Marilia Oliveira Doutorado Original Integral

MARÍLIA GARCIA DE OLIVEIRA
PAPEL DO RECEPTOR IONOTRÓPICO DE GLUTAMATO NMDAR EM

CÉLULAS T αβ DA MUCOSA INTESTINAL EM MODELO EXPERIMENTAL
MURINO
Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Imunologia dom Instituto de
Ciência Biomédicas da Universidade de
São Paulo, para obtenção do Título de
Doutor em Ciências.
São Paulo
2023
1
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
DEPARTAMENTO DE IMUNOLOGIA
MARÍLIA GARCIA DE OLIVEIRA
PAPEL DO RECEPTOR IONOTRÓPICO DE GLUTAMATO NMDAR EM

CÉLULAS T αβ DA MUCOSA INTESTINAL EM MODELO EXPERIMENTAL
MURINO
Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Imunologia dom Instituto de
Ciência Biomédicas da Universidade de
São Paulo, para obtenção do Título de
Doutor em Ciências.
Área de concentração: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. Jean Pierre

Schatzmann Peron
Versão Original
São Paulo
2023
2
3
Aos meus pais, meus irmãos, minhas

cunhadas e meu sobrinho. Com todo
amor por nossa família e gratidão por
tê-los em minha vida.
4
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Mauro e Vera, por todos os ensinamentos e valores. Por
proporcionarem a mim e aos meus irmãos a educação que vocês não tiveram a
oportunidade de ter e o caráter que sempre carregaram junto a vocês. Vocês são a base
de nossa linda família.
Aos meus irmãos Willian e Leonardo, por serem a parte mais doce de minhas
lembranças. Por sempre me apoiarem e acreditarem em mim, por toda a torcida e pelo
extremo cuidado. Não vejo a hora de estarmos juntos novamente.
As minhas cunhadas Gabriela e Ana Paula, por todas as risadas e momentos de
descontração. Por cuidarem tão bem de meus irmãos e por trazerem muita felicidade a
nossa família.
Ao meu sobrinho Maurício, meu grande amor, por ser a pessoa mais especial em
minha vida. Por me ensinar tanto desde o dia em que chegou a este mundo. Por todo o
amor e felicidade que me traz e por me inspirar a ser alguém melhor a cada dia. Não tem
um dia em que eu não penso em você. Obrigada por trazer a melhor parte de mim.
Estaremos sempre juntos, mesmo com a atual distância de cidade e país. Eu te amo!
Ao Prof. Dr. Jean Pierre Schatzmann Peron, meu orientador e grande amigo, pela
oportunidade única de aprender com sua mente brilhante, por todo o apoio e incentivo
científico e pessoal. Serei eternamente grata por todos os anos de aprendizado com você
e por essa linda amizade que construímos há anos. Te levarei para sempre comigo.
Aos meus avós Eurípedes e Terezinha, nossos anjos, por trazerem meu pai a este
mundo. Por todos os esforços em tornar a vida de uma família tão grande mais leve e digna.
Por sempre buscarem o melhor a seus filhos e por todo o amor com seus netos e bisnetos.
Eu nunca me esquecerei de vocês e gostaria que estivessem aqui neste momento.
Aos meus avós Mariano e Olga, por todo o carinho e amor. Por sempre desejarem
o melhor a mim e por estarem sempre presentes, mesmo com a distância em que
enfrentamos. Obrigada por todas as conversas, brincadeiras, histórias e comidas. Torço
para ter vocês aqui por muitos e muitos mais anos.
Aos meus padrinhos Jorge e Silvia, pelo sentimento de amor, carinho e cuidado.
Obrigada por serem meus segundos pais e meus tios favoritos. A vida é muito mais feliz
com vocês.
A minha prima Beatriz, por ser como uma irmã e por estar presente em todos os
momentos bons ou ruins de minha vida. Por tudo o que vivemos em nossa infância e
adolescência e por toda a vida adulta que temos pela frente. Estaremos sempre juntas!
5
Aos meus primos Mariane, Daniela, Matheus, Douglas e Andrews, por tornarem a
infância mais leve e alegre. Por todas as brincadeiras e desavenças, importantes para nos
tornamos pessoas melhores.
A minha prima Gabriela e toda sua família, por terem me recebido tão bem na casa
de vocês e por tornarem os Estados Unidos uma extensão de casa.
À Carolina, Lilian e Nagela, por todos os momentos juntas e pela parceria. Tive muita
sorte de ter a amizade de vocês desde antes do início do doutorado e por tê-las em minha
vida durante todo este período. Obrigada pelos ensinamentos científicos, pela companhia
em dias difíceis e em todos os congressos, e por todos os conselhos de vida. Estaremos
sempre juntas e, agora, em outro país. Que venham muito mais churrascos, pizzas, viagens
e bebedeiras internacionais.
À Ariana, minha grande amiga, Lucas, seu marido e Heitor, o fruto dessa união, pela
amizade em todos estes anos e por todos os finais de semana e feriados especiais. Por
fazerem parte de toda a minha vida pessoal e profissional. Por sempre estarmos juntos,
mesmo com a distância. Tenho certeza de que será assim por toda a vida.
Aos meus amigos Mayara e João, que se tornaram especiais e que trazem o bem.
É sempre muito bom estar com vocês.
Ao Prof. Dr. Rafael Machado Rezende, por acreditar em mim desde o primeiro dia.
Por me receber tão bem em seu laboratório e por me ensinar a pensar como uma grande
cientista. Obrigada por ser quem você é, com sua simplicidade, carinho e alegria. Obrigada
pela oportunidade de estar com você novamente, não vejo a hora de voltar e iniciarmos a
próxima etapa juntos.
Ao Prof. Dr. Howard Liu Weiner, por ceder o espaço de seu laboratório para eu
desenvolver nossa pesquisa. Por todas as reuniões e apoio financeiro.
Ao meu grande amigo e irmãozinho Gabriel, por ter contribuído tanto em tão pouco
tempo de amizade. Por ter me trazido paz em meio a tantos experimentos e novidades. Por
ter grande parte de meu coração e minhas lembranças em Boston. Você foi essencial para
esta experiencia ter sido única e incrível. Com você eu me senti em casa e, não é à toa,
pois compartilhamos o mesmo teto, as mesmas comidas e o mesmo laboratório. Obrigada
por ter me acolhido, me ouvido e por estar sempre presente em minha vida até os dias de
hoje. Esta amizade eu levarei por toda a vida.
À Kassiana, por toda sua leveza e delicadeza. Por também termos compartilhado o
mesmo teto e por fazermos parte da rotina e vida uma da outra. Aprendi muito com você e
seu jeito calmo e sereno de ser e conduzir sua pesquisa. Espero muito estarmos juntas em
Boston novamente.
6
Aos gringos Danielle e Taha, por serem como irmãos e por toda a amizade e
companheirismo nestes últimos anos. Boston não seria a mesma cidade sem vocês. Team
Bro Forever!
À Thais, por sua amizade e pensamento positivo. Por sua ajuda e aconselhamentos.
Eu aprendi tanto com você, cientificamente e pessoalmente. Você é uma pessoa incrível e
eu tive a sorte de dividir a vida em Boston com você.
Aos meus colegas do laboratório do Prof. Dr. Howard, Liam, Mathijs, Mary, Ella,
Christine, Tian, Millecent, Kusha, Estefania, Megha, Caroline, Luke e Mahsa por todo o
apoio e ajuda. Desejo tudo de mais especial na vida de cada um e espero nos
reencontrarmos no futuro.
A todos os alunos e amigos que passaram pelo laboratório do Prof. Rafael, Gabriela,
Felipe, Maria Júlia, Isabelly, Júlia, Roberta, Lívia, Ana Clara, Toby e Patrick por tornarem o
dia a dia divertido e por toda a ajuda em dias caóticos de experimento. Vocês foram
essenciais no desenvolvimento de grande parte desta tese.
Aos colegas de mundo em Boston, Camilo, Melissa, Kylynne, Xiaoming, Ana
Brandão, Michael, Kilian, Nico e Udbov por tornarem o laboratório mais divertido.
Aos melhores ‘roommates’, Anderson, Maria, Michele, Salvatore, Federica e Miyuki
por todas as conversas, refeições e companhia. Por tornarem minha primeira casa longe
do ninho extremamente feliz e agradável. Levarei vocês sempre comigo.
Aos colegas do laboratório de Interações Neuroimunes, Wesley, Rafaela, Beatriz,
Laura, Tiago, Brendo, Yan, Jonathan e Sandra, por toda a discussão de resultados e pela
agradável companhia em todos estes anos.
Aos colegas que tive o prazer de dividir o Departamento de Imunologia da USP por
anos, Igor, Rafael, Aline, Thiago, João e Flávia, pela companhia e por tornar a ciência mais
alegre e divertida.
À banca de qualificação, Profa. Dra. Patrícia, Dra. Luana e Prof. Dr. Vinícius, por
todas as sugestões e conselhos.
A todos funcionários do Departamento de Imunologia do ICB, em especial à Maria
Eni, Claudia, Aurea, Sandra e João, por estarem sempre dispostos a ajudar a todos os
alunos.
7
APOIO FINANCEIRO
Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pelo financiamento do primeiro ano de doutorado (2018-2019).
Agradeço também à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) pelo financiamento do restante do doutorado (2019-2023, Processo
Doutorado/Fluxo Contínuo-FAPESP: 2018/10242-5), incluindo o estágio de pesquisa no
exterior (2021-2022, Processo BEPE-FAPESP: 2021/06508-2).
8
“É precisamente na fronteira do
conhecimento que a imaginação tem
seu papel mais importante; o que ontem
foi apenas um sonho, amanhã poderá
se tornar realidade.” – Marcelo Gleiser
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura do NMDAR...........................................................................................21

