Aula Questoes Micro Clinica

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Livro Eletrônico

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Microbiologia Clínica p/ EMSERH (Farmacêutico)


Professor: Thaiana Cirqueira

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AULA 14: Microbiologia

SUMÁRIO PÁGINA
Apresentação 1
1. Conceitos Básicos em Microbiologia 2
2. Estrutura dos Microorganismos 2
3. Características das Bactérias 6
4. Coleta de Amostras 14
5. Transporte de Amostras 17
6. Recebimento de Amostras 21
0
7. Meios de Cultura 22
8. Coloração 42
9. Provas de Controle de Qualidade 60
10. Lista de Questões Apresentadas 61
11. Gabarito 74
12. Referências Bibliográficas 74

Olá pessoal,
Sou a Professora Thaiana Cirqueira, sou Bacharel em Biomedicina e
mestranda na Universidade de São Paulo no Programa de Hemoterapia.
Atualmente trabalho na Secretaria de Saúde do Distrito Federal exercendo
atividades pertinentes as Análises Clínicas e Hemoterapia. Estou aqui para
acompanhar vocês no estudo deste módulo de Microbiologia para
concursos públicos.
Nesta aula iniciaremos os estudos dos nossos microorganismos com
alguns conceitos básicos, coleta, transporte de amostras, meios de
cultura e coloração de lâminas microbiológicas.
Espero que aproveitem bem este módulo e que todos alcancem a
aprovação!

Então vamos começar o delicioso estudo das bactérias...

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1. Conceitos básicos em microbiologia:

Para darmos início aos nossos estudos, precisamos traçar um


panorama geral sobre o que é a microbiologia.

O que é a microbiologia?

Basicamente, a microbiologia é o estudo dos microrganismos e


suas atividades, a esses microrganismos damos os nomes de: bactérias,
fungos, vírus, algas e protozoários. Muitos desses microrganismos são
causadores de diversas patologias, e foi ai que surgiu a microbiologia
médica, que estuda os microrganismos patogênicos responsáveis pelas
doenças infecciosas. A microbiologia médica envolve o estudo da
bacteriologia, da virologia e da micologia.
Os agentes causadores de doenças infecciosas envolvem cinco
principais grupos de organismos: as bactérias, os fungos, os protozoários,
os helmintos e os vírus.

2. Estrutura dos microrganismos:

As bactérias são organismos pertencentes ao reino dos procariotos,


já os fungos (divididos em leveduras e bolores) e os protozoários são
membros do reino protista, e os helmintos (vermes) são classificados no
reino animal. Essa classificação se baseia em diferenças apresentadas por
esses organismos, já que os protistas são organismos unicelulares ou
multicelulares muito simples, e os helmintos são organismos

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multicelulares complexos que junto com os protozoários são comumente
denominados como parasitas.
Dessa forma, podemos citar diversas características essenciais que
cada um desses organismos possui que os diferenciam uns dos outros.
Por exemplo, as bactérias, os fungos, os protozoários e os helmintos são
organismos celulares, enquanto os vírus são organismos acelulares. Essas
diferenças são baseadas em três principais critérios:

 Estrutural: Os vírus não possuem citoplasma, por isso dependem


das células hospedeiras para promover a síntese proteica.
 Mecanismo de replicação: Diferentemente das bactérias, que se
replicam por fissão binária, os vírus desorganizam-se, e produzem
várias cópias de seu ácido nucleico e proteínas, e depois se
reorganizam em uma geração de múltiplos vírus. E ainda devem se
replicar no interior de células hospedeiras, uma vez que são
desprovidos de sistema de síntese de proteínas, como mencionado
anteriormente.
 Natureza do ácido nucleico: O vírus, diferentes das outras células
que contém DNA e RNA, eles possuem DNA ou RNA, mas não
ambos.

Além de todas essas diferenças, os organismos ainda são classificamos


em eucariontes e procariontes. Os fungos e protozoários são
microrganismos eucarióticos, já as bactérias são microrganismos
procarióticos. Essa diferenciação baseia-se na presença ou ausência de
núcleo. Os organismos eucarióticos são aqueles que possuem
carioteca (uma membrana que separa o material genético do
citoplasma), já os procarióticos são aqueles que não apresentam
carioteca. Além dessa diferença, os procariotos e eucariotos se
diferenciam por outras características:

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 As células eucarióticas apresentam organelas, como mitocôndrias,


lisossomos e ribossomos, já procariotos não apresentam organelas,
apenas ribossomos menores.
 Os procariotos apresentam parede celular externa que contem
peptideoglicanos, ao contrário, as células eucarióticas não contem
peptideoglicano, elas apresentam uma membrana celular mais
flexível.
 A membrana da célula eucariótica contém esteróis.
 A maioria dos protozoários e algumas bactérias são móveis,
enquanto os fungos e os vírus são imóveis.

Na tabela abaixo temos um resumo das principais características e


diferenças entre os microrganismos citados acima.

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Tabela 1 – Comparação entre os organismos de importância médica

CARACTERÍSTICA VÍRUS BACTÉRIAS FUNGOS PROTOZOÁRIOS/


HELMINTOS

CÉLULAS AUSENTES PRESENTES PRESENTES PRESENTES

DIÂMETRO 0,02-0,2 1-5 3-10 15-25


APROXIMADO (LEVEDURAS) (TROFOZOÍTICOS)
(µM)¹

ÁCIDO NUCLEICO DNA OU RNA TANTO DNA TANTO DNA TANTO DNA COMO
COMO RNA COMO RNA RNA

RIBOSSOMOS AUSENTES 70S 80S 80S

TIPO DE NÚCLEO AUSENTE PROCARIÓTICO EUCARIÓTICO EUCARIÓTICO

MITOCÔNDRIAS AUSENTE AUSENTE PRESENTE PRESENTE

NATUREZA DA CAPSÍDEO PAREDE PAREDE MEMBRANA


SUPERFÍCIE PROTEICO E RÍGIDA, RÍGIDA, FLEXÍVEL
EXTERNA ENVELOPE CONTENDO CONTENDO
LIPOPROTEICO PEPTIDEOGLI- QUITINA.
CANO

MOTILIDADE NENHUM ALGUMAS NENHUM A MAIORIA

MÉTODO DE NÃO POR FISSÃO BROTAMENTO MITOSE


REPLICAÇÃO FISSÃO BINÁRIA OU MITOSE
BINÁRIA

Lembrando que essa foi uma pequena introdução sobre a


microbiologia. Ao decorrer do curso ainda falaremos diversos conceitos
que serão extremamente importantes para o nosso estudo. Então, vamos
ao primeiro tópico.

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As análises das características morfológicas das bactérias são importantes
para classificação preliminar e para o conhecimento de algumas
propriedades importantes do ponto de vista industrial.

3. Características das bactérias:

Como já falamos as bactérias são organismos unicelulares. Podem


ser encontrados de forma isolada ou em colônias; são constituídos por
uma célula (unicelulares), não possuem núcleo celular definido
(procariontes) e não possuem organelas membranosas.

Morfologia: tamanho, forma e arranjos bacterianos

As bactérias são variáveis quanto ao tamanho e quanto às formas que


apresentam.

 Tamanho:

 A unidade de medida das bactérias é o mm (micrômetro) que


equivale a 103 mm. Muitas bactérias medem de 2 a 6 mm de
comprimento e 1 a 2 mm de largura. Tamanho variável: 0,1 –
0,2 m 5,0 mm

 Morfologia das bactérias: formas e arranjos bacterianos

 As bactérias podem ser agrupadas em três tipos morfológicos


gerais: cocos, bacilos e espiralados.

a) Formas de cocos (esféricas) – é o grupo de bactérias mais


homogêneo em relação ao tamanho. Os cocos tomam
denominações diferentes de acordo com o seu arranjo.

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Micrococos – cocos.

Diplococos – cocos agrupados aos pares.

Tétrades – agrupamentos de quatro cocos.

Sarcina – agrupamentos de oito cocos em forma cúbica.

Estreptococos – cocos agrupados em cadeias.

Estafilococos – cocos agrupados em grupos irregulares,


lembrando cachos de uva.

(a) Coco: Methanococcus sp; (b) Diplococo: Neisseria sp (gonococo); (c)


Tétrade: Deinococcus sp; (d) Sarcina: Methanosarcina sp; (e) Estreptococo:
Streptococcus sp e (f) Estáfiococo: Staphylococcus sp

b) Forma de bastonete – são células cilíndricas em forma de


bastonete; apresentam grande variação na forma e no tamanho entre
gêneros e espécies.

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Exemplos de bastonetes: (a) Halobacterium e (b) Salmonella, causadora


de aguda infecção intestinal
em humanos.

As células bacterianas
cilíndricas ou em
bastonetes (bacilos) não apresentam a mesma disposição dos cocos, mas
podem apresentar-se isolados, aos pares (diplobacilos) e em cadeias
(estreptobacilos). Em alguns casos esses arranjos não constituem
padrões morfológicos característicos, mas é devido às etapas de
crescimento ou às condições de cultivo. De um modo geral, essas duas
formas de bactérias (cocos e bacilos) são as mais comuns entre as
contaminantes nas indústrias de açúcar e de álcool.

c) Formas espiraladas – caracterizadas por células em espiral; dividem


se em:

• Espirilos – possuem corpo rígido e movem-se à custa de flgelos


externos. Ex.: Gênero Aquaspirillium.
• Espiroquetas – são flexíveis e locomovem-se geralmente por
contrações do citoplasma, podendo dar várias voltas completas em torno
do próprio eixo. Ex.: Gênero Treponema.

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Exemplos de bactérias com formas espiraladas: (a) espirilo e (b) espiroqueta


Leptospira interrogans, causadora da leptospirose.

Além desses três tipos


morfológicos, existem algumas
formas de transição:

• Bacilos muito curtos: cocobacilo.

• Unidades celulares que se assemelham a uma vírgula: vibrião.

Formas bacterianas de transição: exemplos de vibriões (a) Vibrio cholerae,


causador da cólera em humanos e (b) Vibrio vulnifius, agressiva bactéria
carnívora

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01) (AOCP- HRL-UFS – 2016 – Biomédico). Estudos


identificam as bactérias como seres unicelulares, constituídas
basicamente de: membrana, citoplasma e núcleo. Esse conjunto
tem o nome de PROTOPLASTO. Além disso, possuem outras
estruturas que, apesar de importantes, nem sempre são
encontradas em todas as bactérias como: parede, cápsula, flagelos
e esporos. Assinale a alternativa INCORRETA a respeito do
agrupamento das bactérias (cocos).

(A) Isolados – Micrococos.


(B) Aos pares – Diplococos.
(C) Em cadeias – Estreptococos.
(D) Em cachos regulares – Estafilococos.
(E) Em grupo de quatro – Tetrágenos.

Comentário: O erro dessa questão está em um detalhe, que pode ser


uma pegadinha para quem faz a questão correta ou despercebidamente,
o erro está em cachos regulares no item d, o correto é falar que os
estafilococos são cachos irregulares. Resposta: Letra D.

Estruturas externas da célula bacteriana

O tamanho, a forma e o arranjo das bactérias constituem sua


morfologia, sua aparência externa; a observação interna das estruturas
celulares permite conhecer um pouco o funcionamento da bactéria no
ambiente.

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 Parede celular:

A parede celular é uma estrutura rígida que está presente em quase


todas as bactérias e localiza-se acima da membrana citoplasmática. Ela
contém polímeros complexos conhecidos como peptidioglicanos, que são
responsáveis pela sua rigidez. A parede celular impede que a célula
estoure em decorrência do grande turgor, atua como uma barreira de
proteção contra determinados agentes químicos e físicos externos e
funciona como suporte de antígenos somáticos bacterianos.

As bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos, com base


na capacidade de suas paredes celulares fiarem o corante violeta cristal:

as Gram-positivas (que coram em roxo) e


as Gram-negativas (que coram em vermelho).

A parede celular de bactérias Gram-positivas é composta


basicamente por peptideoglicano, que constitui uma espessa camada ao
redor da célula. Outros polímeros, tais como ácidos lipoteicóicos e
polissacarídeos, também podem estar presentes nessa camada.
Nas bactérias Gram-negativas o peptideoglicano constitui uma
camada final, sobre a qual se encontra outra camada, denominada

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membrana externa que é composta por lipoproteínas, fosfolipídios,
proteínas e lipopolissacarídeos.

