669-6. EDU - DIAG - Ebook Finalizado-7054-1-10-20210125

Juan Carlos Ramos Gonçalves
Marianna Vieira Sobral

organizadores
Cultivo de células
da teoria à bancada
Cultivo de células
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
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CULTIVO DE CÉLULAS
João Pessoa
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2020
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Catalogação na fonte:
Biblioteca Central da Universidade Federal da Paraíba
C968 Cultivo de células: da teoria à bancada / Juan Carlos Ramos

Gonçalves, Marianna Vieira Sobral (organizadores). - João
Pessoa : Editora UFPB, 2020.
166 p. : il.
Recurso digital (5,88 MB)

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ISBN: 978-65-5942-027-8
1. Biologia celular e molecular. 2. Cultivo celular. 3. Cultura

celular. 4. Biossegurança. 5. Criopreservação. I. Gonçalves, Juan
Carlos Ramos. II. Sobral, Marianna Vieira. III. Título.
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Livro aprovado para publicação através do Edital Nº 01/2020/Editora Universitária/

UFPB - Programa de Publicação de E-books.
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AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal da Paraíba e a todos que contribuíram,

direta ou indiretamente, para a viabilização desta obra.
APRESENTAÇÃO
A evolução na área da biologia celular e molecular tem

proporcionado o desenvolvimento de técnicas e ferramentas cada
vez mais avançadas. O domínio das técnicas de cultivo de células
em laboratório assume importância crucial no avanço do nosso
conhecimento acerca das funções celulares em nível molecular,
celular e até mesmo nos eventos fisiopatológicos, alavancando o
avanço na compreensão, diagnóstico e tratamento das mais variadas
enfermidades,o que possibilita o desenvolvimento de abordagens
terapêuticas mais eficientes e menos danosas.
Diversas publicações têm sido propostas, com o objetivo de
apresentar e difundir os fundamentos do cultivo celular adquiridos nas
últimas décadas, no entanto, ainda são escassos ou pouco acessíveis,
aqueles que conseguiram aliar a teoria à prática de forma didática e
com maior direcionamento à rotina diária enfrentada no âmbito do
laboratório de cultivo de células.
Portanto, esperamos com este trabalho, disponibilizar um guia
básico e, ao mesmo tempo, atualizado sobre as principais técnicas
envolvendo o cultivo celular e as rotinas determinantes para o bom
desempenho de um laboratório de cultura de células. Dessa forma,
a obra apresentada destina-se à um amplo público, compreendido
por pesquisadores, profissionais e técnicos, além de estudantes de
graduação e pós-graduação,inseridos nas grandes áreas das ciências
da saúde, biológicas, biotecnologia e áreas correlatas.
Organizadores
As células de Henrietta agora vivem fora do corpo dela,
há muito mais tempo do que jamais viveram dentro dele”.
Rebecca Skloot
(A vida Imortal de Henrietta Lacks)
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – FUNDAMENTOS DO CULTIVO DE CÉLULAS......................... 10
Daiana Karla Frade Silva
Rawny Galdino Gouveia
Micheline Freire Donato
CAPÍTULO 2 – TIPOS DE CULTURAS CELULARES.............................20

CAPÍTULO 3 – O LABORATÓRIO DE CULTIVO CELULAR.......................33

Valgrícia Matias de Sousa
CAPÍTULO 4 – PRINCÍPIOS DE BIOSSEGURANÇA............................ 44

Ana Paula Gomes Moura Farias
CAPÍTULO 5 – MEIOS DE CULTIVO CELULAR..................................... 64

CAPÍTULO 6 – CRIOPRESERVAÇÃO.......................................................73
Thaís Mangeon Honorato Lisboa
CAPÍTULO 7 – PROPAGAÇÃO DAS CULTURAS.................................... 81

CAPÍTULO 8 – CONTAGEM DE CÉLULAS..............................................87

CAPÍTULO 9 – CONTAMINANTES DA CULTURA CELULAR......................94
Ana Luiza de Oliveira Lopes
CAPÍTULO 10 – INTRODUÇÃO À AVALIAÇÃO

DA VIABILIDADE CELULAR....................................................................105
Camyla Caroliny Neves de Andrade
CAPÍTULO 11 – ENSAIO DE CAPTAÇÃO DO VERMELHO NEUTRO.......114

CAPÍTULO 12 – ENSAIO DE REDUÇÃO DO MTT.................................123

Rafael Carlos Ferreira
CAPÍTULO 13 – ENSAIO DA SULFORODAMINA B.............................133

Sâmia Sousa Duarte
CAPÍTULO 14 – ENSAIO DO IODETO DE PROPÍDEO...........................141

Sâmia Sousa Duarte
APÊNDICE..................................................................................................150
GLOSSÁRIO...............................................................................................155
SOBRE OS ORGANIZADORES.................................................................161
SOBRE OS AUTORES...............................................................................163
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS
DO CULTIVO DE CÉLULAS
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, o cultivo celular, em especial de células
de mamíferos, constitui uma ferramenta importante utilizada nas
pesquisas biológicas e farmacêuticas para predizer o mecanismo
de ação, o metabolismo e a toxicidade de fármacos e agentes
tóxicos. Sabe-se que a célula é a unidade morfofisiológica básica
dos seres vivos, com exceção dos vírus. A célula eucariótica (com
núcleo organizado por proteínas histonas e delimitado pela membrana
nuclear, com organelas membranosas e citoesqueleto, dentre outras
particularidades) compreende o modelo básico de “sistema vivo” para
os testes de substâncias e o entendimento dos fenômenos fisiológicos
no microambiente corpóreo.
O cultivo celular é uma técnica que permite manter e estudar o
comportamento de células vivas fora do organismo. Dá-se por meio do
isolamento de células eucarióticas de um determinado tecido (animal
ou vegetal), da manutenção da viabilidade e proliferação dessas células
em um sistema in vitro constituído de nutrientes e fatores essenciais
à sobrevivência, sob condições controladas de temperatura, pH e
osmolaridade (BARBOSA et al., 2015).
Capa | Sumário | 10
Cultivo de células: da teoria à bancada
Neste capítulo, serão abordados os aspectos fundamentais do

cultivo de células em laboratório, ao descrever seu histórico, o padrão
de crescimento celular em laboratório e possíveis aplicações médicas
e biotecnológicas da cultura celular.
2 CULTIVO DE CÉLULAS: BREVE HISTÓRICO

Historicamente, os primeiros indícios de cultivo celular datam
do final do século XIX, numa tentativa de manter células vivas da
placa neural de embriões de galinha em solução salina por dias, feita
por Wilhelm Roux. Contudo, essa técnica teve o seu marco no iníciodo
século XX, com o pesquisador Ross Granville Harrison (1870-1959), um
biólogo e anatomista estadunidense que, em 1907, buscando conhecer
o funcionamento do Sistema Nervoso, conseguiu demonstrar que as
fibras nervosas eram constituídas por células nervosas, tornando-se
pioneiro no estudo de tecidos fora do corpo de um animal. Para tal, ele
utilizou embriões de anfíbios isolando pequenos fragmentos de tecido
e os cultivou em um meio fisiológico nutritivo (linfafresca de sapo),
utilizando o método de “gota suspensa”, tendo o cuidado de manter
condições assépticas, acompanhando o experimento por meio de
observações diárias em microscópio óptico. Os fragmentos de tecido
permaneceram vivos e cresceram por alguns dias, sendo este um
marco para a cultura de células, o que possibilitou Harrison provar sua
hipótese (RODRÍGUES-HERNÁNDEZ et al., 2014). O que chamou atenção
nos experimentos de Harrison foi o desenvolvimento de uma técnica
com reprodutibilidade, e, por esses resultados, muitos pesquisadores
se interessaram e passaram a utilizar esse modelo experimental.
Pouco tempo depois, Montrose Burrows, em 1910, adaptou os
ensaios celulares em anfíbios para tecidos sanguíneos de animais de
sangue quente, usando coágulo de plasma de galinha em substituição
à linfa. Dois anos depois, ele e Alexis Carrel (1873–1944), um médico e
pesquisador francês, cultivaram tecidos embrionários de cães adultos,

gatos, galinhas, ratos e cobaias, fazendo uso de plasma fresco de
cada organismo que estava sendo cultivado. Logo em seguida, Carrel
descobriu a importância da renovação constante dos nutrientes no meio
de cultivo, desenvolvendo ummodelo de cultivo de células cardíacas
de embrião de galinha, possível de ser mantido por bastante tempo
em cultura, desde que mantidas as condições de assepsia. Além disso,
elaborou subculturas por amostras de tecidos em plasma fresco
que foram mantidos em crescimento por alguns meses e, portanto,
desenvolveu a primeira linhagem celular (AMBROSE, 2019; RODRÍGUES-
HERNÁNDEZ, et al., 2014).
Mas foi no início dos anos 1940 que a cultura de células se
expandiu a partir da produção de um meio de cultura sintético para
células vegetais e animais, o que possibilitou o surgimento da primeira
linhagem celular, os fibroblastos, com adaptação ao crescimento
em meio de cultura (EARLE et al., 1943). Desse momento em diante,
em 1951, o biólogo e pesquisador americano George Otto Gey (1899–
1970) isolou células de câncer cervical da paciente Henrietta Lacks,
estabelecendo a linhagem celular HeLa, que revolucionou pesquisas,
como no desenvolvimento da vacina Salk contra poliomielite. Mais
tarde, o uso dessa linhagem celular ajudou no descobrimento dos 46
cromossomos presentes nas células humanas, no desenvolvimento
de pesquisas de fertilização in vitro, além de estudos sobre a AIDS,
tuberculose e muitas outras doenças, sendo amplamente utilizada no
mundo até hoje (SKLOOT, 2010; SHARRER, 2006).
Ainda na década de 1950, diferentes meios de cultura foram
sendo produzidos, como o “Meio 199”, criado por Morgan, Morton e Parker;
o meio essencial livre de proteínas, criado pelo grupo de Eagle (Minimum
Essential Medium Eagle ou MEM), e o “Meio de Eagle modificado por
Dulbecco” (Dulbecco’s Modified Eagle Medium ou DMEM), que adicionou
aminoácidos essenciais e não-essenciais (RODRÍGUES-HERNÁNDEZ
et al., 2014).
A partir de então, muitas descobertas foram feitas por

sucessivas décadas. Dentre estas pode-se destacar as primeiras
células híbridas de mamíferos, por Harris e Watkins (1965) utilizando
partículas virais para fazer uma mistura de células humanas com
camundongos (HARRIS et al., 1965). Em 1969, Augustin e Sato produziram
linhagens tumorais a partir de células nervosas de camundongos -
neuroblastoma, e isolaram clones eletricamente excitáveis. Já em
1973 foram introduzidas amostras de DNA em células em culturade
mamífero, por Graham e van der Eb, sendo um marco importante
para a “engenharia de células” e biotecnologia. No início da década
de 1990, surge a American Type Culture Collection (ATCC), companhia
importante para a produção e comercialização de linhagens celulares.
Também, ocorre o marco revolucionário para o cultivo de células de
mamíferos, no final do século XX, com a clonagem da ovelha Dolly,
por Wilmut, Schnieke e colaboradores (RODRÍGUES-HERNÁNDEZ et
al., 2014; WILMUT et al., 1997).
3 O CRESCIMENTO CELULAR EM LABORATÓRIO

Os avanços ocorridos durante os estudos e pesquisas com
células em cultura permitiram um maior entendimento acerca das
propriedades e características compartilhadas pela maioria dos tipos
celulares em crescimento no âmbito laboratorial.
Percebeu-se que muitos experimentos com células exigiam
que estas se encontrem em um determinado grau de expansão das
células na garrafa de cultivo, denominado de confluência celular. Nesse
contexto, diferentes fatores podem interferir no crescimento celular,
incluindo a morfologia, a expressão proteica, a adaptação à cultura
e às condições do ambiente, além da disponibilidade de nutrientes e
substratos para o processo de proliferação (VILELA et al., 2003).
As células em cultura possuem um padrão de crescimento

representado por uma curva sigmoidal (Figura 1), denominada curva
de crescimento (PERES; CURI, 2005). É essencial o conhecimento das
características de crescimento da linhagem celular em manipulação,
pois uma alteração no crescimento da linhagem celular poderá
indicar um problema significativo e afetar os resultados dos
experimentos realizados.
Figura 1 – Curva de crescimento padrão de células em cultura
Fonte: Acervo particular do autor.
Legenda: Na fase Lag as células apresentam um período de adaptação à cultura;

na fase Log as células se encontram em um estado de proliferação exponencial;
na fase estacionária ou Plateau há uma diminuição no crescimento celular; e na
fase de declínio ou morte celular, há predominância de células mortas.
A curva de crescimento de células em cultura é dividida nas

fases de crescimento descritas a seguir.
3.1 Fase Lag

As células apresentam um período de adaptação, no qual a
célula demora a se recuperar, juntamente com o tempo de aderência
na garrafa de cultivo (para as células aderentes) e de disseminação

celular (CREE, 2011). A duração dessa fase pode variar de acordo com
a linhagem celular.Nessa fase, há produção de proteínas estruturais e
enzimas, com aumento na síntese de DNA, além de intensa atividade
metabólica (PERES; CURI, 2005).
3.2 Fase Log

Também conhecida como fase logarítmica ou exponencial,
a fase log é o momento em que o número de células começa a
aumentar exponencialmente, e se caracteriza por um processo no
qual a proliferação celular é máxima e constante. A população celular
nessa fase é considerada a mais viável, a porcentagem de células que
podem estar ativas no ciclo celular é entre 90-100%, o que a torna a
fase ideal para estudos experimentais (ALVES et al., 2010).
3.3 Fase estacionária ou Plateau

A fase estacionária ou plateaué o período no qual a cultura
se torna mais densa e diminui ou interrompe a sua velocidade de
crescimento. Nessa fase, o número de morte celular pode se tornar
proporcional ao número de células novas, a atividade metabólica
decresce e as células se tornam mais susceptíveis a danos
(FRESHNEY, 2011).
3.4 Fase de declínio ou fase de morte celular

A fase de declínio ou morte celular é caracterizada pela redução
do número de células viáveis e predominância do número de células
mortas. A morte das células nessa fase não se dá devido à redução
de nutrientes, mas em consequência da progressão natural do ciclo
celular (MERCK, 2018).
4 APLICAÇÕES MÉDICAS E BIOTECNOLÓGICAS

DA CULTURA CELULAR
Com o advento das técnicas modernas de biologia celular e
molecular, o cultivo de células de animais nos ensaios in vitro tornou-se
progressivamente uma ferramenta essencial para o avanço da ciência
e trouxe a solução de muitos problemas na área da saúde e medicina.
Ainda, vários avanços ocorreram nesses estudos, não se limitando ao
entendimento de determinada célula ou tecido, mas sim em diferentes
aplicações na área médica, como na pesquisa e desenvolvimento de
novos fármacos, de vacinas, da terapia gênica, dos transplantes, entre
outros, contribuindo com a busca do conhecimento e tratamento de
diferentes doenças.
É compreensível que, como qualquer outro modelo, existam
desvantagens na utilização de experimentos com cultura de células,
uma vez que a proliferação das células in vitro ocorre de maneira
diferente de in vivo, já que o meio é sintético, modificado e favorece o
crescimento e espalhamento das células, não ocorrendo crescimento
tridimensional como no interior de um organismo, culminando também
na redução da adesão célula-célula e célula-matriz. No entanto, grande
parte dessas desvantagens foram minimizadas com o advento da
cultura de células em 3D, como será discutido no Capítulo seguinte.
Apesar de tudo, os experimentos in vitro continuam sendo
bastante realizados em pesquisas no mundo inteiro, tendo em vista
que apresentam muitas vantagens em seu uso, pois são mais fáceis de
controlar, apresentam amostras homogêneas, são mais econômicos
do que os modelos in vivo e compreendem o principal modelo utilizado
como alternativa para substituir ou diminuir a utilização de animais
em diferentes pesquisas (ARANGO et al., 2013).
A partir da padronização das culturas de células, houve
uma revolução tecnológica que compreende o desenvolvimento de
meios de cultura específicos, a manipulação genética de linhagens
celulares, o desenvolvimento de incubadoras cada vez mais sofisticadas

que proporcionam a atmosfera desejada, o design de vacinas, o
desenvolvimento de novas superfícies de adesão, andaimes 3D, e
robotização (FRESHNEY, 2011).
Com o avanço da Biologia Molecular, das técnicas em
Bioquímica de proteoma e peptidoma, e da Biologia Celular tornou-se
possível a introdução de novas técnicas para produção de diferentes
linhagens. Além disso, atualmente é sintetizada uma série de produtos
bioterapêutico sem larga escala, que são produzidos para uso comercial
ou tecnologia aplicada e estudos clínicos ou de pesquisa.
Na pesquisa básica, podem ser citados estudos que envolvem
atividades intracelulares de transcrição de DNA, síntese proteica
marcada com isótopos radioligantes ou fluorescência, metabolismo,
ensaios de proliferação, senescência, ciclo celular; estudos com RNA;
transporte de proteínas, etc. Dessa forma a cultura de células vem
cada vez mais permear as áreas de genômica e proteômica.
A cultura de células também tem sido indispensável no estudo
da virologia, uma vez que os vírus sobrevivem no interior das células,
e o uso de células de mamíferos torna-se então uma ferramenta
importante para a produção de vacinas - a exemplo da recente corrida
mundial para a descoberta de uma vacina para a Covid-19, e para a
produção de fármacos em biorreatores, tais como interferon, insulina,
hormônio do crescimento, etc.
Na Farmacologia e Toxicologia, vários estudos são descritos
na literatura testando o efeito de diferentes drogas, as interações
fármaco-receptor, mutagênese, carcinogênese, dentre outros. Na
descoberta de drogas para o tratamento do câncer, em especial nas
culturas 3D, com ensaios de ancoragem, agregação de células, etc. E
na engenharia de tecidos, onde encontra uma área em destaque para
a produção de organoides com o objetivo de transplantes, regeneração
de tecido e desenvolvimento de matriz extracelular (YAO; ASAYAMA,
2017; RODRÍGUES-HERNÁNDEZ et al., 2014).
REFERÊNCIAS
ALVES, E. A.; GUIMARÃES, A. C. R. Cultivo celular. In: MOLINARO, E. M.;
CAPUTO, L. F. G.; AMENDOEIRA, M. R. R. (Org.). Conceitos e métodos
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Janeiro: EPSJV, 2010. p. 215-253.
AMBROSE, C. T. An amended history ofb tissue culture: Concerning
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27, n. 2, p. 95-102, 2019.
ARANGO, M. T.; QUINTERO-RONDEROS, P.; CASTIBLANCO, J.; et
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Y.; ROJAS-VILLARRAGA, A.; et al. Autoimmunity: From Bench to
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Chapter 45, 2013.
BARBOSA, B. S.; SANTOS, F. A.; PIMENTEL, M. M. L.; FERNANDES, D.
P.; PREXEDES, E. A.; BEZERRA, M. B. Histórico do desenvolvimento
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CREE, I. A. Principles of Cancer Cell Culture. In: Methods in
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EARLE, W. R.; SCHILING, E. L.; STARCK, T. H.; STRAUS, N. P.; BROWN,
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FRESHNEY, R. I. Cult. Anim. Cells. Wiley Online Books. Hoboken, NJ,
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HARRIS, H.; WATKINS, J. F.; CAMPBELL, G. L. M.; EVANS, E. P.; FORD,
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MERCK. Fundamental Techniques in Cell Culture, ECACC
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<https://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-
center/ecacc-handbook.html>
PERES, C. M.; CURI, R.; PAFFARO, A. M. D. A.; MARTINS, A. K. A.;
PIMENTA, A.; GONÇALVES, C. R; MARTINS, E. F. Como cultivar
células, Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2005.
RODRÍGUES-HERNÁNDEZ, C. O.; TORRES-GARCA, S. E.; OLVERA-
SANDOVAL, C.; RAMÍREZ-CASTILLO, F. Y.; MURO, A. L.; AVELAR-
GONZALEZ, F. J.; GUERRERO-BARRERA, A. L. Cellculture: History,
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SHARRER, T. “He-La” Herself celebrating the woman who gave the
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SKLOOT, R. The Immortal Life of Henrietta Lacks. Edição: 1. Crown
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VILELA, M. J.; MARTINS, M. L.; MENDES, R. L; SANTOS, A. A.
Determinação de padrões de crescimento de células em cultura.
Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. Rio de
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WILMUT, I.; SCHNIEKE, A. E.; MCWHIR, J.; KIND, A. J.; CAMPBELL, K.
H. S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.
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YAO, T.; ASAYAMA, Y. Animal-cell culture media: History,
characteristics, and current issues. Reprod. Med. Biol.,
v. 16, p. 99-117, 2017.
CAPÍTULO 2
TIPOS DE CULTURAS CELULARES

1 INTRODUÇÃO
As células crescem em um ambiente artificial que contém um
substrato ou meio que fornece os nutrientes essenciais (aminoácidos,
carboidratos, vitaminas, minerais), fatores de crescimento, hormônios,
gases (CO2 e O2), e sob condições físico-químicas reguladas como pH,
pressão osmótica e temperatura. A maioria das células é dependente
de ancoragem e deve ser cultivada aderida a um substrato sólido ou
semissólido (cultura aderente ou em monocamada), enquanto outros
tipos celulares podem ser cultivadosde forma suspensaou flutuando
em meio de cultura (cultura em suspensão).
Por essas particularidades, é preciso conhecer os diferentes
tipos de culturas celulares para entender como devem ser mantidas,
bem como suas vantagens e desvantagens. No geral, o cultivo celular
refere-se à remoção de células de um tecido antes de seu crescimento,
para que haja um resultado favorável ao seu desenvolvimento no
ambiente artificial. Podem ser removidas diretamente do tecido e
desagregadas por enzimas e de modo mecânico, desprendendo uma
célula das outras (cultura primária), ou ainda, podem ser derivadas de
uma linhagem celular.
Neste capítulo, serão abordados os principais tipos de culturas
de células, como cultura primária, células em linhagem contínua além
das células transformadas. Ainda, serão apresentados termos clássicos,

como a cultura de células aderentes e em suspensão, bem como serão
discutidos métodos modernos como a cultura de células em 3D.
2 CULTURA PRIMÁRIA
A cultura primária é obtida a partir da fragmentação ou
dissociação mecânica e/ou enzimática de tecidos.Desse modo, as
células que sobrevivem ao processo de isolamento irão apresentar
características genotípicas e fenotípicas do seu tecido de origem,
inicialmente heterogêneas, sendo uma vantagem para investigação
de um evento fisiológico ou patológico que, em alguns casos, ocorre
especificamente naquele órgão ou tecido de origem. Todavia, estas
células apresentam crescimento finito, uma vez que não são resistentes
a grandes períodos de tempo em cultura, sendo chamadas de células
primárias (FRESHNEY, 2010). Como exemplo, a cultura primária de
células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), que é muito
utilizada para investigar eventos de citotoxicidade.
Outro modelo interessante de cultura primária são as culturas
de células do sistema nervoso periférico, por exemplo, a cultura de
neurônios do gânglio da raiz dorsal – DRG de roedores, para investigação
de eventos envolvidos na nocicepção ou testes com substâncias
analgésicas e anestésicas (GONÇALVES et al., 2013). Para avaliação do
sistema nervoso central (SNC) pode-se citar como exemplo a cultura
primária de neurônios piramidais de hipocampo de roedores, no intuito
de avaliar eventos de neurotoxicidade e excitotoxicidade promovida por
neurotransmissores excitatórios, tais como o L-glutamato (DONATO,
2014). Como exemplo de cultura primária de células de tecido periférico
pode-se citar a cultura primária de hepatócitos de rato, bastante
utilizada em experimentos envolvendo a avaliação da toxicidade,
funções bioquímicas e metabolismo de drogas.
Além destes, vários tipos de cultura primária provenientes de

tecidos epiteliais, musculares, tumores, entre outros, estão descritos
na literatura, cabendo ao experimentador avaliar a mais adequada à
sua proposta de investigação e condições laboratoriais.
3 LINHAGENS CELULARES
As células somáticas saudáveis de mamíferos muito raramente
adquirem capacidade ilimitada de proliferação durante o cultivo.
Como característica, após certo número de divisões celulares, elas
param de crescer. Logo, pesquisadores, em busca de conduzirem suas
pesquisas utilizando as amostras de células de animais em sucessivos
experimentos, desenvolveram as linhagens celulares (YAO; ASAYAMA,
2017). Nesse contexto, várias linhagens de diferentes tipos celulares
foram isoladas e estabelecidas por pesquisadores em todo o mundo
(ARANGO et al., 2013). A seguir, o Quadro 1 apresenta algumas das
principais linhagens utilizadas em ensaios biológicos.
Quadro 1 – Exemplos de linhagens celulares e suas características