Figura 2: Células imunes da mucosa intestinal na homeostase e inflamação.....................27
Figura 3: Interações neuro-imunes nos intestinos..............................................................31
Figura 4: Avaliação da expressão de NMDAR por linfócitos T αβ CD4+ no baço, timo,
linfonodos mesentéricos e cecais........................................................................................42
Figura 5: Avaliação da expressão de NMDAR por linfócitos T αβ CD8+ no baço, timo,
linfonodos mesentéricos e cecais, lâmina própria e compartimento intraepitelial do intestino
delgado e cólon...................................................................................................................43
Figura 6: Expressão de NMDAR por linfócitos T αβ no intestino delgado......................... 44
Figura 7: Expressão gênica das isoformas NR2a, NR2b, NR2c e NR2d do NMDAR no baço,
linfonodos mesentéricos e intestino delgado.......................................................................46
Figura 8: Expressão gênica de Il2, Il6, Il17, Foxp3 e Tbx21 no baço, linfonodos
mesentéricos e intestino delgado........................................................................................47
Figura 9: Avaliação da permeabilidade e trânsito intestinal................................................48
Figura 10: Distribuição de linfócitos T αβ e T γδ em órgãos linfoides primários e secundários
de camundongos Cd4CrexGrin1f/f......................................................................................50
Figura 11: Distribuição de linfócitos T αβ e T γδ na lâmina própria e compartimento epitelial
dos intestinos de camundongos Cd4CrexGrin1f/f...............................................................51
Figura 12: Distribuição de linfócitos T αβ CD8+ intraepiteliais típicos e atípicos de
camundongos Cd4CrexGrin1f/f...........................................................................................52
Figura 13: Sinais e sintomas da colite aguda induzida por DSS em camundongos
Cd4CrexGrin1f/f..................................................................................................................53
Figura 14: Distribuição e fenótipo de linfócitos T αβ e T γδ nos tecidos afetados pelo modelo
de colite aguda induzido por DSS em camundongos Cd4CrexGrin1f/f................................54
Figura 15: Produção intracelular de Il-10, IL-17 e IFN-γ por linfócitos T αβ CD4+ nos tecidos
afetados pelo modelo de colite aguda induzido por DSS em camundongos
Cd4CrexGrin1f/f..................................................................................................................55
Figura 16: Sinais e sintomas da colite crônica induzida por DSS em camundongos
Cd4CrexGrin1f/f................................................................................................................. 56
Figura 17: Distribuição e fenótipo de linfócitos T αβ e T γδ nos tecidos afetados pelo modelo
de colite crônica induzido por DSS em camundongos Cd4CrexGrin1f/f..............................57
10
afetados pelo modelo de colite crônica induzido por DSS em camundongos
Cd4CrexGrin1f/f................................................................................................................. 58
Figura 19: Sinais e sintomas da colite crônica induzida por transferência de células T de
Figura 20: Distribuição e fenótipo de linfócitos T αβ CD4+ nos tecidos afetados pelo modelo
de colite crônica induzido por transferência de células T de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f..................................................................................................................61
afetados pelo modelo de colite crônica induzido por transferência de células T de
Figura 22: Avaliação da tolerância oral em camundongos Cd4CrexGrin1f/f.......................63
Figura 23: Distribuição e fenótipo de linfócitos T αβ e T γδ no baço de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f em modelo de tolerância oral....................................................................64
Figura 24: Produção intracelular de IL-10, IL-17 e IFN-γ por linfócitos T αβ CD4+ no baço
de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em modelo de tolerância oral........................................65
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Lista de primers utilizados para avaliação de mRNA dos genes em interesse.....39
Tabela 2: Frequência de linfócitos T αβ (CD4+ e CD8+) e T γδ nos órgãos linfoides de
camundongos Cd4CrexGrin1f/f naïve.................................................................................72
Tabela 3: Frequência de linfócitos T αβ (CD4+ e CD8+) e linfócitos T γδ e expressão de
CD25, FoxP3 e CD103 por linfócitos T CD4+ nos órgãos linfoides de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f submetidos a três modelos distintos de colite...........................................73
Tabela 4: Produção intracelular de IL-10, IL-17 e IFN-γ por linfócitos T CD4+ de
camundongos Cd4CrexGrin1f/f submetidos a três modelos distintos de colite....................73
12
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA - do inglês, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid Receptor

AMPs - do inglês, Antimicrobial Peptides
APRIL - do inglês, a proliferation-inducing ligand
BAFF - do inglês, B-cell-activating factor of the TNF family
BSA - do inglês, Bovine serum albumin
Ca2+ - Cálcio
cDNA - DNA complementar
CFA - do inglês, Complete Freund’s Adjuvant
ChAT - do inglês, Choline Acetyltransferase
DCs - do inglês, Dendritic Cells
DNA - ácido desoxirribonucleico
DSS - do inglês, Dextran Sulfate Sodium
DTT - do inglês, DL-Dithiotreitol
EAAC1 - do inglês, Excitatory Amino Acid Carrier 1
EAE - do inglês, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
GABA - do inglês, Gamma-Aminobutyric Acid
GAD - do inglês, Glutamic Acid Decarboxylase
GALT - do inglês, Gut-Associated Lymphoid Tissue
Grin1 - do inglês, Glutamate receptor ionotropic, NMDA 1
H&E - do inglês, hematoxylin and eosin
HBSS - do inglês, Hank’s Balanced Salt Solution
HEPES - do inglês, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HIV - do inglês, Human Immunodeficiency Virus
IBD - do ingês, Inflammatory Bowel Disease
IEC - do inglês, Intestinal Epithelial Cell
IEL - do inglês, Intraepithelial Lymphocytes
IFN - interferon
iGluRs - do inglês, ionotropic Glutamate Receptors
IL - Interleucina
ILC - do inglês, Innate Lymphoid Cells
iNKT - do inglês, invariant Natural Killer T cells
13
iTreg - do inglês, Induced regulatory T cell

K+ - Potássio
KA - do inglês, Kainate Receptor
LP - Lâmina Própria
LTi - do inglês, Lymphoid tissue inducer
mg - miligramas
Mg2+ - Magnésio
mGluRs - do inglês, metabotropic Glutamate Receptors
mL - mililitros
mM - milimolar
MOG - do inglês, Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein
mRNA - RNA mensageiro
Na+ - Sódio
NHS - do inglês, normal horse serum
NK - do inglês, Natural Killer Cells
nM - nanomolar
NMDA - N-metil-D-aspartato
NMDAR - do inglês, N-methyl-D-aspartate Receptor
NO - do inglês, Nitric Oxide
NR1 - do inglês, NMDA receptor subunit 1
OT - do inglês, Oral tolerance
OVA - do inglês, ovalbumin
PACAP - do inglês, Pituitary Adenylyl Cyclase Activating Peptide
PFA - paraformaldeído
PMA - do inglês, Phorbol myristate acetate
qPCR - PCR quantitativo
RA - do inglês, Retinoic Acid
RNA – ácido ribonucleico
RPMI - do inglês, Roswell Park Memorial Institute
s.c. - subcutâneo
SBF - Soro Bovino Fetal
SNA - Sistema Nervoso Autônomo
SNC - Sistema Nervoso Central
14
SNE - Sistema Nervoso Entérico