O processo de coloração de Gram é usado para classificar as


bactérias em Gram-positivas ou Gram-negativas, conforme fixam
ou não o corante. Essa classificação é importante, pois as bactérias
Gram-positivas são mais sensíveis à penicilina e à sulfa. Este processo
de coloração é um dos mais importante métodos realizados em
laboratório de microbiologia. ==0==

 Flagelos:

São organelas especiais (apêndices delgados) responsáveis pela


locomoção das bactérias. De acordo com o número e distribuição dos
flgelos, as bactérias podem ser classificadas como: atríquias (sem
flgelos), monotríquias (um único flagelo), anfiríquias (um flagelo em cada
extremidade), lofotríquias (um tufo de flagelos em uma, ou ambas as
extremidades) e peritríquias (apresentando flagelos ao longo de todo o
corpo bacteriano).

 Pêlos (Fímbrias):

São apêndices fios, retos e curtos que estão presentes em muitas


bactérias Gram-negativas. São encontrados tanto nas espécies móveis
como nas imóveis e, portanto, não desempenham papel relativo à
mobilidade. Os pelos originam-se de corpúsculos basais na membrana
citoplasmática e sua função parece estar relacionada com a troca de
material genético durante a conjugação bacteriana (fímbria sexual) com a
aderência às superfícies mucosas.

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 Glicocálice:

É formado por uma substância mucilaginosa ou gelatinosa (viscosa)


e fia ligada à parede celular como um revestimento externo. Se o
glicocálice estiver organizado de maneira definida e acoplado firmemente
à parede celular, recebe o nome de cápsula (Figura 3.11); se estiver
desorganizado e sem qualquer forma frouxamente acoplada à parede
celular, recebe o nome de camada limosa. O glicocálice pode ser de
natureza polissacarídica ou polipeptídica (ácido glutâmico). O glicocálice
desempenha papel importante na infecção, permitindo que a bactéria
patogênica se ligue a tecidos específicos do hospedeiro. Acredita-se que o
glicocálice possa proteger as bactérias da dessecação.

Fatores limitantes do crescimento bacteriano

A oferta de nutrientes é o principal fator que limita o crescimento


bacteriano. Outros fatores importantes no crescimento bacteriano são:
temperatura, pH, disponibilidade de O2 e quantidade de água.

• Temperatura – algumas bactérias crescem melhor em


temperaturas baixas, outras em temperaturas intermediárias e outras em
temperaturas altas. A temperatura ótima de crescimento é aquela
em que o microrganismo cresce mais rapidamente. Em
temperaturas mais favoráveis para o crescimento, o número de divisões
celulares por hora, chamada de taxa de crescimento, dobra para cada
aumento de temperatura de 10ºC. Há três temperaturas importantes a
conhecer: mínima, ótima e máxima (nessa última as enzimas são
danificadas pelo calor e a célula para de crescer). De acordo com a
temperatura de crescimento, é possível distinguir, pelo menos, três

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grupos fisiológicos de bactérias: as psicrófilas têm temperatura ótima de
crescimento entre 15 - 25ºC; as mesófilas têm temperatura ótima de
crescimento entre 25 - 45ºC; e as termófilas têm temperatura ótima de
crescimento entre 45 - 80ºC.

• pH – quanto à tolerância ao pH, as bactérias podem ser


acidófilas, neutrofílicas e alcalófilas. Normalmente, o pH ótimo é bem
definido para cada espécie e a maioria das bactérias não cresce em
valores de pH acima ou abaixo de seu pH ótimo.

• Oxigênio – quanto à respiração, as bactérias podem ser:


aeróbias estritas (necessitam de O2 para crescer), anaeróbias
estritas (só crescem na ausência de O2), microaerofílicas (precisam de
O2, mas em pressão inferior à atmosférica) e anaeróbias facultativas
ou aerotolerantes (crescem na presença ou ausência de O2).

• Água – essencial a qualquer microrganismo; embora a


necessidade seja variada, somente endósporos bacterianos podem
sobreviver sem água.

4. Coleta de amostras

A etapa da coleta da amostra é essencial para o sucesso da


identificação do patógeno. Por isso, devem-se coletar as amostras
DIRETO do sítio de infecção. Além disso, deve-se coletar a amostra no
momento ideal em que o microrganismo manifestará sua patogenicidade.
O volume de material colhido deverá ser suficiente para realizarmos todas
as técnicas necessárias ao cultivo, mas sempre tomando cuidado com a
coleta de material excessivo.

Para realizarmos a coleta, utilizamos os swabs, pois são de fácil


manipulação.

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4.1 Locais da coleta:

Em primeiro lugar, devemos sempre nos preocupar com o uso de


equipamentos de proteção individual (EPI’s) adequados a essas atividades
(luvas, máscaras).

Vamos destacar os principais sítios anatômicos de coleta de amostras:

1. Trato respiratório superior: A microbiota da boca, garganta e


nasofaringe é bem numerosa. Na maioria dos casos, os swabs de
orofaringe são realizados para isolar estreptococos hemolíticos do
grupo A, que causam faringite. Nesse sítio, devemos coletar a amostra
na cavidade oral, entre os pilares tonsilares e atrás da úvula.

2. Trato respiratório inferior: A coleta é feita direto do escarro das vias


respiratórias inferiores. A coleta do escarro deve ser feita
preferencialmente pela manhã, quando o paciente se levanta, e em
jejum.

3. Trato urinário: Para coleta do trato urinário feminino, primeiro deve


ser feito a higienização no local, depois descartar o primeiro jato de
urina e coletar o jato médio da micção em recipiente estéril.

4. Trato genital: As culturas de amostras vaginais podem muitas vezes


não apresentar resultados significativos. Em caso de vaginite
supurativa, devem-se montar lâminas a fresco logo após a coleta e
examinar.

5. Sangue: O momento ideal para coleta de sangue é quando ocorre a


bacteremia (presença de bactéria no sangue). As hemoculturas podem
ser obtidas utilizando-se agulha e seringa ou métodos de vácuo, como
o sistema fechado. O local da punção deve ser descontaminado de
forma adequada.

6. Lesões cutâneas: Fazer a aspiração do material purulento localizado


nas profundidades da ferida com agulha e seringa estéreis.

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7. Trato gastrointestinal: A confirmação laboratorial de uma infecção
intestinal efetua-se, usualmente, pela detecção de ovos e parasitas,
por montagens de material fecal com solução salina ou iodada, ou
isolando-se bactérias de amostras de fezes.

8. Líquido cefalorraquidiano (líquor): Obtido por um medico


neurologista, por punção lombar, após desinfecção conveniente da pele
e anestesia local.

Quando escolhemos um método de coleta temos que pensar em


preservar os microrganismos até a chegada ao laboratório. A coleta é um
dos passos mais importante do exame de microbiologia. Se a coleta for
inadequada o resultado final será inadequado. Para uma coleta de
qualidade é necessário:

 Coletar o material do sítio de infecção com técnica de antissepsia


adequada.
 Escolher o momento apropriado para a coleta do espécime clínico
que propicie a melhor chance de isolar o microrganismo causador
da infecção.
 Quantidade suficiente para realização dos exames solicitados pelo
médico.
 Materiais de coleta e transporte adequados conforme amostra
analisada.
 Sempre que possível coletar amostra antes da administração de
antimicrobianos no paciente
 A amostra sempre deve estar com identificação completa do
paciente. Nome, data de nascimento, número de identificação do
paciente, sítio de coleta, data e hora da coleta.

Após a coleta, devemos garantir as condições necessárias para o


armazenamento e transporte dessa amostra.

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5. Transporte de amostras:

Os materiais coletados devem ser enviados para o laboratório em


meios de transporte adequados de acordo com o material em estudo.
Abaixo segue uma tabela com o meio de transporte, uma pequena
descrição e o respectivo material a ser analisado:

Tabela 02- Tipos de meio de transporte com o respectivo material a ser transportado.

Meio de Transporte Material


Frasco de coleta com boca larga Urina, fezes e escarro.
e com tampa de rosca.

Swabs com meio de Stuart ou Isolamento de bactérias aeróbias e


Amies. anaeróbias facultativas.

Swabs com meio de Stuart ou Isolamento de bactérias aeróbias e


Amies com carvão. anaeróbias facultativas.
Principalmente gonococos,
hemófilos e pneumococos.

Meio de Cary-Blair Conservantes de fezes para


isolamento de enteropatógenos.

Meio de transporte pré-reduzido Isolamento de bactérias anaeróbias


Meio TSA em tubo Envio de cepas para exames
complementares ou para
confirmação em laboratórios de
referência.

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Os meios de transporte preservam a viabilidade dos microrganismos
nas amostras, mas evitam a proliferação bacteriana.
Coleta e/ou transporte inadequado podem ocasionar falhas no
isolamento do agente etiológico causador da doença.
Para cada material em análise existe critérios diferentes para o
melhor e mais adequada realização do exame. A tabela abaixo é um
esquema com cada material, o tempo de envio ao laboratório,
estabilidade da amostra e temperatura de transporte:

Tabela 3- Tipos de amostras com os critérios necessários para transporte.

Tipo de Material de Tempo e Estabilidade Temperatura


amostra coleta temperatura da amostra de
até envio ao transporte
laboratório
Seringa < 2h em TA <24h TA
refrigerada
Swab com < 8h em TA <24h TA
meio de refrigerada
transporte e
Aspirado e lâmina para
exsudatos Gram
Swab sem Imediatamente Não aplicável TA
meio de
transporte e
lâmina de
Gram
Escarro Frasco estéril < 2h em TA <24h TA
refrigerada
Secreção Frasco estéril < 2h em TA <24h TA
Traqueal refrigerada
Lavado Frasco estéril < 2h em TA <24h TA

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Broncoalveolar refrigerada
Swab com < 12h em TA <24h TA
meio de em TA
Nasal transporte e
lâmina de
Gram
Tudo estéril < 2h em TA <24h TA
Líquidos refrigerada
Orgânicos Frasco de < 12h em TA <24h em TA TA
(pleural, hemocultura,
0
peritoneal, método
ascítico, automatizado
diálise, Frasco de < 2h em TA ou <12h em TA TA
pericárdico, hemocultura, 12h a 35+/-
sinovial) método 2°C
manual
Frasco de < 12h em TA <12h em TA TA
hemocultura,
método
Sangue e automatizado
Medula óssea Frasco de < 2h em TA ou <12h em TA TA
hemocultura, 12h a 35+/-
método 2°C
manual
Tubo ou < 2h em TA <24h TA
Fragmentos de frasco refrigerada
biópsia, tecido contendo
e osso solução
fisiológica
estéril
Frasco estéril < 1h em TA <24h TA

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seco refrigerada
se coloca em
Fezes meio
conservante
Com <12h TA ou <48h TA
conservante 24h refrigerada refrigerada
Líquor Tubo estéril Imediatamente, <24h TA
TA refrigerada
Cateter Tubo estéril <1h em TA <12h TA
refrigerada
Raspado da Swab fino <2h em TA <24h em TA TA
conjuntiva com meio de
transporte
Raspado de Semeadura < 2h em TA <12h em TA TA
córnea diretamente
em meio
adequado
Fluido vítreo Seringa com Imediatamente <12h TA
ponta em TA refrigerada
protegida ou
frasco de
hemocultura
Urina de jato Frasco estéril <2h em TA < 24h Refrigerada
médio ou refrigerada
Até 12h
refrigerada
Esperma Frasco estéril <2h em TA <12h TA
refrigerada
Vol. > 2ml, < 3h em TA <12h TA
seringa com refrigerada
ponta

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bloqueada,
Cultura de sem bolha de
anaeróbio ar
Frasco de < 12h em TA <24h em TA TA
hemocultura,
método
automatizado
Frasco de <2h em TA ou <12h em TA TA
hemocultura, 12h a 35°C +/-
método 2°C
manual
Vol. <1ml, < 30 min. em <1h TA
seringa com TA refrigerada
ponta
bloqueada,
sem bolha de
ar
Sendo TA = temperatura ambiente.

