MARCADORES MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE

HÍBRIDOS E INTROGRESSÃO GENÉTICA EM

POPULAÇÕES DE Pseudoplatystoma corruscans E
Pseudoplatystoma reticulatum

Fernanda Dotti do Prado

BOTUCATU-SP
2014
 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"Júlio de Mesquita Filho"

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU

MARCADORES MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE

HÍBRIDOS E INTROGRESSÃO GENÉTICA EM
POPULAÇÕES DE Pseudoplatystoma corruscans E
Pseudoplatystoma reticulatum

FERNANDA DOTTI DO PRADO

ORIENTADOR: FÁBIO PORTO FORESTI

Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus

de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de
Doutor no Programa de Pós Graduação em Ciências
Biológicas (Genética).

BOTUCATU-SP
2014
 “ ... e se o olhar tenta seguir o voo de uma vistosa borboleta, ele é interrompido por alguma
árvore ou fruta estranha. E ao olhar um inseto, ele é deixado de fora para que uma maior
atenção seja dada à estranha flor sobre a qual ele rasteja…. A mente é um caos de encanto.”
Charles Darwin
A minha família, em especial a minha mãe Luzia
 Agradecimentos

Meu agradecimento a todas as Instituições e pessoas que contribuíram com o

desenvolvimento deste trabalho, em particular:

À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), pelo auxílio

financeiro concedido (Processo Fapesp 2009/18326-4).

Ao programa de Pós Graduação (A/C: Genética) da UNESP, Campus de Botucatu, que

possibilitou o desenvolvimento deste Doutorado.

À seção de Pós Graduação do Instituto de Biociências da UNESP, Botucatu.

Ao Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências, UNESP, Bauru.

Ao Prof. Dr. Fábio Porto-Foresti. Por me receber em seu laboratório desde o início da
minha graduação, por todos os ensinamentos, orientação e oportunidades que me ofereceu até
hoje, fundamentais para o meu crescimento profissional e humano. Agradeço também pela
amizade e bons momentos no laboratório.

Ao Prof. Dr. Fausto Foresti, pelos valiosos ensinamentos e oportunidades. Por

disponibilizar o laboratório e amostras para as análises deste projeto.

Ao professor Dr. Jehud Bortolozzi, pelas oportunidades de ministrar disciplinas e

monitorias. Pelos ensinamentos em genética e evolução, e pela amizade durante a graduação e
pós-graduação.

Ao pesquisador Dr. José A. Senhorini, pelas coletas e amostras de material biológico.

Por sempre apoiar e incentivar a pesquisa com os bagres, por sua amizade e parceria.

Ao pesquisador Dr. Diogo Teruo Hashimoto, pela amizade e pela ajuda e

ensinamentos no desenvolvimento dos marcadores genéticos e estudo da hibridação.
 Ao Prof. Dr. Cláudio de Oliveira pelas amostras de material biológico e por
disponibilizar as análises no laboratório.

Ao Prof. Dr. Luiz H. Garcia Pereira, Prof. Dr. Celso Benites e Dr. Sebástian Sanchez,
por disponibilizarem amostras de material biológico para este trabalho.

Aos companheiros e amigos do Laboratório de Genética de Peixes de Bauru: Aline,

Andrea, Bruna, Caio, Diego, Faiçall, Flávio, Maíce, Manolo, Milena, Raquel, Rosangela,
Sandro, Vinícius, Will, assim como Carol, Daniela, Diogo, Tatiana e todos os demais alunos
que já estiveram no laboratório. Agradeço pela ajuda com as práticas moleculares, programas,
análise dos dados, formatação da tese e inglês. Além disso, sou especialmente grata pela
amizade e por nos ajudarmos uns aos outros, aprendendo a conviver com as diferenças e nos
tornando pessoas melhores.

Aos professores, técnicos e amigos do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes,

UNESP, Campus de Botucatu. Obrigada pela estrutura disponibilizada, pelos ensinamentos e
bons momentos em eventos científicos e trabalhos no laboratório;

Ao professor Paulino Martínez Portela, por ter me receber tão bem em seu laboratório
em Lugo e pelos importantes ensinamentos em genética. Também agradeço pelos ótimos
momentos de confraternização do laboratório e almoços que nos ofereceu em sua casa, além
de todo o incentivo e amizade.

A todos os professores, pesquisadores, alunos e técnicos do grupo ACUIGEN,

Faculdade de Santiago de Compostela, Lugo, Espanha: Adrián, Belén, Carlos, Carmen,
Diego, Jorge, José, Laura, Lucía, María Portela, María (Peque), Manuel, Mónica, Miguel,
Paulino, Raquel, Sonia, Susana, Vanessa e Xoana. Obrigada pelo auxílio com as técnicas
moleculares, documentação e programas. Em especial, agradeço à Raquel, Jorge e Belen, por
me ensinarem as análises genéticas com paciência e dedicação. À Susana, por ser uma pessoa
sincera e humana, pelos momentos divertidos e por ajudar em tudo. Além disso, sou grata a
todos pela amizade que recebi desde o primeiro dia que cheguei ao laboratório.
 Ao Carlos, María, Pepe, Susana, Júlio, Tori, Néstor, Homero, Xoana e todos os
amigos que conheci na Espanha. Vocês fizeram da minha estadia muito especial, me
transmitindo um sentimento de que a Galícia é a minha segunda casa. Foram momentos
únicos, de aprendizado e crescimento, os quais levarei por toda a vida.

Ao André, Daiana, Dani, Simony, Thiago e todos os meus amigos pessoais. Amigos
de Bauru, da VBS, da época da graduação em Biologia, enfim os que fizeram ou ainda fazem
parte da minha vida. Vocês são meus irmãos do coração, essenciais em minha vida.

Ao André, que compartilha comigo o amor pela Biologia, obrigada por me ajudar com
as dúvidas na pesquisa e com a tese. Principalmente agradeço pela amizade, por todos os
momentos que passamos juntos e por ser um amigo sempre alegre e leal.

A toda minha família, por seu amor, compreensão e incentivos. Por terem me ensinado
que o mais importante na vida é a integridade e o respeito ao próximo. Por todo o esforço para
a minha formação. Às minhas tias Ana e Mali, por seu carinho e por serem grandes amigas.
Aos meus avós Maria Thereza, Margarida e Cândido, por terem me criado com tanto amor e
dedicação. Ao Geraldo, Nancy, Henrique e toda a família Stabile.

Ao meu companheiro de vida Felipe (Batche), por todo o apoio durante o

desenvolvimento deste trabalho, paciência, conselhos e incentivos, fundamentais para
finalizarmos mais esta etapa em nossas vidas. Por sempre estar disposto a ouvir e ajudar, não
medindo esforços para me fazer feliz. Por me transmitir calma e tranquilidade e ao mesmo
tempo me ensinar muito a cada dia. Você é uma pessoa incrível, te amo!

À minha mãe, por seu amor incondicional, por sempre ser amiga e companheira. Por
tudo o que passamos juntas, superando as dificuldades e acreditando no amor. Não tenho
palavras para descrever o quanto te amo... você é o meu exemplo de vida, caráter e bondade.
Obrigada por tudo!
 RESUMO

Níveis de diversidade e estruturação genética, assim como a investigação de eventos de

hibridação interespecífica ou introgressiva em populações selvagens, estão entre as principais
análises a serem consideradas em projetos de conservação. A hibridação entre espécies
nativas de peixes, principalmente quando decorrente de ações humanas, tem levado a taxas
crescentes de cruzamentos não naturais entre diferentes taxa, o que pode ocasionar impactos
ecológicos e genéticos. As espécies de bagres Neotropicais, Pseudoplatystoma reticulatum e
Pseudoplatystoma corruscans, têm sido afetadas pela produção induzida de híbridos na
aquicultura e pelo contato destes híbridos com suas populações. Neste estudo foram
desenvolvidos diferentes marcadores genéticos (genes e microssatélites) com o intuito de
identificar a ocorrência de hibridação e introgressão em rios da América do Sul e para acessar
a diversidade genética intra e interpopulacional destas espécies. Marcadores dos genes
nucleares EF1 e 18S foram completamente diagnósticos na identificação das espécies e seus
híbridos. Através de um pirosequenciamento Roche 454, foram desenvolvidos e
caracterizados 16 microssatélites para P. reticulatum, os quais apresentaram 100% de
transferabilidade em P. corruscans e alto polimorfismo para a maioria dos loci estudados. As
análises populacionais utilizando estes microssatélites revelaram alta variabilidade para ambas
espécies em todos os rios das bacias hidrográficas do Paraguai e Paraná. A diferenciação
genética interpopulacional destas espécies dentro da bacia do Paraguai foi baixa ou
inexistente, revelando um alto fluxo gênico e a possível existência de uma população
panmítica resultante da migração e reprodução entre indivíduos de rios próximos. Porém,
diferenças genéticas significativas foram observadas entre rios distantes geograficamente e
entre bacias hidrográficas distintas. Em P. reticulatum, foi verificada diferenciação genética
entre os rios Cuiabá e Miranda (bacia do Paraguai), e entre os rios da bacia do Paraguai e
Baixo Paraná, porém, sem evidências de estruturação genética (K=1). Em P. corruscans, uma
diferenciação significativa foi encontrada entre os rios das bacias do Paraguai+Baixo Paraná
(similares geneticamente) e os rios do Alto Paraná. Foram observados 2 grupos distintos
estruturados (K=2), o que pode ser devido à distância geográfica e ao isolamento entre estes
locais pela usina de Itaipú. Estes diversos cenários de diferenciação populacional entre as
espécies podem estar relacionados a distintos comportamentos migratórios. A avaliação
inicial da hibridação nas populações naturais destas espécies utilizando três genes nucleares e
um marcador mitocondrial demonstrou a ocorrência das espécies parentais em 12 rios

i
distribuídos pelas bacias do Tocantins/Araguaia, Paraguai, Paraná e Uruguai (América do
Sul), inclusive em populações simpátricas, o que indica que a hibridação natural entre estes
peixes seja rara. Porém foi registrada a presença de F1 e retrocruzamentos com P. reticulatum
(50% de híbridos) no rio Aquidauana (bacia do Paraguai), híbridos F1 no rio Paraná (3.92%),
híbridos F1 e retrocruzamentos com P. reticulatum (44.19 %) no rio Mogi-Guaçu (bacia do
Alto Paraná). Neste rio também foi identificada a possível introdução da espécie P.
reticulatum, que não ocorria neste ambiente. Como estas populações estão localizadas em
regiões onde existe um alto número de pisciculturas, possivelmente estejam ocorrendo
escapes e introduções acidentais de híbridos na natureza. As análises interespecíficas de oito
microssatélites revelaram alta diferenciação genética entre as espécies parentais, o que foi
confirmado por dois grupos claramente distintos após a análise bayesiana (K=2). Estes
marcadores identificaram precisamente a hibridação e disponibilizaram importantes indícios
de híbridos e intogressão genética nas populações, como desequilíbrios de ligamento e
excesso de heterozigotos. Além disso, os testes utilizando diferentes marcadores nucleares
demonstraram que a combinação dos marcadores diagnósticos (quatro loci microssatélites e
três genes) através de análises bayesianas pode ser a metodologia mais precisa para distinguir
as espécies e híbridos em nível individual. Estes resultados disponibilizam dados importantes
no que se refere ao desenvolvimento e aplicação de um grupo de marcadores genéticos no
estudo da diversidade genética e hibridação em populações selvagens, os quais podem ser
utilizados em estudos evolutivos, ecológicos e genéticos de P. corruscans e P. reticulatum, e
também como parâmetros no estabelecimento de áreas a serem conservadas e em políticas de
manejo.

ii
 ABSTRACT

Levels of genetic diversity and structure, as well as the investigation of interspecific and
introgressive hybridization events in wild populations, are amongst the major analyzes to be
considered in conservation projects. Hybridization between native fish species, especially
when caused by human actions, has led to increasing rates of non natural crosses between
different taxa, which may cause ecological and genetic impacts. The Neotropical catfish
species, Pseudoplatystoma reticulatum and Pseudoplatystoma corruscans, have been affected
by the induced production of hybrids in aquaculture and by the contact of these hybrids with
their populations. In this study, different genetic markers were developed (genes and
microsatellites), in order to identify the occurrence of hybridization and introgression in South
American rivers and to access the intra and inter populational genetic diversity of these
species. EF1 and 18S nuclear gene markers were completely diagnostics in the identification
of the species and their hybrids. Through a Roche 454 pyrosequencing, were developed and
characterized 16 microsatellite loci for P. reticulatum, which presented 100% of
transferability in P. corruscans and high polymorphism for the majority of the loci.
Population analysis using these microsatellites revealed high variability for the both species in
all rivers from Paraguay and Paraná hydrographic basins. The interpopulational genetic
differentiation of these species within the Paraguay basin was low or absent, revealing a high
gene flow and the possible existence of a panmitic population, resulting from the migration
and reproduction of individuals from closely rivers. However, significant genetic differences
were observed between geographically distant rivers and distinct hydrographic basins. In P.
reticulatum, genetic differentiation was found between the Cuiabá and Miranda Rivers
(Paraguai basin), and between Paraguay and Lower Paraná basins, but without evidences of
genetic struturing (K=1). In P. corruscans, a significant genetic differentiation was found
between the rivers of the Paraguay+Lower Paraná (genetically similar) and Upper Paraná
basins. Two structured groups (K = 2) were observed, which may be due to the geographical
distance and the isolation between these sites by the Itaipu dam. These several scenarios of
population differentiation between the species may be related to distinct migratory behaviors.
The initial assessment of hybridization in natural populations of these species, using three
nuclear genes and one mitochondrial marker demonstrated the occurrence of the parental
species in 12 rivers distributed in the Tocantins/Araguaia, Paraguay, Parana and Uruguay
basins (South America), even in sympatric populations, indicating that the natural

iii
hybridization between these fishes is rare. However, were registered the presence of F1
hybrids and backcrosses with P. reticulatum (50% of hybrids) in the Aquidauna River
(Paraguai basin), F1 hybrids in the Paraná River (3.92%), F1 and backcrosses with P.
reticulatum in the Mogi-Guaçu River (44.19%) (Upper Parana basin). In this river was also
identified the possible introduction of P. reticulatum, which did not occur naturally in this
environment. As these populations are located in regions where there is a high number of fish
farms, are likely occurring escapes and accidental introductions of hybrids in nature. The
interspecific analyzes of eight microsatellites revealed high genetic differences between the
parental species, which was confirmed by two clearly distinct groups after the bayesian
analysis (K = 2). These markers have precisely identified the hybridization and provided
important evidences of hybrids and genetic introgression in the populations, as linkage
disequilibrium or heterozygote excess. In addition, tests using different nuclear markers
demonstrated that the combination of the diagnostic markers (four microsatellites and three
genes) through bayesian analysis may be the most accurate methodology in distinguishing
species and hybrids in an individual level. These results provide significant data regarding to
the development and application of a group of genetic markers in the study of genetic
diversity and hybridization in wild populations, which can be used in evolutionary, genetic
and ecological studies of P. corruscans and P. reticulatum, and also as parameters in the
establishment of areas to be conserved and management policies.

iv
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
1.1 Diversidade e estrutura genética na conservação biológica ................................................. 1
1.2 Aspectos evolutivos e ambientais da hibridação interespecífica ........................................ 2
1.3 Considerações sobre as espécies Neotropicais P. corruscans e P. reticulatum ............... 5
1.3.1 Conservação das espécies P.corruscans e P. reticulatum ......................................... 7
1.4 Marcadores genético moleculares e suas aplicações na conservação.............................. 8
1.4.1 Hibridação e introgressão genética ........................................................................... 9
1.5 Justificativa ......................................................................................................................... 12
1.6 Objetivos............................................................................................................................. 12
2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 14
2.1 Amostragem de material biológico................................................................................ 14
2.2 Extração de DNA........................................................................................................... 18
2.3 Desenvolvimento e aplicação dos marcadores moleculares ........................................... 19
2.3.1 Genes nucleares e mitocondrial ............................................................................... 20
2.3.2 Microssatélites ........................................................................................................ 24
2.3.3 Avaliação de híbridos e introgressão utilizando genes nucleares e mitocondrial ... 26
2.3.4 Aplicação dos microssatélites no estudo das populações naturais ......................... 27
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 31
Capítulo 1 ............................................................................................................................. 32
Capítulo 2 ............................................................................................................................. 50
Capítulo 3 ............................................................................................................................. 70
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 88
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 89
6. APÊNDICES .....................................................................................................................102

v
 Introdução

1 INTRODUÇÃO

1.1 Diversidade e estrutura genética na conservação biológica

A variabilidade ou diversidade genética, ou seja, os diferentes alelos e genótipos

presentes em populações ou espécies são a base da biologia evolutiva no planeta (Frankham e
Briscoe, 2002). A presença de variação genética é essencial para o potencial de sobrevivência
das espécies e para a evolução com sucesso em resposta a mudanças ambientais (Laikre et al.,
1999). A seleção natural favorece alelos que são superiores em um determinado ambiente,
assim, caso não haja variação genética, indivíduos melhor adaptados nunca poderão ser
criados (Laikre et al., 1999).
A diversidade gênica é geralmente referida como variabilidade intraespecífica e
representa a diversidade biológica dentro de uma única espécie. Esta variação pode ser
intrapopulacional, distribuída dentro de uma população e expressa como diferentes
combinações alélicas entre os indivíduos (genótipos) e interpopulacional, distribuída entre as
populações, na forma de diferenças na ocorrência e frequência dos alelos (Laikre et al., 1999).
Uma população é definida como um conjunto de indivíduos intercruzantes da mesma
espécie, que vive em proximidade de forma a manter o sistema de acasalamento em comum
(Templeton, 2011). Associada com cada população local está uma população correspondente
de genes locais chamada de pool gênico, o conjunto de genes coletivamente compartilhados
pelos indivíduos de uma população (Templeton, 2011).
Populações selvagens têm sofrido impactos negativos constantemente, decorrentes
principalmente da sobre-explotação de recursos naturais, poluição e introdução de espécies
(Frankham e Briscoe, 2002). Estes eventos podem causar fragmentação e redução de habitats
e uma consequente diminuição do tamanho de populações selvagens, inibindo o fluxo de
genes adaptáveis entre populações e interrompendo o processo adaptativo (Templeton, 2011).
Quando o fluxo gênico é severamente restrito, fragmentos de populações de baixa abundância
tornam-se cada vez mais vulneráveis a características correlacionadas com o risco de
extinção, incluindo a perda de variação genética através de deriva genética, o acúmulo de
mutações ligeiramente deletérias, depressão por endogamia, e a incapacidade de se adaptar às
mudanças (Laikre et al., 1999; Frankham e Briscoe, 2002).
Esta intensificação das mudanças ambientais tem aumentado a necessidade de
variabilidade genética nas populações naturais para que possam responder a estas mudanças.

1
 Introdução

Ao mesmo tempo, as manipulações humanas têm reduzido a variabilidade genética, sendo que
a perda de alelos e combinações alélicas pode ocorrer extremamente rápido, dentro de apenas
uma geração (Laikre et al., 1999). Recursos genéticos podem ser perdidos como resultado
direto da extinção das espécies, o que é irreversível, ou por redução da variabilidade genética
dentro de uma espécie (Oliveira et al., 2009).
Conservar espécies, portanto, não é o suficiente; o seu potencial evolutivo,
representado pela variabilidade genética intra e interpopulacional também precisa ser
conservado (Frankham e Briscoe, 2002; Frankham et al., 2008). Uma etapa importante em
análises populacionais é a verificação de estruturação genética e a ocorrência ou não de fluxo
gênico. Esta informação possibilita esclarecer que forma a variabilidade genética está
distribuída ao longo da distribuição geográfica da espécie, verificar o que é necessário
conservar e como deve ser feito o manejo e monitoramento da diversidade biológica das
populações que estejam ameaçadas (Laikre et al., 1999). Como exemplo, as diretrizes para
conservação genética de trutas indicam que o acesso à estruturação genética populacional, a
fim de ter conhecimento sobre a quantidade e distribuição dos recursos genéticos, é essencial
para qualquer tipo de manejo (Laikre et al., 1999).
Outro tema importante na conservação de populações naturais é a hibridação
interespecífica que, quando intensivamente provocada por ações humanas, pode estar
relacionada com a perda de diversidade genética. Quando os genomas de espécies distintas se
misturam através da hibridação, pode ocorrer a perda de alelos (extinção genética), ou o
rearranjo de combinações gênicas previamente existentes e que provavelmente podem nunca
mais ser recriadas, resultando no desaparecimento de adaptações a determinados ambientes
(Laikre et al., 1999). A hibridação e introgressão de genes entre espécies estão entre as
principais ameaças para a conservação de muitas espécies de plantas e animais, e suas taxas
de ocorrência têm aumentado dramaticamente em todo o mundo, ocasionadas por introduções
intencionais e acidentais de organismos e modificações de habitats (Allendorf et al., 2001;
2010).

1.2 Aspectos evolutivos e ambientais da hibridação interespecífica

O cruzamento espontâneo entre diferentes espécies sempre foi considerado pela maioria
dos zoólogos como um evento esporádico em animais que se mantém em frequências baixas
(Mayr, 1963). Isso se deve a muitos exemplos onde os híbridos F1 (interespecíficos ou geração

2
 Introdução

filial 1) são estéreis e apresentam menor viabilidade em um ambiente onde as espécies puras
estão melhor adaptadas (Mayr, 1963). Além disso, na maioria dos casos existem barreiras pré e
pós zigóticas bem definidas que mantém um isolamento reprodutivo espacial, temporal e
comportamental entre espécies diferentes (Mayr, 1963).
Geralmente híbridos interespecíficos são intermediários entre suas espécies parentais nos
caracteres em que elas diferem tais como forma do corpo, coloração externa, estrutura e número
de partes corporais (vértebras, rastros branquiais, raios da nadadeira, dentes) (Hubbs, 1955).
Porém, os níveis de viabilidade e desempenho dos híbridos podem variar e serem menores,
equivalentes ou até maiores (vigor híbrido resultante da alta heterose destes animais) em relação
a suas espécies parentais (Arnold e Hodges, 1995).Se os híbridos interespecíficos são estéreis,
uma hibridação ocasional pode ter baixo impacto para as espécies puras e os híbridos F1, caso
sejam menos adaptados, provavelmente serão removidos através de processos de seleção
natural (Arnold e Hodges, 1995; Toledo-Filho et al., 1998). Mesmo em casos onde os híbridos
F1 sejam férteis, as linhagens híbridas avançadas (indivíduos resultantes de cruzamentos de
linhagens híbridas entre si ou retrocruzamentos de híbridos com espécies parentais puras)
usualmente são menos adaptadas do que as espécies parentais, partindo do pressuposto de que
seus diversos tipos de genótipos recombinantes perdem a heterose e nunca foram testados pela
seleção natural (Barton, 2001).
Atualmente também tem sido reconhecido que a hibridação, mesmo em pequena
escala, pode contribuir em processos adaptativos e de especiação (Arnold et al., 1999; Barton,
2001; Mallet, 2007; Willis et al., 2012; Abbott et al., 2013). Estima-se, em geral, que
aproximadamente 6 a 10% das espécies animais realizem cruzamentos interespecíficos
(Mallet, 2005). Em alguns casos, a hibridação introgressiva, ou seja, a transferência do DNA
de uma espécie para o conjunto genômico de outra espécie, por retrocruzamento repetido dos
indivíduos híbridos com uma ou ambas as espécies parentais, pode ser uma importante fonte
de variabilidade genética nas populações (Arnold e Martin, 2009). A introgressão de poucos
loci pode promover a divergência adaptativa e assim facilitar a especiação (Abbott et al.,
2013). Sugere-se, por exemplo, que a hibridação pode ser um mecanismo de especiação em
ciclídeos, contribuindo para a alta diversidade de espécies (Smith et al., 2003).
A hibridação natural pode não constituir ameaças ecológicas às espécies envolvidas,
justamente por estar intimamente relacionada aos processos evolutivos das espécies durante a
sua história biológica e geralmente ser caracterizada pela ocorrência de eventos esporádicos
de cruzamentos interespecíficos entre espécies simpátricas, resultando na formação de zonas

3
 Introdução

híbridas que podem manter-se estáveis por milhares de anos em uma determinada região
geográfica (Arnold et al., 1999; Barton, 2001; Mallet, 2005; Willis et al., 2012). A hibridação
introgressiva pode ser observada em habitats naturais não perturbados (Willis et al., 2012),
sugerindo que algum grau de fluxo gênico é um processo normal, faz parte da construção dos
processos evolutivos, sendo que alguns genes e genótipos usualmente são modificados através
do tempo (Rhymer e Simberloff, 1996).
No grupo dos peixes, principalmente nas espécies continentais, a formação de híbridos
é mais comum quando comparada com outros animais, devido à fertilização externa,
competição por territórios de desova e convivência em ambientes limitados que facilitam o
cruzamento interespécies (Hubbs, 1955). Características genéticas próprias dos híbridos de
peixes também podem favorecer o aparecimento de linhagens híbridas avançadas, pois os
híbridos F1 férteis, apesar de possuírem gametas com complementos cromossômicos
desequilibrados, podem manter parcialmente suas capacidades genéticas e funcionais, gerando
descendentes viáveis (Toledo-Filho et al., 1994).
No entanto, para muitas espécies não existem dados sobre quando a hibridação ocorre,
tanto em termos de número de espécies que intercruzam como a proporção de indivíduos com
ascendência híbrida (Willis et al., 2012). A contribuição destes eventos para a adaptação ou
especiação vai depender basicamente de como e onde as populações intercruzantes ocorrem,
dos níveis de fertilidade dos híbridos F1 e da possibilidade de vantagem adaptativa e
estabelecimento das linhagens híbridas (Barton, 2001). Verificar se existem híbridos em
populações naturais, sua frequência e a ocorrência de introgressão genética são dados
importantes em projetos que envolvam a preservação ou conservação de populações nativas
(Allendorf et al., 2001; 2010). Além disso, é importante assumir qual o cenário que originou a
hibridação, ou seja, se é consequência direta de modificações ambientais propiciadas por
ações humanas ou está relacionada estritamente a fatores ambientais naturais (Allendorf et al.,
2001).
Nas últimas décadas tem sido verificado um aumento brusco na ocorrência de híbridos
e introgressão genética no ambiente selvagem, onde o principal fator de mudança ambiental é
o homem, responsável direta ou indiretamente por cerca de metade dos eventos de hibridação
(Rhymer e Simberloff, 1996; Scribner et al., 2001; Allendorf et al., 2010; Lamer et al., 2010).
Entre os processos de ação antropogênica relacionados à hibridação em peixes está a
destruição de locais de desova, alterações ambientais que podem modificar o comportamento
reprodutivo, introdução de espécies exóticas e o escape ou introduções de híbridos artificiais

4
 Introdução

produzidos na aquicultura (Bartley et al., 2001; Scribner et al., 2001; Porto-Foresti et al., 2010;
Prado et al., 2012a).
A hibridação interespecífica resultante de ações antrópicas, como podem ocorrer em um
curto espaço de tempo, podem levar a modificações ecológicas e genéticas irreversíveis
(Allendorf et al., 2010). Em ambientes onde apenas os híbridos F1 são encontrados, ou seja,
são estéreis, as consequências da hibridação podem envolver competição e a perda de
esforços reprodutivos das espécies parentais, sem modificação genética (Toledo-Filho et al.,
1994; 1998). Por outro lado, quando os híbridos são férteis e ocorre introgressão, pode ocorrer
a formação de uma população composta inteiramente por híbridos ("mistura" genética ou
"hybrid swarms"), a diluição dos genomas parentais e decorrente extinção genética das
espécies parentais, onde a população será formada essencialmente por indivíduos
recombinantes (Huxel, 1999; Epifanio e Philipp, 2001; Muhlfeld et al., 2009; Allendorf et al.,
2001; Allendorf et al., 2010). Mesmo que seja formada uma população de híbridos, a questão
é se estes indivíduos irão se adaptar e permanecer no ambiente ou todo o pool gênico das
populações e espécies hibridizadas será perdido (Allendorf et al., 2001; 2010).

1.3 Considerações sobre as espécies Neotropicais P. corruscans e P. reticulatum

Os peixes das espécies Pseudoplatystoma corruscans (surubim “pintado”) e

Pseudoplatystoma reticulatum (surubim “cachara”) são bagres pertencentes à família
Pimelodidae, na qual está incluída grande parte dos Siluriformes da região Neotropical, com
mais de noventa espécies descritas (Lundberg e Littmann, 2003; Ferraris et al., 2007).
Representam um importante papel ecológico (regulação de topo de cadeia) por serem grandes
predadores e desta forma, exercerem forte pressão sobre os níveis inferiores da cadeia trófica
aquática(Resende et al., 1996).
Sua distribuição é endêmica do continente Sul Americano, com ampla ocorrência em
rios de importantes bacias hidrográficas. Ocorrem em simpatria na bacia do Prata, que inclui
as bacias dos rios Paraguai, Paraná e Uruguai (abrangendo os países Brasil, Argentina,
Paraguai e Uruguai) (Lundberg e Littman, 2003; Buitrago-Suárez e Burr, 2007). Em outras
localidades ocorre apenas uma das espécies, como P. corruscans na bacia do rio São
Francisco e P. reticulatum na bacia Amazônica (Lundberg e Littman, 2003; Buitrago-Suárez e
Burr, 2007).

5
 Introdução

Anteriormente, o surubim “cachara” era a espécie mais amplamente distribuída dentro

do gênero Pseudoplatystoma, classificada como P. fasciatum e com distribuição nas bacias do
Amazonas, Magdalena, Orinoco, Paraná-Paraguai e Tocantins-Araguaia (Lundberg e
Littmann, 2003). Uma nova classificação desta espécie, feita por Buitrago-Suárez e Burr
(2007) dividiu a espécie em P. fasciatum (restrita a região das Guianas), P. punctifer (bacias
Amazônica e Tocantins-Araguaia), P. orinocoense (bacia do Orinoco), P. magdaleniatum (rio
Magdalena) e P. reticulatum (bacia Paraná-Paraguai e Bacia Amazônica). Porém, ainda
existem controvérsias a respeito da classificação de P. reticulatum. Torrico et al. (2009),
utilizando dados moleculares de DNA mitocondrial, confirmaram que P. tigrinum, P.
reticulatum, P. corruscans e P. magdaleniatum estão realmente diferenciados em espécies
distintas. Outro estudo genético indicou que as espécies P. punctifer, P. reticulatum e P.
fasciatum estão agrupadas em um único clado, que também pode ser referido como P.
fasciatum (latu sensu) (Carvalho-Costa et al., 2011), sendo necessárias futuras revisões
taxonômicas neste grupo (Torrico et al., 2009; Carvalho-Costa et al., 2011).
Dentre os diversos parâmetros morfológicos e taxonômicos utilizados para distinguir
os surubins pintado e cachara, as manchas da pele são as características externas mais
marcantes, onde P. corruscans apresenta uma pigmentação composta por manchas escuras e
circulares (pontos) e P. reticulatum um padrão de bandas reticuladas escuras (listras)
(Buitrago-Suarez e Burr, 2007). Ambos os peixes apresentam grande porte, porém, com
tamanhos distintos, que podem atingir valores aproximados de 140 cm e 40 Kg para P.
corruscans e de 114 cm e 15 Kg para P. reticulatum (Resende et al., 1996; Mateus e Penha,
2007).
Estas espécies alcançam a maturidade sexual por volta dos quatro anos e meio de
idade, tem alta fecundidade, não apresentam cuidado parental com a prole e possuem um
tempo de vida aproximado de 15 anos (Resende et al., 1996; Mateus e Penha, 2007). São
peixes migratórios que realizam movimentos laterais complexos entre rios, lagos e várzeas de
rios, assim como movimentos longitudinais ao longo dos canais fluviais (Carolsfeld et al.,
2003; Godinho et al., 2007). As migrações para reprodução são anuais, com início no período
chuvoso onde nadam para as cabeceiras dos rios para se reproduzir, usualmente durante os
meses de outubro a janeiro (Resende, 2003; Godinho et al., 2007). Assim como outros bagres,
realizam dois fluxos migratórios principais durante o ano: inicialmente permanecem nos leitos
dos rios durante fevereiro a setembro (época de alimentação), em outubro iniciam a migração
rio acima (época de reprodução) e posteriormente os adultos migram rio abaixo para se

6
 Introdução

alimentar no rio principal, enquanto os juvenis permanecem por algum tempo nos lagos
(Resende, 2003; Godinho et al., 2007).
Estudos com P. corruscans no rio São Francisco demonstraram que o estilo de
migração foi dualístico, com indivíduos residentes (não migratórios) e peixes migratórios
(Godinho et al., 2007). De acordo com os autores, esta espécie pode realizar desovas
múltiplas, onde as fêmeas visitam os locais de reprodução várias vezes durante as enchentes.
Também foi evidenciado que possivelmente esta espécie apresente o comportamento de
“homing”, ou seja, retorne sempre ao seu local de nascimento para se reproduzir (Pereira et
al., 2009). Contudo, ainda há pouco conhecimento sobre o comportamento migratório destas
espécies, como as distâncias que percorrem e os movimentos da história de vida e de desova
de adultos, especialmente para P. reticulatum.
Além de sua importância biológica nos ambientes onde ocorrem, estes bagres estão
entre as principais espécies nativas mais produzidas no Brasil (Crepaldi et al., 2006; Campos,
2010; Ministério da Pesca e Aquicultura, 2010). Sua carne é apreciada pelo consumidor pela
ausência de espinhos intramusculares e são consideradas espécies nobres na pesca, além de
seu papel recreativo em estabelecimentos de lazer como “pesque-pagues” e “pesque-solte”
(Crepaldi et al., 2006; Campos, 2010; Porto-Foresti et al., 2010).