SNP - Sistema Nervoso Periférico
SNS - Sistema Nervoso Somático
SP - do inglês, Substance P
TECs - do inglês, Thymic Epithelial Cells
TGF-β - do inglês, transforming growth factor β
Th - do inglês, T helper cell
TLR2 - do inglês, Toll-like receptor 2
TLR4 - do inglês, Toll-like receptor 5
TNF - do inglês, Tumor necrosis fator
Treg - Linfócitos T reguladores
Trm - do inglês, T resident memory cells
TSLP - do inglês, Thymic Stromal Lymphopoietin
VIP - do inglês, Vasoactive Intestinal Peptide
μg - microgramas
μL - microlitros
μM - micromolar
15
SUMÁRIO
RESUMO............................................................................................................................17
ABSTRACT........................................................................................................................18
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................19
1.1. Glutamato e NMDAR................................................................................................19
1.2. Microbiota e o sistema imune no GALT.................................................................... 23
1.3. Doenças inflamatórias intestinais.............................................................................26
1.4. O sistema nervoso entérico......................................................................................29
2. OBJETIVOS ............................................................................................................33
2.1. Objetivos específicos...............................................................................................33
3. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................34
3.1. Animais....................................................................................................................34
3.2 Tolerância Oral.........................................................................................................34
3.3 Colite induzida com DSS..........................................................................................34
3.4 Colite induzida por transferência de linfócitos T........................................................35
3.5 Separação magnética de células T CD4+ e CD8+ do baço.......................................35
3.6 Obtenção de células do baço, timo, linfonodos mesentéricos e cecais.....................36
3.7 Obtenção de células da mucosa intestinal................................................................36
3.7.1 Linfócitos intraepiteliais intestinais...........................................................................37
3.7.2 Linfócitos da lâmina própria intestinal.......................................................................37
3.8 Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA).....................................38
3.9 Quantificação de mRNA por PCR em Tempo Real...................................................39
3.10 Citometria de fluxo....................................................................................................39
3.11 Permeabilidade e trânsito intestinal..........................................................................40
3.12 Histologia do cólon....................................................................................................41
3.13 Imunofluorescência do intestino delgado..................................................................41
3.14 Análise estatística.....................................................................................................42
4. RESULTADOS..............................................................................................................43
4.1 Expressão de NMDAR por linfócitos T αβ.................................................................43
4.2 Alteração na expressão de genes relacionados ao fenótipo Th1, Th17 e Treg no
baço, linfonodos mesentéricos e compartimento intraepitelial do intestino delgado de
4.3 A deleção de NMDAR especificamente em linfócitos T αβ não prejudica a
permeabilidade e o trânsito intestinal..................................................................................48
16
4.4 A deleção de NMDAR especificamente em linfócitos T αβ leva a distribuição alterada

das subpopulações CD4+ e CD8+ em tecidos linfoides de camundongos naïve.................50
4.5 Papel do NMDAR na inflamação intestinal...............................................................53
4.6 Papel do NMDAR na tolerância oral.........................................................................64
5. DISCUSSÃO............................................................................................................67
6. CONCLUSÕES........................................................................................................71
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................74
APÊNDICES.......................................................................................................................82
ANEXOS.............................................................................................................................85
17
RESUMO
DE OLIVEIRA, M.G. Papel do receptor ionotrópico de glutamato NMDAR em células T

αβ da mucosa intestinal em modelo experimental murino. Tese (Doutorado em
Imunologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2023.
Plexos ganglionares formados por redes de interconexão entre neurônios do sistema

nervoso entérico estão presentes nas camadas muscular e submucosa dos intestinos
delgado e grosso. Estes neurônios secretam diversos neurotransmissores inibitórios e
excitatórios, como o glutamato, e suas inervações atingem a lâmina própria da mucosa
intestinal. Estes neurotransmissores desempenham papel fundamental na motilidade e
homeostase intestinal através de suas interações com as células epiteliais intestinais.
Recentemente, foi descoberto que linfócitos T expressam receptores para
neurotransmissores, incluindo o receptor ionotrópico de glutamato NMDAR. A maioria dos
linfócitos encontrados no corpo estão localizados na mucosa intestinal e estes
desempenham funções importantes na tolerância local à microbiota e à antígenos
alimentares. Porém, pouco se sabe sobre o papel do NMDAR em linfócitos T,
especialmente na mucosa intestinal. Portanto, definimos por investigar inicialmente o papel
do NMDAR em linfócitos T, através de sua deleção específica, na homeostase intestinal.
Conceitualmente, mostramos neste trabalho a eficiência da deleção específica do NMDAR
em linfócitos T αβ CD4+ e CD8+ em tecidos linfoides como no baço, timo, linfonodos
mesentéricos e cecais, assim como na lâmina própria e compartimento intraepitelial dos
intestinos delgado e grosso em camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Tal deleção favorece a
expressão gênica de outras subunidades do NMDAR, como NR2c e NR2d no baço e
linfonodos mesentéricos, sem interferir na permeabilidade e no trânsito intestinal. Além
disso, mostramos que camundongos Cd4CrexGrin1f/f possuem distribuição alterada de
células T CD4+ e CD8+, até mesmo células T γδ, no timo, baço e linfonodos mesentéricos
e cecais. Embora não tenhamos observado diferenças na lâmina própria e compartimento
intraepitelial dos intestinos em camundongos Cd4CrexGrin1f/f na condição naïve, definimos
por investigar também o papel do NMDAR em linfócitos T αβ mediante estímulo inflamatório
através de modelos experimentais de colite aguda e crônica. Na colite aguda induzida por
DSS, observou-se um aumento na frequência de linfócitos T CD4+ e redução na frequência
de linfócitos T CD8+ na lâmina própria do ceco e compartimento intraepitelial do cólon em
camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Por sua vez, os linfócitos T CD4+ da lâmina própria do ceco
destes animais produziram mais IL-17. Além disto, mostramos também alterações na
frequência de linfócitos T γδ na lâmina própria do ceco e cólon de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f. No modelo de colite crônica induzido por múltiplos ciclos de DSS, a deleção
específica de NMDAR em linfócitos T αβ resultou na redução da frequência de células T
CD4+ e no aumento da produção de IFN-γ por estas células na lâmina própria do cólon.
Finalmente, também avaliamos o modelo de colite crônica induzido pela transferência
adotiva de células T CD4+ naïve à camundongos Rag1-/-. A transferência de células T CD4+
depletadas de NMDAR gerou um aumento na frequência de células T CD4+, assim como
a redução na expressão de CD103 e na produção de IL-17 e IFN-γ por estas células nos
linfonodos mesentéricos e cecais quando comparados ao grupo controle. Embora estas
alterações sejam sugestivas da perda da homeostase intestinal, assim como no modelo de
colite aguda e crônica induzidos por DSS, também não observamos diferenças nos
parâmetros macro e microscópicos referentes a inflamação crônica em camundongos
Cd4CrexGrin1f/f. Nossos dados sugerem a participação do NMDAR expresso por linfócitos T
αβ no controle da homeostase intestinal e durante doenças inflamatórias intestinais,
principalmente a colite aguda sem comprometer a indução da tolerância oral a Ovalbumina.
Palavras-chave: linfócitos T, glutamato, NMDAR, mucosa intestinal, colite.