6. Recebimento das amostras:

O recebimento das amostras é uma etapa fundamental para um


exame de qualidade. O primeiro passo a ser realizado é a inspeção
visual para aceitação das amostras. Deve-se observar:
 Se a amostra está identificada (nome do paciente, sítio anatômico,
data e hora da coleta).
 Se o volume é adequado e suficiente para realização dos exames.
 Se a amostra foi coletada nos meios de transportes adequados.
 Se a amostra é apropriada para o exame solicitado.

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Lembrando, que é recomendável que todo o processamento


seja feito em cabine de segurança biológica, utilizando
equipamentos de proteção individual, conforme normas de
biossegurança.

7. Meios de Cultura

O que são os meios de cultura?

São os meios destinados para reprodução, isolamento e


análise dos microrganismos de interesse médico. Nesses meios, é
utilizado um conjunto de substâncias que são capazes de promover o
crescimento bacteriano de laboratório in vitro.

Os meios de cultura precisam de alguns suprimentos que irão


permitir o crescimento dos microrganismos, como fonte de carbono e
nitrogênio, fonte de energia, sais minerais, fatores de crescimento,

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condições físicas (pH, temperatura, pressão osmótica), e condições
ambientais favoráveis (ambiente estéril).
Bom, para escolhermos qual será o meio mais adequado, vamos
analisar as características que cada um apresenta.
Primeiro, precisamos classificar os meios de cultura quanto ao estado
físico, quanto à procedência dos constituintes e quanto à composição
química.

 Estado físico: Podemos classificar os meios em sólidos, quando


contém agentes solidificantes, principalmente Agar (1,00 a 2,00%;
semi-sólidos, quando a quantidade de Agar e ou gelatina é de 0,075
a 05%, formando uma consistência intermediária; e líquidos,
quando não possuem agentes solidificantes, apresentando-se como
um caldo. O crescimento bacteriano, nesse meio, muda seu
aspecto, ou seja, o meio sofre uma turvação.

 Procedência dos constituintes: São definidos como naturais ou


complexos quando são utilizados ingredientes que possuem
composição química não definida, como extratos de vegetais
(malte, tomate, amido de tubérculos), de animais (carne, cérebro,
fígado) e de microrganismos. Quando são utilizados ingredientes
quimicamente definidos chamamos de artificiais ou sintéticos. Os
artificiais ou sintéticos são aqueles que oferecem suprimentos
exigidos pelos microrganismos para favorecer seu crescimento,
como nitrogênio, sais minerais, vitaminas, dentre outros.
 Composição química: São divididos em meios básicos ou
especiais. Os básicos permitem o crescimento microbiano, mas
sem satisfazer nenhuma condição especial. Já os especiais, são
aqueles que cumprem as exigências necessárias para que
determinado microrganismo cresça naquele meio.

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 Mas professora, o que é o ágar?

O ágar, também conhecido como ágar-ágar ou agarose, é um


hidrocolóide fortemente gelatinoso. É bastante empregado em
microbiologia para produção de meios de culturas sólidos. O meio de
cultura é feito a partir do ágar adicionado outros componentes específicos
para cada tipo de microrganismo, pois estes possuem diferentes
necessidades nutricionais.

02) (AOCP- EBSERH/HC-UFG – 2015). Meios de cultura podem


ser sólidos, semissólidos ou líquidos. O componente mais utilizado
para a solidificação de meios de cultura estéreis é o:

A) álcool 70%.
B) xilol.
C) ágar-ágar.
D) formol.
E) Metanol

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Comentário: O componente utilizado nos meios de cultura é o ágar-ágar,
um hidrocoloide que forma base gelatinosa dos meios de cultura.
Resposta: Letra C

03) (AOCP - Biomédico - EBSERH/HU-UFJF – 2015). Quais são os


principais componentes de um meio de cultura?
(A) Energia, oxigênio, elastina e colágeno.
(B) Fósforo, queratina, glúten e carbono.
(C) Fontes de carbono, açúcares, nitrogênio, fósforo e sais minerais.
(D) Sais minerais, oxigênio, elastina e carbono.
(E) Fontes de carbono, energia, colágeno e elastina.

Comentário: Como vimos na nossa aula os meios de cultura são


compostos por diversas substâncias que favorecem o crescimento
microbiano, pois é suporte de nutrientes para os microrganismos, “como
fonte de carbono e nitrogênio, fonte de energia, sais minerais,
fatores de crescimento, condições físicas (pH, temperatura, pressão
osmótica), e condições ambientais favoráveis (ambiente estéril)”.
Resposta: Letra C.

04) (CESPE – UNIPAMPA – FARMACÊUTICO/BIOQUÍMICO – 2013).


Julgue os próximos itens, que versam sobre meios de cultura.
A composição do meio de cultura independe da exigência nutricional do
microrganismo.

Comentário: A composição química é extremamente importante para o


crescimento do microrganismo que se deseja isolar. Resposta: Errado.

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05) (CESPE- UNIPAMPA – 2013). Julgue os próximos itens, que


versam sobre meios de cultura. Meios de cultura ou meios de cultivo
podem ser definidos como qualquer substância química ou biológica
utilizada para a manutenção de microrganismos vivos.

Comentário: Os meios de culturas são preparações químicas que


possuem na sua formula nutrientes e entre outras substâncias que
provém condições necessárias para que os micro-organismos inoculados
multipliquem-se em um meio artificial. Resposta: Certo.

Principais tipos de meio de cultura:

Podemos dividir os meios de cultura em vários tipos. Vamos


relacionar aqui aqueles mais cobrados em prova e que são os mais
importantes na análise microbiológica.

Podemos dividir os meios em:


 Meios para transporte/conservação;
 Meios de crescimento (enriquecidos ou não);
 Meios de enriquecimento;
 Meios seletivos;
 Meios diferenciais;
 Meios cromogênicos;

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Vamos nos atentar para cada característica que diferencia os meios


apresentados, pois as bancas costumam cobrar bastante a composição
e a definição de cada meio!!!

Meios de transporte/conservação:

São os meios que preservam a viabilidade dos microrganismos nas


amostras coletadas, além de minimizarem a proliferação bacteriana. Em
geral, são meios semissólidos para evitar a dissecação da amostra e são
meios que não possuem fonte de carbono, para evitar que ocorra uma
multiplicação bacteriana, interferindo no resultado do exame.

 Amies: modificação do Stuart: O Stuart é um meio que utiliza


glicerosfato de sódio, porém, ele permitia o crescimento de
contaminantes, por isso, foi criado o meio Amies, que utiliza
fosfato inorgânico para eliminar o crescimento de contaminantes.
 Cary-Blair: é o meio utilizado para transporte e preservação de
amostra de fezes para cultura. Nesse meio, existem
componentes que promovem o tamponamento da amostra,
mantendo as bactérias viáveis e impedindo sua multiplicação.
Conserva a maioria dos enteropatógenos especialmente Vibrio
cholerae e Campylobacter spp.
 TSB (Caldo Soja Tripticaseína): é o meio de cultura utilizado para
o crescimento de bactérias em geral, pois possui peptonas na
formula, que é altamente nutritivo para os microrganismos.

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 Skim-Milk: é utilizado para preservação de microrganismos e
recomendado para o cultivo e enumeração de microrganismos
encontrados na indústria de lacticínios.

Meios de crescimento:

São classificados em: líquidos, sólidos e semissólidos;


Vamos começar pelos meios líquidos:

 Caldo BHI (Brain Heart Infusion): é composto por nutrientes


de cérebro e coração de gado, peptona e dextrose, são
utilizados para cultivo de estreptococcos, pneumococos,
meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras
e fungos.
 TSB (Triptic Soy Broth): é um meio não enriquecido
utilizado para o crescimento de bactérias em geral.

Meios de enriquecimento:

São aqueles meios líquidos ricos em nutrientes que permitem que


as bactérias contidas na amostra coletada cresçam quantitativamente.
Apesar de serem meios que estimulam o crescimento de determinados
microrganismos, podem inibir o crescimento de outros.

 Caldo Tetrationato de Kauffman: é um meio composto por


sais de bile que impedem o crescimento de bactérias gram-
postivas, e iodo, que cria um ambiente favorável para o
crescimento de espécies fecais. É um meio de enriquecimento
para Salmonella.
 Selenito-Cistina: é um meio utilizado para inibir o crescimento
de estreptococos e coliformes fecais e permite o crescimento
de Salmonella.

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 Caldo Tioglicolato: é um meio de enriquecimento para
Clostridium perfringens.

ATENÇÃO!!! Cuidado para NÃO confundir os MEIOS ENRIQUECIDOS


com os MEIOS DE ENRIQUECIMENTO!!! Os meios de enriquecimento,
como os caldos tetrationato de Kauffman e selenito possuem produtos
seletivos ou proporcionam SOMENTE o crescimento de determinado
grupo bacteriano. FIQUE ESPERTO!

Meios seletivos e diferenciais:

Os MEIOS SELETIVOS são aqueles


que permitem selecionar e isolar organismos
específicos que estão misturados com outros
em uma mesma amostra, através da adição
de inibidores que irão impedir o
crescimento de organismos não
desejados e favorecer o crescimento
daqueles organismos que se deseja isolar. Um exemplo disso é
adicionar Cristal-Violeta que impede o crescimento de Gram-positivos, e
favorece o crescimento de Gram-negativos. Também é bastante comum
adicionar antibióticos que irão agir sobre as bactérias sensíveis e não
terão efeito sobre as bactérias resistentes.

Os MEIOS DIFERENCIAIS são meios que devido a adição de


alguns reagentes ou substâncias resultam em um tipo de crescimento ou
reação específica, o que permite estabelecer diferenças entre
microrganismos muito parecidos. Por exemplo, a incorporação de
lactose e de um indicador de pH: fermentadores ou não deste açúcar

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nos permite diferenciar as bactérias lactose (+) e lactose (-), pois elas
formam cores distintas.

O meio Eosina Azul de Metileno (EBM) é


diferencial para coliformes; O Agar MacConkey para a
diferenciação de enterobactérias; e o Agar sangue e
Agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de
cocos Gram positivos.

06) ( COMPERVE – UFRN- 2015). Meios de cultura consistem na


associação de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao
desenvolvimento de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em
vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários
tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências
nutricionais.
Sobre os meios de cultura é correto afirmar:
a) Os meios de enriquecimento contêm substâncias que inibem o
desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos,
favorecendo o crescimento de outros.
b) Os meios seletivos proporcionam nutrientes adequados ao crescimento
de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de
crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos.
c) Os meios diferenciais contêm substâncias que permitem estabelecer
diferenças entre microrganismos muito parecidos.
d) Os meios de dosagem prestam-se para a realização de provas
bioquímicas e para a verificação de funções fisiológicas de organismos
submetidos à identificação.

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Comentário:
a) São aqueles meios líquidos ricos em nutrientes que permitem que as
bactérias contidas na amostra coletada cresçam quantitativamente. São
meios que estimulam o crescimento de determinados microrganismos,
mas não contêm substancias que inibem.
b) são aqueles que permitem selecionar e isolar organismos específicos
que estão misturados com outros em uma mesma amostra, através da
adição de inibidores que irão impedir o crescimento de organismos não
desejados e favorecer o crescimento daqueles organismos que se deseja
isolar.
c) são meios que devido a adição de alguns reagentes ou substâncias
resultam em um tipo de crescimento ou reação específica, o que permite
estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos.
d) empregado nas determinações de vitaminas, antibióticos e
aminoácidos.

Resposta: Letra C.

07) (CESPE – Farmacêutico/Bioquímico – 2013). Julgue os próximos


itens, que versam sobre meios de cultura. O meio de cultura de
enriquecimento é aquele que contém um agente redutor (tioglicolato ou
cisteína), previne a desidratação e mantém o pH favorável.

Comentário: A questão definiu o meio de transporte, que mantém o pH


favorável e previne a desidratação para manter as condições necessárias
para o crescimento da bactéria desejada. Resposta: Errado.

