Apoptose

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ISABEL CRISTINA OLIVEIRA DE MORAIS
EFEITO NEFROTÓXICO DIRETO INDUZIDO PELA FRAÇÃO
L-AMINOÁCIDO OXIDASE ISOLADA DO VENENO DA SERPENTE

Bothrops leucurus.
ORIENTADORA: ALICE MARIA COSTA MARTINS
Fortaleza
2015
ISABEL CRISTINA OLIVEIRA DE MORAIS
EFEITO NEFROTÓXICO DIRETO INDUZIDO PELA FRAÇÃO
L-AMINOÁCIDO OXIDASE ISOLADA DO VENENO DA SERPENTE

Bothrops leucurus.
Tese de doutorado apresentada à Coordenação do

Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará como requisito parcial
para obtenção do título de doutor em Farmacologia.
ORIENTADORA: ALICE MARIA COSTA MARTINS
Fortaleza
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
M825e Morais, Isabel Cristina Oliveira de.
Efeito nefrotóxico direto induzido pela fração l-aminoácido oxidase

isolada do veneno da serpente Bothrops leucurus/ Isabel Cristina Oliveira
de Morais. – 2015.
96 f. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de

Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza,
2015.
Área de concentração: Farmacologia.
Orientação: Profa. Dra. Alice Maria Costa Martins.
1. Nefropatias. 2. Toxicidade. 3. Apoptose. 4. L-Aminoácido Oxidase. I. Título.
CDD 615.1
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Socorro e Vicente.

À minha irmã Vilmara e ao meu sobrinho Nathan.
AGRADECIMENTOS
À Deus que guia e protege minha vida, pelas oportunidades e conquistas. Por
me dar força e coragem para enfrentar os momentos difíceis.
Aos meus pais (Socorro e Vicente), minha Irmã (Vilmara) e a toda minha
família por todo o amor, apoio, educação, exemplo, confiança e incentivo durante
minha vida.
À Professora Dra. Alice Maria Costa Martins, pela orientação, exemplo,

dedicação e incentivo à pesquisa.
À Enrique Pérez Payá (in memoriam) e Mar Orzáez Cataluyad por terem me
aceitado no laboratório de Peptídeos e Proteínas e por tudo que fizeram para meu
aprendizado como pesquisadora e para melhorar este trabalho.
Aos meus grandes amigos Roberta Jeane, Sonnara Correia, Gustavo Pereira,
Aline Marinho, Dânya Bandeira, Melca Amanda, Mary Sandra e Jennifer Cabral pela
força no dia a dia, pelas confidências, cumplicidade e amizade. Espero tê-los para
sempre em minha vida.
As amigas Roberta Jeane, Larissa Gonçalves e Janaina Serra Azul pela

amizade e companheirismo durante o período do doutorado sanduíche na Espanha.
Aos amigos do Laboratório de Nefrologia e Doenças Tropicais (LNDT):

Ramon Róseo, Tiago Sampaio, Dânya Bandeira, Clarissa Perdigão, Louise
Tessarolo, Jáder Canuto, Lívia Fernandes, Gabriela Freire, Gdaylon Cavalcante,
Marcus Felipe, Ticiana Praciano, Alba Fabíola e Rodrigo Tavares, pela ajuda nos
experimentos, a amizade e o excelente convívio.
A todos os amigos do Grupo de Pesquisa de Sinalização e Morte Celular por

me proporcionarem um ambiente de trabalho maravilhoso, pelo apoio, amizade e
profissionalismo. Em especial a Soraya Soubhi Smaili por sempre ter me recebido
em seu grupo de pesquisa, a Gustavo Pereira e Hanako Hirata pela amizade e
ajudas científicas.
Aos amigos do Laboratório de Farmacologia de Venenos e Toxinas
(LAFAVET). Em especial a Dra Helena Serra Azul Monteiro, Roberta Jeane, Rafael
Jorge, Natacha Tereza, Aline Marinho, João Vitor, Adelvane e Antônio Neto.
A todos do laboratório de Peptídeos e Proteínas e do Centro de Investigação

Príncipe Felipe, pelo acolhimento e pela excelente assistência científica e técnica.
Em especial a Tatiana Guevara, Vicente Andreu, Guillermo Garcia e Cristina
Paredes.
À Banca examinadora, pelo aceite ao convite.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pelo auxílio financeiro concedido na forma de bolsa de doutorado para parte
realizada no país e para parte desenvolvida na Espanha.
À todos os professores que tive nessa longa jornada, que construíram passo
a passo o conhecimento que hoje detenho. Obrigada pela dedicação, amor e
competência.
Agradeço a todos que contribuíram de maneira direta ou indireta em minha

formação.
À todos meus sinceros agradecimentos.

“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se
chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence
obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.”
José de Alencar
“La mejor recompensa que puede tener un científico es ver que su

trabajo, y el de toda la gente que trabaja con él, pueda devolver a la
sociedad esa inversión que hace con nosotros o si pudiéramos mejorar,
al menos un poco, la salud de las personas. "
Enrique Pérez Payá

RESUMO
A Bothrops leucurus (jararaca do rabo branco) é uma serpente peçonhenta que

habita a região Nordeste do Brasil. Os efeitos biológicos devido ao envenenamento
por B. leucurus têm perfil semelhante àqueles apresentados por outras serpentes do
gênero Bothrops, tais como, importantes efeitos locais e sistêmicos graves como a
Insuficiência Renal Aguda (IRA). O veneno de Bothrops leucurus induziu
nefrotoxicidade em sistema de perfusão de rim isolado de rato, associado com
citotoxicidade em células tubulares epiteliais renais. Neste trabalho foi avaliado o
efeito nefrotóxico direto da enzima L-aminoácido oxidase isolada do veneno de
Bothrops leucurus (LAAO-Bl) sobre células epiteliais renais (MDCK e HK2) e o seu
potencial nefrotóxico em rim isolado de rato. O tratamento com LAAO-Bl, 1.56 – 100
µg/mL induziu significativa morte celular de maneira concentração dependente em
ambas às linhagens celulares após 12 horas de tratamento. Nas células MDCK não
foi observada liberação de LDH após 12 horas de exposição à LAAO-Bl, enquanto
nas células HK2 LAAO-Bl induziu ruptura de membrana nas maiores concentrações
estudadas quando comparado ao controle não tratado. Nas células MDCK o
tratamento com LAAO-Bl aumentou significativamente a porcentagem de células em
apoptose (Anexina-V+, IP-), necrose (Anexina-V-, IP+) e necrose secundária
(Anexina-V+, IP+). Nas células HK2 LAAO-Bl induziu um aumento na porcentagem
de células em necrose (IP+) e necrose secundária (Anexina-V+, IP+) de maneira
concentração dependente. A indução de apoptose nas células MDCK foi
acompanhada de liberação de Ca2+ do retículo endoplasmático, aumento de
espécies reativas de oxigênio, disfunção mitocondrial e aumento de expressão de
Bax. O tratamento com LAAO-Bl induziu ativação de caspase 3 e 7 em ambas as
linhagens celulares. LAAO-Bl (10 µg/mL) exerce efeitos significativos no rim isolado
de rato aumentando a pressão de perfusão e o fluxo urinário e diminuindo a taxa de
filtração glomerular e os transportes tubulares de sódio, potássio e cloreto. Os
nossos resultados sugerem que LAAO-Bl contribui para nefrotoxicidade observada
no envenenamento por Bothorps leucurus. Além disso, os efeitos citotóxicos de
LAAO-Bl nas células epiteliais renais podem ser responsáveis, pelo menos em parte,
pela nefrotoxicidade observada no rim isolado.
Palavras-chave: Nefropatias; Toxicidade; Apoptose; L-Aminoácido Oxidase

ABSTRACT
Title: Effect direct nephrotoxic induced by L-aminoacid oxidase isolated of Bothrops
leucurus venom
The pit viper Bothrops leucurus (White-tailed-jararaca) is a poisonous snake

habituating area in the northeast of Brazil. The biological effects due envenomation
have similar profile than those observed with other Bothrops, such as important
severe local and systemic effects such as Acute Renal Failure (ARF). Bothrops
leucurus venom induces nephrotoxicity in the isolated perfused kidney of rats
associated with cytotoxicity against renal tubular epithelia cells. In this study, it was
evaluated the direct nefrotoxicity of L-aminoacid oxidase isolated of B. leucurus
venom (LAAO-Bl) on renal epithelial cells (MDCK and HK2) and their potential
nephrotoxic in isolated rat kidney. In these cells treated with LAAO-Bl, 1.56 – 100
µg/mL for 12 h, there was a decrease in their viability in a concentration-dependent
manner after 12 hours of treatment. In MDCK cells LDH release was not observed
after 12 h of LAAO-Bl exposure while LAAO-Bl induced membrane rupture in HK-2
cells at the highest concentrations studied when compared with untreated cells. In
MDCK cells, LAAO-Bl significantly increased the percentage of early apoptotic
(Annexin-V+, PI-), necrotic (Annexin-V-, PI+) and secondary necrotic cells (Annexin-
V+, PI+) when compared with control untreated cells. In HK-2 cells LAAO-Bl induced
an increase in necrotic (PI+ cells) and secondary necrotic cells (Annexin-V+, PI+) in a
concentration-dependent manner. MDCK apoptosis induction was accompanied with
Ca2+ release from the endoplasmic reticulum, reactive oxygen species (ROS)
generation, mitochondria dysfunction with enhanced expression of Bax protein levels.
LAAO-Bl induced caspase-3 and caspase-7 activation in both cell lines. LAAO-Bl (10
µg/mL) exerts significant effects on the isolated kidney perfusion increasing perfusion
pressure and urinary flow and decreasing the glomerular filtration rate and sodium,
potassium and chloride tubular transport. Taken together our results suggest that
LAAO-Bl contributes for the nephrotoxicity observed in the envenomation by
Bothrops leucurus. Moreover, the cytotoxic of LAAO-Bl to renal epithelial cells might
be responsible, least in part for the nephrotoxicity observed in isolated kidney.
Keywords: Nephropathy; Toxicity, Apoptosis, L- aminoacid oxidase.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
[Ca2+]c - concentração citoplasmática de íons cálcio

2-APB - Borato de 2-Aminoetoxidifenil
Ac-DEVD-AFC - Acetil-Asp-Glu-Val-Asp- 7-amino-trifluorometil-coumarina
AM - acetoximetil éster
AnnV - Anexina V
APAF-1 - Fator de Ativação Associado a apoptose-1
BSA - albumina sérica bovina
Ca2+ - íon cálcio
CAT - catalase
DCFH-DA - 2,7diclorodiidrofluoresceina diacetato
DISC - Disc Inducing Sinaling Complex
DMEM - Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DMSO - Dimetilsulfóxido
DOXO - Doxorrubicina
DR - Death Receptors
DTT - Ditiotreitol
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-Ácético
EGTA - Ácido Etileno Glicol Tetracético
EROS - Espécies Reativas de Oxigênio
FCCP - Carbonilcianeto-p-tri fluorometoxifenilhidrazon
FU - Fluxo Urinário
HK2 - Human Kidney 2
IP - Iodeto de propídeo
IP3R - Receptor de trifosfato de inositol
IRA - Insuficiência Renal Aguda
LAAO - L- aminoácido oxidase
LAAO- Bl - LAAO isolada de Bothrops leucurus
LDH - Lactato desidrogenase
MDCK - Madin-Darby Canine Kidney
MS - Ministério da Saúde
MTT - 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H
OMS - Organização Mundial de Saúde
%TCl - Percentual de cloreto transportado
%TK+ - Percentual de potássio transportado
%TNa+ - Percentual de sódio transportado
PMSF - fluoreto de fenilmetilsulfonio
PP - pressão de perfusão
PS - fosfatidilserina
RE - Retículo Endoplamático
RFG - Ritmo de Filtração Glomerular
rTNF - Receptor de fator de necrose tumoral
RVR - Resistência Vascular Renal
RyR - Receptor de rianodina
SBF - Soro Bofino Fetal
SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
SERCA - Ca2+-ATPase do retículo endoplasmático
SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação
svLAAO - L- aminoácido oxidase isolada de veneno de serpente
svMPS - Metaloproteinases isoladas de venenos de serpentes
svPLA2 - Fosfolipase isolada de venenos de serpente
TAP - tapsigargina
t-BHP - Tert-Butilhidroperóxido
TMRE - Tetramethylrhodamine ethyl ester
ΔΨm - potencial de membrana mitocondrial
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Bothrops leucurus 21

Figura 2: Distribuição geográfica da serpente Bothrops leucurus 22
Figura 3: Composição química do veneno botrópico 23
Figura 4: Fisiopatologia dos efeitos renais induzidos pelo veneno botrópico e 28
suas toxinas
Figura 5: Vias de sinalização da apoptose 31
Figura 6: Esquema da ação de componentes de peçonhas ofídicas na morte 32
celular apoptótica
Figura 7: Esquema do ensaio do MTT 42
Figura 8: Esquema do ensaio de LDH 43
Figura 9: Esquema do ensaio de marcação com Anexina V/PI 44
Figura 10: Esquema da medida de variação de Ca2+ intracelular 47
Figura 11: Foto do sistema de perfusão de rim isolado 53
Figura 12: Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado 53
Figura 13: Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durante a 54
calibração do sistema (n = 6)
Figura 14: Valores registrados pelo fluxômetro (L/min) durante a calibração 54
do sistema (n=6)
Figura 15: Valores de volume urinário (mL/min) registrados durante a 55
calibração do sistema (n = 6)
Figura 16: Fotografia do rim de rato isolado no sistema de perfusão 56
Figura 17: Efeito da LAAO-Bl sobre a viabilidade de células tubulares renais 61
Figura 18: Efeito da LAAO-Bl sobre a liberação da enzima lactato 62
desidrogenase (LDH)
Figura 19: Análise do tipo de morte celular por citometria de fluxo 63
Figura 20: Medida do ΔΨm nas células MDCK 64
Figura 21: Efeito da LAAO-Bl na mobilização de cálcio citosólico nas células 66
MDCK
Figura 22: Determinação do aumento intracelular de ROS nas células MDCK 67
Figura 23: Avaliação da ativação de caspases executores 69
Figura 24: Western blotting das proteínas envolvidas na morte celular por
70
apoptose
Figura 25: Efeito da LAAO-Bl na liberação de citocromo c no citosol nas 71
células HK2
Figura 26: Efeitos da LAAO-Bl em rim isolado de rato 73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estudos de nefrotoxidade direta com venenos de Bothrops no 57

