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FREDERICO CONSTȂNCIO ANTÓNIO

RELATORIO DESCRITIVO DE ACTIVIDADE EXPERIMENTAL

DE AULA DE MICROBIOLOGIA

LICENCIATURA EM ENSINO DE BIOLOGIA COM HABILITAÇÕES EM

ENSINO DE QUÍMICA/ GESTÃO DE LABORATÓRIO
3º ANO

UNIVERSIDADE PEDAGOGICA DE MOCAMBIQUE

CEAD CATANDICA, ABRIL DE 2017
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FREDERICO CONSTȂNCIO ANTÓNIO

LICENCIATURA EM ENSINO DE BIOLOGIA COM HABILITAÇÕES EM

ENSINO DE QUÍMICA/ GESTÃO DE LABORATÓRIO

Faculdade de Ciências Naturais e Matemática

Curso de Licenciatura em ensino de Biologia 3º
ano. Relatório de actividade experimental
recomendado por docente da cadeira de
Microbiologia, Msc. Jamila Aboobacar, para
fins avaliativos.

UNIVERSIDADE PEDAGOGICA DE MOCAMBIQUE

CEAD CATANDICA, ABRIL DE 2018
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ÍNDICE

Introdução ……………………………………………………………………………………..4
Objectivos ………..……………………………………………………………………………4
Experiencia 1
Observação de bactérias presentes no iogurte por método de coloração simples……………...5
Protocolo experimental…………………………………………………………………………5
Experiencia 2
Observação de celulas procarióticas presentes no iogurte por método de Gram……………...6
Protocolo experimental………………………………………………………………………..7
Experiencia 3
Observação de bacilos de tuberculose, através de coloração de Zihel-Neelsen……………….8
Protocolo experimental………………………………………………………………………...9
Conclusão……………………………………………………………………………………..11
Referência bibliográfica …………………………………………………………………..….12
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INTRODUÇÃO

Desde antiguidade o homem faz o uso de diversos microrganismos no seu dia a dia, quer na
preparação da comida, quer na de bebidas. Os seres como as bactérias e cianobactérias são
designados por seres procariontes por serem constituídos por células procariontes pertencentes a
reino moneras.

As células procarióticas não apresentam na sua estrutura uma membrana que individualiza o
material nuclear do material citoplasmático. Por outro lado o citoplasma destas células não se
apresenta dividido em compartimentos, por ausência de endomembrana.

As bactérias apresentam uma parede celular quimicamente complexa e podem possuir flagelos
conferindo lhes a mobilidade. Estas podem se apresentam isoladas com forma variada- esférica
ou ovoide (cocos), cilíndricas ou bastonetes (bacilos), helicoidal (espirilos) ou em colonias-
diplococos, estreptococos ou estafilococos.

Objectivo geral:
 Observação microscópica de células procariotas (bactérias)
Objectivos específicos:
 Observação de bactérias por método simples ou de azul-de-metileno.
 Observação de bactérias por método de Gram
 Observação de bactérias por método de Zihel-Neelsen.
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EXPERIENCIA 1

OBSERVAÇÃO DE BACTÉRIAS PRESENTES NO IOGURTE POR MÉTODO DE

COLORAÇÃO SIMPLES.
Para observação de células bacterianas presentes no iogurte, utilizam se esfregaços secos,
fixados e corados, que podem ser conservados pra posterior observação-preparação definitiva.
Na montagem duma preparação definitiva envolve se varias etapas, desde a colheita, esfregaço,
fixação do material, desidratação, coloração e montagem.
Fixação é a técnica que tem como objectivo matar as célula e impedir a destruição do material
biológico ou a ser observado por autólise, de modo a preservar a estrutura inicial. Esta operação
pode ser realizada por acção de factores físicos (calor) ou por químicos (álcool ou formol)
A técnica de coloração a utilizar nesta primeira etapa das experiencia é designada por coloração
simples, em que o esfregaço é coberto com uma solução durante um tempo especifico,
seguidamente a lamina é lavada em agua corrente e seca com papel absorvente em temperatura
ambiente.

Protocolo experimental
I. Material necessário
 Microscópio óptico;
 Lamina;
 Ansa de inoculação;
 Varetas de vidro;
 Agua destilada;
 Papel de limpeza;
 Azul-de-metileno;
 Álcool;
 Óleo de imersão;
 Lamparina;
 Iogurte natural.