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08) (CESPE – HEMOBRÁS – ESPECIALISTA EM PRODUÇÃO DE
HEMODERIVADOS – FARMÁCIA – 2008). Sabendo que os meios de
cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias
que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de
microrganismos fora do seu meio natural, julgue os itens a seguir.

Os meios de cultura empregados em preparações bacteriológicas são


sólidos, visto que os meios líquidos não servem para o cultivo de
bactérias.

Comentário: Os meios líquidos servem para o cultivo de bactérias.


Resposta: Errado.

Vamos estudar as características principais de


cada meio e assim escolher corretamente qual meio será utilizado para o
cultivo de cada amostra.

 Agar Sal manitol: meio seletivo usado para o isolamento de


estafilococos patogênicos. Nesse meio tem caseína e tecido animado,
extrato de carne, manitol, sais e vermelho fenol. Os principais
patógenos isolados nesse meio é o S. aureus, que crescem na
presença de sais e fermentam manitol, produzindo colônias amarelas
neste meio.

- Placa de Agar Sal manitol utilizado para diferenciar


S. aureus e o S. não aureus, já que o S. aureus

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fermenta manitol, acidificando o meio que passa de rosa para amarelo.

 Agar SS: Possui componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de


sódio) que inibem microrganismos Gram-Positivo. É meio seletivo
para detecção de Salmonella e Shighella, em culturas entéricas.
Encontramos nesse meio extrato de levedura com xilose, lisina,
lactose, sucrose, desoxicolato de sódio, tiossulfato de sódio, citrato de
ferro amoniacal e vermelho de fenol. Quando o meio de cultura forma
colônias rosa é porque possui a presença de microrganismos que
fermentam a lactose, sacarose ou xilose. A Shighella
não fermenta esses carboidratos, portanto, formam
COLÔNIAS TRANSPARENTES. A Salmonella, na
presença de citrato de ferro amoniacal, formam
COLÔNIAS PRETAS!! Sendo possível diferenciar
Salmonella e Shighella. ANOTA AI QUE ESSA CAI NA PROVA!

- Agar SS: a E. coli


fermenta lactose
alterando o meio para
rosa. A Shigella não
fermenta lactose e não
altera a coloração do meio, formando colônias transparentes. E a
Salmonella não fermenta lactose, mas reagem formando gás sulfeto,
alterando a cor do meio para colônias pretas.

 Agar Eosin Methylene Blue (EMB): Ligeiramente seletivo (inibe Gram


positivas em determinado grau) e indica fermentação de lactose (meio
indicador). As colônias fermentadoras apresentaram coloração azul/preto,
as que não são fermentadoras irão apresentar coloração roxo claro ou
sem cor. A principal indicação para o uso desse meio é diferenciação dos
coliformes.

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- EMB: utilizado para diferenciar


enterobactérias gram-negativas.
Os coliformes produzem colônias
pretas-azuladas. A E. coli fermenta
rapidamente a lactose, formando
colônias verde metalizado.

 Agar MacConkey: meio seletivo para bactérias Gram-negativas e


diferencial para bactérias fermentadoras e não fermentadoras de
lactose. A composição do Agar MacConkey envolve peptonas, sais
biliares, lactose, vermelho neutro e cristal violeta. Os sais biliares e o
cristal violeta presentes no meio inibem bactérias Gram-positivas. As
bactérias fermentadoras de lactose produziram ácidos que alterando a
cor do meio para vermelha.

Agar MacConkey: utilizado para diferenciar bactérias


fermentadoras e não fermentadoras de lactose. As
bactérias que fermentadoras alteram a coloração do
meio para rosa.

 Agar Sangue: possuem dois principais componentes: um meio base (p.


ex: triptona de soja, infusão de coração e cérebro, base Brucella); e
sangue (de carneiro, cavalo ou coelho). Nesse meio podem ser
adicionados outros suplementos que vão permitir alcançar um maior
leque de microrganismos. É um meio utilizado para a diferenciação de
Streptococcus spp. e Staphylococcus spp, pela formação de halos de
hemólise nítidos.

 Agar chocolate: É um tipo de Agar sangue modificado. No Agar sangue


temos a presença de sangue, claro né? Então, quando o sangue ou a
hemoglobina são adicionados ao meio base ainda quente, o meio passa a

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ser marrom (por isso o nome de Agar chocolate :D). Esse meio favorece
o crescimento da maioria das bactérias, incluindo algumas que não
crescem em Agar sangue.

Agar Sangue com a presença


de E. coli e Agar chocolate
que permite o crescimento de
diversas bactérias como
Haemophilus, Neisseria e
Moraxella.

 Agar Mueller-Hinton: meio utilizado para teste rotineiro de


suscetibilidade das bactérias. A sua composição é de extratos de carne e
caseína, sais, cátions divalentes e amido solúvel.

 Caldo tioglicolato com indicador: Esse meio possui indicadores, a


resazurina e azul de metileno. Esses indicadores avaliam a presença de
bactérias aeróbias, pois possuem um alto potencial de oxidação. Além
dos aeróbios, avalia a presença de microaerófilos e anaeróbios.

 Caldo tioglicolato sem indicador: Usado para cultivo de microrganismos


anaeróbios.

Meios cromogênicos:

Eles permitem a identificação dos microrganismos baseada nas


diferentes colorações das colônias, causada pelas reações enzimáticas
da espécie ou gênero específico com os substratos que foram
incorporados no meio de cultura. Esses meios permitem a identificação
direta dos principais uropatógenos (Escherichia coli, Klebsiella pneumonie,
Proteus mirabilis e Enterococcus spp), em 24 horas após incubação.

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09) (AOCP - EBSERH/CH-UFPA – Biomédico – 2016). O crescimento


de microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as
primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o
potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil
bacteriano esperado para cada material. Um meio de cultura muito
utilizado é o ágar sangue (AS). Qual é sua principal finalidade?
(A) Isolamento de microrganismos não fastidiosos, verificação de
hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. e usado na prova
de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.).
(B) Análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar
das amostras submetidas a exames bacteriológicos e isolamento de
organismos para culturas puras, conservação e manutenção de culturas
em temperatura ambiente, como método opcional para os laboratórios
que não dispõem do método da criopreservação (congelamento das cepas
em freezer à - 70ºC) e observação da esporulação de espécies de bacilos
Gram-positivos.
(C) Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp.,
Neisseria spp. Branhamellacatarrhalis e Moraxella spp.
(D) Isolar bacilos Gram-negativos (enterobactérias e não fermentadores)
e verificar a fermentação ou não da lactose.
(E) Selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de
fezes, alimentos e água.

Comentário: O ágar sangue é um meio não seletivo e diferencial que


permite o crescimento de gram positivas e negativas, além de permitir a
visualização de hemólise. Ou seja, esse meio é utilizado para Usado para
o isolamento de microrganismos não fastidiosos, verificação de hemólise
dos Streptococcus spp. e Staphylococcusspp, e usado na prova de

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satelitismo (teste para identificação presuntiva de Haemophilusspp).
Resposta: Letra A.

10) (IDECAN Farmacêutico - Bioquímico - Pref. Simonésia/MG –


2016). “O crescimento dos micro-organismos nos diferentes meios de
cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua
identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada
meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada
material.” (Preparo de materiais em microbiologia; Meios de cultura
usados no laboratório; Técnicas de semeadura e colorações. Luciana
Debortoli de Carvalho.) Relacione adequadamente o meio de cultura ao
tipo de bactéria.
1. Ágar-Chocolate.
2. Caldo tioglicolato com indicador.
3. Caldo tioglicolato sem indicador.
4. Ágar-MacConkey.
5. Ágar-Manitol.
( ) Diferencial para espécies fermentadoras da lactose.
( ) Moraxella spp.
( ) Micro-organismos aeróbios, microaerófilos e anaeróbios.
( ) Diferencial para Staphylococcus aureus.
( ) Micro-organismos anaeróbios.
A sequência está correta em
A) 3, 5, 1, 4, 2.
B) 5, 3, 2, 4, 1.
C) 2, 1, 5, 3, 4.
D) 4, 1, 2, 5, 3.

Comentário: Como vimos acima, o agar chocolate “favorece o


crescimento da maioria das bactérias, incluindo algumas que não
crescem em Agar sangue”, então não pode ser considerado um meio
diferencial. O tioglicolato com indicador é utilizado para “avaliar a

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presença de bactérias aeróbias”, e além dos aeróbios, avalia a
presença de microaerófilos e anaeróbios, enquanto o tioglicolato sem
indicador é “usado para cultivo de microrganismos anaeróbios”. O Agar-
MacConkey é “meio seletivo para bactérias Gram-negativas e diferencial
para bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose”. E o
manitol é “meio seletivo usado para o isolamento de estafilococos
patogênicos, e o principal patógeno isolado nesse meio é o S. aureus.
Resposta: Letra D

11) (COTEC/UNIMONTES - Biomédico - Pref. Guaraciama/MG –


2016). Meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem
a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos
filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos
e outros fastidiosos. A descrição do quadro acima está mais bem
relacionada com qual meio de cultura abaixo?
A) Ágar chocolate.
B) Ágar sangue.
C) Ágar CLED.
D)Ágar Sabouraud.

Comentário: O Ágar Sangue é aquele meio utilizado para a diferenciação


de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. pela formação de halos de
hemólise nítidos. Além disso, nesse meio podem ser adicionados outros
suplementos que irão permitir alcançar um maior leque de
microrganismos. Resposta: Letra B.

12) (FUNCAB - Biomédico - Pref. Anápolis/GO – 2016). Durante a


rotina bacteriológica, vários meios podem ser utilizados dependendo do
tipo de microrganismo a ser pesquisado. Observe as características a
seguir:
I. Fornece fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas.

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II. Meio para cultivo de estreptococos, meningococos, penumococos,
enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos.
III. É um meio derivado de nutrientes de cérebro, coração peptona e
dextrose.
Essas características são referentes a qual meio de cultura?
A) Caldo BHI
B) Caldo selenito
C) Ágar CLED
D) Ágar sangue
E) Ágar Chocolate

Comentário: Vamos recordar a nossa aula: “Caldo BHI (Brain Heart


Infusion): é composto por nutrientes de cérebro e coração de gado,
peptona e dextrose, são utilizados para cultivo de estreptococcos,
pneumococos, meningococos, enterobactérias, não
fermentadores, leveduras e fungos”. Resposta: Letra A.

13) (FAFIPA - Serviço de Biomedicina - Pref. Londrina/PR –


2015). O ágar Mueller-Hinton é o meio de escolha para realização dos
testes de sensibilidade a antimicrobianos, pois:
(A) Demonstra reprodutibilidade reduzida entre os diferentes lotes nos
testes de sensibilidade.
(B) Permite crescimento satisfatório dos patógenos não fastidiosos.
(C) Existe falta de dados e experiência relativos a testes de sensibilidade
realizados com esse meio.
(D) Apresenta elevado custo.
(E) Nunca apresenta contaminações exógenas.

Comentário: “Agar Mueller-Hinton: meio utilizado para teste


rotineiro de suscetibilidade das bactérias. A sua composição é de
extratos de carne e caseína, sais, cátions divalentes e amido solúvel”. O
agar mueller-hinton é utilizado para o crescimento de diversas bactérias,

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principalmente aquelas que não exigem muitos suprimentos para crescer.
Resposta: Letra B.

14) (CESPE – HEMOBRÁS – ESPECIALISTA EM PRODUÇÃO DE


HEMODERIVADOS – FARMÁCIA - 2008).
Sabendo que os meios de cultura consistem da associação qualitativa e
quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao
desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural,
julgue os itens a seguir.

O ágar MacConkey é um meio de cultura destinado ao crescimento de


bactérias gram-negativas e é empregado na diferenciação de
enterobactérias.

Comentário: meio seletivo para bactérias Gram-negativas e diferencial


para bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose. Resposta:
Certo.

15) (AOCP - PREFEITURA MUNICIPAL DO JABOATÃO DOS


GUARARAPES ESTADO DO PERNAMBUCO - Bioquímico – 2015). As
culturas são feitas pela semeadura dos materiais clínicos em meios
sólidos, distribuídos em placas de Petri, ou em meios líquidos, distribuídos
em tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos. A respeito da
realização das culturas, assinale a alternativa correta.
(A) Os meios líquidos são utilizados como meio de enriquecimento ou
quando é grande o volume do material clínico a ser semeado.
(B) Uma vez semeados, todos os meios devem ser incubados em
temperatura acima de 45 ºC.
(C) A atmosfera isenta de O2 é a atmosfera necessária para o
crescimento de microrganismos aeróbios.