1.3.1 Conservação das espécies P.corruscans e P. reticulatum

A pesca excessiva dos bagres P. corruscans e P. reticulatum, associada à poluição dos

ambientes aquáticos e construções de barragens que dificultam ou impedem sua migração,
representa um fator crucial na diminuição de suas populações selvagens (Carolsfeld et al.,
2003; Mello et al., 2009). Recentemente, P. corruscans foi incluída como criticamente
ameaçada (Mello et al., 2009).
Outro fator preocupante para a sua conservação é a atual produção em larga escala de
híbridos interespecíficos em pisciculturas brasileiras (Campos, 2010; Porto-Foresti et al.,
2010). Os produtores relatam vantagens destes híbridos F1, com uma combinação de
características proveitosas de ambas as espécies, como maior crescimento, diminuição do
canibalismo e maior facilidade de manejo (Campos, 2010; Crepaldi et al., 2006). Estas
vantagens, somadas ao fato de P. corruscans ser a espécie mais popular entre os
consumidores, têm levado a uma produção generalizada de alevinos híbridos para serem

7
 Introdução

comercializados, superando a produção das espécies puras (Campos, 2010; Crepaldi et al.,
2006; Porto-Foresti et al., 2010).
Embora os adultos híbridos F1 possam ser parcialmente identificados através do seu
padrão de manchas na pele (intermediário entre as espécies, com pontos e listras), os alevinos
e juvenis são muito parecidos com as espécies puras (Porto-Foresti et al., 2010). Além disso,
foi comprovada a fertilidade de um dos híbridos recíprocos em cultivo (híbrido " cachapinta",
resultante do cruzamento entre fêmea de P. reticulatum e macho de P. corruscans), que pode
gerar híbridos F2 ou retrocruzar com os parentais (Prado et al., 2012b). As linhagens híbridas
avançadas entre estas espécies apresentam caractísticas morfológicas muito variáveis, o que
dificulta sua identificação morfológica (José A. Senhorini, comunicação pessoal).
Os problemas resultantes desta falta de identificação correta das linhagens em cultivo
são mistura, venda equivocada de produtos e prejuízos para a piscicultura e para o meio
ambiente. Apenas P. corruscans é citada nas estatísticas oficiais de pesca (IBAMA, 2007;
Ministério da Pesca e Aquicultura, 2010), porém, a maioria dos juvenis de Pseudoplatystoma
produzidos no país são híbridos, comercializados e rotulados apenas como “pintado”
(Campos, 2010). Em relação à natureza, foi relatada a ocorrência destes híbridos em
populações selvagens, o que provavelmente resulta de escapes ou introduções dos estoques de
cultivo (Veríssimo et al., 2005; Bignotto et al., 2009; Prado et al., 2012a), e coloca em risco a
integridade genética de populações localmente adaptadas das espécies parentais.

1.4 Marcadores genético moleculares e suas aplicações na conservação

A genética é uma importante ferramenta para o estudo da biodiversidade e para o

manejo e conservação de populações selvagens que sofrem impactos antrópicos (Hansen et
al., 2001; Schwartz et al., 2007; Allendorf et al., 2010; Zhang et al., 2013). O
desenvolvimento de técnicas que permitam visualizar os marcadores do DNA, ou seja, regiões
com diferenças nucleotídicas entre espécies e populações (Ferreira e Grattapaglia, 1998),
possibilita realizar uma avaliação dos níveis de diversidade genética, estruturação
populacional, identificar espécies e hibridação, entre outras análises genéticas.
O número de marcadores de DNA é vasto, uma vez que abrange polimorfismos de
regiões de todo o genoma nuclear e mitocondrial do organismo a ser estudado (Ferreira e
Grattapaglia, 1998). Vários tipos diferentes de marcadores genéticos moleculares estão
disponíveis para analises de estoques cultivados e selvagens, cada um com suas vantagens e

8
 Introdução

desvantagens e diferentes características genéticas (dominantes ou codominantes, regiões do

DNA nuclear ou mitocondrial, herança maternal ou biparental etc.), e diferentes tipos de
procedimentos e técnicas de análise são necessários em cada caso, de acordo com os objetivos
de cada etapa do trabalho, custos, requisitos técnicos e de especialização (Blohm et al., 2007;
Teletchea, 2009).

1.4.1 Hibridação e introgressão genética

A primeira etapa em estudos que envolvam a identificação de hibridação na natureza é

o estabelecimento de ferramentas que possibilitem a distinção dos indivíduos como espécies
puras, híbridos F1 ou avançados (Toledo-Filho et al., 1994; Allendorf et al., 2001).
Informações taxonômicas fornecem dados importantes para estudos de hibridação, porém,
pode ser difícil e duvidoso distinguir híbridos unicamente através parâmetros morfológicos
(Demandt e Bergek, 2009). Há algumas décadas a detecção de híbridos assumia a presença de
características intermediárias nestes animais (Hubbs, 1955), contudo, alguns híbridos F1
recíprocos podem apresentar diferenças de desempenho e morfologia entre si de acordo com
suas espécies parentais maternas e paternas, híbridos F2 podem apresentar fenótipos
heterogêneos e híbridos resultantes de retrocruzamentos podem conter uma grande quantidade
de genes de uma espécie parental e serem morfologicamente indistinguíveis desta (Leary,
1996; Toledo-Filho et al., 1994; 1998; Allendorf et al., 2001).
Diversos tipos de ferramentas genéticas têm sido desenvolvidas e aplicadas na
identificação de híbridos em diversos grupos animais, fornecendo inúmeros marcadores para
o estudo da hibridação e introgressão genética (Machado-Schiaffino et al., 2010; Dubut et al.,
2010; Bohling et al., 2013; Khosravi et al., 2013). Uma vantagem proporcionada por
marcadores do genoma é a possibilidade de uma identificação precisa de espécies parentais e
seus híbridos, independente de sua morfologia externa.
A identificação genética de táxons distintos pode ser feita basicamente de duas
maneiras: utilizando marcadores moleculares diagnósticos e monomórficos entre as espécies
(com pouca variação, como por exemplo genes nucleares conservados com poucas mutações
entre as espécies e SNPs - single nucleotide polymorphism) ou utilizando marcadores
multialélicos polimórficos (microssatélites ou SSR - simple sequence repeat), para os quais é
necessária uma análise probabilística com base na distribuição das frequências e tamanhos
alélicos (Schwartz et al., 2007).

9
 Introdução

Regiões relativamente conservadas do genoma nuclear, como genes que acumulem

diferenças estabelecidas em nível de espécie e não apresentem variação intraespecífica, são
úteis na identificação dos diferentes taxa e seus híbridos F1, que herdarão os marcadores
biparentais e serão geneticamente heterozigotos (Rubidge et al., 2001; Hashimoto et al.,
2011a; Porto-Foresti et al., 2013). O DNA mitocondrial, como apresenta herança
exclusivamente materna em peixes, altas taxas de evolução e facilidade de isolamento e
caracterização (Avise, 1986; Moritz et al., 1987), permite o estabelecimento do parental
materno envolvido, e consiste em um marcador eficaz na identificação de espécies, híbridos
recíprocos e na direção de eventos de hibridação em ambientes selvagens (Gunnel et al.,
2008; Metcalf et al., 2008; Broughton et al., 2011).
Além disso, o desenvolvimento de técnicas que permitam a visualização dos
polimorfismos espécie-específicos de diferentes regiões do genoma, como o PCR-multiplex
(Polimerase chain reaction) e o PCR-RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism)
permitem resultados rápidos e de relativo baixo custo (Teletchea, 2009; Porto-Foresti et al.,
2013).
Em relação aos híbridos avançados, após a primeira geração (F1), é difícil decidir
quando um indivíduo é um híbrido ou um membro de uma das duas populações parentais
submetidos à introgressão (Rhymer e Simberloff 1996). Isso se deve ao alto número de
combinações genéticas resultantes do intercruzamento de híbridos F1 entre si ou o
retrocruzamento destes híbridos com as espécies parentais (Toledo-Filho et al., 1994, 1998;
Scribner et al., 2001).
Em casos simples de identificação de hibridação, um único marcador nuclear com dois
alelos fixos pode ser suficiente para classificar indivíduos de uma espécie e seus híbridos F1
(Vähä e Primmer, 2006). Porém, um marcador é eficaz apenas quando a hibridação começou
apenas recentemente e a taxa de introgressão é baixa. Quando se usa apenas um alelo
diagnóstico, um híbrido avançado poderá apresentar-se homozigoto como seus parentais ou
heterozigoto como um híbrido F1 (Toledo-Filho et al., 1994; Allendorf et al., 2001). Assim, a
utilização de um conjunto de marcadores nucleares é recomendada para que seja possível
identificar a hibridação introgressiva (Vähä e Primmer, 2006; Sanz et al., 2009; Allendorf et
al., 2010).
Os microssatélites são regiões abundantes no genoma nuclear que se caracterizam por
terem motivos de sequência curta (2 a 6 pares de bases) que se repetem em tandem diversas
vezes e constituem marcadores altamente polimórficos (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Estas

10
 Introdução

regiões do DNA seguem modelos evolutivos simples (marcadores neutros), e por serem
facilmente genotipadas através de PCR, têm sido amplamente desenvolvidas para diferentes
espécies e utilizadas para acessar a diversidade genética e detectar estruturação populacional
(Oliveira et al., 2009; Ciofi et al., 2011; Vera et al., 2011; Vargas-Ramirez et al., 2012;
Storfer et al., 2013).
Apesar de altamente polimórficos estes marcadores podem fornecer marcadores
adicionais para identificar espécies e hibridação através de diferentes abordagens, onde os
alelos parentais são transmitidos aos híbridos interespecíficos com características de uma
herança mendeliana clássica (You et al., 2009; Kang et al., 2011). São especialmente úteis em
análises onde não existem marcadores de regiões mais conservadas disponíveis para as
espécies e em casos onde os objetivos buscam integrar análises genético populacionais e a
identificação de hibridação na natureza.
Com o crescente desenvolvimento de métodos analíticos e programas estatísticos, um
avanço no campo da genética populacional tem sido o desenvolvimento de novas análises que
não eram viáveis utilizando apenas marcadores conservados (Hansen et al., 2001). Entre estas
análises estão os métodos de atribuição ou agrupamento dos indivíduos, que podem
identificar híbridos e introgressão em populações selvagens de forma eficiente utilizando
informações de frequências alélicas, verificar divergências genéticas interespecíficas,
identificar desequilíbrios populacionais relacionados a eventos de hibridação ou introgressão,
atribuir indivíduos a suas populações de origem, entre outras análises (Hansen et al., 2001;
Ostberg e Rodriguez 2004; Manel et al., 2005; Roques et al., 1999; Dubut et al., 2010;
Fitzpatrick, 2012; Zhang et al., 2013).
Os microssatélites possuem potencial para definir genótipos únicos o que, junto com a
sua relativa facilidade de aplicação e de confiabilidade nas determinações alélicas, os torna
marcadores particularmente úteis em estudos que necessitem de identificação individual
(Roques et al., 1999). A identificação de espécies pode ser realizada através da comparação
das frequências alélicas de duas espécies distintas e verificação dos alelos compartilhados
(Roques et al., 1999). Neste caso, a acumulação de mutações pode ter contribuído mais
substancialmente para a diferenciação das espécies do que ao observado entre populações do
mesmo taxa. De posse das frequências alélicas individuais, algumas análises também
permitem, por exemplo, a classificação dos espécimes em distintas classes híbridas (F1, F2 ou
retrocruzamentos), o que é especialmente importante para documentar a introgressão com
precisão (Anderson e Thompson 2002).

11
 Introdução

Estudos genéticos da hibridação ainda são escassos em populações selvagens de

espécies Neotropicais no Brasil. Porém, na última década tem sido verificada uma crescente
preocupação sobre os impactos negativos que a hibridação pode estar causando em
populações nativas (Toledo-Filho et al., 1994; 1998; Porto-Foresti et al., 2010). Diversos
marcadores genéticos têm sido desenvolvidos, especialmente envolvendo espécies de
interesse comercial como bagres Pimelodídeos e “peixes redondos” Serrassalmídeos,
disponibilizando importantes dados sobre a caracterização cromossômica de espécies e
híbridos (Hashimoto et al., 2009; Prado et al., 2012b, Hashimoto et al., 2013b) e marcadores
moleculares espécie-específicos (Hashimoto et al., 2011a; Prado et al., 2011a; Porto-Foresti et
al., 2013). Porém, para as espécies P. corruscans e P. reticulatum existe apenas um marcador
nuclear desenvolvido para a identificação de seus híbridos (Prado et al., 2011a), o que limita
as análises de hibridação introgressiva neste grupo de peixes.

1.5 Justificativa

As espécies Pseudoplatystoma corruscans e P. reticulatum estão amplamente

distribuídas por rios da América do Sul e apresentam incontestável importância ecológica e
econômica. Como seus híbridos são férteis, torna-se necessário o desenvolvimento de um
conjunto de marcadores genéticos nucleares para determinar os graus de introgressão nas suas
populações naturais. Neste sentido, marcadores de genes, sem variação intraespecífica, serão
importantes para a identificação precisa dos indivíduos, enquanto análises de frequências
alélicas, utilizando microssatélites podem contribuir com loci adicionais para análises de
diversidade, estrutura populacional e hibridação neste grupo de peixes. Além disso, o estudo
da hibridação entre estas espécies pode propiciar uma importante oportunidade para investigar
as divergências alélicas entre P. reticulatum e P. corruscans, além de possibilitar inferências
sobre a conservação de suas populações e ações de manejo adequadas.

1.6 Objetivos

1) Desenvolver marcadores de genes nucleares para a distinção entre as espécies P.

corruscans e P. reticulatum, úteis para identificar seus híbridos F1 e avançados;

12
 Introdução

2) Realizar uma avaliação genética da ocorrência de híbridos e introgressão genética em

populações selvagens destas espécies;

3) Isolar e caracterizar novos microssatélites para a espécie P. reticulatum e testar a

transferabilidade dos loci em P. corruscans;

4) Realizar análises genético populacionais para avaliar a diversidade genética intra e

interpopulacional destas espécies em rios das bacias hidrográficas do Paraná e Paraguai (bacia
do Prata, América do Sul);

5) Testar a eficácia dos microssatélites na diferenciação interespecífica e identificação de seus

híbridos através de análises bayesianas.

13
 Material e métodos

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Amostragem de material biológico

Foram analisadas geneticamente amostras de material biológico (nadadeira ou sangue)

de indivíduos adultos das espécies P. reticulatum e P. corruscans (Figura 1). As amostras
foram provenientes das bacias do Tocantins/Araguaia, Paraná, Paraguai e Uruguai (bacia do
Prata), América do Sul. A nomenclatura P. reticulatum foi utilizada de acordo com o descrito
por Buitrago-Suárez e Burr (2007), mas esta espécie também pode ser referida como P.
fasciatum (sensu lato) (Carvalho-Costa et al., 2011).
As amostras de P. reticulatum totalizaram 319 indivíduos provenientes de 15 pontos
de coleta nos rios Araguaia (Bacia do Tocantins/Araguaia), Paraguai, Cuiabá, São Lourenço,
Taquari, Negro, Aquidauana, Miranda (Bacia do Paraguai), Mogi-Guaçu, Paranapanema,
Iguaçu e Paraná (Bacia do Paraná) (Tabela1, Figura 3). As amostras de P. corruscans
compuseram um total de 562 exemplares provenientes de 18 pontos de coleta distribuídos
pelos rios Paraguai, Cuiabá, São Lourenço, Taquari, Negro, (Bacia do Paraguai), Mogi-
Guaçu, Verde, Ivinhema, Paranapanema, Iguaçu, Paraná (Bacia do Paraná) e Uruguai (Bacia
do Uruguai) (Tabela 1, Figura 3).
Entre os peixes coletados no rio Mogi-Guaçu, 15 apresentaram uma morfologia
externa duvidosa, o que inviabilizou inferências sobre sua identificação visual. Foram
verificados exemplares com má formação, padrões de manchas da pele intermediário ou
misturado entre as espécies (Tabela 1, Figura 2). Assim, estes peixes foram provisoriamente
classificados como possíveis híbridos (Tabela 1).

14
 Material e métodos

b 1. Exemplar de P. reticulatum (acima) e P. corruscans (abaixo) provenientes da bacia do Paraná,

Figura
Argentina. Foto de Mark. H. Sabaj. Imagem retirada de Buitrago-Suárez e Burr (2007).

c
b

Figura 2. Exemplares coletados no rio Mogi-Guaçu, apresentando características morfológicas

intermediárias entre P. corruscans (pintas) e P. reticulatum (listras) (b, c) ou má formação (a).

15
 Material e métodos

Tabela 1. Total de amostras obtidas organizadas por ponto de coleta, os rios onde foram coletadas,
bacias hidrográficas, período aproximado de coleta e sua prévia identificação morfológica.

População* N
BH Rio/Município ou local** Período Total
Pc Pr H
Ta 1 Ar Araguaia 2002-2009 - 24 - 24
2 Pa1 Paraguai/Cárceres 1998-2005 32 - - 32
3 Pa2 Paraguai/Corumbá 1998-2005 29 27 - 56
4 Pa3 Paraguai/Miranda 2002-2005 18 12 - 30
5 Cb1 Cuiabá/Nobres 2002-2005 - 11 - 11
6 Cb2 Cuiabá/Poconé, MT 1998-2005 36 30 - 66
7 Sl São Lourenço/Cuiabá 1998-2005 27 11 - 38
Pa
8 Cb3 Cuiabá3/ParnaPanta 2002-2010 18 42 - 60
9 Ta1 Taquari/Coxim 1998-2005 30 16 - 46
10 Ta2 Taquari/Corumbá 1998-2005 28 - - 28
11 Ng Negro 1998-2005 34 23 - 57
12 Aq Aquidauana 1998-2005 - 30 - 30
13 Mir Miranda 1998-2005 12 41 - 53
APr 14 Pr1 Paraná/Represa de Jupiá 2009 51 - - 51
15 Ve Verde 2008-2011 43 - - 43
16 Mogi Mogi-Guaçu 2008-2011 14 14 15 43
Pr 17 Ivi Ivinhema 2004 19 - - 19
18 Pp Paranapanema 2003 53 04 - 57
19 Ig Iguaçu 1998-2005 63 14 - 77
BPr 20 Pr2 Paraná 2011 49 20 - 69
Ur 21 Ur Uruguai 2003 06 - - 06
Total 562 319 15 896
BH: Bacias hidrográficas (Ta: Tocantins/Araguaia, Pa: Paraguai, Pr: Paraná, Ur: Uruguai, APr: Alto Paraná,
BPr: baixo Paraná), ParnaPanta: Parque Nacional do Pantanal, N: número amostral, Pc: P. corruscans, Pr: P.
reticulatum, H: possíveis híbridos, *1 a 21: pontos de coleta indicados na Figura 3, **Os rios amostrados em
mais de um ponto tiveram o município indicado e foram distinguidos através de número em sua sigla
correspondente.

16
 Material e métodos

Figura 3. Pontos de amostragem dos peixes em rios da América do Sul. Os locais estão identificados
por círculos coloridos que representam onde foram amostradas as espécies P. reticulatum (azul), P.
corruscans (vermelho) e híbridos (verde). Os locais de coleta (1 a 21) e a quantidade de indivíduos
coletados estão indicados na Tabela 1. Barra = 300Km.

Os parâmetros utilizados para a identificação das espécies foram os padrões de

coloração externa da pele (Buitrago-Suárez e Burr, 2007). A classificação dos indivíduos
demonstrada na tabela 1 foi feita de acordo com o indicado pelos pescadores que cederam as
amostras (peixes das populações de Pr1, Pr2 e algumas amostras do rio Mogi-Guaçu) e
seguindo a identificação prévia estabelecida pelos pesquisadores e laboratórios responsáveis
pela concessão do material biológico (amostras da bacia do Tocantins, Paraguai e o restante
dos rios da bacia do Paraná) (Tabela 1).
As amostras das bacias do Tocantins, Paraguai e Uruguai e dos rios Ivinhema, Iguaçu
e Paranapanema foram coletadas durante os anos de 1998 e 2010 e estão mantidas na coleção
de peixes e tecidos do Laboratório de Genética de Peixes, UNESP campus de Bauru e no
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, UNESP campus de Botucatu (Estado de São
Paulo, Brasil), enquanto os indivíduos dos rios Paraná (Pr1) Verde e Mogi-Guaçu foram
17
 Material e métodos

coletados entre 2008 e 2011 e cedidos por José A. Senhorini da coleção de peixes do
CEPTA/ICMBio, Pirassununga (Estado de São Paulo, Brasil). As amostras da de Pr2 (rio
Paraná) foram cedidas por Sebastián Sánchez, do Instituto de Ictiología del Nordeste,
Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste, Argentina, coletadas
em 2011 por pescadores no Porto de Antequera (Corrientes, Argentina).

2.2 Extração de DNA

Para as análises moleculares foram utilizados os métodos de extração e purificação do

DNA total baseados no kit comercial Wizard genomic DNA purification kit (Promega).
Foram utilizados dois protocolos de extração de DNA (protocolos A e B), com algumas
modificações de acordo com o tecido utilizado. O protocolo A foi empregado para extração de
DNA de sangue, enquanto o protocolo B foi utilizado para amostras de tecidos sólidos como
fígado e nadadeira. O DNA genômico total extraído foi quantificado em gel de agarose 1%
através da comparação com o padrão do marcador ladder Low DNA Mass Ladder
(Invitrogen), que possui peso molecular e concentrações conhecidos.

Protocolo A
1 numerar duas séries de tubos de microcentrífuga (1,5 ml);
2 retirar uma pequena quantidade de sangue, adicionar nos tubos de microcentrífuga e colocar
na estufa por aproximadamente 10 minutos;
3 adicionar 300 μl de Cell lysis solution;
4 adicionar 5 μl de Proteinase K e vortexar;
5 levar ao banho-maria a 55º C por aproximadamente 1hora; Esperar voltar a temperatura
ambiente e continuar os procedimentos;
6 centrifugar por 30 segundos a 13.000 rpm e descartar o sobrenadante;
7 vortexar o pellet e adicionar 300 μl de Nuclei lysis solution e vortexar por 20 segundos;
8 centrifugar por 4 minutos a 13.000 rpm;
9 transferir o sobrenadante para a segunda série de tubo de microcentrífuga contendo 300 μl
de isopropanol e misturar por inversão;
10 centrifugar por 4 minutos a 13.000 rpm e descartar o sobrenadante;
11 adicionar 300 μl de Etanol 70% a temperatura ambiente;
12 centrifugar por 4 minutos a 13.000 rpm;

18
 Material e métodos

13 descartar o etanol cuidadosamente virando o tubo;

14 deixar secar em temperatura ambiente ou na estufa a 37° C, por 1 hora;
15 adicionar 100 μl de DNA rehydration solution por 1 hora a 65º C ou 24 horas a 4ºC.

Protocolo B
1 numerar duas séries de tubos de microcentrífuga (1,5 ml);
2 retirar uma pequena quantidade de tecido, adicionar nos tubos de microcentrífuga e colocar
na estufa por aproximadamente 10 minutos;
3 adicionar 600 μl de Cell lysis solution;
4 adicionar 5 μl de proteinase K e vortexar;
5 levar ao banho-maria a 60º C por aproximadamente 2 horas; Esperar voltar a temperatura
ambiente e continuar os procedimentos;
6 adicionar 3 μl de RNAse e colocar no banho-maria a 37° C por 30 minutos. Esperar voltar a
temperatura ambiente e continuar os procedimentos;
7 adicionar 200 μl de Protein precipitation solution e misturar rapidamente no vórtex;
8 Levar ao gelo por 5 minutos;
9 centrifugar por 4 minutos a 13.000 rpm;
10 remover o sobrenadante com cuidado e transferi-lo para outro tubo com 600 μl de
isopropanol a temperatura ambiente;
11 inverter os tubos gentilmente até que os filamentos de DNA tornem-se visíveis;
12 centrifugar por 4 minutos a 13.000 rpm e remover o sobrenadante invertendo o tubo
cuidadosamente;
13 adicionar 600 μl de etanol 70% (com a ponteira voltada para parede do tubo para não soltar
o pellet do fundo do tubo);
14 centrifugar por 4 minutos a 13000 rpm;
15 deixar secar em temperatura ambiente ou na estufa a 37° C, por 1 hora;
16 adicionar 75 μl de DNA rehydration solution por 1 hora a 65º C ou 24 horas a 4ºC.

2.3 Desenvolvimento e aplicação dos marcadores moleculares

Foram desenvolvidos três marcadores nucleares (EF1 - nuclear elongation factor 1 α,

Globina – β globina, ribossômico 18S) através das técnicas de PCR-RFLP (Polymerase chain
reaction-Restriction fragment length polymorphism) e PCR-multiplex, para a identificação

19
 Material e métodos

das espécies P. reticulatum, P. corruscans e seus híbridos. Estes marcadores foram utilizados
em conjunto com os marcadores RAG2 (Recombination activating gene 2) e mitocondrial 16S
(Prado et al., 2011a) previamente desenvolvidos para estas espécies.
Em uma próxima etapa, através de um pirosequenciamento Roche-454, foram
desenvolvidos e caracterizados novos marcadores microssatélites para a espécie P.
reticulatum. Foram feitos testes de transferabilidade para testar a amplificação em P.
corruscans. Os loci mais adequados foram selecionados de acordo com os objetivos de cada
etapa do trabalho para serem aplicados na investigação da diversidade, estruturação genética e
hibridação em populações destas espécies.

2.3.1 Genes nucleares e mitocondrial

2.3.1.1 Genes EF1, Globina e 18S

Para o desenvolvimento de novos marcadores nucleares, fragmentos dos genes

nucleares EF1, Globina e 18S foram amplificados através de PCR utilizando-se pares de
primers foward (F) e reverse (R) para cada região nuclear (Tabela 2).
As amplificações destes fragmentos gênicos foram realizadas basicamente em um
volume total de 25 μl contendo 150 μM de cada dNTP (dATP, dTTP, dGTP e dCTP), MgCl2
1.5 mM, tampão da Taq 1X(20 mM Tris-HCl, pH 8.4 e 50 mM KCl), 0.5 unidades (U) da
enzima Taq polymerase (Invitrogen), 0.1 a 0,2 μM de cada primer e 10-50 ng de DNA
genômico. Estas reações foram realizadas no termociclador Mastercycler personal
(Eppendorf), basicamente sob as condições de desnaturação a 95°C por 40s, hibridização de
52°C por 40s e extensão a 72°C por 20s, com 35 repetições.

20
 Material e métodos

Tabela 2. Sequências dos primers utilizados na amplificação dos fragmentos dos genes nucleares e
gene mitocondrial.

Primer Sequencia* Referências

RAG2 Silu F CCTGAGTGCTACCTATTCATGGA
Prado et al., 2011a
RAG2 Silu R CTTGGGAGGAGAGACCATC
EF1α 835 F ATTGGAACTTACCTGTGG
Moyer et al., 2004
EF1α 1417 R CAGCCTTCTGTGCAGACTT
NS1 F GTAGTCATATGCTGTCTC White et al., 1990
18S Silu R CCATCGAAAATTGATAGGG presente trabalho
Glob Silu F TCAATATGGTTCATGGACAGA
presente trabalho
Glob Silu R CCAGAAGCTGAAAGTAGACAGT
16S F ACGCCGTTTATCAAAAACAT
Palumbi, 1996
16S R CCGGTCTGAACTCAGATCCGT
*Sequência na ordem de 5’ para 3’, Silu: Siluriformes, F:Forward, R:Reverse.

2.3.1.2 Purificação dos produtos amplificados por PCR

Foi utilizado o protocolo de purificação de DNA tendo por base o kit comercial
Protocolo do PEG (PolyEthylene Glycol) desenvolvido por Travis Glenn, disponível no
endereço <http://www.uga.edu/srel/DNA_Lab/PEG_Precip’00.rtf>:
1 adicionar 25 µl de polietileno glicol (PEG) 20%-NaCl 2,5 M ao produto de PCR
amplificado (25 µl). Misturar com a pipeta várias vezes;
2 colocar a 37ºC em estufa ou termociclador por 15 minutos;
3 centrifugar a 14.000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente;
4 descartar o sobrenadante;
5 adicionar 63 µl de álcool etílico 80% e esperar 2 minutos;
6 centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente;
7 descartar o sobrenadante;
8 adicionar 63 µl de álcool etílico 80% e esperar 2 minutos;
9 centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente;
10 descartar o sobrenadante;
11 secar em estufa a 37ºC por cerca de 10 minutos;
12 eluir em TE (100 mM Tris-CL e 10 mM EDTA - pH 8.0) adicionando 12,5µl e aguardar
pelo menos 30 minutos antes de utilizar o produto limpo.

21
 Material e métodos

2.3.1.3 Reação de amplificação para o sequenciamento

Os produtos amplificados e purificados foram utilizados como moldes para as reações

de sequenciamento com o kit DYEnamic Terminator Cycle Sequencing (Amersham
Biosciences), utilizando o primer forward para cada gene. Para cada sequência gênica
realizou-se uma réplica. A reação de sequenciamento seguiu os seguintes parâmetros: um
ciclo inicial a 95ºC por 2 min, e 25 ciclos de 95ºC/45s, 50ºC/30s e 60ºC/2min. Em cada
reação foram utilizados 3 l de produto da PCR, 2 l de tampão da reação (buffer), 2 l de
pré-mix e 2 l do primer foward (3 M).

2.3.1.4 Limpeza dos fragmentos marcados

Na limpeza dos fragmentos resultantes do processo de amplificação procedeu-se do

seguinte modo:
1 adicionar 1,0 µl de acetato de sódio 1,5M/EDTA 250 mM a cada tubo;
2 adicionar 80 µl de etanol 95% para cada reação e misturar no vórtex;
3 centrifugar a 16.000 rpm por 20 minutos a 4ºC;
4 remover o sobrenadante por aspiração;
5 adicionar 400 µl de etanol 70%;
6 centrifugar a 16.000 rpm por 10 minutos a 4ºC;
7 remover o sobrenadante por aspiração;
8 deixar secar na estufa a 37ºC por 30 minutos, protegido da luz.
As sequências foram determinadas no seqüenciador automático ABI PRISMTM 377
DNA Sequencer (Perking-Elmer) e posteriormente foram depositadas no GenBank do
National Center of Biotechnology Information (NCBI).

2.3.1.5 PCR-RFLP

As regiões sequenciadas dos genes Globina, EF1 e 18S foram submetidas ao programa
NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003) para gerar mapas de restrição, tornando possível
encontrar enzimas específicas para as espécies parentais analisadas. Os produtos do PCR
foram submetidos à restrição enzimática em um volume final de 8 μl contendo 5 μl dos
produtos de PCR, tampão da enzima 1X e 5 unidades de enzima de restrição (10 U/μl) (New

22
 Material e métodos

England Biolabs Inc.). O material das reações foi incubado por 2 horas de acordo com a
temperatura ideal de cada enzima.

2.3.1.6 PCR-Multiplex

As sequências parciais dos genes Globina e EF1 foram alinhadas através do programa
ClustalW (Thompson et al., 1994) implementado no programa BIOEDIT (Hall, 1999) para
verificar pontos de mutação, a partir dos quais foram desenhados os primers espécie-
específicos. As condições ideais dos primers foram analisadas através do programa NetPrimer
disponível no site do PREMIER Biosoft International
<http://www.premierbiosoft.com/netprimer>.
Para as amplificações multiplex foram utilizados, na mesma reação, tanto os primers
foward e reverse (Tabela 2) como os primers espécie-específicos desenvolvidos para as
espécies parentais, de acordo com o gene a ser analisado. As reações inicialmente foram
realizadas em uma concentração de aproximadamente 150 μM de cada dNTP, MgCl2 1.5
mM, tampão da Taq 1X, 0.5 unidades de Taq polymerase (Invitrogen), 0.1 a 0,4 μM de cada
primer e 10-50 ng de DNA genômico (total de 25 μl). As amplificações foram realizadas no
termociclador Mastercycler personal (Eppendorf) basicamente sob as condições de
desnaturação a 95°C por 40s, hibridização de 50 a 58°C por 40s e extensão a 72°C por 10 a
20s, com 35 repetições.
Para os genes onde foram desenvolvidas ambas as técnicas, a PCR-multiplex foi
utilizada em primeiro lugar, seguida pela PCR-RFLP em análises subsequentes para
confirmação dos resultados. Três amostras de DNA de cada espécie parental, previamente
identificadas como puras, foram utilizadas como controle de especificidade de todas as
reações. Os fragmentos de DNA das análises PCR-multiplex e PCR-RFLP foram visualizados
em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio (1 ng/ml) ou SYBR Safe™ (Applied
Biosystems), utilizando o DNA ladder de 1 Kb (Invitrogen).

2.3.1.7 Genes RAG2 e 16S

Na PCR-RFLP os fragmentos de genes RAG2 e 16S foram amplificados por PCR

utilizando os primers descritos na tabela 2 e utilizando as enzimas Sau96I (RAG2) e SmlI
(16S) seguindo as mesmas etapas de clivagem enzimática (tópico 2.3.1.5). No multiplex-PCR,

23
 Material e métodos

além dos iniciadores para cada gene (Tabela 2), foram utilizados os primers espécie-
específicos RAG2Pc R (5’-AACTCCAGGTCAATGAGATAAATG-3’) e RAG2Pr R (5’-
CAGTTCCAGGTCTCTGTGGTT-3’) para o gene RAG2 e 16SPc F (5-
TGACCATAAAGATCCGGCTAT-3’) e 16SPr R (5’-TCTTGGTTTTGGGGTTGTTA-3’)
para o gene 16S (Prado et al., 2011a). As condições dos programas e concentração das
amplificações por PCR seguiram o indicado por Prado et al. (2011a) enquanto a análise em
gel de agarose seguiu as mesmas etapas descritas anteriormente.