18
ABSTRACT
DE OLIVEIRA, M.G. The role of the ionotropic glutamate receptor NMDAR on αβ T cells
of the intestinal mucosa in an experimental murine model. PhD Thesis (Immunology) –
Biomedical Sciences Institute, University of Sao Paulo, 2023.
Ganglionic plexuses formed by interconnecting networks between neurons of the enteric

nervous system are present in the muscular and submucosal layers of the small and large
intestines. These neurons secrete several inhibitory and excitatory neurotransmitters,
including glutamate, and their innervations reach the lamina propria of intestinal mucosa.
Such neurotransmitters play a key role in intestinal motility and homeostasis through their
interactions with intestinal epithelial cells. Recently, it has been discovered that T cells
express receptors for neurotransmitters, including the ionotropic glutamate receptor
NMDAR. Most lymphocytes found in the body are located within the intestinal mucosa and
these cells play important roles in local tolerance to microbiota and food antigens. However,
little is known about the role of NMDAR on T cells, especially in the intestinal mucosa.
Therefore, we decided to initially investigate the role of NMDAR in T lymphocytes, through
its specific deletion, in intestinal homeostasis. Conceptually, we show in this work the
efficiency of the specific deletion of NMDAR on CD4+ and CD8+ αβ T cells in lymphoid
tissues such as the spleen, thymus, mesenteric and cecal lymph nodes, as well as in the
lamina propria and intraepithelial compartment of both intestines of Cd4CrexGrin1f/f mice.
Such deletion favors gene expression of other NMDAR subunits, such as NR2c and NR2d
in the spleen and mesenteric lymph nodes, without interfering with intestinal permeability
and transit. Furthermore, we demonstrate that naïve Cd4CrexGrin1f/f mice have altered
distribution of CD4+ and CD8+ T cells, even γδ T cells, in the thymus, spleen, and
mesenteric and cecal lymph nodes. Although we did not observe differences in the lamina
propria and intraepithelial compartment of the intestines in Cd4CrexGrin1f/f mice in the naïve
condition, we decided to also investigate the role of NMDAR in αβ T cells upon inflammatory
stimulus through experimental models of acute and chronic colitis. In acute DSS-induced
colitis, an increase of CD4+ T cells and a decrease of CD8+ T cells frequencies in the lamina
propria of the cecum and colonic intraepithelial compartment were observed in
Cd4CrexGrin1f/f mice. In turn, CD4+ T cells from the lamina propria of the cecum of these
mice produced more IL-17. In addition, we also showed changes in the frequency of γδ T
cells in cecum and colon lamina propria, dependent on this deletion. In chronic colitis model
induced by multiple cycles of DSS, specific deletion of NMDAR in αβ T cells resulted in
reduced frequency of CD4+ T cells and increased IFN-γ production by these cells in the
colonic lamina propria. Finally, we also evaluated a chronic colitis model caused by adoptive
transfer of naive CD4+ T cells to Rag1-/- mice. The transfer of NMDAR-depleted CD4+ T
cells generated an increase in the frequency of CD4+ T cells, as well as a reduction in the
expression of CD103 and in the consecutive production of IL-17 and IFN-γ by these cells in
the mesenteric and cecal lymph nodes when compared to control group. Although these
alterations are suggestive of loss of intestinal homeostasis, as well as in the model of acute
and chronic colitis induced by DSS, we also did not observe differences in the macroscopic
and microscopic parameters referring to chronic inflammation in Cd4CrexGrin1f/f mice. Taken
together, our data suggest the involvement of NMDAR expressed by αβ T cells in controlling
the intestinal homeostasis and during inflammatory bowel diseases, mainly acute colitis,
without compromising the induction of oral tolerance to Ovalbumin.
Keywords: T cells, glutamate, NMDAR, intestinal mucosa, colitis.

19
1. INTRODUÇÃO
Há alguns anos nosso grupo vem estudando o papel do receptor ionotrópico de

glutamato N-metil-D-aspartato (NMDAR) na biologia das células do sistema imune
utilizando o modelo murino de encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzido pela
imunização de camundongos com a glicoproteína de mielina produzida por oligodendrócitos
(MOG35-55).
Mais recentemente, nosso grupo também tem visado entender o papel dos
receptores NMDAR na ontogenia tímica de linfócitos T CD4+. Para tanto, realizamos o
cruzamento entre camundongos C57BL/6 Cd4Cre com camundongos C57BL/6 Grin1flox,
promovendo a deleção de NMDAR especificamente em linfócitos Tαβ CD4+ e CD8+, devido
à expressão do coestimulador CD4 juntamente com a expressão do CD8 no estágio imaturo
ou duplo positivo do desenvolvimento de timócitos no timo.
Dando continuidade nesses estudos, no presente projeto investigamos o papel do
NMDAR na imunobiologia dos linfócitos Tαβ CD4+ e CD8+ presentes no tecido linfóide
associado ao intestino (GALT), um dos sítios de maior abundância de linfócitos T no
organismo, onde estas células apresentam ações fundamentais na manutenção da
tolerância à microbiota, assim como na manutenção da homeostase intestinal.
1.1 Glutamato e NMDAR

O aminoácido não-essencial glutamato é o neurotransmissor mais importante como
mediador de sinapses excitatórias no sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. É
considerado um neurotransmissor, pois é encontrado em vesículas de neurônios pré-
sinápticos e, após a despolarização da membrana, é liberado na fenda sináptica em
concentrações altas suficiente para provocar resposta em neurônios pós-sinápticos
(Fonnum, 1984). Sua função excitatória já é conhecida desde a década de 50, em estudos
envolvendo o cérebro e medula espinhal em modelos experimentais de epilepsia e
excitação e depressão de neurônios, respectivamente (Hayashi, 1952; Curtis e Watkins,
1960).
O glutamato está envolvido nos principais aspectos funcionais de neurônios
encontrados no cérebro, como cognição, consolidação da memória, plasticidade e
aprendizado (Fonnum, 1984; Ottersen e Storm-Mathisen, 1984; Collingridge e Lester, 1989;
Headley e Grillner, 1990). O mesmo também atua no desenvolvimento do SNC, agindo na
indução e eliminação de sinapses, migração celular, diferenciação, sobrevivência e morte
de células neuronais (Mcentee e Crook, 1993; Hack e Balázs, 1994; Yano et al., 1998;
20
Hertz, 2006). Durante processos inflamatórios do SNC, o glutamato é responsável por