Linhagem
Organismo Tecido de origem Doença Propriedade
Celular
CHO Cricetulusgriseus ovário de hamster normal aderente
L929 Mus musculus fibroblasto normal aderente
leucemia murinade
RAW 264.7 Mus musculus tumor induzido aderente
Abelson
Neuro-2a Mus musculus cérebro neuroblastoma aderente
A7r5 Rattusnorvegicus aorta torácica normal aderente
VERO Cercopithecusaethiops rins normal aderente
HEK-293 Homo sapiens rim embrionário normal aderente
MRC5 Homo sapiens pulmão normal aderente

HeLa Homo sapiens cérvice adenocarcinoma aderente
carcinoma
Hep G2 Homo sapiens fígado aderente
hepatocelular
SK-MEL Homo sapiens pele melanoma aderente
MCF-7 Homo sapiens glândula mamária carcinoma ductal aderente
SH-SY5Y Homo sapiens medula óssea neuroblstoma aderente/suspensão
U-87 MG Homo sapiens cérebro glioblastoma aderente
leucemia mieloide
K562 Homo sapiens medula óssea suspensão
crônica
leucemia promielocítica
HL-60 Homo sapiens sangue periférico suspensão
aguda
O processo de morte celular controlada (apoptose) ocorre

normalmente em nossos tecidos, permitindo a constante renovação
das células no organismo. Por conta disso, as células primárias não
sobrevivem muito tempo em cultura, além de morrerem por não se
adaptarem ao meio ou por conta dos traumas e do estresse oriundos
do processo de isolamento. Entretanto, algumas células irão conseguir
sobreviver e proliferar mais rapidamente porque se adaptaram bem
ao meio de cultivo, se tornando predominantes no meio após algumas
passagens. Estas células irão formar linhagens celulares que, diferente
da cultura primária, podem ser mantidas por longos períodos de tempo
(FRESHNEY, 2010).
A linhagem celular contínua ou “imortalizada” exibe algumas
características do seu tecido de origem, porém, possui alta capacidade
proliferativa e podem se dividir por um grande número de vezes sem
perder as suas características (células homogêneas), sendo possível
a formação de bancos de células a partir da sua criopreservação
(VERTREES, 2009). Por conta disso, essas células são muito utilizadas
em pesquisas, como na produção de fármacos e vacinas. Como principal
exemplo pode-se citar a linhagem HeLa, proveniente de adenocarcinoma
cervical humano, que é considerada a primeira linhagem imortalizadada
história e ainda hoje comumente utilizada em experimentos de avaliação
de atividade antitumoral (Quadro 1).
As células transformadas são aquelas com características
tumorais, que apresentam modificações que as tornam genética
e morfologicamente diferentes do tecido original, principalmente
por conta de alterações em genes que controlam a divisão celular,
provocando a proliferação descontrolada. A transformação da célula
pode ocorrer por diferentes fatores, podendo ser induzida por vírus,
substâncias químicas ou agentes físicos. Um exemplo clássico desse
tipo de linhagem é a HEK293 (Quadro 1), que foi originalmente gerada
pela transformação de células normais do rim embrionário humano
(HEK) por fragmentos de DNA de adenovírus humano tipo 5 (Ad5). Esta
linhagem é bastante utilizada em experimentos envolvendo a expressão

de proteínas recombinantes (FRESHNEY, 2010).
Atualmente, as linhagens celulares imortalizadas e
transformadas comumente são utilizadas como uma alternativa
interessante para compreender os processos farmacodinâmicos, como
especificidade de drogas aos receptores e sinalização celular, além
de serem úteis em ensaios de citotoxicidade utilizando compostos
naturais bioativos e derivados, medicamentos, compostos sintéticos
e nano compostos. Como exemplo, pode-se citar o uso das linhagens
SH-SY5Y e SK-MEL-28 (Quadro 1).
A linhagem SH-SY5Y, frequentemente utilizada durante ensaios
de toxicidade in vitro de compostos que atuam no SNC (ARBO et al.,
2016), foi isolada a partir da biópsia de um paciente na década de 70
e, desde 1980, vem sendo utilizada como modelo de célula neuronal
(BIEDLER et al., 1973; JOSHI et al., 2006) por apresentar propriedades
bioquímicas e funcionais de células neuronais (XIE; HU; LI, 2010),e por
expressarem receptores de membrana celular do tipo colinérgico
muscarínico, subtipos M1 e M2 (ADEM et al., 1987), além de receptores
dopaminérgicos (XIE; HU; LI, 2010).
Por sua vez, a SK-MEL-28 é uma linhagem celular derivada
de melanoma, inicialmente obtida a partir de um linfonodo axilar de
um homem de 51 anos (CAREY et al., 1976; SANTOS et al., 2020). Em
particular, a SK-MEL-28 é uma linhagem estabelecida e amplamente
utilizada na avaliação in vitro de drogas com atividade antimelanoma.
Essa linhagem expressa o gene mutante B-Raf (V600E) e o tipo selvagem
N-Ras, ambos capazes de formar tumores em camundongos nude
(XING et al., 2012).
4 CÉLULAS ADERENTES E EM SUSPENSÃO

Normalmente as linhagens celulares possuem, ao menos
inicialmente, características similares aos seus tecidos de origem.
Desse modo, as linhagens provenientes de tecidos sólidos, como
células epiteliais, crescem em monocamadas de células aderentes
na superfície do local de cultivo, pois dependem de ancoragem para
se proliferarem (Figura 1). Por outro lado, as células em suspensão
não necessitam de interação, sendo cultivadas em suspensão
no meio (Figura 2), uma vez que são, muitas vezes, derivadas de
células hematopoiéticas (FRESHNEY, 2010; FUNDAÇÃO OSWALDO
CRUZ, 2010).
Figura 1 – Exemplo de linhagem celular aderente. Linhagem SK-MEL-28 derivada

de melanoma humano, observada por microscopia óptica (400x)
Fonte: Acervo particular do autor
Figura 2 – Exemplo de linhagem celular não aderente. Linhagem K562 derivada de

leucemia mieloide humana, observada por microscopia óptica (400x)
Devido às diferenças entre estes tipos celulares, as garrafas de

cultura devem ser, preferencialmente, diferenciadas para as células
aderentes, pois possuem uma superfície capaz de atrair as células,
com carga negativa para permitir a ancoragem, sendo esta carga
importante para a produção de proteínas de adesão celular (FUNDAÇÃO
OSWALDO CRUZ, 2010).
5 CULTIVO CELULAR TRIDIMENSIONAL (3D)

A cultura de células convencional envolve o crescimento das
células em superfícies planas e sólidas formando monocamadas em
formato bidimensional (2D). As células ficam aderidas a substratos
plásticos ou de vidro, e seus contatos com outras células só ocorrem
nas laterais (perifericamente). Ocorre também que os gradientes de
oxigênio e nutrientes não estão distribuídos fisiologicamente de forma
uniforme, uma vez que um dos lados se encontra aderido à superfície

do substrato. Isso impede também que as células se amontoem umas
sobre as outras, o que as obrigam a assumirem uma morfologia em
monocamadas, o que não é natural para boa parte das células. De fato,
o cultivo de células em superfícies planas de plástico não mimetiza o
modelo in vivo com fidedignidade.
Alguns estudos já mostraram haver falhas na comprovação da
eficácia e toxicidade de fármacos que se apresentaram promissores
quando testados em cultura 2D, mas falharam quando testados
posteriormente in vivo. Logo, uma alternativa prática foi criar uma
terceira dimensão para a cultura de células, sendo esse o princípio da
cultura 3D (ANTONI et al., 2015).
Os organismos vivos apresentam um arranjo tridimensional
de células com complexas interações célula-célula e um transporte
dinâmico de nutrientes. No ambiente in vivo, as células são mantidas
num ambiente quimiotático e com constante suplementação de
nutrientes frescos e oxigênio, além de haver constante remoção
de metabólitos e resíduos tóxicos via sistema circulatório. Por isso,
é importante que o ambiente da célula em cultura considere essa
organização espacial (ABBOT, 2003).
As culturas tridimensionais (3D) são modelos in vitro em que
células imortalizadas, células tronco ou explantes são inseridos em
uma matriz de hidrogel que mimetiza o ambiente in vivo(ANTONI
et al., 2015). Diversas vantagens e limitações nesse tipo de cultura
foram demonstradas em alguns estudos biológicos e foram
resumidas no Quadro 2. Dentre as principais vantagens sobre a
cultura 2D, pode-sedestacar a preservação das características in
vivo e funções gerais da célula tais como: morfologia, proliferação,
diferenciação, migração, expressão gênica, síntese proteica, etc.
Como desvantagens, pode-se citar problemas de natureza técnica,
reprodutibilidade e dificuldade de controle das condições de
temperatura e pH no ambiente da cultura (Quadro 2).
Quadro 2: Cultura de células 3D: vantagens e limitações
Características Propriedades
Vantagens Monitoramento do número de células; Viabilidade;

Morfologia; Proliferação; Diferenciação; Resposta a
estímulos; Comunicação célula a célula; Migração
de células tumorais para os tecidos circundantes;
Invasão de células tumorais nos tecidos
circundantes; Polarização celular; Estimulação
por angiogênese; Evasão do sistema imunológico;
Metabolismo de drogas; Expressão genética;
Síntese proteica; Função geral da célula; Relevância
do genótipo fisiológico; Relevância fisiológica do
fenótipo; Relevância in vivo.
Limitações
Reprodutibilidade entre camadas biomiméticas;
Extração de todas as células para análise com
aumento de tamanho e tortuosidade; Criação de
matrizes 3D; Capacidade para aumentar ou diminuir
um único formato 3D; Manuseio do processamento
pós-cultura; Imagem dependendo do tamanho da
camada, transparência do material e profundidade
no microscópio; Desempenho, sensibilidade e
compatibilidade com alto rendimento; Instrumentos
de triagem; Otimização para cultura de células
3D dos ensaios utilizados para determinar a
resposta à interação medicamentosa (viabilidade
celular dependente da dose, célula-célula/célula-
matriz interação, migração celular); Controle das
condições de cultura (temperatura e pH).
Fonte: Adaptado de Antoniet al. (2015)
Vários modelos de cultura em 3D podem ser citados, tais como

o estudo de todas as células de animais e organotipos de tecidos
explantados, células esferoides, cultura de microcarregadores e
modelos de engenharia de tecido (PAMPALONI et al., 2007). Apesar
dos avanços constantes na última década, a cultura de células em
3D ainda necessita passar por aprimoramentos e acessibilidade até
que possa ser estabelecida nos laboratórios de cultivo celular do
mundo inteiro.
REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 3
O LABORATÓRIO
DE CULTIVO CELULAR
1 INTRODUÇÃO
Um laboratório de cultivo de células e tecidos pode ser distinguido
facilmente dos demais, principalmente devido a sua necessidade
constante de manter um ambiente de assepsia suficiente para que não
ocorram contaminações da cultura por microrganismos e, ao mesmo
tempo, proteger ao máximo o manipulador de riscos biológicos.
A introdução de sistemas como cabines de fluxo laminar
simplificou bastante o problema corrente da assepsia durante a
prática envolvendo o cultivo de células. No entanto, vários outros
equipamentos e requisitos mínimos exigidos de boas práticas devem
ser adotados para o perfeito funcionamento de um laboratório
de cultivo celular (QUISEN; ANGELO, 2008). De fato, podem ser
considerados seis esquemas básicos, a saber: manuseio estéril,
incubação, preparação, lavagem, esterilização e armazenamento.
Para tanto, devem ser tomadas providências para preparação e
esterilização, manuseio asséptico e outras atividades na área de
cultura, incluindo centrifugação, contagem de células, microscopia,
incubação e armazenamento em temperatura ambiente, 4 °C, -20
°C e -196 °C (FRESHNEY, 2010).
Neste capítulo serão delineados a infraestrutura mínima de um
laboratório de cultivo de células, a apresentação dos equipamentos
essenciais, e, finalmente, será fornecido um guia básico de boas práticas

da manipulação de células e tecidos.
2 INFRAESTRUTURA LABORATORIAL
A infraestrutura laboratorial compreende um ambiente limpo e
asséptico, extremamente isolado do ambiente externo, com salas sem
janelas ou com janelas duplas, para evitar o risco de contaminações.
O laboratório deverá possuir instalações adequadas e equipamentos
essenciais para o trabalho e manutenção da cultura celular in vitro
(QUISEN; ANGELO, 2008).
Para garantir a limpeza e assepsia do ambiente laboratorial,
deve-se reduzir o número de pessoas em circulação, evitando-se a
contaminação no laboratório, e, em relação a estrutura, alguns critérios
devem ser estabelecidos:
• As paredes e pisos devem ser projetados para facilitar a limpeza;
• As salas não devem conter janelas, pois facilita a entrada da luz,

poeira, animais, levando ao risco de contaminação;
• As paredes devem ser brancas, para refletir a luz e a iluminação

ao ambiente;
• O controle da temperatura é essencial para manutenção do

ambiente favorável ao trabalho.
Em relação a infraestrutura e divisão do ambiente ou áreas

laboratoriais, deve-se conter:
a. Área externa ou antessala: designada ao armazenamento de

pertences dos usuários, como calçados, bolsas, dentre outros;
b. Área de lavagem e esterilização: ambiente destinado ao

descarte de meio de cultura e demais resíduos, e também à
lavagem e autoclavagem de vidrarias e utensílios utilizados
nos experimentos. Esse ambiente deve possuir equipamentos
essenciais, como autoclave, lavador de pipetas, destilador,
geladeira. Além disso, deve conter pias grandes, bancadas,
armários para armazenamento de materiais e vidrarias e estufas
de secagem;
c. Área de preparação de soluções e meio de cultura: esse ambiente

deve ser comum ao fluxo de pessoas e conter bancadas, armários,
pia, geladeiras e freezers. Além de equipamentos como: pHmetro,
agitador magnético, balanças de precisão e analítica, essenciais
para o preparo de meios e soluções;
d. Área para manipulação asséptica: local exclusivamente

destinado à manutenção das culturas celulares e experimentos.
Esse ambiente possui uma cabine de fluxo laminar, onde são
manipuladas as culturas.O local deve ser mantido com controle
de temperatura e umidade, sempre fechado e com circulação
restrita ao pessoal do laboratório, para garantir um ambiente
asséptico e seguro;
e. Almoxarifado: ambiente repleto de prateleiras ou estantes,

direcionado ao armazenamento de reagentes químicos e materiais
utilizados na rotina laboratorial. Além disso, deve-se respeitar
as normas de segurança inerentes aos produtos químicos
armazenados, mantendo o controle de temperatura e umidade
(QUISEN; ANGELO, 2008).
A Figura 1 apresenta, de forma ilustrativa, a infraestrutura

básica de um laboratório de cultura de células de pequeno-médio
porte, delimitando as áreas principais e organização dos equipamentos.
Figura 1 – Estrutura básica de um laboratório de cultivo de células

de médio porte
Fonte: Adaptado de Freshney (2010)
3 EQUIPAMENTOS ESSENCIAIS
A necessidade de um equipamento a ser utilizado em um
laboratório de cultivo celular específico é frequentemente subjetiva,
podendo variar de acordo com o tipo de trabalho pretendido,a economia
de tempo ou eficiência técnica, além da qualidade dos dados, capacidade
analítica, requisitos de amostra, o orçamento disponível e o custo-
benefício potencial, entre outros fatores (FRESHNEY, 2010; MERCK, 2018).
No entanto, alguns equipamentos em particular se fazem
essenciais para a realização de procedimentos envolvendo o cultivo
de células e na manutenção do ambiente asséptico em um laboratório,
dentre estes, pode-se citar:
3.1 Cabines de fluxo laminar e segurança biológica

As cabines de fluxo laminar e segurança biológica foram
desenvolvidas com o objetivo de proporcionar um ambiente estéril
no laboratório, que permita a manipulação de forma segura de
materiais biológicos e/ou estéreis, e ainda fornecer proteção
adequada ao manipulador contra riscos associados ao material
utilizado (MERCK, 2018).
Apesar de serem bastante semelhantes, tanto na aparência
quanto na função básica, as cabines (ou capelas) de fluxo laminar e
as cabines de segurança biológica possuem diferenças notáveis entre
si, cabendo ao manipulador avaliar qual o tipo mais adequado para a
suas necessidades.
As cabines de fluxo laminar promovem a recirculação de 100%
do ar, criando áreas de trabalho estéreis para o manuseio de materiais
biológicos que não podem sofrer contaminação do meio externo,
garantindo a proteção das amostras manipuladas. Estes equipamentos
são subdivididos em duas categorias: a) Fluxo laminar horizontal, que
realiza 100% da renovação do ar, direcionado de forma horizontal, e
oferece proteção apenas para os materiais a serem manipulados; b)

Fluxo laminar vertical que também produz 100% da recirculação do ar,
direcionado verticalmente (de cima para baixo) oferecendo proteção
tanto para o operador quanto para o ambiente contra possíveis agentes
contaminantes de risco.
Já as cabines de segurança biológica são utilizadas para
promover a proteção tanto dos usuários quanto das amostras
manipuladas e do meio externo, de forma a renovar 100% do ar. Isso é
possível devido a sua operação em pressão negativa, evitando a saída do
ar contaminado para o ambiente, diferentemente dos fluxos laminares.
É recomendada para a manipulação de substâncias e materiais de baixo
e moderado risco biológico, não comportando o manuseio de produtos
tóxicos ou voláteis. As cabines de segurança biológica podem ser
subdivididas em três categorias: a) Classe II A1 promove a recirculação
de 70% do ar e renovação de 30%, despejando-os já filtrados para o
interior do laboratório; b) Classe II A2 produz a recirculação de 70% do
ar e a renovação de 30%, no entanto, despejando o ar filtrado para a
área externa do ambiente laboratorial; c) Classe II B2 promove 100% da
renovação do ar, que por sua vez é conduzido para fora do laboratório
por meio de um sistema de dutos semelhante ao tipo anterior.
3.2 INCUBADORA DE CO2

Embora as culturas possam ser incubadas e mantidas em cultura
de forma mais simples e de menor custo, as incubadoras de CO2 são de
fato a alternativa mais comumente adotada em laboratórios. Apesar de
mais caras, sua facilidade de uso e controle da temperatura e tensão
de CO2 justificam os gastos. Uma atmosfera controlada, geralmente
de 5% CO2 a 37°C para a maioria das culturas, é alcançada usando-se
uma bandeja de umidificação e controlando a tensão gasosa com um
dispositivo de monitoramento de CO2, que extrai o ar da incubadora para
uma câmara específica, determina a concentração e injeta CO2 puro

na incubadora para compensar qualquer deficiência. O ar é circulado
pela incubadora por convecção natural ou usando um ventilador para
manter o nível de CO2 e a temperatura uniformes.
3.3 Centrífuga
Periodicamente, as suspensões celulares requerem
centrifugação, seja para aumentar a concentração das células ou
para lavar um reagente, trocar meio, etc. Uma pequena centrífuga de
bancada, de preferência com frenagem controlada proporcionalmente,
é suficiente para a maioria dos propósitos. Apesar de não ser
necessária, a refrigeração pode ser uma boa alternativa para evitar o
superaquecimento das amostras de células durante as centrifugações.
A unidade de rotação pode ser programada em RPM (rotações por
minuto) ou RCF (força centrífuga relativa), também representada por
força g, sendo esta última mais adequada por não depender do tamanho
e inclinação do rotor. Por exemplo, a maioria das células em cultura
sedimentam satisfatoriamente quando centrifugadas a uma velocidade
de 80 a 100 x g (FRESHNEY, 2010).
3.4 Micr
Um simples microscópio invertido é essencial no ambiente de
cultivo celular, para permitir a observação das culturas regularmente,
detectar alterações morfológicas e a possibilidade de contaminação
microbiológica. Um microscópio com bom contraste de fase de longa
distância de trabalho, obtido pelo conjunto condensador e objetiva,
também é crucial para compensar a espessura dos frascos de e
microplacas de plástico.
3.5 Outros equipamentos

Além dos equipamentos descritos, vários outros também são
considerados essenciais ou de grande importância em um laboratório
de cultura celular, tais como hemocitômetro (Câmara de Neubauer) ou
contador automatizado de células, geladeira, freezer -20°C, cilindro de
CO2, botijão de N2 (para o estoque de linhagens), purificador de água,
balança analítica, pHmetro, autoclave, estufa de secagem, filtros de
esterilização, pipetas e pipetadores, vidrarias, materiais descartáveis
como tubos e garrafas de cultivo, etc. Os principais equipamentos
essenciais e suas respectivas funções encontram-se resumidos no
Quadro 1.
Quadro 1 – Equipamentos essenciais em cultura de células

Item Finalidade
Cabine de Fluxo laminar Manutenção do ambiente asséptico
Visualização e avaliação das células em
Microscópio invertido
cultura
Hemocitômetro Contagem de células
Geladeira Armazenamento local de meios e reagentes
Armazenamento a -20 °C de soluções
Freezer
instáveis, soro e reagentes
Centrífuga de bancada Centrifugação de células em cultura
Manutenção das células em ambiente
Incubadora de CO2 úmida
controlado
Cilindro de CO2 Suprimento de CO2 para a incubadora
Botijão de N2 Criopreservação das linhagens celulares

Purificador de água Suprimento de água pura
Balança Pesagem de substâncias químicas
pHmetro Medir o pH em meios preparados e reagentes
Estufa de secagem Secagem de vidro e plástico
Autoclave Esterilização de líquidos e soluções estáveis
Pia Lavagem do material utilizado
Filtros de esterilização Esterilização de soluções termolábeis
Fonte: Adaptado de Freshney (2010)
4 BOAS PRÁTICAS EM LABORATÓRIO DE CULTIVO