2.3.2 Microssatélites

2.3.2.1 Análise das sequências e seleção dos microssatélites

O DNA genômico total de três indivíduos da espécie P. reticulatum foi analisado em

sequenciador Roche 454 GS FLX com plataforma Titanium Genome sequencer 20 System
(Instituto Agrobiotecnológico de Rosário – INDEAR, Argentina). Detalhes sobre a técnica de
pirosequenciamento estão descritas em Margulies et al. (2005).
Após o sequenciamento foram obtidas aproximadamente 80.000 sequências de DNA,
que foram analisadas a fim de identificar os fragmentos mais adequados para o
desenvolvimento dos marcadores microssatélites. Em uma primeira busca foram selecionadas
manualmente cerca de 400 sequências de 250 a 500 pares de bases (pb) contendo
microssatélites perfeitos do tipo dinucleotídeos (com oito repetições ou mais) tri, tetra, penta e
hexanucleotídeos (com um mínimo de cinco repetições) e que apresentassem um tamanho
suficiente para o desenho de primers nas regiões flanqueadoras das repetições. As sequências
reversas e complementares de cada fragmento foram obtidas através do programa Reverse
Complement disponível em http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html.
Foram desenhados 40 pares de primers com o auxílio do programa Primer3 (Rozen e
Skaletsky, 2000) observando-se os seguintes critérios: serem constituídos de 18 a 22 pares de
bases, estar a uma distância adequada dos microssatélites (de 10 a 50pb), com temperaturas de
anelamento similares entre os primers foward e reverse (entre 55 e 62° C) e apresentando
menores taxas de complementaridade ou formação de dímeros. Os loci foram denominados
Prt como referência ao nome da espécie P. reticulatum, abreviando-se o nome do gênero (P) e
da espécie (rt), seguido de número correspondente à ordem com que foram desenhados.

24
 Material e métodos

A eficácia de amplificação dos 40 pares de primers foi testada em quatro exemplares

de P. reticulatum e quatro indivíduos de P. corruscans. O PCR foi conduzido em reações com
um volume final de 15ul contendo 100 μM de cada dNTP, MgCl2 1.5 mM, tampão da Taq
1X, 0.5 unidades de Taq (Applied Biosystems), 0.67 μM de cada primer e 30 ng de DNA
genômico. As condições de amplificação foram de 10 minutos a 95ºC, seguidos de 34 ciclos
de 45 s a 94º C, 50 s a 58ºC e 50 s a 72ºC, com uma extensão final de 72 ºC por 10 min em
um termociclador VeritiTM (Applied Byosystems). Os produtos foram visualizados em gel de
agarose 2.5% utilizando o DNA ladder 100 pb (Invitrogen) e SYBR Safe™ (Applied
Biosystems).
Entre as amplificações positivas foram selecionados 16 microssatélites considerando
critérios úteis para a identificação de híbridos e estudos de diversidade como: bons resultados
de PCR utilizando a mesma temperatura de anelamento (requisito para a posterior
amplificação simultânea de diversos primers em reações de PCR-multiplex), especificidade,
alto polimorfismo e diferenças de tamanho entre os alelos das espécies.

2.3.2.2 Caracterização dos microssatélites em P. reticulatum e P. corruscans

Para a caracterização e o estabelecimento dos 16 loci microssatélites desenvolvidos

para P. reticulatum, foram genotipados 22 indivíduos desta espécie provenientes da população
Cb2, rio Cuiabá, Bacia do Paraguai (Tabela 1). Os testes de amplificação cruzada, ou
transferabilidade, foram conduzidos em uma mescla de 12 espécimes de P. corruscans
coletados de quatro populações diferentes nas bacias do Paraguai e Paraná: Cb3 (N=4), Ng
(N=2), Ve (N=3) e Pr2 (N=3) (Tabela 1). Além disso, com a intenção de obter uma ampla
representação da diversidade e divergência genética dos microssatélites a serem estabelecidos
para ambas as espécies, foram adicionados às análises 20 indivíduos de P. reticulatum
provenientes de oito populações distintas das bacias do Paraguai e Paraná: Pa2 (N=3), Cb3
(N=4), Taq1 (N=3), Ng (N=2), Mir (N=2), Pp (N=3) e Pr2 (N=3) (Tabela 1).
Nas reações de PCR-multiplex os 16 loci foram organizados em grupos de 4 pares de
primers de acordo com o tamanho dos seus fragmentos e cor com que seriam marcados, a fim
de possibilitar a distinção de seus alelos durante a análise automática. As reações tiveram um
volume final de 10 μl contendo 5 μl de Mix para PCR (Quiagen Master mix - 100 μM de cada
dNTP, MgCl2 1.5 mM, tampão da Taq 1X, 0.5 unidades de Taq, 0.4 μM de cada primer
reverse, 0.4 μM de cada primer foward marcado com fluorescência (NED - amarelo, VIC -

25
 Material e métodos

verde, Pet - vermelho ou 6-FAM - azul) (Applied Biosystems) e 30 ng de DNA genômico. O

programa foi de 15 min a 95ºC, seguidos por 30 ciclos de 30 s a 94ºC, 1 min a 58ºC e 1 min a
72ºC, com uma extensão final de 60ºC por 30 min em um termociclador VeritiTM (Applied
Byosystems).
As amplificações foram confirmadas em gel de agarose a 1% agarose utilizando o
DNA ladder de 100 bp DNA ladder (Invitrogen) corado com SYBR Safe ™ (Applied
Biosystems) e posteriormente aplicadas em analisador genético automático ABI PRISM_3730
(Applied Biosystems). O tamanho dos alelos foram estabelecidos e marcados utilizando o
programa Gene Mapper 3.7 (Applied Biosystems). As sequências dos primers foram
depositadas no GenBank do NCBI.

2.3.3 Avaliação de híbridos e introgressão utilizando genes nucleares e mitocondrial

Inicialmente os indivíduos de todas as populações coletadas (Tabela 1) foram

identificados através dos padrões de banda diagnósticos dos marcadores de genes nucleares
(RAG2, Globina, EF1 e 18S) e mitocondrial 16S. As espécies parentais foram as que
apresentaram os marcadores monomórficos espécie-específico. Os exemplares que possuíram
marcadores de ambas as espécies para um ou mais genes nucleares ou gene mitocondrial
foram inicialmente categorizados como híbridos.
Em uma segunda etapa, foram analisados os genótipos individualmente na tentativa de
identificar a qual linhagem parental ou híbrida os indivíduos pertenciam. Os híbridos F1
foram os que apresentaram bandas de ambas as espécies, ou heterozigotas, para todos os
marcadores nucleares. Os híbridos com marcadores nucleares variáveis entre as espécies ou
diferenças entre o marcador mitocondrial e nucleares foram categorizados como híbridos
avançados.
Utilizando o marcador mitocondrial foi possível identificar o parental materno P.
corruscans ou P. reticulatum, categorizar os híbridos F1 como cruzamentos entre fêmea de P.
reticulatum e macho de P. corruscans (F1 "cachapinta" ou PrPc) ou entre fêmea de P.
corruscans e macho de P. reticulatum (F1 "pintachara" ou PcPr) e verificar a direção dos
cruzamentos avançados.
Posteriormente, foi utilizado o programa NewHybrids 1.1 (Anderson e Thompson,
2002) para verificar a probabilidade (Q) de cada indivíduo pertencer a uma das seis classes:
parental 1 P. reticulatum (Pr), parental 2 P. corruscans (Pc), primeira geração de híbridos

26
 Material e métodos

interespecíficos (F1), segunda geração de híbridos (F2), retrocruzamentos de F1 com o

parental 1 (RPR) ou retrocruzamentos de F1 com o parental 2 (RPC). Os testes foram baseados
em 100.000 varreduras MCMC após um período de burn-in de 100.000. Os híbridos que não
puderam ser identificados através desta abordagem foram classificados em uma única
categoria como híbridos avançados (HA).

2.3.4 Aplicação dos microssatélites no estudo das populações naturais

Indivíduos das populações parentais e locais com ocorrência de híbridos foram

genotipados através de 10 microssatélites (Prt3, 5, 11, 12, 25, 27, 30, 34, 36 e 39). Estes loci
foram escolhidos por apresentarem altos valores de polimorfismo, estarem em equilíbrio de
Hardy-Weinberg, não apresentarem indícios de alelos nulos e por possuírem diferentes
tamanhos de alelos entre as espécies (utilizados para os estudos de hibridação).
As populações das espécies parentais foram provenientes de rios das bacias do
Paraguai e Paraná, totalizando 119 amostras de P. reticulatum provenientes de seis
populações dos rios Paraguai (Pa2), Cuiabá (Cb2), Taquari (Ta1), Negro (Ng), Miranda (Mir)
(Bacia do Paraguai) e Paraná (Pr2) (Bacia do Baixo Paraná). As amostras de P. corruscans
compuseram um total de 202 exemplares provenientes de sete populações dos rios Paraguai
(Pa2), Cuiabá (Cb2), Taquari (Ta1), Negro (Ng), (Bacia do Paraguai), Verde (Ve),
Paranapanema (Pp) (Bacia do Alto Paraná) e Paraná (Pr2) (Bacia do Baixo Paraná) (Tabela 1,
Figura 1). Estas localidades foram eleitas por apresentarem um maior número de indivíduos
coletados e por abrangerem áreas distantes geograficamente, o que pode ser útil para verificar
os padrões de estruturação ou diferenciação entre as populações de cada espécie. Também
foram genotipados indivíduos das populações de Aquidauana (N=30) e Mogi-Guaçu (N=43).
As amplificações foram feitas através de dois PCRs-multiplex utilizando cinco pares
de primers em cada reação (Multiplex 1: Prt3, 12, 25, 11 e 34; Multiplex 2: Prt36, 5, 27, 30 e
39). As reações seguiram as mesmas etapas, concentrações e programas descritos no item
2.3.2.2.

2.3.4.1 Diversidade e estruturação em populações de P. reticulatum e P. corruscans

Para cada espécie foram estabelecidos os valores alélicos totais e médios por locus e
por população. O número de indivíduos analisados, número de alelos e valores de
heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) foram obtidos através do programa Cervus
27
 Material e métodos

3.0 (Marshall et al., 1998). Riqueza alélica foi obtida através do programa Fstat 2.9.3.2
(Goudet, 2002). Os valores de Fis (coeficiente de endogamia) e os cálculos de desvios do
equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e desequilíbrio de ligação foram analisados através de
testes exatos de Fisher, implementados no programa GenePop 3.4 (Raymond e Rousset,
1995). Para verificar a ocorrência de alelos nulos utilizou-se o programa Micro-checker 2.2.3
(Van Oosterhout et al., 2004). Os valores de significância (P<0.05) foram ajustados de acordo
com a correção de Bonferroni) (Rice, 1989).
Para investigar a ocorrência de estruturação genética entre as populações de P.
reticulatum e P. corruscans foram obtidos os índices de Fst (Weir e Cockerham, 1984)
assumindo o modelo de alelos infinitos (IAM) para todos os loci e para todas as populações
no programa Arlequin 3.11 (Excoffier et al., 2005). Neste mesmo programa foram realizados
testes de variância molecular (AMOVA) (Excoffier et al., 1992) para verificar a distribuição
da variação entre populações, grupos de populações e dentro de populações. As significâncias
foram testadas por 1000 permutações.
Nos testes de AMOVA, as amostras de P. reticulatum foram analisadas de duas
formas: primeiro com todos os indivíduos como um único grupo; e posteriormente separadas
em dois grupos (um grupo com os indivíduos da bacia do Paraguai e outro grupo com as
amostras do Baixo Paraná). Para P. corruscans estas análises foram conduzidas de duas
maneiras: um único grupo composto por todas as populações; e dois grupos (um grupo com as
populações da bacia do Paraguai+Baixo Paraná e outro com amostras do Alto Paraná).
Análises bayesianas foram conduzidas através do programa Structure 2.3.4 (Pritchard
et al., 2000) para verificar o número real de populações (K) entre as amostras de cada espécie.
Foi permitido o modelo de ancestralidade não misturada (no admixture model) a fim de
permitir uma resolução máxima, uma vez que este parâmetro assume que cada indivíduo vem
exclusivamente de uma das populações (K) e é mais indicado para verificar uma estruturação
populacional sutil (Pritchard et al., 2000). Foram utilizados alelos correlacionados, 20 réplicas
para cada valor de K, 500.000 gerações da cadeia de Markov Monte Carlo(MCMC), com
períodos de “burn-in” de 200.000, e assumindo K=2 a 12 em P. corruscans e K=2 a 11 em P.
reticulatum. Posteriormente, para visualizar a extensão dos genótipos compartilhados entre as
populações (q), foram feitas novas análises com 20 réplicas para K=2, admixture mode,
500.000 cadeias MCMC, e período de “burn in”de 100.000.

28
 Material e métodos

2.3.4.2 Diferenciação entre as espécies

A fim de visualizar as diferenças alélicas interespecíficas, as populações de P.

reticulatum e P. corruscans sem ocorrência de hibridação foram agrupadas por espécie. A
diversidade genética e diferenças dos alelos entre as espécies foram medidas através do
número de alelos, riqueza alélica, variação de tamanho dos alelos e valores de Ho e He para
cada microssatélite. Foram utilizandos os programas citados no tópico anterior.
A divergência relacionada à variação e frequência dos alelos entre as espécies foi
medida através do índice Fst utilizando o programa Arlequin 3.11. Através deste mesmo
programa também foram feitas análises de AMOVA para acessar a variação entre as espécies
e entre as populações dentro de cada espécie. Também foram obtidos valores de Rst (Rousset,
1996; Goodman, 1997) que consiste em uma variação dos índices de diferenciação genética
com base no tamanho alélico, implementado no programa GenePop 3.4. As frequências
alélicas para todos os loci por espécie foram obtidas através do programa Fstat 2.9.3.2.
A fim de verificar o número real de K entre todas as amostras (N=394) e visualizar o
número de grupos diferenciados entre as espécies parentais e as populações com híbridos, o
valor de K foi estimado através do programa Structure2.3.4 assumindo ancestralidade
misturada, alelos correlacionados, testados valores de K=2 a 10, 20 réplicas para cada valor
de K, 500.000 cadeias MCMC e 100.000 gerações “burn-in”.

2.3.4.3 Identificação de híbridos e introgressão genética

Foram obtidos dados de diversidade genética nas populações com híbridos (A, Ar,
variação de tamanho dos alelos, Ho e He) e verificados possíveis desvios do EHW, alelos
nulos e desequilíbrio de ligamento entre os loci utilizando os parâmetros e programas
descritos anteriormente. Os valores de significância (P<0.05) para estes testes foram ajustados
de acordo com a correção de Bonferroni (Rice, 1989).
Posteriormente foram realizados testes para verificar as probabilidades de
identificação de híbridos F1 e híbridos avançados em populações naturais de P. reticulatum e
P. corruscans com ocorrência de híbridos (rio Aquidauana e Mogi-Guaçu) utilizando análises
bayesianas. Foram feitos testes utilizando somente os marcadores variáveis microssatélites (8
loci - Prt3, 5, 12, 25, 27, 30, 36 e 39); utilizando os microssatélites junto com marcadores dos
genes RAG2, EF1 e gene ribossômico 18S ou utilizando apenas os microssatélites que se

29
 Material e métodos

mostraram totalmente diagnósticos entre as espécies junto com os marcadores dos genes
RAG2, EF1 e 18S.
O programa Structure 2.3.4 foi utilizado para acessar os valores de q de cada indivíduo
atribuído a cada espécie parental, P. reticulatum ou P. corruscans. Foi estimado K=2,
ancestralidade misturada, 20 réplicas para cada valor de K, 500.000 cadeias MCMC, 100.000
gerações “burn-in” e utilizando a opção “popflag” para as espécies parentais (1: P.
reticulatum, 2: P.corruscans e 0: populações com hibridação). O programa NewHybrids 1.1
(Anderson e Thompson, 2002) foi utilizado para estimar a probabilidade total (Q) de cada
indivíduo pertencer a uma das seis classes: parental 1 P. reticulatum (Pr), parental 2 P.
corruscans (Pc), primeira geração de híbridos interespecíficos (F1), segunda geração de
híbridos (F2), retrocruzamentos de F1 com o parental 1 (RPR) ou retrocruzamentos de F1 com
o parental 2 (RPC). Os testes foram baseados em 100.000 varreduras MCMC após um período
de burn-in de 100.000, com as opções de z e s para indicar as espécies puras (z0s: P.
reticulatum e z1s: P. corruscans). Esta classificação foi realizada utilizando os marcadores
que permitiram uma melhor identificação dos indivíduos testados através do programa
Structure. Foi utilizado um índice de confiança de 90% para discriminar os indivíduos como
espécies parentais, sendo que os exemplares com valores menores de atribuição a determinada
espécie (0.1≤q≥0.9) foram identificados como indivíduos com algum nível de mistura entre as
espécies.

30
 Resultados e discussão

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados e discussão referentes ao desenvolvimento e caracterização dos

marcadores genéticos nucleares estão apresentados na forma de dois artigos: “Detection of
post-F1 fish hybrids in broodstock using molecular markers: approaches for genetic
management in aquaculture” (publicado na revista Aquaculture Research) e "Development
and characterization of 16 microsatellites loci in the Neotropical catfish Pseudoplatystoma
reticulatum and cross-species analysis in P. corruscans: tools for population genetics and
hybridization studies” (enviado para publicação na revista Conservation Genetics)
(Apêndices).
Os resultados e discussão relacionados à aplicação destes marcadores nos estudos de
diversidade genética, estruturação e hibridação encontram-se na forma de três capítulos:

Capítulo 1.
Avaliação genética da hibridação entre os bagres Pseudoplatystoma reticulatum e P.
corruscans revela introgressão genética na natureza

Capítulo 2.
Diversidade e estruturação genética em populações dos peixes migradores Neotropicais
Pseudoplatystoma reticulatum e Pseudoplatystoma corruscans em rios das bacias do Paraguai
e Paraná

Capítulo 3.
Microssatélites e genes na detecção de hibridação entre duas espécies do gênero
Pseudoplatystoma através de análises bayesianas

31
 Resultados e discussão - Capítulo 1

CAPÍTULO 1

Avaliação genética da hibridação entre os bagres Pseudoplatystoma reticulatum e

P. corruscans revela introgressão genética na natureza

RESUMO

A hibridação interespecífica em peixes tem aumentado rapidamente devido a ações antrópicas

como alterações ambientais, introdução de espécies e a produção de híbridos na aquicultura.
No Brasil ainda são escassos os estudos que envolvam a análise do ambiente natural em
relação à ocorrência de híbridos e retrocruzamentos em populações de espécies nativas. Como
tem sido relatada a presença de híbridos dos bagres Pseudoplatystoma reticulatum e P.
corruscans na natureza, este trabalho buscou realizar uma avaliação da ocorrência de
hibridação e introgressão genética em populações destas espécies distribuídas pelas bacias do
Tocantins, Uruguai, Paraná e Paraguai (América do Sul), utilizando marcadores genéticos
(três genes nucleares e um gene mitocondrial). Em 12 rios não foram observados híbridos,
mesmo em populações onde as espécies ocorrem em simpatria, indicando que possivelmente a
hibridação natural é rara entre estas espécies. No Rio Paraná (Bacia do Alto Paraná) dois
híbridos F1 estavam presentes na população amostrada (3.92 %). Já no rio Aquidauana (Bacia
do Paraguai) foram observados altos níveis de híbridos (50.00 %), sendo que poucos foram F1
e a maioria correspondeu a retrocruzamentos com P. reticulatum. No rio Mogi-Guaçu (Bacia
do Alto Paraná) foi evidenciada a possível introdução da espécie P. reticulatum, além de uma
população apresentando 44.19 % de híbridos, composta por ambas as gerações F1 recíprocas
e retrocruzamentos com P. reticulatum. Estes dados indicam que a introgressão entre estas
espécies está ocorrendo em rios brasileiros, possivelmente devido à escapes e introduções de
híbridos de pisciculturas. Como são férteis, as linhagens avançadas podem ser tanto
provenientes de cultivo como estarem se reproduzindo na natureza. Todos os peixes coletados
eram adultos, o que demonstra que os híbridos F1 e as linhagens avançadas
(retrocruzamentos) entre estas espécies sobrevivem e possivelmente estão permanecendo em
populações de ocorrência destas espécies. Discussões sobre a eficácia dos marcadores para
detectar hibridação e possíveis ações de conservação também são apresentados.

32
 Resultados e discussão - Capítulo 1

INTRODUÇÃO

Populações selvagens de peixes tem sofrido alterações ecológicas e genéticas

ocasionadas por diversos fatores antrópicos como a pesca excessiva, poluição, construção de
barragens, introdução de espécies, hibridação interespecífica entre espécies nativas e exóticas
e hibridação ocasionada por escapes e introduções de indivíduos cultivados (Scribner et al.,
2001; Metcalf et al., 2008; Allendorf et al., 2010; Porto-Foresti et al., 2010).
O cruzamento interespecífico pode não constituir ameaças ecológicas quando
intimamente relacionada aos processos evolutivos das espécies durante a sua história
biológica e geralmente ser caracterizada pela ocorrência de eventos esporádicos de hibridação
entre espécies simpátricas, resultando na formação de zonas híbridas limitadas a determinadas
regiões (Arnold et al., 1999; Barton, 2001; Mallet, 2005; Willis et al., 2012). Mesmo em
pequena escala, a hibridação natural pode contribuir em processos adaptativos e de especiação
durante a evolução de muitos grupos animais (Arnold et al., 1999; Mallet, 2007; Willis et al.,
2012; Abbott et al., 2013)
Porém, a hibridação não natural, ou ocasionada pelo homem, está ocorrendo de forma
muito rápida, e é considerada uma das principais ameaças para a conservação de espécies
selvagens (Rhymer e Simberloff, 1996; Allendorf et al., 2001; Allendorf et al., 2010; Lamer et
al., 2010). Quando os genomas de espécies distintas se misturam através da hibridação e
introgressão genética (ou seja, quando alelos são transferidos entre as espécies através de
retrocruzamentos), pode ocorrer a perda de alelos ou o rearranjo de combinações gênicas
previamente existentes e que provavelmente podem nunca mais ser recriadas, resultando no
desaparecimento de adaptações a determinados ambientes (Laikre et al., 1999).Os híbridos F1
(primeira geração filial ou híbridos interespecíficos) estéreis podem competir ecologicamente
com as espécies parentais ou, caso sejam férteis, alterar a composição genética das populações
através de introgressão (Toledo-Filho et al., 1994, 1998).
Uma prática indicada para avaliar os efeitos genéticos da hibridação em populações
selvagens é o monitoramento ou avaliação genética, que permite verificar a ocorrência de
híbridos F1 e introgressão através da identificação dos indivíduos utilizando marcadores
genético-moleculares (Toledo-Filho et al., 1998; Allendorf et al., 2001; 2010; Jolly et al.,
2011). Estas análises representam um dos meios mais efetivos para verificar quando as
populações atingem limiares críticos que necessitem medidas de gestão (Allendorf et al.,
2010; Schwartz et al., 2007).

33
 Resultados e discussão - Capítulo 1

Os estudos sobre hibridação introgressiva em espécies nativas de peixes ainda são

escassos no Brasil. Contudo, atualmente tem sido verificada uma crescente preocupação sobre
os impactos biológicos da hibridação (Toledo-Filho et al., 1994; 1998; Porto-Foresti et al.,
2010) e diversos marcadores genéticos tem sido desenvolvidos para a identificação de
híbridos, especialmente para espécies de interesse comercial como bagres Pimelodídeos e
“peixes redondos” Serrassalmídeos (Hashimoto et al., 2011a; Prado et al., 2011a, Hashimoto
et al., 2013a; Porto-Foresti et al., 2013; Carvalho et al., 2013).
Os bagres Neotropicais, Pseudoplatystoma reticulatum e Pseudoplatystoma
corruscans são peixes migradores (Lundberg e Littman et al., 2003) e de alto valor econômico
no Brasil. Estas espécies tem sido intensivamente utilizadas na produção de híbridos
interespecíficos em pisciculturas brasileiras (Crepaldi et al., 2006; Campos, 2010; Porto-
Foresti et al., 2010; Hashimoto et al., 2013a). Embora os adultos híbridos F1 possam ser
parcialmente identificados através do seu padrão de manchas na pele (intermediário entre as
espécies, com pontos e listras), os alevinos e juvenis são muito parecidos com as espécies
puras (Campos, 2010; Porto-Foresti et al., 2010). Além disso, estes híbridos são férteis (Prado
et al., 2012b; José A. Senhorini, comunicação pessoal), e tem sido equivocadamente
utilizados como reprodutores em pisciculturas, resultando na produção de linhagens híbridas
avançadas com altas taxas de mortalidade e de difícil identificação morfológica (Hashimoto et
al., 2013a).
Embora não existam estudos que indiquem a formação de híbridos naturais ou zonas
híbridas entre estas espécies, nas últimas décadas tem sido relatada a presença de seus
híbridos na natureza. Veríssimo et al. (2005) capturaram um híbrido “P. corruscans x P.
fasciatum” no rio Manso (bacia do Paraguai) durante o período de 2000 a 2005, o qual foi
identificado através de parâmetros morfológicos. Bignotto et al. (2009) também observaram
um exemplar híbrido destas espécies na planície de inundação do rio Paraná (bacia do Alto
Paraná), utilizando marcadores genéticos ISSR (Inter simple sequence repeat) e DNA
mitocondrial. Outro estudo, utilizando dois marcadores genéticos (um gene nuclear e um gene
mitocondrial) demonstraram a ocorrência de híbridos F1 destas espécies nos rios Aquidauana,
Paraná, Mogi-Guaçu, e um híbrido avançado no rio Mogi-Guaçu (Prado et al., 2012a).
Possivelmente, o manejo inadequado destes híbridos em pisciculturas seja o principal
responsável pela sua dispersão em rios brasileiros através de introduções e escapes (Bignotto
et al., 2009; Porto-Foresti et al., 2010; Prado et al., 2012a).

34
 Resultados e discussão - Capítulo 1

Até o momento, a hibridação foi investigada em poucos rios de ocorrência das

espécies P. reticulatum e P. corruscans. Também não existem dados sobre os níveis de
hibridação introgressiva em suas populações. Assim, este trabalho objetivou utilizar um
conjunto de cinco marcadores genético moleculares para avaliar a ocorrência e frequência de
híbridos e introgressão genética em rios das Bacias do Tocantins/Araguaia, Paraguai, Paraná e
Uruguai (Brasil e Argentina,América do Sul).

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisados 304 indivíduos de P. reticulatum, provenientes de 15 pontos de

coleta nos rios Tocantins (Bacia do Tocantins/Araguaia), Paraguai, Cuiabá, São Lourenço,
Taquari, Negro, Aquidauana, Miranda (Bacia do Paraguai), Mogi-Guaçu, Paranapanema,
Iguaçu e Paraná (Bacia do Paraná); e 462 exemplares indivíduos da espécie P. corruscans,
provenientes de 18 pontos de coleta distribuídos pelos rios Paraguai, Cuiabá, São Lourenço,
Taquari, Negro (Bacia do Paraguai), Mogi-Guaçu, Verde, Ivinhema, Paranapanema, Iguaçu,
Paraná (Bacia do Paraná) e Uruguai (Bacia do Uruguai) (Tabela 3, Figura 1). Quinze peixes
coletados no rio Mogi-Guaçu foram previamente classificados como possíveis híbridos pois
apresentaram características morfológicas intermediárias entre as espécies (Figura 1).

Figura 1. Pontos de amostragem dos peixes em rios da América do Sul. Os locais estão identificados
por círculos coloridos que representam onde foram amostradas as espécies P. reticulatum (azul), P.
corruscans (vermelho) e híbridos (verde). Os locais de coleta (1 a 21) e a quantidade de indivíduos
coletados estão indicados na Tabela 3. Barra = 300 Km.

35
 Resultados e discussão - Capítulo 1

Extração de DNA e marcadores moleculares

Para a extração do DNA foram utilizados os métodos descritos no kit comercial

Wizard genomic DNA purification kit (Promega). A identificação genética dos animais foi
conduzida utilizando quatro marcadores nucleares (RAG2 - recombination activating gene 2,
EF1 - nuclear elongation factor 1 α, Globina – β globina e ribossômico 18S) e o marcador
mitocondrial 16S (Prado et al., 2011a; Hashimoto et al., 2013a).
Os marcadores foram obtidos utilizando-se as técnicas de PCR-RFLP (Polymerase
chain reaction-Restriction fragment length polymorphism) e PCR-multiplex. No PCR-RFLP,
os fragmentos de cada gene foram amplificados utilizando seus respectivos pares de primers
foward (F) e reverse (R) (Tabela 2). As amplificações possuíram basicamente um volume
total de 25 μl contendo 150 μM de cada dNTP (dATP, dTTP, dGTP e dCTP), MgCl2 1.5 mM,
tampão da Taq 1X(20 mM Tris-HCl, pH 8.4 e 50 mM KCl), 0.5 unidades (U) da enzima Taq
polymerase (Invitrogen), 0.1 μM de cada primer e 10-50 ng de DNA genômico. Foi utilizado
um programa de desnaturação a 95°C por 40s, hibridização de 52°C por 40s, extensão a 72°C
por 20s (35 repetições.) e uma extensão final de 7 minutos. A restrição enzimática ocorreu em
um volume final de 8 μl contendo 5 μl dos produtos de PCR, tampão da Taq 1X e 5 unidades
de cada enzima de restrição (10 U/μl) (New England Biolabs Inc.). O material das reações foi
incubado por 2 horas de acordo com a temperatura ideal de cada enzima (Prado et al., 2011a;
Hashimoto et al., 2013a).
Para as amplificações multiplex foram utilizados, na mesma reação, tanto os primers
foward e reverse (Tabela 1) como os primers espécie-específicos desenvolvidos para as
espécies parentais, de acordo com o gene a ser analisado (Tabela 3).As reações foram
realizadas em uma concentração de aproximadamente 150 μM de cada dNTP, MgCl2 1.5
mM, tampão da Taq 1X, 0.5 unidades de Taq polymerase (Invitrogen), 0.1 a 0.4 μM de cada
primer e 10-50 ng de DNA genômico (total de 25 μl). As amplificações foram realizadas
basicamente sob as condições de desnaturação a 95°C por 40s, hibridização de 50 a 58°C (de
acordo com o gene analisado) por 40s e extensão a 72°C por 10 a 20s, com 35 repetições
(mais detalhes em Prado et al., 2011a e Hashimoto et al., 2013a).As PCRs foram realizadas
em termociclador Mastercycler personal (Eppendorf) e os fragmentos de DNA visualizados
em gel de agarose 1,5% corado com SYBR Safe™ (Applied Biosystems), utilizando DNA
ladder de 1 Kb (Invitrogen).

36
 Resultados e discussão - Capítulo 1

Tabela 1. Sequências dos primers dos genes nucleares e mitocondrial utilizados nas técnicas de PCR-
RFLP e PCR-multiplex.

Primer Sequencia* Referências

16S F ACGCCGTTTATCAAAAACAT Palumbi, 1996
16S R CCGGTCTGAACTCAGATCCGT Palumbi, 1996
16S PcF TGACGATCCTATCCGGCTAT Prado et al., 2011a
16S PrR TACCTGTTATTGGGTTGTA Prado et al., 2011a
RAG2 Silu F CCTGAGTGCTACCTATTCATGGA Prado et al., 2011a
RAG2 Silu R CTTGGGAGGAGAGACCATC Prado et al., 2011a
RAG2 PcR AACTCCACCACTCTGAATAAATG Prado et al., 2011a
RAG2 PrR CAGAASCGGGTCTCTGTGGTT Prado et al., 2011a
EF1α 835 F ATTGGAACTTACCTGTGG Moyer et al., 2004
EF1α 1417 R CAGCCTTCTGTGCAGACTT Moyer et al., 2004
EF1 PcR CAACAATGCACGCATCTCT Hashimoto et al., 2013a
EF1 PrR ATAAAGACCCAGACAAGATCG Hashimoto et al., 2013a
NS1 F GTAGTCATATGCTGTCTC White et al., 1990
18S Silu R CCATCGAAAATTGATAGGG Hashimoto et al., 2013a
Glob Silu F TCAATATGGTTCATGGACAGA Hashimoto et al., 2013a
Glob Silu R CCAGAAGCTGAAAGTAGACAGT Hashimoto et al., 2013a
Glob PcR CAGCCACTTGGGGTTTCCT Hashimoto et al., 2013a
Glob PrF GGTACGTCTATCTCAGTAATTGAAA Hashimoto et al., 2013a
*Sequência na ordem de 5’ para 3’, Silu: Siluriformes, F: Forward, R: Reverse, em negrito os primers utilizados
no PCR-RFLP, sublinhado os primers espécie-específicos adicionados no PCR-multiplex.

Identificação das amostras

Os indivíduos foram inicialmente identificados através dos padrões de banda

diagnósticos de cada marcador molecular (Tabela 2). As espécies parentais foram as que
apresentaram os marcadores monomórficos espécie-específicos para todos os genes
analisados de acordo com a tabela 2. Os híbridos F1 foram os que apresentaram bandas de
ambas as espécies, ou heterozigotas, para todos os marcadores nucleares. Os híbridos com
marcadores nucleares variáveis entre as espécies ou diferenças entre o marcador mitocondrial
e nucleares foram inicialmente categorizados como híbridos avançados, uma vez que podem
representar linhagens de híbridos F2, F3 etc. ou retrocruzamentos. O marcador mitocondrial
permitiu identificar o parental materno P. corruscans ou P. reticulatum, categorizar os
híbridos F1 como cruzamentos entre fêmea de P. reticulatum e macho de P. corruscans (F1
PrPc) ou entre fêmea de P. corruscans e macho de P. reticulatum (F1 PcPr) e a verificar a
direção dos cruzamentos avançados.