modelo de perfusão de rim isolado de rato.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 19
1.1 Gênero Bothrops e Bothropoides 19
1.1.1 Bothrops leucurus 21
1.1.1.1 Distribuição geográfico- epidemiológica 22
1.2 Veneno botrópico 23
1.2.1 Composição química 23
1.2.2 Efeitos tóxicos 26
1.2.2.1 Insuficiência Renal Aguda (IRA) 27
1.2.2.1.1 Nefrotoxicidade direta induzida pelo veneno botrópico e seus 29
componentes
2. JUSTIFICATIVA 36
3. OBJETIVOS 38
3.1 Objetivo Geral 38
3.2 Objetivos específicos 38
4. MATERIAIS E MÉTODOS 40
4.1 Materiais 40
4.1.1 Obtenção de LAAO-Bl 40
4.2 Linhagens Celulares 40
4.2.1 Cultivo das linhagens celulares 41
4.3 Estudo da atividade citotóxica in vitro 41
4.3.1 Ensaio com MTT 41
4.3.1.1 Princípio do método 41
4.3.2 Ensaio de atividade da enzima Lactato desidrogenase (LDH) 42
4.3.2.1 Princípio do método 42
4.4 Detecção de células apoptóticas e necróticas por marcação com 44
Anexina V/Iodeto de propídeo
4.4.1 Princípio do método 44
4.5 Medida do potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm) 45
4.6 Medidas da variação do Ca2+ intracelular 46
4.7 Geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROS) 48
4.8 Ensaio de ativação da caspase 3 e 7 49
4.9 Análise de proteínas por western blott 50
4.9.1 Extratos proteicos totais 50
4.9.2 Eletroforese das proteínas em SDS-PAGE 50
4.9.3 Imunodetecção de proteínas (Western blot) 51
4.10 Ensaio de liberação de citocromo c 51
4.11 Perfusão de rim isolado 52
4.11.1 Animais 52
4.11.2 Sistema utilizado 52
4.11.2.1 Calibração do sistema 53
4.11.3 Análises bioquímicas 57
4.11.4 Cálculo dos parâmetros funcionais renais 57
4.12 Análise estatística 58
4.13 Comitê de Ética 59
5. RESULTADOS 61
5.1 Efeito da LAAO-Bl sobre a viabilidade das células tubulares renais 61
(MDCK e HK2).
5.2 Efeito da LAAO-Bl sobre a liberação da enzima lactato desidrogenase 61
(LDH).
5.3 Análise do tipo de morte celular por citometria de fluxo 62
5.4 Efeito da LAAO-Bl sobre o potencial de membrana mitocondrial nas 63
células MDCK
5.5 Efeito da LAAO-Bl na mobilização de cálcio citosólico nas células 65
MDCK
5.6 Estresse oxidativo induzido por LAAO-Bl nas células MDCK 66
5.7 Avaliação da ativação de caspases executores do processo de morte 68
celular por apoptose
5.8 Avaliação da liberação de citocromo c induzido por LAAO-Bl nas 71
células HK2
5.9 Efeitos da LAAO-Bl em rim isolado de rato 72
6. DISCUSSÃO 76
7. CONCLUSÕES 84
REFERÊNCIAS 86
INTRODUÇÃO
19
1. INTRODUÇÃO
Envenenamento por serpentes, reconhecido como uma doença tropical

negligenciada pela Organização Mundial de Saúde (OMS), constitui um importante
problema de saúde pública, particularmente em áreas rurais de países tropicais
como África, Ásia e América Latina (WHO, 2009; MARTINES et al ., 2014). Dentre
os países da América do Sul o Brasil é o país com o maior número de acidentes com
aproximadamente 20.000 casos notificados por ano e uma taxa de letalidade de
0,45% (LEITE et al., 2013). De acordo com os dados do Sistema de Informação de
Agravos de Notificação (SINAN) do ministério da Saúde (MS) ocorreram nos anos de
2000 a 2013, mais de 360.506 casos de acidentes por serpentes no Brasil,
resultando em 1.487 óbitos (BRASIL, 2013).
O Brasil possui uma vasta fauna ofídica totalizando 381 espécies, distribuídas
em 10 famílias e 75 gêneros. Apenas 2 famílias (Elapidae e Viperidae) reúnem as
espécies chamadas de peçonhentas, ou seja, aquelas que produzem toxinas em
suas glândulas especializadas e possuem aparelhos apropriados para inoculá-las
(BÉRNILS, 2012).
Dentre as famílias de serpentes peçonhentas existentes no Brasil, destaca-se

a família Viperidae, pela gravidade dos acidentes que causam. Essa família é
composta pelos gêneros Bothrops, Bothropoides, Bothriopsis, Bothrocophias,
Rhinocerophis, Crotalus e Lachesis (OLIVEIRA et al., 2009).
1.1 Gênero Bothrops e Bothropoides
Na América do Sul, serpentes do gênero Bothrops apresentam um alto

interesse científico, pois são as maiores causadoras de envenenamentos ofídicos
(HIGUCHI et al., 2007; ACOSTA, 2010). No Brasil, são responsáveis por cerca de
90% dos acidentes ofídicos notificados. Esse gênero compreende cerca de 30
espécies e são popularmente conhecidas como jararacas (CARRASCO et al., 2012).
As serpentes pertencentes a este gênero são caracterizadas por possuírem a
cauda sem maiores modificações, geralmente com escamas subcaudais em pares,
20
cabeça triangular e fosseta loreal. Habitam preferencialmente os ambientes úmidos,

como matas e áreas cultivadas. Possuem hábitos noturnos ou crepusculares, são
consideradas muito agressivas e chegam a atacar sem causar ruídos
(MELGAVAREJO, 2003; ALBUQUERQUE; COSTA; CAVALCANTE, 2004).
Possuem um alto grau de especialização no aparato venenífero, caracterizado pela
presença de complexos sistemas de produção e armazenamento do veneno, bem
como modificações morfológicas importantes, como musculatura cefálica bem
desenvolvida, sobretudo próxima às glândulas de veneno, além de dentes móveis e
canaliculados, implantados na parte anterior do maxilar, que permite a ereção das
presas para frente no momento do bote (AZEVEDO-MARQUES; CUPO; HERING,
2003).
Devido a grande diversidade de serpentes do gênero Bothrops, as relações
filogenéticas não são completamente definidas e a separação das serpentes em
diferentes gêneros é frequentemente necessária (SOUSA et al., 2013). Em 2009,
levando em consideração as variações morfológicas e moleculares, foi criada uma
nova espécie e reclassificadas algumas espécies anteriormente pertencentes ao
gênero Bothrops; este gênero foi nomeado por Bothropoides e contém 11 espécies:
Bothropoides alcatraz, Bothropoides diporus, Bothropoides erythromelas,
Bothropoides insularis, Bothropoides jararaca, Bothropoides lutzi, Bothropoides
marmoratus, Bothropoides Mattogrossensis, Bothropoides neuwiedi, Bothropoides
pauloensis e Bothropoides pubescens. Essa nova classificação é aceita e fornecida
pela Sociedade Brasileira de Herpetologia (FENWICK et al., 2009).
Algumas espécies apresentam maior importância devido sua ampla
distribuição geográfica como: a B. atrox, encontradas no Norte do Brasil; B. jararaca,
distribuídas na região Sul e Sudeste do país; B. jararacussu, encontradas no cerrado
da região Central e em florestas tropicais da região Sudeste; B. alternatus,
distribuídas ao Sul do país; B. moojeni na região Centro Oeste e Sudeste; B.
erythromelas e B. leucurus principalmente na região Nordeste (PINHO, PEREIRA,
2001; MELGAVAREJO, 2003).
21
1.1.1 Bothrops leucurus
A serpente Bothrops leucurus foi descrita pela primeira vez por Wagler em
1824 e pertencia a um complexo da Bothrops atrox, o qual compreendia as
serpentes Bothrops marajoensis, Bothrops moojeni, Bothrops asper, Bothrops
leucurus, Bothrops colombienses, Bothrops isabelae, Bothrops lanceolatus aidae,
Bothrops lanceolatus nacaridae. Na década de 60, as serpentes incluídas neste
complexo, foram divididas em espécies distintas de acordo com sua localização
geográfica e a composição dos venenos (WÜSTER et al., 1997).
É popularmente conhecida como jararaca-do-rabo-branco e/ou caiçara,
quando filhote, e malha-de-sapo, cabeça de capanga e jararaca, quando adulta
(LIRA-DA-SILVA, 2009). Apresenta um par de fossetas loreais (órgão
termorreceptor), um olho e uma narina de cada lado de sua cabeça, daí sua
denominação popular de cobra de “quatro-ventas”. A dentição é do tipo solenóglifa,
é uma espécie de médio porte (28 a 187 cm) que possui vários padrões de
coloração. Diferenças mais marcantes podem ser encontradas entre indivíduos
adultos e jovens. Geralmente apresentam um padrão dorsal cinza ou amarronzado,
com manchas negras em formato de “V” invertido (Figura 1). Apresentam também
uma faixa pós-ocular bem definida e um ventre enxadrezado de coloração cinza e
amarelada (PORTO; TEIXEIRA, 1995).
Figura 1: Bothrops leucurus (Fonte: http://www.venomland.org).

22
1.1.1.1 Distribuição geográfico epidemiológica.
Sua incidência varia desde o Norte da região Sudeste (Espírito Santo) até o
Nordeste brasileiro (Figura 2). No Nordeste a distribuição dessa espécie é mais
ampla, se estendendo para o norte do Estado do Maranhão, Sul do Ceará e na
Bahia ela ocorre na Chapada Diamantina e no Chapadão Ocidental de São
Francisco (MELGAVAREJO, 2003). É comum em áreas florestadas do Nordeste e
se adapta bem em ambientes urbanos, incluindo os ambientes peridomiciliares. Foi
registrada a incidência dessa espécie também na região de Caatinga na Bahia
(ULLOA et al., 2004), em que prevalece a vegetação secundária desse tipo de
ecossistema, altamente impactado pela ação antrópica. Além disso, ela também foi
localizada em remanescentes da Mata Atlântica no Estado de Pernambuco. Essa
incidência indica que B. leucurus está aumentando a sua distribuição geográfica
para áreas com diferentes características pedoclimáticas e vegetacionais, invadindo
diferentes biotas, fato provavelmente favorecido pelo desmatamento e pela sua
grande plasticidade ecológica (GUARNIERI et al., 2000; LIMA-DUARTE et al., 2003).
Figura 2: Distribuição geográfica da serpente Bothrops leucurus. (Fonte:

www.luar.dcc.ufmg.br).
Do ponto de vista médico, Bothrops leucurus constitui uma importante

serpente causadora de acidentes no Nordeste do Brasil. Juntamente com a
Bothropoides erytromelas, são as responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos
notificados nesta região.
23
1.2 Veneno botrópico
1.2.1 Composição química
Os venenos de serpentes do gênero Bothrops são constituídos por uma

complexa mistura de componentes proteicos e não proteicos, com diferentes
estruturas e atividades bioquímicas específicas (DE MARCO et al., 2015). Todos
estes componentes sofrem grande variabilidade, tanto inter como intraespecífica, as
quais são decorrentes da idade, sexo, sazonalidade, variação geográfica e
alimentação das serpentes (JORGE et al., 2015).
Os maiores componentes proteicos do veneno (cerca de 90% do peso seco),

com ou sem atividade catalítica, são neurotoxinas, cardiotoxinas, lectinas,
disintegrinas, peptídeos natriuréticos, proteinases (metaloproteinases, serino
proteinases), fosfolipases, L-aminoacido oxidades, fosfodiesterases, nucleotidases,
hialuronidases, acetilcolinesterases, fatores de crescimento e ativadores de proteína
C (DE TONI et al., 2015). Enquanto os componentes não protéicos incluem
constituintes orgânicos e não orgânicos (MATSUI et al. 2004; RAJENDRA et al. 2004)
(Figura 3). Dentre todos os compostos proteicos, os que merecem destaque são as
enzimas fosfolipase A2, metaloproteinases, serinoproteinases e L-aminoácido
oxidases, devido ao seu valor farmacológico, medicinal e biotecnológico.
Figura 3: Composição química do veneno botrópico (Fonte: DE TONI et al., 2015).
As fosfolipases isoladas de venenos de serpentes (svPLA2s) são enzimas

secretórias de baixo peso molecular (13 a 15 kDa), estáveis, requerem cálcio para
desempenhar sua atividade catalítica e agem sobre substratos lipídicos
24
(principalmente fosfolipídios) (FERREIRA et al., 2013). Atuam catalisando a hidrólise

especificamente na ligação 2-acil éster de fosfolipídios, liberando como produtos os
lisofosfolipídios e ácidos graxos livres (GARCIA-DENEGRI et al., 2014). svPLA2s são
muito tóxicas e iniciam um importante papel na imobilização da presa. Em um único
veneno podem ocorrer várias isoenzimas, cujos efeitos farmacológicos podem variar
consideravelmente. Esses efeitos incluem ação hemolítica indireta, neurotoxicidade,
cardiotoxicidade, agregação de plaquetas, anticoagulante, edematogênica, miotóxica,
bactericida e pró-inflamatória. Nos venenos botrópicos, estas enzimas estão
relacionadas à mionecrose local que pode provocar sequelas drásticas, como perda
tecidual permanente, incapacidade ou amputação do membro afetado (GHAZARYAN
et al., 2014).
As metaloproteases e serinoproteases são complexos de proteases que atuam

sobre diferentes alvos hemostáticos e ajudam na digestão de presas, promovendo
danos teciduais. As metaloproteinases são um grupo de endopeptidases,
dependendes de cálcio ou zinco ligados no sítio ativo para possuírem atividade,
desempenham um papel central no envenenamento, e são classificadas em cinco
superfamílias sendo uma delas a família metzincinas, da qual fazem parte as
metaloproteinases isoladas dos venenos de serpentes (svMPs) (DE PAULA et al.,
2014).
Metaloproteinases de venenos de serpentes têm sido objeto de muito estudo

devido à importância que estas desempenham no envenenamento. Em geral, a ação
das SVMPs relaciona-se com a proteólise de componentes da matriz extracelular
(colágeno tipo IV, laminina e fibronectina), proteínas plasmáticas (fibrina, fibrinogênio,
fator Von Willenbrand e pró-trombina) e das proteínas da superfície celular (integrinas
e caderinas). Estes efeitos promovem diversas alterações patológicas, tais como
hemorragia, inibição da agregação plaquetária, coagulopatia, mionecrose, edema,
equimose e resposta inflamatória (BERNADONI et al., 2014).
As serinoproteases estão associadas aos distúrbios hemostáticos devido à sua

atuação nos componentes da cascata da coagulação sanguínea e do sistema
fibrino(geno)lítico (ZAQUEO et al., 2014). Apresentam outras funções, podendo estar
envolvidas na digestão da presa, ativação do sistema complemento e diferenciação
celular. Individualmente, essas enzimas não são consideradas letais, mas elas
25
contribuem para o efeito tóxico quando combinadas com outras proteínas presentes
no veneno (BRAUD et al., 2000). Na captura de presas, as serino proteinases agem
em conjunto com as metaloproteinases, que também podem apresentar atividade
fibrinogenolítica, produzindo uma hemorragia incontrolável no animal capturado,
facilitando sua digestão (GUTIÉRREZ et al., 2009).
Outro importante componente protéico encontrado nos venenos botrópicos é a

enzima L-aminoácido oxidase (LAAO). LAAOs são flavoenzimas que catalisam a
desaminação estereoespecífica de um substrato L-aminoácido, a um α-cetoácido
correspondente, com a produção de peróxido de hidrogênio e amônia. Essas enzimas
são amplamente distribuídas em venenos de serpentes da família Viperidae,
Crotalidae e Elapidae. Nos venenos botrópicos pode chegar a 30% do teor total de
proteína (TAN et al., 2009; LEE et al., 2014).
L-aminoácido oxidases isoladas dos venenos de serpentes (svLAAOS)

apresentam grande similaridade, como, massa molecular e sequência N-terminal.
Estruturalmente são glicoproteinas (3-4%), homodiméricas ácidas ou básicas, se
ligam a FMN (flavina mononucleotídeo) e FAD (flavina adenina dinucleotídeo) como
co-fatores, têm massa molecular de 120-150 kDa na forma nativa e 55-56 kDa na
forma monomérica (CALDERON et al., 2014).
Até a década de noventa, os estudos realizados com LAAOs foram restritos as