CELULAR
O ambiente de culturas celulares requer uma sequência de
normas e cuidados para reduzir ou evitar os riscos de contaminação
para o manipulador e para a amostra, evitando o desperdício de tempo,
reagentes, material biológico e oneração de custo.
Os vetores de maior contaminação da cultura envolvem o
manipulador e o ambiente de trabalho, responsáveis por introduzir
contaminantes, como fungos, bactérias, entre outros. Tais
microrganismos podem contaminar uma cultura isoladamente, ou
disseminar-se, infectando de forma abrangente a sala de cultura e
diversos experimentos em análise.
Neste contexto, com o intuito de minimizar os riscos de
contaminação, algumas medidas de boas práticas de manipulação
devem ser introduzidas:
• Higienização das mãos do manipulador com água e sabão

antisséptico, ou aplicação de álcool em gel ou líquido a 70%;
• Paramentação adequada do manipulador, com o uso de
equipamentos de proteção individual (EPIs), tais como, touca,
máscara, jaleco descartável, propés e luvas. Caso se faça a opção
de uso de um jaleco de tecido para a cultura de células, este
deverá permanecer exclusivamente no ambiente, sem uso externo;
• Realizar a limpeza do ambiente de trabalho, como bancadas,

microscópios e cabine de fluxo com papel embebido em álcool 70%;
• Limpar o material necessário para experimento com álcool 70%,
antes de levar ao fluxo;
• Ligar a luz ultravioleta (UV) do fluxo por 15-20 min;
• Higienizar as mãos com álcool 70% para retirar as garrafas da
estufa de cultivo celular (estufa de CO2), para observação das
culturas sob microscópio óptico, antes da manipulação, a fim
de observar a presença de possíveis contaminantes (bactéria
e/ou fungos) na cultura;
• Ao final do experimento, higienizar todas garrafas com álcool
70% antes de devolvê-las à estufa;
• Realizar a antissepsia das bancadas, microscópios e cabine de
fluxo laminar com papel embebido de álcool 70% para garantir
um ambiente asséptico na sala de cultura.
O ambiente da sala de cultura deve ser limpo uma ou duas

vezes por semana com pano embebido com solução desinfetante
bactericida e antifúngica ou lisofórmio, realizando a limpeza
adequada e desinfecção do ambiente e superfícies que possivelmente
estão contaminadas com material biológico ou microrganismos
potencialmente infectantes.
Os equipamentos devem ser lavados com água e sabão e/
ou higienizados com álcool 70%; a água da estufa e banho-maria
deverá ser trocada, e a limpeza realizada periodicamente; além de
realizar a limpeza do filtro do ar-condicionado a cada três meses
(CURI; PERES, 2005).
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QUISEN, R. C.; ANGELO, P. C. da S. Manual deprocedimentos do
Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa Amazônia Ocidental.
Manaus: Embrapa Amazônia Ocidental, 2008.
CAPÍTULO 4
PRINCÍPIOS
DE BIOSSEGURANÇA
1 INTRODUÇÃO
Desde a década de 70, a construção do conhecimento em
biossegurança tem sido adotada pela comunidade científica, iniciando-
se uma ampla discussão acerca dos impactos da engenharia genética
na sociedade. A partir de então, com a evolução crescente dos conceitos
associados, o termo biossegurança tem evoluído em conjunto com as
descobertas e avanços científicos, e assim, vem sofrendo alterações
em seus fundamentos.
Atualmente, entende-se por biossegurança o conjunto de
ações voltadas para a prevenção e minimização de riscos inerentes às
atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico
e prestação de serviços, visando à saúde do homem, dos animais, à
preservação do meio ambiente e à qualidade dos resultados (SILVA,
2017). Caracteriza-se, portanto, como um termo bastante amplo e
complexo, que abrange diversas áreas do conhecimento.
Especificamente, a rotina diária de um laboratório de cultivo de
células demanda a realização de atividades de risco biológico iminente,
não apenas aos pesquisadores envolvidos como também ao meio ambiente
em que este encontra-se inserido. Dessa forma, o presente capítulo
propõe-se a apresentar e discutir as noções básicas de biossegurança e
relacioná-las às práticas de cultivo celular.
2 BIOSSEGURANÇA: FUNDAMENTOS BÁSICOS

O objetivo principal da biossegurança em um laboratório de
cultura de células é criar um ambiente de trabalho onde se promova
a contenção do risco de exposição a agentes potencialmente nocivos
ao manipulador, ao material manipulado e ao meio ambiente, de modo
que este risco seja minimizado ou eliminado (DA SILVEIRA, 2019).
Segundo a NR 32 (que segue as diretrizes internacionais para
classificação dos agentes biológicos para o trabalho em laboratórios)
tais agentes biológicos humanos e animais são divididos em quatro
classes, de 1 a 4, segundo os seguintes critérios: patogenicidade,
alteração genética ou recombinação gênica, virulência, modo de
transmissão, endemicidade, estabilidade, concentração e volume,
origem do agente biológico, consequências epidemiológicas,
disponibilidade de medidas profiláticas e de tratamento eficaz, fatores
referentes ao trabalhador.
Classe de risco 1: baixo risco individual para o trabalhador e para

a coletividade, com baixa probabilidade de causar doença ao ser
humano.
Classe de risco 2: risco individual moderado para o trabalhador e
com baixa probabilidade de disseminação para a coletividade. Podem
causar doenças ao ser humano, para as quais existem meios eficazes
de profilaxia ou tratamento.
Classe de risco 3: risco individual elevado para o trabalhador e com
probabilidade de disseminação para a coletividade. Podem causar
doenças e infecções graves ao ser humano, para as quais nem sempre
existem meios eficazes de profilaxia ou tratamento.
Classe de risco 4: risco individual elevado para o trabalhador e com

probabilidade elevada de disseminação para a coletividade. Apresenta
grande poder de transmissibilidade de um indivíduo a outro. Podem
causar doenças graves ao ser humano, para as quais não existem

meios eficazes de profilaxia ou tratamento.
Em função do tipo de risco a que os trabalhadores estão

expostos, o nível de biossegurança exigido para o laboratório também
é subdivido em quatro níveis.
Quadro 1 – Caracterização dos níveis de segurança biológica (OMS)
Normas para a manipulação de agentes biológicos

Nível de que representam baixo risco individual e para a
Biossegurança comunidade. É o nível de biossegurança necessário
1 – NB1: ao trabalho que envolva material biológico que
contenha agentes biológicos da classe de risco 1.

Nível de que representam risco individual moderado e
Biossegurança risco limitado para a comunidade. É o nível de
2 – NB2: biossegurança exigido para o trabalho com agentes
biológicos da classe de risco 2.

Nível de que representam elevado risco individual e risco
Biossegurança limitado para a comunidade. É aplicável aos locais
3 – NB3: onde forem desenvolvidos trabalhos com material
biológico da classe de risco 3.

Nível de que representam elevado risco individual e
Biossegurança elevado risco para a comunidade. Este nível de
4 – NB4: contenção deve ser usado sempre que o trabalho
envolver material biológico da classe de risco 4.
Como em qualquer atividade laboratorial, antes do início do

cultivo celular, deve-se planejar o trabalho a ser realizado de modo a
executá-lo com segurança. Para promover segurança é imprescindível
que as pessoas que atuam em laboratórios de cultura de células sejam
conscientizadas a respeito dos potenciais riscos, como também devem
ser treinadas para efetuarem as práticas e técnicas fundamentais
para o manuseio seguro dos materiais e fluidos biológicos (TEIXEIRA;
VALLE, 2010).
Além do risco biológico, um laboratório de cultivo celular
possui risco químico, com a utilização de agentes químicos, no geral,
como corantes tóxicos (azul de tripan, MTT), DMSO, quimioterápicos,
e risco físico, com agentes físicos como radiações (luz ultravioleta),
frio (nitrogênio líquido) e calor (autoclave) (ALVES et al., 2010). O
experimentador deve sempre ficar atento aos quadros de aviso no
ambiente de trabalho e documentos descritivos de substâncias e meios,
que contenham o símbolo universal de biossegurança e risco biológico
(Figura 1).
Figura 1 – Símbolo universal de biossegurança e risco biológico
Dentre as medidas de segurança para garantir um ambiente de

trabalho seguro com cultura de células, destacam-se os Equipamentos
de Proteção Individual (EPI), que são considerados elementos de
contenção primária que podem reduzir a exposição individual a agentes
potencialmente perigosos assim como proteger o material manipulado
de potenciais contaminações (DA SILVEIRA, 2019).
A higienização das mãos deve anteceder o uso dos EPIs com
o objetivo de remover as células descamativas, sujidades, pelos,
oleosidade e a microbiota da pele, interrompendo a transmissão pelo
contato, além de prevenir as infecções cruzadas. Por isso, todos os
profissionais de laboratório devem adotar essa prática, para tanto, deve
lavar as mãos até a parte anterior do antebraço com água e sabão,
preferencialmente antisséptico, e devem retirar anéis, relógios, e demais
adornos (PAULA et al., 2017).
3 EPIS NA CULTURA DE CÉLULAS

A seguir serão descritos os principais EPIs de uso comum em
um laboratório de cultivo celular.
3.1 Luvas
As luvas são utilizadas para proteger as mãos e o material
manejado, seu uso é obrigatório na manipulação de qualquer material
biológico ou produto químico. São fabricadas em diferentes materiais
para atender às atividades laboratoriais.
a. Luva de procedimento (descartável): São colocadas após a

higienização das mãos, deve-se realizar assepsia das luvas com
álcool 70% após calça-las e sempre que necessário durante o
desenvolvimento das atividades e devem ser descartadas ao
término (Figura 2A).
Figura 2 – Tipos de luvas. A) Luvas descartáveis comuns.

B) Luva de borracha antiderrapante. C) Luva de fio de Kevlar tricotado.
D) Luva criogênica impermeável
b. Luva de borracha antiderrapante: As luvas de borracha grossas

são usadas para manipulação de resíduos, lavagem de material
ou para procedimentos de limpeza em geral. Essas luvas podem
ser reutilizadas depois de higienizadas (Figura 2B).
c. Luvas resistentes a temperaturas altas e baixas: São utilizadas

na manipulação de materiais submetidos a aquecimentos
ou congelamentos. Utilizadas, por exemplo, no processo de
autoclavagem de material e na criopreservação das células.
Como exemplo, pode-se citar as luvas de fio de Kevlar tricotado,
que protegem o experimentador durante a realização de trabalhos
a temperaturas até 250 °C (Figura 2C). Já as luvas criogênicas
impermeáveis são utilizadas em temperaturas baixas de até -196
°C (Figura 2D).
3.2 Máscaras
As máscaras são EPIs projetadas para ajudar a prevenir a
contaminação do ambiente de trabalho ou o material manipulado
com as partículas de saliva ou muco, geradas pelo pesquisador,
evitando-se também a contaminação do manipulador com material
biológico e substâncias químicas. O uso das máscaras (Figura 3)
auxilia na prevenção, por exemplo, da propagação de bactérias
como Mycoplasmaspp, consideradas um dos grandes vilões da
cultura celular, sendo responsáveis por frequentes contaminações
(SHLOMO; KORNSPAN, 2012), evitando que atinjam as células, meios,
reagentes e equipamentos. Dividemse em dois tipos principais: as
máscaras cirúrgicas, que são sempre descartáveis (Figura 3A), e
as máscaras de proteção respiratória propriamente ditas (também
designadas “respiradores”) (Figura 5-B).
a. Máscara cirúrgica: é um equipamento médico hospitalar

descartável que limita a transmissão de agentes infecciosos por
gotículas, não protegendo de agentes infecciosos transmitidos
por via áerea, ou seja, presentes em partículas de dimensões
iguais ou inferiores a 5μm. São projetadas, portanto, para ajudar a
prevenir a contaminação do ambiente de trabalho ou da amostra
com as partículas grandes (exemplo: saliva e muco).
b. Respiradores: também designada “máscara de proteção
respiratória” são constituídas por uma peça facial e por um
elemento filtrante. Nos modelos autofiltrantes, a peça facial é
composta pelo próprio material filtrante – Peça Facial Filtrante -
(PFF). Seguem abaixo as classificações dos filtros e para quais
contaminantes são recomendados:
PFF1 / P1: Poeiras e/ou Névoas (aerossóis mecanicamente
gerados)
PFF2 / P2: Fumos (aerossóis termicamente gerados) e/ou

Agentes Biológicos
PFF3 / P3: Particulados altamente tóxicos (LT<0,05 mg/

m³) e/ou de toxidez desconhecida.
Figura 3 – Máscara descartável (A) e máscara N95(PFF2) (B).
3.3 Jaleco (avental)

O jaleco ou avental é uma vestimenta de proteção que deve ser
separado para uso exclusivo dentro da sala de cultura. Tem a função
de minimizar a exposição dos pesquisadores e do meio ambiente a
materiais perigosos associados às células cultivadas, enquanto protege
simultaneamente as culturas celulares de contaminações. Deve ser
lavado com frequência e esterilizado com lâmpada UV antes do uso.
3.4 Touca
O gorro ou touca tem a função de proteger os cabelos de
aerossóis e salpicos durante a manipulação como também evitar
contaminação da cultura com queda de fios de cabelo.
3.5 Propé
O propé é para proteção dos calçados para trabalhar em
áreas estéreis como no laboratório de cultura de células, podendo
ser substituídos por sapatos de plástico de fácil higienização de uso
exclusivo dentro do laboratório.
3.6 Protetores faciais

Os óculos de segurança e os protetores faciais tipo escudo
(shield) (Figura 4) são usados para proteger os olhos e o rosto em todas
as atividades que possam produzir salpicos, respingos e aerossóis,
assim como possível projeção de estilhaços pela quebra de materiais
contaminados com substâncias químicas ou material biológico.
Figura 4 – Óculos (A) e protetor facial tipo shield (B)
4 TÉCNICAS DE CONTROLE DE CONTAMINAÇÕES

De fato, as infecções microbiológicas representam o principal
problema para a manutenção das células in vitro. Agentes infecciosos,
como bactérias e fungos, são tóxicos para as células eucarióticas

e, por fim, levam à morte celular. Além disso, mesmo níveis baixos
de contaminação podem produzir resultados anormais e levar a
interpretações científicas erradas (SEGERITZ; VALLIER, 2017).
Então, além do uso dos EPIs, faz-se necessário manter o
ambiente do laboratório de cultura de células o mais asséptico possível,
uma vez que o ar atmosférico carrega micropartículas de natureza
potencialmente infecciosa, sendo assim, a cabine de segurança
biológica é o equipamento de proteção coletiva (EPC) crucial para
restringir a contaminação das células cultivadas pelos aerossóis não
estéreis e os componentes transportados pelo ar.
4.1 Cabine de Segurança Biológica (CSB)

As cabines de segurança biológica (CSBs) são equipamentos
com sistemas de filtração de ar que protegem o profissional, o material
que está sendo manipulado e o ambiente laboratorial dos aerossóis
potencialmente infectantes. As CSBs têm filtros de alta eficiência, sendo
mais utilizado atualmente o filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air)
que apresenta uma eficiência de filtração de 99,93% para partículas
de 0,3 μm de diâmetro, chamadas de MPPS (Maximum Penetration
Particulate Size) (BRASIL, 2010).
Os sistemas de filtração das CSBs são de acordo com o tipo
de microrganismo ou produto que vai ser manipulado em cada cabine,
podendo esse filtro ser mais ou menos complexo para atender
a necessidade de trabalho de cada laboratório.Por isto, elas são
classificadas em três tipos: Classe I, Classe II, subdivididas em A1,
A2 e B2 (Tabela 1) e Classe III, sendo a de classe II a mais utilizada na
cultura de células (Figura 5).
Figura 5 – Cabine de segurança biológica classe II tipo A1
Tabela 1 – Comparação entre as CSBs de Classe II
Risco
Padrão de fluxo Radionucleotídeos /
Tipo Biológico
do ar Substâncias Químicas
(classes)
Classe II 70% de ar recirculado Não 1e2
Tipo A1 através de filtro HEPA.
30% de ar exaurido para o

ambiente interno através
de filtro HEPA.
Classe II 70% de ar recirculado Sim 1, 2 e 3
Tipo A2 através de filtro HEPA. (Níveis baixos /
baixa volatilidade-toxicidade)
30% de ar exaurido para o
ambiente externo através
defiltro HEPA.
Nenhuma recirculação
de ar.
Classe II 100% de ar exaurido Sim 1, 2 e 3

Tipo B2 através de filtros HEPA
e tubulação rígida para o
ambiente externo.
As instruções para utilização das CSBs devem ser bem

descritas nos Protocolos Operacionais Padrão (POP) e seguidos à
risca (BRASIL, 2010). Dessa forma, algumas recomendações são
indispensáveis, como:
• Ao ligar a cabine, esperar o fluxo de ar estabilizar e, então, se

inicia o processo de descontaminação da superfície da área de
trabalho com álcool 70%;
• Pulverizar as paredes e superfície de trabalho com o álcool 70%
com cuidado para não atingir o filtro e nem os terminais elétricos
da lâmpada fluorescente e a lâmpada Ultravioleta (UV);
• Não colocar a cabeça dentro da cabine, limpar as paredes de cima
para baixo e a mesa de trabalho de trás para frente, seguindo o
fluxo da exaustão e evitando trazer a contaminação removida
na sua direção;
• Todo material que entrará na CSB também precisa ser pulverizado
com álcool 70%, mantendo o menor número possível de itens e
evitando qualquer obstrução ao fluxo de ar, verificando sempre
se as grelhas estão totalmente desbloqueadas;
• Por fim, liga-se a luz UV como método secundário de
descontaminação por 15 a 20 minutos, lembrando que a luz
UV não penetra em materiais, agindo somente na superfície,
então, materiais com embalagens de fábrica ou do processo de
autoclavação devem ser abertos dentro da cabine e expostos
para receber a luz UV.
Uma atenção especial deve ser dada a utilização da lâmpada

UV, pois a intensidade da mesma é afetada pela distância da
superfície a ser descontaminada e pelo acúmulo de sujidades em
sua superfície. Portanto, é necessário limpar após cada utilização
e não tocar a lâmpada com as mãos sem luvas, pois o óleo natural
da pele pode criar uma barreira para a luz. Durante o período em
que a lâmpada UV estiver ligada é aconselhável que ninguém

permaneça no ambiente, a menos que a abertura frontal da cabine
esteja fechada (BRASIL, 2010).
Após desligar a lâmpada UV, a cabine estará pronta para receber
as células, sendo agora a cabine um ambiente asséptico. É importante
ajustar a altura da cadeira, fazendo com que o rosto do pesquisador
fique acima da abertura frontal, posicionar os braços dentro da cabine
e esperar alguns segundos para que ocorra a estabilização do fluxo de
ar e a remoção de partículas contaminantes que são introduzidas junto
com os braços. É importante executar as atividades dentro da cabine
evitando movimentos bruscos e o movimento de introduzir e retirar os
braços da cabine deve ser cuidadoso para não interferir no fluxo de ar.
Ao término das atividades dentro da CSB deve-se pulverizar
álcool 70% novamente nas garrafas de cultura que voltarão para
incubadora de CO2, segregar o que vai para descarte de material
contaminado, e o que vai para lavagem/autoclavação, cobrindo o
recipiente de descarte antes de serem retirados. É necessário proceder
a descontaminação da CSB após o uso (SEGERITZ; VALLIER, 2017).
5 LIMPEZA, DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO

Toda superfície da área de trabalho do laboratório de cultura de
células incluindo bancadas, pisos e paredes necessitam de limpeza
e desinfecção regular. Utiliza-se para tanto, solução de hipoclorito
(água sanitária comercial, 2% a 5% de cloro) diluindo-se 5 mL de
solução de hipoclorito em um litro de água. Por ser um agente oxidante,
o hipoclorito age sobre os constituintes da membrana, levando os
microrganismos à morte. Outro aliado indispensável no processo de
desinfecção é o álcool etílico a 70%, um excelente desinfetante por
suas propriedades desidratante e desnaturante de proteínas, sendo
esse feito responsável por sua ação antimicrobiana. Lembrando que
o material de limpeza deve ser exclusivo da sala de cultura (ALVES;

GUIMARÃES, 2010).
Também é essencial manter todas as outras superfícies que
entram em contato com as garrafas de cultura de células, meios e
suplementos limpos e desinfectados, isso inclui todos os equipamentos
como incubadora de CO2 , centrífuga, microscópio, banho-maria,
geladeira e freezer.
A desinfecção dos equipamentos deve ser realizada
semanalmente com álcool 70% como o microscópio, balança e
centrífuga, mas há equipamentos que exige uma limpeza prévia com
água e detergente neutro para remoção de sujidades para posterior
desinfecção com álcool 70%, como é o caso do banho-maria e
incubadora de CO2 (SALVATORI, 2013).
A incubadora de CO2 e o banho-maria são os equipamentos
mais favoráveis para a proliferação de microrganismos, porém, seu
material em inox favorece esse protocolo de limpeza e desinfecção.
Para tanto, as garrafas de cultura da incubadora são removidas para
dentro da cabine de segurança previamente limpa, ficando a incubadora
livre para uma completa limpeza e descontaminação (ÇELIK-UZUNER;
UZUNER, 2017).
5.1 Limpeza e desinfecção da Incubadora de CO2
• Retirar da incubadora todas as partes removíveis, como estantes,

hastes e bandeja, e lavar com água e sabão neutro;
• Em caso específico de derramamento de meio com células
nas estantes ou no caso de contaminação recente, fazer uma
descontaminação com hipoclorito ou detergente específico;
• Enxaguar com água abundante;
• Enxugar com papel toalha;
• Desinfectar com álcool 70%;

• A água da bandeja deve ser previamente preparada (água destilada
autoclavada e acrescida de dodecil sulfato de sódio- SDS);
• Finalizar a descontaminação com a luz ultravioleta;
• A parte interna da incubadora deve ser desinfectada com álcool 70%.
5.2 Limpeza e desinfecção do banho-maria
• Esvaziar o banho e lavar com água edetergente neutro;

• Enxugar;
• Passar álcool 70%;
• Encher o banho-maria com água destilada (pode-se colocar um
pouco de hipoclorito na água do banho-maria).
5.3 Esterilização (Autoclavação)

Todos os materiais utilizados no laboratório de cultura de células,
desde vidrarias, tubos e ponteiras, devem ser estéreis. Primeiramente,
o material passa pelo processamento de limpeza e desinfecção.
A esterilização é o processo de destruição ou eliminação total
de todos os microrganismos na forma vegetativa e esporulada, por
meio do uso de agentes físicos ou químicos (MCDONNELL, 2017).
Em laboratórios de cultura de células a forma mais utilizada é
por meios físicos, o calor úmido e o seco, sendo a esterilização por calor
úmido a autoclavação, que é o processo que oferece maior segurança
e economia.
Na autoclavação, a esterilização é feita por vapor saturado sob
pressão de 1 atmosfera, a uma temperatura de 121 °C. O processo leva
em média 15 minutos, dependendo do material. É um método indicado
para a esterilização de materiais termorresistentes. É realizada com

um equipamento denominado autoclave, semelhante a uma grande
panela de pressão.
Antes de ser autoclavado, o material deve ser higienizado
(BACHA; PONSANO, 2005), conforme descrito a seguir:
• Imergir em solução de água, hipoclorito e detergente neutro;