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(D) Quando se deseja obter um ambiente rico em O2 para o
crescimento de bactérias, deve se acender uma vela no fundo de uma
jarra, fechando-se hermeticamente essa jarra.
(E) Os meios de cultura não devem ser preparados no próprio
laboratório.

Comentário: A temperatura de incubação varia conforme o


microorganismo que deseja crescimento. A atmosfera isenta de O2 é
adequada para crescimento de microrganismos anaeróbios. Quando se
deseja um ambiente pobre em O2 deve se acender uma vela no fundo
da jarra. Os meios de cultura podem ser preparados no próprio
laboratório. Resposta: Letra A.

Pronto, finalizamos nossos estudos sobre os meios de cultura, e


como vimos na questão acima, eles realmente caem em prova!
Lembrando que os meios de cultura devem ser armazenados em locais
adequados. Para armazenar por um período curto, as culturas podem ser
mantidas à temperatura de refrigeradores (4 a 10ºC).

Depois de estudarmos todos esses tipos de meios de cultura, fica a


seguinte pergunta: Qual a importância e por que temos tantos meios de
cultura disponíveis?

A resposta é simples, a escolha para o processamento inicial das


amostras é muito importante e está condicionada à flora patogênica
do local da coleta. Em geral, se utiliza mais de um meio porque a
maioria das doenças são causadas por uma variedade de organismos,
então é importante que o laboratório de diagnóstico seja capaz de
selecionar os meios apropriados para o isolamento dos microrganismos

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mais comuns e selecionar meios especializados quando o clinico suspeitar
de um organismo específico.

Já vimos como é feita a coleta das amostras, já vimos os meios que


são utilizados para cultivo e crescimento dos microrganismos, e agora
iremos estudar quais são os meios utilizados para a identificação do
patógeno. Então, vamos começar!

8. Coloração:

Bom, como o próprio nome diz, a coloração significa corar os


microrganismos com uma substância que irá enfatizar certas estruturas e
assim permitir a sua identificação. Essas substâncias são conhecidas
como corantes. Mas para que os corantes façam sua função, precisamos
primeiro fixar (aderir) os microrganismos à lâmina. Para isso, é feito um
esfregaço do material na lâmina e depois deixar secar. Só depois da
lâmina seca que poderá ser feito o processo de coloração.
Eita, vamos por partes!

Como é feito a preparação do esfregaço?


Para o esfregaço, precisaremos pegar uma pequena quantidade da
amostra e colocá-la sobre a lâmina de vidro, esperar secar e fixar o
esfregaço passando a lâmina (no lado oposto ao esfregaço) na chama do
bico de Bunsen. Depois de preparado o esfregaço, iniciaremos a nossa
coloração. Aqui, vamos abordar os dois tipos de coloração mais utilizados.

Coloração de Gram:

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista


dinamarquês Hans Christian Gram, daí o nome coloração de Gram :D.
Esse método as bactérias em dois grandes grupos: as bactérias gram-

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negativas e as bactérias gram-positivas. Mas para entendermos a
coloração de gram, precisamos diferenciar as bactérias em gram-
negativas e gram-positivas.

A principal diferença entre as bactérias gram-negativas e gram-


positivas é a composição da parede celular. Basicamente, a parede
celular de uma bactéria é uma estrutura complexa e semi-rígida,
responsável pela forma da célula. E aí, vamos ver as diferenças entre
a parede celular das bactérias gram-negativas e gram-positivas:
 Gram-positivas: A parede celular das bactérias gram-positivas
consiste de muitas camadas de peptideoglicano que formam
uma estrutura espessa e rígida. Além dos peptideoglicanos, a
parede celular das gram-positivas contêm ácidos teicóicos, que
consistem basicamente em um álcool (glicerol ou ribitol) e
fosfato;
 Gram-negativas: Em contraste, a parede celular das bactérias
gram-negativas contém somente uma camada fina de
peptideoglicano, mas apresentam uma membrana externa
lipídica que não está presente nas gram-positivas. E diferente
das gram-positivas, na parede celular das gram-negativas não
contêm ácidos teóicos;

A parede celular das bactérias


gram-negativas é quimicamente
mais complexa, porque possui maior quantidade de aminoácidos e
lipídeos. A membrana externa presente nas bactérias gram-
negativas não fornecem uma barreira para todas as substâncias no

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ambiente, pois os nutrientes devem atravessá-la para manter o
metabolismo da célula. O componente lipopolissacarídeo (LPS) da
membrana externa das bactérias gram-negativas atua como
antígenos e são úteis para diferenciar as espécies das bactérias.

Estrutura da parede Estrutura da parede


celular de bactéria celular de bactéria
Gram-positiva Gram-negativa

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O peptideoglicano é um dissacarídeo (açúcar) repetitivo unido por


polipeptídeos (aminoácidos) para formar uma rede que circunda e
protege toda a célula. A porção dissacarídica é composta de
monossacarídeos denominados N-acetilglicosamina (NAG) e ácido N-
acetilmurâmico (NAM), que estão relacionados à glicose.

Estrutura química do pepetidioglicano

Agora que sabemos as diferenças entre as bactérias gram-negativas


e gram-positivas, entenderemos o principio da coloração de Gram.
A coloração de Gram se baseado nas diferenças estruturais da
parede celular das bactérias gram-negativas e gram-positivas, e como
cada uma reage aos vários reagentes.
O corante principal é o violeta de genciana, que cora as células de
púrpura, já que o corante entra no citoplasma de ambos os tipos de
células. Quando o iodo é aplicado, ele forma cristais com o corante, e
aí em seguida, aplica-se o álcool, que irá desidratar o peptideoglicano
das células gram-positivas, tornando assim as células mais impermeáveis

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ao cristal violeta-iodo. Ao contrário, nas bactérias gram-negativas, o
álcool dissolve a membrana externa, fazendo com que o corante violeta-
iodo entre dentro da membrana, e aí as bactérias gram-negativas ficam
incolores com a lavagem de álcool, e com a adição do corante safarina
torna as células cor-de-rosa.

CARACTERÍSTICAS GRAM-POSITIVA GRAM-NEGATIVA

REAÇÃO DE GRAM RETÉM O CORANTE PODE SER DESCORADO


VIOLETA DE GENCIANA E PARA ACEITAR
CORA-SE DE VIOLETA CONTRACORANTE
ESCURO OU PÚRPURA. (SAFARINA) E CORA-SE
DE VERMELHO.

CAMADA DE ESPESSA (MÚLTIPLAS FINA (CAMADA ÚNICA)


PEPTIDEOGLICANA CAMADAS)

ÁCIDOS TEICÓICOS PRESENTES EM MUITAS AUSENTES

ESPAÇO PERIPLÁSMICO AUSENTE PRESENTE

MEMBRANA EXTERNA AUSENTE PRESENTE

CONTEÚDO DE NENHUM ALTO


LIPOPOLISSACARÍDEO
(LPS)

CONTEÚDO DE LIPÍDEOS BAIXO (AS BACTÉRIAS ALTO (DEVIDO À


E LIPOPROTEÍNAS ÁLCOOL-ÁCIDO PRESENÇA DA
RESISTENTES POSSUEM MEMBRANA EXTERNA)
LIPÍDEOS UNIDOS À
PEPETIDEOGLICANA)

RESISTÊNCIA À ALTA BAIXA


RUPTURA FÍSICA

INIBIÇÃO POR ALTA BAIXA


CORANTES BÁSICOS

Vamos falar detalhadamente como é feito o processo da coloração


de Gram.

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Procedimento da coloração de Gram:

1. Coloca-se sobre o esfregaço realizado um corante básico púrpura,


normalmente é o corante violeta de genciana, essa etapa constitui
a coloração primária;

2. Após um minuto, lavar rapidamente com água destilada;

3. Cobrir a lâmina com solução de lugol (iodo) por um minuto;

4. Após um minuto, lavar em água destilada;

5. Após a lavagem, lavar a lâmina com álcool-acetona ou álcool


absoluto por 15 segundos, e em seguida lavar com água correte;

6. Em seguida, cobrir a lâmina com fucsina de gram ou safarina e


aguardar por 30 segundos;

7. Após essa etapa, lavar a lâmina com água destilada e deixar secar;

16) (AOCP - EBSERH/HC-UFG – 2015). Para executar a coloração de


Gram, utiliza-se, respectivamente, os seguintes componentes:

A) violeta de metila, lugol, álcool-cetona e Giemsa.


B) violeta de metila, lugol, azul de metileno, e safranina.
C) iodo, álcool-cetona e safranina.
D) giemsa, lugol, álcool-cetona e safranina.
E) cristal violeta, lugol, álcool-cetona e safranina.

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Comentário: Moleza né!? O protocolo de coloração pelo método de gram


segue a seguinte sequência: cristal violeta, lugol, álcool-acetona e
safranina (ou fucsina). Resposta: Letra E.

17) (AOCP - EBSERH/CH-UFPA – Biomédico – 2016). Um aluno de


Biomedicina realizou a coloração de Gram, que é um método para corar
lâminas de vários materiais biológicos na identificação de bactérias.
Observou ao final do método que trocou a ordem dos corantes, colocando
primeiro a fucsina, em seguida o lugol, depois o descorante e por último o
cristal violeta. Nesse caso, o que irá acontecer?
(A) As bactérias gram negativas ficarão coradas de roxo.
(B) As bactérias gram positivas ficarão coradas de roxo.
(C) As bactérias gram negativas ficarão coradas em rosa.
(D) As bactérias gram positivas não irão corar.
(E) Ele não conseguirá visualizar nada na lâmina, pois não haverá
nenhuma bactéria corada.

Comentário: O correto seria primeiramente corar com o cristal violeta,


posteriormente colocar o lugol que é um fixador, posteriormente utilizar o
descorante para que aquelas gram-negativas se descorassem e ao ser
colocado em contato com a fucsina se corassem de rosa. Como a ordem
foi trocada, todas as bactérias estariam coradas inclusive as gram
negativas estariam em uma coloração roxa. Resposta: Letra A.

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O que acontece no processo de coloração de Gram?

Quando utilizamos o corante violeta de genciana e depois lavamos


com a solução de iodo (lugol), forma-se um complexo entre os dois de
coloração escura, chamado iodopararosanilina. Esse complexo é
fortemente retido nas bactérias Gram-Positivas e o álcool não consegue
remover esse complexo, já nas bactérias Gram-negativas, esse
complexo é removido pelo álcool. Quando realizamos a segunda
coloração, com safarina ou fucsina, as bactérias Gram-Negativas
apresentarão coloração avermelhada, porque elas retêm o
contracorante, enquanto as Gram-Positivas apresentam coloração
roxa, porque elas conservam o primeiro corante.

Esquema da coloração de Gram

Visualização das bactérias no


microscópio após a coloração de Gram

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18) (IDECAN Farmacêutico - Bioquímico - Pref. Simonésia/MG


2016). Sobre a técnica de coloração de Gram, assinale a alternativa
correta.

A) Os micro-organismos são expostos a uma coloração a quente com


carbolfucsina concentrada por 5 minutos.
B) Bactérias Gram-negativas não perdem o corante violeta durante a
descoloração e, por isso, adquirem coloração rosa.
C) Bactérias Gram-positivas retêm o corante violeta por resistirem à
descoloração e ficam coradas em azul escuro / roxo.
D) Bactérias Gram-positivas perdem o corante violeta durante a
descoloração e adquirem a coloração azul escuro / roxo.

Comentário: “Quando utilizamos o corante violeta de genciana e depois


lavamos com a solução de iodo (lugol), forma-se um complexo entre os
dois de coloração escura, chamado iodopararosanilina. Esse
complexo é fortemente retido nas bactérias Gram-Positivas e o álcool
não consegue remover esse complexo, já nas bactérias” Como vimos na
nossa aula, as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular que
consiste em muitas camadas de peptideoglicano, formando uma parede
espessa e rígida, fazendo com que o corante violeta de genciana fique
retido e não sofra descoloração, por isso ela apresenta coloração
roxa/azul escuro. Resposta: Letra C.

