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and herin and fibronectin embedded in carbonate-apatite

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46. canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010

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Corpo de texto com as referencias bibliográficas numeradas sequencialmen- 1. Tsubokawa M, Tohyama Y, Tohyama K, Asahi M, Inazu T, Nakamura H,
te e listadas no final com o formato exigido no FEBS J., nomeadamente: Saito H & Yamamura H (1997) Interleukin-3 activates Syk in a human mye-
1. Tsubokawa M, Tohyama Y, Tohyama K, Asahi M, Inazu T, Nakamura H, loblastic leukemia cell line, AML193. Eur J Biochem 249, 792-796.
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3. Langer T & Neupert W (1994) Chaperoning mitochondrial biogenesis. In RI, Tissières A & Georgopoulos C, eds), pp. 53-83. Cold Spring Harbor La-
The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones (Morimoto boratory Press, Plainview, NY.
RI, Tissières A & Georgopoulos C, eds), pp. 53-83. Cold Spring Harbor La-
boratory Press, Plainview, NY. Figure legends should be gathered in a single section of the manuscripts,
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