• Enxaguar abundantemente;
• Imergir em solução de água e detergente enzimático;
• Enxaguar abundantemente;
• Imergir em água destilada;
• Secar em estufa de secagem.
Após esses procedimentos, o material deverá estar pronto para

ser autoclavado (BRASIL, 2010), conforme os passos a seguir:
• Todos os materiais precisam estar acondicionados em recipientes

com aberturas para facilitar a retirada do ar e permitir a
penetração do calor;
• Embalar o material com papel cirúrgico ou Kraft e fita adesiva
termossensível;
• Identificar e datar;
• Não encher a autoclave até o máximo, é importante deixar espaço
para a circulação do vapor. Distribuir o materialde modo a garantir
a circulação do vapor. A autoclavação perde a eficiência se o vapor
não atingir todos os materiais. Com a câmara muito carregada a
penetração do calor será inadequada e parte da carga não será
esterilizada;
• Sempre conferir o nível de água, pois, se estiver abaixo da

resistência, a autoclave pode ser danificada.
• Fechar e selar a tampa;
• Ligar no máximo e, quando começar a sair vapor, fechar a válvula;
• Esperar a temperatura atingir 121°C;
• Uma vez nessa temperatura, mudar para o médio e deixar 15
minutos;
• Após o período, desligar a autoclave e abrir a válvula para o vapor
sair;
• Só abrir a tampa depois que o manômetro estiver no zero;
• Retirar o material com luvas resistentes ao calor.
• Colocar na estufa de secagem;
• Guardar em recipiente fechado.
Faz-se necessário realizar monitoramento da esterilização com

testes biológicos para verificar a eficiência do processo de esterilização.
Os indicadores biológicos são representados por tiras de celulose, meios
de cultura ou outros veículos, impregnados geralmente por esporos
bacterianos como B. stearothermophylus (JORGE, 2002).
Para a realização de testes biológicos, deve-se:
• Colocar os envelopes contendo os esporos na autoclave, em

diferentes locais, inclusive dentro de caixas e pacotes.
• Submeter ao procedimento de esterilização adequado.
• A seguir, abrir os envelopes, retirar assepticamente a tira de papel
contendo esporos com auxílio de uma pinça esterilizada e colocar
no interior de tubos com meio de cultura (TrypticSoyBroth).
• Incubar a 37° C por 48 horas, deixando na estufa por até oito dias
para confirmação. Observar crescimento de microrganismos;
quando positivo, fazer esfregaço, corar pelo Gram e observar na
microscopia presença de bacilos Gram-positivos esporulados.
5.4 Controle microbiológico

O controle microbiológico deve ser realizado não apenas no
processo de autoclavação, mas em todo o ambiente do laboratório para
o cultivo de células. O monitoramento microbiológico da sala, bem como
das cabines de segurança biológica, deve ser realizado pela pesquisa de
microrganismos, como fungos e bactérias. Um procedimento rotineiro
indicado para controle ambiental é o método de exposição de placas
com meios nutritivos ágar caseína de soja (trypticasesoyagar-TSA) e
ágar sabouraud 4% de glicose (ALVES; GUIMARÃES, 2010).
Embora as bactérias possam ser detectadas como pequenas
partículas com baixa ampliação ao microscópio, suas formas distintas
são geralmente detectadas com maior ampliação. E, embora cepas
bacterianas como E. coli possam ser descobertas facilmente devido
ao seu tamanho (~ 2 μM) e à mobilidade induzida por flagelos, outras
cepas como Mycoplasma spp. são de tamanho menor (<1 μM), imóveis e,
portanto, não tão facilmente detectáveis. Como resultado, as infecções
por Mycoplasma podem passar despercebidas por um longo período
de tempo e, geralmente, só se tornam aparentes devido à diminuição
da qualidade das células cultivadas. Isso pode se manifestar como
proliferação celular reduzida e morte celular (SEGERITZ; VALLIER, 2017).
Para monitorar as culturas de células em busca de possíveis
infecções porMycoplasma, é aconselhável testar rotineiramente as
culturas quanto à sua presença, uma vez que é muito fácil esse tipo
de contaminação, pois eles se encontram na via respiratória humana.
Para detectar micoplasmas, pode-se utilizar o teste de coloração
fluorescente Hoescht 33258, que cora DNA, assim, ao observar uma
cultura contaminada em microscopia de fluorescência é possível

visualizar o núcleo da célula e o seu contorno (ALVES; GUIMARÃES, 2010).
Pode-se também identificar a contaminação usando reação em cadeia
da polimerase (PCR), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou
imunocoloração (DREXLER; UPHOFF, 2002). Outro desafio é a presença
de contaminantes virais, mas que também pode serconfirmado com
PCR, ELISA, imunohistoquímica, ou microscopia eletrônica (SEGERITZ;
VALLIER, 2017; MERTEN,2002).
REFERÊNCIAS
ALVES, E. A.; GUIMARÃES, A. C. R. Cultivo celular. EPSJV, 2010.
ALVES, E. A. et al. Cultivo celular. 2010
BACHA, Stella Maris Cortez; PONSANO, Giglio. Biossegurança em
fonoaudiologia: enfoque em motricidade orofacial. Pulso Editorial,
2005.
BRASIL. Ministério da Saúde de Brasília. Departamento de Doenças
Sexualmente Transmissíveis, Aids e Hepatites Virais. Biossegurança-
Diagnóstico e monitoramento das DST, Aids e Hepatites Virais. Série
Telelab, 2010.
ÇELIK-UZUNER, S.; UZUNER, U. An Extensive Method for
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Routine. Challenges, v. 8, n. 2, p. 26, 2017.
DA SILVEIRA, J. E. S. et al. PRINCIPAIS MEDIDAS PREVENTIVAS DE
BIOSSEGURANÇA UTILIZADAS EM LABORATÓRIOS CLÍNICOS DE
SAÚDE. Mostra Científica da Farmácia, v. 6, n. 1, 2019.
DREXLER, H. G.; UPHOFF, C. C. Mycoplasma contamination of
cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination,
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JORGE, A. O. C. Princípios de biossegurança em odontologia. Revista

biociências, v. 8, n. 1, 2002.
MCDONNELL, G. E. Antisepsis, disinfection, and sterilization: types,
action, and resistance. John Wiley & Sons, 2017.
MERTEN, O.-W. Virus contaminations of cell cultures–a
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PAULA, D. G. et al. Estratégias de adesão à higienização das mãos
por profissionais de saúde. R Epidemiol Control Infec, v. 7, n. 2,
p. 113-21, 2017
SALVATORI, R. U. Laboratório de Microbiologia: normas gerais,
instruções de trabalho e procedimentos operacionais padrões /
Rosângela UhrigSalvatori, Greice Aline Kaisecamp Wolf, Fabíola
Dresch e Andreia Aparecida Guimarães Strohschoen - Lajeado: Ed.
da Univates, 2013.
SEGERITZ, C.-P.; VALLIER, L. Cell Culture: Growing Cells as
Model Systems In Vitro. In: Basic Science Methods for Clinical
Researchers. Academic Press,. p. 151-172, 2017.
SHLOMO, R. K., N. S.; KORNSPAN, J. D. Contamination of Tissue
Cultures by Mycoplasmas. 35-56, IntechOpen, 2012.
SILVA, E. J. Princípios de biossegurança aplicados à fase pré-
analítica do laboratório de análises clínicas. 2017.
TEIXEIRA, P.; VALLE, S. (Ed.). Biossegurança: uma abordagem
multidisciplinar. SciELO-Editora FIOCRUZ, 2010.
CAPÍTULO 5
MEIOS DE CULTIVO CELULAR

1 INTRODUÇÃO
Para que as células cresçam e se mantenham em cultura é
necessário que sejam disponibilizados meios nutritivos, capazes de
simular as condições ideais para um determinado tipo celular. Muitas
vezes, estes meios requerem suplementação com outras substâncias
e devem ser constantemente renovados, de modo a fornecerem os
nutrientes adequados, bem como garantir condições de assepsia
suficientes, evitando-se contaminações.
Neste capítulo, serão fornecidos elementos teóricos e práticos,
de modo a permitir uma melhor compreensão acerca dos principais
meios de cultura de células utilizados na rotina laboratorial.
2 COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

As células animais isoladas de tecidos vivos e as células
de linhagem podem crescer in vitro quando são suplementadas de
nutrientes e estímulos essenciais para o seu crescimento, proliferação
e sobrevivência. Esse ambiente artificial propício para as células é
chamado de cultura celular, intrinsicamente controlado por parâmetros
físico-químicos como temperatura, pH, oxigênio, gás carbônico (CO2)
e umidade.
Os nutrientes necessários para o crescimento, divisão e

multiplicação celular são fornecidos por um veículo líquido chamado
de meio de cultura. Este veículo nutricional é composto por diversos
componentes, dentre estes: sais inorgânicos, vitaminas, aminoácidos
essenciais e não essenciais, proteínas, glicose, antibióticos e um
indicador de pH, sendo necessária uma composição específica para
as diferentes linhagens celulares dependendo da demanda nutricional
e energética de cada uma delas (Quadro 1) (MOLINARO; CAPUTO;
AMENDOEIRA, 2009).
Quadro 1 – Componentes básicos dos meios de cultura
Sais Vitaminas Aminoácidos Proteínas Outros
NaCl Biotina Arginina Penicilina

Insulina
KCl Colina Cistina Estreptomicina
Transferrina
NaH2PO4 Folato Glutamina Glicose
Fatores
NaHCO3 Nicotinamida Isoleucina específicos Vermelho de
CaCl2 Tiamina Leucina do fenol
crescimento
MgCl2 Riboflavina Triptofano Soro fetal
Os meios de cultura celular podem ser classificados em meio

completo e incompleto. A denominação de meio completo é designada
pela presença do elemento soro, que o difere do meio incompleto. Este
elemento é rico em fatores de crescimento que induzem a proliferação,
e fatores de adesão que são responsáveis pela adesão celular ao
substrato e que levam a sustentabilidade das células.
Os soros mais utilizados na complementação dos meios são
provenientes de bezerro bovino (BCS) ou bovino fetal (SBF), sendo
este último geralmente mais enriquecido em fatores de crescimento
e, portanto, mais adequado para a maior parte das culturas celulares.
A suplementação de componentes adicionais no meio de

cultura, como os tampões HEPES (ácido etanosulfônico 4-2 hidroxietil
piperazina-1)e bicarbonato de sódio (NaHCO3), ou de fontes energéticas
como piruvato de sódio e glicose, além de insulina bovina, dentre outros,
são condicionados às necessidades nutricionais de cada linhagem
celular específica, o que por sua vez, está atrelado ao metabolismo e
função celular característicos (Tabela 1) (FRESHNEY, 2011).
Tabela 1. Exemplos da suplementação de meios para algumas linhagens

celulares específicas
Linhagens L929 OVCAR-3 PC-3 HeLa

e meios
Componentes RPMI -1640 RPMI -1640 DMEM

F-12K
adicionais Tradicional Modificado alta glicose
Bicarbonato de sódio 2,0 g/L 1,5 g/L ---- 3,7 g/L
HEPES 3,0 g/L 2,4 g/L ---- 2,0 g/L
Glicose ---- 2,5 g/L ---- ----

10 mL
Piruvato de sódio ---- (estoque ---- ----
[10 mM])
Insulina bovina ---- 10 mg/L ---- ----
Soro Fetal Bovino (SBF) 10% 20% 10% 10%
Solução de antibióticos
(penicilina/ 1% 1% 1% 1%
eestreptomicina)
1% (500 µL/ 50
Solução de aminoácidos ---- ---- ----
mL de meio)
Legenda: RPMI 1640: Roswell Park Memorial Institute;

DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium;
F-12K: Kaighn’s Modification of Ham’s F-12 Medium.
3 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS
Os meios de culturas utilizados na rotina para a manutenção e
o crescimento de células eucarióticas são, em sua grande maioria, de
natureza química complexa, sujeitos, portanto, às variações de natureza
físico-química, tais como pH, temperatura, tensão gasosa de oxigênio
(O2), gás carbônico (CO2) e umidade.
Qualquer variação nos fatores físico-químicos pode interferir
no crescimento celular, devendo o manipulador estar sempre atento
às variações nestes parâmetros. A seguir, serão apresentados
alguns dos principais fatores físico-químicos relacionados aos
meios de cultivo.
3.1 pH
O pH ideal para o crescimento da maioria das células em cultura
pode variar em torno de pH 7,4 a pH 7,7, de acordo com o tipo celular
específico. Majoritariamente, as linhagens celulares desenvolvem-se
saudavelmente em pH 7,4, e as células transformadas crescem bem
entre pH 7,0 a pH 7,4 (YAO; ASAYAMA, 2017).
Com o intuito de facilitar a análise visível do pH no microambiente
da cultura celular ideal, faz-se necessário o uso de um indicador de
pH adicionado ao meio de cultura, como o vermelho de fenol. Este
indicador, em pH 7,4, reflete uma coloração vermelho claro, em pH
7,0 exibe uma cor alaranjada, já em pH 6,5 apresenta-se amarelo, e,
com o aumento do pH para 7,8, o indicador reflete uma coloração
vermelho escuro/roxa. A vantagem de utilizar o indicador é a facilidade
de avaliação de alterações no meio, e a desvantagem está na percepção
da cor que é subjetiva (FRESHNEY, 2011).
3.2 Tamponamento
Os sistemas-tampão, ou tampões, são frequentemente
utilizados na rotina laboratorial, uma vez que servem para evitar a
variação significativa do pH na faixa ideal do meio, quando expostos a
diferentes condições inerentes da cultura celular, como a variação nas
concentrações de CO2, metabólitos, etc. Dentre os principais tampões
utilizados em grande parte das culturas, pode-se citar o bicarbonato
de sódio (NaHCO3) e o HEPES (C8H18N2O4S).
O bicarbonato de sódio é um tampão inorgânico que possui
capacidade fraca de tamponamento, mas é amplamente utilizado
por apresentar baixa toxicidade, baixo custo e benefício nutricional
para a cultura. Além disso, esse sistema de tamponamento ocorre
naturalmente no corpo humano e outros animais, melhor se aproximando
das condições fisiológicas.
Por sua vez, o HEPES é um agente orgânico zwitteriônico (dupla
polaridade) que possui maior tamponamento, porém, é mais tóxico e
de alto custo, quando comparado ao bicarbonato de sódio, devendo
ser utilizado com maior cautela (FRESHNEY, 2011).
3.3 Concentração de CO2

A maioria dos laboratórios de cultura de células possui uma
incubadora de dióxido de carbono (CO2) umidificada em 5% de CO2, no
entanto, nem sempre é óbvio o motivo pelo qual as culturas precisam
dessa quantidade de CO2.
Inicialmente, é importante ressaltar que o CO2 não é um requisito
metabólico para as culturas celulares e tecidos de animais. O objetivo do
uso desse gás está envolvido na formação do ácido carbônico (H2CO3),
por meio das reações de tamponamento do sistema bicarbonato,
utilizado no controle do pH. Dessa forma, a quantidade de NaHCO3 no
meio é o que na verdade determina a quantidade de CO2 que deve ser

usada para manter o pH da cultura (Figura 1).
Figura 1 – Variações na coloração do meio DMEM em função do pH

e da concentração de CO2
3.4 Controle de qualidade da água

A água é o componente primordial utilizado na preparação
dos meios e soluções. O controle de qualidade da água é essencial
para evitar a contaminação por diferentes compostos orgânicos e
microrganismos, em virtude da facilidade desse veículo em reter
impurezas que venham a influenciar no crescimento das células in vitro.
A água utilizada em cultura celular passa por um processo

de filtração com carvão ativado, colunas de troca iônica e filtros
revestidos de acetato de celulose, que produzem a água ultrapura
proveniente de um ciclo do sistema de purificação. A vantagem deste
processo é a redução do risco de possíveis contaminações, no entanto
trata-se de um sistema de alto custo e que requer manutenção
frequente, sendo esta a desvantagem na produção (MOLINARO;
CAPUTO; AMENDOEIRA, 2009).
4 PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTURA

A seguir, para fins ilustrativos, será descrito como exemplo
prático a preparação do meio RPMI – 1640 (Tabela 2).
Tabela 2 –Preparo de 1L de meio RPMI - 1640
COMPONENTES QUANTIDADES
HEPES 3,0 g/L

Bicarbonato de sódio 2,0 g/L
RPMI - 1640 1 frasco em pó
Água q.s.p. 1L
NaOH Se necessário
HCl Se necessário
4.1 Protocolo de preparação
a) Pesar o HEPES e o bicarbonato de sódio;

b) Depositar o volume de 1 L de água ultrapura em uma proveta;
c) Em um béquer de 1 L, adicionar parte do volume de água reservado
800 ml);
d) Colocar o béquer com o volume de água em um agitador magnético

e adicionar lentamente todo o conteúdo do frasco de meio RPMI 1640;
e) Após a dissolução do meio, acrescentar os tampões: HEPES e
bicarbonato de sódio. Manter sob agitação, até que ambos sejam
dissolvidos totalmente;
f)Ainda sob agitação, ajustar o pH para 7,2, adicionando soluções
específicas (NaOH ou HCl);
g) Completar o volume com água para 1 L;
h) Ligar o fluxo laminar e colocar todos os materiais estéreis
necessários para a filtração do meio. Ligar a lâmpada UV por 15
minutos;
i) Levar o béquer (contendo o meio preparado) para o fluxo laminar
previamente estéril;
j) Instalar a bomba à vácuo ao sistema de filtração estéril;
k) Após o término da filtração, deve-se adicionar 1% da solução de
antibióticos (penicilina/eestreptomicina) ao meio (10 ml da solução
a cada 1 L de meio RPMI).Homogeneizar;
l) Realizar o teste de esterilidade do meio filtrado na incubadora de
células por 24 horas.
4.2 Filtração do meio

O processo de filtração para substâncias orgânicas ou lábeis,
como o meio de cultura, consiste em um sistema de filtração por
membranas de acetato de celulose com porosidade menor que 0,22
µm. Em virtude dessas substâncias serem facilmente degradadas
na presença do calor, são consideradas lábeis ao processo de
autoclavagem. No entanto, o aparato utilizado no sistema de filtração
é anteriormente autoclavado para garantir esterilidade e segurança
no processo.
Dessa forma, o processo de filtração consiste na passagem

do líquido (meio) pela membrana (0,22 µm) impedindo a passagem
de microrganismo, e garantindo a esterilidade e eficiência do
procedimento. Em seguida, o material filtrado é analisado por meio
do teste de esterilidade por incubação do líquido em um tubo cônico
de polipropileno estéril tipo Falcon, levado diretamente à estufa de
CO2, a 37 °C, com a tampa semiaberta. Após 24 horas uma alíquota é
analisada no microscópio, e, sendo descartado indício de contaminação,
o meio filtrado poderá ser utilizado com segurança.
O meio é filtrado sem suplementação, como soro bovino
fetal (SBF) ou solução de aminoácidos, para evitar a perda desses
componentes nutritivos no processo de filtração. Dessa forma, o meio
deverá ser aliquotado e suplementado conforme a necessidade de uso
(MOLINARO; CAPUTO; AMENDOEIRA, 2009).
REFERÊNCIAS
FRESHNEY, R. I. Culture of Animal Cells. Wiley Online Books.
Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2011. p. 99-114.
MOLINARO, E. M.; CAPUTO, L. F. G.; AMENDOEIRA, M. R. R. (Org).
Conceitos e Métodos para a Formação de Profissionais em
Laboratórios de Saúde, v. 2. Rio de Janeiro: EPSJV, IOC, 2009.
YAO, T.; ASAYAMA, Y. Animal-cellculture media: History,
characteristics, and current issues. Reprod. Med. Biol., v. 16,
99-117, 2017.
CAPÍTULO 6
CRIOPRESERVAÇÃO
1 INTRODUÇÃO
A utilização de células em cultura por longos períodos de
tempo acabam induzindo alterações fenotípicas, uma vez que,
durante os processos de imortalização que ocorrem durante várias
gerações celulares, há uma grande probabilidade de ocorrerem
alterações demasiadas em seu DNA. Dessa forma, faz-se necessário
induzir o processo de congelamento celular, para que as células
diminuam ou mesmo atrasem o surgimento de eventuais alterações
que poderiam ocorrer quando em cultura.
Neste capítulo, serão introduzidos os fundamentos da
criopreservação de células animais, além de fornecer em detalhes
protocolos demonstrativos e ilustrados de técnicas de congelamento
e descongelamento de células utilizadas na rotina de um laboratório
de cultivo celular.
2 CRIOPRESERVAÇÃO: DA TEORIA À BANCADA

A criopreservação é uma técnica empregada no cultivo
celular que utiliza baixas temperaturas para armazenar células. A
preservação do estoque de células em temperaturas abaixo de -130
°C permite o armazenamento de células a longo prazo por períodos
de pelo menos duas a três décadas (GURRUCHAGA et al., 2018). A
temperatura muito baixa utilizada na criopreservação (-196 °C)
interrompe a atividade biológica, preserva o DNA celular e impede
a morte celular, de modo a conservar a capacidade proliferativa
da célula (PERES; CURI, 2005). É importante que o congelamento
seja feito em células com poucas passagens para preservar as
características celulares (CREE, 2011).
2.1 Congelamento
Células em cultura geralmente são congeladas em nitrogênio
líquido. O congelamento deve ser um processo lento, em geral,
sugere-se a redução de 1 °C por minuto (PEGG, 2007). A redução
vagarosa da temperatura promove a solidificação da água presente
no meio, e o aumento da força osmótica causa um efluxo de água das
células, essa água congela no exterior, deixando a célula desidratada
(GURRUCHAGA et al., 2018; ALVES; GUIMARÃES, 2010). Um resfriamento
lento é necessário para permitir o efluxo suficiente de água, e assim
minimizar a probabilidade de formação de gelo intracelular (PEGG,
2007). Esse processo é necessário, pois a formação de cristais
dentro da célula pode levar ao rompimento da membrana celular, e,
consequentemente, à morte celular (Figura 1).
Figura 1 – Processos de congelamento lento e rápido, seguido de

descongelamento (Descong.)
Fonte: Autoria própria.
Legenda: O processo de congelamento envolve a redução gradual

de temperatura que pode ser realizada de forma lenta (congelamento lento) ou
rápida (congelamento rápido). No processo de congelamento lento a vagarosa
redução de temperatura promove o congelamento da água presente no meio
extracelular, o que permite que a água do meio intracelular saia da célula pelo
processo de osmose, e à medida que a água sai ela congela no meio extracelular.
No processo de congelamento rápido ocorre
o congelamento da água no meio extracelular e intracelular, formando cristais
dentro da célula que levam a dano na membrana celular
e posterior morte da célula.
Utilizando esse processo de congelamento lento obtém-se maior

viabilidade celular do que no processo de congelamento rápido, no qual
as células são transferidas diretamente para o nitrogênio líquido (ALVES;
GUIMARÃES, 2010). Além disso, também são usados crioprotetores, que
protegem a membrana das células dos cristais formados. O agente
crioprotetor comumente utilizado é o dimetilsulfóxido (DMSO), mas o
glicerol também é uma alternativa (GURRUCHAGA et al., 2018; PERES;
CURI, 2005; ALVES; GUIMARÃES, 2010).
Os processos de congelamento e descongelamento é o mesmo

para células em suspensão ou de adesão. Segue uma metodologia
simplificada para o congelamento de linhagens celulares (Figura 2).
• Transferir as células para um tubo cônico de polipropileno estéril

tipo Falcon (se as células forem aderentes deve ser realizado o
processo de tripsinização, e, após 5-10 minutos, inativar a tripsina
com meio de cultura e transferir as células para o tubo cônico
de polipropileno estéril tipo Falcon).
• Centrifugar a 500 x g por 5 minutos a 25°C.
• Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio
de cultura completo (10% de Soro Bovino Fetal - SBF + 1% de
penicilina/estreptomicina. O volume de meio dependerá do
tamanho do precipitado formado: geralmente 1 mL de meio para
um precipitado celular pequeno).
• Realizar coloração com azul de Tripan e contagem em câmara
de Neubauer para avaliar a viabilidade celular (ver Capítulo 8).
• Se a cultura apresentar ≥ 90% de células viáveis, seguir o
procedimento de congelamento.
• Transferir 950 µL da suspensão celular para um tubo criogênico
e adicionar 50 µL de DMSO por gotejamento (5% de DMSO).
• Homogeneizar rapidamente e vedar o tubo criogênico com filme
de alta aderência utilizado para vedação (Parafilm M).
• Transferir para o congelador (-20 °C), onde o criotubo deve
permanecer por 20 a 30 minutos.
• Transferir o criotubo para o freezer -80 °C.
• No dia seguinte, transferir o criotubo para um container de

nitrogênio líquido, onde os criotubos devem ser mantidos imersos
na fase líquida no nitrogênio.
Figura 2 – Metodologia para congelamento de células
Legenda: Para o processo de congelamento, as células devem ser centrifugadas,

em seguida,ressuspensas em meio de cultura completo e avaliada a viabilidade
celular. Posteriormente, as células devem ser transferidas para tubo criogênico
e o DMSO adicionado por gotejamento, o tubo criogênico deve ser transferido
para o congelador por 30 minutos e, em seguida, transferido para o freezer -80
o
C. Após 24 horas, o tubo criogênico deve ser armazenado em nitrogênio líquido.
2.2 Descongelamento
O descongelamento das células é um processo simples,
porém importante, que requer a mesma atenção que o processo de
congelamento. Apesar do congelamento lento e do uso de agentes
crioprotetores durante o congelamento, o processo de criopreservação
é danoso para as células e o crescimento de células após o
descongelamento é lento. Portanto, após o descongelamento, as células
devem ser cultivadas em meio de cultura com uma concentração de
soro bovino fetal maior que a usual (20%) até que se recuperem (ALVES;
GUIMARÃES, 2010; PERES; CURI, 2005).
Para minimizar a perda de células, o processo de
descongelamento deve ser realizado com cuidado e rapidamente
(PERES; CURI, 2005). As etapas do descongelamento que devem ser
levadas em consideração para garantir uma criopreservação bem-
sucedida serão resumidas e discutidas a seguir (Figura 3).
• Retirar o tubo criogênico do container de nitrogênio líquido e

colocar em gelo.
• Dentro do fluxo laminar, deixar descongelar (não totalmente) em
temperatura ambiente, e transferir rapidamente o conteúdo celular
para um tubo cônico de polipropileno estéril tipo Falconcontendo
10-20 mL de meio de cultura completo (adicionado de 10% de SBF
e 1% de penicilina/estreptomicina).
• Centrifugar a 500 x g por 5 minutos a 25 °C.
• Descartar o sobrenadante e ressuspender em meio de cultura
completo (20% de SBF e 1% de penicilina/estreptomicina). Essas
duas últimas etapas têm como objetivo eliminar o crioprotetor
do meio celular.