características estruturais e funcionais destas enzimas (DU, CLEMETSON, 2002).
Atualmente LAAOs têm atraído o interesse de pesquisadores devido aos seus efeitos
polifuncionais em diferentes sistemas biológicos. Os estudos mostraram evidentes
efeitos sobre a agregação plaquetária, formação de edema, hemorragia,
antimicrobianos, antivirais, anti-HIV e citotóxicos para células tumorais. O mecanismo
pelo qual LAAO participa da toxicidade dos venenos é desconhecido. Entretanto,
essa enzima libera H2O2 quando oxidada, o que provavelmente desempenha um
importante papel na sua toxicidade, pois sua atividade antibacteriana, citotóxica e
agregante plaquetária é inibida por catalase (STABELI et al., 2007; NAUMAN et al.,
2011; LEE et al., 2014).
26
1.2.2 Efeitos tóxicos
Os componentes ativos do veneno botrópico possuem importantes atividades

fisiopatológicas, com ação proteolítica, coagulante e hemorrágica (OLIVEIRA et al.,
2009; CAMPOS et al., 2013).
A ação proteolítica caracteriza-se por lesão do tecido local proeminente,

desenvolve-se rapidamente após o acidente e pode resultar em sequelas
permanentes. A patogênese é complexa, decorrente da ação de várias enzimas
presentes no veneno, dentre elas, as metaloproteinases, hialuronidades,
fosfolipases A2 (STUQUI et al., 2015). Estas enzimas podem atuar por ação direta
sobre diferentes substratos, causando lesão tecidual através da ativação/liberação
de mediadores celulares e moleculares do processo inflamatório. O quadro clínico
caracteriza-se por manifestações locais importantes como dor e edema de caráter
precoce e progressivo. Frequentemente surgem equimoses, lesões bolhosas e
sangramentos no local da picada. Nos casos mais graves, pode ocorrer necrose de
tecidos moles com formação de abscessos e desenvolvimento de síndrome
compartimental, podendo deixar como sequelas a perda funcional ou mesmo
anatômica do membro acometido (GUTIERREZ, 2014; YAMASHITA et al., 2014).
Uma grande variedade de proteínas presentes no veneno botrópico

afetam a hemostasia. Muitas são enzimas como nucleotidases, fosfolipases A2, L-
aminoácido oxidases (LAAO), metaloproteinases e serinoproteinases, enquanto
outras, como desintegrinas e lectinas tipo C, não têm atividade enzimática. Essas
proteínas podem ser classificadas como pró-coagulantes, anticoagulantes ou
ativadoras de fibrinólise. No grupo dos pró-coagulantes estão incluídos os ativadores
do fator V, do fator X e de protrombina, além de várias enzimas semelhantes à
trombina. Inibidores de fatores IX e X, ativadores de proteína C, inibidores de
trombina e fosfolipases A2 exibem propriedades anticoagulantes. Atuantes sobre o
sistema fibrinolítico estão às proteínas com atividade proteolítica sobre a fibrina e os
ativadores de plasminogênio. As proteínas que agem como pró-coagulantes, causam
a ativação in vivo do sistema de coagulação, mas, na maioria dos casos, isto não
27
resulta em trombose maciça e embólica, mas provoca o consumo de fatores da

coagulação, resultando em um quadro clínico de incoagulabilidade sanguínea
(CLEMETSON; LU; CLEMETSON, 2005; SARTIM et al., 2015).
A ação hemorrágica é decorrente de toxinas presentes no veneno que agem

como anticoagulantes diretos ou indiretos, potencializando o risco de hemorragia.
Essas toxinas atuam aumentando a permeabilidade vascular ou danificando o
endotélio vascular (hemorraginas e metaloproteinases). Os mecanismos de ação das
hemorraginas incluem danos às células endoteliais, mionecrose, ruptura das fibras de
colágeno e da membrana basal. O resultado final é um aumento da permeabilidade
vascular com extravasamento de líquido intersticial, acarretando a formação de
edema, ou extravasamento de células sanguíneas, levando a equimoses, púrpuras ou
sangramentos (HUTTON , WARREL, 1993; OGUIURA et al., 2014 ).
Os efeitos clínicos são vistos localmente no membro picado e por todo o corpo.
Pode haver sangramento espontâneo a partir de tecidos, observáveis muitas vezes
como sangramento das gengivas (gengivorragia), mas também como sangramento
no trato gastrointestinal (TGI), com hematêmese e melena, hemorragia nos pulmões,
com hemoptise, sangramento no trato genito-urinário, com hematúria ou menorragia.
Cada um destes pode variar de leve a grave, capaz de provocar um choque com risco
de vida (WHITE, 2005).
As manifestações sistêmicas incluem, além das supracitadas, náuseas,

vômitos, sudorese, hipotensão arterial e, mais raramente, choque. As complicações
sistêmicas mais comuns são, insuficiência renal aguda, septicemia e coagulação
intravascular disseminada, tendo patogênese multifatorial e sendo causas frequentes
de óbitos (PINHO; PEREIRA, 2001; FRANÇA; MALÁQUE, 2003).
1.2.2.1 Insuficiência Renal Aguda (IRA)
Uma importante complicação sistêmica nos envenenamentos por serpentes do

gênero Bothrops é a Insuficiência Renal Aguda (IRA). A IRA é considerada a
complicação mais grave e letal desses acidentes. Estudos retrospectivos mostraram
28
que IRA ocorreu em 1,5% a 10% dos casos, mas provavelmente a real magnitude
deste problema é subestimada (TORREZ et al., 2014).
O rim é um órgão altamente vulnerável à ação de venenos e toxinas devido

sua alta vascularidade. Muitos fatores têm sido implicados na patogênese da IRA
induzida pelo envenenamento botrópico, dentre eles, alta concentração do veneno no
tecido renal, ação direta dos componentes do veneno sobre o túbulo renal e células
epiteliais renais, hemoglobinúria, deposição de fibrina glomerular, lesão vascular,
liberação de substâncias vasoativas, deposição de complexos imunes e estresse
oxidativo (Figura 4) (SITPRIJA, SITPRIJA, 2012).
Figura 4: Fisiopatologia dos efeitos renais induzidos pelo veneno botrópico e suas toxinas. (Fonte:
Adaptado de Sitprija e Sitprija, 2012).
29
A lesão renal mais frequente observada após o acidente botrópico é a necrose

tubular aguda, mas casos de necrose cortical também são descritos, bem como
nefrite intersticial aguda, alterações glomerulares, vasculite e necrose de papila em
menor frequência. A evolução clínica depende da precocidade do diagnóstico e do
tratamento com soroterapia, hidratação e diálise (MARROTA et al., 2006; SITPRIJA,
SITPRIJA, 2012).
1.2.2.1.1 Nefrotoxicidade direta induzida pelo veneno botrópico e seus

componentes
Dentre os fatores envolvidos na patogênese da IRA, o efeito nefrotóxico direto

de venenos botrópicos e suas frações foram relatados. Segundo Sitprija e Sitprija
(2012), os estudos clínicos e histopatológicos não são conclusivos sobre a
nefrotoxidade direta de venenos e toxinas. Evidência convincente é fornecida a partir
de estudos com cultura de células renais e perfusão de rim isolado. Vários estudos
demonstraram que diferentes componentes dos venenos estão envolvidos na indução
de morte celular por necrose e/ou apoptose (ARAKI et al., 2002; MORA et al., 2005;
NASCIMENTO et al., 2009; NAUMAN et al., 2011; LEE et al., 2014).
A necrose é um tipo de morte celular que ocorre de forma descontrolada e

acidental, sendo desencadeada principalmente por lesões mecânicas, agentes
citotóxicos e hipóxia. É caracterizada pela ruptura da membrana plasmática,
condensação da cromatina, hidrólise do DNA, aumento do volume celular,
desagregação dos ribossomos e finalmente lise celular. Após a lise celular ocorre a
liberação de componentes intracelulares, ocasionando uma reação inflamatória local.
Ainda que o material necrótico seja removido por fagócitos, a inflamação causa danos
locais significativos (ORRENIUS; GOGVADZE; ZHIVOTOVSKY, 2015). Os múltiplos
caminhos bioquímicos que são ativados pelo dano celular inicial e que podem levar à
necrose incluem a depleção severa de reservas de energia celular (ATP); aumento do
cálcio citosólico livre; geração de espécies reativas de oxigênio (EROS) e a ativação
de várias enzimas, incluindo as fosfolipases, proteases e endonucleases (RANA;
SATHYANARAYANA; LIEBERTHAL, 2001).
30
Recentemente, demonstramos que o veneno de Bothrops leucurus induziu

nefrotoxidade direta associada com indução de morte celular por necrose e
apoptose (DE MORAIS et al., 2013). Castro et al. (2004) demonstraram que o
veneno de B. jararaca causou toxicidade direta para túbulos proximais via estresse
oxidativo. Bothrops insulares induziu citotoxicidade em células tubulares renais
através de disfunção mitocondrial e estresse oxidativo (MELLO et al., 2014).
Nascimento et al., (2007) e Colares Buzato et al., (2002) avaliaram a citotoxidade
das peçonhas de Bothrops alternatus e Bothrops moojeni em cultura de células
tubulares renais, e verificaram redução da viabilidade celular, com diminuição da
resistência transepitelial das monocamadas. Ao estudarem o mecanismo de morte
celular, verificaram morte predominantemente por necrose e possivelmente através
da ação das espécies reativas de oxigênio.
A apoptose caracteriza-se por alterações no citoesqueleto que induzem

contração celular, fragmentação do DNA, condensação da cromatina, clivagem de
substratos proteicos, formação de vesículas sem perda de integridade da membrana
e sem resposta inflamatória. É um dos principais mecanismos que contribui para
perda da função das células do rim e atrofia tubular em doenças renais (VERZOLA
et al., 2014).
A ativação da apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos por meio
da ativação de receptores específicos presentes na superfície celular (via extrínseca
ou via de receptor de morte celular), ou pelo estresse intracelular (via intrínseca ou
mitocondrial). Ambas as vias culminam com a ativação de caspases que levam à
morte celular (ZHU et al., 2015).
A via extrínseca é desencadeada pela ligação de ligantes específicos a um

grupo de receptores de membrana da superfamília dos receptores de fatores de
necrose tumoral (rTNF), a porção citoplasmática desses receptores contém um
domínio de morte intracelular chamados de receptores de morte (death receptores,
DRs). Quando os receptores de morte celular reconhecem um ligante específico, os
seus domínios de morte interagem com moléculas conhecidas como FADD/ MORT-1.
Essas moléculas têm a capacidade de recrutarem as pró caspases iniciadoras 8 e 10.
Depois de tornarem-se ativas as caspases 8 e 10 difundem-se no citoplasma e ativam
as caspases efetoras 3, 6 e 7, entre outras (Figura 5). As caspases efetoras, por sua
31
vez, clivam múltiplos componentes vitais para as células, levando a morte por
apoptose (CHEN et al., 2015; SAKAMAKI et al., 2015).
A via intrínseca é ativada por estresse intracelular ou extracelular, como

privação de fatores de crescimento, danos no DNA, hipóxia, dentre outros. A
mitocôndria sofre modificações de potencial de membrana interna, de permeabilidade
de membrana e aumento de densidade de matriz. Estas alterações mitocondriais
podem ser cruciais para o disparo da morte, podendo facilitar a translocação de
proteínas mitocondriais, bloqueio na síntese de ATP e aumento na produção de
espécies reativas de oxigênio, que leva à oxidação de lipídios, proteínas e ácidos
nucléicos, além de contribuir para a ativação de caspases-9 e 3. O desarranjo
mitocondrial também pode facilitar a liberação de citocromo c para o citoplasma, onde
o mesmo forma complexo com o fator de ativação associado à apoptose-1 (APAF-1)
e caspase-9, o chamado apoptossomo, que promove a clivagem da pró-caspase-9,
liberando a caspase-9 ativa, que é capaz de ativar a caspase-3 e levar a apoptose
(Figura 5) (JEONG et al., 2015; YANG et al., 2015).
Figura 5: Vias de sinalização da apoptose: A via de receptores de morte (via à esquerda da

figura) é acionada por membros da superfamília de receptores de morte (como FasL, TRAIL e de fator
necrose tumoral). Este complexo ativa a pró caspase 8, que uma vez ativada pode ativar diretamente a
pró caspase 3 ou clivar a proteina pró apoptótica Bid, a qual induz a saída do citocromo c. Na via
intrínseca, a mitocôndria integra os estímulos de morte celular, induzindo a permeabilização
mitocondrial e conseqüente liberação de moléculas pró-apoptóticas nela presentes (citocromo c). O
32
citocromo c liberado se oligomeriza com APAF-1 e pró-caspase 9, para formar o complexo ativador da
caspase 9 chamado apoptossoma, uma vez ativada a caspase 9 cliva e ativa a pró-caspase 3,
induzindo a apoptose (Fonte: Galluzzi, Blomgren, Kroemer , 2009).
Diversas proteínas presentes nos venenos botrópicos podem induzir ativação

da via extrínseca ou intrínseca da apoptose (Figura 6). Vários estudos identificaram
metaloproteinases que, devido à sua similaridade com a convertase de TNF-α, são
capazes de causar apoptose in vitro (MOURA-DA-SILVA e BALDO, 2012;
CALDERON et al., 2014; ACHÊ et al., 2015). PLA2 podem induzir apoptose via
estresse oxidativo, distúrbios da sinalização de cálcio e produção de ceramida
(SHAKHMAN et al., 2003; MORA et al., 2005; TONELLO et al., 2012). As
desintegrinas interferem na adesão celular e também atuam na via de transdução de
sinal da fosfolipase C fosfatidilcolina-específica, assim como a indução da expressão
de p53 (ZHAO et al., 2004; LUCENA et al., 2015). As cardiotoxinas podem ativar
apoptose tanto pela via extrínseca (caspases 8 e 3) como pela via mitocondrial, com
a liberação de citocromo c (CHIEN et al., 2008; CALDERON et al., 2014). Outro
importante indutor de apoptose é a enzima L-aminoácido oxidase (LAAO), que pode
bloquear os receptores de timidina causando danos ao DNA. LAAO induz apoptose
ao ativar os receptores de morte (CALDERON et al., 2014). LAAO gera H2O2 em sua
reação catalítica, produzindo apoptose como efeito secundário (NAUMAN et al., 2011;
LEE et al., 2014; MORAIS et al., 2015).
Figura 6: Esquema da ação de componentes de peçonhas ofídicas na morte celular apoptótica. As