19) (COVEST - Biomédico – UFPE – 2015). Um estagiário do


laboratório de Microbiologia Clínica recebeu uma lâmina contendo
esfregaço de Escherichia coli e uma lâmina contendo esfregaço de Staphy

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lococcus aureus para serem coradas pela coloração de Gram (cristal
violeta, lugol, álcool, fucsina diluída). Após fixar os esfregaços pelo calor,
o estagiário realizou a coloração, porém inverteu a ordem da utilização
dos corantes (fucsina, álcool diluído, cristal violeta, lugol). Qual foi o
resultado da coloração observado ao microscópio para E. coli e S. aureus,
respectivamente?
A) Bacilos vermelho claros e cocos vermelho-escuros.
B) Bacilos vermelho-claros e bacilos violeta-escuros.
C) Bacilos e cocos vermelho-claros.
D) Bacilos e cocos violeta-escuros.
E) Cocos vermelho-claros e cocos violeta-escuros.

Comentário: A E. coli é um bacilo gram-negativo, ao analisarmos essa


cepa no microscópio, ela irá apresentar a forma bacilar e por ser um
microrganismos gram-negativo deverá apresentar coloração
avermelhada/vermelho claro. Já o S. aureus, é uma bactéria do grupo
cocos gram-positivo, ou seja, apresentaram forma de cocos (ou cachos
de uva) e coloração vermelho-escuro/roxo/azul-escuro. Porém,
quando o estagiário inverteu a ordem dos corantes, não será
possível observar a cor vermelho claro, já que esse corante não
será fixado. Resposta: Letra D.

20) (COVEST - Biomédico – UFPE – 2015). A técnica de coloração


diferencial mais importante em bacteriologia é o método de Gram. Este
método explora o fato de células com propriedades diferentes
apresentarem coloração diferente. Assim, as bactérias podem se
comportar como Gram-positivas ou como Gram-negativas. Nesse
contexto, analise as afirmativas abaixo.
1) A camada de peptideoglicano é muito mais espessa nas bactérias
Gram-positivas, e essas bactérias podem possuir uma camada de ácido
teicoico.

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2) Os micro-organismos Gram-negativos possuem uma camada externa
composta de lipopolissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídios.
3) Apenas os micro-organismos Gram-positivos têm uma membrana
externa contendo endotoxina (lipopolissacarídeo).
4) Os micro-organismos Gram-positivos e os Gram-negativos contêm
peptideoglicano; contudo, nos primeiros, a parede é única e fina e nos
segundos a parede é múltipla e espessa. Estão corretas, apenas:
A) 1 e 4.
B) 1 e 3.
C) 2 e 3.
D) 3 e 4.
E) 1 e 2.

Comentário: “Gram-positivas: A parede celular das bactérias gram-


positivas consiste de muitas camadas de peptideoglicano que formam
uma estrutura espessa e rígida. Além dos peptideoglicanos, a parede
celular das gram-positivas contêm ácidos teicóicos, que consistem
basicamente em um álcool (glicerol ou ribitol) e fosfato;
Gram-negativas: Em contraste, a parede celular das bactérias gram-
negativas contém somente uma camada fina de peptideoglicano, mas
apresentam uma membrana externa lipídica que não está presente nas
gram-positivas. E diferente das gram-positivas, na parede celular das
gram-negativas não contêm ácidos teóicos;”. Resposta: Letra E.

21) (AOCP - Biomédico - EBSERH/HC-UFG – 2015). “As bactérias


são classificadas de acordo com sua morfologia, estrutura, atividade
metabólica e fatores ambientais necessários à sobrevivência” (ARAÚJO et
al, 2010). Em relação às bactérias, é correto afirmar que
(A) as bactérias gram-negativas possuem espessa camada que é
firmemente aderida à carioteca de sua própria célula.
(B) certos organismos gram-positivos e gramnegativos podem apresentar
também uma cápsula, ou camada de glicocálice, internamente à parede

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celular. Essa cápsula torna a bactéria vulnerável à fagocitose por
monócitos, podendo dificultar sua fixação tecidos do hospedeiro.
(C) os organismos gram-positivos são assim denominados devido às
características de coloração próprias da sua finíssima camada externa de
peptidoglicano, além disso, esses micro-organismos possuem amplo
complexo de Golgi e mitocôndrias em seu interior.
(D) as bactérias são classificadas em Gram-positivas ou Gram-negativas
em função da diferença na arquitetura da parede celular. A parede celular
Gram-positiva consiste de uma camada espessa de peptidoglicano (~30
nm), enquanto a parede celular da Gram-negativa apresenta camada
mais fina de peptidoglicano (~10nm) e sua estrutura e composição da
membrana mais complexas.
(E) bactérias como as microbactérias têm glicolipídeos múltiplos que lhes
conferem uma aparência de bolor, acarretando desvantagens biológicas,
impedindo a infecção ao hospedeiro.

Comentário: Mesma justificativa da questão anterior, as bactérias Gram-


Positivas e Gram-Negativas se diferenciam pela sua parede celular.
“Gram-positivas: A parede celular das bactérias gram-positivas consiste
de muitas camadas de peptideoglicano que formam uma estrutura
espessa e rígida. Além dos peptideoglicanos, a parede celular das gram-
positivas contêm ácidos teicóicos, que consistem basicamente em um
álcool (glicerol ou ribitol) e fosfato; Gram-negativas: Em contraste, a
parede celular das bactérias gram-negativas contém somente uma
camada fina de peptideoglicano, mas apresentam uma membrana externa
lipídica que não está presente nas gram-positivas. E diferente das gram-
positivas, na parede celular das gram-negativas não contêm ácidos
teóicos;”. Resposta: Letra D.

22) (UFT/COPESE- Biomédico - Pref. Guaraí/TO- 2016). “A Grã-


Bretanha e a Ásia estão enfrentando um surto de escarlatina que intriga
especialistas. De acordo com a Autoridade de Saúde Pública da Inglaterra

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(PHE, na sigla em inglês), em 2015, foram registrados 17.586 casos da
infecção no país – o número só não ultrapassa os registros de 1967, com
19.305 notificações. A escarlatina é uma infecção bacteriana, causada por
estreptococos do grupo A, que atinge principalmente crianças com idades
entre 5 e 12 anos.” Fonte: Adaptado de VEJA.com/Divulgação
(21/03/2016). Referente às características das bactérias, é CORRETO
afirmar que:
(A) A diferenciação entre as bactérias é realizada exclusivamente pelas
suas características morfológicas.
(B) Os aspectos microscópicos, incluindo o tamanho, forma e os arranjos
dos organismos (cocos, bastonetes, curvos ou espiralados), determinam a
capacidade das bactérias de resistir a certos antibióticos.
(C) Coloração de Gram é um teste rápido que permite aos clínicos a
diferenciação entre as duas mais importantes classes de bactérias.
(D) As bactérias Gram negativas têm a camada de peptidoglicano espessa
contendo ácido teicoico e ácidos lipoteicoicos.

Comentário: Abordamos esse assunto no tópico sobre coloração: “A


coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista
dinamarquês Hans Christian Gram, daí o nome coloração de Gram . Esse
método as bactérias em dois grandes grupos: as bactérias gram-
negativas e as bactérias gram-positivas”. Resposta: Letra C.

23) (FAFIPA - Serviço de Biomedicina - Pref. Londrina/PR –


2015). A coleta de materiais biológicos para exames de microbiologia
deve seguir as seguintes recomendações:
(A) Identificar o material do paciente adequadamente.
(B) Informar dificuldades que possam ocorrer durante a coleta, como
material insuficiente para análise adequada.
(C) Informar sobre o uso de antimicrobianos prévios à coleta do material
pelo paciente.

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(D) No geral, os procedimentos de coleta seguem protocolos específicos
que facilitam o cultivo dos micro-organismos suspeitos, de acordo com o
sítio a ser investigado.
(E) Todas estão corretas.

Comentário: A questão descreve corretamente a ordem que deve ser


seguida para a coleta de materiais biológicos para exames de
microbiologia.

 A coleta deve sempre ser realizada previamente à introdução de


terapia antimicrobiana ou de sua modificação, pois estas interferem
na viabilidade das bactérias para a cultura microbiológica;
 O volume de amostra interfere na sensibilidade dos testes
microbiológicos e deve ser suficiente para a execução dos diversos
procedimentos solicitados. Amostras insuficientes podem levar a
resultados falso-negativos;
 Informar claramente ao paciente os procedimentos necessários à
coleta da amostra microbiológica;
 A identificação correta da amostra, assim como o sítio de origem e
a suspeita clínica são informações importantes que devem constar
na requisição para que o microbiologista clínico possa executar os
procedimentos recomendados e utilizar os meios de cultura
adequados. Resposta: Letra E.

Gabarito: E

24) (MAKIYAMA - Biomédico - Pref. Natal/RN – 2016). A respeito


da coloração bacteriana de Gram:
A) As bactérias que possuem a camada de lipídios associados a
polissacarídeos não são coradas pela coloração de Gram.
B) Escherichia coli e Staphylococcus aureus são bactérias Gram-
negativas.

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C) Bactérias Gram negativas são aquelas que apresentam uma camada
lipídica não corada pelo corante devido à afinidade entre a pigmentação e
a camada de fosfolipídeos.
D) As bactérias Gram-positivas têm parede celular espessa e única de
peptidoglicanos, que, ao contato com a coloração de Gram, adquire cor
púrpura ou azul.

Comentário: O que caracteriza as bactérias é a composição da parede


celular. “Gram-positivas: A parede celular das bactérias gram-positivas
consiste de muitas camadas de peptideoglicano que formam uma
estrutura espessa e rígida. Além dos peptideoglicanos, a parede celular
das gram-positivas contêm ácidos teicóicos, que consistem basicamente
em um álcool (glicerol ou ribitol) e fosfato;”. Resposta: Letra D.

25) (UNIPAMPA – CESPE – 2013 – FARMACÊUTICO-BIOQUÍMICO)


Com relação aos exames de diagnóstico em microbiologia, julgue os itens
que se seguem.
Considere que, na análise de determinados microrganismos, sejam
visualizadas, após coloração pelo método de gram, bactérias de
morfologia esférica, agrupadas em forma de corrente, de cor roxa ao
microscópio. Nesse caso, os microrganismos analisados são estafilococos
gram-negativos.

Comentário: Nesse caso, os microrganismos analisados são estafilococos


gram-positivos, pois apresentam coloração roxa ao microscópio.
Resposta: Errado.

Coloração de Ziehl-Neelsen

Outro tipo de coloração utilizada na prática clínica foi


desenvolvida pelo bacteriologista Franz Ziehl e pelo patologista
alemão Friedrich Carl Adolf Neelsen, em 1882. Eles se basearam

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nas propriedades que alguns gêneros bacterianos apresentam de
resistir ao descoramento feito por uma solução álcool-ácido, que
fazem com que essas bactérias permaneçam coradas de vermelho
depois de serem tratadas com fucsina. Chamamos essas bactérias
de Bacilo-Álcool-Ácido-Resistente – BAAR). Elas se diferem das
outras bactérias que retém a cor do corante de fundo.

Procedimento da coloração de Ziehl-Neelsen:

1. Cobrir o esfregaço com solução de fucsina de Ziehl e deixar


agir por 5-10min, aquecendo com chama branda, até
observar o desprendimento de vapores.
2. Lavar com água corrente e descorar com solução de álcool-
ácido clorídrico a 1%.
3. Cobrir o esfregaço com azul de metileno, por
aproximadamente 30 segundos.
4. Lavar e deixar secar.

Esquema da coloração de Ziehl-Neelsen

Pronto! Estudamos os principais métodos de coloração


bacteriana! Após o preparo da lâmina, é só analisar a lâmina no
microscópio!

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26) (AOCP - EBSERH/HDT-UFT- 2015). Um paciente está


apresentando sintomas de hanseníase. Para confirmar o diagnóstico, um
técnico deve realizar uma coloração específica para a bactéria causadora
da hanseníase. Qual coloração é essa?
A) De campo escuro.
B) Giemsa.
C) Ziehl-Neelsen
D) Tinta da china.
E) Hematoxilina e eosina.