37
 Resultados e discussão - Capítulo 1

Tabela 2. Fragmentos diagnósticos dos marcadores nucleares e mitocondrial utilizados na

identificação das espécies P. reticulatum e P. corruscans.

Fragmento diagnóstico
Técnica Gene (pb) Referências
Pr Pc
RAG2 550 300, 250 Prado et al., 2011
Globina 569 186, 381 Hashimoto et al., 2013a
DNAn 240, 270,
PCR-RFLP EF1 240, 560 Hashimoto et al., 2013a
290
18S 350 163, 187 Hashimoto et al., 2013a
DNAmt 16S 300, 350 650 Prado et al, 2011a
RAG2 550, 290 550, 330 Prado et al., 2011a
PCR- DNAn Globina 569, 137 569, 304 Hashimoto et al., 2013a
multiplex EF1 800, 630 800, 520 Hashimoto et al., 2013a
DNAmt 16S 650, 400 650, 200 Prado et al., 2011a
DNAn: DNA nuclear, DNAmt: DNA mitocondrial, Pr: P. reticulatum , Pc: P. corruscans, pb: pares de bases

Também foi utilizado o programa NewHybrids 1.1 (Anderson e Thompson, 2002)

para verificar a probabilidade (Q) de cada indivíduo pertencer a uma das seis classes: parental
1 P. reticulatum (Pr), parental 2 P. corruscans (Pc), primeira geração de híbridos
interespecíficos (F1), segunda geração de híbridos (F2), retrocruzamentos de F1 com o
parental 1 (RPR) ou retrocruzamentos de F1 com o parental 2 (RPC). Os testes foram baseados
em 100.000 varreduras MCMC após um período de burn-in de 100.000. Um intervalo de
confiança de 90% (Q≥0.90) foi utilizado para identificar as linhagens parentais, conforme
sugerido por estudos simulados (Sanz et al., 2009; Aboim et al., 2010), sendo que os
indivíduos com valores de Q entre 0.1 e 0.9 foram classificados como híbridos. Os
exemplares que não foram identificados através destes parâmetros, porém, apresentaram
genótipos recombinantes visualizados pelos genes nucleares e mitocondrial, foram
classificados genericamente como híbridos avançados (HA).

RESULTADOS

Nas populações dos rios Araguaia (bacia Tocantins-Araguaia), Paraguai, Cuiabá, São
Lourenço, Taquari, Negro, Miranda (bacia do Paraguai), Verde, Ivinhema, Paranapanema,
Iguaçu, Paraná (população Pr2) (bacia do Paraná) e Uruguai (bacia do Uruguai) foram
identificados indivíduos das espécies parentais P. reticulatum e/ou P. corruscans, sem
evidências de híbridos ou introgressão genética (Tabela 3). As espécies destas populações
possuíram os marcadores diagnósticos espécie-específicos (Tabela 2) e sua identificação

38
 Resultados e discussão - Capítulo 1

genética correspondeu à identificação morfológica (Tabela 3). O programa NewHybrids

indicou que todos os 458 indivíduos identificados como P. corruscans (Tabela 3)
apresentaram valores de Q=0.999 de pertencerem a esta categoria parental, enquanto os 286
exemplares de P. reticulatum (Tabela 3) possuíram Q=0.990 de serem esta espécie.
Para estas populações, a visualização em géis de agarose dos marcadores nucleares
EF1, RAG2, 18S, e do marcador mitocondrial 16S, permitiu visualizar fragmentos
eletroforéticos diagnósticos para as espécies parentais, sem polimorfismos intraespecíficos. O
marcador do gene da Globina apresentou-se diagnóstico para a maioria das populações das
espécies parentais analisadas. Porém, alguns indivíduos de P. reticulatum (N=30) e P.
corruscans (N=19) apresentaram marcadores não correspondentes entre as técnicas de PCR-
RFLP e PCR-multiplex, podendo ser heterozigotos (bandas de ambas as espécies) ou
homozigotos, e este marcador não foi utilizado nas análises seguintes.
Em três populações foram observados híbridos na natureza: rio Aquidauana (bacia do
Paraguai), rio Paraná (população Pr1) e Mogi-Guaçu (bacia do Paraná) (Tabela 3). As
frequências de híbridos foram altas no rio Aquidauana (50 %) e no rio Mogi-Guaçu (44.19 %)
enquanto no rio Paraná (Pr1) foi observada uma frequência de 3.92 % de híbridos (Tabela 3).
Em relação à identificação morfológica e genética, na população de Pr1, dois indivíduos de P.
corruscans foram identificados como híbridos. No rio Aquidauana todos os híbridos haviam
sido anteriormente categorizados como P. reticulatum. Já no rio Mogi-Guaçu, nas amostras de
P. corruscans foram verificados 2 híbridos, de P. reticulatum 3 híbridos e os 15 exemplares
identificados como possíveis híbridos realmente pertenciam a esta classe (Tabela 3).

39
 Resultados e discussão - Capítulo 1

Tabela 3. Frequência de híbridos nas populações de P. reticulatum e P. corruscans e sua prévia

identificação morfológica.

N
BH Pop. Rio Época de coleta %H
Pc Pr H
Ta Ar (1) Araguaia 2002-2009 - 24 (24) - 0.00
Pa1 (2) Paraguai 1998-2005 30 (30) -- -- 0.00
Pa2 (3) Paraguai 1998-2005 29 (29) 25 (25) -- 0.00
Pa3 (4) Paraguai 2002-2005 18 (18) 11 (11) -- 0.00
Cb1 (5) Cuiabá 2002-2005 -- 08 (08) -- 0.00
Cb2 (6) Cuiabá 1998-2005 36 (36) 28 (28) -- 0.00
Sl (7) São Lourenço 1998-2005 27 (27) 11 (11) -- 0.00
Pa
Cb3 (8) Cuiabá 2002-2010 16 (16) 42 (42) -- 0.00
Ta1 (9) Taquari 1998-2005 29 (29) 16 (16) -- 0.00
Ta2 (10) Taquari 1998-2005 28 (28) -- -- 0.00
Ng (11) Negro 1998-2005 34 (34) 23 (23) -- 0.00
Aq (12) Aquidauana 1998-2005 - 15 (30) 15 (0) 50.00
Mir (13) Miranda 1998-2005 12 (12) 40 (40) -- 0.00
Pr1 (14) Paraná/Jupiá 2009 49 (51) -- 02 (00) 3.92
Ve (15) Verde 2008-2011 43 (43) - - 0.00
Mogi (16) Mogi-Guaçu 2008-2011 12 (14) 12 (14) 19 (15) 44.19
Pr Ivi (17) Ivinhema 2004 19 (19) - - 0.00
Pp (18) Paranapanema 2003 30 (30) 4 (4) - 0.00
Ig (19) Iguaçu 1998-2005 5 (5) 14 (14) - 0.00
Pr2 (20) Paraná 2011 35 (35) 14 (14) - 0.00
Ur Ur (21) Uruguai 2003 6 (6) - - 0.00
Total 458 (462) 286 (304) 36 (15) -
BH: Bacias hidrográficas (Ta: Tocantins/Araguaia, Pa: Paraguai, Pr: Paraná, Ur: Uruguai), Pop: população (os
números em parênteses indicam as respectivas localidades na Figura 1), N: número amostral, Pc: P. corruscans,
Pr: P. reticulatum, H: híbridos. Entre parênteses está indicada a prévia identificação morfológica dos
exemplares.

A classificação dos híbridos através do programa NewHybrids indicou Q=0.696 de

chance dos híbridos F1 pertencerem a esta classe híbrida. Em genótipos com maior mistura,
alguns exemplares foram classificados como RPR (retrocruzamentos entre F1e P. reticulatum),
apresentando Q entre 0.506 e 0.954 (Tabela 4). Dez híbridos foram classificados como
espécies parentais (indivíduos 4, 6, 8, 10, 11, 14 - Aq; 1, 2, 16, 19 - Mogi), porém, com
Q≤0.871 de serem puros, os quais foram posteriormente categorizados como híbridos
avançados por não ser possível sua distinção entre as classes híbridas. Um exemplar (1-Mogi),
apesar de possuir todos os marcadores nucleares de P. corruscans (Q=0.999), apresentou o

40
 Resultados e discussão - Capítulo 1

marcador mitocondrial de P. reticulatum o que indica que é um híbrido avançado (Tabela 4).
Outro indivíduo (19-Mogi) possuiu metade de chance de ser um híbrido F2 e metade de ser
um RPR, também classificado genericamente como híbrido avançado (Tabela 4).
Desta forma, foi possível verificar um total de 13 híbridos avançados na população de
Aq, dos quais sete possivelmente resultam de retrocruzamentos entre F1 e P. reticulatum
(RPR). Também foram observados dois híbridos F1 nesta localidade. Na população de Pr1
foram observados dois híbridos F1 (Tabela 4). O marcador mitocondrial demonstrou que
todos estes peixes possuíram herança materna de P. reticulatum (Tabela 4). No rio Mogi-
Guaçu foram encontrados sete híbridos F1 e 12 híbridos avançados, dos quais oito foram do
tipo RPR. Entre os F1, cinco possuíram o marcador mitocondrial de P. reticulatum e dois de P.
corruscans(Tabela 4). Os híbridos RPR possuíram o DNA mitocondrial de P. reticulatum e as
outras linhagens avançadas demonstraram este marcador de ambas as espécies (Tabela 4).

41
 Resultados e discussão - Capítulo 1

Tabela 4. Identificação dos indivíduos híbridos de acordo com seu genótipo nuclear e mitocondrial e
suaprobabilidade de classificação.
RAG2 EF1 18S DNAmt
Pop. Fen. NewHybrids (Q) Classe
Pc Pr Pc Pr Pc Pr Pc Pr
1 (Pr) - x - x x x 0.506 (RPR) - x HA(RPR)
2(Pr) - x - x x x 0.506(RPR) - x HA(RPR)
3 (Pr) x x - x x x 0.932 (RPR) - x HA(RPR)
4 (Pr) x x - x - x 0.643 (Pr) - x HA
5 (Pr) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1 (PrPc)
6 (Pr) x x - x - x 0.643 (Pr) - x HA
7 (Pr) - x x x - x 0.670 (RPR) - x HA(RPR)
Aq 8 (Pr) x x - x - x 0.643 (Pr) - x HA
9 (Pr) - x - x x x 0.670 (RPR) - x HA(RPR)
10 (Pr) x x - x - x 0.643 (Pr) - x HA
11 (Pr) x x - x - x 0.643 (Pr) - x HA
12 (Pr) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1 (PrPc)
13 (Pr) x x - x x x 0.932 (RPR) - x HA(RPR)
14 (Pr) x x - x - x 0.643 (Pr) - x HA
15 (Pr) x x - x x x 0.932 (RPR) - x HA(RPR)
1(Pc) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1 (PrPc)
Pr1
2(Pc) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1 (PrPc)
1 (Pc) x - x - x - 0.999 (Pc) - x HA
2 (Pc) x - x x x - 0.871 (Pc) x - HA
3 (Pr) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1 (PrPc)
4 (Pr) x x x x x x 0.696 (F1) x - F1 (PcPr)
5 (Pr) x x x x x x 0.696 (F1) x - F1 (PcPr)
6 (H) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1 (PrPc)
7 (H) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1 (PrPc)
8 (H) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1 (PrPc)
9 (H) x x x x x x 0.696 (F1) - x F1
Mogi 10 (H) x x x x - x 0.941 (RPR) - x HA(RPR)
11 (H) x x x x - x 0.941 (RPR) - x HA(RPR)
12 (H) x x - x x x 0.932 (RPR) - x HA(RPR)
13 (H) x x - x x x 0.932 (RPR) - x HA(RPR)
14 (H) - x - x x x 0.506 (RPR) - x HA(RPR)
15 (H) - x - x x x 0.506 (RPR) - x HA(RPR)
16 (H) x x - x - x 0.643 (Pr) - x HA
17 (H) - x x x - x 0.670 (RPR) - x HA(RPR)
18 (H) - x x x - x 0.670 (RPR) - x HA(RPR)
19 (H) - x x x x - 0.500 (RPR), 0.500 (F2) x - HA
Pop: população, Fen.: fenótipo, DNAmt: DNA mitocondrial, Pc – P. corruscans, Pr – P. reticulatum, H: híbrido,
PrPc: cruzamento entre fêmea de P. reticulatum e macho de P. corruscans, PcPr: cruzamento entre fêmea de P.
corruscans e macho de P. reticulatum, HA: híbrido avançado, RPR: retrocruzamento de F1 com P. reticulatum.

42
 Resultados e discussão - Capítulo 1

DISCUSSÃO

Marcadores genético moleculares

Os marcadores genético moleculares dos genes nucleares e mitocondriais utilizados

neste estudo demonstraram um padrão molecular único entre P. corruscans e P. reticulatum,
sem a ocorrência de variações intraespecíficas para os marcadores RAG2, EF1, 18S e 16S.
Apesar das metodologias de PCR-multiplex e PCR-RFLP utilizadas terem base em
polimorfismos de poucos nucleotídeos, estes marcadores consistem em fragmentos de genes
com diferenças fixas em sua composição nucleotídica entre P. reticulatum e P. corruscans
(Prado et al., 2011a; Hashimoto et al., 2013a). Os resultados obtidos para as populações
analisadas neste estudo comprovam o conservadorismo e especificidade destas regiões
gênicas, mesmo em amostras provenientes de localidades distantes geograficamente, como
entre os rios Araguaia, rios da Bacia do Paraguai,Paraná e Uruguai, confirmando a eficiência
destes genes na identificação destas espécies e seus híbridos (Prado et al., 2011a; Prado et al.,
2012a;Hashimoto et al., 2013a). O marcador do gene Globina, apesar de ser diagnóstico e útil
na identificação da maioria dos indivíduos, apresentou polimorfismos que possivelmente
estão relacionados com a amplificação de outras regiões gênicas, uma vez que a Globina faz
parte de uma família multigênica (Tomoko, 1983; Goodman et al., 1988). Apesar disto, este
marcador pode ser útil para auxiliar em outros estudos que envolvam a diferenciação entre
estas espécies.
Híbridos interespecíficos diplóides em peixes comumente podem ser identificados por
possuírem fragmentos eletroforéticos heterozigotos de ambas espécies parentais, com
ocorrência de uma herança mendeliana clássica (Ostberg et al., 2004; Hashimoto et al., 2011a;
Porto-Foresti et al., 2013; Cunha et al., 2013), o que foi confirmado neste estudo. Em relação
aos híbridos avançados, após a primeira geração híbrida, é difícil discriminar quando um
indivíduo é um híbrido recente (F1) ou um membro de uma das duas populações parentais
submetidos à introgressão avançada (Rhymer e Simberloff, 1996; Allendorf et al., 2001). Isso
se deve ao alto número de combinações genéticas resultantes do intercruzamento de híbridos
F1 entre si ou o retrocruzamento destes híbridos com as espécies parentais, resultando, por
exemplo, em animais com genótipos homozigotos como seus parentais ou heterozigotos como
um híbrido F1 (Toledo-Filho et al., 1994; Scribner et al., 2001).

43
 Resultados e discussão - Capítulo 1

A utilização de um marcador nuclear diagnóstico para verificar hibridação em

populações selvagens pode ser eficaz quando a hibridação começou apenas recentemente e a
taxa de introgressão é baixa (Vähä e Primmer, 2006). Testes utilizando diferentes números de
marcadores nucleares demonstraram que a sua eficácia em distinguir os taxa está diretamente
relacionada com a diferenciação dos loci entre as espécies parentais (Roques et al., 1999;Vähä
e Primmer, 2006; Sanz et al., 2009; Bohling et al., 2013), ou seja, quando os marcadores são
variáveis dentro da espécie, e possuem pouca diferenciação interespecífica, um maior número
de marcadores é requerido nas análises (Vähä e Primmer, 2006). Em casos de marcadores
altamente diagnósticos, como os genes utilizados no presente trabalho, três genes nucleares
demonstraram ser eficazes para detectar mesmo a hibridação introgressiva, como verificado
em outros estudos que utilizaram de dois a quatro marcadores nucleares (Rubidge et al., 2001;
Rubidge e Taylor, 2004; Lammer et al., 2010; Devitt et al., 2011).
Análises bayesianas, como as utilizadas no programa NewHybrids, que indiquem a
probabilidade dos indivíduos pertencerem a determinada categoria, são importantes para
distinguir os híbridos entre suas classes F1 ou avançadas e determinar com maior precisão a
introgressão genética nas populações (Anderson e Thompson, 2002). No entanto, como
observado por estes autores, a correspondência entre a classe de frequência do genótipo e a
classe genealógica (parentais, F1, F2 ou retrocruzamentos) aplica-se apenas às duas primeiros
gerações de cruzamentos, enquanto gerações mais avançadas tornam-se indistinguíveis ou
com menor probabilidade de identificação. Apesar de suas limitações, este método é um dos
mais eficazes para a detecção de híbridos e introgressão (Sanz et al. 2009). Aboim et al.
(2010) demonstraram uma menor probabilidade de classificação de alguns híbridos avançados
através do programa NewHybrids, devido à sua alta heterogeneidade alélica, com valores de
Q menores que 0.533, por exemplo, indicando mistura genética. Já Devitt et al. (2011)
utilizaram um parâmetro de Q entre 0.1 a 0.9 para identificar que os indivíduos eram híbridos,
independente de sua classificação posterior. Loci nucleares adicionais possivelmente
permitiriam maior acuracidade na porcentagem de classificação dos híbridos analisados neste
trabalho, entretanto, os três marcadores utilizados foram suficientes para documentar a
existência de híbridos e introgressão na natureza, incluindo a presença de genótipos
recombinantes que somente podem ter surgido através de cruzamentos avançados.
O DNAmitocondrial, apesar de não ser um marcador diagnóstico para detectar
hibridação, pode ser uma ferramenta eficaz para auxiliar na identificação de espécies, híbridos
recíprocos e na direção de eventos de hibridação em ambientes selvagens (Gunnel et al.,

44
 Resultados e discussão - Capítulo 1

2008; Metcalf et al., 2008; Broughton et al., 2011). Neste trabalho o DNA mitocondrial
permitiu discriminar os híbridos recíprocos F1 através da observação do seu parental materno
(P. reticulatum ou P. corruscans) e também indicou que os retrocruzamentos na natureza
envolvem a espécie P. reticulatum. Também foi interessante verificar que esta região
genômica possibilitou identificar um híbrido avançado, que apresentou todos os marcadores
nucleares de P. corruscans e o marcador mitocondrial de P. reticulatum. Este genótipo
provavelmente resulta de retrocruzamentos entre o híbrido PrPc com P. corruscans, seguido
de retrocruzamentos sucessivos com a espécie parental P. corruscans. Fato similar foi
observado por Bettles et al. (2005) estudando hibridação em trutas, onde observou indivíduos
homozigotos para uma espécie em sete marcadores nucleares mas apresentando o DNA
mitocondrial da espécie oposta. Este indivíduo foi classificado pelos autores como um híbrido
"antigo", resultante de alta introgressão entre as espécies.

Ocorrência de híbridos e introgressão genética na natureza

Neste trabalho, os resultados da identificação genética das populações de P.

reticulatum e P. corruscans indicam que não ocorreram híbridos na maioria das localidades,
mesmo em locais onde as espécies ocorrem em simpatria, como em alguns rios rios da bacia
do Paraguai e Paraná (Lundberg e Littman, 2003; Buitrago-Suárez e Burr, 2007). Estudos
relatam algumas diferenças de crescimento e tamanho do corpo durante os estágios de
maturação sexual entre P. corruscans e P. reticulatum (Resende et al., 1996). Além disso,
apesar destas espécies migrarem durante o mesmo período, podem ocorrer diferenças na
duração total do período reprodutivo (Resende et al., 1996; Godinho, 2007). Mesmo em locais
onde estas espécies ocorrem em simpatria, estes mecanismos podem dificultar a formação de
zonas híbridas naturais. Não obstante, a presença das mesmas diferenças genéticas fixas entre
estas espécies em regiões de simpatria, assim como em outras localidades de sua distribuição,
indicam que qualquer introgressão natural tem sido rara.
Por outro lado, os dados aqui obtidos confirmam a ocorrência de híbridos destas
espécies nos rios Paraná (população Pr1), Aquidauana e Mogi-Guaçu, que correspondem às
mesmas localidades onde foram observados híbridos anteriormente (Prado et al., 2012a). O
presente estudo, além de ter analisado uma maior quantidade de indivíduos e rios de
ocorrência das espécies, também demonstrou uma alta introgressão genética nas populações
de Aquidauana e Mogi-Guaçu, o que ainda não havia sido descrito para populações naturais

45
 Resultados e discussão - Capítulo 1

de P. corruscans e P. reticulatum. Nestes locais, aproximadamente metade dos indivíduos

coletados corresponderam a híbridos, em sua maior parte retrocruzamentos, demonstrando
que nestas populações existem indivíduos resultantes de uma mistura genética entre as
espécies.
Escapes de peixes de cultivo tem sido relatados em todo o mundo, responsável pela
introdução de espécies exóticas que hibridam com espécies nativas, em muitos casos levando
à introgressão genética (Scribner et al., 2001), como observado principalmente em espécies de
interesse comercial como salmão e truta (Allendorf e Leary, 1988; Allendorf et al., 2004;
Glover et al., 2012; Zhang et al., 2013). A hipótese mais aceita para a presença de híbridos em
populações de P. corruscans e P. reticulatum são escapes e introduções dos próprios híbridos
produzidos em cultivo (Bignotto et al., 2009; Porto-Foresti et al., 2010; Prado et al., 2012a).
Como estes animais tem sido extensivamente produzidos em pisciculturas nacionais e os
produtores tem dificuldades em identificar visualmente os exemplares (Hashimoto et al.,
2013), possivelmente estes peixes estejam escapando ou sendo acidentalmente introduzidos
na natureza. Isto é evidente em locais com frequências muito altas de híbridos (rios Mogi-
Guaçu e Aquidauana), onde existem diversas pisciculturas produtoras de alevinos (Suplicy,
2007).
O escape de peixes para o ecossistema aquático é um fato alarmante observado na
maioria das pisciculturas brasileiras (cerca de 95% de acordo com Castellani e Barrela, 2005)
principalmente devido ao alagamento dos tanques de criação e a introdução acidental de
peixes em rios (Orsi e Agostinho, 1999; Fernandes et al., 2003; Castellani e Barrella, 2005).
Mesmo os projetos de reintrodução de espécies nativas, caso não sejam acompanhados por
uma identificação genética e um manejo efetivo dos produtos, podem ser responsáveis pela
liberação de peixes no ambiente selvagem.
As espécies P. corruscans e P. reticulatum são peixes de grande porte (Resende et al.,
1996; Mateus e Penha, 2007) e seus híbridos produzidos em cultivo também atingem mais de
um metro de comprimento (José A. Senhorini, comunicação pessoal). Como os escapes e
introduções de peixes podem ser mais frequentes para alevinos ou juvenis, por serem
pequenos e de difícil controle (Fernandes et al., 2003), os híbridos adultos identificados neste
estudo e coletados na natureza são uma evidência de que estes animais aparentemente tem um
desenvolvimento normal, são viáveis e estão permanecendo nos rios.
Uma vez que tenham sido detectados híbridos na natureza, a introgressão genética
observada neste estudo pode ter duas origens. A primeira seria o escape ou introduções de

46
 Resultados e discussão - Capítulo 1

híbridos F1 que posteriormente estariam se reproduzindo com as espécies parentais, gerando

os híbridos avançados e retrocruzamentos nos rios. Outra fonte de introgressão genética pode
ser o cultivo, e os híbridos avançados produzidos em pisciculturas nacionais (Hashimoto et
al., 2013a) também podem estar entrando em contato com os rios.
Analisando-se individualmente as localidades com híbridos observadas neste estudo
foi possível verificar que os híbridos no rio Paraná foram do tipo F1 e ocorreram em baixa
quantidade. Como este ponto de coleta se localizou à jusante da represa de Jupiá, peixes de
diversas regiões próximas da bacia do Alto Paraná, incluindo os híbridos, podem ter migrado
para esta região do rio. Já em Aquidauana, como a maior parte da população foi composta por
retrocruzamentos com P. reticulatum e uma baixa quantidade de F1, é possível que tenha
ocorrido um contato de híbridos com esta população a algumas gerações passadas,
ocasionando a introgressão de genes.
O rio Mogi-Guaçu é um importante exemplo de alterações ambientais relacionadas
com a alteração antrópica dos sistemas aquáticos. P. corruscans foi introduzido neste rio e
desde então foi relatada como a única espécie do gênero a ocorrer na ictiofauna local
(Meschiatti e Arcifa, 2007). Contudo, os dados do presente trabalho indicam a ocorrência de
P. reticulatum no rio a partir de 2008, que possivelmente foi introduzida. Além disso, a
extensa quantidade de ambos os híbridos recíprocos F1 e retrocruzamentos demonstra que
provavelmente ocorre uma constante contaminação deste rio por escapes ou introduções de
pisciculturas, levando à hibridação generalizada na natureza. O rio Mogi-Guaçu é atualmente
um ambiente "fechado" para os grandes migradores, limitado pelo reservatório da PCH
(pequena central hidrelétrica) de Emas até o rio Grande, onde existem as barragens de
Marimbondo e Volta Grande que impedem a movimentação dos peixes migradores para
outros rios (José A. Senhorini, comunicação pessoal). P. corruscans permanece durante seis a
oito meses no rio Grande, e migra para o rio Mogi-Guaçu para se reproduzir (José A.
Senhorini, comunicação pessoal). As espécies e híbridos ali introduzidos representam grande
impacto, pelos riscos ecológicos e genéticos que os híbridos representam (Toledo-Filho et al.,
1004; 1998; Allendorf et al., 2010). Este ambiente, apesar de não ser de ocorrência natural
destas espécies, pode ser um interessante modelo ambiental e evolutivo para ser utilizado para
futuros estudos sobre as consequências da ocorrência destes híbridos na natureza, tais como o
futuro estabelecimento ou não das linhagens híbridas, a extensão da introgressão e a possível
extinção genética de P. corruscans nesta localidade.

47
 Resultados e discussão - Capítulo 1

Implicações para a conservação

As espécies P. corruscans e P. reticulatum apresentam alta divergência genética e,

apesar das controvérsias que envolvam os conceitos de espécie, encontram-se diferenciadas
geneticamente a aproximadamente 11.8 a 10 milhões de anos atrás, quando P. corruscans se
separou do grupo que posteriormente daria origem a P. reticulatum (Torrico et al., 2009). Em
casos de introgressão genética, como o verificado neste trabalho, a extinção de alelos únicos
das espécies parentais e a possível perda de adaptações de populações locais estabelecidas
durante sua história evolutiva pode ser irreversível (Allendorf et al., 2010).
Pode ocorrer a “diluição” dos genomas parentais e a decorrente extinção genética, ou
seja, as espécies geneticamente distintas deixam de existir e dão lugar a uma população
composta apenas por híbridos (Huxel, 1999; Epifanio e Philipp, 2001; Muhlfeld et al., 2009;
Allendorf et al., 2010). Estas populações hibridizadas podem se fundir em uma única unidade,
reduzindo a diversidade taxonômica (uma espécie ao invés de duas); ou em caso de
isolamento de uma população híbrida pode ser produzido um taxon inteiramente novo,
aumentando a diversidade taxômica (duas espécies parentais e a espécie " híbrida"). Por outro
lado, em populações com hibridação introgressiva pode ocorrer depressão exogâmica, ou seja,
a redução da aptidão de híbridos F1 ou F2, que resulta de incompatibilidades genéticas ou
baixa adaptação às condições ambientais locais (Allendorf et al., 2010). Desta forma, mesmo
se ocorrer a formação de uma população composta por híbridos, a questão é se estes irão se
adaptar ou todo o pool gênico das espécies hibridizadas será perdido.
Como ações de gestão, alguns pesquisadores indicam a retirada dos híbridos do
ambiente na tentativa de minimizar os danos genéticos para as espécies nativas e impedir a
introgressão generalizada (Allendorf et al., 2001; 2010). De acordo com os autores, esta
medida é válida em locais onde a introgressão não é alta, como no rio Paraná analisado neste
trabalho. Em locais onde a população é constituída por mistura genética, como rio
Aquidauana e Mogi-Guaçu, além de ser muito difícil identificar quais são as espécies
parentais após uma introgressão avançada, seria necessário avaliar se população é passível de
proteção, uma vez que possuiu alelos únicos destas populações locais (Allendorf et al., 2001;
2010). Um importante fator para este tipo de medida é considerar quantas populações não
hibridizadas da espécie ainda restam, ou seja, quanto menos populações puras, maior o valor
da conservação de qualquer população hibridizada (Allendorf et al., 2004). Os híbridos podem

48
 Resultados e discussão - Capítulo 1

representar um conjunto genético distinto a ser conservado, além da possibilidade de

preencher o papel ecológico da espécie parental (Allendorf et al., 2004).
No caso de Salmonídeos, a introgressão generalizada entre espécies nativas e não
nativas tem criado populações híbridas em extensas áreas geográficas extensas, resultando em
extinção genômica (Muhlfeld et al., 2010). Estes autores indicam que mesmo pequenas
quantidades de hibridização reduzem acentuadamente a aptidão de trutas machos e fêmeas, e
o sucesso reprodutivo declinou em cerca de 50 %, com apenas 20 % de mistura genética,
sugerindo que os estudos que sugerem conservar populações hibridizadas devem ser revistos.
Outro ponto importante a ser considerado nas ações de conservação de P. corruscans e
P. reticulatum é a migração que realizam durante seu período reprodutivo (Carolsfeld et al.,
2003; Resende, 2003; Godinho et al., 2007). Apesar de ser difícil prever o comportamento
biológico dos híbridos, caso realizem migrações sazonais, estes animais podem se deslocar
para outros rios e se reproduzir, ocasionando uma maior disseminação da introgressão
genética entre as espécies.
Políticas que normatizem, regularizem e fiscalizem a produção de híbridos em
pisciculturas do Brasil possivelmente são a melhor opção para a conservação destas espécies,
a fim de evitar novos escapes e introduções de espécies na natureza. Porém, as leis devem ser
flexíveis, levando em consideração aspectos ambientais e sociais, uma vez que existem
diferentes cenários e situações. Com o intuito de alertar os produtores de peixes a respeito dos
riscos ambientais e os problemas comerciais (mortalidade, problemas de desenvolvimento e
heterogeneidade morfológica) que podem ocorrer pela produção acidental de híbridos F2 ou
retrocruzamentos (Toledo-Filho et al., 1994; 1998; Porto-Foresti et al., 2010), alguns
trabalhos de divulgação científica (Hashimoto et al., 2011b; Porto-Foresti et al., 2011; Prado
et al., 2011b) foram publicados no Brasil.
Uma contínua análise genética também é essencial para verificar a amplitude da
introgressão genética nas populações naturais (Toledo-Filho et al., 1994; 1998; Allendorf et
al., 2001; 2004; 2010). Os dados do presente estudo podem ser úteis para futuros
monitoramentos temporais da hibridação nos rios de ocorrência das espécies P. corruscans e
P. reticulatum. Estudos ecológicos e sobre a viabilidade de suas gerações híbridas, assim
como seus níveis de fertilidade e migração também consistem etapas essenciais a serem
adicionadas às análises genéticas. Como estas espécies estão distribuídas por diversos rios e
bacias hidrográficas, provavelmente ainda possam ser realizadas medidas de manejo dos
híbridos da natureza.

49
 Resultados e discussão - Capítulo 2

CAPÍTULO 2

Diversidade e estruturação genética em populações dos peixes migradores Neotropicais

Pseudoplatystoma reticulatum e P. corruscans em rios das bacias do Paraguai e Paraná.

RESUMO

O conhecimento de como a variação genética é dividida dentro e entre as populações pode ter
implicações importantes na biologia evolutiva e conservação das espécies. Estimativas
confiáveis de diferenciação população são cruciais para entender a conectividade entre as
populações e representam ferramentas importantes para o desenvolvimento de estratégias de
conservação. Neste trabalho foi analisada a diversidade genética intra e interpopulacional dos
bagres Pseudoplatystoma reticulatume Pseudoplatystoma corruscans provenientes de rios
distribuídos pelas bacias do Paraguai, Alto e Baixo Paraná (Bacia Platina, América do Sul)
utilizando microssatélites. Os resultados evidenciaram uma alta diversidade em todas as
localidades estudadas para ambas as espécies. Foi verificada ausência de diferenciação e alta
similaridade genética entre rios da bacia do Paraguai nas amostras de P. reticulatum e P.
corruscans, indicando a possível existência de uma população panmítica e homogeinização
genética resultante da migração e reprodução entre rios próximos. Em P. reticulatum, uma
diferenciação baixa a moderada, porém significativa, foi verificada entre rios mais distantes
geograficamente como Cuiabá e Miranda, e entre a bacia do Paraguai e Baixo Paraná. Em P.
corruscans as análises de estruturação genética revelaram dois grupos distintos, compostos
pelos rios Cuiabá (Bacia do Paraguai) e Verde+Paranapanema (Bacia do Alto Paraná). Não
foi observada diferenciação entre os rios da bacia do Paraguai e Baixo Paraná. Porém, uma
diferenciação moderada foi encontrada entre os rios do Paraguai+Baixo Paraná e os rios do
Alto Paraná, o que pode ser devido à distância geográfica e o isolamento entre estes locais
pela usina de Itaipú. Os diferentes cenários de diferenciação populacional entre estas espécies
podem estar relacionados à distintos comportamentos migratórios. Este trabalho disponibiliza
informações sobre a diversidade e estruturação genética destes peixes, que contribuem para o
conhecimento genético de suas populações naturais e podem ser úteis em futuras ações de
conservação e manejo. Além disso, estes dados genéticos podem complementar análises
ecológicas sobre a migração destas espécies.