II. Procedimento do método:

1) Colocou-se uma gota de água destilada numa lâmina;

2) Com ansa de inoculação retirou se uma pequena porção de iogurte e colocou se sobre a gota
de agua. Aplicou se a técnica de esfregaço e espalhou se o iogurte sobre a lamina;
3) Secou se levemente a chama da lamparina o esfregaço efectuado;
4) Colocou se sobre o esfregaço três gotas de álcool para retirar o excesso de gordura.
5) Deixou se secar o esfregaço ao ar durante alguns minutos.
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6) Colocou se a lamina na tina de coloração sobre duas varetas de vidro e tapou se

completamente o esfregaço com o corante azul de metileno e deixou se actuar durante dois
minutos.
7) Apos o tempo de coloração retirou se o corante do esfregaço por imersão em agua.
8) Deixou se secar ao ar.
9) Observou se ao microscópio óptico com objectiva de 10x para localização do campo
microscópico e depois recorreu se a objectiva de imersão-100x para tal deve se colocar uma
gota de óleo de imerso sobre o esfregaço para facilitar a visualização.

III. Resultados e discussão

Apos o processo de coloração, foi possível observar dois tipos de bactérias diferentes na
morfologia mas todas coradas de azul, dentre as quais umas apresentam se em forma de
bastonetes isoladas (bacilos) e as outras em forma esférica e em colonia (estreptococos). Porem
não foi possível especificar os observados pois a técnica não permite a diferenciação de
espécies. No entanto pode se concluir que na produção de iogurte emprega se dois tipos de
bactérias diferentes, bacilos e estreptococos.

EXPERIENCIA 2
OBSERVAÇÃO DE CELULAS PROCARIÓTICAS PRESENTES NO IOGURTE POR
METODO DE GRAM

Um dos principais métodos para identificar bactérias na bacteriologia é o método de Gram,

desenvolvido por Hans Gram no final do seculo XIX.

O método de Gram é uma técnica de coloração diferencial, isto é, as células são expostas a
mais de um corante.
O método de Gram consta das seguintes etapas principais:
a) Coloração das células por cristal violeta;
b) Precipitação do corante nas células pelo iodo;
c) lavagem com um agente descorante álcool,
d) Coloração das células pele safranina, (contrastante)

As bactérias apresentam diferentes respostas a esta técnica, podendo se apresentar coradas de

violeta denominadas Gram-positivo ou de vermelho (rosadas) Gram-negativo.
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Protocolo experimental
I. Material necessário.
 Microscópio óptico;
 Laminas;
 Lamparina;
 Pipeta de Pasteur;
 Tina de coloração;
 Vareta de vidro;
 Papel absorvente;
 Papel de limpeza;
 Hansa de inoculação;
 Cristal violeta;
 Soluto de lugol;
 Safranina;
 Solução de acetona e álcool;
 Agua destilada;
 Iogurte natural;
 Óleo de imersão.

II. Procedimento da técnica

1) Colocou-se uma gota de água destilada numa lâmina;

2) Com ansa de inoculação retirou se uma pequena porção de iogurte e colocou se sobre a gota
de agua. Aplicou se a técnica de esfregaço e espalhou se o iogurte sobre a lamina;

3) Secou se e fixou se levemente a chama da lamparina o esfregaço efectuado;

4) Colocou se sobre o esfregaço duas a quatro gotas de álcool para retirar o excesso de gordura;

5) Colocou-se a lâmina na tina de coloração sobre as varetas;

6) Cobriu se por completo com a solução de cristal violeta e deixou se actua durante um minuto;

7) Removeu se o corante do esfregaço passando agua corrente gentilmente sobre a lamina;

8) Retirou se o excesso de água da lâmina inclinando-a levemente sobre o papel absorvente;

9) Cobriu se por completo o esfregaço com soluto de lugol e deixou se actuar por um período
de um minuto.

10) Verteu se o lugol na tina de coloração, lavou se com água destilada sem deixar secar a
preparação;
11) Cobriu se a lâmina com acetona e deixou se secar por um período de 1 minuto;
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12) Lavou se a lamina com agua destilada e retirou se o excesso de agua inclinando-a levemente
ao papel absorvente;
13) Cobriu se a lâmina com solução de safranina e deixou se actuar por 1.5 minuto;
14. Lavou se com agua destilada corrente e retirou se o excesso de agua inclinando levemente
ao papel absorvente. Secou se ao ar livre.
15. Observou se ao microscópio óptico com objectiva de imersão (100x).