33
setas tracejadas indicam as possíveis vias de ação das enzimas/toxinas da peçonha nas células. As
setas contínuas indicam vias já estabelecidas na literatura. X = bloqueio de integrinas ou canais
iônicos. U = aumento na expressão; V = redução na expressão. (Fonte: NASCIMENTO, 2008).
Além dos estudos de citotoxicidade, outros estudos foram conduzidos com

venenos botrópicos e suas toxinas utilizando perfusão de rim isolado de rato, onde
foram observados efeitos nefrotóxicos diretos. Em estudos prévios realizados por
Havt et al., (2005), Martins et al., (2005)., Braga et al. (2006), Evangelista et al.,
(2010), De Morais et al., (2013), foi demonstrado que os venenos de diferentes
espécies de Bothrops alteram os parâmetros fisiológicos da função renal. De um
modo geral os venenos botrópicos induzem diminuição na Pressão de Perfusão, na
Resistência Vascular Renal, no Ritmo de Filtração Glomerular, no Fluxo Urinário e na
porcentagem de transporte tubular de sódio (Tabela 1).
Tabela 1: Estudos de nefrotoxicidade direta com venenos de Bothrops no modelo de perfusão de rim
isolado de rato.
PP: Pressão de Perfusão; RVR: Resistência Vascular Renal; RFG: Ritmo de Filtração Glomerular; FU:
Fluxo Urinário; %TNA: percentual de sódio transportado.
Observamos que o veneno de Bothrops leucurus induziu nefrotoxicidade em

rim isolado de rato, associado com citotoxicidade em células tubulares epiteliais
renais (DE MORAIS et al., 2013). No presente trabalho demos continuidade ao
estudo, avaliando o efeito nefrotóxico da enzima L-aminoácido oxidase isolada do
veneno de Bothrops leucurus (LAAO-Bl). A fim de saber se esta enzima está
envolvida no processo de nefrotoxidade direta do veneno de Bothrops leucurus nós
34
investigamos a sua citotoxicidade sobre células epiteliais renais e o seu potencial

nefrotóxico em rim isolado de rato.
35
JUSTIFICATIVA
36
2. JUSTIFICATIVA
A Bothrops leucurus é uma serpente peçonhenta que habita a região Nordeste

do Brasil, responsável por grande parte dos casos de acidentes ofídicos reportados
na região (SATURNINO, OLIVEIRA et al., 2014). Os efeitos biológicos devido ao
envenenamento por B. leucurus têm perfil semelhante àqueles apresentados por
outras serpentes do gênero Bothrops, ou seja, importantes efeitos locais, assim como
efeitos sistêmicos graves, como a insuficiência renal aguda (IRA) que é a principal
causa de morte nesses acidentes (SANCHEZ et al., 1992, LIRA- DA- SILVA, 2009).
Recentemente, demonstramos os efeitos do veneno da serpente Bothrops
leucurus em rim isolado e em cultura de células renais. O veneno induziu alterações
nos parâmetros fisiológicos renais, e efeitos citotóxicos em cultura de células
tubulares renais, como indução de morte celular por necrose e apoptose,
despolarização no potencial de membrana mitocondrial, aumento de cálcio citosólico
e aumento de expressão de caspases (DE MORAIS et al., 2013).
A abordagem proposta neste trabalho foi dar continuidade ao estudo. Portanto,
objetivou-se estudar se a fração L-aminoácido oxidase, o maior componente proteico
de B. leucurus, está envolvida na nefrotoxicidade do veneno. Para isso, utilizamos
técnicas farmacológicas clássicas aliadas a técnicas modernas de sinalização de
morte celular.
O estudo do mecanismo molecular envolvido nos distúrbios renais causado por
ofidismo tem como finalidade dar um melhor entendimento de como agem os
venenos e seus componentes e contribuir para o conhecimento da fisiopatologia
renal. Espera-se assim, esclarecer os mecanismos de nefrotoxicidade, bem como
ajudar na busca de fármacos e estratégias terapêuticas mais efetivas que possam
ser úteis para o tratamento da insuficiência renal aguda induzida pelo
envenenamento botrópico.
37
OBJETIVOS
38
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
 Estudar os efeitos nefrotóxicos diretos induzidos pela fração L- aminoácido

oxidase isolada do veneno de B. Leucurus (LAAO-Bl).
3.2 Objetivos específicos
 Avaliar os efeitos da LAAO-Bl sobre a viabilidade das células tubulares renais

(MDCK e HK2).
 Estudar o mecanismo de morte induzido por LAAO-Bl sobre as linhagens

celulares em estudo.
 Verificar o efeito da LAAO-Bl sobre o potencial de membrana mitocondrial nas

células MDCK.
 Avaliar o efeito da LAAO-Bl sobre a mobilização de Ca2+ citosólico nas células

MDCK.
 Investigar se LAAO-Bl induz aumento de espécies reativas de oxigênio nas

células MDCK.
 Avaliar se LAAO-Bl induz ativação de caspases executoras da apoptose sobre

as linhagens celulares em estudo.
 Avaliar se LAAO-Bl induz liberação de citocromo c nas células HK2.
 Avaliar os efeitos da LAAO-Bl em rim isolado de rato.

39
MATERIAIS E MÉTODOS
40
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
Para o ensaio de viabilidade: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

Diphenyltetrazolium Bromide (MTT, (M5655, Sigma). Atividade de lactato
desidrogenase (Kit cytoTox96 – Promega 6179A). Análise de apoptose e necrose por
citometria de fluxo: AnnexinV/FITC Apoptosis Detection Kit BD Pharmigen (CA, USA).
No ensaio de atividade de caspase-3: substrato fluorogénico de caspase-3 (Ac-
DEVD-AFC, P-409, Biomol). Tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE), Fura-2AM e
2,7dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) foram obtidos de Molecular
Probes (Eugene, OR, USA). Nos experimentos de western Blot: Caspase 3 (#96615),
Caspase 7(#9492) foram obtidas de Cell Signaling, α-tubulin (#T8203) foi obtida de
Sigma-Aldrich e Bax (Sc 493) de Santa Cruz Biotechnology. Para revelar os western:
ECL Western Blotting Detection Reagents (RPN2209, GE Healthcare).
4.1.1 Obtenção da LAAO-Bl
L- aminoácido oxidase foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Marcos Hikari
Toyama da Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Campus do Litoral
Paulista, Unidade de São Vicente.
4.2 Linhagens Celulares
As células utilizadas para os ensaios de citotoxicidade foram: HK2 e MDCK

As células HK2 constituem uma linhagem imortalizada proveniente do túbulo
proximal renal humano (ATCC 2290). Fenotipicamente, as células HK2 têm as
mesmas características das células tubulares de adultos normais, como
demonstradas por uma série de testes bioquímicos. Em particular, foi mostrado que
as células HK2 mantêm a borda em escova e atividades enzimáticas típicas (ácido e
fosfatase alcalina, aminopeptidase de leucina e gama glutamil transferase). Vários
estudos demonstraram que esta linhagem celular é uma ferramenta experimental
para o estudo da fisiopatologia renal bem como para mecanismos de lesão e
41
reparação ao nível da célula tubular (ROMITI et al., 2008; VERZOLA et al., 2014).
As células MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) constituem uma linhagem
imortalizada proveniente do túbulo renal de cadelas, com características morfológicas
e funcionais semelhantes às células do ducto colector e/ou túbulo distal de mamíferos
e têm sido muito utilizadas na investigação de uma variedade de processos celulares,
incluindo o transporte epitelial e resposta celular a agentes tóxicos (COLLARES-
BUZATO et al., 2002; DE MORAIS et al., 2013;)
4.2.1 Cultivo das linhagens celulares
As células HK2 e MDCK foram cultivadas em frascos plásticos, com meio

DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de penicilina (10.000
UI/mL) e estreptomicina (10 mg/mL). As células foram mantidas em estufa a 37°C
com atmosfera de 5% de CO2, seguido da observação do crescimento celular a cada
24 horas.
4.3 Estudo do efeito citotóxico in vitro
4.3.1 Ensaio com MTT
4.3.1.1 Princípio do método
O ensaio consiste em uma análise colorimétrica que mede indiretamente a

citotoxicidade. A técnica baseia-se na capacidade da succinato desidrogenase, uma
enzima do ciclo de Krebs, ativa em mitocôndrias de células viáveis, em converter o
sal de tetrazólio (3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H ou MTT), que é solúvel em
água e de cor amarelada em cristais de formazan, que são de cor púrpura. Os cristais
de formazan são solubilizados, formando um produto colorido cuja medição da
densidade óptica é feita em espectrofotômetro a 570 nm de absorbância (Figura 7). A
intensidade do produto colorido formado é diretamente proporcional ao número de
células viáveis presentes na amostra, confirmando a capacidade redutora do sistema
sobre o MTT (MOSMANN 1983; HEINRICH et al., 2005).
42
Figura 7: Esquema do ensaio do MTT. Redução metabólica do Brometo de 3-(4,5-

dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol a formazan (composto azul). A adição de dimetilsulfóxido (DMSO)
solubiliza os cristais de formazan e a intensidade é medida a uma longitude de onda de 570 nm.
Protocolo experimental
As células foram distribuídas em placas de 96 poços. Decorridas 24 horas do

plaqueamento, foram adicionadas aos poços diferentes concentrações da LAAO-Bl
solubilizadas em PBS. Após 12 horas do tratamento, foi removido todo o meio de
cultura (100µL) e adicionou-se 20µL da solução do sal de tetrazolium (MTT; 5mg/mL;
Sigma) dissolvido em PBS. Após incubação por 4 horas em estufa com 5% de CO 2 à
37ºC, adicionou-se 100µL de dimetilsulfóxido (DMSO) para solubilizar os cristais de
formazan formados. Mediu-se a absorbância a 570 nm usando o espectrofluorímetro
Wallac Victor 1420 (PerkinElmer). Os resultados da leitura se expressam como
porcentagem de morte celular das amostras tratadas comparadas com as amostras
que receberam apenas o veículo de diluição da substância teste (PBS).
% Morte celular: [1-(Células tratadas/Células controle)*100)]
4.3.2 Ensaio de atividade da enzima Lactato desidrogenase (LDH)
4.3.2.1 Princípio do método
Nos ensaios de citotoxicidade, a atividade da enzima lactato desidrogenase

tem sido utilizada como principal marcador de lise celular in vitro. Para verificarmos
se a citotoxicidade da LAAO-Bl nas linhagens celulares em estudo estava associada
43
à lise da membrana plasmática, realizamos o teste de atividade da enzima lactato

desidrogenase. O teste baseia-se na redução de NAD a NADH pela LDH (enzima
citosólica, liberada para o meio extracelular quando a integridade da membrana é
afetada). Nas condições do ensaio, a LDH catalisa a conversão do piruvato para
lactato, enquanto o NADH é oxidado para NAD+. A atividade catalítica é determinada
a partir da velocidade de desaparecimento do NADH (Figura 8). Assim, quanto maior
a liberação da enzima, e consequentemente a perda da integridade da membrana,
maior a atividade da enzima (CHAN; MORIWAK; DE ROSA, 2013).
Figura 8: Esquema do ensaio de LDH: A LDH catalisa a redução do piruvato pelo NADH, que é
convertido em lactato, transformando o NADH em NAD. A concentração catalítica é determinada a
partir da velocidade de extinção do NADH, medida espectrofotometricamente em 490nm.
As células foram distribuídas em placas de 96 poços. Decorridas 24 horas do

plaqueamento, foram adicionadas aos poços diferentes concentrações de LAAO-Bl.
Após 12 horas do tratamento foi retirado 50 µL de sobrenadante, levado para outra
placa de 96 poços e adicionado 50 µL da solução do substrato mix (Promega) e a
mistura foi incubada por 30 minutos protegida da luz. Triton-X 7% foi utilizado como
controle positivo de liberação de LDH. Mediu-se a absorbância a 490 nm usando o
espectrofluorímetro Wallac Victor 1420 (PerkinElmer). Os valores de citotoxicidade
foram calculados utilizando os resultados do controle negativo como liberação basal
de LDH, e os resultados do controle positivo, como 100% de liberação da enzima.
44
4.4 Detecção de células apoptóticas e necróticas por marcação com

Anexina V/Iodeto de propídeo.
4.4.1 Princípio do método
Este método baseia-se na detecção da fosfatidilserina (PS), que nas células

apoptóticas se transloca do interior ao exterior da membrana plasmática. A anexina V
é uma proteína anticoagulante vascular que possui uma grande afinidade pela
fosfatidilserina. A anexina V pode ser conjugada com fluórocromos, permitindo a
identificação das células apoptóticas através de sua ligação a fosfatidilserina na
superfície celular. No entanto, a anexina V também é capaz de se ligar a PS no
interior das células que não apresentam sua membrana plasmática intacta,
consideradas como necróticas (ENGELAND et al., 1998). Portanto, junto com a
anexina, simultaneamente as células são incubadas com iodeto de propídeo (IP) um
marcador que se internaliza somente nas células mortas que não possuem a
membrana intacta e se intercala no DNA emitindo fluorescência (Figura 9). Este
ensaio permite distinguir entre células viáveis (Anexina-/IP-), em apoptose
(Anexina+/IP-), em apoptose tardía/necrose secundária (Anexina+/IP+) e em necrose
(Anexina-/IP+).
Figura 9: Esquema do ensaio de marcação com Anexina V/IP: A anexina V tem uma grande
afinidade por fosfatidilserina, tal característica pode ser utilizada para identificar células apoptóticas.
Células viáveis excluem o iodeto de propideo (IP) da interação com a membrana, enquanto que a
membrana de células mortas ou danificadas pode ser penetrada pelo IP. Células que são positivas
para FITC-Anexina V e negativas para IP estão no estágio precoce da apoptose. Células que são
45
positivas para FITC-Anexina V e IP estão no final do estágio de apoptose, em estágio de necrose ou

estão completamente mortas. Células que são negativas para FITC-Anexina V e IP estão viáveis
Para este ensaio as células foram plaqueadas em placas de 12 poços. Após

12 horas do tratamento com diferentes concentrações de LAAO-Bl, o meio de cultura
foi coletado e as células aderidas à placa foram lavadas com PBS e tripsinizadas, e
procedeu-se a marcação seguindo as instruções do fabricante Kit BD Pharmigen.
Resumidamente, o “pellet” obtido após as lavagens e centrifugação foi ressuspendido
em 100µL de tampão de ligação. Posteriormente, adicionou-se 5µL de AnnV e 5µl de
IP e os tubos foram incubados durante 15 minutos a temperatura ambiente protegidos
da luz, após este período adicionou-se 400 µL do tampão de ligação. Por último, os
resultados foram analisados por citometria de fluxo (Cytomics FC de Beckman
Coulter). A emissão de luz de excitação realizou-se a 488 nm com um láser de
argônio. O sinal de AnnV-FITC (fluorescência verde) detectou-se a 518 nm e o sinal
do IP (fluorescência vermelha) a 620nm. Os dados foram analisados utilizando o
programa WinMDI 2.9.
4.5 Medida do potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm)
Essa técnica baseia-se na capacidade de um corante fluorescente específico,

se ligar diretamente as mitocôndrias de células viáveis. A tetrametilrodamina (TMRE)
é um indicador catiônico que se acumula preferencialmente em mitocôndrias
energizadas e tem sido amplamente utilizada como corante fluorescente de
mitocôndrias. Ao utilizar TMRE é possível acompanhar a dissipação do potencial de
membrana mitocondrial (∆Ψm) indicada pela perda do corante acumulado na
mitocôndria para o citosol, bem como é possível verificar aumentos no ∆Ψm indicado
pelo aumento na fluorescência na organela (MITRA; LINPPINCOTT, 2010). O sinal do
TMRE é calibrado usando Carbonilcianeto-p-tri fluorometoxifenilhidrazona (FCCP) no
final do experimento. Antes de iniciar o experimento, a estabilidade de fluorescência
deve ser verificada através da aquisição de algumas imagens, até que uma base
46
estável seja alcançada. Quando uma base estável não foi obtida, devido à
photobleashing ou efeitos de fotodinâmica, as células foram descartadas.
Protocolo experimental:
Microscopia de fluorescência: Para avaliar os efeitos da LAAO-Bl (50 ug / mL)