50
 Resultados e discussão - Capítulo 2

INTRODUÇÃO

A presença de variação genética é essencial para o potencial de sobrevivência das

espécies e para a evolução com sucesso em resposta a mudanças ambientais (Laikre et al.,
1999). Porém, tem sido crescente o número de espécies que se encontram ameaçadas pela
diminuição da variação genética de suas populações, decorrente principalmente da sobre-
explotação de recursos naturais, poluição e introdução de espécies não nativas (Frankham e
Briscoe, 2002). Os fragmentos de populações de baixa abundância podem tornar-se cada vez
mais vulneráveis a características correlacionadas com o risco de extinção, incluindo a perda
de variação genética através de deriva genética, o acúmulo de mutações ligeiramente
deletérias, depressão por endogamia, e a incapacidade de se adaptar às mudanças (Laikreet al.,
1999; Frankham e Briscoe, 2002; Templeton, 2011).
Uma população é definida como um conjunto de indivíduos intercruzantes da mesma
espécie, que vive em proximidade de forma a manter o sistema de acasalamento em comum
(Templeton, 2011). Associada com cada população local está uma população correspondente
de genes locais chamada de pool gênico, o conjunto de genes coletivamente compartilhados
pelos indivíduos de uma população (Templeton, 2011). Conservar espécies, portanto, não é o
suficiente; o seu potencial evolutivo, representado pela variabilidade genética intra e
interpopulacional também precisa ser conservado (Frankham e Briscoe, 2002; Frankham et
al., 2008). A verificação da estruturação genética de populações naturais possibilita esclarecer
que forma a variabilidade genética está distribuída ao longo da ocorrência geográfica da
espécie, verificar o que é necessário conservar, como deve ser feito um manejo correto das
populações que estejam ameaçadas e como monitorar a diversidade biológica (Laikre et al.,
1999).
Os peixes Pseudoplatystoma corruscans (surubim “pintado”) e Pseudoplatystoma
reticulatum (surubim “cachara”) são bagres pertencentes à família Pimelodidae, na qual está
incluída grande parte dos Siluriformes da região Neotropical, com mais de noventa espécies
descritas (Lundberg e Littmann, 2003; Ferraris et al., 2007; Buitrago-Suárez e Burr, 2007).
Representam um importante papel ecológico por serem grandes predadores e desta forma,
exercerem forte pressão sobre os níveis inferiores da cadeia trófica aquática (Resende et al.,
1996). Sua distribuição é endêmica do continente Sul Americano, com ampla ocorrência em
rios de importantes bacias hidrográficas. Ocorrem em simpatria na bacia do Prata, que inclui
as bacias dos rios Paraguai, Paraná e Uruguai (Brasil, Argentina, Paraguai e Uruguai)

51
 Resultados e discussão - Capítulo 2

(Lundberg e Littman, 2003; Buitrago-Suárez e Burr, 2007). Em outras localidades ocorre

apenas uma das espécies, como P. corruscans na bacia do rio São Francisco e P. reticulatum
na bacia Amazônica (Lundberg e Littman, 2003; Buitrago-Suárez e Burr, 2007).
Estas espécies apresentam hábitos migratórios e realizam movimentos laterais
complexos entre rios, lagos e várzeas de rios, assim como movimentos longitudinais ao longo
dos canais fluviais (Carolsfeld et al., 2003; Godinho et al., 2007). As migrações para
reprodução são anuais, com início no período chuvoso onde nadam para as cabeceiras dos rios
para se reproduzir, usualmente durante os meses de outubro a janeiro (Resende, 2003;
Godinho et al., 2007). Assim como outros bagres, realizam dois fluxos migratórios principais
durante o ano: inicialmente permanecem nos leitos dos rios durante janeiro a setembro (época
de alimentação), em outubro iniciam a migração rio acima (época de reprodução) e
posteriormente os adultos migram rio abaixo para se alimentar no rio principal, enquanto os
juvenis permanecem por algum tempo nos lagos (Resende, 2003; Godinho et al., 2007).
Também foi evidenciado que possivelmente esta espécie apresente o comportamento de
“homing”, ou seja, retorne sempre ao seu local de nascimento para se reproduzir (Pereira et
al., 2009). Contudo, ainda há pouco conhecimento sobre o comportamento migratório destas
espécies, como as distâncias que percorrem e os movimentos da história de vida e de desova
de adultos, especialmente para P. reticulatum.
Além de sua importância biológica, estes bagres estão entre as principais espécies
nativas produzidas no Brasil (Crepaldi et al., 2006; Campos, 2010; Ministério da Pesca e
Aquicultura, 2010). Entretanto, a pesca excessiva, a poluição dos ambientes aquáticos e as
construções de barragens que dificultam ou impedem sua migração representam um fator
crucial na diminuição de suas populações selvagens (Carolsfeld et al., 2003; Bignotto et al.,
2009; Mello et al., 2009). P. corruscans foi recentemente incluído na lista de espécies
criticamente em perigo (Mello et al., 2009).
A genética é uma importante ferramenta para o estudo da biodiversidade e para o
manejo e conservação de populações selvagens que sofrem impactos antrópicos (Hansen et
al., 2001; Schwartz et al., 2007; Allendorf et al., 2010; Zhang et al., 2013). Marcadores
altamente polimórficos, como os microssatélites, são regiões abundantes no genoma nuclear
que se caracterizam por terem motivos de sequência curta (2 a 6 pares de bases) que se
repetem em tandem diversas vezes (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Estas regiões do DNA
seguem modelos evolutivos simples (marcadores neutros), são facilmente genotipados através
de PCR (polymerase chain reaction), têm sido amplamente desenvolvidos para diferentes

52
 Resultados e discussão - Capítulo 2

espécies e utilizados para acessar a diversidade genética e detectar estruturação populacional

(Oliveira et al., 2009; Ciofi et al., 2011; Vera et al., 2011; Vargas-Ramirez et al., 2012;
Storfer et al., 2013). Assim, este trabalho buscou utilizar microssatélites para avaliar a
diversidade genética intrapopulacional e estruturação genética entre populações das espécies
P. reticulatum e P. corruscans em diversas localidades da bacia do Prata, América do Sul.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram obtidas amostras de nadadeiras de populações provenientes de rios das bacias

do Paraguai e Paraná (bacia Platina, América do Sul). As amostras de Pseudoplatystoma
reticulatum totalizaram 119 indivíduos adultos provenientes de seis populações: rios
Paraguai, Cuiabá, Taquari, Negro, Miranda (Bacia do Paraguai) e Paraná (Bacia do Baixo
Paraná). As amostras de P. corruscans compuseram um total de 202 exemplares adultos
provenientes de sete populações: rios Paraguai, Cuiabá, Taquari, Negro, (Bacia do Paraguai),
Verde, Paranapanema (Bacia do Alto Paraná) e Paraná (Bacia do Baixo Paraná) (Tabela 1,
Figura 1).

Tabela 1. Locais de coleta, época de coleta e número de amostras de P. corruscans, P. reticulatum.

Época de coleta N
BH Rio Pop
Ano Mês Pc Pr
Cuiabá Cb 1998-2005 Outubro a janeiro (R) 33 27
Paraguai Pa 1998-2005 (N) 24 22
Pa Taquari Ta 1998-2005 Outubro a janeiro (R) 22 12
Negro Ng 1998-2005 Outubro a janeiro (R) 32 20
Miranda Mir 1998-2005 (N) - 28
Verde Ve 2008-2011 Outubro a novembro (R) 30 -
APr
Paranapanema Pp 2003 Outubro a janeiro (R) 30 -
BPr Paraná Pr 2011 Setembro a outubro (A/R) 31 10
Total 202 119
BH: Bacia hidrográfica, Pa: Paraguai; APr: Alto Paraná, BPr: Baixo Paraná, Pop: população, N: número
amostral, Pc: P. corruscans, Pr: P. reticulatum; R: época de reprodução, A: época de alimentação, N: dados não
disponíveis.

53
 Resultados e discussão - Capítulo 2

Figura 1. Locais de coleta identificados por círculos coloridos que representam onde foram
amostradas as espécies P. reticulatum (azul) e P. corruscans (vermelho). Os rios correspondentes às
siglas e a quantidade de indivíduos estão indicados na Tabela 1.Barra = 300 Km.

A extração e purificação do DNA genômico total foi realizada de acordo com o

protocolo descrito no kit comercial Wizard genomic DNA purification kit (Promega). Todos
os exemplares foram genotipados utilizando dez loci microssatélites previamente
desenvolvidos para P. reticulatum e testados em P. corruscans (Prado et al., in press).
As amplificações foram realizadas através de dois PCR-multiplex, utilizando grupos
de 5 primers por PCR, sendo os primers foward marcados com fluorescência. No multiplex1
foram adicionados os primers foward Prt3NED, Prt116-FAM, Prt12Pet, Prt25Pet e Prt346-FAM; e
multiplex 2: primers foward Prt5Pet, Prt27VIC, Prt306-FAM, Prt36NED e Prt396-FAM) (NED -
amarelo, VIC - verde, Pet - vermelho ou 6-FAM - azul) (Applied Biosystems). As reações
tiveram um volume final de 10 μl contendo 5 μl de Mix para PCR (Quiagen Master mix - 100
μM de cada dNTP, MgCl2 1.5 mM, tampão da Taq 1X, 0.5 unidades de Taq polymerase), 0.4
μM de cada primer e 30 ng de DNA genômico. O programa consistiu em 15 min a 95ºC,
seguidos por 30 ciclos de 30 s a 94ºC, 1 min a 58ºC e 1 min a 72ºC, com uma extensão final
de 60 ºC por 30 min em um termociclador VeritiTM (Applied Byosystems).
Os produtos de PCR foram confirmados em gel de agarose a 1% agarose utilizando o
DNA ladder de 100 pares de bases (pb) DNA ladder (Invitrogen) corado com SYBR Safe ™
(Applied Biosystems) e posteriormente aplicados em analisador genético automático ABI

54
 Resultados e discussão - Capítulo 2

PRISM_3730 (Applied Biosystems). O tamanho dos alelos foram estabelecidos e marcados

utilizando o programa Gene Mapper 3.7 (Applied Biosystems).

Análises estatísticase programas

Os microssatélites foram utilizados para estimar os valores de diversidade genética

intra e interpopulacional de P. reticulatum e P. corruscans. Os microssatélites Prt11 e Prt34
foram excluídos das análises em P. corruscans, pois estavam marcados com a mesma
fluorescência (6-FAM – azul) e durante a análise dos genótipos seus alelos apresentaram
tamanhos muito próximos, não sendo possível distingui-los entre os loci.
Para cada espécie foram estabelecidos os valores alélicos totais e médios por locus e
por população. O número de indivíduos analisados, número de alelos e valores de
heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) foram obtidos através do programa Cervus
3.0 (Marshall et al., 1998). Riqueza alélica foi obtida através do programa Fstat 2.9.3.2
(Goudet, 2002). Os valores de Fis (coeficiente de endogamia) e os cálculos de desvios do
equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e desequilíbrio de ligação foram analisados através de
testes exatos de Fisher, implementados no programa GenePop 3.4 (Raymond e Rousset,
1995). Para verificar a ocorrência de alelos nulos utilizou-se o programa Micro-checker 2.2.3
(Van Oosterhout et al., 2004). Os valores de significância (P<0.05) foram ajustados de acordo
com a correção de Bonferroni) (Rice, 1989).
Para investigar a ocorrência de estruturação genética entre as populações de P.
reticulatum e P. corruscans foram obtidos os índices de Fst (Weir e Cockerham, 1984)
assumindo o modelo de alelos infinitos (IAM) para todos os loci e para todos os pares de
populações no programa Arlequin 3.11 (Excoffier et al., 2005). Neste mesmo programa foram
realizados testes de variância molecular (AMOVA) (Excoffier et al., 1992) para verificar a
distribuição da variação entre populações, grupos de populações e dentro de populações. As
significâncias foram testadas por 1000 permutações.Nos testes de AMOVA, as amostras de P.
reticulatum foram analisadas de duas formas: primeiro com todos os indivíduos como um
único grupo ou separados em dois grupos (um grupo com os indivíduos da bacia do Paraguai
e outro grupo com as amostras do Baixo Paraná). As mesmas análises em P. corruscans
foram conduzidas de duas maneiras: um único grupo composto por todas as populações ou
dois grupos (um grupo com as populações da bacia do Paraguai e Baixo Paraná e outro com
amostras do Alto Paraná).

55
 Resultados e discussão - Capítulo 2

Análises bayesianas foram conduzidas através do programa Structure 2.3.4 (Pritchard

et al., 2000), para verificar o número real de populações (K) entre as amostras de cada
espécie. Foi permitido o modelo de ancestralidade não misturada (no admixture model) a fim
de permitir uma resolução máxima, uma vez que este parâmetro assume que cada indivíduo
vem exclusivamente de uma das populações (K) e é mais indicado para verificar uma
estruturação populacional sutil (Pritchard et al., 2000). Foram utilizados alelos
correlacionados, 20 réplicas para cada valor de K, 500.000 gerações da cadeia de Markov
Monte Carlo (MCMC), com períodos de “burn-in” de 200.000, e assumindo K=2 a 12 em P.
corruscans e K=2 a 11 em P. reticulatum. Posteriormente, para visualizar a extensão dos
genótipos compartilhados entre as populações (q), foram feitas novas análises com 20 réplicas
para K=2, admixture mode, 500.000 cadeias MCMC, e período de “burn in”de 100.000.

RESULTADOS

Pseudoplatystoma reticulatum

Considerando-se todas as populações e loci em conjunto, foi observada uma média de

9.4 alelos por locus (total de 94 alelos), riqueza alélica média de 7.029e He média de 0.738. O
microssatélite Prt3 foi o menos variável, apresentando 7 alelos e He média de 0.621 (Tabela
2). Prt25 foi o locus com um maior número de alelos (A=17), enquanto Prt34 apresentou
maior He média (0.874). A maioria dos loci estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg
(Tabela 2). Foram verificados desvios significativos (P<0.005 após a correção de Bonferroni)
para Prt5 na população de Ng, Prt 27 na localidade de Ta e Prt39 na população de Mir. O
programa Micro-checker indicou a provável existência de alelos nulos para estes loci,
possivelmente devido a um déficit de heterozigotos, o que pode ser visualizado pelos valores
de Fis positivos significativos nestas localidades (Tabela 2). Também foi observada a
possibilidade de alelos nulos para Prt3 (população de Cb), Prt5 (Mir) e Prt39 (Ng).
Na populaçãoMir foi verificada a maior diversidade, com 89 alelos, riqueza alélica
média de 6.429 e He média de 0.772 (Tabela 2). A localidade Pr apresentou o menor número
de alelos e riqueza alélica média (A=58, Ar=5.766), porém a He foi de 0.766 (segundo maior
valor de He). A menor He média (0.726) foi verificada na população de Cb. Como verificado
anteriormente, três populações (Ng, Ta e Mir) apresentaram desvios significativos do EHW,
porém apenas para um locus em cada (Tabela 2). Na população Cb foi verificada a ocorrência

56
 Resultados e discussão - Capítulo 2

de desequilíbrio de ligamento (DL) entre Prt34 e Prt27, Prt36 e Prt5; Prt39 com Prt25 e Prt5;
Prt 36 e Prt27 (P<0.005). Já na população Ng, DL ocorreu entre os microssatélites Prt39 e
Prt34 (P<0.005).

Tabela 2. Variabilidade genética de 10 loci microssatélites para seis populações de P. reticulatum.

Lócus Cb Pa Ta Ng Mir Pr
Prt3
N 27 22 12 20 27 9
Na 5 5 3 5 7 3
Ar 3.605 3.955 2.750 4.214 4.119 3.000
Ho 0.370 0.727 0.333 0.600 0.519 0.556
He 0.609 0.644 0.518 0.669 0.629 0.569
EHW 0.018 0.740 0.120 0.078 0.513 0.192
Fis 0.396 -0.133 0.367 0.106 0.178 0.024
Prt5
N 27 20 12 20 26 10
Na 9 14 12 10 10 8
Ar 7.372 8.729 10.273 8.047 7.906 7.974
Ho 0.889 0.750 0.833 0.700 0.692 1.000
He 0.867 0.787 0.899 0.874 0.863 0.911
EHW 0.925 0.643 0.643 0.003* 0.032 1.000
Fis -0.025 0.048 0.076 0.204 0.201 -0.104
Prt11
N 27 22 12 20 27 9
Na 8 9 6 8 10 9
Ar 5.379 6.976 5.686 6.243 7.510 9.000
Ho 0.704 0.773 0.833 0.650 0.889 0.889
He 0.718 0.833 0.819 0.755 0.867 0.908
EHW 0.088 0.127 0.959 0.090 0.974 0.824
Fis 0.020 0.074 -0.018 0.142 -0.026 0.023
Prt12
N 27 22 12 20 27 9
Na 5 6 5 4 6 5
Ar 4.017 5.042 4.250 3.441 4.814 5.000
Ho 0.556 0.727 0.500 0.700 0.778 0.778
He 0.616 0.736 0.565 0.633 0.726 0.758
EHW 0.302 0.355 0.753 0.722 0.983 1.000
Fis 0.100 0.012 0.120 -0.108 -0.073 -0.027
Prt25
N 27 21 12 20 27 9
Na 10 13 7 11 11 6
Ar 6.655 8.639 6.390 7.379 7.112 6.000
Ho 0.852 0.857 0.667 0.600 0.704 0.667
He 0.782 0.840 0.804 0.714 0.745 0.784
EHW 0.563 0.523 0.480 0.020 0.509 0.082
Fis -0.091 -0.021 0.178 0.163 0.056 0.158
N: número de indivíduos, Na: número de alelos por locus, A: número total de alelos, Ar: riqueza alélica, Ho:
heterozigosidade observada, He: heterozigosidade esperada. EHW: testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Fis:
coeficiente de endocruzamento. * P<0.005 após a correção de Bonferroni. Em negrito os valores de Fis para os
loci com possíveis alelos nulos.

57
 Resultados e discussão - Capítulo 2

Tabela 2. Continuação.
Lócus Cb Pa Ta Ng Mir Pr
Prt27
N 27 22 12 20 28 10
Na 7 4 6 6 7 4
Ar 4.996 3.547 5.391 4.012 5.090 3.895
Ho 0.630 0.409 0.250 0.300 0.464 0.500
He 0.522 0.425 0.674 0.360 0.606 0.626
EHW 1.000 0.575 0.000* 0.090 0.019 0.166
Fis -0.211 0.038 0.639 0.171 0.238 0.210
Prt30
N 27 22 12 20 26 10
Na 8 8 6 10 9 5
Ar 5.292 6.289 5.248 7.324 5.802 4.895
Ho 0.667 0.727 0.667 0.750 0.769 0.700
He 0.682 0.792 0.703 0.829 0.757 0.737
EHW 0.422 0.118 0.895 0.251 0.855 0.153
Fis 0.023 0.083 0.054 0.098 -0.016 0.053
Prt34
N 27 21 12 20 28 9
Na 11 10 11 9 11 8
Ar 7.877 7.905 9.663 7.564 8.342 8.000
Ho 0.778 0.714 0.917 0.850 0.821 1.000
He 0.833 0.856 0.920 0.874 0.874 0.902
EHW 0.110 0.272 0.566 0.178 0.647 0.852
Fis 0.067 0.169 0.004 0.029 0.061 -0.116
Prt36
Na 27 21 12 20 21 9
Ar 7 9 8 8 6 5
Ar 5.866 7.384 7.415 7.320 5.230 5.000
Ho 0.778 0.857 1.000 0.950 0.619 0.778
He 0.805 0.863 0.866 0.876 0.772 0.732
EHW 0.685 0.647 0.757 0.183 0.132 0.352
Fis 0.034 0.007 -0.163 -0.087 0.202 -0.067
Prt39
N 27 19 12 19 25 10
Na 9 8 6 7 12 5
Ar 7.203 5.873 5.490 5.511 8.365 4.895
Ho 0.704 0.579 0.583 0.474 0.560 0.600
He 0.829 0.767 0.801 0.745 0.881 0.737
0.012 0.228 0.382 0.088 0.000 * 0.383
0.153 0.250 0.280 0.371 0.369 0.194
Total
A 79 86 70 78 89 58
Média
N 27 22 12 20 28 10
A 7.9 8.6 7.0 7.8 8.9 5.8
Ar 5.826 6.434 6.256 6.106 6.429 5.766
Ho 0.693 0.712 0.658 0.657 0.681 0.747
He 0.726 0.754 0.757 0.733 0.772 0.766
EHW 0.412 0.423 0.617 0.189 0.518 0.500
Fis 0.047 0.053 0.154 0.109 0.119 0.035
N: número de indivíduos, Na: número de alelos por locus, A: número total de alelos, Ar: riqueza alélica, Ho:
heterozigosidade observada, He: heterozigosidade esperada. EHW: testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Fis:
coeficiente de endocruzamento. * P<0.005 após a correção de Bonferroni. Em negrito os valores de Fis para os
loci com possíveis alelos nulos.

58
 Resultados e discussão - Capítulo 2

Os índices Fst entre as populações de P. reticulatum apresentaram valores baixos a

moderados que variaram de 0.00083 a 0.1016 (Tabela 3). Valores estatisticamente
significativos (P<0.05) foram verificados entre Cb, Pa, Ng e Mir (Bacia do Paraguai) e Pr
(Bacia do Baixo Paraná). Também foi observada uma diferença significativa entre a
população de Mir e de Cb, ambas da Bacia do Paraguai.

Tabela 3. Valores de Fst entre pares de populações de P. reticulatum.

Paraguai Baixo Paraná
Cb Pa Ta Ng Mir Pr
Cb -
Pa 0.01688
Ta 0.00579 0.00083
Ng 0.00601 0.01451 0.00451
Mir 0.01906* 0.01504 -0.01488 -0.01133
Pr 0.10163* 0.09008* 0.03346 0.07446* 0.05443* -
Em destaque os valores significativos, * P<0.05, 1023 permutações.

As análises de AMOVA, considerando todas as populações como um único grupo,

demonstrou a maior porcentagem da variação dentro das populações (97.93 %) e de 2.07 %
entre as populações, ambas significativas (P<0.05) (Tabela 4). Quando as populações foram
divididas em dois grupos (Bacia do Paraguai e Bacia do Baixo Paraná), as análises de
AMOVA revelaram 5.69% da variação entre os grupos e 93.46% entre os indivíduos dentro
das populações, ambas estatisticamente significativas (P<0.05). A variação entre as
populações dentro dos grupos foi baixa, com valores de 0.85% e não significativa (P>0.05).

Tabela 4. Análise de variância molecular (AMOVA), aplicando o índice Fstpara todas as populações e
grupos de populações de P. reticulatum.
Componentes de
Grupos Tipo de variação Porcentagem de variação (%)
variação
Entre populações 0.05584 2.07*
1
Dentro das populações 2.63643 97.93*
Entre os grupos 0.21311 5.69*
2 Entre as populações dentro dos grupos 0.03163 0.85
Entre indivíduos dentro das populações 3.50050 93.46*
1: análise de todas as populações como um único grupo, 2: análise através da divisão em dois grupos, um
composto pelas populações da bacia do Paraguai e outro compreendendo a população do Baixo Paraná.
*variação significativa (P<0.05).

Os resultados do teste inicial no programa Structure indicaram K=1, sem divisão das
populações em grupos distintos. As análises utilizando K=2 para verificar a extensão do fluxo

59
 Resultados e discussão - Capítulo 2

gênico entre as populações demonstraram que os genótipos estavam divididos entre todas as
localidades com valores de q entre 0.438 a 0.572 atribuídos a cada um dos grupos (Figura 2).

100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Cb Pa Ta Ng Mir Pr

Figura 2. Estrutura “bar plot” das populações de P. reticulatum, estimada pelo programa Structure
utilizando K=2. Cada cor indica um grupo com base em semelhanças genotípicas. As legendas das
populações (Cb-Pr) estão indicadas na tabela 1.

Pseudoplatystoma corruscans

Foi observado um total de 150 alelos (média de 18.75 alelos por locus), Ar média de
9.590 e He média de 0.670 entre todos os loci e populações. Todos os microssatélites foram
polimórficos ao menos em uma localidade (Tabela 5). O locus Prt25 foi o menos diverso,
apresentando-se monomórfico na maioria das populações (Cb, Pa, Ta, Ve e Pp). Entre as
populações onde foi polimórfico, apresentou até 2 alelos e He média de 0.015. Prt3 também
foi monomórfico em algumas populações (Ve e Pp) e apresentou uma variação de 2 a 3 alelos
e He média de 0.111. O maior número de alelos foi encontrado no locus Prt36 (A=44)
enquanto Prt 27 demonstrou maiores valores de He (He média=0.952) (Tabela 5).
A população de Ve apresentou os valores mais baixos de diversidade (A=76, Ar
média=8.044, He média=0.624), enquanto na população de Ta foi verificado o maior valor de
He médio (0.691) e na localidade de Ng a maior quantidade de alelos (A=105, Ar
média=10.715). A maioria dos microssatélites e populações encontrou-se em equilíbrio de
Hardy-Weinberg (Tabela 5). Desvios significativos (P<0.006 após a correção de Bonferroni)
do EHW foram detectados para Prt5 na população de Taq. O valor positivo de Fis foi
significativo para este locus e o programa Micro-checker indicou a provável existência de
alelos nulos devido a um déficit de heterozigotos (Tabela 5). Também foi observada a
probabilidade de alelos nulos para Prt3 e Prt25 na população de Pr. Foi verificado
desequilíbrio de ligamento entre Prt27 e Prt36 na população Ng (P<0.006). Na população de
60
 Resultados e discussão - Capítulo 2

Ve os DL foram entre os microssatélites Prt 5 com 39, 30, 27 e 12; Prt30 com 12, 27 e 39; Prt
27 com 12 e 39 (P<0.006).

Tabela 5. Variabilidade genética de 8 loci microssatélites para sete populações de P. corruscans.

Lócus Cb Pa Ta Ng Ve Pp Pr
Prt3
N 33 23 22 30 30 29 30
Na 2 2 2 2 1 1 3
Ar 1.962 1.999 2.000 1.978 1.000 1.000 2.444
Ho 0.121 0.087 0.182 0.067 0.000 0.000 0.033
He 0.116 0.162 0.304 0.127 0.000 0.000 0.098
EHW 1.000 0.132 0.107 0.101 - - 0.016
Fis -0.049 0.470 0.408 0.477 0.663
Prt5
N 33 22 22 32 30 28 29
Na 15 15 13 17 11 11 17
Ar 11.696 13.815 12.204 13.588 9.294 9.077 13.601
Ho 0.788 0.864 0.727 0.906 0.967 0.857 0.931
He 0.871 0.913 0.901 0.904 0.844 0.825 0.905
EHW 0.166 0.134 0.003* 0.254 0.009 0.830 0.549
Fis 0.097 0.056 0.196 -0.002 -0.149 -0.040 -0.029
Prt12
N 33 22 21 25 29 28 29
Na 10 9 12 12 10 12 10
Ar 9.104 8.754 10.982 10.713 9.064 10.704 9.360
Ho 0.879 0.909 0.905 0.880 0.862 0.857 0.897
He 0.832 0.833 0.846 0.882 0.863 0.879 0.867
EHW 0.508 0.929 0.399 0.437 0.015 0.454 0.618
Fis -0.057 -0.094 -0.072 0.002 0.001 0.026 -0.035
Prt25
N 33 23 22 31 30 29 30
Na 1 1 1 2 1 1 2
Ar 1.000 1.000 1.000 1.581 1.000 1.000 1.844
Ho 0.000 0.000 0.000 0.032 0.000 0.000 0.000
He 0.000 0.000 0.000 0.032 0.000 0.000 0.066
EHW - - - - - - 0.017
Fis 1.000
Prt27
N 33 21 22 32 30 28 30
Na 18 19 21 24 18 19 24
Ar 16.148 18.014 19.176 19.347 14.844 16.361 19.490
Ho 0.909 1.000 1.000 0.969 0.867 1.000 0.867
He 0.947 0.955 0.958 0.957 0.907 0.942 0.952
EHW 0.074 0.869 0.847 0.636 0.087 0.947 0.017
Fis 0.041 -0.049 -0.045 -0.013 0.046 -0.063 0.091
N: número de indivíduos, Na: número de alelos por locus, A: número total de alelos, Ar: riqueza alélica, Ho:
heterozigosidade observada, He: heterozigosidade esperada. EHW: testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Fis:
coeficiente de endocruzamento. * P<0.005 após a correção de Bonferroni. Em negrito os valores de Fis para os
loci com possíveis alelos nulos.

61
 Resultados e discussão - Capítulo 2

Tabela 5. Continuação.
Lócus Cb Pa Ta Ng Ve Pp Pr
Prt30
N 33 22 22 32 30 28 30
Na 12 8 10 13 8 8 11
Ar 10.162 7.632 9.753 11.201 6.798 6.805 9.464
Ho 0.727 0.773 0.955 0.844 0.867 0.679 0.900
He 0.833 0.821 0.867 0.843 0.780 0.797 0.854
EHW 0.344 0.304 0.280 0.119 0.769 0.166 0.954
Fis 0.128 0.060 -0.104 -0.001 -0.113 0.151 -0.055
Prt36
N 32 22 18 29 26 27 24
Na 15 20 18 19 16 20 21
Ar 11.887 17.662 18.000 14.019 13.430 16.484 17.253
Ho 0.875 0.909 0.944 0.759 0.769 0.963 0.792
He 0.828 0.862 0.914 0.831 0.819 0.927 0.885
EHW 0.442 0.415 0.867 0.517 0.174 0.416 0.105
Fis -0.058 -0.057 -0.034 0.089 0.062 -0.040 0.107
Prt39
N 33 22 22 32 30 28 30
Na 14 11 9 16 11 8 16
Ar 10.701 10.082 8.391 12.954 8.922 6.998 12.267
Ho 0.758 0.864 0.682 0.875 0.767 0.750 0.733
He 0.778 0.838 0.740 0.856 0.779 0.749 0.814
EHW 0.068 0.435 0.250 0.300 0.025 0.817 0.266
Fis 0.026 -0.031 0.080 -0.023 0.016 -0.001 0.101
Total
A 87 85 86 105 76 80 104
Média
N 33 24 22 32 30 30 31
Na 10.88 10.63 10.75 13.13 9.50 10.00 13.00
Ar 9.083 9.870 10.188 10.673 8.044 8.554 10.715
Ho 0.632 0.676 0.674 0.666 0.637 0.638 0.644
He 0.650 0.673 0.691 0.679 0.624 0.640 0.680
EHW 0.372 0.460 0.458 0.338 0.180 0.605 0.318
Fis 0.018 0.051 0.061 0.076 -0.023 0.005 0.230
N: número de indivíduos, Na: número de alelos por locus, A: número total de alelos, Ar: riqueza alélica, Ho:
heterozigosidade observada, He: heterozigosidade esperada. EHW: testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Fis:
coeficiente de endocruzamento. * P<0.005 após a correção de Bonferroni. Em negrito os valores de Fis para os
loci com possíveis alelos nulos.

Uma análise interpopulacional indicou valores de Fst que variaram de 0.00008a

0.09716. As diferenças significativas foram entre Ve e Pp (Bacia do Alto Paraná) e as
localidades de Cb, Pa, Ta, Ng, Pr (Bacias do Paraguai e Baixo Paraná) (P<0.05) (Tabela 6).

62
 Resultados e discussão - Capítulo 2

Tabela 6. Valores de Fst entre pares de populações de P. corruscans.

Baixo
Paraguai Alto Paraná
Paraná
Cb Pa Ta Ng Ve Pp Pr
Cb -
Pa 0.00362
Ta -0.00224 0.00378
Ng -0.00369 -0.00799 -0.01466
Ve 0.09196* 0.04418* 0.09716* 0.08152*
Pp 0.06170* 0.03443* 0.06028* 0.04010* 0.01004
Pr 0.00008 -0.01122 -0.00334 -0.00350 0.04928* 0.02582* -
Em destaque os valores significativos, * P<0.05, 1023 permutações.

Nas análises de AMOVA, considerando-se todas as populações como um único grupo,

a maior porcentagem da variação ocorreu entre os indivíduos dentro das populações (97.10%)
e menor entre as populações (2.85%), porém ambas significativas (P<0.05) (Tabela 7). A
análise das populações divididas em dois grupos demonstrou uma variação maior e
significativa entre os grupos (3.53%, P<0.05), não significativa entre as populações dentro
dos grupos (0.71%, P>0.05); e a maior variação entre os indivíduos dentro das populações
(95.75%, P<0.05).

Tabela 7. Análise de variância molecular (AMOVA). aplicando o índice Fst para todas as populações
e grupos de populações de P. corruscans.
Componentes
Grupos Tipo de variação Porcentagem de variação (%)
de variação
Entre populações 0.04590 2.85*
1
Dentro das populações 1.56358 97.15*
Entre os grupos 0.08899 3.53*
2 Entre as populações dentro dos grupos 0.01797 0.71
Entre indivíduos dentro das populações 2.41325 95.75*
1: todas as populações como um único grupo, 2: dois grupos, um composto pelas populações da bacia do
Paraguai e Baixo Paraná e outro compreendendo as populações da bacia do Alto Paraná, *variação significativa
(P<0.05).

As análises de estruturação genética do programa Structure indicaram K=2, com as

populações divididas em dois grupos genéticos distintos, um da população de Cb (Bacia do
Paraguai) e outro das populações de Ve e Pp (Bacia do Alto Paraná) (Figura 3). Os valores de
q foram maiores para estas populações Cb (0.793 ao grupo 1), Ve (0.898 ao grupo 2) e Pp
(0.792 ao grupo 2), enquanto as outras localidades apresentaram genótipos atribuídos à ambos
63
 Resultados e discussão - Capítulo 2

grupos. No rio Paraná foi verificado aproximadamente metade de atribuição de seu genótipo a
cada grupo inferido (0.562 ao grupo 1 e 0.438 ao grupo 2).