de Neubauer para avaliar a viabilidade celular (ver Capítulo 8).
• Transferir a suspensão celular para uma garrafa de cultivo celular.
• Manter em incubadora de CO2 pararecuperação das células.
Figura 3 – Metodologia para descongelamento de células
Legenda: O processo de descongelamento deve ser iniciado com a retirada

do tubo criogênico do nitrogênio líquido, em seguida, as células devem ser
ressuspensas em meio de cultura completo. Após centrifugação, as células
devem ser novamente ressuspensas em meio de cultura completo
para avaliação da viabilidade celular, seguida de transferência
para a garrafa de cultivo celular.
REFERÊNCIAS
ALVES, E. A.; GUIMARÃES, A. C. R. “Cultivo celular”. Rio de Janeiro:
Fiocruz, EPSJV, 2010.
CREE, I. A. Principles of Cancer Cell Culture. In: Methods in
Molecular Medicine. p. 13-26, 2011.
GURRUCHAGA, H; DEL BURGO, L. S.; HERNANDEZ, R. M.; ORIVE, G.;
SELDEN, C.; FULLER, B.; PEDRAZ, J. Advances in the slow freezing
cryopreservation of microencapsulated cells. Journal of Controlled
Release, 2018.
PEGG, D. E. Principles of cryopreservation. In: Cryopreservation and
freeze-drying protocols. Humana Press, p. 39-57, 2007.
CAPÍTULO 7
PROPAGAÇÃO DAS CULTURAS

1 INTRODUÇÃO
O processo de propagação celular visa evitar a morte nos
cultivos, pois as células geralmente param de se dividir em alta
densidade devido a vários fatores, dentre estes, o aglomerado
celular e o esgotamento de fatores de crescimento, a exaustão de
nutrientes no meio, a inibição do crescimento por contato, o excesso
de metabólitos secretados para o meio e a acidificação do meio
(PERES; CURI, 2005).
Caso a quantidade de células na garrafa de cultivo celular
exceda o limite de confluência adequado, não haverá o crescimento
normal da suspensão celular ou da monocamada (células aderentes),
e, consequentemente, as células entrarão em seguida na fase de
morte. Por isso, é necessário realizar o procedimento de repique
para, periodicamente, retirar células do cultivo e mantê-las com o
crescimento ideal, ou seja, em fase log (ALVES; GUIMARÃES, 2010).
Neste capítulo serão descritos os procedimentos básicos para
a propagação das culturas celulares, incluindo protocolos ilustrativos
e detalhados dos processos envolvendo a troca de meio, repiques e
passagens celulares.
2 TROCA DE MEIO, REPIQUE E PASSAGENS

Para a manutenção de cultura de linhagens celulares é
necessário observar a densidade de células (confluência para células
aderentes) e seu aspecto geral (FRESHNEY, 2011). Normalmente,
esse procedimento é realizado em microscópio óptico invertido com
contraste de fase. É essencial familiarizar-se com o ciclo celular de
crescimento de cada linhagem celular, uma vez que, diferentes tipos
celulares e também células em diferentes fases se comportam de
maneira distinta em relação à proliferação, atividade enzimática,
glicólise, respiração, etc.
As culturas de células aderentes devem ser mantidas com
confluência entre 80-90% (subconfluência), enquanto que as células em
suspensão são utilizadas em concentrações entre 1x105 a 1x106 células/
mL, isso porque, antes de atingirem esse limiar, as células devem ser
repicadas (PURDIE; POURREYRON; SOUTH, 2011; HELGALSON; MILLER,
2004; PERES; CURI, 2005).
Caso a densidade ou confluência celular não estejam próximas
a seu limiar é necessário apenas que o meio de cultura seja substituído
periodicamente (a cada 48 horas aproximadamente) (PERES; CURI,
2005). Alguns fatores podem indicar a necessidade de troca do meio de
cultura, como: queda no pH (para ≤ 6,5), alta concentração de células,
tipo celular e modificação da morfologia celular (FRESHNEY, 2011).
Nesse contexto, a troca do meio irá garantir o ambiente adequado para
o crescimento e função celulares.
2.1 Troca de meio de cultura

A troca de meio de cultura é um procedimento simples e rápido
que envolve as seguintes etapas para células aderentes:
• Remover o meio de cultura da garrafa de cultivo celular.
• Lavar a garrafa de cultura com Tampão Fosfato Salino (PBS).

• Ressuspender as células em novo meio de cultura.
No caso das células em suspensão, esse procedimento pode

ser realizado apenas por adição de novo meio de cultura e diluição do
número de células, sem remover o meio de cultura já existente.
2.2 Repique
O procedimento de repique inicia-se com a observação
do aspecto e confluência das células em microscópio. Existem
procedimentos diferentes para o início do repique em linhagens
aderentes e em suspensão, os quais estão descritos abaixo.
a) Para linhagens em suspensão:

• As linhagens em suspensão devem ser cuidadosamente
homogeneizadas com a pipeta, para desagrupar as células em
grumos, e seu conteúdo deve ser transferido para um tubo cônico
de polipropileno estéril tipo Falcon.
b) Para linhagens aderentes:

• Lavar a cultura com PBS para remover os resíduos de meio de
cultura.
• Incubar a cultura com tripsina em incubadora de CO2 por 5-10
minutos (esse tempo varia de acordo com o tipo celular), a qual age
digerindo e clivando as proteínas de adesão das células. Geralmente,
a tripsina utilizada é a tripsina-EDTA (0,25%), pois o EDTA (ácido
etilenodiamino tetra-acético )adicionado à solução (protocolo
descrito no apêndice) atua como um agente quelante que neutraliza
os íons cálcio e magnésio, que estariam favorecendo as ligações
peptídicas nas quais a tripsina atua (PERES; CURI, 2005). Sendo

assim, a remoção desses íons aumenta a atividade enzimática da
tripsina. O volume de tripsina-EDTA (0,25%) varia de acordo com
o tamanho do frasco de cultura, porém, geralmente, é utilizado 2
mL da solução para garrafas grandes (250 mL, 75 cm2) e 1 mL para
garrafas pequenas (50 mL, 25 cm2).
• Inativar a tripsina com meio de cultura específico para o
tipo celular, adicionado de 10% de SBF e 1% de penicilina/
estreptomicina, e transferir para um tubo cônico de polipropileno
estéril tipo Falcon. As proteínas do soro irão bloquear a ação da
tripsina, uma vez que a tripsina cliva as proteínas do soro, que
competem com as moléculas de adesão das células (Figura 1).
Figura 1 – Tripsinização de células aderentes em cultura celular
Legenda: Para trispsinização, as células aderentes devem ser incubadas

com a tripsina por 5-10 minutos em incubadora de CO2 (37 oC e 5% de CO2). Em
seguida,meio de cultura completo deve ser adicionado à garrafa de cultivo para
bloquear a ação da tripsina.
As etapas seguintes são comuns para células aderentes e em

suspensão, após as etapas descritas anteriormente (Figura 2):

• Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio
de cultura suplementado (10% de SBF e 1% de penicilina/
estreptomicina).
de Neubauer (ver Capítulo 8).
• Ajustar a concentração celular de acordo com a linhagem
utilizada.
• Transferir as células para garrafa de cultivo.
Figura 2 – Metodologia para repique de células
Legenda: Para o processo de repique da cultura, as células devem ser

centrifugadas, em seguida, ressupensas em meio de cultura completo.
Posteriormente, deve ser realizado o ajuste da concentração celular e
transferência para garrafa de cultura.
2.3 Passagens celulares

O número de passagens é um fator importante que deve
ser monitorado durante a manutenção de linhagens celulares, pois
influencia na proliferação celular e também na expressão de proteínas.
Isso ocorre devido a alterações na expressão gênica ou silenciamento
de genes que podem acontecer espontaneamente, modificando o
fenótipo celular (ALVES; GUIMARÃES, 2010; PERES; CURI, 2005).
Portanto, é importante controlar o número de passagens de
uma linhagem celular visando a reprodutibilidade dos resultados
experimentais. O número de passagens que garante a manutenção
das características fenotípicas da célula pode variar de acordo com
a linhagem e não existe um limite definido, mas, em geral, varia entre
70 e 80 passagens (PERES; CURI, 2005).
REFERÊNCIAS
Technique. 6. ed. NJ, USA: John Wiley and Sons, 2011.
HELGASON, C. D.; MILLER, C. Basic Cell Culture Protocols.[s.l.]
Humana Press, 2004.
PURDIE, K. J.; POURREYRON, C.; SOUTH, A. P. Cancer Cell Culture.
Totowa, NJ: Humana Press, v. 731, 2011.
CAPÍTULO 8
CONTAGEM DE CÉLULAS
1 INTRODUÇÃO
A contagem de células é um procedimento básico e fundamental
para a pesquisa científica que utiliza células em cultura para o
desenvolvimento de protocolos experimentais. Esse procedimento
permite estimar a taxa de crescimento das células na garrafa de cultivo,
avaliar a viabilidade celular e as condições de crescimento, além de
direcionar o planejamento dos possíveis experimentos nos quais as
células serão utilizadas (MACLEOD, 2004).
Neste capítulo, serão descritos em detalhes os procedimentos
necessários para a contagem manual de células por hemocitômetro,
um dos métodos mais utilizados pelos laboratórios de cultivo celular,
por possuir melhor custo benefício.
2 CONTAGEM DE CÉLULAS: DA TEORIA À BANCADA

Uma das formas mais comuns de estimar o número de células
é por meio da contagem ao microscópio utilizando uma câmara de
Neubauer, que também é conhecida como hemocitômetro ou câmara
de contagem (LUCARINI; SILVA; BIANCHI, 2004; ALVES et al., 2010).
Existem procedimentos diferentes para a etapa inicial da
contagem de células em linhagens aderentes e em suspensão, os
quais estão descritos a seguir.
a) Preparação das células em suspensão:

• As linhagens em suspensão devem ser cuidadosamente
homogeneizadas com a pipeta, para desagrupar as células em
grumos, e seu conteúdo deve ser transferido para um tubo cônico
de polipropileno estéril tipo Falcon.
b) Preparação das células aderentes:

• Incubar a cultura com tripsina em incubadora de CO2 [O volume da
tripsina-EDTA (0,25%) varia de acordo com o tamanho do frasco
de cultura, porém, geralmente, é utilizado 2 mL da solução para
garrafas grandes (250 mL, 75 cm2) e 1 mL para garrafas pequenas
(50 mL, 25 cm2)], por 5-10 minutos. Esse tempo varia de acordo com
o tipo celular, e deve ser monitorado observando-se ao microscópio
se as células foram removidas da superfície da garrafa.
• Inativar a tripsina com meio de cultura específico para o tipo
celular, adicionado de 10% de soro bovinofetal (SBF), e transferir
para um tubo cônico de polipropileno estéril tipo Falcon. O
processo de tripsinizaçãoestá descrito no capítulo 7.
Após essas etapas, os passos seguintes são comuns tanto para

células aderentes quanto em suspensão.

• Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de
cultura completo (10% de SBF + 1% de penicilina/estreptomicina.O
volume dependerá do tamanho do precipitado formado,
geralmente 1 mL de meio para um precipitado celular pequeno).
Nesse processo é necessária uma boa homogeneização para que
as células fiquem completamente desagrupadas.

de Neubauer.
2.1 A câmara de Neubauer e a contagem de células

A câmara de Neubauer é uma lâmina de microscopia diferente
de uma lâmina normal, uma vez que existe uma câmara gravada no
vidro, sendo que cada lâmina contém geralmente duas câmaras iguais.
Ao lado da câmara existem dois suportes onde a lamínula é
posicionada, permitindo um espaço entre a lamínula e a câmara de
0,1 mm (Figura 1). Assim, quando se coloca uma solução de células
na câmara e a lamínula é posicionada, é conhecida a profundidade da
solução, sendo possível determinar o número de células contido na
solução (LUCARINI; SILVA; BIANCHI, 2004).
Figura 1 – A Câmara de Neubauer
Fonte: SPLAB (2020)
Legenda: Foto da câmara de Neubauer espelhada tradicional,

onde é possível observar as câmaras gravadas no vidro
(as duas partes mais escuras no centro).
Por sua vez, a grade de contagem que compõe a câmara de

Neubauer possui 3 mm2 e a área de contagem de cada câmara é
composta de nove quadrantes grandes, sendo cada um de área igual a
1 mm2 (ALVES et al., 2010). Cada quadrante é subdividido em quadrados
de 0,25 mm2 de área, e o central é subdividido até ter área igual a
0,0025 mm2 (Figura 2).
Figura 2 – Quadrantes da câmara de Neubauer
Legenda: A) Quadrantes da câmara de Neubauer. Em “a” observa-se o quadrante

central e em “b” observam-se os quadrantes externos. B) Sentido utilizado no
quadrante para a realização da contagem de células.
Para a realização da contagem de células na câmara de

Neubauer deve-se realizar um procedimento de coloração das células
com o azul de Tripan. Este corante é utilizado para diferenciar células
viáveis, nas quais o corante não consegue permanecer no citoplasma,
das células danificadas que são coradas em azul (ver Capítulo 10).
Os seguintes passos devem ser seguidos para a contagem de
células em câmara de Neubauer (Figura 3):
• Volumes iguais da suspensão celular e da solução do azul de

Tripan à 0,4% (10 a 20 μL) devem ser homogeneizados em um
microtubo cônico de prolipropileno estéril tipo Eppendorf.
• Deixar a mistura descansar de 2 a 3 minutos em temperatura

ambiente (períodos mais longos levarão à morte celular e a
contagem de viabilidade reduzida).
• Antes de usar, lavar o hemocitômetro com etanol a 70% (v/v) e
deixar secar.
• Lavar uma lamínula com etanol a 70% (v/v), deixar secar e aplicá-
la em cima da câmara de contagem do hemocitômetro.
• Aplicar 10 μL da mistura de azul de Tripan/células na borda da
câmara entre a lamínula e a ranhura em forma de V na câmara.
Permita que a suspensão de células seja puxada para a câmara
por ação capilar.
• Colocar o hemocitômetro na mesa/platina de um microscópio
óptico para a contagem das células (objetiva 10×).
• Contar o número de células viáveis (não coradas com o azul de
Tripan) e não viáveis (coradas em azul) nos quatro quadrantes
externos (A, B, C e D) da câmara de Neubauer. Fazer a média
dos quatro quadrantes e multiplicar por 104 (fator da câmara)
para obter o número de células por mL na amostra aplicada ao
hemocitômetro.
• Multiplicar por dois (2) para levar em consideração a diluição 1:1 da
suspensão de células no azul de Tripan e multiplicar por qualquer
diluição na preparação original da amostra da suspensão celular,
conforme a seguinte equação:
Onde: A, B, C e D representam os quadrantes externos da câmara

de Neubauer e FD o fator de diluição utilizado.
Obs.: Em uma diluição 1:1 o FD = 2.
Para o cálculo do número de células viáveis, deve entrar na

fórmula a contagem média dos quatro quadrantes apenas das células
não coradas em azul. Portanto, a porcentagem de células não coradas

representa a porcentagem de células viáveisna suspensão, de acordo
com a seguinte fórmula:
Figura 3 – Contagem de células em câmara de Neubauer utilizando o ensaio de

exclusão do azul de Tripan
Legenda: Após centrifugação, uma mistura do azul de tripan e das células

ressuspensas (1:1) deve ser aplicada ao hemocitômetro para contagem em
câmara de Neubauer utilizando microscópio óptico.
REFERÊNCIAS
LUCARINI, A. C.; SILVA, L. A.; BIANCHI, R. A. C. Um sistema para
contagem semiautomática de microorganismos. Revista pesquisa e
tecnologia FEI, São Bernardo do Campo, v. 26, p. 36-40, 2004.
MACLEOD, K. G. Essential Techniques of Cancer Cell Culture. In:
LANGDON, Simon, P. Methods in Molecular Medicine, vol. 88: Cancer
Cell Culture: Methods and Protocols. Totowa, NJ: Humana Press,
2004. p. 17-29
CAPÍTULO 9
CONTAMINANTES DA CULTURA CELULAR

1 INTRODUÇÃO
O trabalho com cultivos celulares exige uma série de cuidados
que objetivam reduzir os riscos de contaminação. As técnicas assépticas
reduzem a probabilidade de infecção por microrganismos, desse modo,
é importante que sejam mantidas a todo momento (ALVES; GUIMARÃES,
2010; FREEDMAN et al., 2015). Ainda, é necessário que a contaminação
seja mantida a um mínimo possível para evitar interferência nos
resultados dos experimentos que comprometam sua reprodutibilidade
e confiabilidade.
Conhecer os principais agentes contaminantes presentes no
ambiente em que um laboratório de cultivo de células está inserido
é tão importante quanto o domínio das técnicas de cultivo celular.
Portanto, neste capítulo, serão abordados os tipos mais comuns de
contaminações que ocorrem em uma cultura de células.
2 AGENTES CONTAMINANTES
Diferentes tipos de contaminações podem acontecer
durante o cultivo celular, a saber, contaminação biológica, química
ou cruzada. Os principais contaminantes biológicos das culturas
celulares são vírus, fungos e bactérias (incluindo micoplasmas,
acholeplasmas e micobactérias) (MAHMOOD; ALI, 2017). Os

contaminantes químicos preocupantes incluem as endotoxinas
das bactérias gram negativas, detergentes residuais, radicais livres,
metais pesados e fixadores residuais (BAUST et al., 2017). Por fim,
a contaminação cruzada indica contaminação entre diferentes
linhagens celulares (ROUTRAY et al., 2016).
2.1 Fontes de contaminantes no laboratório

Na maioria dos laboratórios de pesquisa as principais fontes
de microrganismos são aquelas que acompanham os usuários do
laboratório. Aerossóis gerados ao falar, espirrar e tossir podem carregar
quantidades significativas de contaminates (BATES; WERNERSPACH,
2018).
As roupas também podem abrigar e transportar uma variedade
de microrganismos, por isso, é crucial a existência de uma antessala
de paramentação, além do uso de equipamentos de proteção individual
(EPIs) (PHILIPPEOS et al., 2012).
Meios de cultura, soro bovinofetal, reagentes e materiais
plásticos podem ser fontes importantes de contaminantes, por isso,
é fundamental usar materiais estéreis e sempre realizar assepsia
dos frascos com álcool 70% (v/v) antes da introdução na cabine de
segurança biológica (ALVES; GUIMARÃES, 2010).
Além dessas precauções, a sala de cultura deve ser limpa
com frequência para reduzir as partículas de poeira no chão e nos
equipamentos, incluindo banho-maria, geladeira e microscópio.
Estufas mal limpas e mantidas de forma incorreta podem servir
como “um lar” para diversos contaminantes (BATES; WERNERSPACH,
2018; PHILIPPEOS et al., 2012).
3 CONTAMINANTES BIOLÓGICOS
A contaminação biológica constitui um dos problemas mais
comuns em laboratórios. Nesse caso, a contaminação é introduzida
por meio de técnicas assépticas impróprias, materiais esterilizados
inadequadamente (pipetas, frascos de cultura, tubos, etc.) ou reagentes
contaminados (tampões, meios de cultura, tripsina, etc.) (GIBCO, 2016;
LANGDON, 2012). Esses contaminantes também são chamados de
agentes adventícios, visto que eles não surgem da própria cultura
celular e sim de fontes extrínsecas à cultura (BAUST et al., 2017).
Alguns desses agentes adventícios podem ser patogênicos
para seres humanos, e sua presença deve ser eliminada de linhagens
celulares em cultivo, assim como de qualquer cultura utilizada na
fabricação de produtos biológicos ou destinados ao uso humano ou
animal. O termo agente adventício não se aplica a vírus endógenos ou
latentes que são intrínsecos à linhagem celular (sendo codificados
no genoma celular e expressos em condições normais ou sob certas
condições de indução pela célula) (LANGDON, 2012).
3.1 Contaminação por bactérias

As bactérias são organismos procariontes com tamanho
variando entre 2-5 µm, apresentam alta capacidade de proliferação
e, na maioria das vezes, conseguem crescer em quaisquer condições.
Elas estão presentes no ar, nas superfícies, no trato digestivo humano
e em outros locais (ALVES; GUIMARÃES, 2010).
A contaminação bacteriana em uma cultura de células
eucariontes é facilmente detectada macro e microscopicamente,
uma vez que se observa turvação do meio de cultura, acompanhada
de mudança no pH, tornando o meio ácido, além de morte das células
devido à competição por nutrientes do meio de cultura. Além disso,
bactérias em cultura assemelham-se a “grânulos de areia” sobre as

linhagens de células eucariontes (Figura 1).
Figura 1 – Culturas de células eucariontes

contaminadas por bactérias
Fonte: A) Acervo particular do autor.

B) Adaptado de Handling Solutions (2020)
Legenda: A) Turvação do meio de cultivo, sinal macroscópico característico de

contaminação bacteriana. B) Presença de bastonetes nas células aderentes,
observadas por microscopia de contraste de fase, 400x.
O contaminante biológico mais grave e disseminado de todos

é o micoplasma, uma bactéria que não apresenta parede celular e se
caracteriza como o menor organismo de replicação celular que infecta
as células com maior frequência (PHILIPPEOS et al., 2012). Os aerossóis
contaminados por micoplasmas juntamente com técnicas assépticas
inadequadas constituem a maior fonte de disseminação de bactérias
em culturas celulares (ALVES; GUIMARÃES, 2010).
Por causa do seu tamanho (menos de 1 µm), os micoplasmas
são díficeis de serem detectados, ademais, a depender da célula
infectada e da espécie de micoplasma, a infecção pode passar
macroscopicamente despercebida já que não ocorre turvação do

meio (ALVES; GUIMARÃES, 2010).
Com o passar do tempo, as células que apresentam infecção
crônica por micoplasma começam a manifestar taxas reduzidas de
proliferação celular, alterações metabólicas e aglutinação em culturas
de suspensão. A única maneira garantida de detectar a contaminação
por essa bactéria é utilizando periodicamente técnicas de fluorescência
(Figura 2), hibridação de DNA, PCR (reação em cadeia da polimerase)
ou técnicas microbiológicas (CREE et al., 2011; GIBCO, 2016).
Figura 2 – Fotomicrografia de micosplasmas em células aderentes
Fonte: Gibco (2016)
Legenda: A) Fotomicrografia de cultura de micoplasma.