no ΔΨm, as células foram plaqueadas em lâminas e incubadas com TMRE (25 nM,
15 min a 37 °C). Antes da adição de LAAO-Bl, as células foram expostas à luz
durante pelo menos 5 minutos para assegurar uma linha de base estável. A
fluorescência do TMRE (548 nm de excitação e 585 nm de emissão) foi adquirida
usando um microscópio de fluorescência de alta resolução (Nikon TE 300, Nikon,
Osaka, Japão) acoplado a uma câmera CCD (CoolSnap-Roper Scientific Inc.,
Princeton Instruments, Princeton, NJ, EUA). As imagens foram adquiridas por
software BioIP (Anderson Eng., EUA).
Citometria de fluxo: Após 12 horas do tratamento com LAAO-Bl, as células
MDCK foram recolhidas e colocadas em frascos do citômetro, centrifugadas e o
preciptado ressuspenso em 200μL PBS contendo o TMRE na concentração de 50
nM. Após 30 minutos de incubação com TMRE, as amostras foram analisadas em
citômetro de fluxo.
4.6 Medidas da variação do Ca2+ intracelular
Os experimentos para verificar as alterações dos níveis intracelulares de Ca 2+

foram realizados com o marcador fluorescente de Ca 2+, Fura-2-AM. O Fura-2-AM é
um indicador de Ca2+ permeante à membrana plasmática, devido à sua porção
acetoximetil éster (AM). Uma vez dentro das células, este indicador que na forma AM
é insensível a íons é hidrolizado por esterases intracelulares liberando o indicador
poliânico do grupamento AM, tornando-se assim sensível a íons. A excitação do Fura-
2-AM foi realizada continuamente em dois comprimentos de onda, 340 nm e 380 nm,
sendo a emissão da fluorescência coletada no comprimento de onda de 505 nm
(Figura 10). Quando o Fura-2-AM está ligado ao Ca2+, a fluorescência em 340 nm
aumenta, enquanto que a fluorescência em 380 nm diminui. Desta maneira, a razão
47
340/380 nm corresponde às variações de cálcio citosólico (SMAILI et al., 2008). Os

valores em porcentagem são expressos como a razão (340/380), normalizado da
fluorescência basal e os dados foram normalizados pela fórmula (F − F0)/F0 × 100,
no qual F0 representa os níveis basais de Ca2+.
2+
Figura 10: Esquema da medida de variação de Ca intracelular: O Fura-2-AM é um indicador
2+
de Ca permeante à membrana plasmática, devido à sua porção acetoximetil éster (AM). Quando o
2+
Fura-2-AM está ligado ao Ca , a fluorescência em 340 nm aumenta, enquanto que a fluorescência em
380 nm diminui. Desta maneira, a razão 340/380 nm corresponde às variações de cálcio citosólico
As células MDCK foram plaqueadas em placas de Petri contendo lamínulas

(coverslips) redondas de 25 mm de diâmetro, previamente lavadas com água
destilada, autoclavadas e deixadas por 30 minutos sob luz UV. Após 24 horas do
plaqueamento as células foram lavadas com tampão para fluorescência (em mM:
NaCl 130; KCl 5,36; MgSO4 1; Na2HPO4 1; CaCl2 1,5; NaHCO3 2,5; Albumina 1,5;
Glicose 25 e HEPES 20) e incubadas com Fura-2AM (3 µM) por 30 minutos e
protegidos da luz à temperatura ambiente em tampão de fluorescência. Transcorrido
o tempo de incubação, as células foram lavadas com o mesmo tampão para
fluorescência e a lamínula foi encaixada na câmara de Leiden, a qual foi adicionado
1,0 mL de tampão. No microscópio a câmara foi inserida no sistema com controle de
temperatura, de forma que os experimentos foram realizados com as células
mantidas a 37 ºC. Durante os primeiros 2 minutos de cada experimento,
correspondentes a 20 imagens, não foi dado qualquer estímulo, para que fosse obtida
48
uma linha de base. Após as 20 primeiras imagens foi adicionado a LAAO-Bl

(50µg/mL). Os experimentos foram desenvolvidos com números de imagens
variados, intervalo de 6 segundos entre as imagens e 100 milisegundos de tempo de
exposição das células à luz fluorescente. Foi usada a objetiva de 40x e resolução de
2 bins. Em alguns experimentos foi feito o estudo da LAAO-Bl na presença de
diferentes antagonistas que foram incubados por diferentes períodos antes do início
dos experimentos. Para tanto, foram utilizados: tapsigargina, rianodina e 2-APB.
A tapsigargina, que inibe a atividade da SERCA presente no RE, foi incubada
na concentração de 2 µM em lamínulas por 20 minutos a temperatura ambiente.
A rianodina, que inibe a atividade do receptor de rianodina (RyR) presente no
retículo endoplasmático, foi incubada na concentração de 20 µM em lamínulas por 20
minutos a temperatura ambiente em tampão de fluorescência.
O 2-APB, antagonista do receptor de IP3 (IP3R) presente no retículo
endoplasmático, foi incubado na concentração de 100 µM em lamínulas por 10
minutos a temperatura ambiente em tampão fluorescência.
Após esse tempo de incubação, as lamínulas foram adaptadas ao microscópio.
Para cada antagonista foi feita, primeiramente, a medida da razão de fluorescência
por estímulo único das células sem adição da LAAO-Bl para, assim, verificar o efeito
de cada antagonista sobre as células, e em seguida foi adicionada a LAAO na
concentração de 50µg/mL.
4.7 Geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROS)
As espécies reativas de oxigênio (EROS) geradas intracelularmente foram

avaliadas utilizando 2,7-diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA), o qual se
difunde através das membranas celulares e é facilmente hidrolisado por esterases
intracelulares para formar o DCFH (não fluorescente), que depois é rapidamente
oxidado ao DCF (2’7’- diclorohidrofluoresceina), altamente fluorescente, por uma
ampla diversidade de EROS. A intensidade de fluorescência do DCF é proporcional à
quantidade de EROs formadas intracelularmente (TOR et al., 2015).
49
As células MDCK foram distribuídas em placas de 24 poços e incubadas com

LAAO- Bl (50 µg/mL) por 12 h. Após este período foram recolhidas e colocadas em
frascos de citômetro, centrifugadas e o precipitado ressuspenso em 200μL de PBS
contendo o DCFH na concentração de 5µM por 30 minutos a 37˚C. Tert-Butyl
hidroperoxido (t-BHP, 5 µM) foi utilizada como controle positivo. Os resultados foram
analisados utilizando citometria de fluxo com comprimento de onda de excitação e
emissão de 490 e 530 nm, respectivamente.
4.8 Ensaio de ativação da caspase 3 e 7
Para a determinação da atividade da caspase 3/-7 utilizamos um ensaio

fluorimétrico (FEARNHEAD, 2001). As caspases são cisteína-proteases
caracterizadas por apresentar um resíduo de cisteína que atua na ruptura de outras
proteínas em um resíduo de aspartato. Neste ensaio, a caspase - 3/-7 proveniente do
lisado celular hidroliza o substrato Acetil-Asp-Glu-Val-Asp- 7-amino-trifluorometil-
coumarina (Ac-DEVD-AFC), liberando o AFC, que é um marcador fluorogénico. A
liberação do AFC em função do tempo nos permite avaliar a atividade da caspase -3/-
7 em cada amostra.
Para realizar este ensaio as células foram plaqueadas em placas de 6 poços.

Após 24 horas, foram tratadas com LAAO-Bl. Depois de 12 horas de tratamento, as
células foram descoladas da placa pela adição de 5 mM de EDTA/PBS. O precipitado
celular foi lavado com PBS frio, resuspendido com 30 μL de tampão de extração (50
mM PIPES pH 7.0, 50 mM KCl, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl 2), e incubado durante 5
minutos no gelo. Este tampão hipotônico permite liberar o conteúdo citosólico sem
romper completamente as células. Após esta incubação, realizaram-se 3 rondas de
congelamento/descongelamento em nitrogênio líquido/água fria, com agitação em um
vibromixer depois de cada ronda. Após centrifugar a 13.200 rpm durante 7 minutos a
50
4°C, o extrato citosólico (sobrenadante) foi recolhido. Foi quantificada a concentração

protéica total do sobrenadante mediante o método colorimétrico do ácido
bicinconinico (BCA, Pierce BCA Protein Assay Kit) de acordo com as instruções do
fabricante. Como proteína padrão utilizaram-se concentrações conhecidas de
albumina sérica bovina (BSA). Em placas de 96 poços de fundo plano negro,
adicionou-se 40 μg de proteína, completando com tampão de extração até alcançar
um volume final de 30 μL. Adicionou-se 200 μL de 2 μL/mL de Ac- DEVD-AFC diluido
em 10% glicerol em PBS com 2mM de DTT. Analisou-se a liberação de AFC, usando
o espectrofluorímetro Wallac Victor 1420; utilizando longitudes de onda de
excitação/emissão de 390/510 nm, em um ensaio cinético que se avaliou durante 1
hora a 37°C.
4.9 Análise de proteínas por western blott
4.9.1 Extratos proteicos totais
Depois de 12 horas de tratamento, as células MDCK e HK2 foram

despregadas da placa mediante tratamento com tripsina e após centrifugação o
sedimento celular foi lavado com PBS frio e resuspenso em solução de lise (25mM de
TrisHCl, 1mM de EDTA, 1mM de EGTA, 1% de SDS, 10 μg/mL leupeptina, 100 μM
fluoreto de fenilmetilsulfonio PMSF e 10 μg/ml de pepstatina A). Os extratos foram
incubados durante 10 minutos no gelo e a 95°C durante 5 minutos. Posteriormente,
foram centrifugados a 13.000 rpm durante 10 minutos para eliminar restos celulares.
O sobrenadante desta centrifugação representa o extrato proteico. A concentração de
proteína total foi determinada mediante o método colorimétrico de BCA.
4.9.2 Eletroforese das proteínas em SDS-PAGE
Os extratos proteicos obtidos na solução de lise (80 μg de proteína) foram

suspendidos em tampão de carga (60 mM de Tris, 10% de glicerol, 2% de SDS, 5%
de 2-mercaptoetanol e 1 mL de 1% de azul de bromofenol, pH 6,8), aquecidos
durante 5 minutos a 95°C, e por último foram centrifugados a 13.000 rpm durante 1
minuto.
51
As proteínas foram separadas mediante eletroforese em géis de poliacrilamida

(SDS-PAGE, 10-12%), utilizando o sistema de eletroforese vertical (Mini Protean-3,
Bio-Rad Laboratories) e um tampão formado por 25 mM de Tris, 200 mM de glicina e
0,1% de SDS. Utilizou-se um marcador de peso molecular (Spectra Multicolor Broad
Range Protein Ladder, Fermentas).
4.9.3 Imunodetecção de proteínas (Western blot)
As proteínas separadas nos géis de SDS-PAGE foram transferidas

eletroforeticamente a membranas de nitrocelulose (Nitrocellulose Membranes, 0.45
μm, Bio-Rad) utilizando o sistema Mini-Transblot (Bio-Rad). O tampão de
transferência é composto por 25 mM de Tris, 192 mM glicina e 20% de metanol. As
membranas foram bloqueadas durante 1 hora com 5% de leite em TBS-T (Tris-
Buffered Saline) composto por 20 mM de Tris, 500 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20).
A incubação das membranas com o anticorpo primário realizou-se com a solução de
bloqueio a 4ºC durante toda a noite. Após lavar as membranas 3 vezes com TBS-T,
foram incubadas com o correspondente anticorpo secundário conjugado a peroxidase
em solução de bloqueio durante 1 hora a temperatura ambiente. Depois de lavar 3
vezes com TBS-T, revelou-se o Western blot mediante ECL seguindo as instruções
do fabricante (ECL Western Blotting Detection Reagents), e as membranas foram
expostas a uma película Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare). Os anticorpos
utilizados foram anti-caspase 3 (#96615), anti-caspase 7 (#9492) e anti-Bax (Sc 493).
As amostras foram também incubadas com anticorpo anti- α-tubulina (#T8203) para
quantificação. Os filmes foram digitalizados e analisados densitometricamente.
4.10 Ensaio de liberação de citocromo c
O citocromo c é uma proteína que se encontra normalmente associada à

membrana mitocondrial interna e no espaço intermembrana mitocondrial, participando
no transporte de elétrons durante a respiração mitocondrial. No entanto, na presença
de determinados sinais pró-apoptóticos, o citocromo c é liberado para o espaço
citosólico onde interage com outras proteínas, desencadeando o processo de
52
apoptose (JEONG et al., 2015). Por tanto, a aparição do citocromo c no citoplasma é

considerada como marcador apoptótico, indicando também uma participação
mitocondrial no processo.
As células HK2 foram plaqueadas em placas de 6 poços contendo lamínulas

(coverslips), previamente lavadas com água destilada e autoclavadas. Após 24 horas,
foram tratadas com LAAO-Bl (50 e 25 µg/mL). Após 6 horas de tratamento, as células
foram lavadas com PBS e posteriormente fixadas com 4% de paraformaldeído,
permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100, e bloqueadas com gelatina a 2% em
PBS. As células foram marcadas com um anticorpo primário contra Citocromo c
(SC13561; Santa Cruz), seguido de anti-IgG de rato conjugado com FITC (Jackson
ImmunoResearch). As imagens foram obtidas usando o microscópio Leica DM 6000
(câmera Leica DC500) com uma objetiva de 20X. As células foram classificadas de
acordo com a localização de Citocromo c, na mitocôndria (morfologia tubular) ou no
citosol (padrão difuso).
4.11 Perfusão de rim isolado
4.11.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300g, obtidos do
Biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do
Ceará. Os animais foram acondicionados em caixas de polipropileno, climatizados
entre 22 ± 0,5ºC, luminosidade (12 horas de ciclo claro/escuro), umidade e circulação
de ar controlados, recebendo ração padrão (Biotec®) e água “ad libitum”. Os mesmos
foram mantidos em jejum cerca de 8 a 12 horas antes dos experimentos de perfusão
renal apenas com água “ad libitum”.
4.11.2 Sistema utilizado
A necessidade do conhecimento dos mecanismos de controle da função renal

levou inúmeros pesquisadores a desenvolverem a técnica de perfusão de rim isolado.
53
O nosso sistema consiste na perfusão de rim isolado com recirculação (Fonteles et

al., 1983) com dois subsistemas, um in situ e outro em circuito fechado, para perfusão
in vitro, mantidos ambos à mesma temperatura de 37 ºC (Figura 11 e 12). Este
sistema apresenta a vantagem da manutenção constante de parâmetros funcionais
renais com utilização de albumina na solução perfusora, em menor volume, mantendo
constantes as substâncias dialisáveis com oxigenação adaptada ao próprio sistema.
Figura 11: Foto do sistema de perfusão de rim isolado. (Fonte: LAFAVET – UFC)
Figura 12 : Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado. (Fonte: LAFAVET –UFC).
4.11.2.1 Calibração do sistema
O sistema foi calibrado sempre antes do início dos experimentos com uma
solução de cloreto de sódio a 0,9% mantida a 37°C. Foi avaliado em cada uma das
bombas (1,2,3,4,5) a pressão de perfusão (PP) em mmHg, o fluxo urinário (L/min) e o
54
volume de urina coletado em um minuto (mL/min). Para uma melhor adaptação do

sistema às unidades, a coleta de dados foi realizada em intervalos de 2 minutos. As
figuras 13, 14 e 15 mostram que o sistema manteve-se constante em todos os grupos
experimentais.
Figura 13: Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durante a calibração do sistema (n = 6).
Figura 14: Valores registrados pelo fluxômetro (L/min) durante a calibração do sistema (n=6).
55
Figura 15: Valores de volume urinário (mL/min) registrados durante a calibração do sistema (n = 6).
A solução de Krebs-Henseleit modificada, concentrada 20 vezes, continha