Comentário: O bacilo de Hansen é um bacilo álcool ácido resistente, e a


técnica apropriada para detecção deste tipo de bactérias é a coloração de
Ziehl-Neelsen como vimos na aula. Resposta: Letra C.

27) (FAFIPA - Serviço de Biomedicina - Pref. Londrina/PR –


2015).
Sobre o método de Ziehl-Nielsen para bacterioscopia direta, pode-se
afirmar que:
(A) Esta metodologia categoriza as bactérias em álcool-ácido-resistentes
e não álcool-ácido resistentes.
(B) O corante empregado é o Albert-Layborn, capaz de penetrar no
interior do Mycobacterium tuberculosis.
(C) É sempre utilizada em associação com o método de impregnação em
prata.
(D) Deve ser confirmado por microscopia de campo escuro ou pelo
método de tinta nanquim.
(E) Utiliza um corante que pode se tornar fluorescente na microscopia
óptica.

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Comentário: “Eles se basearam nas propriedades que alguns gêneros
bacterianos apresentam de resistir ao descoramento feito por uma
solução álcool-ácido, que fazem com que essas bactérias permaneçam
coradas de vermelho depois de serem tratadas com fucsina. Chamamos
essas bactérias de Bacilo-Álcool-Ácido-Resistente – BAAR)”. Resposta:
Letra A.

28) (FIOCRUZ – FGV – 2010). Assinale a alternativa que apresente a


sequência correta para se obter a coloração de Ziehl-Neelsen.
a) Adicionar fuccina, aquecer por cinco minutos até sair vapor, escorrer o
corante, adicionar álcool-clorídrico, lavar com água, corar com azul de
metileno, lavar e secar.
b) Adicionar fuccina, aquecer até sair vapor, escorrer o corante, adicionar
álcool, lavar com água, corar com azul de metileno, lavar e secar.
c) Adicionar fuccina, aquecer até sair vapor, escorrer o corante, adicionar
álcool-clorídrico deixando por um minuto, lavar com água, corar com azul
de metileno, lavar e secar.
d) Adicionar fuccina, aquecer por cinco minutos até sair vapor, escorrer o
corante, adicionar ácido clorídrico, lavar com água, corar com azul de
metileno, lavar e secar.
e) Adicionar fuccina, aquecer por cinco minutos até sair vapor, escorrer o
corante, adicionar álcool-clorídrico, lavar com água, corar com cristal
violeta, lavar e secar.

Comentário: Como o procedimento descrito acima, a resposta correta é


a letra A. Resposta: A.

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9. Provas de controle de qualidade:

Para manter um controle de qualidade dentro do laboratório


microbiológico, utilizamos algumas cepas padrão que indicaram se o meio
de cultura está gerando os resultados esperados. Essas cepas apresentam
respostas conhecidas a uma série de provas laboratoriais. As principais
cepas utilizadas são ATCC (American Type Culture Collection). Alguns
exemplos de cepas utilizadas são:

 E. coli ATCC 25922: Cepa não produtora de beta-lactamase;


Utilizada para testes de sensibilidade para painéis de gram-
negativos;
 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883: produz um grande número de
provas positivas para controle de painéis de gram-negativos;
 Pseudomonas aeruginosas ATCC 27853: são cepas sensíveis aos
agentes anti-pseudomonas, utilizadas para testes de crescimento de
enterobactérias;
 Enterococcus fecalis ATCC 51299: cepas sensíveis à ampicilina,
vancomicina e aminoglicosídeos de alto nível; utilizadas para testes
automatizados de identificação e sensibilidade para painéis de
gram-positivos;
 Staphylococcus aureus ATCC 25927: cepas não produtoras de beta-
lactamase para testes de identificação de Staphylococcus sp. e
Enterococcus sp.;

E assim, encerramos nossa primeira aula! Agora vamos colocar em


prática o que nós aprendemos sobre o conteúdo. E aguardo vocês na
nossa próxima aula.
Abraços,
Professora Thaiana Cirqueira

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10. Lista de Questões Apresentadas

01) (AOCP- HRL-UFS – 2016 – Biomédico). Estudos


identificam as bactérias como seres unicelulares, constituídas
basicamente de: membrana, citoplasma e núcleo. Esse conjunto
tem o nome de PROTOPLASTO. Além disso, possuem outras
estruturas que, apesar de importantes, nem sempre são
encontradas em todas as bactérias como: parede, cápsula, flagelos
e esporos. Assinale a alternativa INCORRETA a respeito do
agrupamento das bactérias (cocos).

(A) Isolados – Micrococos.


(B) Aos pares – Diplococos.
(C) Em cadeias – Estreptococos.
(D) Em cachos regulares – Estafilococos.
(E) Em grupo de quatro – Tetrágenos.

02) (AOCP- EBSERH/HC-UFG – 2015). Meios de cultura podem


ser sólidos, semissólidos ou líquidos. O componente mais utilizado
para a solidificação de meios de cultura estéreis é o:

A) álcool 70%.
B) xilol.
C) ágar-ágar.
D) formol.
E) Metanol

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03) (AOCP - Biomédico - EBSERH/HU-UFJF – 2015). Quais são os
principais componentes de um meio de cultura?
(A) Energia, oxigênio, elastina e colágeno.
(B) Fósforo, queratina, glúten e carbono.
(C) Fontes de carbono, açúcares, nitrogênio, fósforo e sais minerais.
(D) Sais minerais, oxigênio, elastina e carbono.
(E) Fontes de carbono, energia, colágeno e elastina.

04) (CESPE – UNIPAMPA – FARMACÊUTICO/BIOQUÍMICO – 2013).


Julgue os próximos itens, que versam sobre meios de cultura.
A composição do meio de cultura independe da exigência nutricional do
microrganismo.

05) (CESPE- UNIPAMPA – 2013). Julgue os próximos itens, que


versam sobre meios de cultura. Meios de cultura ou meios de cultivo
podem ser definidos como qualquer substância química ou biológica
utilizada para a manutenção de microrganismos vivos.

06) ( COMPERVE – UFRN- 2015). Meios de cultura consistem na


associação de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao
desenvolvimento de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em
vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários
tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências
nutricionais.
Sobre os meios de cultura é correto afirmar:
a) Os meios de enriquecimento contêm substâncias que inibem o
desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos,
favorecendo o crescimento de outros.

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b) Os meios seletivos proporcionam nutrientes adequados ao crescimento
de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de
crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos.
c) Os meios diferenciais contêm substâncias que permitem estabelecer
diferenças entre microrganismos muito parecidos.
d) Os meios de dosagem prestam-se para a realização de provas
bioquímicas e para a verificação de funções fisiológicas de organismos
submetidos à identificação.

07) (CESPE – Farmacêutico/Bioquímico – 2013). Julgue os próximos


itens, que versam sobre meios de cultura. O meio de cultura de
enriquecimento é aquele que contém um agente redutor (tioglicolato ou
cisteína), previne a desidratação e mantém o pH favorável.

08) (CESPE – HEMOBRÁS – ESPECIALISTA EM PRODUÇÃO DE


HEMODERIVADOS – FARMÁCIA – 2008). Sabendo que os meios de
cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias
que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de
microrganismos fora do seu meio natural, julgue os itens a seguir.

Os meios de cultura empregados em preparações bacteriológicas são


sólidos, visto que os meios líquidos não servem para o cultivo de
bactérias.

09) (AOCP - EBSERH/CH-UFPA – Biomédico – 2016). O crescimento


de microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as
primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o
potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil
bacteriano esperado para cada material. Um meio de cultura muito
utilizado é o ágar sangue (AS). Qual é sua principal finalidade?

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(A) Isolamento de microrganismos não fastidiosos, verificação de
hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. e usado na prova
de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.).
(B) Análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar
das amostras submetidas a exames bacteriológicos e isolamento de
organismos para culturas puras, conservação e manutenção de culturas
em temperatura ambiente, como método opcional para os laboratórios
que não dispõem do método da criopreservação (congelamento das cepas
em freezer à - 70ºC) e observação da esporulação de espécies de bacilos
Gram-positivos.
(C) Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp.,
Neisseria spp. Branhamellacatarrhalis e Moraxella spp.
(D) Isolar bacilos Gram-negativos (enterobactérias e não fermentadores)
e verificar a fermentação ou não da lactose.
(E) Selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de
fezes, alimentos e água.

10) (IDECAN Farmacêutico - Bioquímico - Pref. Simonésia/MG –


2016). “O crescimento dos micro-organismos nos diferentes meios de
cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua
identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada
meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada
material.” (Preparo de materiais em microbiologia; Meios de cultura
usados no laboratório; Técnicas de semeadura e colorações. Luciana
Debortoli de Carvalho.) Relacione adequadamente o meio de cultura ao
tipo de bactéria.
1. Ágar-Chocolate.
2. Caldo tioglicolato com indicador.
3. Caldo tioglicolato sem indicador.
4. Ágar-MacConkey.
5. Ágar-Manitol.
( ) Diferencial para espécies fermentadoras da lactose.

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( ) Moraxella spp.
( ) Micro-organismos aeróbios, microaerófilos e anaeróbios.
( ) Diferencial para Staphylococcus aureus.
( ) Micro-organismos anaeróbios.
A sequência está correta em
A) 3, 5, 1, 4, 2.
B) 5, 3, 2, 4, 1.
C) 2, 1, 5, 3, 4.
D) 4, 1, 2, 5, 3.

11) (COTEC/UNIMONTES - Biomédico - Pref. Guaraciama/MG –


2016). Meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem
a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos
filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos
e outros fastidiosos. A descrição do quadro acima está mais bem
relacionada com qual meio de cultura abaixo?
A) Ágar chocolate.
B) Ágar sangue.
C) Ágar CLED.
D)Ágar Sabouraud.

12) (FUNCAB - Biomédico - Pref. Anápolis/GO – 2016). Durante a


rotina bacteriológica, vários meios podem ser utilizados dependendo do
tipo de microrganismo a ser pesquisado. Observe as características a
seguir:
I. Fornece fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas.
II. Meio para cultivo de estreptococos, meningococos, penumococos,
enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos.
III. É um meio derivado de nutrientes de cérebro, coração peptona e
dextrose.
Essas características são referentes a qual meio de cultura?

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A) Caldo BHI
B) Caldo selenito
C) Ágar CLED
D) Ágar sangue
E) Ágar Chocolate

13) (FAFIPA - Serviço de Biomedicina - Pref. Londrina/PR –


2015). O ágar Mueller-Hinton é o meio de escolha para realização dos
testes de sensibilidade a antimicrobianos, pois:
(A) Demonstra reprodutibilidade reduzida entre os diferentes lotes nos
testes de sensibilidade.
(B) Permite crescimento satisfatório dos patógenos não fastidiosos.
(C) Existe falta de dados e experiência relativos a testes de sensibilidade
realizados com esse meio.
(D) Apresenta elevado custo.
(E) Nunca apresenta contaminações exógenas.

14) (CESPE – HEMOBRÁS – ESPECIALISTA EM PRODUÇÃO DE


HEMODERIVADOS – FARMÁCIA - 2008).
Sabendo que os meios de cultura consistem da associação qualitativa e
quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao
desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural,
julgue os itens a seguir.

O ágar MacConkey é um meio de cultura destinado ao crescimento de


bactérias gram-negativas e é empregado na diferenciação de
enterobactérias.

15) (AOCP - PREFEITURA MUNICIPAL DO JABOATÃO DOS


GUARARAPES ESTADO DO PERNAMBUCO - Bioquímico – 2015). As

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culturas são feitas pela semeadura dos materiais clínicos em meios
sólidos, distribuídos em placas de Petri, ou em meios líquidos, distribuídos
em tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos. A respeito da
realização das culturas, assinale a alternativa correta.
(A) Os meios líquidos são utilizados como meio de enriquecimento ou
quando é grande o volume do material clínico a ser semeado.
(B) Uma vez semeados, todos os meios devem ser incubados em
temperatura acima de 45 ºC.
(C) A atmosfera isenta de O2 é a atmosfera necessária para o
crescimento de microrganismos aeróbios.
(D) Quando se deseja obter um ambiente rico em O2 para o
crescimento de bactérias, deve se acender uma vela no fundo de uma
jarra, fechando-se hermeticamente essa jarra.
(E) Os meios de cultura não devem ser preparados no próprio
laboratório.