100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Cb Pa Ta Ng Pr Pp Ve

Figura 3. Estrutura “bar plot” das populações de P. corruscans, estimada pelo programa Structure
utilizando K=2. Cada cor indica um grupo com base em semelhanças genotípicas. As legendas das
populações (Cb-Ve) estão indicadas na tabela 1.

DISCUSSÃO

Análises intrapopulacionais

Os dados obtidos neste trabalho para P. reticulatum demonstraram valores altos de

diversidade. Algumas diferenças observadas na quantidade de alelos entre as populações
possivelmente está relacionada com o número amostral, pois os loci foram polimórficos em
todas as localidades e os dados de riqueza alélica demonstraram uma variação sutil entre as
populações. Estes dados condizem com o comumente observados em peixes de água
continental (DeWoody e Avise, 2000) e em outros estudos com esta espécie (Abreu et al.,
2009).
Em P. corruscans, apesar de dois microssatélites apresentarem baixa diversidade,
todos os seis microssatélites restantes também apresentaram alto polimorfismo e He. A
diversidade entre as sete populações desta espécie, apesar do diferente número amostral,
também foi média a alta entre todos os loci. Estes resultados condizem com a diversidade já
observada para esta espécie em populações da bacia do Paraguai, Paraná e São Francisco
(Pereira et al., 2009; Carvalho et al., 2012).

64
 Resultados e discussão - Capítulo 2

A variação intrapopulacional é gerada primariamente através de mutação e

recombinação(Templeton, 2011). Porém, as mutações são raras e o fator que mais
rapidamente contribuiu para o aumento da diversidade intrapopulacional é a imigração de
indivíduos de outras populações, através de fluxo gênico (Laikre et al., 1999). Como as
espécies P. reticulatum e P. corruscans são migradoras (Resende, 2003; Carolsfeld et al.,
2003; Godinho et al., 2007), os altos valores de variabilidade genética observados podem
estar relacionados com o contato entre as populações, aumentando a heterozigosidade.
Entre os diversos tipos de análises que disponibilizam, os marcadores microssatélites
permitem verificar desvios das frequências genotípicas do Equilíbrio de Hardy-Weinberg,
possibilitando detectar fragmentação populacional, migração e seleção (Frankham e Briscoe,
2002). Neste estudo, desvios significativos do EHW foram observados em poucos loci e
populações para ambas as espécies, os quais estavam principalmente relacionados com um
excesso de homozigotos e altos valores positivos e significativos de Fis. Entre os fatores mais
comuns responsáveis por desvios do EHW em microssatélites está a existência de alelos
nulos, endogamia, efeito Whalund, o alto número de alelos por locus e amostragem não
randômica (García de Leon et al., 2007). Uma possível causa dos desvios do EHW
observados neste estudo podem ser devido ao número limitado de indivíduos analisados em
algumas localidades (N≤20) ou a algum tipo de amostragem não randômica, onde a
diversidade alélica dos microssatélites, altamente polimórficos, não pôde ser acessada
corretamente, aumentando a quantidade de homozigotos detectados para alguns loci em
algumas populações. Porém, nenhuma população apresentou desvios para todos os loci.
Entre as possíveis causas dos desvios do EHW, o excesso de homozigotos também
pode estar relacionado com a ocorrência de alelos nulos, comum em microssatélites (Dakin e
Avise, 2004). A ocorrência de alelos nulos é causada por uma baixa eficácia de hibridação dos
primers devido a mutações pontuais em uma ou mais regiões da sequências flanqueadoras dos
microssatélites onde os primers iriam se anelar (Dakin e Avise, 2004). Assim, os poucos
desvios do EHW verificados neste trabalho também podem ser devido à ocorrência de alelos
nulos para estes microssatélites, porém, em frequências baixas, limitados a uma ou duas
populações. A maioria dos estudos que encontram loci com possibilidade de alelos nulos não
os excluem das análises, já que os efeitos nos padrões de diversidade geralmente são
pequenos quando as frequências de alelos nulos são baixas a moderadas (Cebrián, 2011).
Desequilíbrios de ligamento entre microssatélites podem indicar uma ligação física
entre os loci, porém, são principalmente causados por fatores populacionais como

65
 Resultados e discussão - Capítulo 2

estruturação, endogamia e alto índice de homozigotos presentes na população, e não porque

estejam realmente ligados (Templeton, 2011). Neste estudo foram verificados DL
significativos nas populações de Cuiabá e Negro para P. reticulatum e no rio Verde para P.
corruscans. Como nenhum par de loci apresentou DL em todas as localidades, é proposto que
haja independência física entre estes marcadores. Já a causa dos DL em algumas populações
pode estar relacionado com algum tipo de estruturação ou diferenciação genética dentro da
população.

Análises interpopulacionais

O comportamento de homing tem sido sugerido para diversas espécies de peixes com
hábitos migratórios (Batista e Gomes, 2006; Piorski et al., 2008; Oliveira et al., 2009; Pereira
et al., 2009). Durante a reprodução as espécies estariam corretamente atribuídas à suas
populações, uma vez que retornariam sempre ao mesmo local, levando a uma diferenciação
genética entre as populações; já os indivíduos que estão em sua época de alimentação
encontram-se "misturados" com outras populações, ocasionando menor diferenciação genética
(Pereira et al., 2009). Desta forma, é indicado que, para verificar a estruturação populacional
em espécies migratórias, deve-se coletar os indivíduos em sua época de reprodução.
Estudos utilizando um grupo de microssatélites distintos (Revaldaves et al., 2005) tem
revelado uma diferenciação baixa a moderada, porém significativas entre populações das
espécies P. reticulatum e P. corruscans (Abreu et al., 2009; Pereira et al., 2009). Segundo
estes trabalhos, mesmo localidades próximas geograficamente, como rios da bacia do
Paraguai (Cb, Ta e Ng) em P. corruscans (Fst entre 0.03435 a 0.16349) e rios Paraguai e
Jauru em P. reticulatum (Fst=0.22) apresentaram estruturação genética, o que pode estar
relacionado com o comportamento de homing nestas espécies.
Estes dados interpopulacionais não condizem com verificado neste trabalho, onde foi
observada alta similaridade genética entre a maioria das populações de P. reticulatum e todas
as populações de P. corruscans dentro da bacia do Paraguai, com diferenciação não
significativa, mesmo entre populações coletadas em sua época de reprodução. É possível que
esta ausência de diferenciação genética esteja relacionada com uma população panmítica na
bacia do Paraguai, e um fluxo gênico maior do que o esperado para estas espécies. Os
movimentos migratórios comuns a estas espécies podem estar ocasionando a ausência de
diferenciação significativa entre as populações mais próximas da bacia do Paraguai, o que

66
 Resultados e discussão - Capítulo 2

também explicaria a alta diversidade encontrada nestas populações. Este padrão pode ter
surgido pelas migrações anuais, atuando na homogeinização entre as populações mais
próximas. Estudos com a espécie migratória Prochilodus lineatus, demonstraram ausência de
estruturação genética entre populações do rio São Francisco, mesmo coletadas em sua época
de reprodução, onde existe a possibilidade da reprodução anual ser um agente de
homogeinização dos diferentes pools genéticos (Carvalho-Costa et al., 2008).
Porém, também existe a possibilidade das análises genéticas deste trabalho não terem
conseguido acessar uma sutil estruturação nas populações destas espécies dentro das bacias
hidrográficas de sua ocorrência. Isto pode ser devido à erros de amostragem, com a possível
coleta de indivíduos provenientes de diversas populações; ou ao relativo baixo número de
indivíduos amostrados em algumas localidades, que não foram suficientes para visualizar as
diferenças alélicas interpopulacionais.
De acordo com Wright (1978), valores entre 0.00 e 0.05 indicam baixo nível de
diferenciação genética, valores entre 0.05 e 0.25 indicam diferenciação genética moderada, e
valores acima de 0.25 indicam alta diferenciação. No entanto, é importante ressaltar que,
mesmo as baixas estimativas de Fst (<0.05) podem refletir uma importante diferenciação
genética entre as populações (Balloux e Lugon- Moulin, 2002). A manutenção da diversidade
genética depende da preservação do fluxo gênico entre as populações de um sistema (Laikre
et al, 2005). Portanto, a estruturação populacional poderia manter a existência de populações
genéticas distintas e evitar a panmixia. Por outro lado, o fluxo de genes assegura a introdução
de variações genéticas nas populações, evitando endogamia e a perda de variação genética nas
espécies como um todo (Laikre et al., 1999; Templeton, 2011). Assim, embora a magnitude
dos valores de Fst na diferenciação populacional ainda seja alvo de debates, em termos de
conservação, é recomendável considerar a existência de subdividsões entre as populações do
que uma única população, o que poderia resultar na depleção da variação genética (Laikre et
al., 2005).
Apesar da alta similaridade entre rios próximos, os dados deste estudo demonstraram
diferenciação genética entre localidades mais distantes. Dentro da bacia do Paraguai a
população de P. reticulatum do rio Cuiabá foi significativamente diferenciada do rio Miranda.
Além disso, todos os rios da bacia do Paraguai, com exceção do rio Taquari, apresentaram
diferenciação genética do rio Paraná (Baixo Paraná). Não existem estudos específicos sobre a
migração de P. reticulatum, como por exemplo, o alcance que realiza, porém,

67
 Resultados e discussão - Capítulo 2

estadiferenciação genética pode ser devida a distância geográfica e a capacidade máxima de

deslocamento desta espécie.
A comparação entre estas bacias na espécie P. corruscans demonstrou um cenário
distinto, sem diferenciação significativa entre a bacia do Paraguai e Baixo Paraná, o que pode
estar relacionado com diferentes comportamentos migratórios entre estas espécies. Talvez P.
corruscans migre por distâncias maiores e ocorra maior fluxo gênico entre os rios da bacia do
Paraguai e Baixo Paraná quando comparada com P. reticulatum. Outra possibilidade são
diferenças do período reprodutivo entre as espécies. A migração destes peixes se inicia com a
movimentação para planícies alagadas do rio Paraguai e Paraná para se alimentar e a subida
para os rios tributários para reprodução (Pereira et al., 2009). Como as amostras no rio Paraná
foram feitas no final da época de alimentação e início da migração reprodutiva (entre
setembro e outubro) é possível que indivíduos de P. reticulatum já tivessem iniciado a
migração, subindo para os rios da bacia do Paraguai, o que aumentaria a diferenciação entre
as localidades. Já os indivíduos de P. corruscans, caso ainda estivessem na área de
alimentação (rio Paraná), ocasionariam maior similaridade genética entre as amostras.
Em relação à bacia do Alto Paraná, onde foram analisadas apenas amostras de P.
corruscans, a diferenciação foi significativa com os rios da bacia do Paraguai e Baixo Paraná,
o que possivelmente está relacionada com a distância geográfica entre os locais analisados. A
estruturação genética relevada pelo programa Structure neste estudo demonstrou a presença
de dois grupos distintos dentro da espécie, que corresponderam justamente às regiões mais
distantes (rios Cuiabá e Verde+Paranapanema) localizados entre estas bacias hidrográficas
distintas.
Para esta mesma espécie, a diferenciação entre localidades mais próximas verificada
neste estudo, como o rio Paraná (Baixo Paraná) e o rio Paranapanema (Alto Paraná), podem
resultar do isolamento entre estas bacias até 1983 pela barreira natural de Salto de Sete
Quedas e atualmente pela barragem da usina de Itaipú (Sekine et al., 2002). De acordo com
Godinho et al. (2002) é difícil que espécies migradoras como P. corruscans sejam capazes de
atravessar as barreiras. Ao mesmo tempo, apesar das diferenças significativas entre estas
localidades, aproximadamente metade da atribuiçãodo rio Paraná (0.438) foi ao grupo do Alto
Paraná, refletindo um possível fluxo gênico. Como o local de coleta da população Pr foi
justamente após a junção dos rios Paraná e Paraguai, alguns indivíduos de ambas as bacias
podem se reproduzir neste local. Pereira et al. (2009) verificou ausência de diferenciação entre

68
 Resultados e discussão - Capítulo 2

o baixo Paraná e o rio Paranapanema (Alto Paraná) e sugeriu que alguns indivíduos possam
passar pela barragem através das escadas de peixes implantadas na usina.
Carvalho et al. (2012) utilizaram DNA mitocondrial e microssatélites para verificar a
diferenciação entre populações de P. corruscans da bacia do São Francisco e bacia do
Paraguai/Paraná. Os microssatélites utilizados por estes autores foram os mesmos utilizados
por Abreu et al. (2009) e Pereira et al. (2009) e disponibilizaramum valor de Fst de 0.18,
altamente significativos entre as bacias. Estes dados, em conjunto com os resultados deste
estudo, indicam que existe diferenciação genética para P. corruscans entre as bacias
geográficas de sua ocorrência (Paraguai, Paraná e São Francisco).
Os resultados deste trabaho fornecem informações sobre a diversidade genética e
padrões de diferenciação populacional para estas espécies e representam a primeira análise
genética das populações de P. reticulatum abrangendo os rios aqui analisados.
Adicionalmente, a diferenciação genética distinta verificada entre as espécies pode ser útil
para futuros estudos ecológicos e de migração nestas espécies. Os valores de diversidade
podem ser futuramente utilizados no manejo destas espécies em cultivo e para verificar
possíveis alterações populacionais.

69
 Resultados e discussão - Capítulo 3

CAPÍTULO 3

Microssatélites e genes na detecção de hibridação entre duas espécies do gênero

Pseudoplatystoma através de análises bayesianas

RESUMO

Os microssatélites, apesar de seu alto polimorfismo, possuem potencial para distinguir

diferentes taxa e seus híbridos, devido a alta divergência alélica que pode ocorrer entre as
espécies. Além disso, análises bayesianas permitem a atribuição dos genótipos dos indivíduos
de acordo com suas frequências alélicas, o que é muito importante para inferências evolutivas
e populacionais em ambientes onde ocorra hibridação. Neste estudo foi testado o potencial de
oito microssatélites em distinguir as espécies de bagres Neotropicais Pseudoplastystoma
reticulatum e P. corruscans e identificar seus híbridos e introgressão genética. Também foram
realizados testes através de diferentes combinações de marcadores microssatélites e genes, a
fim de acessar a probabilidade de identificação dos indivíduos. Os microssatélites
apresentaram diferenças bem estabelecidas entre as espécies, tanto no que se refere ao
tamanho como a frequência alélica, confirmadas por dois grupos estruturados claramente
distintos correspondentes a cada uma das espécies. Os dados populacionais indicaram que os
desvios do EHW, excesso ou déficit de heterozigotos e desequilíbrios de ligamento podem ser
fatores importantes para detectar hibridação e introgressão neste grupo de peixes. Os testes
bayesianos demonstraram que os microssatélites foram extremamente informativos para
identificar a hibridação nas amostras e úteis em estudos genético populacionais. Porém, como
estas regiões do DNA são muito polimórficas, quando o objetivo é a identificação indvidual, a
utilização apenas dos loci diagnósticos (totalmente fixos entre as espécies) em conjunto com
marcadores de genes pode permitir uma identificação mais precisa. Além disso, o uso de dois
ou mais dos métodos bayesianos, como os programas Structure e NewHybrids, foram a
melhor opção. Estes resultados disponibilizam uma gama de marcadores microssatélites para
serem aplicados em futuras investigações de hibridação e introgressão genética neste grupo de
peixes, assim como em projetos de conservação, produção e manejo destas espécies.

70
 Resultados e discussão - Capítulo 3

INTRODUÇÃO

Uma etapa primordial para investigar eventos de hibridação interespecífica ou

introgressiva em ambientes naturais são metodologias que permitam uma identificação e
discriminação precisa entre as espécies parentais e linhagens híbridas F1, F2 e
retrocruzamentos (Toledo-Filho et al., 1994; Allendorf et al., 2001; 2010). Informações
taxonômicas fornecem dados importantes para estudos de hibridação, porém, pode ser difícil e
duvidoso distinguir híbridos unicamente através parâmetros morfológicos, principalmente
gerações híbridas avançadas, as quais podem ser heterogêneas (Demandt e Bergek, 2009;
Allendorf et al., 2010). Inúmeros marcadores de regiões do DNA nuclear tem sido
desenvolvidos e aplicados com sucesso no estudo da hibridação e introgressão genética, os
quais independem das variações morfológicas (Machado-Schiaffino et al., 2010; Dubut et al.,
2010; Bohling et al., 2013; Khosravi et al., 2013).
Marcadores moleculares diagnósticos e monomórficos entre as espécies (como genes
nucleares sem variações alélicas entre as espécies) possibilitam identificar espécies e híbridos
com precisão através de mutações espécie-específicas ou fragmentos eletroforéticos de
tamanhos diagnósticos (Rubidge et al., 2001; Hashimoto et al., 2011; Porto-Foresti et al.,
2013). Por outro lado, marcadores polimórficos com variação intraespecífica, como os
microsatélites (SSR - simple sequence repeat), por seguirem modelos evolutivos simples
(marcadores neutros), e serem facilmente genotipados através de PCR, têm sido amplamente
aplicados em estudos de hibridação (Ostberg e Rodriguez 2004; Dubut et al., 2010; Bohling et
al., 2013; Khosravi et al., 2013; Zhang et al., 2013).
Com o uso de microssatélites a distinção dos taxa pode ser realizada através da
comparação das frequências e tamanhos alélicos entre as espécies, onde a acumulação de
mutações pode contribuir mais substancialmente para a diferenciação interespecífica do que
ao observado entre as populações das espécies (Roques et al., 1999). Além disso,
desequilíbrios genéticos populacionais e valores de heterozigosidade, disponibilizados pelos
marcadores microssatélites, podem ser extremamente úteis e informativos no estudo da
hibridação (Hansen et al., 2001; Sanz et al., 2009).
As espécies de peixes Neotropicais Pseudoplatystoma reticulatum e Pseudoplatystoma
corruscans são amplamente distribuídas por rios Sul Americanos (Lundberg e Littman, 2003;
Buitrago-Suárez e Burr, 2007) e tem sido extensivamente utilizadas para a produção de
híbridos na aquicultura brasileira (Campos, 2010; Hashimoto et al., 2013a). Os ambientes

71
 Resultados e discussão - Capítulo 3

naturais destas espécies estão sofrendo contaminação genética através de retrocruzamentos, o

que acredita-se estar sendo ocasionado pelo contato de híbridos de pisciculturas com as
populações parentais (Veríssimo et al., 2005; Bignotto et al., 2009; Prado et al., 2012a; Prado
et al., Capítulo 1).
Em casos como este, onde existe fertilidade híbrida e hibridação introgressiva, a
identificação precisa de retrocruzamentos na natureza podere querer um número alto de
marcadores nucleares, devido as várias combinações alélicas resultantes da mistura genética
entre as espécies (Toledo-Filho et al., 1994; Boecklen e Howard, 1997; Vähä e Primmer,
2006; Sanz et al., 2009).A maioria dos estudos de hibridação utiliza 6 a 10 marcadores
nucleares, porém, no caso dos microssatélites, comosão altamente variáveis, é recomendada
uma maior quantidade de loci para identificar a hibridação introgressiva avançada,
especialmente se a diferenciação alélica entre as espécies é baixa (Allendorf et al., 2001; Vähä
e Primmer, 2006; Sanz et al., 2009).
Estudos disponibilizaram três marcadores de genes nucleares com diferenças fixas
entre as espécies P. reticulatum e P. corruscans, eficazes na distinção entre os taxa e para
documentar a presença de híbridos e introgressão na natureza (Prado et al., 2011; Hashimoto
et al., 2013a; Prado et al., capítulo 1). Carvalho et al., (2013) demonstraram que oito
microssatélites previamente desenvolvidos para P. corruscans por Revaldaves et al. (2005)
apresentaram diferenças entre as espécies e possibilitaram uma identificação de amostras
contendo híbridos através de métodos de atribuição dos indivíduos. Prado et al. (in press)
disponibilizaram 16 microssatélites para P. reticulatum, que apresentaram 100% de
transferabilidade em P. corruscans, e entre eles, seis apresentaram tamanhos alélicos distintos
entre as espécies, com potencial para análises interespecíficas.
Tendo em vista a importância de maior número de marcadores genéticos para avaliar a
hibridação introgressiva nas populações de P. reticulatum e P. corruscans, este trabalho
buscou utilizar alguns microssatélites disponíveis para estas espécies (Prado et al., in press)
para verificar a extensão da divergência genética interespecífica e testar seu potencial na
identificação dos híbridos. Também objetivou-se utilizar análises bayesianas na identificação
da hibridação testando diferentes quantidades e tipos de marcadores genéticos (microssatélites
e genes nucleares).

72
 Resultados e discussão - Capítulo 3

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisadas populações das espécies parentais (P. reticulatum: N=119 amostras
dos rios Paraguai, Cuiabá, Taquari, Negro, Miranda e Paraná; P. corruscans: N=202
amostrasdos rios Paraguai, Cuiabá, Taquari, Negro, Verde, Paranapanema e Paraná) e duas
populações com ocorrência de hibridação (rio Aquidauana: N=30 e rio Mogi-Guaçu: N=43).
Estas amostras foram as mesmas analisadas por Prado et al. (Capítulo 1), que realizaram sua
identificação genética utilizando os genes nucleares RAG2 (Recombination activating gene
2), EF1 (elongation factor 1) e ribossômico 18S (Prado et al., 2011; Hashimoto et al., 2013a)
e cederam a genotipagem destes genes para este trabalho.
Também foram analisados oito microssatélites (Prt3, Prt 5, Prt12, Prt25, Prt27, Prt30,
Prt36 e Prt39) (Prado et al. in press). Os dados alélicos destes loci para as populações
parentais foram cedidos por Prado et al. (Capítulo 2), enquanto as populações de Aquidauana
e Mogi-Guaçu foram genotipadas neste trabalho.
Foi realizada extração e purificação do DNA genômico total das populações com
hibridação, de acordo com o protocolo descrito no kit comercial Wizard genomic DNA
purification kit (Promega). A amplificação dos microssatélites foi realizada através de PCR
(Polymerase chain reaction) utilizando as concentrações e programas descritos por Prado et
al. (Capítulo 2). Os produtos de PCR foram confirmados em gel de agarose a 1% agarose
utilizando o DNA ladder de 100 pares de bases (pb) DNA ladder (Invitrogen) corado com
SYBR Safe ™ (Applied Biosystems) e posteriormente aplicados em analisador genético
automático ABI PRISM_3730 (Applied Biosystems). O tamanho dos alelos foram
estabelecidos e marcados utilizando o programa Gene Mapper 3.7 (Applied Biosystems).

Análises dos dados e programas

Análises interespecíficas

A fim de visualizar as diferenças alélicas interespecíficas, as populações de P.

reticulatum e P. corruscans foram agrupadas por espécie. A diversidade genética e diferenças
dos alelos entre as espécies foram medidas através do número de alelos, variação de tamanho
dos alelos, heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) através do programa Cervus 3.0
(Marshall et al., 1998). A divergência relacionada à variação e frequência dos alelos entre as

73
 Resultados e discussão - Capítulo 3

espécies foi medida através do índice Fst (Weir e Cockerham, 1984) utilizando o programa
Arlequin 3.11 (Excoffier et al., 2005). Através deste mesmo programa também foram feitas
análises de variância molecular (AMOVA) para acessar a variação entre as espécies e entre as
populações dentro de cada espécie, sendo que as significâncias foram testadas por 1000
permutações. Também foram obtidos valores de Rst (Rousset, 1996; Goodman, 1997) que
consiste em uma variação dos índices de diferenciação genética com base no tamanho alélico,
implementado no programa GenePop 3.4 (Raymond e Rousset, 1995). As frequências alélicas
para todos os loci por espécie foram obtidas através do programa Fstat 2.9.3.2 (Goudet, 2002)
e os alelos exclusivos para cada espécie foram identificados manualmente.
A fim de verificar o número real de K entre todas as amostras (N=394) e visualizar o
número de grupos diferenciados entre as espécies parentais e as populações com híbridos, o
valor de K foi inicialmente estimado através do programa Structure 2.3.4 (Pritchard et al.,
2000), assumindo ancestralidade misturada, alelos correlacionados, testados valores de K=2 a
10, 20 réplicas para cada valor de K, 500.000 cadeias MCMC e 100.000 gerações “burn-in”.

Identificação de híbridos e introgressão genética

Foram obtidos dados de diversidade genética nas populações com híbridos (A,
variação de tamanho dos alelos, Ho e He) utilizando os parâmetros e programas descritos
anteriormente. Os valores de Fis (coeficiente de endogamia) e os cálculos de desvios do
equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e desequilíbrio de ligação foram analisados através de
testes exatos de Fisher, implementados no programa GenePop 3.4 (Raymond e Rousset,
1995). Os valores de significância (P<0.05) foram ajustados de acordo com a correção de
Bonferroni) (Rice, 1989).
Posteriormente, foram realizados testes para verificar as probabilidades de
identificação de híbridos F1 e híbridos avançados utilizando análises bayesianas. Foram feitos
testes utilizando somente os marcadores variáveis microssatélites (Prt3, 5, 12, 25, 27, 30, 36 e
39); utilizando todos os marcadores (oito microssatélites e genes RAG2, EF1 e 18S); ou
selecionando apenas os marcadores totalmente diagnósticos entre as espécies.
Através do programa Structure foram obtidos os valores de q de cada indivíduo
atribuído a cada espécie parental, P. reticulatum (q1) ou P. corruscans (q2). Foi estimado
K=2, ancestralidade misturada, 20 réplicas para cada valor de K, 500.000 cadeias MCMC,
100.000 gerações “burn-in” e utilizada a opção “popflag” para as espécies parentais (1: P.

74
 Resultados e discussão - Capítulo 3

reticulatum, 2: P. corruscans, 0: populações com hibridação). Foi utilizado um intervalo de

confiança de 90% para discriminar os indivíduos como espécies parentais, conforme proposto
por estudos simulados (Sanz et al., 2009; Aboim et al., 2010), sendo que os exemplares com
valores menores de atribuição a determinada espécie (0.1≤q≥0.9) foram identificados como
indivíduos com algum nível de mistura entre as espécies, ou híbridos.
O programa NewHybrids 1.1 (Anderson e Thompson, 2002) foi utilizado para estimar
a probabilidade total (Q) de cada indivíduo pertencer a uma das seis classes: parental 1 P.
reticulatum (Pr), parental 2 P. corruscans (Pc), primeira geração de híbridos interespecíficos
(F1), segunda geração de híbridos (F2), retrocruzamentos de F1 com o parental 1 (RPr) ou
retrocruzamentos de F1 com o parental 2 (RPc). Os testes foram baseados em 100.000
varreduras MCMC após um período de burn-in de 100.000, com as opções de z e s para
indicar as espécies puras (z0s: P. reticulatum e z1s: P. corruscans). Esta classificação foi
realizada utilizando os marcadores que permitiram uma melhor identificação dos indivíduos
testados através do programa Structure.

RESULTADOS

Análises interespecíficas

Entre todos os loci, foi verificado um total de 71 alelos exclusivos em P. reticulatum

(A=94), 124 alelos exclusivos em P. corruscans (A=150) e 24 alelos compartilhados entre as
espécies (Tabela 1). A extensão de tamanho dos alelos foi de 99 a 306 pb em P. reticulatum e
de 69 a 433 pb em P. corruscans. Os loci Prt3, 12, 30 e 36 apresentaram as maiores
diferenças alélicas interespecíficas, sem alelos compartilhados e tamanhos que não se
sobrepuseram. Prt36 apresentou a maior diferença de tamanho alélico entre as espécies (maior
alelo de P. reticulatum=272 pb e menor alelo de P. corruscans=326 pb). A He variou de
0.530 a 0.869 em P. reticulatum e de 0.015 a 0.952 em P. corruscans (Tabela 8). Prt25
apresentou as maiores diferenças de diversidade entre as espécies, com P. reticulatum
apresentando A=17 e He=0.782, e P. corruscans com A=2 alelos e He=0.015 (Tabela 1).
O índice Fst revelou uma diferenciação altamente significativa entre as espécies para
todos os microssatélites (Fst médio= 0.35612, P=0.000). Os dados de Rst demonstraram uma
diferenciação baixa e não significativa para o locus Prt5 (P>0.05) e valores que variaram de

75
 Resultados e discussão - Capítulo 3

0.7028 a 0.9968, altamente significativos para o restante dos loci (Rst médio= 0.9008,
P=0.000) (Tabela 1).

Tabela 1. Diversidade genética por espécie, por locus e diferenciação genética entre as espécies
através dos índices de Fst e Rst.
A (Ae) Tamanho dos alelos (pb) He
Lócus Fst Rst
Pr Pc Pr Pc Pr Pc
Prt3 7 (7) 3 (3) 184-197 159-161 0.621 0.111 0.72772* 0.9968*
Prt5 16 (7) 24 (13) 219-280 221-297 0.869 0.905 0.16014* 0.0006
Prt12 7 (7) 13 (13) 272-292 296-320 0.678 0.865 0.29307* 0.9574*
Prt25 17 (15) 2 (0) 167-207 169-171 0.782 0.015 0.70195* 0.8333*
Prt27 9 (6) 31 (28) 211-233 225-293 0.530 0.952 0.22317* 0.8379*
Prt30 14 (14) 13 (13) 99-133 69-95 0.760 0.831 0.28144* 0.9116*
Prt36 10 (10) 44 (44) 232-272 326-433 0.833 0.872 0.24203* 0.9345*
Prt39 14 (5) 20 (10) 268-306 255-288 0.828 0.807 0.28284* 0.7028*
Pr: P. reticulatum, Pc: P. corruscans, A: número total de alelos, Ae: alelos exclusivos, pb: pares de bases, He:
heterozigosidade esperada. Variação significativa, *P=0.0000. Em destaque os loci diagnósticos.

As análises de AMOVA demonstraram a maior porcentagem da variaçãodentro das

populações dentro dos grupos (64.39 %, P=0.000). A variação entre as espécies foi de
33.69%, altamente significativa (P=0.000), enquanto a variação entre as populações dentro de
cada espécie foi menor, de 1.94%, porém, significativa (P<0.05) (Tabela 2).

Tabela 2. Análise de variância molecular (AMOVA) de todos os loci microssatélitesentre as espécies

P. reticulatum e P. corruscans
Porcentagem de variação
Tipo de variação Componentes de variação
(%)
Entre as espécies 1.31482 33.69*
Entre as populações dentro de cada
0.07587 1.94*
espécie
Dentro das populações 2.51446 64.39*
Variação significativa, **P=0.0000 e *P<0.05.

A análise bayesiana inicial gerada pelo programa Structure indicou K=2 grupos
correspondentes às duas espécies: P. reticulatum e P. corruscans (Figura 1). Todas as
populações de P. reticulatum foram atribuídas a um único grupo claramente distinto das
populações de P. corruscans (Figura 1). Entre todos os indivíduos de P. reticulatum, um
espécime apresentou q1=0.860 de seu genótipo atribuído a esta espécie, enquanto o restante

76
 Resultados e discussão - Capítulo 3

teve valores de q1=0.946 a 0.998 de seus genótipos atribuídos a esta classe parental (média de
q1=0.995). Para o grupo de P. corruscans os valores de atribuição dos genótipos a esta
espécie foram de q2=0.924 a 0.998 (média de q2=0.995). As populações com hibridação
apresentaram genótipos atribuídos a ambas espécies, demonstrando sinais de introgressão,
porém, sem constituir um grupo diferenciado (a atribuição de cada indivíduo das populações
de Aquidauana e Mogi-Guaçu utilizando os oito loci encontra-se nas tabelas 5 e 6,
respectivamente) (Figura 1).

100%

80%

60%

40%

20%

0%
Pr Pc Mogi Aq

Figura 1. Estrutura “bar plot” das populações, estimada pelo programa Structure utilizando oito
microssatélites. Cada cor indica um grupo com base em semelhanças genotípicas. K=2. Pr: populações
de P. reticulatum, Pc: populações de P. corruscans, Mogi: população do rio Mogi-Guaçu, Aq: população do rio
Aquidauana.

Identificação de híbridos e introgressão genética

As análises de diversidade demonstraram um número total de 58 alelos que variou de

4 a 12 alelos por locus no rio Aquidauana (Tabela 3). A He esteve entre 0.673 e 0.870, Ho
entre 0.690 e 1.000 e o tamanho dos alelos entre 69 e 381 pb. Os valores de Fis foram
negativos para 7 entre os oito loci analisados, e com excesso de heterozigotos significativo
para Prt30, 36 e 39, que estavam fora do EHW (P<0.006 após a correção de Bonferroni)
(Tabela 3). Desequilíbrio de ligamento foi verificado entre o locus Prt3 com Prt12, Prt30 e
Prt39; entre Prt27 e Prt30 e Prt39; e entre Prt36 e Prt39 (P<0.006). No rio Mogi-Guaçu foram
observados 123 alelos no total, com uma variação de 7 a 21 alelos por locus. A He variou de
0.704 até 0.947. O tamanho dos alelos esteve entre 69 e 432 pb (Tabela 3). Cinco loci
apresentaram desvios do EHW (P<0.006). Neste local todos os loci demonstraram
desequilíbrio de ligamento (P<0.006).