NaCl = 138g; KCl = 7g; NaH2PO4.H2O = 3,2g; MgSO4.7H2O = 5,8g e Ureia = 10g.
Quarenta e oito horas antes dos experimentos, 100 mL desta solução foram
separados e acrescidos de NaHCO3 = 4,2g; CaCl2.2H2O = 0,74g; glicose = 2g e
penicilina G potássica cristalina = 0,05g. Em seguida, o volume foi completado para
2000 mL com água bidestilada. Foram retirados 300 mL desta solução, volume ao
qual se adicionou albumina bovina (6g%). Esta solução final foi dializada com a
albumina, auxiliada por um homogeneizador. A diálise teve como objetivo retirar
substâncias contaminantes como piruvatos, citratos e lactatos (COHEN; KOOK;
LITTLE, 1977; ROSS, 1978).
A solução de Krebs-Henseleit modificada para diálise foi trocada com 24 horas.
No final, após 48 horas de diálise, a solução perfusora foi acrescida com 0,15g de
inulina. O pH da solução perfusora foi ainda ajustado entre os valores de 7,3 a 7,4.
Os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico na dose de 50mg/Kg

de peso corporal. As cirurgias foram realizadas segundo o método descrito por
BALHLAMANN, GIEBISCH e OCHWADT (1967), ROSS (1978). Inicialmente, a veia
femoral foi isolada e manitol (100mg/mL–3mL) foi administrado a fim de facilitar a
visualização e a fixação da cânula ao ureter.
56
Após assepsia da parede abdominal, procedeu-se uma incisão mediana e

duas incisões perpendiculares à linha alba para uma melhor observação das
estruturas anatômicas. Com uma lupa o ureter foi identificado, dissecado e canulado
com um tubo de polietileno PE-30. A artéria renal foi isolada e canulada através da
artéria mesentérica superior. Durante o procedimento cirúrgico, uma parte da solução
já oxigenada (40 mL) foi desviada para o sistema de perfusão in situ, para perfundir o
rim ainda in vivo, evitando qualquer isquemia ao órgão. Finalmente, o rim foi
transportado para o sistema de perfusão in vitro, sem a interrupção do fluxo (figura
16).
Figura 16: Fotografia do rim de rato isolado no sistema de perfusão.

(Fonte: LAFAVET –UFC).
Os experimentos foram iniciados após a estabilização e adaptação do órgão às

novas condições. Os 30 min iniciais foram utilizados como controle interno. A cada
cinco minutos foram registrados a pressão de perfusão e o fluxo de perfusão em
manômetro e fluxômetro, respectivamente, em um período total de 120 min. Amostras
do perfusato e da urina foram coletadas a cada dez minutos e depois congeladas a
-20 ºC para posterior dosagem de sódio, potássio, cloreto, inulina e osmolaridade,
importantes na determinação dos seguintes parâmetros de função renal: pressão de
perfusão (PP), resistência vascular renal (RVR), ritmo de filtração glomerular (RFG),
fluxo urinário (FU) e transporte tubular de sódio (%TNa +), potássio (%TK+) e cloreto
(%TCl-).
57
4.11.3 Análises bioquímicas
Nas amostras de urina e perfusato foram realizadas dosagens de sódio,

potássio e cloreto utilizando aparelho de íons eletrodos seletivos (RapidChem 744 –
Bayer® diagnostica). A inulina do perfusato e da urina foi determinada por hidrólise
direta, conforme Walser, Davidson e Orloff (1955) e Fonteles et al. (1983) com
modificações que reduziram as quantidades de amostras e reagentes utilizados. Para
tanto, foram realizadas leituras fotométricas em espectrofotômetro e a osmolaridade
determinada através de osmômetro (Vapor pressure osmometer – modelo 5520
ESCOR).
4.11.4 Cálculo dos parâmetros funcionais renais
O quadro 1 apresenta as fórmulas utilizadas para determinação de parâmetros

funcionais renais (MARTINEZ-MALDONADO et al., 1978).
Quadro 1 : Fórmulas utilizadas para determinação dos parâmetros renais
Parâmetros renais Fórmula
1. PP (mmHg)- Pressão de Perfusão Leitura em manômetro
-1 -1
2. FU (mL.g . min ) – Fluxo Urinário FU = Peso do volume urinário/ peso do rim
esquerdo x 10
-1 -1
3. RFG (mL .g . min ) – Ritmo de Filtração RFG = (DOUin / DOPin x FU) sendo DOUin =
Glomerular densidade ótica da inulina na urina e DOPin =
densidade ótica da inulina no perfusato.
-1 -1
4. FPR (mL .g . min ) – Fluxo de perfusão renal Registrado a cada 10 min/peso do rim/intervalo
de tempo
58
-1 -1
5. RVR (mmHg/mL .g . min ) – Resistência RVR = PP (mmHg) / FPR
vascular renal.
+ -1 -1 + +
6. FNa (µEq.g . min ) – Sódio filtrado FNa = RFG x PNa
+ -1 -1 + +
7. ENa (µEq.g . min ) – Sódio excretado ENa = FU x UNa
+ -1 -1 + + +
8. TNa (µEq.g . min ) - Sódio transportado TNa = FNa - ENa
+ + + +
9. %TNa - Percentual de sódio transportado %TNa = TNa x 100/ FNa
+ -1 -1 + +
10. FKa (µEq.g . min ) – Potássio filtrado FKa = RFG x PKa
+ -1 -1 + +
11. EK (µEq.g . min ) – Potássio excretado EK = FU x UKa
+ -1 -1 + + +
12. TK (µEq.g . min ) – Potássio transportado TK = FK - EK
+ + + +
13. %TK - Percentual de potássio transportado %TK = TK x 100/ FK
- -1 -1 - - -
14. TCl (µEq.g . min ) – Cloreto transportado TCl = FCl - ECl
- - - -
15. %TCl - Percentual de cloreto transportado %TCl = TCl x 100/ FCl
- -1 -1 - -
16. FCl (µEq.g . min ) – Cloreto filtrado FCl = RFG x PCl
- -1 -1 - -
17. ECl (µEq.g . min ) – Cloreto excretado ECl = FU x UCl
4.12 Análise estatística
Os resultados obtidos foram expressos como média ± erro padrão da média e

submetidos à análise estatística através da análise de variância Anova de uma via,
seguido do pós-teste de Dunnett para comparações com experimento controle,
Bonferroni para comparações entre pares de grupos. Valores de p menores que 0,05
(p < 0,05) foram considerados estatisticamente significativos.
59
4.13 Comitê de Ética
Todos os nossos experimentos que foram utilizados animais foram feitos de

acordo com as recomendações do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais
(CEPA) da Universidade Federal do Ceará (número de protocolo 79/08).
60
RESULTADOS
61
5. RESULTADOS
5.1 Efeito da LAAO-Bl sobre a indução de morte nas células tubulares

renais (MDCK e HK2).
A citotoxicidade da LAAO-Bl foi avaliada em células tubulares renais (MDCK e

HK2) após 12 horas de exposição a diferentes concentrações da toxina através do
teste do MTT. Como mostrado na Fig. 17, LAAO-Bl induziu significativa morte celular
de maneira concentração dependente (p<0.05) em ambas as linhagens celulares.
Figura 17: Efeito da LAAO-Bl sobre a viabilidade de células tubulares renais ensaio com MTT.
As células foram tratadas com diferentes concentrações de LAAO-Bl por 12 h. Os resultados se
expressam como porcentagem de morte celular das amostras tratadas comparadas com as amostras
controle. Valores foram dados como média ± EPM de três experimentos independentes. * p <0,05
comparado ao grupo controle (teste Anova One-way, seguido do pós-teste de Dunnett).
5.2 Efeito da LAAO-Bl sobre a liberação da enzima lactato desidrogenase

(LDH).
Para avaliar se a morte celular por necrose está implicada na diminuição da

viabilidade celular, o sobrenadante de cultivo dos poços tratados com LAAO-Bl foi
62
removido para determinação dos níveis de LDH, uma enzima citoplasmática

presente em todas as células e liberada quando a integridade da membrana é
rompida. Como podemos observar na figura 18, nas células MDCK não foi
observado liberação de LDH após 12 horas de tratamento com LAAO-Bl (Fig 18a).
LAAO-Bl induziu ruptura da membrana nas células HK2 nas maiores concentrações
estudadas (50 e 25 µg/mL) em relação ao controle não tratado (Fig 18b).
MDCK HK2
Figura 18: Efeito da LAAO-Bl sobre a liberação da enzima lactato desidrogenase (LDH).
Liberação percentual da enzima lactato desidrogenase (LDH) nas células MDCK (a) e HK2 (b)
induzidas pelo tratamento com LAAO-Bl por 12 horas. Valores foram dados como média ± EPM de
três experimentos independentes. * p <0,05 comparado ao grupo controle (teste Anova One-way,
seguido do pós-teste de Dunnett).
5.3 Análise do tipo de morte celular por citometria de fluxo
Com o objetivo de identificar as modalidades de morte celular envolvidas nos

nossos resultados, analisamos diferentes marcadores de apoptose e necrose. A
exposição da fosfatidilserina (PS) no folheto exterior da membrana plasmática é
geralmente considerada uma característica de apoptose. Assim, a coloração de
células com FITC anexina V, que se liga a PS, é considerada um marcador de
apoptose precoce. O iodeto de propídio (IP) é um agente de intercalação do DNA
que pode ser incorporado nas células apenas depois de grandes danos da
membrana celular (IP). Assim, a coloração de anexina V/IP foi utilizada para detectar
63
células apoptóticas / necróticas após tratamento com LAAO-Bl. Nas células MDCK,
LAAO-Bl significativamente aumentou a porcentagem de células em apoptose
(Anexina-V+, IP-), necrose (Anexina-V-, IP+) e necrose secundária (Annexin-V+, IP +)
quando comparado ao grupo controle sem tratamento (Fig. 19a). Nas células HK-2,
corroborando com os dados obtidos da liberação de LDH, Anexina-V- IP demonstrou
um aumento na porcentagem de células em necrose (células IP +) e em necrose
secundária (Annexin-V+, IP +) de maneira concentração dependente (Fig. 19b). O
tratamento com estaurosporina (1 µg/mL) e doxorubicina (10 µM) por 12 horas foi
usado como controle positivo.
Figura 19: Análise do tipo de morte celular por citometria de fluxo: Quantificação do tipo de
morte celular (Apoptose/Necrose) utilizando marcação de fluorescência com Anexina V e Iodeto de
Propídeo (IP) nas células MDCK (a) e HK2 (b) expostas a diferentes concentrações de LAAO-Bl por
um período de 12h. Cinco mil eventos foram considerados em cada experimento. Estaurosporina
(1µg/mL) e Doxorrubicina (10µM) foram usadas como controle positivo. Valores foram dados como
média ± EPM de três experimentos independentes. * p <0,05 comparado ao grupo controle (teste
Anova One-way, seguido do pós-teste de Dunnett).
5.4 Efeito da LAAO-Bl sobre o potencial de membrana mitocondrial nas

células MDCK
Para verificar o efeito de LAAO-Bl sobre o potencial de membrana

mitocondrial (ΔΨm), a intensidade de fluorescência do tetrametilrodamina etil ester
(TMRE) foi mensurado, o qual indicou o ∆Ψm usando experimentos em tempo real
(50 µg/mL, 30 min) ou citometria de fluxo (50 µg/mL, 12h). Foi demonstrado após
64
tratamento com LAAO-Bl (15 min) que o sinal de fluorescência das células MDCK
aumentou rapidamente (hiperpolarização) (Fig 20a). Os dados foram confirmados
por citometria de fluxo, LAAO-Bl induziu um aumento na fluorescência do TMRE
indicando que o ∆Ψm também aumentou quando as células MDCK foram expostas a
LAAO-Bl (50 µg/mL) por 12 horas (Fig 20b). Para testar a sensibilidade do TMRE,
FCCP, um desacoplador da fosforilação oxidativa, foi adicionado às células com
TMRE. Após adição de FCCP, a fluorescência do TMRE diminuiu imediatamente
indicando despolarização mitocondrial (30 Min).
Figura 20: Medida do ΔΨm nas células MDCK: As células MDCK foram marcadas com TMRE 50
nM por 15 min, 37 °C, antes e após a adição de LAAO-Bl (a) A aquisição das imagens foi feita em
microscópio confocal. 0 min : Células marcadas com TMRE- 15 min : após a exposição com LAAO-Bl
que mostra o aumento do ΔΨm nas células MDCK em relação aos níveis basais. 30 min: Células
foram tratadas com o desacoplador FCCP (5 µM) usado como controlo positivo (b) histogramas
representativos obtidos a partir de células MDCK marcadas com TMRE, expostas a LAAO-Bl (50
ug/mL) e analisadas por citometria de fluxo.
65
5.5 Efeito da LAAO-Bl na mobilização de cálcio citosólico nas células

MDCK.
Nosso próximo objetivo foi avaliar a mobilização de cálcio citosólico induzida

por LAAO-Bl nas células MDCK. Para tanto, as células foram incubadas com o
indicador de cálcio citosólico Fura-2 AM. A aquisição das imagens foi feita em tempo
e espaço reais, por meio de um microscópio de fluorescência Nikon TE300 (Nikon
Osaka, Japão) acoplado a uma câmera digital CoolSnap (Roper Sci, Princeton
Instruments, USA), de alta resolução com sistema de resfriamento para diminuição
de ruídos e aumento da resolução. Podemos observar na figura 21 que LAAO-Bl
(50µg/mL) induziu um aumento significativo de Ca2+ citosólico. Como o retículo
endoplasmático (RE) é a principal organela responsável pela liberação de cálcio
citosólico, pré tratamos as células com tapsigargina (2 µM), que inibe a atividade da
SERCA presente no RE, e avaliamos a resposta de LAAO-Bl (50µg/mL).
Notavelmente, a mobilização de Ca2+ por LAAO-Bl foi diminuída nesta condição
devido à inibição da bomba de cálcio do retículo (SERCA). Para definir o mecanismo
que LAAO-Bl promove a liberação de Ca2+ a partir do retículo, e elucidar o possível
envolvimento dos canais de Ca2+ nessas respostas, as células MDCK foram pré
tratadas com diferentes inibidores dos canais de Ca2+ do retículo, tais como
rianodina (20 µM, 20 min) e 2-APB (100 uM, 10 min), que inibem a liberação de Ca2+
do receptor de rianodina e IP3, respectivamente. Os nossos resultados mostraram
que rianodina e 2-APB foram capazes de diminuir a resposta de LAAO-Bl na
mobilização de Ca2+ do retículo, sugerindo uma regulação desses canais na
mobilização de cálcio intracelular induzida por LAAO-Bl. Os valores médios do
aumento de Ca2+ citosólico, obtidos a partir destes experimentos, estão graficamente
representados na figura 21. Os resultados representam a média de pelo menos três
experimentos, com número de células variado.
66
Figura 21: Efeito da LAAO-Bl na mobilização de cálcio citosólico nas células MDCK: Gráfico de
2+
colunas representando os efeitos máximos do aumento de Ca citosólico em relação ao basal
(considerado como valor zero), nas células MDCK. As células MDCK foram carregadas com Fura-2
AM e as respostas máximas de cálcio promovidas pela adição de LAAO-Bl (50 µg/mL) na presença
de diferentes antagonistas: tapsigargina (TAP, 2 μM, 20 min), 2-APB (100 μM, 10 min) e rianodina (
20 μM, 20 min). * representa as diferenças entre LAAO x (TAP+LAAO, 2APB+LAAO). Diferença
considerada quando p < 0,05 (one-way ANOVA; pós-teste: Tukey).
5.6 Estresse oxidativo induzido por LAAO-Bl nas células MDCK
Para investigar o possível envolvimento da produção de EROS no mecanismo