causar morte neuronal por excitotoxicidade, como já foi observado durante o acidente
vascular cerebral (Farooqui e Horrocks, 1991) e, também, em doenças neurodegenerativas,
como Azheimer e Huntington (Choi, 1994).
Além disso, o glutamato pode exercer funções periféricas por ser encontrado dentro
de microvesículas presentes na glândula pineal, participando do processo de produção da
melatonina. Também foi sugerida a possível participação do glutamato em outra glândula
endócrina fora do SNC, o pâncreas, pois as células das ilhotas de Langerhans expressam
receptores para esse neurotransmissor (Moriyama et al., 2000).
Outras funções importantes do glutamato fora do SNC podem ser encontradas no
trato gastrointestinal, levando em consideração que o glutamato é o principal combustível
para homeostase do tecido intestinal. Suas fontes são: ingestão principalmente de dietas
proteicas (8-10% dos aminoácidos consumidos), metabolização por componentes da
microbiota (Lactobacillus) (Tomé, 2018) ou ainda pode ser secretado por grandes
populações de neurônios do sistema nervoso entérico (SNE), como será descrito mais à
frente no item 1.3.
O glutamato proveniente da dieta e da microbiota é absorvido do lúmen intestinal e
metabolizado principalmente pelos enterócitos (células epiteliais dos intestinos delgado e
grosso) por diferentes vias que culminam na produção de energia para sustentar a
motilidade intestinal e outras funções como, o metabolismo de proteínas e a produção de
diferentes moléculas que utilizam o glutamato como precursor. Algumas bactérias da
microbiota (Lactobacillus e Bifidobacterium) possuem a enzima glutamato descarboxilase
(GAD) que sintetiza o principal neurotransmissor inibidor, ácido γ-aminobutírico (GABA),
através da descarboxilação do glutamato, também envolvendo a participação de neurônios
glutamatérgicos e outras células presentes nos intestinos que expressam o transportador
de aminoácidos excitatórios 1 (EAAC1) (Kirchgessner, 2001; Tomé, 2018).
As primeiras especulações de que o glutamato poderia ter papel regulador sobre o
sistema imune vieram de estudos clínicos que reportaram altas concentrações plasmáticas
de glutamato em condições associadas à imunodeficiência, como em pacientes com o vírus
da imunodeficiência humana (HIV) e pacientes com câncer (Eck et al., 1989; Ollenschläger
et al., 1989; Eck et al., 1990).
Recentemente, foi demonstrado que células dendríticas (DCs) esplênicas secretam
quantidades significativas de glutamato durante a apresentação antigênica, o que foi capaz
de modular a produção de citocinas e a proliferação de linfócitos T ativados in vitro (Pacheco
et al., 2006). Tais resultados evidenciam o papel imunomodulador do glutamato também
21
durante sua ativação em órgãos linfóides secundários, e não somente quando essas células
infiltram o SNC. Trabalhos recentes demonstraram que DCs tímicas podem ser
consideradas fontes fisiológicas de glutamato assim como as células epiteliais tímicas
(TECs), o que sugere um possível papel do glutamato também em órgão linfóides primários,
atuando principalmente na seleção tímica levando em consideração que timócitos em
desenvolvimento expressam os receptores de glutamato do tipo NMDAR em altas
concentrações (Storto et al., 2000; Affaticati et al., 2011).
Como já citado, a função biológica do glutamato é exercida pela ativação de
transportadores e de duas famílias de receptores de membrana encontrados principalmente
em neurônios pós-sinápticos, chamados de receptores metabotrópicos (mGluRs) e
receptores ionotrópicos (iGluRs). Existem oito receptores metabotrópicos acoplados à
proteína G (mGluRs1-8), classificados em três subgrupos com base nas sequências
homólogas de seus aminoácidos. São eles: grupo I (mGluR1 e mGluR5), grupo II (mGluR2
e mGluR3), grupo III (mGluR4, mGluR6, mGluR7 e mGluR8) (Schoepp e Conn, 1993; Pin
e Duvoisin, 1995; Conn e Pin, 1997). Já os receptores ionotrópicos, são assim denominados
por ativarem canais iônicos, e são subdivididos em três subfamílias: os receptores AMPA
(do inglês, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor), os receptores
KA (do inglês, kainate receptor) e os receptores NMDAR (do inglês, N-methyl-D-aspartate
receptor). Estes receptores são assim nomeados pois, seus agonistas mais seletivos são:
ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico (AMPA), cainato (do inglês, kainate -
KA) e N-metil-D-aspartato (NMDA), respectivamente (Kew e Kemp, 2005).
Os receptores ionotrópicos são multímeros proteicos transmembrânicos arranjados
na forma tetramérica (Laube et al., 1998) ou pentamérica (Dingledine e Conn, 2000). Todos
constituem canais iônicos permeáveis a cátions, como por exemplo sódio (Na+) e cálcio
(Ca2+), sendo que essa permeabilidade pode variar dependendo das famílias e das
subunidades que compõem cada receptor (Danbolt, 2001; Kew e Kemp, 2005; Hertz, 2006;
Watkins e Jane, 2006). Os receptores AMPA e Cainato são permeáveis ao sódio (Na+) e
potássio (K+) e responsáveis pela rápida ativação da neurotransmissão excitatória no SNC.
Já o receptor NMDA é altamente permeável a cálcio (Ca2+), liberando o potássio (K+)
extracelular, tendo sua função baseada na potenciação de longo prazo (Segovia et al.,
2001).
Como já discutido, o receptor NMDAR é formado por quatro subunidades codificadas
por três famílias de genes diferentes: NR1 (Grin1), NR2 (Grin2) e NR3 (Grin3). A
subunidade NR1 possui um só gene, porém com oito variantes de splycing (Nakanishi et
al., 1992). A subunidade NR2 possui quatro isoformas denominadas NR2a, NR2b, NR2c e
22
NR2d e a subunidade NR3 possui duas isoformas, NR3a e NR2b. O NMDAR é formado por
duas subunidades invariantes NR1, as quais se ligam ao co-agonista glicina, e outras duas
subunidades variantes que se ligam ao glutamato, podendo ter seis opções, as
subunidades NR2a, NR2b, NR2c, NR2d ou as subunidades NR3a ou NR3b. As
subunidades NR2a-d são comumente expressas nas porções anteriores do cérebro,
diencéfalo, mesencéfalo e nas células granulares do cerebelo. Já as subunidades NR3a-b,
menos comumente encontradas, são expressas principalmente nos períodos iniciais do
desenvolvimento fetal (Monyer et al., 1994; Danysz e Parsons, 1998).
Quando em repouso, o receptor NMDA está bloqueado por íons de magnésio (Mg2+)
e, para sua ativação, é necessária uma despolarização para a abertura do canal iônico
através da saída dos íons de Mg2+ e da ligação dos agonistas, glicina e glutamato. Essa
despolarização pode ser dependente da ativação de outros iGluRs (Mcbain e Mayer, 1994).
Figura 1: Estrutura do NMDAR. O receptor ionotrópico de glutamato NMDAR está representado acima,
possuindo seu sítio de ligação ao agonista glutamato (esferas verdes) nas subunidades NR2 (A-D) e seu sítio
de ligação ao co-agonista glicina (esferas vermelhas) na subunidade invariante NR1. Quando em repouso, o
canal iônico está bloqueado por íons de magnésio (esferas cinzas). Após sua ativação e despolarização da
membrana, os íons de magnésio são liberados, promovendo a abertura do canal iônico com o influxo de íons
de cálcio e sódio (esferas azuis) e efluxo de íons de potássio (esferas laranjas). Figura criada no
BioRender.com.
Recentemente, tem se observado que determinadas conformações do NMDAR

podem levar tanto à sobrevivência das células neurais quanto à morte das mesmas (Luo et
23
al., 2011). De fato, altas concentrações de glutamato fora da fenda sináptica podem induzir
uma ativação excessiva de seus receptores, com grande influxo de Ca2+ e posterior morte
celular por apoptose, num processo conhecido por excitotoxicidade (Mcdonald et al., 1998;
Matute et al., 2006; Bai et al., 2013).
De forma interessante, os receptores de glutamato, principalmente o NMDAR, além
de serem expressos em células neuronais também são encontrados em células da glia em
modelos experimentais e em humanos, porém suas funções ainda não são bem
compreendidas (Hösli e Hösli, 1993; Steinhäuser e Gallo, 1996; Vernadakis, 1996; Conti et
al., 1999; Shelton e Mccarthy, 1999; Bergles et al., 2000).
Desde a década de 90, diversos estudos demonstraram que receptores para
neurotransmissores também são expressos por células do sistema imune, como por
exemplo os linfócitos T e B de camundongos e humanos. Dentre eles podemos citar
receptores para dopamina, das diferentes subfamílias (Santambrogio et al., 1993; Barbanti
et al., 1996; Ricci et al., 1998), receptores nicotínicos de acetilcolina α7 (Rosas-Ballina et
al., 2011), receptores β2 adrenérgicos expressos por linfócitos T reguladores (Guereschi et
al., 2013) e receptores serotoninérgicos 5-HTr (Young et al., 1993; Laberge et al., 1996).
Mais recentemente, a expressão de receptores de glutamato também foi observada em
macrófagos (Mantuano et al., 2017) e em linfócitos T (Lombardi et al., 2001; Kvaratskhelia
et al., 2009; Fallarino et al., 2010; Mashkina et al., 2010; Kahlfuß et al., 2014), sendo
possível ainda observar o bloqueio de NMDAR em linfócitos T através da utilização do
antagonista memantina (Kahlfuß et al., 2014). De fato, tanto células da resposta imune inata
como células da resposta imune adaptativa expressam receptores de glutamato de ambas
as famílias (Storto et al., 2000; Pacheco et al., 2006).
Apesar da atuação do glutamato fora do SNC e da presença dos NMDAR em células
do sistema imune, mais precisamente os linfócitos T, poucos trabalhos na literatura
buscaram compreender sua biologia e, tampouco é sabida sua função em diferentes
contextos da resposta imune, como por exemplo no GALT.
1.2 Microbiota e o sistema imune no GALT