77
 Resultados e discussão - Capítulo 3

Tabela 3. Dados alélicos por locus para a populações dos rios Aquidauana e Mogi-Guaçu.
Lócus N A Tamanho dos alelos (pb) Ho He EHW Fis
Aquidauana
Prt3 30 4 159-195 0.800 0.693 0.668 -0.157
Prt5 28 7 248-278 0.821 0.786 0.007 -0.045
Prt12 30 6 272 – 308 0.800 0.673 0.376 -0.192
Prt25 30 5 169-183 0.900 0.708 0.218 -0.277
Prt27 29 7 211-271 0.690 0.707 0.033 0.025
Prt30 28 9 69-129 1.000 0.864 0.000* -0.160
Prt36 25 12 232-381 0.960 0.870 0.002* -0.106
Prt39 28 8 255-294 0.929 0.850 0.001* -0.094
Média 28.5 7.25 - 0.862 0.769 0.163 -0.126
Mogi-Guaçu
Prt3 41 7 159-197 0.683 0.704 0.353 0.030
Prt5 42 21 205-292 0.952 0.947 0.094 -0.006
Prt12 40 18 270-318 0.875 0.924 0.000* 0.054
Prt25 41 11 161-197 0.610 0.755 0.000* 0.194
Prt27 41 19 221-291 0.878 0.893 0.005* 0.016
Prt30 41 16 69-142 0.805 0.896 0.011 0.103
Prt36 39 20 232-432 0.795 0.911 0.002* 0.129
Prt39 42 11 261-297 0.619 0.876 0.000* 0.296
Média 40.9 15.37 - 0.777 0.863 0.058 0.102
Pr: P. reticulatum, Pc: P. corruscans, N: número de indivíduos genotipados, A: número total de alelos, Ar:
riqueza alélica, pb: pares de bases, Ho: heterozigosidade observada, He: heterozigosidade esperada. EHW: testes
de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Fis: coeficiente de endocruzamento. * P<0.006 após a correção de Bonferroni.

Os testes realizados para testar a eficácia dos marcadores na identificação das espécies
e os híbridos demontraram que, utilizando o programa Structure, a atribuição das espécies
parentais foi muito alta utilizando os oito microssatélites (q=0.995) e permitiu identificar a
ocorrência de hibridação nas populações (Figura 1, Tabela 4). A utilização de todos os
marcadores (oito microssatélites e três genes) aumentou a atribuiçao das classes parentais
(q=0.997) e a detecção da hibridação, o que pôde ser visualizado pela maior atribuição da
população de Aquidauana ao genótipo de P. corruscans. Por outro lado, a utilização apenas
dos marcadores totalmente diagnósticos entre as espécies (microssatélites Prt3, 12, 30 e 36; e
três genes), além de indicar os mesmos valores de atribuição observados utilizando todos os
marcadores (q=0.997), intensificou a detecção da introgressão de genes em Aquidauana
(Tabela 4).

78
 Resultados e discussão - Capítulo 3

Tabela 4. Atribuição média dos indivíduos de cada população aos genótipos das espécies parentais.

8 micros 8 micros, 3 genes 4 micros, 3 genes

Pop
q1 q2 q1 q2 q1 q2
Pr 0.995 0.005 0.997 0.003 0.997 0.003
Pc 0.995 0.005 0.003 0.997 0.003 0.997
Mogi 0.472 0.528 0.525 0.475 0.532 0.468
Aq 0.911 0.089 0.883 0.117 0.879 0.121
Pop: população, Pr: P. reticulatum, Pc: P. corruscans, Mogi: rio Mogi-Guaçu, Aq: rio Aquidauana, 8 micros: 8
loci microssatélite, 3 genes: marcadores dos genes conservados RAG2, EF1 e 18S, q1: genótipo atribuído à P.
reticulatum, q2: gemótipo atribuído à P. corruscans.

Na população de Aquidauana, o programa Structure indicou a presença de 13

indivíduos de P. reticulatum (3, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 22, 26 e 28) utilizando todas
as combinações de marcadores (Tabela 5). Através deste mesmo programa, os oito
microssatélites identificaram 18 P. reticulatum e 12 híbridos; com 11 marcadores (oito
microssatélites e três genes) foram identificados 17 P. reticulatum e 13 híbridos; enquanto
utilizando apenas os marcadores diagnósticos (quatro microssatélites e três genes) foram
identificados 14 P. reticulatum e 16 híbridos (Tabela 6). O programa NewHybrids, aplicado
para os genótipos com maior identificação dos híbridos (quatro microssatélites e três genes)
classificou um híbrido F1, um F2 e todos os restantes como retrocruzamentos com P.
reticulatum (RPR). Além disso, identificou o indivíduo 15 como um híbrido avançado, o qual
não havia sido identificado pelo Structure (Tabela 5).
No rio Mogi-Guaçu as análises no Structure revelaram dez indivíduos de P.
corruscans, 11 de P. reticulatume 18 híbridos através de todos os marcadores (Tabela 6).
Porém, a análise com o programa NewHybrids demonstrou a presença de uma maior
quantidade de híbridos, 21 no total (Tabela 6) e classificou quatro exemplares de RPC, dez de
RPR, cinco F1 e dois F2 (Tabela 6).

79
 Resultados e discussão - Capítulo 3

Tabela 5. Identificação dos indivíduos do rio Aquidauana através de análises bayesianas no programa
Structure e sua posterior classificação pelo NewHybrids.
q - Structure
8 micros. 4 micros. Q– NewHybrids
Indiv. 3 genes* 8 micros.
3 genes 3 genes (classe)**
q1 Pr q2 Pc q1 Pr q2 Pc q1 Pr q2 Pc
1 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.995 0.005 0.942 (Pr)
2 Pr 0.720 0.280 0.793 0.207 0.807 0.193 0.977 (RPR)
3 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.985 (Pr)
4 Ha (RPR) 0.717 0.283 0.725 0.275 0.758 0.242 0.977 (RPR)
5 Ha (RPR) 0.624 0.376 0.694 0.306 0.728 0.272 0.966 (RPR)
6 Ha (RPR) 0.940 0.060 0.778 0.222 0.705 0.295 0.969 (RPR)
7 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.989 (Pr)
8 Ha 0.986 0.014 0.939 0.061 0.881 0.119 0.993 (RPR)
9 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.978 (Pr)
10 Pr 0.964 0.036 0.926 0.074 0.997 0.003 0.985 (Pr)
11 Pr 0.996 0.004 0.994 0.006 0.997 0.003 0.965 (Pr)
12 F1 0.570 0.430 0.543 0.457 0.569 0.431 0.769 (F1)
13 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.989 (Pr)
14 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.989 (Pr)
15 Ha 0.981 0.019 0.924 0.076 0.979 0.021 0.666 (RPR)
16 Pr 0.986 0.014 0.988 0.012 0.997 0.003 0.965 (Pr)
17 Ha (RPR) 0.819 0.181 0.806 0.194 0.849 0.151 0.988 (RPR)
18 Ha 0.693 0.307 0.726 0.274 0.645 0.355 0.712 (F2)
19 Pr 0.874 0.126 0.916 0.084 0.853 0.147 0.548 (RPR)
20 Ha 0.941 0.059 0.839 0.161 0.877 0.123 0.988 (RPR)
21 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.989 (Pr)
22 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.989 (Pr)
23 Ha (RPR) 0.916 0.084 0.861 0.139 0.791 0.209 0.988 (RPR)
24 Ha 0.852 0.148 0.821 0.179 0.860 0.140 0.991 (RPR)
25 F1 0.960 0.040 0.758 0.242 0.649 0.351 0.956 (RPR)
26 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.992 (Pr)
27 Ha (RPR) 0.847 0.153 0.735 0.265 0.771 0.229 0.983 (RPR)
28 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.978 (Pr)
29 Ha 0.990 0.010 0.900 0.100 0.897 0.103 0.987 (RPR)
30 Ha (RPR) 0.989 0.011 0.836 0.164 0.805 0.195 0.988 (RPR)
Total*** 15 Pr, 15 H 18Pr, 12H 17Pr, 13H 14 Pr, 16H 13 Pr, 17H
*Dados de Prado et al. (Capítulo 1) utilizando 3 genes RAG2, EF1 e 18S,micros.: microssatélites, **Análises
utilizando 4 micros. e 3 genes, Pr: P. reticulatum, Pc: P. corruscans, HA: híbrido avançado, F1: primeira geração
híbrida, F2: segunda geração híbrida, RPR, retrocruzamentos com P. reticulatum, RPC: retrocruzamentos com P.
corruscans. ***IC= 90% para o programa Structure. Em negrito e sublinhado os indivíduos identificados como
híbridos.

80
 Resultados e discussão - Capítulo 3

Tabela 6. Identificação dos indivíduos do rio Mogi-Guaçu através de análises bayesianas no programa
Structure e sua posterior classificação pelo NewHybrids.
q - Structure
8 micros. 4 micros. Q - NewHybrids
Indiv. 3 genes* 8 micros.
3 genes* 3 genes (classe)**
q1 Pr q2 Pc q1 Pr q2 Pc q1 Pr q2 Pc
1 Ha 0.244 0.756 0.170 0.830 0.139 0.861 0.953 (RPC)
2 Pc 0.003 0.997 0.002 0.998 0.003 0.997 0.997 (Pc)
3 Pc 0.002 0.998 0.002 0.998 0.003 0.997 0.996 (Pc)
4 Ha 0.146 0.854 0.187 0.813 0.136 0.864 0.951 (RPC)
5 Pc 0.002 0.998 0.002 0.998 0.003 0.997 0.996 (Pc)
6 Pc 0.003 0.997 0.002 0.998 0.003 0.997 0.996 (Pc)
7 F1 0.553 0.447 0.540 0.460 0.572 0.428 0.912 (RPR)
8 F1 0.482 0.518 0.487 0.513 0.503 0.497 0.946 (F1)
9 F1 0.473 0.527 0.478 0.522 0.503 0.497 0.946 (F1)
10 F1 0.553 0.447 0.537 0.463 0.498 0.502 0.900 (F1)
11 Pc 0.243 0.757 0.171 0.829 0.138 0.862 0.953 (RPC)
12 Ha (RPR) 0.496 0.504 0.551 0.449 0.571 0.429 0.886 (RPR)
13 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.992 (Pr)
14 Pr 0.998 0.002 0.998 0.002 0.997 0.003 0.992 (Pr)
15 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.996 0.004 0.991 (Pr)
16 Pr 0.996 0.004 0.996 0.004 0.995 0.005 0.983 (Pr)
17 Ha 0.979 0.021 0.934 0.066 0.981 0.019 0.586 (RPR)
18 Ha (RPR) 0.470 0.530 0.577 0.423 0.574 0.426 0.928 (F2)
19 F1 0.585 0.415 0.558 0.442 0.571 0.429 0.911 (RPR)
20 Pr 0.997 0.003 0.997 0.003 0.995 0.005 0.942 (Pr)
21 Pc 0.002 0.998 0.002 0.998 0.003 0.997 0.996 (Pc)
22 Pc 0.003 0.997 0.002 0.998 0.003 0.997 0.996 (Pc)
23 F1 0.512 0.488 0.504 0.496 0.503 0.497 0.899 (F1)
24 Ha 0.281 0.719 0.353 0.647 0.434 0.566 0.992 (F2)
25 Ha (RPR) 0.998 0.002 0.989 0.011 0.972 0.028 0.693 (RPR)
26 Pc 0.028 0.972 0.024 0.976 0.063 0.937 0.831 (RPC)
27 Pc 0.003 0.997 0.002 0.998 0.003 0.997 0.997 (Pc)
28 Pc 0.003 0.997 0.002 0.998 0.003 0.997 0.993 (Pc)
29 Pc 0.002 0.998 0.002 0.998 0.003 0.997 0.993 (Pc)
30 Pc 0.003 0.997 0.002 0.998 0.003 0.997 0.996 (Pc)
31 Pr 0.996 0.004 0.997 0.003 0.996 0.004 0.970 (Pr)
32 Ha (RPR) 0.687 0.313 0.724 0.276 0.719 0.281 0.977 (RPR)
33 Ha (RPR) 0.690 0.310 0.722 0.278 0.721 0.279 0.977 (RPR)
34 Pr 0.989 0.011 0.992 0.008 0.997 0.003 0.992 (Pr)
35 Ha (RPR) 0.505 0.495 0.555 0.445 0.626 0.374 0.930 (RPR)
36 Pr 0.992 0.008 0.996 0.004 0.995 0.005 0.942 (Pr)
37 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.992 (Pr)
38 F1 0.553 0.447 0.530 0.470 0.505 0.495 0.945 (F1)
39 Ha (RPR) 0.445 0.555 0.509 0.491 0.572 0.428 0.886 (RPR)
40 Pr 0.997 0.003 0.998 0.002 0.997 0.003 0.992 (Pr)
41 Pr 0.998 0.002 0.998 0.002 0.997 0.003 0.992 (Pr)
42 Ha (RPR) 0.444 0.556 0.509 0.491 0.572 0.428 0.886 (RPR)
43 Pr 0.984 0.016 0.991 0.009 0.996 0.004 0.991 (Pr)
12 Pr, 12Pc, 19
Total*** 14Pr, 11Pc, 18H 14 Pr, 11Pc, 18H 14 Pr, 11Pc, 18H 12 Pr, 10 Pc, 21H
H
*Dados de Prado et al. (Capítulo 1) utilizando 3 genes RAG2, EF1 e 18S, micros.: microssatélites. **Análises
utilizando 4 micros. e 3 genes, Pr: P. reticulatum, Pc: P. corruscans, HA: híbrido avançado, F1: primeira geração
híbrida, F2: segunda geração híbrida, RPR, retrocruzamentos com P. reticulatum, RPC: retrocruzamentos com P.
corruscans. ***IC= 90% para o programa Structure. Em negrito e sublinhado os indivíduos identificados como
híbridos.

81
 Resultados e discussão - Capítulo 3

DISCUSSÃO

Análises interespecíficas

Um dos passos iniciais para o estabelecimento de marcadores microssatélites na

identificação de espécies é determinar a diversidade alélica e a extensão da diferenciação
entre os taxa, o que irá afetar a atribuição dos indivíduos (Roques et al., 1999). Este estudo
revelou que a análise dos genótipos através de oito microssatélites foi eficiente discriminar as
espécies P. reticulatum e P. corruscans, com apenas 24 alelos compartilhados entre as
espécies e quatro loci totalmente diagnósticos. Peixes do gênero Sebastes apresentaram 20%
dos alelos compartilhados entre as espécies e os valores de Fst variaram entre 0.088 a 0.199 e
Rst entre 0.120 e 0.486 (Roques et al., 1999). No presente estudo o Rst médio foi de 0.9008,
aproximadamente 2,5 vezes maior que o Fst médio (0.35612), o que demonstra uma maior
diferença entre os tamanhos alélicos quando comparado com as frequências alélicas. Apesar
disto, análises bayesianas para identificar hibridação utilizam, além de diferenças fixas entre
as espécies, como alelos exclusivos ou de tamanhos distintos, frequências alélicas como
componente para verificar a divergência entre os indivíduos (Pritchard et al., 2000; Anderson
e Thompson, 2002). Os valores de Fst foram altamente significativos para todos os loci neste
trabalho, o que confirma a utilidade destes marcadores para os estudos de hibridação.
Roques et al. (1999) investigaram o potencial de microssatélites para distiguir
diferentes espécies de peixes do gênero Sebastes e observaram que, apesar de não existirem
alelos diagnósticos ou exclusivos entre as espécies, a diferenciação interespecífica foi na
proporção de 10:1 (Fst) no que se refere a variação entre as espécies e entre as populações
dentro de cada espécie. As análises de AMOVA neste trabalho indicaram uma variação
altamente significativa entre as espécies (33,69%), aproximadamente na proporção de
aproximadamente 17:1 quando comparada com a variação entre as populações de cada
espécie (1,94%). Assim como o verificado por Roques et al. (1999), estes dados indicam que
a acumulação de mutações contribuiu mais substancialmente para a diferenciação entre as
espécies quando comparada com a diferenciação entre as populações dentro de cada espécie.
Diversos estudos tem utilizado microssatélites com eficácia para investigar a
hibridação em estoques selvagens, demonstrando diferenças alélicas entre espécies próximas.
Dubut et al. (2010) distinguiram espécies de Ciprinídeos através de análises bayesianas com
uma atribuição correta de 97% a 99%, tanto utilizando 23 como 42 loci. Em outro estudo com

82
 Resultados e discussão - Capítulo 3

estas espécies, o Fst foi entre 0.5 e 0.16 utilizando cinco microssatélites (Demandt e Bergek,
2009). Uma análise da hibridação entre espécies de lobo e cão doméstico utilizando 15
microssatélites demonstrou valores médios de Fst=0.05 e Rst=0.36, enquanto as análises de
atribuição pelo programa Structure demonstraram q médio de 0.8 (Khosravi et al., 2013). Um
estudo com P. corruscans, utilizando microssatélites distintos dos utilizados neste trabalho
(Revaldaves et al., 2005), demonstraram uma identificação eficiente entre esta espécie e P.
reticulatum, com 98 e 89 % de atribuição correta dos taxa, respectivamente Carvalho et al.
(2013).
Estes resultados, quando comparados com o observado neste estudo demontram que os
microssatélites aqui utilizados apresentaram uma alta diferenciação entre as espécies, o que
foi confirmado através do programa Structure, que identificou 2 grupos distintos
correspondentes à cada uma das espécies com 100% de atribuição correta de P. corruscans e
apenas um entre os 202 indivíduos de P. reticulatum com atribuição menor que 95 % ao seu
taxa (99.5 % de identificação correta).

Identificação de híbridos e introgressão genética

Além de marcadores moleculares que distingam espécies parentais e permitam a

identificação de híbridos, dados genético-populacionais resultantes de genótipos multialélicos
como os microssatélites podem demonstrar importantes características populacionais que
indiquem hibridação no ambiente selvagem. Populações com ocorrência de introgressão
genética podem apresentar um aumento da diversidade genética resultante da presença de
novos alelos de duas espécies distintas, levando a um aumento de heterozigotos na população
(Arnold e Martin, 2009). A população de Aquidauana, analisada neste estudo, apresentou uma
maior diversidade quando comparada com a espécie P. reticulatum, e os valores de Fis foram
negativos para sete entre os oito loci analisados, entre os quais, três apresentaram desvios
significativos do EHW. Valores negativos de Fis indicam um excesso de heterozigotos
(Wright, 1978), o que pode ser decorrente de hibridação introgressiva entre as espécies P.
reticulatum e P. corruscans nesta localidade. Além disso, dados sugerem que quando o fluxo
gênico e a introgressão não ocorreram por tempo suficiente para homogeneizar as diferenças
entre os loci, pode resultar em um excesso de heterozigotos (Haas et al., 2009), como o
verificado no rio Aquidauana, demonstrando que retrocruzamentos relativamente recentes
podem ter ocorrido nesta população.

83
 Resultados e discussão - Capítulo 3

Na população de Mogi-Guaçu, a diversidade média entre todos os loci também foi

maior do que o observado em ambas as espécies parentais, o que também pode ser resultado
da mistura de alelos interespécies e híbridos F1 heterozigotos na amostra. Apesar disto, o Fis
médio indicou positivo. Os desvios do EHW e o excesso de homozigotos observados podem
estar relacionados com a ocorrência de ambas as espécies parentais nesta localidade. Como
estas espécies foram introduzidas neste rio (Meschiatti e Arcifa, 2009; Prado et al., Capítulo
1), é provável que sejam provenientes de cultivo e possuam alta endogamia e excesso de
homozigotos.
Em relação ao tamanho dos alelos foi interessante verificar neste estudo que em ambas
as populações com hibridação a variação do tamanho entre todos os loci abrangeu alelos das
duas espécies parentais (A=69 a 381 pb no rio Aquidauana; 69 a 432 pb no rio Mogi-Guaçu)
quando comparados com a variação de A=99 a 306 pb para P. reticulatum e 69 a 433 pb para
P. corruscans. Estes dados confirmam a presença de híbridos nestes locais.
A distribuição de desequilíbrio de ligamento entre pares de loci (DL) é útil para
descrever a distribuição dos genótipos híbridos e para estimar a “idade" da população
hibridizada (Allendorf et al., 2010). Populações com ocorrência de hibridação recente irão
apresentar DL para a maioria das associações entre os loci, uma vez que irá conter espécies
parentais e muitos híbridos F1. Em contraste, os genótipos serão randomicamente associados
entre os loci em populações com alta hibridação ("hybrid swarms") onde a introgressão tenha
ocorrido por muitas gerações. Isto irá ocorrer rapidamente para loci não ligados fisicamente,
pois o DL irá decair pela metade em cada geração (Allendorf et al., 2010). Neste estudo, DL
foi verificado entre poucas combinações de loci no rio Aquidauana, o que indica que alguns
microssatélites restauraram o equilíbrio após algumas gerações e a hibridação nesta população
(apesar de recente o suficiente para não ter restaurado o equilíbrio de HW), possivelmente
ocorreu há algumas gerações atrás. No rio Mogi, por outro lado, foram observados DL entre
todas as combinações para todos os loci, resultante da presença de ambas as espécies
parentais, híbridos F1 e retrocruzamentos neste rio, confirmados neste estudo e em trabalhos
anteriores (Prado et al., Capítulo 1).
O programa Structure, em amostras com mistura genética, assumindo que k=2, isto é,
duas populações parentais de referência, infere que existem duas populações (ou espécies)
contribuindo para o pool gênico da amostra, e assume que cada indivíduo herdou uma fração
do seu genoma (q) do genoma de seus ancestrais na população K (Pritchard et al., 2000; Sanz
et al., 2009; Vähä e Primmer, 2006). Híbridos F1 podem ser identificados, por exemplo, por

84
 Resultados e discussão - Capítulo 3

serem intermediários em certo grau entre os dois clusters em termos do valor de q, isto é,
provavelmente apresentarão q=0.5. Este programa permitiu identificar a maioria das amostras
analisadas neste estudo. Em comparação com trabalho anterior utilizando três genes nucleares
(Prado et al., Capítulo 1), os microssatélites identificaram todos os indivíduos no rio Mogi
Guaçu e 12 entre 15 híbridos no rio Aquidauana, indicando uma alta eficácia.
Estudos simulados demonstram uma diferença significativa na detecção de híbridos de
acordo com a presença ou não de introgressão genética avançada e de acordo com a
frequência de híbridos na população. Em casos onde existem poucos híbridos F1 na amostra
(1 %, por exemplo) e alta introgressão, pode ser muito difícil identificar os indivíduos, mesmo
dispondo de diversos marcadores nucleares (Sanz et al., 2009; Vähä e Primmer, 2006). Como
em ambas as populações analisadas neste trabalho ocorre introgressão, e especialmente em
Aquidauana os níveis de introgressão são altos, teoricamente, todos os indivíduos podem
corresponder a retrocruzamentos avançados com uma grande variação de genótipos, o que
dificultou a identificação de alguns indivíduos.
Apesar disto, os resultados demonstram que os microssatélites aqui utilizados são
extremamente úteis e informativos no estudo da hibridação neste grupo dos peixes. Além de
diferenciar as espécies e híbridos, estes marcadores neutros disponibilizaram informações
populacionais importantes, como valores de He, desvios do EHW e desequilíbrio de
ligamento, que representam indicadores de desequilíbrios populacionais causados pela
hibridação (Haas et al., 2009). Uma outra utilidade dos microssatélites é, além da detecção da
hibridação, integrar análises de diversidade e estruturação genética, possibilitando uma
análise mais completa e dinâmica das populações naturais (Dubut et al., 2010; Prado et al., in
press). Além disso, microssatélites com diferenças bem estabelecidas entre as espécies, como
os loci analisados neste estudo, podem ser úteis para identificar a origem de peixes selvagens
e cultivados, monitorar escapes e realizar estudos de parentesco (Zhang et al., 2013), o que
não seria possível através de marcadores sem variação intraindividual.

Testes dos marcadores para a identificação individual

Em casos de alta mistura genética entre as espécies, e quando é necessária maior

acuracidade e certeza da identificação individual, como por exemplo, para a remoção dos
híbridos em projetos de conservação ou manejo em aquicultura (Toledo-Filho et al.,
1994;1998; Allendorf et al., 2010), ou em projetos de pesquisa onde não possam ser utilizados

85
 Resultados e discussão - Capítulo 3

híbridos, a identificação equivocada dos exemplares pode causar problemas. Neste trabalho, o
uso de todos os microssatélites em conjunto com os genes diagnósticos (11 marcadores) foi
eficaz, porém, não identificou alguns híbridos quando comparado com a utilização dos
marcadores diagnósticos e teve resultados quase idênticos à utilização apenas dos
microssatélites. Assim, a aplicação de todos estes marcadores seria um gasto de tempo e
reagentes desnecessários. Já a utilização dos microssatélites diagnósticos (Prt3, 12, 30 e 36) e
dos genes RAG2, EF1 e 18S parece ser a melhor opção para a identificação individual, que
permitiu identificar uma maior quantidade de híbridos nas amostras. O programa NewHybrids
foi muito importante, pois além de classificar os híbridos em sua maioria com alta
probabilidade, identificou alguns híbridos não identificados pelo Structure. Quando
comparado com Prado et al. (Capítulo 1), este programa permitiu classificar uma maior
quantidade de híbridos avançados no rio Aquidauana, demonstrando que a introgressão
genética é maior do que o esperado. Além disso, no rio Mogi-Guaçu foram identificados
retrocruzamentos com a espécie P. corruscans, o que não havia sido relatado anteriormente.
Vähä e Primmer (2006) assessaram a performance de métodos bayesianos para
detectar híbridos F1 e retrocruzamentos utilizando diferentes níveis de divergência genética
entre as espécies parentais (Fst= 0.03, 0.06, 0.12 ou 0.21) e aplicando vários números de loci
microssatélites (6, 12, 24 ou 48). Os autores verificaram que o número de marcadores para
detectar os indivíduos híbridos aumentou conforme os níveis de divergência entre as espécies
diminuiu. Com relativa baixa diferenciação entre as espécies parentais (Fst= 0.03 a 0.06) os
híbridos F1 puderam ser distinguidos com eficiência, porém um maior número de marcadores
foi necessário. Roques et al (1999) demonstraram que utilizando de oito a dez loci, a
atribuição variou de 87 a 100%, enquanto utilizando os quatro microssatélites com maiores
diferenças entre as espécies, a atribuição geral foi de 95%.
Neste estudo, a utilização dos microssatélites diagnósticos e dos genes nucleares, por
sua alta divergência entre P. corruscans e P. reticulatum, demonstrou ser altamente eficaz
para identificar os exemplares. Em análises com truta por exemplo, foram utilizados
microssatélites para análises populacionais, porém, como existe hibridação entre espécimes de
cultivo e selvagens, e o interesse é utilizar apenas indivíduos selvagens, os autores
complementam as análises com o marcador nuclear diagnóstico"LDH-C*90"(Vilas et al.,
2010).
No presente trabalho, todos os marcadores utilizados e testados permitiram a
identificação dos híbridos entre P. corruscans e P. reticulatum. As análises bayesianas

86
 Resultados e discussão - Capítulo 3

também foram eficientes para atribuir os indivíduos ao seu grupo correspondente, parental ou
híbrido. Assim, a escolha de cada tipo ou combinação de marcadores nucleares vai depender
do objetivo de cada estudo, da quantidade de introgressão nas populações a serem estudadas e
disponibilidade de tempo, custo e reagentes. Em casos de análises genético populacionais os
microssatélites aqui aplicados podem disponibilizar informações valiosas sobre a hibridação e
introgressão genética. Quando os objetivos forem a identificação de peixes provenientes de
cultivo, amostras comercializadas ou projetos de conservação que requeiram uma alta
acuracidade de identificação individual, pode ser mais adequado a utilização dos
microssatélites e genes diagnósticos.

87
 Considerações finais

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este trabalho disponibiliza uma gama de marcadores genéticos para serem aplicados
em estudos genético populacionais e de hibridação em populações de P. reticulatum e P.
corruscans. Os marcadores dos genes nucleares EF1 e 18S consitiram em marcadores úteis
para a identificação destas espécies e seus híbridos, sem variação intraespecífica. Já os 16
microssatélites desenvolvidos e caracterizados para a espécie P. reticulatum, com
amplificação cruzada 100% eficaz em P. corruscans, e amplificados através de dois PCR-
multiplex, permitiram obter a genotipagem destes loci nestas espécies de maneira rápida e
eficaz.
Os estudos populacionais demonstraram importantes dados de diversidade e
diferenciação genética nas populações de P. reticulatum e P. corruscans, além de diferentes
cenários de diferenciação populacional entre as espécies, os quais podem estar relacionados à
distintos comportamentos migratórios.
A avaliação genética da hibridação nas populações destas espécies demonstrou que
possivelmente a hibridação natural entre estas espécies é rara. A presença de híbridos F1 e
híbridos avançados foi observada em três rios, demonstrando que ocorre contaminação
genética do ambiente selvagem, possivelmente devido à escapes e introduções de
pisciculturas. Esta etapa do trabalho representou a primeira documentação de introgressão
genética entre estas espécies em suas populações naturais.
Posteriormente, os microssatélites demonstraram alta divergência genética entre P.
reticulatum e P. corruscans, tanto no tamanho como variação alélica, e foram eficientes para
a identificação de híbridos e introgressão genética. Além disso, podem fornecer importantes
dados genético-populacionais que indiquem a ocorrência de hibridação nas populações
naturais, constituindo marcadores genéticos flexíveis para serem utilizados em estudos que
integrem a obtenção de dados de diversidade, estruturação e hibridação. Os testes realizados
também indicaram que a utilização dos microssatélites totalmente diagnósticos em conjunto
com marcadores de genes nucleares pode ser a metodologia mais precisa na identificação
individual.
Os dados deste estudo, relacionados com a hibridação, diversidade e estruturação
genética destas espécies representam informações importantes para um futuro monitoramento
genético das populações naturais, para a aplicação de metodologias genéticas na aquicultura e
no estabelecimento de políticas de conservação das espécies parentais.

88
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Aquaculture Research, 2013, 44, 876–884 doi:10.1111/j.1365-2109.2012.03092.x

Detection of post-F1 fish hybrids in broodstock using

molecular markers: approaches for genetic
management in aquaculture

Diogo Teruo Hashimoto1, Fernanda Dotti do Prado1, José Augusto Senhorini2,

Fausto Foresti3 & Fábio Porto-Foresti1
1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de
Bauru, Bauru, Brazil
2
Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, CEPTA/ICMBio, Pirassununga, Brazil
3
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, Brazil

Correspondence: F Porto-Foresti, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista
(UNESP), CEP 17033-360, Bauru, SP, Brazil. E-mail: fpforesti@fc.unesp.br

(Lundberg & Littmann 2003). Pseudoplatystoma is

Abstract
one of the more economically important groups of
Herein, we have developed molecular markers for the family Pimelodidae. Due to their flesh quality,
nuclear genes to use in multiplex-PCR and PCR- large size and significance in sport fishing and his-
RFLP, with the goal of characterising hybrid lines torical fishery production in their regions of occur-
derived from crosses between pintado Pseudoplatys- rence, species of Pseudoplatystoma are important
toma corruscans and cachara P. reticulatum. These resources for Brazilian aquaculture (Campos
markers, together with others described previously, 2010).
were used to perform molecular identification The hybrids generated by crosses between pinta-
analyses as genetic subsidies for Brazilian aquacul- do Pseudoplatystoma corruscans (Spix & Agassiz)
ture. These analyses were performed due to the and cachara Pseudoplatystoma reticulatum Eigen-
problems of high mortality in the offspring mann & Eigenmann, popularly known as ‘Ponto-
reported by the aquaculturist. From a total of 16 e-vı́rgula’ or ‘Cachapinta’, are the fish most often
broodstock samples, 13 were genetically identified produced by several producers who work with
as hybrids; surprisingly, nine of these hybrids were juveniles of these species; the pure species are
found to be post-F1 lineages. These data show that rarely commercialized (Campos 2010). The hybrids
the fertility of these animals can seriously affect exhibit better growth performance than the pure
the cultivated stocks, thus causing financial dam- species (Crepaldi, Faria, Teixeira, Ribeiro, Costa,
age in this aquaculture system. The establishment Melo, Cintra, Prado, Costa, Drumond, Lopes &
of PCR-RFLP and multiplex-PCR as molecular Moraes 2006). However, there is an enormous
techniques allows for both the correct manage- lack of information about trade and production of
ment of these animals and the routine monitoring these fish, and the majority of juveniles commer-
of production and trade of fish hybrids in aquacul- cialized in Brazil as pintado (P. corruscans) actually
ture. Consequently, such tools will enable a sus- correspond to hybrid products. In addition, these
tainable development in the aquaculture industry. hybrids are fertile and can backcross with their
parental species (J. A. Senhorini, pers. comm.),
Keywords: genetic identification, sustainable which demonstrates that the marketing and man-
development, hybridization, Pseudoplatystoma agement of the ‘Ponto-e-vı́rgula’ hybrids should
receive special attention, mainly due to the threat
that they pose to the cultivated stocks and because
Introduction
they are sold commercially as parental species.
Pimelodid species are currently placed among 30 Therefore, the methods of identification of these
genera and are endemic to the neotropics interspecific hybrids should be routinely employed

876 © 2012 Blackwell Publishing Ltd

Aquaculture Research, 2013, 44, 876–884 Genetic management of hybrids in aquaculture D T Hashimoto et al.

in Brazil; this will allow for proper monitoring and specimens of P. reticulatum were genetically analy-
management in aquaculture. Several studies iden- sed. For the interspecific hybrid lines, we analysed
tify fish hybrids based on morphological or meristic 30 specimens of ‘Pintachara’ (crosses using
characteristics without any inference from genetic P. corruscans as females and P. reticulatum as
markers (Scribner, Page & Bartron 2001). The iden- males) and 30 specimens of ‘Cachapinta’ (crosses
tification of hybrids obtained through the external using P. reticulatum as females and P. corruscans
morphology is considered unreliable when it is used as males). All samples were obtained from the
as the only source for analysis (Chevassus 1983; stocks maintained at the CEPTA/ICMBio (Centro
Mallet 2005), particularly for estimating introgres- Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes
sion events that should be assessed via examination Continentais, Pirassununga, São Paulo State,
of multiple loci (Boecklen & Howard 1997). Brazil), where the hybrids were produced. The fish
Interest in the genetic identification of interspe- specimens used in this study were identified and
cific hybrids combined with recent advances in stored in the collection of the Laboratory of Fish
molecular technology has provided a considerable Genetics, UNESP, Bauru (São Paulo State), Brazil.
variety of genetic markers, which allow for the To perform the analysis of molecular identifica-
correct identification of hybrids (Scribner et al. tion in a broodstock belonging to an important
2001). The techniques of polymerase chain reac- Brazilian fish farm, we collected biological samples
tion – restriction fragment length polymorphism (fin fragments) from 16 individuals. According
(PCR-RFLP) and multiplex-PCR are efficient meth- to the personal classification of the fish farmer,
odologies that can be quickly and inexpensively the samples were identified morphologically as
executed and would allow for diagnoses based cachara (P. reticulatum), pintado (P. corruscans)
upon single nucleotide variations (Hashimoto, and hybrids, which were derived from crosses
Mendonça, Senhorini, Bortolozzi, Oliveira, Foresti between these two species. These analyses were
& Porto-Foresti 2010). Recently, using these meth- performed due to problems with high mortality
odologies, molecular markers based on the mito- and low viability in the offspring, as well as diffi-
chondrial gene 16S and the nuclear gene RAG2 culty in spawning the broodstock, according to
(recombination activating gene 2) were developed for reports of the producer. These problems were ini-
the identification of hybrids between P. corruscans tially attributed to the genetic integrity of the
and P. reticulatum (Prado, Hashimoto, Mendonça, broodstock, and we raised the issue that the
Senhorini, Foresti & Porto-Foresti 2011). breeding stock may be composed of hybrid lines.
According to Prado et al. (2011), it is not possi- The animals were marked with tags (magnetic
ble to diagnose post-F1 lineages involving these markers) and maintained by fish farming. When
hybrids, because only one nuclear marker (RAG2 necessary, these animals were identified with
gene) was established. For the identification of reader equipment, which provided a means by
post-F1 hybrids with statistical confidence, at least which the aquaculturist could identify the ideal
four nuclear markers are required (Boecklen & crosses.
Howard 1997; Docker, Dale & Heath 2003). Thus,
we describe PCR-RFLP and multiplex-PCR proto-
Characterisation of the molecular markers
cols here to differentiate between the neotropical
species P. corruscans and P. reticulatum and to add Sequences of nuclear genes encoding elongation fac-
new nuclear markers for the identification of tor 1-alpha (EF1a), b-globin (GLOB) and ribosomal
hybrids, especially post-F1 lineages. We have uti- RNA 18S (rRNA 18S) (GenBank accession num-
lized these methods to demonstrate the efficiency bers JF834080 to JF834109) were obtained using
of genetic markers for the evaluation of genetic the primer pairs described in the Table 1. The
integrity in a broodstock from a Brazilian fish farm application of the rRNA 18S gene can have some
and to report the uncontrolled management of fish limitations for species identification, because this
hybrids in the aquaculture industry. gene family shows a complex organization with
the presence of paralogous copies in the genome of
some species (Carranza, Baguñà & Riutort 1999;
Materials and methods
Barthélémy, Grino, Pontarotti, Casanova & Faure
To characterize molecular markers for the parental 2007). However, we did not detect rDNA 18S
lineages, 20 specimens of P. corruscans and 20 variants or alleles within the same species,

© 2012 Blackwell Publishing Ltd, Aquaculture Research, 44, 876–884 877

Genetic management of hybrids in aquaculture D T Hashimoto et al. Aquaculture Research, 2013, 44, 876–884

Table 1 Sequences of the primers and sizes of the PCR products or restriction fragments

Fragment size (bp)

Method Gene Primer (5′ to 3′) Pr Pc

PCR-RFLP GLOB GLOB SiluF (TCAATATGGTTCACTGGACAGA) 569 186 and 381

GLOB SiluR (CCAAGAAGCTGAAAGTAGACAGT)
EF1a *
EF1a F (ATTGGAACTGTACCTGTGG) 240, 270 and 290 240 and 560
*
EF1a R (CAGCCTTCTGTGCAGACTT)
†
18S 18S NS1 (GTAGTCATATGCTTGTCTC) 350 163 and 187
18S SiluR (CCATCGAAAAGTTGATAGGG)
Multiplex-PCR GLOB GLOB PcR (CAGCCACCTTGGGGTTTCCT) 569 and 137 569 and 304
GLOB PrF (GGTACGTCTAATCTCAGTAATTGAAA)
EF1a EF1a PcR (CAACAATGGCAGCATCTCCT) 800 and 630 800 and 520
EF1a PrR (ATAAAGGACAAGGACAAGATCG)

*Moyer, Burr and Krajewski (2004).