B) e C) Células infectadas por micoplasmas.
As células foram tratadas com o kit MycoFluor™ da Invitrogen™.
As imagens foram obtidas utilizando uma excitação
de 365 nm com lente objetiva Plan Neofluar™.
3.2 Contaminação por fungos

Fungos são microrganismos unicelulares (formas
leveduriformes) ou multicelulares (formas filamentosas) que
pertecem ao reino Fungi. Seu tamanho varia de 2-10 µm de diâmetro
até vários centímetros de comprimento. Quando ocorre contaminação

por fungos em cultivo de células eucariontes é possivel observar
macroscopicamente a turvação do meio de cultivo, assim como a
formação de colônias isoladas na placa(HANDLING SOLUTIONS, 2020).
Do ponto de vista microscópico é possível identificar as estruturas
fúngicas que parasitam à garrafa (GIBCO, 2016).
a. Contaminação por fungos leveduriformes
Leveduras são estruturas unicelulares, com tamanho que varia

de alguns micrômetros até 40µm. Microscopicamente, as leveduras
apresentam-se como partículas ovoides ou esféricas individuais que
podem brotar de partículas menores (Figura 3).
Figura 3 – Presença de leveduras em cultura de células

aderentes (cinza escuro)
Fonte: Handling Solutions, 2020.
Legenda: Imagem em microscópio de contraste de fases (400x)

mostrando células aderentes contaminadas com leveduras
(pequenas estruturas em cinza claro)
b. Contaminação por fungos filamentosos

Os fungos filamentosos crescem como filamentos
multicelulares formando as hifas, cujo tamanho pode variar de alguns
micrômetros até centímetros. Uma rede conectada de hifas contém
núcleos geneticamente idênticos, e são denominadas como colônia
ou micélio (GIBCO, 2016). Geralmente são os esporos fúngicos que
contaminam uma garrafa de cultura e utilizam-na para se desenvolver
(Figura 4).
Figura 4 – Presença de fungos filamentosos em garrafa de cultivo celular (50x)
Fonte: Handling Solutions, 2020.
3.3 Contaminação por vírus

Assim como os micoplasmas, os vírus não fornecem pistas
visuais para a sua presença; eles não alteram o pH do meio de cultura
nem promovem a turbidez do meio. Como os vírus usam seu hospedeiro
para replicação, os medicamentos usados para bloquear os vírus

também podem ser tóxicos para as células que estão sendo cultivadas
(BATES; WERNERSPACH, 2018).
Esses agentes são extremamente díficeis de serem detectados
em culturas celulares, e o uso de células infectadas com vírus representa
um risco sério à saúde para todos que frequentam o laboratório.
Infecções virais podem ser detectadas por microscopia eletrônica,
ensaios de ELISA ou pela técnica de PCR (ALVES; GUIMARÃES, 2010).
Nesse contexto, a presença de retrovírus (especialmente HIV ou
HTLV) nas linhagens celulares humanas primárias deve ser sempre
considerada ao manusear tais culturas celulares (BAUST et al., 2017).
4 CONTAMINAÇÃO CRUZADA
Em todas as ocasiões, uma célula que é mantida em laboratório
enfrenta o risco de contaminação com outra célula, particularmente as
linhagens celulares de crescimento rápido e contínuo. O primeiro caso
de contaminação cruzada na cultura de células foi relatado na década
de 1950 e, desde então, a contaminação cruzada continua sendo um
problema preocupante nos laboratórios de cultura de células, pois a
contaminação de uma linhagem celular com outra linhagem celular não
é facilmente detectável como a contaminação bacteriana ou fúngica
(ROUTRAY et al., 2016).
O Comitê Internacional de Autenticação de Linhagem
Celular(ICLAC) relata que cerca de 500 linhagens celulares
eucarióticas documentadas estão contaminadas com células de
outras linhagens (ICLAC, 2019). Um caso comum de contaminação
cruzada, e de fácil identificação, é a presença de células HeLa
(linhagem de adenocarcinoma de colo do útero humano), que forma
colônias de células arredondadas, em fibroblastos humanos normais,
com a forma orbital (Figura 5).

Figura 5 – Fibroblastos humanos normais contaminados

com a linhagem HeLa (setas). Microscopia óptica (400x)
Fonte: Adaptado de Routray et al. (2016)
5 CONTAMINANTES QUÍMICOS
Os contaminantes químicos são derivados do manuseio ou
uso inadequado de reagentes e da cultura de células. Deve-se utilizar
substâncias próprias para cultura de células e com alto grau de pureza
(GIBCO, 2016).
A água é componente essencial na preparação de meios e
soluções, porém, constitui uma fonte potencial de impurezas que podem
afetar o crescimento de culturas in vitro. Para evitar contaminação por
compostos orgânicos voláteis, que permanecem após a destilação e
que inibem o crescimento das culturas, deve-se utilizar água ultrapura,
que consiste num sistema de purificação por filtração com carvão
ativado, colunas de troca iônica e filtros de acetato de celulose (ALVES;
GUIMARÃES, 2010).
Por fim, é importante ressaltar que a ocorrência de contaminação
química é atenuada por meio da adesão às melhores práticas de
manuseio de todos os materiais em uso, assim como por evitar o uso
de solventes voláteis nas incubadoras celulares.

REFERÊNCIAS
BATES M. K.; WERNERSPACH D. Entendendo as causas e
gerenciando riscos. Datamed, 2018. Disponível em: <https://
datamedweb.com.br/2018/08/contaminacao-em-cultura-de-
celulas/> Acesso em: 09 abr. 2020.
BAUST, J. M.; BUEHRING, G. C.; CAMPBELL, L.; ELMORE, E.; HARBELL,
J. W.; NIMS, R. W.; SIMIONE, F. Best practices in cell culture: an
overview. In: Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, v. 53,
n. 8, p. 669-672, 2017.
CREE, I. A. et al. (Ed.). Cancer cell culture: methods and protocols.
Humana Press, 2011.
FREEDMAN, L. P.; GIBSON, M. C.; ETHIER, S. P.; SOULE, H. R.; NEVE, R.
M.; REID, Y. A. Reproducibility: Changing the policies and culture of
cell line authentication. Nature Methods, v. 12, n. 6, p. 493-497, 2015.
GIBCO. Cell Culture Basics. Thermo Fisher Scientific, p. 20-27, 2016.
Disponível em: <https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-
science/cell-culture/cell-culture-learning-center/gibco-education.
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HANDLING SOLUTIONS. Contamination in Cell Culture, 2020.
Disponível em: <https://handling-solutions.eppendorf. com/cell-
handling/contamination/introduction/> Acesso em: 13 abr. de 2020.
ICLAC. Register of Misidentified Cell Lines, 2019. Disponível em:
<https://iclac.org/databases/cross-contaminations/> Acesso em: 1
abr. 2020.
LANGDON, S. P. Cancer cell culture. Humana, 2010.
MAHMOOD, A.; ALI, S. Microbial and viral contamination of animal
and stem cell cultures: common contaminants, detection and
elimination. J. Stem Cell Res. Ther., v. 2, p. 00078, 2017.

PHILIPPEOS, C.; HUGHES, R. D.; DHAWAN, A.; MITRY, R. R.

Introduction to cell culture. In: Human Cell Culture Protocols.
Humana Press, p. 1-13, 2012.
ROUTRAY, I.; MAHMOOD, A.; NGWA, N. E.; TASLEEM, M., SAHIN, K.;
KUCUK, O. Cell Line Cross-Contamination and Accidental Co-
Culture. J StemCell Res Ther, v. 1, n. 5, p. 00031, 2016.

CAPÍTULO 10
INTRODUÇÃO À AVALIAÇÃO
DA VIABILIDADE CELULAR
1 INTRODUÇÃO
A determinação da viabilidade celular é uma etapa
imprescindível na avaliação e triagem de novos compostos candidatos
a fármacos, bem como na seleção de suspensões celulares contendo
um maior número de células viáveis antes da realização de ensaios
específicos. Além disso, o domínio destas técnicas básicas é
fundamental para as mais diversas áreas, desde a pesquisa básica
até as áreas aplicadas em saúde, biotecnologia, indústria, etc.
Neste capítulo serão descritas as etapas comuns de preparação
da cultura celular e tratamento com as amostras teste, de forma
prática e detalhada, visando a realização de testes de viabilidade
celular como o ensaio de exclusão do azul de Tripan. Nos próximos
capítulos, serão apresentados os testes mais comumente utilizados
em laboratórios de cultivo celular.
2 PREPARO E TRATAMENTO DAS CÉLULAS

As etapas iniciais para a determinação da viabilidade celular
por meio de ensaios específicos consistem na preparação prévia da
cultura celular e exposição das células às amostras teste, que serão
investigadas quanto às suas atividades farmacológicas. A seguir, estão

descritas as etapas comuns (Figura 1) de preparação da cultura e

tratamento com as amostras teste.
• Centrifugar as células em cultura (aderentes ou em

suspensão), seguindo-se o protocolo descrito no Capítulo 7.
• Proceder com o protocolo de contagem de células do
Capítulo 8. As células devem encontrar-se com alta
viabilidade (>90%).
• Ajustar a concentração e incubar as células em microplacas de
cultura de 96 poços (plaqueamento celular),100 µL da suspensão
celular por poço. Sugerimos 3×105células/mL para linhagens
aderentes e 5×105 células/mL para linhagens em suspensão.
• Para células aderentes, incubar a placa em estufa (5%CO2, 37
°C) por 24h, período necessário para a aderência das células
às placas. Esta etapa não é necessária para células em
suspensão.
• Adicionar 100 µL da amostra teste, previamente dissolvida
em DMSO (ou em solvente similar indicado), nas diferentes
concentrações a serem testadas.
• Incubar as placas em estufa (5%CO2, 37 °C) em diferentes
intervalos de tempos (como, por exemplo, de 24à 72h) para
observar a cinética de citotoxicidade da amostra teste.
• Após o período de incubação, proceder com a execução das
metodologias específicas para avaliação da citotoxicidade
e viabilidade celular.

Figura 1 – Metodologia para plaqueamento celular

e tratamento com as amostras teste
Legenda: Após o preparo da suspensão celular, deve-se adicionar 100 µL desta

suspensão na placa e incubá-la por 24 h (para células aderentes).
Em seguida, adicionar 100 µL da amostra teste dissolvida em DMSO
nas diferentes concentrações e incubar a placa por um período
de 24, 48 e/ou 72 h. Decorrido o tempo de incubação,
proceder com os ensaios de citotoxicidade.
3 ENSAIO DE EXCLUSÃO DO AZUL DE TRIPAN

A avaliação da viabilidade celular por meio do ensaio de exclusão
do azul de Tripan foi a primeira metodologia proposta na literatura e

vem sendo realizada há mais de um século. É considerada uma técnica

padrão para a avaliação da viabilidade celular, e continua sendo a mais
utilizada (PICCININI et al., 2017; CHAN; RICE; QIU, 2020).
3.1 Fundamentação do ensaio

O azul de Tripan (C 34 H 24 N 6 O 14 S 4) (Figura 2) é um corante
diazoderivado da toluidina e solúvel em água. Foi descoberto em 1904
por Paul Ehrlich para o tratamento da tripanossomíase africana e
utilizado pela primeira vez na oftalmologia para fins de diagnóstico para
marcar a córnea e a conjuntiva (PICCININI et al., 2017; BROCKMANN
et al., 2018).
Figura 2 – Estrutura química do azul de Tripan
Quando a membrana celular está íntegra, esta não permite a

entrada de diversos compostos químicos, inclusive o azul de Tripan.
Assim, o azul de Tripan é uma molécula que não consegue atravessar
a membrana semipermeável das células vivas. Portanto, ele só é
absorvido por células com a membrana comprometida, ou seja, por
células mortas ou que estejam em processo de morte celular, cuja
membrana começou a se romper (CROWLEY et al., 2016a; PICCININI et

al., 2017). Sendo assim, esse corante é frequentemente utilizado para

marcar e distinguir células vivas de células mortas (SINUMOL et al.,
2019) (Figura 3).
Figura 3 – Fundamento do ensaio de exclusão do azul de Tripan
Nesse ensaio, a viabilidade celular é avaliada indiretamente

por meio da observação da integridade da membrana celular. Após
penetrar na célula, o azul de Tripan liga-se a proteínas intracelulares
e, em campo claro, as células mortas encontram-se coradas em azul
(células em apoptose ou em necrose não são diferenciadas), já as
células vivas permanecem com a coloração inalterada (PICCININI et
al., 2017). Com isso, torna-se possível avaliar a viabilidade celular por

meio da quantificação das células mortas ou em processo de morte

celular coradas com o azul de Tripan.
As células coradas com o azul de Tripan podem ser observadas
com o auxílio de microscópio óptico de campo claro de baixa resolução,
tornando este ensaio acessível à maioria dos laboratórios de pesquisa
(CROWLEY et al., 2016). O procedimento de coloração das células
acontece rapidamente,podendo ser analisadas em pouquíssimo tempo,
o que facilita sua realização em combinação com outros ensaios de
morte celular (CROWLEY et al., 2016).
O ensaio de exclusão do azul de Tripan apresenta algumas
desvantagens, tais como: janela de tempo de contagem limitada,
pois o azul de Tripan exerce um efeito tóxico nas células após um
curto período de exposição, o que limita o tempo de contagem após a
coloração; e contagens imprecisas, pois existe uma grande quantidade
de falsos positivos, ou seja, “células mortas” que sofreram algum dano
a sua membrana, e falsos negativos, células que iniciaram a apoptose,
porém ainda possuem a membrana íntegra (PICCININI et al., 2017;
CHAN; RICE; QIU, 2020).Ainda assim, o azul de Tripan continua sendo
o corante mais utilizado para avaliar a viabilidade celular, pois, apesar
de apresentar desvantagens, possui inúmeras vantagens, como por
exemplo, a rapidez na execução do procedimento experimental, a
facilidade na utilização, o baixo custo e a análise pode ser realizada
com microscópio óptico de campo claro, acessível a praticamente todos
os laboratórios de pesquisa, além de poder ser contabilizado também
por meio de contadores automáticos.Sendo assim, esse método é
consideradoum método de referência para a avaliação da viabilidade
celular (CHAN; RICE; QIU, 2020).
O produto azul de Tripan possui risco biológico associado como
agente carcinogênico, portanto, deve ser manipulado seguindo-se os
procedimentos de biossegurança descritos no Capítulo 4.

3.2 Procedimento experimental
3.2.1 Material
A seguir, estão elencados os materiais necessários para a

realização do ensaio de exclusão do azul de Tripan:
• Capela de segurança biológica ou fluxo laminar;

• Cultura celular;
• Solução tampão fosfato (PBS) estéril;
• Solução de azul de Tripan a 0,4% (armazenado em frasco âmbar);
• Câmara de Neubauer (hemocitômetro) e lamínula;
• Centrífuga refrigerada;
• Tubo cônico de polipropileno estéril tipo Falcon;
• Microtubo cônico de prolipropileno estéril tipo Eppendorf;
• Microscópio óptico;
• Kit de micropipetas e ponteiras de volumes variados;
• Etanol a 70% (v/v);
• Contador digital ou analógico (opcional).
3.2.2 Protocolo
O protocolo experimental detalhado para a contagem de células

em câmara de Neubauer utilizando como método o ensaio de exclusão
do azul de Tripan encontra-se descrito no Capítulo 8.
Resumidamente, o corante azul de Tripan e a suspensão celular
devem ser homogeneizados na proporção 1:1, e a mistura aplicada ao
hemocitômetro para a contagem de células utilizando microscópio
óptico. As células coradas em azul são consideradas não viáveis
(Figura 4).

Figura 4 – Células HepG2 viáveis (setas pretas) e não viáveis (setas brancas)
marcadas com o azul de Tripan. Escala: 50 μm
Fonte: Adaptado de Liu et al. (2012)
REFERÊNCIAS
BROCKMANN, T.; BLANCHARD, V.; HERETSCH, P.; BROCKMANN, C.;
BERTELMANN, E. Photochemical degradation of trypan blue. PloS
one, v. 13, n. 4, 2018.
CHAN, L. L. Y.; RICE, W. L.; QIU, J., Observation and quantification
of the morphological effect of trypan blue rupturing dead or dying
cells. PloS one, v. 15, n. 1, p.e0227950, 2020.
CROWLEY, L. C.; MARFELL, B. J.; CHRISTENSEN, M. E; WATERHOUSE,
N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light
microscopy. Cold Spring Harbor Protocols, v. 2016, n. 7, pp.pdb-
prot087155, 2016.
LIU, J. J.; GAO, D.; MAO, S.; LIN, J-M. A microfluidic photolithography
for controlled encapsulation of single cells inside hydrogel

microstructures. Science China Chemistry, v. 55, n. 4, p. 494-501,

2012.
PICCININI, F.; TESEI, A.; ARIENTI, C.; BEVILACQUA, A. Cell counting
and viability assessment of 2D and 3D cell cultures: expected
reliability of the trypan blue assay. Biological procedures online,
v. 19, n.1, p. 8, 2017.
SINUMOL, S.; JAYALAKSHMY, P. S.; SREEDHARAN, T.; UNNI, M. O.;
NARAYAN, S.; SUJATHA, N. Effect of intraoperative trypan blue on
lens epithelial cells-Histomorphological analysis. Saudi Journal of
Ophthalmology, v. 33, n. 1, p. 18-23, 2019.

CAPÍTULO 11
ENSAIO DE CAPTAÇÃO
DO VERMELHO NEUTRO
1 INTRODUÇÃO
O vermelho neutro (VN) é um dos corantes mais empregados
em pesquisas e exames médicos. Ele pode ser utilizado como
corante histológico, indicador de pH e, principalmente, por ser
considerado também um corante vital, é bastante utilizado na
avaliação da viabilidade celular em ensaios de citotoxicidade de
diversos compostos químicos (PATHROSE et al., 2017; NABLO et al.,
2019; VAHEDI et al., 2018).
Neste capítulo serão introduzidos os princípios fundamentais
do uso do VN em cultivo de células, apresentando-se um protocolo
detalhado de sua utilização visando ensaios de avaliação de
viabilidade celular.
2 FUNDAMENTAÇÃO DO ENSAIO
O ensaio de captação do vermelho neutro é baseado na capacidade
das células viáveis de incorporar e reter o VN no interior dos lisossomos
(MELLO et al., 2020).
O vermelho neutro (VN) (cloridrato de 3-amino-7-dimetilamino-
2-metilfenazina) é um corante catiônico eurodina, solúvel em água,
pertencente à classe de corantes com estrutura fundamental fenazina.

Estruturalmente, possui fórmula C15H17ClN4, sendo formado por dois

anéis fenil, que se encontram ligados por um composto heterocíclico
contendo dois átomos de nitrogênio (fenazina) (Figura 1) (ATES et al.,
2017; GEORGE et al., 2014; VAHEDI et al., 2018).
Sua captação depende da capacidade da célula de manter
gradientes de pH, por meio da produção de ATP. Em pH fisiológico, o
VN é fracamente catiônico e entra nas células por meio de difusão
passiva não iônica.
Figura 1 – Estrutura química do vermelho neutro
Ao penetrar na célula, o VN irá se acumular nos lisossomos,

onde se liga por meio de ligações eletrostáticas hidrofóbicas à matriz
aniônica e/ou a grupos fosfato. No interior dos lisossomos há um
gradiente de prótons que mantém um pH menor que o do citoplasma
(pH lisossômico < pH citoplasmático), com isso, o VN recebe um próton
e fica carregado e retido no interior dos lisossomos (Figura 2) (ATES et
al., 2017; BULGARELLI et al., 2018; REPETTO; DEL PESO; ZURITA, 2008;
LEMOS, 2018; SOUZA et al., 2011; BAYDYUK et al., 2019).

Figura 2 – Fundamento do ensaio de marcação

com vermelho neutro.
Legenda: O vermelho neutro, um corante fracamente catiônico, penetra nas

células por difusão passiva não iônica e se acumula no interior dos lisossomos,
ligando-se por meio de ligações eletrostáticas hidrofóbicas à matriz aniônica e/
ou aos grupos fosfato. Devido ao gradiente de prótons
que mantém o pH lisossômico inferior ao pH citoplasmático, o VN recebe
um próton, ficando carregado e retido no interior dos lisossomos.
Compostos citotóxicos podem causar alterações na superfície

das células ou na membrana lisossomal, resultando em uma diminuição
na captação e retenção do vermelho neutro, devido à redução da
eficiência da bomba de prótons (H+-ATPase), com consequente
diminuição do gradiente de prótons e elevação do pH no interior dos
lisossomos, resultando na desprotonação do VN, o qual não é mais retido
nos lisossomos. Dessa forma, o ensaio de captação de VN possibilita a
avaliação da integridade da membrana lisossomal e sua capacidade
para reter o corante, permitindo a diferenciação entre células viáveis

e células mortas (ATES et al., 2017; REPETTO; DEL PESO; ZURITA, 2008;
SOUZA et al., 2011).
A viabilidade celular é quantificada por espectrofotometria
após a extração do corante acumulado no interior das células
utilizando uma solução alcoólica acidificada, sendo a quantidade
de corante incorporado diretamente proporcional à quantidade de
células viáveis (PEREZ et al., 2017; NABLO et al., 2019). Portanto, a
redução na viabilidade celular é expressa como uma redução da
captação do VN após a exposição à amostra em teste, representando
assim uma estimativa sensível da integridade celular e da inibição
do crescimento (MANNERSTRÖM et al., 2017). Adicionalmente,
pesquisas mostram que algumas células, a exemplo das células
cancerígenas, possuem uma absorção diferenciada de vermelho
neutro em comparação com células normais, o que possibilita uma
distinção entre elas (VAHEDI et al., 2018).
O VN é capaz de induzir toxicidade aguda quando ingerido,
podendo causar irritações na pele e mucosas (olho, pele, trato
respiratório). Além disso, possui risco biológico associado como
agente carcinogênico, portanto, deve ser manipulado seguindo-se os
procedimentos de biossegurança descritos no Capítulo 4.
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1 Material
A seguir, estão elencados os materiais necessários para
realização do ensaio do VN:
• Capela de segurança biológica ou fluxo laminar;

• Cultura celular;

• Vermelho neutro (cloridrato de 3-amino-7-dimetilamino-2-

metil-fenazina);
• Solução tampão fosfato (PBS) estéril;
• Meio de cultura adequado e suplementado;
• Ácido acético glacial;
• Etanol absoluto (96%);
• Microscópio óptico invertido;
• Incubadora de CO2;
• Espectrofotômetro com comprimentos de onda de excitação
e emissão de 530 e 645 nm, respectivamente;
• Agitador para microplacas;
• Microplaca de 96 poços;
• Tubos cônicos de polipropileno estéril tipo Falcon (50 mL);
• Pipeta multicanal (preferencialmente) e ponteiras.
3.2 Protocolo
A seguir, detalha-se o protocolo para a realização do ensaio do
VN (Figura 3):
• Preparar uma solução de trabalho de vermelho neutro de 40

µg mL-1 (protocolo descrito no apêndice) e incubar overnight,
a 37°C.
• Proceder com o protocolo de “preparo e tratamento das
células para ensaios de citotoxicidade”, conforme descrito
no Capítulo 10.
• Aspirar ou descartar o meio das células.