de citotoxicidade de LAAO-Bl, analisamos os níveis de EROS nas células MDCK
após exposição a LAAO-Bl (50µg/mL). Para este efeito, as células foram marcadas
com diacetato de 7'-diclorofluoresceina (DCFH-DA) um marcador não-fluorescente
de células-permeáveis que se transforma em altamente fluorescente 2',7'-
diclorofluoresceína após oxidação. As alterações na fluorescência foram analisadas
por citometria de fluxo. LAAO-Bl induziu um aumento dos níveis de EROS
intracelulares observado através da mudança significativa do pico (mudança na
intensidade de fluorescência relativa), quando comparado com o grupo controle sem
tratamento (Fig. 22a). O agente oxidante tercbutilhidroperoxido- (t-BHP) foi usado
como controle positivo. Para melhor avaliar o papel do aumento do cálcio e do
estresse oxidativo na sinalização da apoptose induzida por LAAO-Bl, as células
MDCK foram pré tratadas com BAPTA-AM (20 µM, 30 min), um quelante de Ca2+, e
67
catalase (100 μg/mL, 30 min) que bloqueia a ação do peróxido. Nossos resultados
mostraram que apoptose induzida por LAAO-Bl nas células MDCK não foi revertida
quando bloqueamos a ação do Ca2+ citosólico. Por outro lado, ao bloquear a ação do
peróxido de hidrogênio, houve uma redução significativa na apoptose induzida por
LAAO-Bl, confirmando a importância da produção de EROS na sinalização da
apoptose induzida por LAAO-Bl (Fig. 22b)
Figura 22: Determinação do aumento intracelular de EROS nas células MDCK: (a) As células
MDCK foram tratadas com LAAO-Bl (50 ug / mL) durante 12h e foram incubas com DCFH-DA (5 µM,
30 min a 37˚C), em seguida, examinadas por citometria de fluxo. Geração de ROS foi expressa como
uma proporção da intensidade de fluorescência relativa em comparação com o grupo controle. Foi
utilizado t-BHP (5 µM) como controle positivo. (b) Análise quantitativa do percentual de apoptose por
citometria de fluxo de células marcadas com iodeto de propídio (IP, 50 ug /mL) após tratamento com
LAAO-Bl (50 ug/ml) durante 12 horas, na presença ou ausência de catalase (CAT- 100 µg/mL) ou
68
BAPTA-AM (20 µM). Os dados representam a média ± SEM de pelo menos três experimentos
independentes. * Diferença considerada quando p < 0,05 (one-way ANOVA; pós-teste: Dunnet).
5.7 Avaliação da ativação de caspases efetoras do processo de morte

celular por apoptose.
A fim de confirmar o efeito apoptótico da LAAO-Bl nas células tubulares renais

(MDCK e HK2), avaliamos a ativação da via das caspases. Para tanto, medimos a
atividade destas enzimas sobre substratos específicos. O substrato Ac-DEVD-afc foi
usado para avaliar a atividade da caspase efetora 3 (ou 7, pois o substrato seria o
mesmo), chave no processo de apoptose, sendo responsável por clivar e iniciar a
degradação da grande maioria das proteínas celulares. A figura 23a mostra que nas
células MDCK houve ativação da caspase 3 e 7 nas concentrações de 100 e 50
µg/mL e nas células HK2 na concentração de 50 µg/mL de LAAO-Bl (Fig 23b). Este
resultado de ativação da via das caspases indica um envolvimento desta via na
toxicidade de LAAO-Bl em ambas as linhagens celulares. Para melhor avaliarmos a
atividade das caspases, tratamos as células com inibidores específicos das
caspases estudadas (ZVAD- 10 µM). Verificamos que a atividade da caspase 3/7 é
inibida pelo pré tratamento das células com ZVAD (Fig 23ab). Este resultado
demonstra que o inibidor específico da caspase 3/7 leva a interrupção do sinal
apoptótico no final da via das caspases, e não ocorre a clivagem de pró-caspase 3
em caspase 3 ativa. Porém a interrupção do sinal apoptótico por ZVAD foi incapaz
de proteger as células MDCK da toxicidade induzida por LAAO-Bl (Fig 23c)
69
MDCK HK2
Figura 23: Avaliação da ativação de caspases executores: A atividade da caspase-3/7 foi

determinada na presença do substrato Ac-DEVD-AFC fluorogênico após o tratamento com LAAO-Bl
(12 h) na presença ou ausência de zVAD (10 µM) nas células MDCK (a) e HK-2 (b) Diferença
considerada quando p < 0,05 (one-way ANOVA; pós-teste: Dunnet). (c) Porcentagem de morte celular
induzida por LAAO-Bl na presença ou ausência de ZVAD (10 µM), ensaio realizado pelo teste do
MTT.
Para confirmar o mecanismo envolvido na apoptose induzida por LAAO-Bl

nós analisamos a expressão de proteínas pró apoptoticas e de caspases executoras
da apoptose. Como mostrado na figura 24A- abc, nas células MDCK o tratamento
com LAAO-Bl induziu aumento de expressão da caspase 3 e 7 clivada e da proteína
pró apoptótica Bax após 12 horas de tratamento. Nas células HK2 LAAO-Bl (50
70
µg/mL) induziu aumento da expressão da caspase 3 e 7 clivada (Fig 24B-ab). Como

controle interno foi utilizada a proteína tubulina. Doxorrubicina (Doxo) 10 µM foi
usada como controle positivo
A
71
Figura 24: Western blotting das proteínas envolvidas na morte celular por apoptose. As células
MDCK e HK2 foram tratadas com LAAO-Bl por 12 horas nas concentrações indicadas na figura. A (a)
caspase 3, (b) caspase 7, (c) Bax nas células MDCK. B (a) caspase 3, (b) caspase 7 nas células
HK2. As figuras mostradas são representativas de 2 experimentos independentes. As bandas de
proteínas foram analisadas e normalizadas para os valores densitométricos de Tubulina: Controle
interno. Doxorrubicina (Doxo 10µM) controle positivo.
5.8 Avaliação da liberação de citocromo c induzido por LAAO-Bl nas

células HK2
Uma vez que verificamos ativação da via das caspases e, na tentativa de

elucidar se a apoptose induzida nas células HK2 por LAAO-Bl envolve a via
mitocondrial, realizamos o ensaio de liberação do citocromo c por
imunofluorescência. O citocromo c uma vez liberado, induz a formação dos
apoptossomos, contendo Apaf-1 (Apoptosis Protease-activing Factor-1), o iniciador
pró-caspase 9 e o próprio citocromo c. Este complexo leva à clivagem de pró-
caspase 9 e inicia a cascata de caspases efetoras 3 e 7 (YANG et al., 2015). Para
avaliar a liberação de citocromo c, as células HK2 foram tratadas com LAAO- Bl nas
concentrações de 50 e 25 µg/mL pelo tempo de 6 horas. Os resultados obtidos estão
demonstrados na figura 25. Observa-se no controle o padrão de localização do
72
citocromo c (morfologia tubular) e nas células que foram tratadas com LAAO-Bl
verifica-se um padrão difuso, indicando que houve a liberação do citocromo c da
mitocôndria para o citosol.
Figura 25: Efeito da LAAO-Bl na liberação de citocromo c no citosol nas células HK2: As células
HK2 foram tratadas com LAAO-Bl por 6 horas nas concentrações indicadas na figura. As células
foram marcadas com um anticorpo primário contra Citocromo c (SC13561; Santa Cruz), seguido de
anti-IgG de rato conjugado com FITC (Jackson ImmunoResearch). As imagens foram obtidas usando
o microscópio Leica DM 6000 (câmera Leica DC500) com uma objetiva de 20X
73
5.9 Efeitos da LAAO-Bl em rim isolado de rato
LAAO-Bl foi administrada ao sistema de perfusão de rim isolado 30 minutos

após o início dos experimentos. Os 30 minutos iniciais foram considerados como
controle interno de cada experimento. Os grupos tratados foram comparados a um
grupo controle, onde os rins foram perfundidos apenas com a solução de Krebs-
Heinselet.
LAAO-Bl (10 µg/mL) induziu alterações significativas nos parâmetros

fisiológicos renais. A Pressão de Perfusão (PP) aumentou aos 60 min e retornou ao
normal aos 90 min de perfusão (Fig. 26A). Não houve diferença significativa na
Resistencia Vascular Renal (RVR) quando comparado ao grupo controle. O Ritmo
de Filtração Glomerular (RFG) diminuiu aos 60 e 90 min de perfusão e normalizou
aos 120 min (Fig. 26B). O Fluxo Urinário (FU) aumentou aos 120 minutos (Fig. 26C).
Houve redução significativa nos transportes tubular de Sódio, Potássio e Cloreto nos
períodos de 60, 90 e 120 min de perfusão (Fig 26. D, E, F).
74
Figura 26: Efeitos da LAAO-Bl em rim isolado de rato: Efeitos de LAAO-Bl (10 µg/mL) sobre
Pressão de Perfusão (A), Ritmo de Filtração Glomerular (B), Fluxo urinário (C), Porcentagem de
Transporte tubular de sódio, potássio e cloreto (D, E, F). Os dados são expressos como (média ±
E.P.M.). Análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t de Student,
considerando p<0,05. LAAO foi adicionada ao sistema 30 minutos após o inicio de cada perfusão .
75
DISCUSSÃO
76
6. DISCUSSÃO
A serpente B. leucurus é endêmica no Nordeste do Brasil, sendo responsável

por acidentes ofídicos graves notificados nesta região. O quadro clínico do
envenenamento por B. leucurus tem perfil semelhante àqueles apresentados por
outras serpentes do gênero Bothrops (SANCHEZ et al., 1992), ou seja, importantes
efeitos locais como dor, edema e necrose tecidual e efeitos sistêmicos graves como
hemorragia e insuficiência renal aguda (LIRA-DA SILVA., 2009; SATURNINO-
OLIVEIRA et al., 2014).
À semelhança das outras espécies do gênero Bothrops, a peçonha de

B.leucurus contém uma variedade de proteínas e enzimas (CECILIO et al., 2013),
várias das quais foram isoladas e caracterizadas, incluindo L-amino ácido oxidase
(NAUMAN et al., 2011), metaloproteinases (BELLO et al., 2006, SANCHEZ et al.,
2007, FERREIRA et al., 2009; GOMES et al., 2011; HIGUCHI et al., 2011),
Fosfolipases A2 (HIGUCHI et al., 2007; CECILIO et al., 2013; MARANGONI et al.,
2013).
O maior componente protéico do veneno de Bothrops leucurus é a enzima L-

aminoácido oxidase. Naumann e colaboradores (2011) estudaram vários aspectos
da LAAO isolada do veneno de Bothrops leucurus, concluindo que essa enzima,
apresenta características de uma citotoxina. Entretanto, o mecanismo funcional e a
correspondente base estrutural da atividade dessa flavoproteína ainda requerem
estudos aprofundados. O conhecimento do mecanismo de ação dessa e de outras
toxinas animais nos dá uma melhor compreensão dos mecanismos de
envenenamento.
Recentemente, observamos que o veneno de Bothrops leucurus induziu

nefrotoxicidade no rim isolado de rato, associado com citotoxidade em células
tubulares renais (DE MORAIS et al., 2013). A fim de melhorar o entendimento sobre
esse efeito biológico, investigamos o papel da LAAO na nefrotoxicidade do veneno.
Com o objetivo de esclarecer os mecanismos moleculares pelos quais LAAO-

Bl induz nefrotoxicidade avaliamos seu potencial citotóxico em linhagens de células
tubulares epiteliais renais. MDCK, isolada do túbulo distal canino (COLLARES-
77
BUZATO et al., 2002) e HK-2 isolada do túbulo proximal humano (LIN et al., 2014).
Nossos resultados mostraram que LAAO-Bl induziu morte celular de maneira
concentração dependente em ambas as linhagens. Ensaio de liberação de LDH e
marcação com Anexina V/IP sugerem que a morte celular ocorreu por necrose e
apoptose.
Existem muitos trabalhos na literatura mostrando que LAAO isolada de outros

venenos de serpentes induz apoptose e necrose em diferentes tipos celulares
(TORRI et al., 2000; SUN et al., 2003; CISOTTO et al., 2009; NAUMAN et al., 2011;
MARCUSSI et al., 2013; LEE et al., 2014). Dentre estes trabalhos, foi observado que
LAAO induziu citotoxicidade via apoptose em células endotelias, células
embrionárias renais, células da linhagem monocítica e células cancerígenas (ALI et
al., 2000; TORRI et al., 2000; LIU et al., 2002). LAAO isolada de B. leucurus induziu
morte por apoptose em linhagens de células de câncer de estômago,
adenocarcinoma, colorretal e células de fibroblastos humanos (NAUMAN et al.,
2011).
O mecanismo de citotoxicidade desencadeado por esta classe de enzimas

ainda não está completamente esclarecido. Hipóteses postulam que LAAO liga-se
diretamente a superfície da célula, o H2O2 liberado é então acumulado nesta área
em uma concentração relativa mais elevada, e a apoptose é desencadeada pela
oxidação de membrana. No entanto, evidências experimentais sugerem que o
mecanismo de apoptose induzido por LAAO é distinto daquele causada pelo H2O2
exógeno (CHUNMEI et al., 2012).
As células tubulares epiteliais são os principais alvos dos efeitos tóxicos dos
venenos (MARROTA et al., 2006; SITPRIJA e SITPRIJA, 2012). A apoptose nessas
células é responsável pela perda da função renal e pode ser induzida por vários
estímulos, incluindo, disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, distúrbio na
sinalização do Ca2+ e privação de energia (LIN et al., 2014). Alguns estudos
sugerem que a apoptose induzida por LAAO, pode ser sinalizada através da via
mitocondrial ou pela via do receptor de morte consequente a um efeito secundário
da produção do peróxido (WEI et al., 2009; DEOLINDO et al., 2010) .
Na via intrínseca, ou via mitocondrial, os estímulos gerados no interior da

célula levam a ativação de proteínas pró-apoptóticas (Bax, Bak e tBid). Em seguida,
78
ocorre a ruptura do potencial transmembrânico mitocondrial, fazendo com que

ocorra um influxo de íons e ao mesmo tempo a liberação de proteínas pró-
apoptóticas como o citocromo c para o citosol. Uma vez liberado, o citocromo c se
liga a APAF-1 que facilita a ligação de dATP e a procaspase 9, formando o
apoptossomo. O apoptossomo ativa as caspases 3 e 7, que por sua vez vão clivar
os substratos protéicos das células, resultando no processo apoptótico (JEONG et
al., 2015).
A via extrínseca é deflagrada por estímulos externos que ativam os

receptores de morte na superfície celular (TNF, CD95/Faz e TRAIL). Após a ligação
do ligante os receptores oligomerizam-se e se ligam à proteína adaptadora FADD
(Fas associated death domain) presente no citoplasma. Este complexo molecular se
liga à pró-caspase-8, resultando na formação do complexo DISC (Death Inducing
Signalling Complex), onde ocorre a ativação (dimerização/clivagem) da pró-caspase-
8, resultando na ativação da caspase-3 efetora, o que culmina na morte celular
(CHABANE et al., 2013).
Uma importante característica associada ao dano celular é o potencial de