16) (AOCP - EBSERH/HC-UFG – 2015). Para executar a coloração de


Gram, utiliza-se, respectivamente, os seguintes componentes:

A) violeta de metila, lugol, álcool-cetona e Giemsa.


B) violeta de metila, lugol, azul de metileno, e safranina.
C) iodo, álcool-cetona e safranina.
D) giemsa, lugol, álcool-cetona e safranina.
E) cristal violeta, lugol, álcool-cetona e safranina.

17) (AOCP - EBSERH/CH-UFPA – Biomédico – 2016). Um aluno de


Biomedicina realizou a coloração de Gram, que é um método para corar
lâminas de vários materiais biológicos na identificação de bactérias.
Observou ao final do método que trocou a ordem dos corantes, colocando
primeiro a fucsina, em seguida o lugol, depois o descorante e por último o
cristal violeta. Nesse caso, o que irá acontecer?
(A) As bactérias gram negativas ficarão coradas de roxo.

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(B) As bactérias gram positivas ficarão coradas de roxo.
(C) As bactérias gram negativas ficarão coradas em rosa.
(D) As bactérias gram positivas não irão corar.
(E) Ele não conseguirá visualizar nada na lâmina, pois não haverá
nenhuma bactéria corada.

18) (IDECAN Farmacêutico - Bioquímico - Pref. Simonésia/MG


2016). Sobre a técnica de coloração de Gram, assinale a alternativa
correta.

A) Os micro-organismos são expostos a uma coloração a quente com


carbolfucsina concentrada por 5 minutos.
B) Bactérias Gram-negativas não perdem o corante violeta durante a
descoloração e, por isso, adquirem coloração rosa.
C) Bactérias Gram-positivas retêm o corante violeta por resistirem à
descoloração e ficam coradas em azul escuro / roxo.
D) Bactérias Gram-positivas perdem o corante violeta durante a
descoloração e adquirem a coloração azul escuro / roxo.

19) (COVEST - Biomédico – UFPE – 2015). Um estagiário do


laboratório de Microbiologia Clínica recebeu uma lâmina contendo
esfregaço de Escherichia coli e uma lâmina contendo esfregaço de Staphy
lococcus aureus para serem coradas pela coloração de Gram (cristal
violeta, lugol, álcool, fucsina diluída). Após fixar os esfregaços pelo calor,
o estagiário realizou a coloração, porém inverteu a ordem da utilização
dos corantes (fucsina, álcool diluído, cristal violeta, lugol). Qual foi o
resultado da coloração observado ao microscópio para E. coli e S. aureus,
respectivamente?
A) Bacilos vermelho claros e cocos vermelho-escuros.
B) Bacilos vermelho-claros e bacilos violeta-escuros.
C) Bacilos e cocos vermelho-claros.
D) Bacilos e cocos violeta-escuros.

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E) Cocos vermelho-claros e cocos violeta-escuros.

20) (COVEST - Biomédico – UFPE – 2015). A técnica de coloração


diferencial mais importante em bacteriologia é o método de Gram. Este
método explora o fato de células com propriedades diferentes
apresentarem coloração diferente. Assim, as bactérias podem se
comportar como Gram-positivas ou como Gram-negativas. Nesse
contexto, analise as afirmativas abaixo.
1) A camada de peptideoglicano é muito mais espessa nas bactérias
Gram-positivas, e essas bactérias podem possuir uma camada de ácido
teicoico.
2) Os micro-organismos Gram-negativos possuem uma camada externa
composta de lipopolissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídios.
3) Apenas os micro-organismos Gram-positivos têm uma membrana
externa contendo endotoxina (lipopolissacarídeo).
4) Os micro-organismos Gram-positivos e os Gram-negativos contêm
peptideoglicano; contudo, nos primeiros, a parede é única e fina e nos
segundos a parede é múltipla e espessa. Estão corretas, apenas:
A) 1 e 4.
B) 1 e 3.
C) 2 e 3.
D) 3 e 4.
E) 1 e 2.

21) (AOCP - Biomédico - EBSERH/HC-UFG – 2015). “As bactérias


são classificadas de acordo com sua morfologia, estrutura, atividade
metabólica e fatores ambientais necessários à sobrevivência” (ARAÚJO et
al, 2010). Em relação às bactérias, é correto afirmar que
(A) as bactérias gram-negativas possuem espessa camada que é
firmemente aderida à carioteca de sua própria célula.
(B) certos organismos gram-positivos e gramnegativos podem apresentar
também uma cápsula, ou camada de glicocálice, internamente à parede

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celular. Essa cápsula torna a bactéria vulnerável à fagocitose por
monócitos, podendo dificultar sua fixação tecidos do hospedeiro.
(C) os organismos gram-positivos são assim denominados devido às
características de coloração próprias da sua finíssima camada externa de
peptidoglicano, além disso, esses micro-organismos possuem amplo
complexo de Golgi e mitocôndrias em seu interior.
(D) as bactérias são classificadas em Gram-positivas ou Gram-negativas
em função da diferença na arquitetura da parede celular. A parede celular
Gram-positiva consiste de uma camada espessa de peptidoglicano (~30
nm), enquanto a parede celular da Gram-negativa apresenta camada
mais fina de peptidoglicano (~10nm) e sua estrutura e composição da
membrana mais complexas.
(E) bactérias como as microbactérias têm glicolipídeos múltiplos que lhes
conferem uma aparência de bolor, acarretando desvantagens biológicas,
impedindo a infecção ao hospedeiro.

22) (UFT/COPESE- Biomédico - Pref. Guaraí/TO- 2016). “A Grã-


Bretanha e a Ásia estão enfrentando um surto de escarlatina que intriga
especialistas. De acordo com a Autoridade de Saúde Pública da Inglaterra
(PHE, na sigla em inglês), em 2015, foram registrados 17.586 casos da
infecção no país – o número só não ultrapassa os registros de 1967, com
19.305 notificações. A escarlatina é uma infecção bacteriana, causada por
estreptococos do grupo A, que atinge principalmente crianças com idades
entre 5 e 12 anos.” Fonte: Adaptado de VEJA.com/Divulgação
(21/03/2016). Referente às características das bactérias, é CORRETO
afirmar que:
(A) A diferenciação entre as bactérias é realizada exclusivamente pelas
suas características morfológicas.
(B) Os aspectos microscópicos, incluindo o tamanho, forma e os arranjos
dos organismos (cocos, bastonetes, curvos ou espiralados), determinam a
capacidade das bactérias de resistir a certos antibióticos.

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(C) Coloração de Gram é um teste rápido que permite aos clínicos a
diferenciação entre as duas mais importantes classes de bactérias.
(D) As bactérias Gram negativas têm a camada de peptidoglicano espessa
contendo ácido teicoico e ácidos lipoteicoicos.

23) (FAFIPA - Serviço de Biomedicina - Pref. Londrina/PR –


2015). A coleta de materiais biológicos para exames de microbiologia
deve seguir as seguintes recomendações:
(A) Identificar o material do paciente adequadamente.
(B) Informar dificuldades que possam ocorrer durante a coleta, como
material insuficiente para análise adequada.
(C) Informar sobre o uso de antimicrobianos prévios à coleta do material
pelo paciente.
(D) No geral, os procedimentos de coleta seguem protocolos específicos
que facilitam o cultivo dos micro-organismos suspeitos, de acordo com o
sítio a ser investigado.
(E) Todas estão corretas.

24) (MAKIYAMA - Biomédico - Pref. Natal/RN – 2016). A respeito


da coloração bacteriana de Gram:
A) As bactérias que possuem a camada de lipídios associados a
polissacarídeos não são coradas pela coloração de Gram.
B) Escherichia coli e Staphylococcus aureus são bactérias Gram-
negativas.
C) Bactérias Gram negativas são aquelas que apresentam uma camada
lipídica não corada pelo corante devido à afinidade entre a pigmentação e
a camada de fosfolipídeos.
D) As bactérias Gram-positivas têm parede celular espessa e única de
peptidoglicanos, que, ao contato com a coloração de Gram, adquire cor
púrpura ou azul.

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25) (UNIPAMPA – CESPE – 2013 – FARMACÊUTICO-BIOQUÍMICO)


Com relação aos exames de diagnóstico em microbiologia, julgue os itens
que se seguem.
Considere que, na análise de determinados microrganismos, sejam
visualizadas, após coloração pelo método de gram, bactérias de
morfologia esférica, agrupadas em forma de corrente, de cor roxa ao
microscópio. Nesse caso, os microrganismos analisados são estafilococos
gram-negativos.

26) (AOCP - EBSERH/HDT-UFT- 2015). Um paciente está


apresentando sintomas de hanseníase. Para confirmar o diagnóstico, um
técnico deve realizar uma coloração específica para a bactéria causadora
da hanseníase. Qual coloração é essa?
A) De campo escuro.
B) Giemsa.
C) Ziehl-Neelsen
D) Tinta da china.
E) Hematoxilina e eosina.

27) (FAFIPA - Serviço de Biomedicina - Pref. Londrina/PR –


2015).
Sobre o método de Ziehl-Nielsen para bacterioscopia direta, pode-se
afirmar que:
(A) Esta metodologia categoriza as bactérias em álcool-ácido-resistentes
e não álcool-ácido resistentes.
(B) O corante empregado é o Albert-Layborn, capaz de penetrar no
interior do Mycobacterium tuberculosis.
(C) É sempre utilizada em associação com o método de impregnação em
prata.

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(D) Deve ser confirmado por microscopia de campo escuro ou pelo
método de tinta nanquim.
(E) Utiliza um corante que pode se tornar fluorescente na microscopia
óptica.

28) (FIOCRUZ – FGV – 2010). Assinale a alternativa que apresente a


sequência correta para se obter a coloração de Ziehl-Neelsen.
a) Adicionar fuccina, aquecer por cinco minutos até sair vapor, escorrer o
corante, adicionar álcool-clorídrico, lavar com água, corar com azul de
metileno, lavar e secar.
b) Adicionar fuccina, aquecer até sair vapor, escorrer o corante, adicionar
álcool, lavar com água, corar com azul de metileno, lavar e secar.
c) Adicionar fuccina, aquecer até sair vapor, escorrer o corante, adicionar
álcool-clorídrico deixando por um minuto, lavar com água, corar com azul
de metileno, lavar e secar.
d) Adicionar fuccina, aquecer por cinco minutos até sair vapor, escorrer o
corante, adicionar ácido clorídrico, lavar com água, corar com azul de
metileno, lavar e secar.
e) Adicionar fuccina, aquecer por cinco minutos até sair vapor, escorrer o
corante, adicionar álcool-clorídrico, lavar com água, corar com cristal
violeta, lavar e secar.

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11. Gabarito:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
D C C Errado Certo C Errado Errado A D

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
B A B Certo A E A C D E

21 22 23 24 25 26 27 28
D C E D Errado C A A

12. REFERÊNCIAS:

DAVIS, B. D. ; DULBECCO, R. Microbiologia de Davis ñ Fisiologia e


Genética Bacterianas. Vol I. 2 a ed., São Paulo: Harbra do Brasil, 1979.
421 p.

DUNLAP; MADIGAN; MARTINKO. Microbiologia de Brock . 12ª Ed. Editora:


Artmed. 2010

LUIZ B. TRABULSI e FLÁVIO ALTERTHUM. Microbiologia. 5 ed. Atheneu,


2009

MURRAY, PR. et al. Microbiologia Médica. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier,


2006. 992 p.

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TORTORA, G. J. ; FUNKE, B. R. ; CASE, C. L. Microbiologia. 8. ed. Porto
Alegre.

Manual de microbiologia clínica para o Controle de infecção em serviços


hospitalares – ANVISA, disponível em
<www.anvisa.gov.br/servicossaude/manuais/microbiologia.asp>.

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