A interface entre o meio externo e interno de todos os vertebrados abriga
comunidades complexas e dinâmicas de microrganismos chamados de microbiota. Os
intestinos de mamíferos abrigam a maior parte da microbiota de todo o corpo, contendo
trilhões de comunidades microbianas comensais presentes no lúmen intestinal que
estabelecem relações simbióticas com o hospedeiro. Essas comunidades bacterianas
intestinais são altamente benéficas ao hospedeiro e desempenham funções importantes
24
como, digestão de compostos da dieta para aumentar posteriormente a absorção do

conteúdo nos intestinos, degradação de xenobióticos e competição com agentes
patogênicos (Hooper et al., 2001; Hooper e Macpherson, 2010).
Somente em 2005 foi realizado o primeiro método molecular (sequenciamento
genético de RNA ribossomal 16S) para identificar o perfil da microbiota intestinal de
humanos, uma vez que 80% das espécies da microbiota intestinal não são cultiváveis, o
que permitiu identificar a diversidade das comunidades microbianas e, até mesmo, novas
espécies (Eckburg et al., 2005; Ley et al., 2008). A metodologia consiste em identificar a
sequência constante do gene que codifica o RNA ribossomal 16S contido na subunidade
30S dos ribossomos de todos os procariotos, diferenciando as bactérias da microbiota e
agrupando-as em espécies de acordo com as regiões variáveis e hipervariáveis do gene
RNAr 16S (Furrie, 2006). A análise é chamada de metagênomica por identificar
comunidades de microrganismos de um determinado ambiente por técnicas independentes
de cultivo (Hugenholtz e Tyson, 2008) e posteriormente são realizadas análises
filogenéticas baseadas em uma biblioteca genômica de RNAr 16S para a identificação e o
agrupamento das espécies (Hayashi et al., 2005).
Devido ao grande número de bactérias intestinais, o hospedeiro apresenta uma
persistente e constante ameaça a infecção, levando também em consideração a enorme
área de superfície intestinal (aproximadamente 200 m 2 em humanos) que é protegida
apenas por uma simples camada de células epiteliais colunares intestinais. Alterações quali
ou quantitativas da microbiota decorrentes, por exemplo, do uso de antibióticos e outros
medicamentos com efeito direto sobre seus componentes alteram o equilíbrio entre
microbiota e hospedeiro, resultando em disbiose e contribuindo para o desenvolvimento de
diversas patologias intestinais, sendo as mais comuns doenças inflamatórias intestinais
agudas e crônicas. Para minimizar o contato entre os microrganismos luminais e as células
epiteliais, evolutivamente foram criadas barreiras físicas e químicas formadas por muco,
peptídeos antimicrobianos e anticorpos IgA transportados ao lúmen. Porém,
ocasionalmente, algumas bactérias invadem o tecido intestinal através das barreiras, o que
demanda respostas antimicrobianas mais eficientes e específicas oferecidas por células do
sistema imune presentes na lâmina própria intestinal (Hooper e Macpherson, 2010).
Os intestinos delgado e grosso são organizados em quatro camadas, do lúmen
externo ao tecido interno, as camadas mucosa, submucosa, muscular e membrana serosa.
A mucosa é a região que apresenta maior contato com os microrganismos luminais e é
formada pela camada simples de células colunares epiteliais, os enterócitos ou colonócitos,
formados por sua vez pelo conjunto de células heterogêneas que desempenham diferentes
25
funções, as células caliciformes, células enteroendócrinas, células de Paneth, células M e

células em tufo, que são organizadas em projeções semelhantes a dedos chamadas de
vilos. Além disso, a região mucosa também é formada pelo tecido conjuntivo subjacente ao
epitélio chamado de lâmina própria (LP), onde estão presentes células estromais, capilares
sanguíneos e linfáticos, células imunes e folículos linfóides organizados chamados de
placas de Peyer, responsáveis principalmente pela vigilância imunológica do lúmen
intestinal. As diferentes células do sistema imune se encontram nas regiões mucosa e
submucosa (Drolia et al., 2018; Mestecky et al., 2015).
Os tecidos linfóides associados à mucosa intestinal recebem o nome de GALT e
abrigam as células do sistema imune que desempenham um papel fundamental na mucosa
intestinal, promovendo não só a manutenção e o reparo tecidual, como também a tolerância
aos microrganismos comensais da microbiota e aos antígenos alimentares. Esse papel
tolerogênico é exercido tanto por células da imunidade inata, células dendríticas e
macrófagos M2, quanto por células da imunidade adaptativa, linfócitos T reguladores (Treg)
entre outros. As células do sistema imune presentes na mucosa intestinal são responsáveis
principalmente pela tolerância local à componentes da microbiota, mas também iniciam
processos inflamatórios após a invasão do epitélio por estes (Abbas et al. 2015).
Dispersas pela lâmina própria são encontradas células da imunidade inata, como
células dendríticas (Becker et al., 2003), macrófagos (Lee et al., 1985), células NK (do
inglês, Natural Killer cells) (Sanos et al., 2009), células linfóides inatas (ILCs) (Ebbo et al.,
2017; Lu et al., 2017) e linfócitos T γδ (Hoytema Van Konijnenburg et al., 2017), e também
células da imunidade adaptativa, dentre estas os linfócitos T αβ CD4+ efetores (Neurath et
al., 2002) e reguladores (Barnes e Powrie, 2009), linfócitos B produtores de anticorpos IgA
(Macpherson et al., 2000) e células iNKT (do inglês, invariant Natural Killer T cells) (Olszak
et al., 2012).
Além das células encontradas na lâmina própria uma série linfócitos atípicos são
encontrados entre as células epiteliais intestinais (compartimento intraepitelial do intestino),
chamados de linfócitos intraepiteliais (IELs), e desempenham funções diretamente contra
os microrganismos do lúmem intestinal, como os linfócitos TCRαβ+ CD4-CD8- (Mayans et
al., 2014), linfócitos TCRαβ+ CD8αα+ (Poussier et al., 2002), linfócitos TCRγδ+ CD8αα+
(Konijnenburg et al., 2017), entre muitos outros (Cheroutre, 2004; Cheroutre et al., 2011).
No intestino delgado de camundongos, os linfócitos T γδ intraepiteliais se localizam
e possuem padrões de motilidade dependentes de microrganismos da microbiota,
comportamento que é alterado em camundongos germ-free após infecção oral por
26
Salmonella enterica Typhimurium e também é dependente de interações com células

epiteliais intestinais (Konijnenburg et al., 2017).
Apesar de bem caracterizados fenotipicamente, ainda há muitas lacunas acerca da
função destes linfócitos na imunobiologia da mucosa intestinal, tanto no contexto de
tolerância como na vigência de processos inflamatórios ou infecciosos, tampouco se sabe
sobre a dependência do glutamato nesse fenômeno (Hooper et al., 2012).
1.3 Doenças inflamatórias intestinais

As doenças inflamatórias intestinais (do inglês, Inflammatory Bowel Disease - IBD)
são distúrbios crônicos que causam inflamação no trato gastrointestinal de humanos, tendo
etiologias multifatoriais (Baumgart and Carding, 2007). Na década passada, as IBDs
emergiram como um desafio de saúde pública mundial devido ao acometimento de mais de
1 milhão de pessoas nos Estados Unidos e mais de 2 milhões na Europa (Burisch et al.,
2013; Kaplan, 2015). Sendo tradicionalmente considerada como uma doença da cultura
ocidentalizada (Estados Unidos, Canadá, Austrália, Nova Zelândia e todos os países da
Europa Ocidental), sua epidemiologia está em mudança desde o final do século 20 e início
do século 21 com a recém industrialização nos países da Ásia, América do Sul e África, os
quais aumentram a incidência de IBD (Molodecky et al., 2012; Kaplan and Ng, 2017).
Dentre os sintomas mais comuns estão dor abdominal, diarreia, perda de peso e
sangramento retal (Sands, 2007). Já as análises de biópsia de pacientes com a doença
ativa mostram infiltração de células mono e polimorfonucleares (neutrófilos), erosão de
enterócitos, perda de células caliciformes, abscessos de criptas e hiperplasia de células
epiteliais intestinais (Morson and Patk, no date). A patogênese das IBDs é complexa e
dependente de diversos fatores, sendo os principais envolvidos a pré-disposição genética,
o meio ambiente e a microbiota, que culminam na ativação desregulada de células imunes
contra a microbiota intestinal (De Souza and Fiocchi, 2016). Resumidamente, o primeiro
evento que ocorre durante a IBD é a perda de integridade da barreira epitelial intestinal, o
que leva a penetração de microrganismos para dentro do tecido intestinal. Em seguida,
células do sistema imune presentes entre o epitélio e na lâmina própria dos intestinos,
principalmente células imunes inatas como granulócitos e macrófagos, geram uma resposta
inflamatória do hospedeiro que leva a disbiose da microbiota intestinal (Ni et al., 2017).
Dentre as IBDs, as formas mais comumente encontradas são a doença de Crohn e
a Colite ulcerativa. Suas etiologias e manifestações são distintas, sendo que a doença de
Crohn é mais esparsa e acomete qualquer região do trato gastrointestinal e a Colite
ulcerativa acomete principalmente a região do cólon (Ng et al., 2017).
27
Diversas células do sistema imune participam do processo de patogênese nas IBD,