• Centrifugar o meio vermelho neutro por 10 min a 600 × g para

remover quaisquer cristais de corante precipitados.
• Obs.: Colocar o meio vermelho neutro em um reservatório.
Fazer isso com cuidado para não ressuspender os cristais
na parte inferior do tubo.
• Adicionar 100 µL de meio vermelho neutro à cada poço da
placa. Incubar a placa por 2 horas nas condições de cultura
apropriadas.
• Obs.: Avaliar as placas em um microscópio invertido para
verificar a possível precipitação do vermelho neutro.
• Retirar o meio vermelho neutro. Lavar as células com 150 µL
de PBS, em seguida, descartar. Adicionar 150 µL da solução
descorante de vermelho neutro (protocolo descrito no
apêndice) em cada poço.
• Agitar a placa rapidamente em um agitador de microplacas
por pelo menos 10 minutos ou até que o vermelho neutro
seja extraído das células e forme uma solução homogênea.
• Realizar a leitura da absorbância a 540 nm em um
espectrofotômetro de leitor de microplacas, utilizando espaços
em branco que não contenham células como referência.

Figura 3 – Metodologia para o ensaio de captação

do vermelho neutro
Legenda: Após incubação com a amostra teste deve-se remover o meio presente
na placa. Em seguida, adicionar 100 µL da solução de vermelho neutro (40 µg mL-
1
) e incubar a placa por 2 horas. Decorrido o tempo de incubação, a placa deve ser
lavada com 150 µL de PBS, seguida da adição de 150 µL da solução descorante
de vermelho neutro. Posteriormente, deve-se manter a placa em agitação por 10
minutos e realizar a leitura da absorbância em espectrofotômetro.

REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 12
ENSAIO DE REDUÇÃO DO MTT

1 INTRODUÇÃO
O ensaio de redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-
il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) é um método colorimétrico que mede
indiretamente a citotoxicidade, proliferação ou viabilidade celular. Este
teste foi inicialmente proposto por Mosmann (1983), sendo considerado
até os dias de hoje como um dos ensaios mais utilizados no mundo
inteiro, devido ao seu bom custo benefício.
Neste capítulo serão apresentados os fundamentos do teste do
MTT bem como a descrição detalhada de um protocolo de execução
desta técnica.
O MTT é um sal de cor amarela e solúvel em água (KUMAR;
NAGARAJAN; UCHIL, 2018). Por ter uma carga residual positiva, essa
molécula é permeável às membranas celulares (STEPANENKO;
DMITRENK, 2015) e, no interior das células viáveis, o MTT é reduzido aos
cristais de formazan, de cor púrpura, insolúveis em água, após clivagem
do anel tetrazólio mediada por enzimas, tais como as desidrogenases
mitocondriais (Figura 1).

Figura 1 – Reação de redução do MTT.

A linha pontilhada na estrutura do MTT formazan
indica o local de clivagem no anel tetrazólio
Fonte: Mittal et al. (2017)
Uma vez solubilizado, o produto formado (formazan) pode ser

quantificado por espectrofotômetro e sua intensidade colorimétrica
é diretamente proporcional ao número de células viáveis (MOSMANN,
1983; SURIN et al., 2017; PASCUA-MAESTRO et al., 2018). A figura 2
demonstra a fundamentação do ensaio do MTT em nível celular.

Figura 2 – Fundamento do ensaio de redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-

2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT)
Legenda: O MTT é um sal de cor amarela permeável às membranas celulares.

A ação enzimática de oxidoredutases, como as desidrogenases mitocondriais,
em células metabolicamente ativas, reduz o MTT aos cristais
de formazan, de cor púrpura.

Nesse ensaio são utilizadas células em fase logarítmica

de crescimento que podem ser incubadas com a amostra teste
por um período de 24 – 72 h, a 37°C em uma atmosfera umidificada
com CO2 a 5%. Ao final do período de incubação, a solução de MTT
é adicionada a cada poço, e a placa é incubada por um período de
3-4 h, para redução do MTT ao formazan (MOSMANN, 1983; ALLEY et
al., 1988; PIETERS et al., 1990; HAYON et al., 2003; KUMAR; NAGARAJAN;
UCHIL, 2018; BARROS et al., 2020; TOKAY et al., 2020).
O formazan deve ser solubilizado para a leitura da absorbância.
Para isso, diversos agentes podem ser usados, tais como o etanol,
o lauril sulfato de sódio (SDS) e o dimetilsulfóxido (DMSO) (TADA et
al., 1986; BAHUGUNA et al., 2017). A quantificação do formazan pode
ser determinada por leitura em comprimento de onda de 570 nm
em leitor de placas de múltiplos poços (leitor de ELISA) (MARKS et
al., 1992; KUMAR; NAGARAJAN; UCHIL, 2018), estando linearmente
associado à atividade enzimática e ao número de células viáveis.
Assim, a alta intensidade da cor púrpura indica maior viabilidade
celular, enquanto a diminuição da intensidade da cor púrpura significa
o número reduzido de células viáveis e, portanto, a citotoxicidade da
amostra teste (BAHUGUNA et al., 2017).
Os valores obtidos da leitura da densidade óptica das células
submetidas ao tratamento com a amostra teste são comparados com
os valores de densidade óptica das células controle não tratadas e os
resultados são apresentados como porcentagem de sobrevivência
celular (HAYON et al., 2003). Vale ressaltar que diferentes linhagens
celulares apresentam diferentes taxas de produção de formazan
(MARKS et al., 1992).
Esse teste é um dos mais utilizados para a avaliação da
citotoxicidade de novos candidatos à fármacos antitumorais
(ŚLIWKA et al., 2016; LIN et al., 2019; LI et al., 2020; ZHU et al., 2020),
apresentando significativa sensibilidade (FOTAKIS; TIMBRELL, 2006),
rapidez (CIAPETTI et al., 1993), precisão e acessibilidade técnica, o

que proporciona um alto rendimento na avaliação da citotoxicidade

de novas amostras (HAYON et al., 2003).
Contudo, algumas desvantagens têm sido observadas no
uso desse ensaio. Por exemplo, pode haver uma diminuição na
produção de formazan mesmo em células viáveis, após modificação
da composição do meio de cultura, como por diminuição na
concentração de D-glicose, NADH ou NADPH. Além disso, tem sido
observado que células em estágios iniciais de apoptose com a
atividade mitocondrial intacta reduzem o MTT ao formazan, o que
pode interferir na legitimidade dos resultados (VISTICA et al., 1991;
VAN DE LOOSDRECHT et al., 1995; HAYON et al., 2003).
3.1 Material
realização do ensaio do MTT:
• Micropipetas e ponteiras de diferentes volumes;
• Leitor de microplacas;
• Agitador de microplacas;
• Dimetilsulfóxido (DMSO);
• Meio de cultivo celular;
• Solução de MTT (5 mg/mL em PBS);
• Solução SDS/HCL 0,01 N.

3.2 Protocolo
A seguir, detalha-se o protocolo para a realização do ensaio do
MTT (Figura 3):
• Proceder com o protocolo de “preparo e tratamento das células

para ensaios de citotoxicidade”, conforme descrito no Capítulo
10. Decorrido o período de incubação com as amostras teste (24
– 72 h), centrifugar a placa (5 min, 500 × g, 25 °C).
• Remover 110 µL do sobrenadante e, ao abrigo de luz, adicionar 10
µL da solução de MTT previamente preparada (5 mg/mL em PBS,
protocolo descrito no apêndice).
• Obs.: Proceder com cuidado para não ressuspender as células
nesta etapa.
• Incubar as placas em estufa (5% CO2, 37 °C) por 3-4h.
• Adicionar 100 µL/poço da solução de SDS/HCl (protocolo descrito
no apêndice).
• Ao abrigo de luz, agitar a placa overnight.
• Realizar leitura da absorbância a 570 nm em um espectrofotômetro
de leitor de microplacas.

Figura 3 – Metodologia para o ensaio de redução do brometo de

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT)
Legenda: Após incubação com a substância teste, a placa deve ser centrifugada
e, em seguida, deve-se remover parte do sobrenadante. Posteriormente, o
MTT deve ser adicionado e a placa incubada por 3-4 h. Decorrido o tempo de
incubação, deve-se adicionar o SDS/HCl, seguido de agitação da placa overnight.
Posteriormente, deve-se realizar a leitura da absorbância em espectrofotômetro

REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 13
ENSAIO DA SULFORODAMINA B
Sâmia Sousa Duarte
1 INTRODUÇÃO
O ensaio da Sulforodamina B foi descrito em 1990 por Skehan
e colaboradores (SKEHAN et al., 1990) e permanece como um dos
principais métodos utilizados atualmente na triagem citotóxica in
vitro de novos compostos (GUPTA et al., 2017; TENG et al., 2018; RAUT
et al., 2018; SAADULLAH et al., 2020). Esta técnica possui bom custo
benefício, podendo ser realizada pela maioria dos laboratórios de cultivo
de células.
Neste capítulo, serão demonstrados os fundamentos do ensaio
de avaliação da viabilidade celular pela Sulforodamina B (SRB), bem
como um passo a passo ilustrativo a respeito desta técnica.
O método colorimétrico descrito tem como princípio a utilização
da Sulforodamina B (C27H30N2O7S2), também conhecida por vermelho
Kiton 620. Trata-se de um corante aminoxanteno aniônico (Figura 1)
de coloração avermelhada, que, sob condições ligeiramente ácidas, é
capaz de se ligar estequiometricamente aos resíduos de aminoácidos
básicos presentes nos constituintes proteicos das células (KUETE;
KARAOSMANOGLU; SIVAS, 2017).

Figura 1 – Estrutura química da Sulforodamina B
Após a ligação com a SRB,as proteínas celulares são

extraídas em meio básico e a quantidade de corante ligado às
células coradas pode ser estimada por espectrofotometria (Figura
2), sendo diretamente proporcional à massa celular e, portanto,
ao número de células presentes na amostra avaliada (ORELLANA;
KASINSKI, 2016). Assim, este ensaio mensura o conteúdo proteico
celular, que é um parâmetro utilizado para inferir indiretamente a
proliferação celular, bem como a citotoxicidade de um composto
(VICHAI; KIRTIKARA, 2006).

Figura 2 – Fundamento do ensaio da Sulforodamina B (SRB)
De maneira geral, o protocolo deste ensaio consiste na

preparação e tratamento prévio das células com as amostras teste,
seguido pela fixação celular com ácido tricloroacético, coloração
com SRB e remoção do excesso de corante não ligado por meio de
lavagens sucessivas das placas tratadas. Finalmente, o corante
ligado é solubilizado em condições básicas e a absorbância da SRB
é mensurada através de um espectrofotômetro (SKEHAN et al., 1990;
VICHAI; KIRTIKARA, 2006; ORELLANA; KASINSKI, 2016).
A SRB é usualmente comparada à outras metodologias
utilizadas para avaliação da citotoxicidade celular, tais com o MTT
(RUBINSTEIN et al., 1990; KEEPERS et al., 1991; VAN TONDER; JOUBERT;
CROMARTY, 2015), apresentando algumas vantagens em comparação a
esta técnica, entre elas: o baixo custo (VOIGT, 2005); a possibilidade de
triagem de drogas em larga escala (VOIGT, 2005); e a maior sensibilidade,
reprodutibilidade e rapidez (HOUGHTON et al., 2007).
Além dessas vantagens, a coloração com SRB raramente sofre
interferência de fatores externos, fornecendo uma maior confiabilidade
dos resultados obtidos. Em contrapartida, como mencionado no Capítulo
12, a conversão do MTT à formazan pode ser influenciada por outros

fatores que não sejam decorrentes da exposição celular às drogas,

havendo a possibilidade da obtenção de resultados não fidedignos
(VICHAI; KIRTIKARA, 2006; VAN TONDER; JOUBERT; CROMARTY, 2015).
Porém, algumas desvantagens também podem ser observadas
com o uso do ensaio da SRB, incluindo: a menor sensibilidade em
células não aderentes (VAN TONDER; JOUBERT; CROMARTY, 2015); a
necessidade de sucessivas etapas de lavagens das células tratadas
(VICHAI; KIRTIKARA, 2006); e o uso de ácido tricloroacético para fixação
celular, que se não utilizado corretamente pode produzir artefatos nas
amostras, alterando os dados (KUETE; KARAOSMANOGLU; SIVAS, 2017).
3.1 Material
A seguir, estão elencados os materiais necessários para a
realização do ensaio da sulforodamina B:
• Leitor de microplacas;
• Ácido tricloroacético (TCA) a 20 %;
• Água destilada;
• Sulforodamina B (SRB) a 0,1%;
• Ácido acético a 1%;
• Tris Base a 10 mM.

3.2 Protocolo
A seguir, detalha-se o protocolo para a realização do ensaio da
sulforodamina B (Figura 3):
• Plaquear as células e incubar por 24 h (conforme descrito

no Capítulo 10).
• Fixar as células do grupo controle negativo com 100 µL de
TCA a 20%, 4 °C,por 30 min.
• Nos demais poços, adicionar 200 µL da amostra teste ou
droga padrão em diferentes concentrações, em triplicata.
• Incubar a placa em estufa (5% CO2, 37 °C) por 48 h.
• Fixar as células com TCA a 20%, 4 °C,por 30 min.
• Lavar os poços com água destilada e deixar a placa secar a
temperatura ambiente.
• Adicionar 50 µL de SRB a 0,1% em ácido acético a 1%, por
30 min.
• Lavar os poços com ácido acético 1% (4 x).
• Deixar a placa secar a temperatura ambiente.
• Adicionar 100 µL de Tris Base (10 mM), para solubilização da
SRB incorporada.
• Realizar leitura da absorbância a 540 nm em um
espectrofotômetro de leitor de microplacas.

Figura 3 – Metodologia para o ensaio da sulforodamina B (SRB)
Legenda: Após incubação por 24 h, as células do grupo controle negativo

devem ser fixadas com TCA a 20%. Em seguida, a amostra teste e a droga
padrão devem ser adicionadas aos poços restantes, seguido da exposição por
48 h em incubadora de CO 2 . Decorrido este período, deve-se fixar as células
tratadas (TCA a 20%), seguido da lavagem com água destilada e secagem
a temperatura ambiente. Posteriormente, deve-se adicionar a SRB e, em
seguida, incubar a placa por 30 minutos. Após esse período, os poços devem
ser lavados com ácido acético, seguido da secagem a temperatura ambiente.
Por fim, deve-se adicionar a cada poço o Tris Base e realizar a leitura da
absorbância em espectrofotômetro (540 nm).

REFERÊNCIAS
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2005, p. 39- 48.

CAPÍTULO 14
ENSAIO DO IODETO DE PROPÍDEO

Sâmia Sousa Duarte
1 INTRODUÇÃO
Há vários anos foi demonstrado que a perda da capacidade de
transporte e da integridade física da membrana plasmática é uma das
características típicas presentes em células mortas, o que permite
diferenciá-las das células viáveis (DARZYNKIEWICZ; LI; GONG, 1994;
HORAN; KAPPLER, 1977).
A marcação com iodeto de propídeo é utilizada principalmente
com o objetivo de mensurar a viabilidade celular, relacionada com a
diminuição da permeabilidade de membrana plasmática, possibilitando
inferir indiretamente o potencial de drogas com atividade citotóxica
(DENGLER et al., 1995; WROBEL et al., 1996)which can be performed
in microtiter plates using a fluorescence plate scanner. The method
is based on the binding of propidium iodide (PI.
Portanto, este capítulo tem como objetivo apresentar a técnica
de incorporação do iodeto de propídeo, para fins de determinação
da viabilidade celular. Para tanto, será apresentado um protocolo
detalhando o passo a passo desta técnica de grande importância.

O iodeto de propídeo (C27H34I2N4) (Figura 1) é uma molécula
fluorescente capaz de se ligar aos ácidos nucleicos (principalmente
DNA), intercalando-se entre pequenas sequências de bases nucleotídicas
(MULLEN, 2004).
Figura 1 – Estrutura química do iodeto de propídeo
De maneira similar à metodologia aplicada com o corante

azul de Tripan (Capítulo 10), o ensaio de incorporação do iodeto de
propídeo tem como fundamento a capacidade de células viáveis serem
impermeáveis a esta sonda, que naturalmente é excluída quando em
contato com a membrana plasmática íntegra. Em contrapartida, células
não viáveis ou em processo de morte celular apresentam perda da
integridade da membrana, permitindo a entrada do corante, que se
intercala ao DNA marcando-o e emitindo alta fluorescência no espectro
vermelho (617 nm) quando excitado por um laser (CROWLEY et al.,
2016a; YANG; XIANG; XU, 2015). Portanto, com o uso desta molécula
fluorescente é possível distinguir seletivamente as células mortas em
amostras por meio do princípio de captação e exclusão do IP (Figura 2).

Figura 2 – Fundamento do ensaio do iodeto de propídeo
Legenda: O iodeto de propídeo é uma molécula fluorescente

que permite avaliar a viabilidade a partir do princípio da integridade da
membrana celular. Ele é excluído ao entrar em contato
com a membrana plasmática intacta de células viáveis.
Em contrapartida, transpõe a membrana rompida de células
não viáveis ou em processo de morte celular, intercalando
em seus ácidos nucleicos e emitindo alta fluorescência,
o que permite distinguir seletivamente as células mortas.
A fluorescência emitida é avaliada por meio de diferentes técnicas,

tais como microscopia de epifluorescência, microscopia confocal de
varredura a laser, espectrofluorimetria ou por citometria de fluxo. Esta
última técnica apresenta uma série de vantagens por fornecer uma
análise precisa, automatizada, rápida e de um maior número de células
por experimento. Dependendo do modelo do equipamento utilizado, os
lasers e fotodetectores dos citômetros de fluxo permitem a leitura das
células coradas com IP em comprimentos de onda que variam entre
300-600 nm de excitação e 600-700 nm de emissão (CROWLEY et al.,
2016a; FRESHNEY, 2010).

O IP pode ser utilizado em associação com outros fluorocromos,

o que permite mensurar parâmetros adicionais em uma população
celular além da viabilidade celular, tais como a diferenciação entre os
diferentes estágios da apoptose, um tipo de morte celular (CROWLEY
et al., 2016b; PIETKIEWICZ; SCHMIDT; LAVRIK, 2015; RICCARDI;
NICOLETTI, 2006).
Devido à propriedade de interagir com ácidos nucleicos o IP
também é aplicado em análises do ciclo celular, permitindo diferenciar as
fases do ciclo a partir da correlação entre a intensidade de fluorescência
celular com a quantificação do conteúdo de DNA (KRISHAN, 1975; MULLEN,
2004; POZAROWSKI; DARZYNKIEWICZ, 2004; SANTOS et al., 2018; SILVA
et al., 2019). Neste caso, as amostras celulares devem ser previamente
preparadas com protocolos especiais, que incluem a utilização de agentes
que permeabilizam a membrana celular (facilitando a entrada do IP na
célula), além do tratamento com enzimas que degradam o RNA, permitindo
que a marcação com o IP seja específica para o DNA (DARZYNKIEWICZ;
BEDNER; SMOLEWSKI, 2001).
O IP é um composto potencialmente cancerígeno, portanto,
deve ser manipulado cuidadosamente, utilizando-se medidas de
biossegurança apropriadas descritas no Capítulo 4.
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1 Material
realização do ensaio do IP:
• Cabine de fluxo laminar ou de segurança biológica;

• Solução de PBS estéril;

• Meio de cultura suplementado;

• Iodeto de Propídeo (solução estoque à 1 mg/mL, protocolo descrito
no apêndice);
• Tubos para citometria;
• Citômetro de fluxo (ou microscópio de fluorescência/confocal
ou fluorímetro).
3.2 Protocolo
A seguir, detalha-se o protocolo para a realização do ensaio
do IP (Figura 3):
• Proceder com o protocolo de “preparo e tratamento das células

para ensaios de citotoxicidade”, conforme descrito no Capítulo 10.
• Obs.: Para este ensaio recomenda-se utilizar uma concentração

de plaqueamento (1×106 células/mL) e volume final da suspensão
celular (500 µL/poço) distintos.
• Decorrido o período de incubação com as amostras teste (24

– 72h), centrifugar a placa (5 min, 500 × g, 25 °C) e descartar o
sobrenadante.
• Lavar e ressuspender as células em PBS estéril. Transferir o
conteúdo para tubos de citometria (ou lâminas de microscopia).
• Obs.: A incubação das células em PBS + albumina sérica bovina
(0,5%) por 30 min pode ser utilizada na recuperação da integridade
de membrana.
• Adicionar 5 µL da solução estoque de IP (1 mg/mL) em 500 µL
da suspensão celular (a concentração final será de 10 μg/mL).

• Incubar as amostras por 15 min, a 25 °C, protegidas da luz.

• Obs.: O IP é fotossensível e o contato com a luz poderá inviabilizar
a leitura.
• Realizar a leitura em 600-700 nm utilizando-se filtros adequados.
Figura 3 – Metodologia do ensaio do iodeto de propídeo
Legenda: Após incubação com a substância teste, a placa deve ser centrifugada e
o sobrenadante removido. Em seguida, ressuspender as células em PBS e transferir
a suspensão para tubos de citometria ou lâminas de microscopia. Adicionar o iodeto
de propídeo (IP) e incubar as amostras por 15 min, à 25 °C, no escuro. A leitura deve
ser realizada em 600 – 700 nm, utilizando filtros/equipamentos adequados.

REFERÊNCIAS
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APÊNDICE
1 PREPARAÇÃO DE TAMPÃO FOSFATO SALINO (PBS)
Material
1. 8 g de Cloreto de Sódio (NaCl)
2. 0,2 g de Cloreto de Potássio (KCl)
3. 1,44 g de Fosfato Dissódico (Na2HPO4)
4. 0,24 g de Fosfato Monopotássico (KH2PO4)
Procedimento
1. Pesar todos os produtos
2. Dissolver em 800 mL de água destilada
3. Ajustar o pH para 7,4
4. Completar 1 L com água destilada
5. Filtrar e autoclavar
2 PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO DE AZUL DE TRIPAN (4%)
Material
1. Azul de Tripan
2. PBS
Procedimento
1. Pesar 0,4g de Azul de Tripan
2. Diluir em 10 mL de PBS
3. Filtrar a solução

3 SOLUÇÃO ESTOQUE DO VERMELHO NEUTRO (4 MG ML-1)
Material
1. Corante vermelho neutro;
2. Solução tampão fosfato (PBS) estéril;
3. Papel alumínio.
Procedimento
1. Pesar 40 mg de corante vermelho neutro;
2. Em fluxo laminar, dissolver o corante vermelho neutro pesado em 10
mL de PBS autoclavado;
3. Armazenar até 2 meses em temperatura ambiente (20-30 °C)
protegida da luz por papel alumínio.
4 SOLUÇÃO DE VERMELHO NEUTRO (40 ΜG ML-1)
Material
1. Solução de estoque do vermelho neutro (4 mg mL-1);
2. Meio de cultura suplementado;
3. Tubo de centrifugação tipo falcon estéril.
Procedimento
1. Em tubos de centrifugação e em condições estéreis, diluir 1:100 da
solução estoque de vermelho neutro com meio de cultura, ou seja, 12
mL de meio mais 0,12 mL da solução estoque por placa;
2. Incubar durante a noite à 37 °C.
OBS.: O meio vermelho neutro deve ser preparado no dia anterior
ao uso.