membrana mitocondrial (∆Ψm). Alterações no potencial de membrana mitocondrial,
que pode ser consequência do aumento de espécies reativas de oxigênio ou
aumento de [Ca2+]c, é considerado um indicador de dano mitocondrial e é
geralmente definido como um estágio inicial de apoptose (SMAILI et al., 2003).
Assim no presente trabalho, decidimos investigar se LAAO-Bl seria capaz de
sensibilizar as mitocôndrias. Nossos dados mostraram que LAAO-Bl (50µg/mL)
induziu hiperpolarização mitocondrial nas células MDCK. Alguns trabalhos sugerem
que o potencial de membrana mitocondrial aumenta após indução de apoptose,
iniciada por EROS, cálcio, Bax e ceramidas (LIU et al., 2013).
As espécies reativas de oxigênio são indispensáveis para as vias de

transdução de sinais que regulam a morte celular e o estado redox da célula. Sua
produção excessiva pode danificar lipídios, proteínas e DNA. Estresse oxidativo em
células tubulares renais tem emergido como a maior causa de dano renal em
diferentes condições fisiopatológicas, como falência renal crônica, hipertensão e
diabetes (VERZOLA et al., 2014; ZHU et al., 2015).
79
Neste estudo a geração de espécies reativas de oxigênio e peróxido de

hidrogênio foi monitorada com DCFH-DA e nossos resultados mostraram que LAAO-
Bl (50µg/mL) induziu o aumento de espécies reativas de oxigênio nas células MDCK.
Ao remover o peróxido do meio, pela adição de catalase, verificamos que
aproximadamente 50% do efeito apoptótico foi abolido, sugerindo que o peróxido
inicia um importante papel na indução de apoptose em células renais por LAAO-Bl.
Como mencionado anteriormente, apoptose induzida por sv-LAAOs é

principalmente atribuída à formação do H2O2 e consequentemente ao estresse
oxidativo causado pelo aumento do peróxido (SUN et al., 2003; SAMEL et al., 2006;
TOYAMA et al., 2006; ZHANG; WEI., 2007; ALVES et al., 2008). Stabeli et al.,
(2007) também demonstraram inibição dos efeitos tóxicos de LAAO isolada de
Bothrops moojeni quando os efeitos do peróxido foram bloqueados pela catalase. No
entanto, as características morfológicas das células em processo de apoptose
induzido por LAAO e H2O2 exógeno são diferentes. Antioxidante e catalase podem
abolir a apoptose induzida por LAAO, mas não inibem a apoptose induzida pelo
H2O2 exógeno. Em outras palavras, apoptose induzida por LAAO isolada de venenos
de serpentes não é apenas desencadeada pelo H2O2 produzido pela reação
enzimática (KANZAWA et al., 2004).
O Ca2+ é o mais versátil dos mensageiros intracelulares, sabe-se que a

homeostase do íon Ca2+ é de fundamental importância para a regulação das
diversas atividades fisiológicas da célula, bem como para a sobrevivência celular.
Pesquisas recentes mostram que a sobrecarga celular de Ca2+, ou alteração da
compartimentalização do Ca2+ intracelular, pode induzir citotoxicidade ou acionar a
morte celular por apoptose ou necrose (PATERGNANI et al., 2015). O aumento da
[Ca2+]c ocorre não somente pelo influxo do íon a partir do meio extracelular, mas
também pelo esvaziamento de estoques intracelulares, tais como retículo
endoplasmático (RE) e mitocôndria (SMAILI et al, 2008). A saída de Ca2+ do RE se
dá principalmente através dos receptores de IP3 (IP3Rs) e dos receptores de
rianodina (RyRs), ambos localizados na membrana desta organela (BERRIDGE;
BOOTMAN; RODERICK, 2003).
Uma vez que verificamos o aumento da concentração citosólica de cálcio na

morte celular induzida pelo veneno de B. leucurus (De MORAIS et al., 2013) e dada
80
à participação crucial do cálcio na sinalização da morte celular por necrose e

apoptose, nosso próximo objetivo foi estudar o envolvimento do íon cálcio na
toxicidade induzida por LAAO-Bl nas células MDCK. LAAO-Bl (50µg/mL) induziu
aumento significativo de Ca2+ citosólico. O principal estoque de cálcio envolvido foi o
do retículo endoplasmático (RE) via receptores de IP3. A função do RE é
prejudicada principalmente pelo estresse oxidativo, o qual é a maior causa de
liberação de seus estoques de cálcio (CAO et al., 2014). Embora o Ca2+ participe do
efeito de LAAO-Bl no dano celular, apoptose induzida por LAAO nas células MDCK
não foi revertida quando o Ca2+ citosólico foi quelado.
As células em processo de apoptose apresentam alterações morfológicas que

são resultado final da ativação de enzimas específicas denominadas caspases.
Estas enzimas modulam o processo apoptótico e servem como marcadores
primários nos ensaios de apoptose antes mesmo que os sinais morfológicos estejam
evidentes. As caspases são responsáveis pela clivagem de substratos que
contenham resíduos de ácido aspártico, como a enzima poli-ADP-ribose-polimerase,
proteínas reguladoras de ciclo celular, proteínas estruturais, como laminina e actina,
dentre outras (FERREIRA et al., 2010). Caspases relacionadas a apoptose são
classificadas em dois grandes grupos, as caspases iniciadoras, consistindo em
caspase 8, 9 e 10 e as efetoras que são as caspases 3, 6 e 7 (WU et al., 2014).
Os resultados deste trabalho mostraram que LAAO-Bl desencadeou ativação

de caspase 3 e 7 nas células MDCK e HK2, e que o tratamento com LAAO-Bl
aumentou a expressão da proteína pró apoptotica Bax nas células MDCK. Através
destes resultados, concluímos que LAAO-Bl induziu morte celular através de
caspases mediando apoptose via mitocondrial nas células MDCK. É importante
mencionar que em ambas as vias, a ativação da caspase-3 é o ponto crucial e
irreversível do fenômeno de morte celular, portanto, neste estágio, mesmo que a
atividade da caspase 3 esteja inibida, não há mecanismos que possam reverter a
apoptose. Outros trabalhos mostraram que LAAO induziu apoptose através de
ativação de caspases (ZHANG ; CUI; 2007; ALVES et al., 2008; ZHANG; WU, 2008;
LEE et al., 2014).
O desarranjo mitocondrial pode facilitar a liberação de citocromo c para o

citoplasma, onde o mesmo forma complexo com o fator de ativação associado à
81
apoptose-1 (APAF-1) e caspase-9, o chamado apoptossomo, que promove a

clivagem da pró-caspase-9, liberando a caspase-9 ativa, que é capaz de ativar a
caspase-3 e provocar a apoptose (WU et al., 2014). Os nossos resultados
mostraram que LAAO-Bl induziu liberação de citocromo c nas células HK2,
evidenciando que neste tipo celular LAAO-Bl induz apoptose via mitocondrial.
Nós usamos o modelo de perfusão de rim isolado de rato a fim de estudar o

potencial nefrotóxico de LAAO-Bl e esclarecer o seu envolvimento nos efeitos renais
induzidos pelo veneno de B. leucurus. LAAO- Bl induziu um aumento na pressão de
perfusão e fluxo urinário, sem nenhum efeito na resistência vascular renal.
Observamos uma diminuição significativa no ritmo de filtração glomerular e nos
transportes tubulares de sódio, potássio e cloreto. A perda da função das células
tubulares epiteliais induzida por LAAO-Bl pode explicar alguns dos efeitos renais
observados neste estudo, como o aumento do fluxo urinário e a redução do
transporte de eletrólitos. Usando este mesmo modelo, nós mostramos que o veneno
de Bothrops leucurus também reduziu o ritmo de filtração glomerular e os
transportes tubulares de sódio e potássio, contudo causou diminuição na pressão de
perfusão e no fluxo urinário (DE MORAIS et al., 2013)
A excreção de sódio encontra-se aumentada na maioria dos venenos
estudados no sistema de perfusão de rim isolado, refletindo uma diminuição na
reabsorção tubular de sódio (MARTINS et al., 2005; HAVT et al., 2005.,
EVANGELISTA et al., 2010). Com relação à diminuição do ritmo de filtração
glomerular pode ser devido à diminuição no coeficiente de filtração glomerular o que
possivelmente reflete o efeito do veneno/toxina em células mesangiais (SITPRIJA e
SITPRIJA, 2012).
Vários componentes proteicos presentes no veneno de serpentes do gênero
Bothrops contribuem para toxicidade renal. Em estudos de perfusão de rim isolado
de rato foi observado que LAAO (BRAGA et al., 2008), lectinas tipo C (HAVT et al.,
2005, BRAGA et al., 2006), fosfolipase A2 (PLA2), (BRAGA et al., 2006) miotoxinas
(BARBOSA et al., 2005) e enzimas trombina-like (BARBOSA et al., 2006) induziram
efeitos nefrotóxicos diretos. LAAO pode causar injúria renal através da geração do
peróxido de hidrogênio, o qual pode induzir injúria endotelial, agregação plaquetária
e apoptose (NAUMAN et al., 2011; MORAIS et al., 2015).
82
Através dos resultados obtidos neste estudo, verificamos que LAAO-Bl é

capaz de causar alterações nos parâmetros fisiológicos renais no modelo de
perfusão de rim isolado de rato. Esses efeitos observados no rim isolado podem
estar associados com a perda da função das células tubulares, uma vez que
demonstramos que LAAO-Bl induziu apoptose via estresse oxidativo nas células
tubulares renais.
Nossos resultados ajudarão a compreender o mecanismo de nefrotoxicidade

desencadeado por LAAO isolada do veneno de B. leucurus. Conhecer os eventos
moleculares responsáveis pela insuficiência renal aguda causada por ofidismo,
poderá contribuir para o conhecimento da patofisiologia renal e ajudar no
desenvolvimento de fármacos e estratégias terapêuticas mais efetivas.
83
CONCLUSÕES
84
7. CONCLUSÕES
 LAAO-Bl induziu morte celular de maneira concentração dependente nas

células tubulares epiteliais renais (MDCK e HK2).
 LAAO-Bl induziu morte por necrose e apoptose em ambas as linhagens

celulares. Nas células MDCK o tipo de morte predominante foi por apoptose e
nas células HK2 por necrose.
 Nas células MDCK, LAAO-Bl induziu ativação e aumento de expressão das

caspases 3 e 7. Também induziu aumento de expressão da proteína pró
apoptótica Bax, confirmando o envolvimento da via intrínseca no efeito
apoptótico de LAAO-Bl.
 Nas células HK2, LAAO-Bl também induziu ativação e aumento de expressão

da caspase 3 e 7. Verificamos também que LAAO induziu a liberação de
citocromo c, evidenciando a ativação da via intrínseca no efeito apoptótico de
LAAO-Bl.
 LAAO-Bl aumentou os níveis de cálcio citosólico nas células MDCK. O

aumento do cálcio foi correlacionado a liberação de Ca 2+ de estoques
sensíveis a tapsigargina e rianodiana, como o retículo endoplasmático.
 LAAO-Bl aumentou os níveis de espécies reativas de oxigênio nas células

MDCK.
 Catalase bloqueou a apoptose induzida por LAAO-Bl nas células MDCK,

confirmando a participação do H2O2 no efeito apoptótico de LAAO-Bl.
 LAAO-Bl promoveu alterações na fisiologia renal avaliados no sistema de

perfusão de rim isolado de rato.
85
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

ISABEL CRISTINA OLIVEIRA DE MORAIS

EFEITO NEFROTÓXICO DIRETO INDUZIDO PELA FRAÇÃO

L-AMINOÁCIDO OXIDASE ISOLADA DO VENENO DA SERPENTE

ORIENTADORA: ALICE MARIA COSTA MARTINS

EFEITO NEFROTÓXICO DIRETO INDUZIDO PELA FRAÇÃO

L-AMINOÁCIDO OXIDASE ISOLADA DO VENENO DA SERPENTE

Tese de doutorado apresentada à Coordenação do

ORIENTADORA: ALICE MARIA COSTA MARTINS

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

M825e Morais, Isabel Cristina Oliveira de.

Efeito nefrotóxico direto induzido pela fração l-aminoácido oxidase

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de

Área de concentração: Farmacologia.

Orientação: Profa. Dra. Alice Maria Costa Martins.

1. Nefropatias. 2. Toxicidade. 3. Apoptose. 4. L-Aminoácido Oxidase. I. Título.

Aos meus pais, Socorro e Vicente.

À Professora Dra. Alice Maria Costa Martins, pela orientação, exemplo,

As amigas Roberta Jeane, Larissa Gonçalves e Janaina Serra Azul pela

Aos amigos do Laboratório de Nefrologia e Doenças Tropicais (LNDT):

A todos os amigos do Grupo de Pesquisa de Sinalização e Morte Celular por

A todos do laboratório de Peptídeos e Proteínas e do Centro de Investigação

À Banca examinadora, pelo aceite ao convite.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Agradeço a todos que contribuíram de maneira direta ou indireta em minha

À todos meus sinceros agradecimentos.

“La mejor recompensa que puede tener un científico es ver que su

Enrique Pérez Payá

A Bothrops leucurus (jararaca do rabo branco) é uma serpente peçonhenta que

Palavras-chave: Nefropatias; Toxicidade; Apoptose; L-Aminoácido Oxidase

The pit viper Bothrops leucurus (White-tailed-jararaca) is a poisonous snake

Keywords: Nephropathy; Toxicity, Apoptosis, L- aminoacid oxidase.

[Ca2+]c - concentração citoplasmática de íons cálcio

Figura 1. Bothrops leucurus 21

Tabela 1. Estudos de nefrotoxidade direta com venenos de Bothrops no 57

Envenenamento por serpentes, reconhecido como uma doença tropical

Dentre as famílias de serpentes peçonhentas existentes no Brasil, destaca-se

1.1 Gênero Bothrops e Bothropoides

Na América do Sul, serpentes do gênero Bothrops apresentam um alto

cabeça triangular e fosseta loreal. Habitam preferencialmente os ambientes úmidos,

1.1.1 Bothrops leucurus

Figura 1: Bothrops leucurus (Fonte: http://www.venomland.org).

1.1.1.1 Distribuição geográfico epidemiológica.

Figura 2: Distribuição geográfica da serpente Bothrops leucurus. (Fonte:

Do ponto de vista médico, Bothrops leucurus constitui uma importante

1.2 Veneno botrópico

1.2.1 Composição química

Os venenos de serpentes do gênero Bothrops são constituídos por uma

Os maiores componentes proteicos do veneno (cerca de 90% do peso seco),

Figura 3: Composição química do veneno botrópico (Fonte: DE TONI et al., 2015).

As fosfolipases isoladas de venenos de serpentes (svPLA2s) são enzimas

(principalmente fosfolipídios) (FERREIRA et al., 2013). Atuam catalisando a hidrólise

As metaloproteases e serinoproteases são complexos de proteases que atuam

Metaloproteinases de venenos de serpentes têm sido objeto de muito estudo

As serinoproteases estão associadas aos distúrbios hemostáticos devido à sua

Outro importante componente protéico encontrado nos venenos botrópicos é a

L-aminoácido oxidases isoladas dos venenos de serpentes (svLAAOS)

Até a década de noventa, os estudos realizados com LAAOs foram restritos as