tendo como as principais as células da imunidade inata. O infiltrado característico de
neutrófilos contribuem para a perda da integridade e função de barreira intestinal,
destruição tecidual através do dano oxidativo e proteolítico e a constante inflamação devido
a liberação de diversos mediadores inflamatórios (Brazil, Louis and Parkos, 2013). Os
macrófagos participam, principalmente, do processo inflamatório presente na doença de
Crohn, onde possuem um fenótipo misto de macrófagos (CD14, CD33 e CD68) e células
dendríticas (CD205 e CD209), produzindo as seguintes citocinas em abundância IL-6, IL-
23 e TNF. Contribuem também com a produção de IFN-γ por células mononucleares
(Kamada et al., 2008). Já as DCs presentes na mucosa intestinal de humanos com doença
de Crohn e Colite ulcerativa, expressam níveis aumentados de TLR2 e TLR4. Durante a
doença de Crohn, as DCs ainda apresentam níveis reduzidos de RNA mensageiro para
linfopoetina estromal tímica (TSLP), o que contribui com o estado inflamatório destas
células, e um aumento na expressão de CD40 e CCR7 e produção de IL-6 e IL-12. Todos
estes fatores contribuem para a retenção destas células no sítio de inflamação da mucosa
intestinal, provendo a inflamação local(Hart et al., 2005; Rimoldi et al., 2005; Middel et al.,
2006).
Linfócitos T também participam da patogênese de IBD. Os subtipos mais
encontrados na doença de Crohn são Th1 e Th17, onde são produzidas simultaneamente
as citocinas IL-17 e IFN- γ por estas células, acreditando-se ser uma condição de fenótipo
misto de células Th1/Th17 (Annunziato et al., 2007; Globig et al., 2014; Ramesh et al.,
2014). Ainda assim, níveis aumentados de IL-17 também são encontrados na mucosa e no
soro de pacientes com Colite ulcerativa, porém, em menores quantidades que pacientes
com doença de Crohn (Fujino et al., 2003). Recentemente, também foi relato o
envolvimento de células Th9 em pacientes com Colite ulcerativa, as quais produzem a
citocina IL-9 e são poucos estudadas nesse contexto (Gerlach et al., 2014). Células Treg
(CD4+CD25+FoxP3+) possuem sua atividade reguladora prejudicada em pacientes com
IBD. Apesar de estarem expandidas na lâmina própria intestinal, sua capacidade e função
supressora não é o suficiente para controlar o processo inflamatório causado por células
Th1/Th17 durante a patogênese em IBD (Maul et al., 2005; Huibregtse, Van Lent and Van
Deventer, 2007). Diversas terapias, como o uso de anti-TNF, visam expandir e estimular a
função de células Treg presentes na mucosa de crianças e indivíduos adultos com IBD ativa
(Ricciardelli et al., 2008; Veltkamp et al., 2011).
O estudo do envolvimento de células T em IBD se dá, principalmente, através de
modelos experimentais de colite aguda e crônica. Estes são agrupados, em geral, em três,
28
sendo eles: colite induzida por químicos (Wirtz et al., 2007; Neurath, 2012), modelo de colite
de transferência de células T (Powrie, 1995) e modelo de colite crônica espontâneo.
Existem pelo menos três tipos de reagentes químicos utilizados no primeiro modelo citado
acima, sendo o dextran sulfato de sódio (DSS) o principal e mais utilizado na literatura
podendo gerar manifestações agudas ou crônicas e envolvendo, principalmente células
imunes inatas, seguido pelo hapteno ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfônico (TNBS) e pela
oxazolona (Boismenu and Chen, 2000). O modelo de colite de transferência de células T é
o segundo modelo mais estudado, causado pela transferência adotiva de células T naïve
(CD4+CD45RBhigh) a animais deficientes de células T e B (Rag1-/-), possibilitando assim a
investigação de bases imunológicas tanto na indução quanto na progressão da inflamação
intestinal, por ser um modelo crônico mediado por células T (Powrie, 1995; Leach et al.,
1996).
29
Figura 2: Células imunes da mucosa intestinal na homeostase e inflamação. a) Na presença de uma

microbiota balanceada (eubiose), as células epiteliais intestinais secretam mucinas e peptídeos
antimicrobianos (AMPs), induzindo a produção de TSLP, IL-33, IL-25 e TGF-β, o que promove o
desenvolvimento de DCs e macrófagos tolerogênicos. DCs induzem iTregs através de TGF-β e ácido retinóico
(RA). Os plasmócitos produtores de IgA+ são gerados a partir do TGF- β produzidos por iTregs e BAFF e
APRIL produzidos pelas células epiteliais intestinais. O fenômeno chamado de tolerância é induzido e mantido
a partir dessa homeostase e da produção de TGF- β e IL-10 por iTregs e IL-10 também produzida pelos
macrófagos. b) Com a disbiose e/ou lesões teciduais, as células epiteliais intestinais produzem citocinas
inflamatórias (IL-1, IL-6 e IL-18) e DCs e macrófagos produzem IL-6, IL-12 e IL-23, que levam a diferenciação
de células Th1 e Th17. Células Th2 e Th9 também podem ser diferenciadas dependendo das citocinas no
meio, levando a perda da integridade de barreira. Células linfoides inatas (NK, LTi e IEL Tγδ) são ativadas
através das citocinas pró-inflamatórias, produzindo por sua vez IL-22, IL-17A e IL-17F e promovendo o
recrutamento de neutrófilos e proteção da barreira epitelial. Adaptado de De Souza, H. S. P. e Fiocchi,C.
Nature Reviews, 2016.
Contudo, considerando o papel de células T na patogênese de IBD, muito pouco se

sabe sobre a participação do glutamato no agravamento ou melhora da inflamação
intestinal nessas doenças.
1.4 O sistema nervoso entérico

A divisão anatômica classifica o sistema nervoso em SNC e sistema nervoso
periférico (SNP), este último por sua vez é ainda dividido por sua funcionalidade em sistema
nervoso somático (SNS) e sistema nervoso autônomo (SNA). O SNA ainda possui duas
subdivisões, a divisão simpática e a divisão parassimpática. Ambas as divisões regulam as
funções de todos os sistemas e órgãos de mamíferos, involuntariamente. O sistema
nervoso entérico é uma das principais divisões do SNA que é encontrado na parede de todo
o trato gastrointestinal, desde o esôfago até o ânus (Mai e Paxinos, 2011).
O sistema nervoso entérico é o único local onde se encontram grupamentos de
neurônios fora do SNC. Em humanos, o SNE contém aproximadamente 500 milhões de
neurônios, classificados funcionalmente em cerca de 20 classes. É constituído por células
neuronais e por células da glia agrupadas em gânglios interligados uns aos outros por feixes
de fibras nervosas. Os gânglios são relativamente pequenos, porém muito numerosos, o
que condiz com a enorme quantidade de células nervosas encontradas nesse sistema.
Como os gânglios encontrados normalmente no SNP, os gânglios do SNE também
promovem o encontro de dois ou mais neurônios o que gera inervações para todos os
componentes do tubo digestivo, desde a musculatura até o epitélio e vasos sanguíneos.
Outro aspecto que torna o SNE especial, é que seus reflexos independem de comandos do
SNC, o que é controlado pelo intercâmbio de sinais entre os dois sistemas (Furness, 2008).
As primeiras descrições de plexos ganglionares no trato gastrointestinal foram
realizadas pelos médicos e anatomistas Georg Meissner em 1857, Theodor Billroth em
1858 e Leopold Auerbach em 1862. Foram descritos dois tipos de plexos principais
30
encontrados nos intestinos delgados e grosso: o plexo mioentérico ou plexo de Auerbach;