†White, Bruns, Lee and Taylor (1990).
Underlined, primers used for initial amplification and sequencing; Bold, primers used for multiplex-PCR; Pc, Pseudoplatystoma corrus-
cans; Pr, Pseudoplatystoma reticulatum.

allowing the precise identification of the Pseudopla- identification of enzymes capable of producing
tystoma species. species-specific cuts, and thus generating diagnos-
Amplifications were performed using PCR in a tic cleavage patterns. In multiplex-PCR, species-
total volume of 25 lL with 200 lM of each dNTP specific primers need to be designed nested within
(dATP, dTTP, dGTP and dCTP), 1.5 mM MgCl2, the universal primers to produce fragments of dif-
19 Taq DNA buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.4 and ferent sizes for each species in the multiplex
50 mM KCl), 0.5 units of Taq Polymerase (Invitro- reactions.
gen, Life Technologies, São Paulo, Brazil), 0.1 lM Restriction maps were analysed using NEBcutter
of each universal primer and 10–50 ng of geno- software, version 2.0 (Vincze, Posfai & Roberts
mic DNA. The reactions were performed for 35 2003). PCR products were digested via restriction
cycles under the following conditions: for EF1a, enzymes in a final volume of 8 lL containing 4 lL
30 s at 95°C, 30 s at 58°C and 45 s at 72°C; for of the PCR product, 19 enzyme buffer and 5 U of
GLOB, 30 s at 95°C, 30 s at 60°C and 30 s at restriction enzyme (10 U lL 1) (New England
72°C; and for rRNA 18S, 30 s at 95°C, 30 s at Biolabs, Uniscience, São Paulo, Brazil). Reactions
50°C and 10 s at 72°C. DNA sequences were were incubated at the ideal temperature of each
analysed on an ABI PrismTM 3730 DNA Analyser enzyme for 1 h.
using the BigDye® Terminator v3.1 Cycle Primer conditions were analysed using
Sequencing Kit (Applied Biosystems, Life Technolo- NetPrimer software, which is available at the PRE-
gies, São Paulo, Brazil). The gene sequences from MIER Biosoft International site <http://www.premier
five individuals of each parental species were biosoft.com/netprimer>. Primers were selected on
sequenced twice on both strands and aligned polymorphic sites between the parental species
using ClustalW (Thompson, Higgins & Gibson and in the presence of mutations located at the
1994). The Kimura 2-parameter distance was esti- 3′ end of the annealing site, as it is based on the
mated using MEGA software, version 4.0 (Tamura, principle that the Taq polymerase has 5′ to 3′ exo-
Dudley, Nei & Kumar 2007). nuclease activity, and therefore, the mismatch
To identify interspecific hybrids routinely in the between the 3′ end of the primer and the DNA
Brazilian aquaculture, we established two types of template results in the difficulty of amplification
molecular markers, PCR-RFLP and PCR-Multiplex, (Rychlik 1995). DNA fragment sizes were deter-
which are considered reliable and straightforward mined by electrophoresis on 1.5% agarose gels
techniques to detect hybridization events (Hashimoto, stained with ethidium bromide (1 ng mL 1) and
Mendonça, Senhorini, Oliveira, Foresti & Porto- visualized under UV illumination. Images were
Foresti 2011). In the method of PCR-RFLP, the captured using a digital camera (Olympus CAME-
strategy is developing restriction maps for the DIA C-5060, 5.1 Megapixel, São Paulo, Brazil).

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Aquaculture Research, 2013, 44, 876–884 Genetic management of hybrids in aquaculture D T Hashimoto et al.

detected for the analysed loci, demonstrating that

Molecular identification of the breeding stock
both genes were conserved.
For the purpose of evaluating the genetic integ- After restriction maps analysis, to standardize
rity of the breeding stock, sample identification the methodology of PCR-RFLP, we used the
was initially performed using multiplex-PCR with enzyme HpyAV, which cleaves only in the GLOB
the genes defined in this study together with gene segment of P. corruscans. For the enzymatic
markers for the mitochondrial 16S and nuclear digestion of the EF1a gene, we utilized the enzyme
RAG2 genes (Prado et al. 2011). Subsequently, to BpmI, which cleaves once in EF1a of P. corruscans
confirm the results, we performed PCR-RFLP and twice in EF1a of P. reticulatum. Finally, for
analyses with the same genes. In all of the multi- RFLP analysis of the 18S gene, we selected the
plex-PCR and PCR-RFLP assays performed at this enzyme SmaI because its restriction site is
stage of analysis, we used DNA samples from the restricted to the 18S gene of P. corruscans. In the
pure parental species as controls for reaction three analysed genes, after digestion of the PCR
specificity. products by the selected enzymes, the results of
Using four nuclear loci as diagnostic tool for the the electrophoresis revealed distinct profiles of
molecular differentiation of backcrossed individuals diagnostic fragments for each of the parental spe-
(F1 9 Parental), the probability of correct identifi- cies (Fig. 1 and Table 1). In the hybrid individuals,
cation of animals belonging to post-F1 lineages is heterozygous patterns were observed due to the
87.5%. On the other hand, in intercrosses between diagnostic bands inherited from each parental spe-
F1 hybrid lines (F1 9 F1), the probability of iden- cies (Fig. 1).
tification is approximately 93% (Toledo-Filho, To produce fragments of different sizes using
Almeida-Toledo, Foresti, Bernardino & Calcagnotto multiplex-PCR, primers for each parental species
1994). Therefore, the use of four nuclear genes were designed in opposite directions (reverse and
(RAG2, EF1a, GLOB and 18S) together with forward) for the GLOB gene. The primer GLOB PcR
mtDNA marker provides a reliable approach for (reverse) was positioned on two mutations, and
the identification of post-F1 individuals, as pro- thus was specific for P. corruscans, whereas the pri-
posed by other studies (Boecklen & Howard 1997; mer GLOB PrF (forward) was developed based on
Docker et al. 2003). three mutations and was specific for P. reticulatum
According to criteria used by previous studies (Table 1). For the EF1a gene, primers were
developed in trout (Docker et al. 2003), we classi- designed in different regions and were facing the
fied the specimens into the following four classes: reverse direction. Each primer contained a
pure P. corruscans, pure P. reticulatum, first genera- mutation; the primer EF1a PcR was exclusive for
tion cross (F1) and post-F1 backcross. Specimens P. corruscans and the primer EF1a PrR was specific
that were homozygous at all five markers for the for P. reticulatum (Table 1). We did not develop
same species were considered pure. Individuals species-specific primers for the rRNA 18S gene,
were designated as F1 if they were heterozygous because the sequences showed a low genetic diver-
at every nuclear locus regardless of the mitochon- gence and only two polymorphic sites were identi-
drial pattern. Finally, samples that were not F1 fied, and thus, these were not considered to be
crosses, but had at least one allele from each ideal regions for primer design. In the electropho-
parental species, were grouped into the category of resis analysis, multiplex-PCR of the GLOB gene
post-F1 backcross. (GLOB SiluF, GLOB SiluR, GLOB PcR and GLOB
PrF,) and EF1a gene (EF1a F, EF1a R, EF1a PcR
and EF1a PrR) demonstrated different patterns
Results
between P. corruscans and P. reticulatum (Fig. 2).
Each synthesized primer generated a fragment of a
PCR-RFLP and multiplex-PCR characterisation
distinct size (Table 1), thus producing diagnostic
Data obtained by sequencing allowed for the anal- phenotypes for each species. The hybrid individu-
ysis of 743 bp of EF1a (four polymorphic sites), als had a pattern of two diagnostic bands, which
569 bp of GLOB (eight polymorphic sites) and were inherited from each parental species (Fig. 2).
350 bp of 18S (two polymorphic sites), with a Thus, this marker can be used to distinguish the
genetic distance of 0.005, 0.014 and 0.006 hybrids from the parental species due to its hetero-
respectively. Intraspecific variability was not zygous nature.

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Genetic management of hybrids in aquaculture D T Hashimoto et al. Aquaculture Research, 2013, 44, 876–884

Figure 1 PCR-RFLP patterns of the GLOB gene digested with HpyAV (a), EF1a cleaved with BpmI (b) and 18S
digested with SmaI (c). Lanes: 1–3 Pseudoplatystoma corruscans, 4–6 ‘Pintachara’ hybrid, 7–9 ‘Cachapinta’ hybrid,
10–12 P. reticulatum; M – molecular weight marker (1 kB).

In the analysis of PCR-RFLP and multiplex-PCR, markers (RAG2, GLOB, EF1a and 18S); two sam-
the patterns obtained by these methods were fixed ples were characterized as ‘Cachapinta’, because
over all reference samples studied. However, the they inherited mtDNA (mitochondrial DNA) from
use of only 20 individuals per species does not P. reticulatum, and two specimens were character-
ensure the absence of polymorphisms in the nucle- ized as ‘Pintachara’ based on the identification of
otide positions studied or in others, which should mtDNA from P. corruscans (Table 2). Finally, only
be further evaluated. three specimens were identified as pure species,
because they were scored as the same species at
all five markers; these included two samples of
Molecular identification of the breeding stock
pure P. reticulatum and one individual of pure
In the samples of the broodstock, nine individuals P. corruscans (Table 2).
with different genotypes at any of the five markers
were identified, which clearly characterizes the
Discussion
presence of post-F1 hybrids (Table 2). Indeed, we
identified four hybrid F1 individuals because het- To apply genetic management of fish hybrids in
erozygous genotypes were observed for all nuclear Brazilian aquaculture is extremely important to

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Aquaculture Research, 2013, 44, 876–884 Genetic management of hybrids in aquaculture D T Hashimoto et al.

Figure 2 Electrophoresis analysis of multiplex-PCR products of the genes GLOB (a) and EF1a (b). Lanes: 1–3
Pseudoplatystoma corruscans, 4–6 ‘Pintachara’ hybrid, 7–9 ‘Cachapinta’ hybrid, 10–12 P. reticulatum; M – molecular
weight marker (1 kB).

Table 2 Individuals of the breeding stock identified morphologically (Phenotypes), and the molecular identification
(Genotypes) by mitochondrial and nuclear markers

16S RAG2 EF1a GLOB 18S

TAG numbers Phenotypes Pr Pc Pr Pc Pr Pc Pr Pc Pr Pc Genotypes

207671 Pintado x – x x – x x x – x Post–F1

189414 Pintado x – x x – x – x – x Post–F1
209759 Pintado x – – x x x x x – x Post–F1
228322 Pintado x – x x x x – x – x Post–F1
220165 Pintado – x x x x x x x x x ‘Pintachara’
242188 Pintado – x – x – x – x – x P. corruscans
212966 Cachara x – x – x – x – x – P. reticulatum
203582 Pintado x – x x – x x x – x Post–F1
207521 Hybrid x – x x x x x x x x ‘Cachapinta’
194799 Hybrid – x x x x x x x x x ‘Pintachara’
200159 Hybrid x – – x – x – x x x Post–F1
198501 Cachara x – x – x – x – x – P. reticulatum
210218 Hybrid – x x x – x – x – x Post–F1
189199 Hybrid – x – x x x x x – x Post–F1
240850 Hybrid x – x x – x – x x x Post–F1
201322 Hybrid x – x x x x x x x x ‘Cachapinta’

Pc, Pseudoplatystoma corruscans; Pr, Pseudoplatystoma reticulatum.

establish methodologies for identification of hybrids is important for the sustainable development of
and their respective parental species (Hashimoto aquaculture and for assessing aquaculture produc-
et al. 2010). Accurate identification of fish hybrids tion, as well as to allow a better understanding of

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Genetic management of hybrids in aquaculture D T Hashimoto et al. Aquaculture Research, 2013, 44, 876–884

biodiversity issues (Bartley et al. 2001; Hashimoto characterization, even of adult individuals, cannot
et al. 2011). As demonstrated in this study, the be considered reliable. Consequently, hybrid lin-
methods of multiplex-PCR and PCR-RFLP proved eages, especially post-F1 lineages, can be misidenti-
to be efficient tools for fast and low-cost applica- fied as pure species and erroneously used as
tions, and should be implemented routinely in fish broodstock. Similarly, such situation was detected
monitoring for the adequate management of fish in the trade of Serrasalmid juveniles because of the
hybrids in natural and cultivated stocks. The dif- particular problem of morphological identification
ference between multiplex-PCR and PCR-RFLP is of hybrid juveniles (Hashimoto et al. 2011).
that the former technique does not require the In Brazil, most aquaculture establishments are
additional time and cost of enzymatic digestion of not licensed, and there are few legal regulations
the amplified DNA; however, the primer design on aquaculture production (Suplicy 2007). In
has several limitations that should be taken into some states, such as Mato Grosso and Amapá, fish
consideration (Hashimoto et al. 2010; Prado et al. farming legislation reveals concerns about the pro-
2011). duction of hybrid juveniles, which should occur in
Currently, there is no institution that uses laboratories properly licensed for this purpose,
genetic resources to provide support to Brazilian together with reports of sanitary inspections by
fish farms for the proper management of strains competent agencies, as well as several criteria for
that have undergone genetic manipulation. the production of hybrid that must be followed.
Through genetic identification analyses performed However, these preventive regulations are not
on a Brazilian fish farm, our results show preli- adopted. The genetic tools validated in this study
minary data regarding the uncontrolled manage- could enforce national laws and regulations and
ment of interspecific hybrid of P. corruscans and support the aim of the correct handling while
P. reticulatum. The analysed broodstock was com- avoiding the introduction of hybrids into the envi-
posed mainly of hybrid individuals, which demon- ronment, which causes irreversible problems.
strated that the fertility of these animals may From an environmental and conservation per-
seriously affect cultivated stocks, as reported for spective, the problem is still considered to be
species of tilapia and carp (Mia, Taggart, Gilmour, a major one. This is because hybrids between
Gheyas, Das, Kohinoor, Rahman, Sattar, Hussain, P. corruscans and P. reticulatum have been fre-
Mazid, Penman & McAndrew 2005; Mair 2007). quently reported and detected in natural environ-
The concern is even greater because more than ments. The case that deserves special attention is
50% of this breeding stock is composed of individ- that of the Mogi Guaçu River in southeast Brazil,
uals belonging to post-F1 hybrid lineages, which reported by Prado (2010). Historically, only
causes substantial economic losses for this fish P. corruscans was represented in the fish fauna of
farm. In general, crosses involving post-F1 hybrids this river. However, in recent years, individuals
generate offspring with low viability and a high with the morphology of P. reticulatum were col-
mortality rate (Almeida-Toledo, Bernardino, Oliveira, lected that, in fact, were identified as hybrids
Foresti & Toledo-Filho 1996), which has already between these species by means of molecular anal-
been diagnosed by the fish farmer. Thus, orienta- yses. These escapes probably originated from fish
tion measures are necessary to organize a new farms; natural hybridization could not occur due
broodstock with pure species, as well as to avoid to the absence of P. reticulatum in the Mogi Guaçu
backcrosses or intercrosses and discard the hybrid River. In recent samplings, it is even more rare to
individuals whose patterns of molecular identifica- capture pure specimens of P. corruscans (J. A. Sen-
tion identify them as such, especially the post-F1 horini, pers. comm.), which provides evidence that
individuals. these animals are backcrossing with the hybrids;
It was interesting to compare the results through genetic introgression, this can lead to the
obtained by visual identification with the informa- extinction of this population of P. corruscans.
tion generated through molecular identification. As producers do not invest in pure broodstock
According to the aquaculturist, the analysed brood- samples obtained in the natural environment due
stock was composed of seven pure P. corruscans to the high price of investment, the trend has been
individuals; however, through molecular identifica- towards the continuous use of broodstock com-
tion, only one specimen was identified as pure posed of hybrid individuals. This is because breed-
P. corruscans, illustrating that simple morphological ing stocks are formed from specimens from other

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Aquaculture Research, 2013, 44, 876–884 Genetic management of hybrids in aquaculture D T Hashimoto et al.

fish farms, which generally provide hybrid samples Crepaldi D.V., Faria P.M.C., Teixeira E.A., Ribeiro L.P.,
(Hashimoto et al. 2011). Thus, due to the lack of Costa A.A.P., Melo D.C., Cintra A.P.R., Prado S.A.,
investment in a systematic genetic improvement Costa F.A.A., Drumond M.L., Lopes V.E. & Moraes V.E.
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contaminating natural stocks, mitigating actions ery supplementation of rainbow trout sympatric with
should be put in place urgently or the problems cutthroat trout. Molecular Ecology 12, 3515–3521.
with fish hybrids will not be solved. The imple- Hashimoto D.T., Mendonça F.F., Senhorini J.A., Bor-
mentation of genetic monitoring would be a useful tolozzi J., Oliveira C., Foresti F. & Porto-Foresti F.
preventive measure to avoid the widespread loss of (2010) Identification of hybrids between Neotropical
pure species in aquaculture, similar to what has fish Leporinus macrocephalus and Leporinus elongatus by
been reported for species of tilapia after their gen- PCR-RFLP and multiplex-PCR: tools for genetic moni-
eral introduction and subsequent hybridization toring in aquaculture. Aquaculture 298, 346–349.
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Development and characterization of 16 microsatellites loci for the Neotropical catfish
Pseudoplatystoma reticulatum and cross-species analysis in P. corruscans: tools for
population genetics and hybridization studies

Prado FD1, Pardo BG2, Guerra-Varela J2, Senhorini JA3, Martínez P2, Foresti F4, Porto-Foresti
F1

1
Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Faculdade de Ciências,
Departamento de Ciências Biológicas, Bauru, SP, Brazil.
2
Universidad de Santiago de Compostela, Facultad de Veterinaria, Departamento de Genética,
Lugo, Spain.
3
Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, Instituto Chico Mendes
de Conservação da Biodiversidade, Pirassununga, SP, Brazil.
4
Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências, Botucatu,
SP, Brazil.

Keywords: 454 pyrosequencing, multiplex-PCR, microssatellite, diagnostic markers,

hybridization.

Correspondence: F. Porto-Foresti, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade

Estadual Paulista, Bauru, SP, Brazil. E-mail: fpforesti@fc.unesp.br. Telephone and fax
number: +55 14 3103-6078.

Abstract

Sixteen polymorphic microsatellite primers were developed for Pseudoplatystoma reticulatum

and provided an efficient multiplex protocol to amplify these loci in just four multiplex PCRs.
A characterization of these loci in a single population demonstrated an average allele number
of 7.8 and a mean He of 0.729. The analysis of a pooled sample of individuals of P.
reticulatum demonstrated a higher allelic diversity with a mean of 10.2 alleles per locus and a
mean He of 0.769. Cross-species amplification in P. corruscans revealed 14 polymorphic and
two monomorphic loci (average of 7.4 alleles and He of 0.710 for the polymorphic loci). An
interspecific comparison allowed detecting six diagnostic microsatellites, which may be
highly valuable for the identification of these taxa and hybrids. Most microsatellites here
obtained showed moderate to high polymorphism levels, representing a useful tool for
management, conservation and hybridization studies of these Neotropical catfish.
The catfishes Pseudoplatystoma reticulatum and Pseudoplatystoma corruscans belong
to the Pimelodidae family, Siluriformes (Lundberg and Littmann 2003) and perform long
distance migrations for reproduction in the watersheds of the Amazon, Paraguay and Parana
Rivers (P. reticulatum) and San Francisco, Paraguay and Parana Rivers (P. corruscans)
(Buitrago-Suárez and Burr 2007). Despite the lack of information about their conservation
status, not included in the IUCN (International Union for Conservation of Nature), P.
corruscans was classified as critically endangered in the state of São Paulo, Brazil (Mello et
al. 2009). The continuous overfishing, together with the increasing destruction of aquatic
environments represents a crucial factor that has led to the decline of Pseudoplatystoma
populations (Carolsfeld et al. 2003). Another concerning issue for the conservation of these
species is the large-scale induced production of hybrids in fish farms, which largely exceeds
the cultivation of the pure species (Campos 2010; Porto-Foresti et al. 2010; Hashimoto et al.
2013). The hybrids can reproduce in captivity (Prado et al. 2012a) and have been detected in
natural populations, which indicates high risks of admixture and extinction of unique parental
genetic pools (Prado et al. 2012b).
In this study, we aimed to develop and characterize a set of microsatellites for P.
reticulatum and, subsequently, check the cross-species amplification and allelic
characterization in P. corruscans. We believe this is particularly important for future
applications related to population genetics, broodstock management for aquaculture and
conservation and the establishment of diagnostic microsatellites for these species and their
hybrids.
DNA was extracted from fin clips using following the commercial kit “Wizard
Genomic DNA Purification Kit” (Promega) protocols. Total genomic DNA from three
individuals of P. reticulatum was pooled for sequencing on a Roche 454 GS FLX sequencer
using the Titanium platform “Genome sequencer 20 System” (Instituto Agrobiotecnológico
de Rosário – INDEAR, Argentina). Details of the pyrosequencing procedure have been
described elsewhere (Margulies et al. 2005). Single reads were manually screened for
sequences of 150-400 bp (bases pairs) containing microsatellites, considering ≥8 repeats for
dinucleotide motifs and ≥6 for tri- tetra- and penta-nucleotide motifs. Primer pairs were
designed using Primer3 software (Rozen and Skaletsky, 2000).
For the initial characterization of the microsatellites, we studied 22 individuals of P.
reticulatum from Cuiaba River, Paraguay basin, Brazil. Moreover, aiming to get a better
representation of the genetic diversity in this species and for interespecific comparisons, we
analyzed a pooled sample of 20 individuals coming from 8 distinct populations from the same
area. Cross species amplification were conducted on 12 specimens of P. corruscans from four
different populations of Paraguay and Upper Parana basins. Multiplex PCRs (A-D, table 1)
were performed in a final volume of 10 μl containing 100 μM of each dNTP, 1.5 mM MgCl2,
1X Taq buffer, 0.5 units of Taq polymerase (Quiagen Master mix), 0.4 μM reverse primer, 0.4
μM fluorescently-labeled forward primer (Applied Biosystems) and 30 ng of genomic DNA.
Amplifications were performed in a thermal cycler VeritiTM (Applied Byosystems) for 15
min. at 95 °C followed by 30 cycles of 30 s at 94°C, 1 min at 58 °C, 1 min s at 72 °C and a
final extension of 60 °C for 30 min.
Amplification products were checked by electrophoresis on 1% agarose gel using 100
bp DNA ladder (Invitrogen) and SYBR Safe ™ (Applied Biosystems) and each multiplex
PCR was loaded separately on an automated DNA sequencer ABI prism_3730 (Applied
Biosystems). Allele sizes were scored against a GeneScan500 LIZ size standard (Applied
Biosystems) using Gene Mapper 3.7 (Applied Biosystems). Micro-checker 2.2.3 (Van
Oosterhout et al. 2004) was employed to check the presence of null alleles and genotyping
errors. Cervus 3.0 (Marshall et al. 1998) was used to estimate genetic diversity: number and
size range of alleles, expected (He) and observed (Ho) heterozygosities. Genepop 3.4
(Raymond and Rousset 1995) was used to test for deviations from HWE (Hardy Weinberg
Equilibrium). Significance values (P=0.05) were adjusted by the Bonferroni correction (Rice
1989).
The first characterization of the loci in P. reticulatum showed 3 to 12 alleles (mean
7.8) and He ranging from 0.498 to 0.885 (mean=0.728) (Table 1). Prt37 presented significant
deviations from HWE (P<0.0032) and Microchecker software suggested the presence of null
alleles for this loci and Prt3, reflected by a homozygote excess. Analisys including all
individuals of this species showed a mean A=10.2 and He=0.771 (Table 2). Amplifications in
P. corruscans demonstrated 14 polymorphic and 2 monomorphic loci; and polymorphic
analyses revealed 2 to 12 alleles (mean=7.4) and a mean He of 0.710 (ranging from 0.083 to
0.928) (Table 2). We also observed six loci with non-overlapping allelic sizes between species
(Table 2).
The most microsatellite loci here developed presented medium to high polimorphism
and the PCR-multiplex protocols represented an efficient molecular tool with relative reduced
costs and time. The 100% success in the cross-amplification between these species suggest
that these loci can also be usefull for other Pimelodidae fish. These markers can to be applied
in evolutionary and populational genetic studies and used in projects for management of P.
reticulatum and P. corruscans in aquaculture, conservation plans and hybridization
investigations.

Acknowledgements
This work was supported by grants from the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo (FAPESP) and the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq).

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Table 1 – Description of primer sequences and characterization of 16 polymorphic microsatellites loci in P. reticulatum.
Repeat Size range
Loci Primer sequence (5’-3’) A Ho He Gen Bank no. M-PCR
motif (bp)
F: AGTGGCGTTAGGTCTGTGTGNED
Prt3 (TG)13 5 185-197 0.409 0.660 KF701044
R: CTCTGCCATCAATACGCTCA
VIC
F: AGGCGACAGCACTAACCAGT
Prt4 (TA)10 7 177-191 0.727 0.799 KF701045
R: GATGGAATGTGGCTGGATCT A
PET
F: CAAGGCGCTGTGTATCTTCTT
Prt25 (CA)15 10 171-207 0.818 0.798 KF701050
R: GATCATGCTTGGCTCAGACTT
6-FAM
F: CACCTGAGACACCACACGTT
Prt30 (TC)8 8 105-133 0.455 0.605 KF701052
R: CGGAGGTAGGAGAGAAAGAGAG
F: GTGCTTCCTGCTGTGAGGTAPET
Prt5 (TG)15 10 246-270 0.909 0.885 KF701046
R: TGGCAACTGAGGCTTACTGA
NED
F: CAGATTGCTGATGTGCTGTG
Prt6 (CA)15 3 210-218 0.455 0.553 KF701047
R: CTGCGTGATAACTTGCCAGA B
VIC
F: TGTCTCGCATCAAACTACGC
Prt27 (AC)16 7 211-233 0.591 0.498 KF701051
R: GTCGAAACCGGGACCTTC
6-FAM
F: GGTAGACCGCAAGACAGAACA
Prt34 (TAGA)14 11 172-232 0.818 0.862 KF701053
R: GGAACTCCTGACCTCCTATGAA
6-FAM
F: TAGCAGCAGGCGATGAGAT
Prt11 (GT)12 7 254-272 0.682 0.717 KF701048
R: CCTAATGTCCAGGGATTTGC
F: ACCGAGCACAGCACAGAACNED
Prt36 (AGAT)14 6 232-252 0.682 0.799 KF701055
R: AAGGCAATGGTTGGAAGAA C
PET
F: GGATTAGGATCGAGGTGATCTG
Prt37 (TATC)17 10 218-256 0.318 0.829* KF701056
R: AATTCCTCCTTCGAGACTTGG
VIC
F: AGACCGTTCACACGTCCTCT
Prt40 (ACAT)7 4 252-260 0.500 0.500 KF701059
R: TGCAGTTGGTGGAGTTGATG
PET
F: AGAGCCATGCTGTTGTTGTG
Prt12 (CA)13 5 272-282 0.636 0.675 KF701049
R: GTTTGTGGGACTCGGTGACT
NED
F: TTCCACACAACCACCAGAAA
Prt35 (TTC)9 12 333-384 0.864 0.875 KF701054
R: GAAACCACAGAATGCCCTCA D
VIC
F: CACACACCGCAACTTCTCAC
Prt38 (ATA)11 8 316-343 0.636 0.783 KF701057
R: TTGCTCTCACCACACTGCTT
6-FAM
F: GCCGCCATATTGGATCAAG
Prt39 (ATA)11 11 275-306 0.727 0.818 KF701058
R: GCGACTCATTATACCACCTCGT
F: forward, R: reverse, forward primers labeled with fluorescence (PET, VIC, 6-FAM, NED), bp: base pairs, A: allele number, Ho: observed heterozygosity, He: expected
heterozygosity, *loci presenting significant deviation from Hardy–Weinberg equilibrium (P<0.0032) after Bonferroni correction, M-PCR: multiplex-PCR.
Table 2 – Cross-species analysis in P. corruscans and interespecific comparisons.

P. reticulatum P. corruscans
Loci
A Allelic range size (bp) Ho He A Allelic range size (bp) Ho He
Prt3 7 183-197 0.571 0.802 1 159 - -
Prt4 7 177-191 0.643 0.779 5 176-180 0.333 0.714
Prt5 16 220-282 0.857 0.892 11 225-279 1.000 0.909
Prt6 7 208-222 0.500 0.710 4 210-228 0.417 0.562
Prt11 10 252-272 0.786 0.805 7 260-290 0.750 0.797
Prt12 6 272-284 0.619 0.701 7 296-310 0.667 0.822
Prt25 14 171-207 0.810 0.822 1 169 - -
Prt27 8 211-239 0.524 0.572 12 251-285 0.917 0.928
Prt30 12 97-133 0.585 0.681 7 69-91 0.917 0.786
Prt34 11 172-232 0.857 0.871 12 188-248 0.917 0.928
Prt35 14 333-384 0.872 0.884 2 354-357 0.083 0.083
Prt36 8 232-268 0.805 0.840 12 329-405 0.750 0.902
Prt37 14 218-280 0.447 0.868 11 196-252 0.667 0.920
Prt38 11 286-343 0.757 0.823 2 307-310 0.083 0.083
Prt39 14 228-306 0.667 0.751 8 260-287 0.917 0.855
Prt40 4 250-260 0.537 0.536 4 248-256 0.500 0.656
A: allele number, bp: base pairs, Ho: observed heterozygosity, He: expected heterozygosity, in bold, the loci with diagnostic allele sizes between species.