III. Resultados e discussão

Apos o processo de coloração, foi possível observar dois tipos de bactérias diferentes na
morfologia mas corados de Gram com resultados semelhantes, Gram-Positivo. No entanto pode
se concluir que na produção de iogurte emprega se dois tipos de bactérias diferentes, bacilos e
cocos: Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus, respectivamente são Gram
positivas. No passo de diferenciação pelo álcool-acetona, as células retiveram no seu interior o
complexo resultante da ligação de iodo à molécula do corante violeta de cristal (complexo VC-
I), ficando coradas de violeta escuro:

EXPERIENCIA 3
OBSERVAÇÃO DE BACILOS DE TUBERCULOSE, ATRAVÉS DE COLORAÇÃO DE
ZIHEL-NEELSEN

A coloração ou técnica de Ziehl-Neelsen, abreviada na literatura muitas vezes como ZN, é uma
técnica de coloração de bactérias mais agressiva que a técnica de Gram, sendo usada em
bactérias que não são bem coradas com esta técnica, como os bacilos da lepra e da tuberculose,
as bactérias dos gêneros Mycobacterium e Nocardia, entre outros. Foi desenvolvida por Franz
Ziehl e posteriormente melhorada por Friedrich Neelsen, no final do século XIX

Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente
à descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Às bactérias que possuem
esta propriedade dizem se que são ácido-álcool resistentes, (BAAR) (géneros Mycobacterium
e Nocardia).

A técnica de Ziehl-Neelsen evidencia esta ácido-álcool resistência. Ácido-álcool resistentes:

coradas de vermelho e não ácido-álcool resistentes: coradas de azul.
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Protocolo experimental
I. Material necessário.
 Lâminas microscópicas;
 Escarradores contendo escarros de doente com tuberculose;
 Fucsina fenicada;
 Ácido sulfúrico a 20%;
 Azul-de-metileno;
 Hansa ou palito de madeira;
 Lamparina;
 Fosforo;
 Agua destilada;
 Microscópio óptico;
 Suporte de coloração.

II. Procedimento da técnica.

1). Com o palito de madeira, confecionou se o esfregaço seguindo as técnicas atuais de
biossegurança e esfregaço. Deixou se secar ao ar livre e fixou se com o calor da chama
passando três vezes pele lamparina;

2). Colocou se a lamina, com a parte do esfregaço voltada para cima, no suporte de coloração;
3). Cobriu se a lâmina com fucsina fenicada e aqueceu se a lâmina por baixo com a lamparina
até à emissão de vapores (sem deixar ferver); e deixou se actuar durante 5 minutos;
4). Lavou se com água corrente e eliminou se o excesso de agua inclinando a lamina;
5). Cobriu se a lâmina com ácido sulfúrico e deixou se actuar por 3 minutos para descorar
totalmente o esfregaço;
6). Lavou se com água corrente e eliminou se o excesso de agua inclinando a lamina;
7). Cobriu se a lâmina com azul-de-metileno durante 1 minuto;
8.) Lavou se com água corrente e deixou se secar a temperatura ambiente;
9. Levou se a observação microscópica com objectiva de 100x.

III. Resultados e discussão

Na experiencia realizada no laboratório da Escola Secundaria de Armando Emílio Guebuza não
foi possível a observação de bactérias usando esta técnica, porém o estudante por iniciativa
própria foi realizar mais experimentos no Laboratório de Centro de Saúde de Nhacolo, (local
de trabalho do autor) usando a mesma técnica onde teve acesso a observação de bactérias da
tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) que apos a acção dos mordente, diferenciador e do
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contrastante este comportou se como um BAAR permanecendo coradas de vermelho- a cor do

corante fucsina.
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Conclusão

Partindo deste minucioso trabalho foi possível concluir que para observação bacteriana de
qualquer espécie e importante verificar as técnicas e etapas de coloração recomendadas.

As bactérias apresentam uma parede celular quimicamente complexa e cada espécie apresenta
uma afinidade própria com os tipos de corantes, dai que existem muitos métodos de coloração
de bactérias. Que vão desde a coloração simples, Gram, Zihel-Neelsen, entre outros, assim
como tipos de fixadores.

Na coloração simples com azul de metileno, foi possível observar bactérias com morfologias
diferentes mas todas coradas de azul. Enquanto que na coloração de Gram foi possível observar
duas espécies diferentes na morfologia mas ambas foram de Gram positivo, coradas a cor
violeta e no método ZN foi possível observar bacilos corados a vermelho.
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Referência bibliográfica

1. AQUARONE, Eugênio. et al. Biotecnologia Industrial. vol.IV. São Paulo: Blucher, 2001.

2. Martin Gengenbacher, and Stefan H. E. Kaufmann; Mycobacterium tuberculosis: Success

through dormancy; FEMS Microbiol Rev. 2012 May;

3. SILVANA TRIFIRO, ANNE-MARIE BOURGAULT, FRANÇOIS LEBEL, AND

PIERRE RENÉ; Ghost Mycobacteria on Gram Stain; JOURNAL OF CLINICAL
MICROBIOLOGY, Jan. 1990, Vol. 28, No. 1,

4. Coloração de bactérias - Estudo da forma e organização das bactérias. - www.uma.pt

5. Métodos de Coloração Bacteriana - estudmed.com.sapo.pt