5 SOLUÇÃO DESCORANTE PARA O TESTE DO VERMELHO NEUTRO

(50% DE ETANOL 96%, 49% DE ÁGUA DEIONIZADA E 1% ÁCIDO
ACÉTICO GLACIAL)
Material
1. Água deionizada;
2. Ácido acético glacial;
3. Etanol a 96%;
Procedimento
1. Preparar 10 mL de água, 10 mL de etanol 96% e 0,2 mL de ácido
acético glacial.
6 SOLUÇÃO DE MTT (5 MG/ML)
Material
1. Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT);
3. Papel alumínio.
Procedimento
1. Pesar 50 mg de MTT;
2. Em fluxo laminar, dissolver o MTT pesado em 10 mL de PBS
autoclavado;
3. Homogenizar bem;
4. Sugestão: Aliquotar o volume preparado em alíquotas de 1 mL em
eppendorfs, envolvidos em papel alumínio para evitar a incidência
de luz (o MTT é fotossensível).
5. Congelar.

7 PREPARAÇÃO SDS/HCL 0,01 N
Material
1. Água destilada;
2. Ácido clorídrico (HCl) a 37%;
3. Dodecil sulfato de sódio (SDS);
Procedimento
1. Adicionar 200 µL de HCl a 37% a 180 mL de água destilada, sob
agitação;
2. Para evitar a formação de espuma, adicionar lentamente 20 g de
SDS a preparação de água destilada/HCl;
3. Após total dissolução do SDS, adicionar água q.s.p 200 mL.
8 PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE TRIPSINA - EDTA (0,25%)
Material
1. Tripsina (0,25 %);
2. EDTA (0,04 %);
Procedimento
1. Pesar a tripsina (0,25 g) e o EDTA (0,04 g);
2. Em fluxo laminar, dissolver os reagentes pesados em 100 mL de
PBS estéril (OBS.: o volume final pode ser alterado conforme as
necessidades experimentais, seguindo a proporção anteriormente
indicada);

3. Homogeneizar bem;
4. Filtrar a solução através de um filtro (0,22 µm) acoplado à seringa;
5. Sugestão: A solução deve ser aliquotada em pequenos
volumes (exemplo: 1 mL), em microtubos do tipo eppendorf.
Preferencialmente, este reagente não deve ser descongelado
e congelado novamente, pois este processo pode alterar sua
atividade;
6. Armazenar no freezer (-20 °C).
9 PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE IODETO DE PROPÍDEO (1 MG/ML)
Material
1. Iodeto de propídeo (IP);

2. Água destilada ou milli-Q;
3. Papel alumínio
Procedimento
6. Pesar 10 mg de IP;
7. Em fluxo laminar, acrescentar 10 mL de água destilada ou milli-Q
(concentração final: 1 mg/mL);
8. Homogeneizar bem e aliquotar em pequenos volumes, em
microtubos tipo eppendorf envolvidos com papel alumínio
(aproximadamente 100 µL/eppendorf);
Obs.: Preferencialmente, este reagente não deve ser descongelado
e congelado novamente, pois este processo pode alterar sua
atividade. Proteger da luz envolvendo os eppendorfs com papel
alumínio, pois o IP é fotossensível.
9. Armazenar no freezer (-20 °C).

GLOSSÁRIO
Absorbância – Também chamada de absorvância, é a capacidade

intrínseca dos materiais em absorver radiações em frequência
específica, usualmente empregada na análise da concentração
de soluções.
Autoclavação – Processo de esterilização feita por vapor saturado
sob pressão de 1 ATM, a 121 °C, destinado a esterilização de materiais
termorresistentes.
Azul de Tripan – Corante diazoderivado da toluidinae solúvel em água,
utilizado em ensaios de avaliação da viabilidade de células.
Biossegurança – Conjunto de ações voltadas para a prevenção e
minimização de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção,
ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços, visando
à saúde do homem, dos animais, à preservação do meio ambiente e à
qualidade dos resultados.
Cabine de segurança biológica – Equipamento que promove um
ambiente asséptico promovendo a proteção tanto dos usuários
quanto das amostras manipuladas e do meio externo, de forma a
renovar 100% do ar, por operar em pressão negativa.
Cabines de fluxo laminar – Equipamento promove um ambiente
asséptico, por recirculação de 100% do ar, criando áreas de trabalho
estéreis para o manuseio de materiais biológicos que não podem
sofrer contaminação do meio externo, garantindo a proteção das
amostras manipuladas.
Câmara de Neubauer – Também conhecida como hemocitômetro,
trata-se uma lâmina de microscopia que contém uma câmara
padronizada para a contagem manual de células.

Células aderentes – Crescem em monocamadas de na superfície do

local de cultivo, dependentes de ancoragem para se proliferarem.
Células em suspensão – Geralmente derivadas de células
hematopoiéticas, crescem em suspensão no meio de cultivo.
Células imortalizadas – Células derivadas da linhagem contínua que
podem se dividir por um grande número de vezes sem perder as suas
características.
Células primárias – Células derivadas da cultura primária com
crescimento finito.
Células transformadas – Células com características tumorais,
devido a transformação de genes que controlam a divisão celular,
provocando a proliferação descontrolada. São morfologicamente
diferentes do tecido original.
Citometria de fluxo – Técnica utilizada para contar, examinar e
classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido
em fluxo.
Confluência – Quantidade de células em crescimento, também
conhecido como densidade celular. Geralmente expresso em %.
Criopreservação – Técnica empregada no cultivo celular que utiliza
baixas temperaturas (menor que -130 °C)visando o armazenamento e
estoque de linhagens celulares.
Crioprotetor – Substância que protege a membrana das células dos
cristaisformados durante o processo de congelamento. Geralmente
utiliza-se DMSO ou glicerol.
Criotubo – Tubo descartável de plástico especializado para o
congelamento de células.
Cultura em 2D – Cultura em que o crescimento das células ocorre em
superfícies planas e sólidas, formando monocamadas em formato
bidimensional (2D).

Cultura em 3D – São modelos de cultura in vitro em que as células

são inseridas em uma matriz de hidrogel, formando multicamadas
tridimensionais, mimetizando o ambiente in vivo.
Cultura primária – Tipo de cultivo celular obtido a partir da
fragmentação ou dissociação mecânica e/ou enzimática de tecidos.
DMEM – Meio de cultura de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s
Modified Eagle Medium).
DMSO – Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo. É um solvente
aprótico e polar bastante utilizado em laboratório e na indústria.
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético, é um composto orgânico
quelante que forma complexos estáveis com diversos íons metálicos,
como Ca2+ e Mg2+.
Espectrofluorometria – Também conhecida porfluorometria, é um tipo
de espectroscopia eletromagnética a qual analisa a fluorescência de
uma amostra.
Esterilização – Processo de destruição ou eliminação total de todos os
microrganismos na forma vegetativa e esporulada, por meio do uso de
agentes físicos ou químicos.
Fase de declínio – Fase do crescimento celular caracterizada pela
redução do número de células viáveis e predominância de células mortas.
Fase de Plateau – Fase do crescimento celular estacionária onde
a cultura se torna mais densa, diminuindo ou interrompendoseu
crescimento.
Fase Lag – Fase do crescimento celular em que as células se
encontram em período de adaptaçãoe de disseminação celular.
Fase Log – Fase do crescimento celular também conhecida como
fase logarítmica ou exponencial, caracterizadapela proliferação
celular exponencial.

Fluorescência – Fenômeno pelo qual uma substância emite luz

quando exposta a radiações, transformam-se em luz visível.
Hemocitômetro – Também conhecido comoCâmara de Neubauer,
trata-se uma lâmina de microscopia que contém uma câmara
padronizada para a contagem manual de células.
HEPES – Tampão orgânico, ácido etanosulfônico 4-2 hidroxietil
piperazina-1).
Incubadora de CO2 – Equipamento essencial da cultura de células,
por permitir o controle da temperatura e tensão de CO2 no ambiente.
Iodeto de propídeo – Molécula fluorescente capaz de se ligar aos
ácidos nucleicos de células com baixa viabilidade celular e assim
utilizado em ensaios de citotoxicidade.
Linhagem celular contínua ou imortalizada – Tipo de cultivo celular
com alta capacidade proliferativa e poucas características do seu
tecido de origem.
Meio completo – Meio de cultura suplementado por soro,
geralmente SBF.
Meio de cultura – Veículo líquido que contém os nutrientes
necessários para o crescimento, divisão e multiplicação celular.
Meio incompleto – Meio de cultura desprovido de suplementação.
MEM – Meio essencial de Eagle (Minimum Essential Medium Eagle).
Microplaca – Placa descartável de plástico de fundo plano, cônico ou
côncavo, que permite a divisão de soluções ou células em cultura em
poços de número variado.
Microscopia confocal – Técnica utilizada para aumentar o contraste da
imagem microscópica e construir imagens tridimensionais através da
utilização de um orifício de abertura, pinhole, que permite uma grande
definição de imagem em amostras mais espessas que o plano focal.

Microtubo – Tubo descartável de plástico utilizado no transporte e

armazenamento de soluções em pequeno volume, conhecido como
tubo “tipo” Eppendorf.
MTT – Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT),
reagente utilizado em ensaios de avaliação da viabilidade celular.
NaHCO3 – Sal inorgânico bicarbonato de sódio, utilizado como tampão
em cultura.
Passagem – Processo de renovação de uma cultura celular, ao passá-
las de uma garrafa para outra. Também conhecida como repique.
PBS – Solução tampão fosfato, bastante utilizada em procedimentos
de cultivo de células.
Plaqueamento – Técnica de transferência de células ou soluções em
microplacas.
Repique – Processo de renovação de uma cultura celular, ao passa-
las de uma garrafa para outra. Também conhecida como passagem.
Ressuspender – Método de suspender o pellet de células após
centrifugação.
RPMI 1640 – Meio de cultivo elaborado no Roswell Park Memorial
Institute, rico em vitaminas e glutationa.
Soro bovino fetal (SBF) – Soro utilizado na complementação dos
meios de cultivo, rico em fatores de crescimento e de adesão celular.
Sulforodamina B – Também conhecida por vermelho Kiton 620,
trata-se de um corante aminoxanteno aniônico capaz de se ligar
a proteínas intracelulares e assim utilizado na determinação da
Tampões – Substâncias orgânicas ou inorgânicas com a finalidade de
evitar a variação significativa do pH em uma determinada solução.

Tripsina – Enzima proteolítica inespecífica utilizada na dissociação

celular, por meio de hidrólise de cadeias polipeptídicas,
desestruturando a matriz e impossibilitando a ligação dos receptores
da superfície celular.
Tripsinizar – Prática de uso de tripsina para a colheita de células
aderentes em uma garrafa ou placa de cultura.
Tubo “tipo” Falcon – Tubo descartável de plástico de fundo cônico,
utilizado no transporte e armazenamento de soluções.
Vermelho neutro – Corante vital bastante utilizado na avaliação da

SOBRE OS ORGANIZADORES
JUAN CARLOS RAMOS GONÇALVES

http://lattes.cnpq.br/0104934558803330
Professor Doutor da Universidade Federal da Paraíba.
E-mail: goncalvesjcr@ccs.ufpb.br
Doutor em Farmacologia de Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos

(PgPNSB) pela UFPB com período sanduíche na UWO/Canadá (Robarts
Reserch Institute) (2011). Possui título de Mestre pelo PgPNSB (2008) e
Graduação em Farmácia – Bioquímica pela UFPB (2006). Atualmente é
Professor Adjunto do Departamento de Ciências Farmacêuticas (DCF/
CCS) da UFPB, ministrando as disciplinas Citologia Clínica, Imunologia
Clínica e Virologia. Realiza atividades de pesquisa junto ao Laboratório
de Oncofarmacologia (OncoFar) do Instituto de Pesquisa em Fármacos
e Medicamentos (IPeFarM/UFPB), atuando em projetos envolvendo a
prospecção de novas drogas antitumorais derivadas de plantas e seus
derivados sintéticos. Tem experiência nas seguintes áreas: Farmacologia,
Biologia Celular e Molecular, e Biotecnologia.
MARIANNA VIEIRA SOBRAL

http://lattes.cnpq.br/1036684849301560
Professora Doutora da Universidade Federal da Paraíba.
E-mail: mariannavbs@gmail.com
Graduada em Farmácia pela Universidade Federal da Paraíba/UFPB (2003).

Doutorado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pela UFPB na área
de concentração Farmacologia (2007). Professora associada da UFPB,
vinculada ao Departamento de Ciências Farmacêuticas (DCF) do Centro
de Ciências da Saúde (CCS), atualmente responsável pelas disciplinas
Farmacoterapia, Estágio de Vivência em Farmácia Hospitalar e Estágio

Sobre os organizadores
Supervisionado em Farmácia. Docente permanente do Programa de Pós-

Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (PPgPNSB/CCS/
UFPB) na área de concentração Farmacologia. Atualmente coordena o
Laboratório de OncoFarmacologia (OncoFar), onde desenvolve atividades
de pesquisa nos seguintes temas: farmacologia e toxicologia não clínica,
produtos naturais e sintéticos com potencial antitumoral, modelo in vitro
e in vivo na prospecção de drogas antitumorais.

SOBRE OS AUTORES
ana.lopes0407@gmail.com
Farmacêutica pela Universidade Federal da Paraíba (2018) atualmente
Mestranda no Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde/UFPB, onde atua
desde à iniciação científica nas áreas de farmacologia de produtos naturais
e sintéticos bioativos, com foco na avaliação da toxicidade não-clínica,
citotoxicidade e atividade antitumoral desenvolvidas no laboratório de
OncoFarmacologia/ UFPB.

anapaulagomesm@hotmail.com
Possui graduação em Farmácia pela Universidade Federal da Paraíba (2007),
habilitação em Análises Clínicas pela Universidade Federal da Paraíba
(2009), Especialização em Farmacologia e Dispensação Farmacêutica (2012),
Especialização em Gestão da Assistência Farmacêutica pela Universidade
Federal de Santa Catarina (2012), Mestrado (2012) e Doutorado (2017) em
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pela Universidade Federal da
Paraíba, tem experiência na área de Farmácia, com ênfase em Farmacologia,
Toxicologia, Oncologia e Biossegurança.

camyla.andrade03@gmail.com
Farmacêutica pela Universidade Federal da Paraíba (2018). Atualmente
Mestranda no Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos do Centro de Ciências da Saúde/UFPB, área de concentração
Farmacologia, com ênfase nos seguintes temas: produtos naturais e sintéticos
bioativos, citotoxicidade e atividade antitumoral, realizados no Laboratório

Sobre os autores
de OncoFarmacologia (OncoFar), do Instituto de Pesquisa em Fármacos e

Medicamentos (IPeFarM/UFPB). Tem experiência nas áreas de farmacologia
de produtos naturais e sintéticos bioativos, avaliação da toxicidade não-
clínica, citotoxicidade e atividade antitumoral.

daiana.frade@gmail.com
Graduada em Ciências Biológicas (licenciatura) pela Universidade Federal
da Paraíba (2014), com Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2016) e
Doutorado em Farmacologia (2020) pela mesma instituição. Tem experiência
em Biologia e Fisiologia Celular, Parasitologia e Oncofarmacologia.

goncalvesjcr@ccs.ufpb.br
Doutor em Farmacologia de Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (PgPNSB)
pela Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e Graduação em Farmácia –
Bioquímica pela UFPB. Atualmente é Professor Adjunto do Departamento
de Ciências Farmacêuticas (DCF/CCS) da UFPB onde realiza pesquisa na
área de Oncofarmacologia.

mariannavbs@gmail.com
Graduada em Farmácia pela Universidade Federal da Paraíba/ UFPB (2003),
Doutorado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pela UFPB (2007), na
área de concentração Farmacologia. Atualmente professora associada do
Departamento de Ciências Farmacêuticas (DCF/CCS), membro do Programa
de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (PPgPNSB)
e coordenadorado Laboratório de OncoFarmacologia (OncoFar).

micheline.donato@gmail.com
Bióloga, licenciada e bacharel pela UFPB. Mestra em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos – Farmacologia pela PGPNSB/ CCS/UFPB. Doutora em

Sobre os autores
Ciências-Fisiologia pela PGFisFar/ UFMG). Pós-doutora em Drug Discovery

pela Universityof Nottingham-UK. Atualmente é Professora Visitante da Pós-
graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos DCF-UFPB. Atuou
como Pesquisadora Visitante da Fundação Ezequiel Dias (FUNED/MG) e
como analista de Propriedade Intelectual no Núcleo de Inovação Tecnológica
CTIT/UFMG. Trabalha com farmacologia de produtos naturais desde 2002.
Atualmente suas linhas de pesquisa estão focadas em Toxicologia não-
clínica in vitro e in vivo, Toxinologia e Farmacologia Molecular de produtos
naturais de plantas, toxinas e derivados na bioprospecção de fármacos com
alvo nos sistemas glutamatérgico e canabinoide.

rafaelcarlos@ltf.ufpb.br
Farmacêutico pela Universidade Federal da Paraíba (UFPB) (2017). Mestre
(2019) e doutorando em farmacologia de Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos (Centro de Ciências da Saúde/UFPB). Tem experiência no estudo
da toxicidade e potencial antitumoral de produtos naturais e sintéticos.

rawny_gg@hotmail.com
Possui graduação em Farmácia pela Universidade Estadual da Paraíba
(2015), é Mestre em Ciências Farmacêuticas pelo Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual da
Paraíba com ênfase na área de Síntese e Planejamento de Fármacos
(2017). Desenvolveu pesquisa nos seguintes temas: Câncer, derivados
de acridina com atividade antiproliferativa, intercaladores do DNA,
inibidores das enzimas topoisomerases. Atualmente é Doutorando do
Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
da Universidade Federal da Paraíba na área de Farmacologia com ênfase
em Oncofarmacologia.

Sobre os autores
Sâmia Sousa Duarte

samiasduarte@gmail.com
Possui graduação em Ciências Biológicas, na habilitação bacharelado (2013)
e Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2016), ambos pela Universidade
Federal da Paraíba (UFPB). Atualmente é doutoranda no Programa de Pós-
Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências
da Saúde/UFPB, na área de concentração Farmacologia, onde atua na
avaliação da atividade citotóxica e antitumoral de novas moléculas sintéticas.
Tem experiência nas áreas de biologia celular, parasitologia e farmacologia
de produtos naturais e sintéticos (com ênfase nos seguintes temas: avaliação
da toxicidade não-clínica, citotoxicidade e atividade antitumoral).

thaismangeon@gmail.com
Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal da
Paraíba (2014), mestrado em Biologia Celular e Molecular (2016) e Doutorado
em Farmacologia (2020) pela mesma instituição. Tem experiência na área
de Biologia Celular e Oncofarmacologia.

valgricia_@hotmail.com
Farmacêutica pela Universidade Federal da Paraíba (2017), Mestra em
Farmacologia de Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (PgPNSB) pela
UFPB (2020) com ênfase nas áreas de Farmacologia e Toxicologia. Atualmente
Doutoranda no PgPNSB na mesma instituição, atuando nos seguintes temas:
produtos naturais e sintéticos bioativos, citotoxicidade e atividade antitumoral,
realizando pesquisa no Laboratório de Oncofarmacologia (OncoFar), do
Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos (IPeFarM/UFPB). Tem
experiência em Farmacologia, Biologia Celular e Bioquímica.

Este livro foi diagramado pela Editora
UFPB em 2020, utilizando as fontes
D-DIN, DINPro e D-DIN Condensed.
Guia básico e atualizado sobre
as principais técnicas envolvendo
o cultivo celular e as rotinas
determinantes para o bom
desempenho de um laboratório
de cultura de células.

669-6. EDU - DIAG - Ebook Finalizado-7054-1-10-20210125

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Juan Carlos Ramos Gonçalves

Marianna Vieira Sobral

Conselho editorial Adailson Pereira de Souza (Ciências Agrárias)

Conselho científico Maria Aurora Cuevas-Cerveró (Universidad Complutense Madrid/ES)

Projeto Gráfico Editora UFPB

C968 Cultivo de células: da teoria à bancada / Juan Carlos Ramos

Recurso digital (5,88 MB)

1. Biologia celular e molecular. 2. Cultivo celular. 3. Cultura

UFPB/BC CDU 576+577.2

Livro aprovado para publicação através do Edital Nº 01/2020/Editora Universitária/

EDITORA UFPB Cidade Universitária, Campus I, Prédio da editora Universitária, s/n

À Universidade Federal da Paraíba e a todos que contribuíram,

A evolução na área da biologia celular e molecular tem

CAPÍTULO 2 – TIPOS DE CULTURAS CELULARES.............................20

CAPÍTULO 3 – O LABORATÓRIO DE CULTIVO CELULAR.......................33

CAPÍTULO 4 – PRINCÍPIOS DE BIOSSEGURANÇA............................ 44

CAPÍTULO 5 – MEIOS DE CULTIVO CELULAR..................................... 64

CAPÍTULO 7 – PROPAGAÇÃO DAS CULTURAS.................................... 81

CAPÍTULO 8 – CONTAGEM DE CÉLULAS..............................................87

CAPÍTULO 10 – INTRODUÇÃO À AVALIAÇÃO

CAPÍTULO 11 – ENSAIO DE CAPTAÇÃO DO VERMELHO NEUTRO.......114

CAPÍTULO 12 – ENSAIO DE REDUÇÃO DO MTT.................................123

CAPÍTULO 13 – ENSAIO DA SULFORODAMINA B.............................133

CAPÍTULO 14 – ENSAIO DO IODETO DE PROPÍDEO...........................141

Neste capítulo, serão abordados os aspectos fundamentais do

2 CULTIVO DE CÉLULAS: BREVE HISTÓRICO

pesquisador francês, cultivaram tecidos embrionários de cães adultos,

A partir de então, muitas descobertas foram feitas por

3 O CRESCIMENTO CELULAR EM LABORATÓRIO

As células em cultura possuem um padrão de crescimento

Figura 1 – Curva de crescimento padrão de células em cultura

Fonte: Acervo particular do autor.

Legenda: Na fase Lag as células apresentam um período de adaptação à cultura;

A curva de crescimento de células em cultura é dividida nas

3.1 Fase Lag

na garrafa de cultivo (para as células aderentes) e de disseminação

3.2 Fase Log

3.3 Fase estacionária ou Plateau

3.4 Fase de declínio ou fase de morte celular

4 APLICAÇÕES MÉDICAS E BIOTECNOLÓGICAS

celulares, o desenvolvimento de incubadoras cada vez mais sofisticadas

TIPOS DE CULTURAS CELULARES

das células transformadas. Ainda, serão apresentados termos clássicos,

Além destes, vários tipos de cultura primária provenientes de

Quadro 1 – Exemplos de linhagens celulares e suas características

HEK-293 Homo sapiens rim embrionário normal aderente

MRC5 Homo sapiens pulmão normal aderente

O processo de morte celular controlada (apoptose) ocorre

linhagem é bastante utilizada em experimentos envolvendo a expressão

4 CÉLULAS ADERENTES E EM SUSPENSÃO

Figura 1 – Exemplo de linhagem celular aderente. Linhagem SK-MEL-28 derivada

Fonte: Acervo particular do autor

Figura 2 – Exemplo de linhagem celular não aderente. Linhagem K562 derivada de

Fonte: Acervo particular do autor

Devido às diferenças entre estes tipos celulares, as garrafas de

5 CULTIVO CELULAR TRIDIMENSIONAL (3D)

uniforme, uma vez que um dos lados se encontra aderido à superfície

Quadro 2: Cultura de células 3D: vantagens e limitações

Vantagens Monitoramento do número de células; Viabilidade;