e o plexo submucoso ou plexo de Meissner. O plexo mioentérico é encontrado entre as
camadas musculares longitudinais e circulares do músculo que reveste os intestinos e
apresentam a maior concentração de neurônios. Já o plexo submucoso é encontrado na
camada submucosa que se situa mais internamente em todo o intestino, apresentando a
minoria dos neurônios (Wood et al., 1999); Furness, 2008).
O primeiro mapeamento do SNE utilizando diversas técnicas foi realizado em 2002
(Schemann et al., 2002). Pequenos grupos de corpos de neurônios foram encontrados na
submucosa e mucosa, mais especificamente na lâmina própria do intestino delgado de
humanos e porcos (Fang et al., 1993; Balemba et al., 1998). A inervação da mucosa do
intestino delgado é dividida em quatro componentes: plexo subglandular, plexo
periglandular, plexo subepitelial e plexo viloso. As fibras nervosas que inervam a mucosa
do intestino delgado penetram apenas o tecido conjuntivo da lâmina própria, não
penetrando o epitélio. Por esse motivo, as fibras nervosas interagem com células do
sistema imune ali presentes, o que nos leva a inferir a presença de mecanismos
neuroimunes importantes (Furness, 2008).
A interação entre os neurônios entéricos e o intestino ocorre através da secreção de
neurotransmissores que se ligam à receptores específicos encontrados em diversas células
presentes nas camadas mucosa, submucosa e muscular, incluindo aquelas do sistema
imune. Os primeiros neurotransmissores descritos, secretados por neurônios motores
entéricos excitatórios, foram as taquicininas, como a neuroquinina A, os neuropeptídeos K
e γ, a substância P, e a acetilcolina (Taylor e Bywater, 1986; Holzer et al., 1993).
Ainda na década de 80, foi demonstrada a expressão de receptores para
aminoácidos excitatórios, possivelmente do tipo ionotrópico NMDAR, no plexo mioentérico
em cobaias (Moroni et al., 1986). Outros neurotransmissores também foram relatados, são
estes: ATP, óxido nítrico (NO), peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e peptídeo ativador da
adenilato ciclase da hipófise (PACAP) (Porter et al., 1997; Lecci et al., 2002). Sabe-se que
existe uma relação direta entre a regulação dos neurotransmissores inibidores, em que o
NO regula a liberação de VIP e PACAP, e VIP e PACAP por sua vez estimulam a produção
de NO durante o peristaltismo (Grider et al., 1994).
Mais recentemente foi relatado o papel do glutamato na detecção química de
nutrientes envolvendo nervos gustativos e as vias humoral e neural (vagal) de conexão
entre o intestino e o cérebro que impactam a função intestinal, o comportamento e a
preferência alimentar. Sendo assim, o glutamato age como molécula sinalizadora do
sistema nervoso entérico e modula os reflexos neuroendócrinos do trato gastrointestinal
31
através de sua ligação a neurônios sensores locais que aumentam os processos digestivos
através do reflexo vago-vagal (Tomé, 2018).
Desde a década de 90 estudos relatam a presença de neurônios secretores de
glutamato nos gânglios dos plexos mioentérico e submucoso de porquinhos-da-índia e ratos
(Kirchgessner et al., 1997; Liu et al., 1997). Foi demonstrado que fibras nervosas
glutamatérgicas são abundantes em ambos os plexos ganglionares e na região mucosa.
No íleo de cobaias, todos os neurônios glutamatérgicos co-expressam colina
acetiltransferase (ChAT) e substância P (SP) (Liu et al., 1997). Estes neurônios presentes
no plexo submucoso de cobaias que expressam ChAT e SP são considerados neurônios
aferentes primários que se projetam para a mucosa e respondem a estímulos sensoriais do
intestino (Kirchgessner et al., 1992).
As evidências de receptores ionotrópicos e metabotrópicos de glutamato no sistema
nervoso entérico se deram por imunohistoquímica e hibridização in situ também na década
de 90, onde foi relatado a expressão do RNA mensageiro para NR1 em neurônios do
intestino de ratos (Burns et al., 1994; Burns e Stephens, 1995). Além da subunidade NR1,
as subunidades NR2a e NR2b do receptor NMDA também foram encontradas em neurônios
dos plexos mioentéricos e submucoso do íleo de porquinhos-da-índia (Liu et al., 1997) e do
cólon de ratos, onde também encontraram a subunidade NR1 em fibras nervosas na
mucosa. Sendo assim, o NMDAR pode estar presente tanto em neurônios primários
aferentes espinhais (Mcroberts et al., 2001) quanto vagais (Hornby, 2001).
A concepção de que o sistema nervoso e o sistema imune podem influenciar um ao
outro de maneira sofisticada foi proposta pelo menos há duas décadas atrás (Ader et al.,
1990). Recentemente, sabe-se que o sistema nervoso entérico e o sistema imune estão
intimamente relacionados, pois se associam para manter a homeostase entre o corpo e a
microbiota. Foi demonstrado, por exemplo, que microrganismos comensais regulam a
motilidade intestinal através da interação de neurônios entéricos e macrófagos encontrados
na camada externa da musculatura do intestino grosso (Muller et al., 2014). Além disso, as
fibras nervosas que inervam a mucosa do intestino delgado penetram apenas o tecido
conjuntivo da lâmina própria, local, como já mencionado, de grande abundância de células
do sistema imune e, que, de forma inquestionável devem interagir para promover a
homeostase tecidual (Furness, 2008).
Sendo assim, levando-se em consideração a importância do GALT na modulação da
resposta imune local, associada à presença do neurotransmissor glutamato, seja advindo
do SNE, seja de células dendríticas teciduais ou da dieta, no presente projeto, investigamos
os fenômenos celulares e moleculares presentes nesta interação. Mais especificamente,
32
estudamos o papel do NMDAR na imunobiologia de linfócitos T da lâmina própria intestinal

em modelo murino, tanto na manutenção da homeostase fisiológica, como no advento de
modelos de doenças inflamatórias intestinais, como a colite aguda e crônica, assim como,
na tolerância oral.
Figura 3: Interações neuro-imunes nos intestinos. 1) A maioria das células imunes são encontradas na
região da lâmina própria intestinal, enquanto os corpos celulares neuronais são restritos aos plexos
mioentérico e submucoso, regiões onde também se encontram macrófagos musculares e mastócitos.
Processos neuronais extrínsecos e intrínsecos inervam todas as camadas de ambos os intestinos.
Perturbações no lúmen intestinal são sentidas inicialmente por IECs, células imunes inatas ou diretamente
por neurônios. Entre vários possíveis circuitos neuro-imunes, quatro são descritos: 2) circuito neuro-imune
local curto entre a lâmina própria e células imunes presentes na camada muscular, assim como o sistema
nervoso intrínseco e extrínseco. 3) Interações neuro-imunes vagais envolvendo fibras nervosas aferentes e
eferentes originadas da medula oblonga. 4) a- Interações neuro-imunes de longo alcance com fibras intestino-
fugais projetadas da medula espinhal ou de gânglios b- fibras aferentes e eferentes originadas no gânglio da
raiz dorsal ou medula espinhal, respectivamente. Adaptado de Fernandes, H. V. e Mucida, D. Cell, 2017.
Levando em consideração que fibras nervosas dos plexos submucoso e mioentérico

inervam a mucosa do intestino delgado, penetrando principalmente a lâmina própria, os
neurônios ali presentes interagem com as células do sistema imune encontradas nessa
região através da secreção de neurotransmissores. Como já se sabe, células da imunidade
inata e adaptativa expressam receptores para neurotransmissores excitatórios, como por
exemplo receptores ionotrópicos de glutamato do tipo NMDAR. Na mucosa intestinal são
encontrados linfócitos T abundantemente sendo esses bem caracterizados
33
fenotipicamente, porém com poucas descrições sobre suas funções na imunobiologia da

lâmina própria. Considerando ainda que o glutamato também pode ser absorvido pela dieta
e metabolizado por algumas bactérias comensais da microbiota, nossa hipótese foi que a
deficiência de NMDAR especificamente em linfócitos Tαβ poderia desempenhar um papel
importante na interação entre a microbiota e o hospedeiro, o que poderia levar ao
agravamento de doenças inflamatórias intestinais.
2. OBJETIVOS
Investigar o papel do receptor ionotrópico de glutamato NMDAR presente em células

T αβ na modulação da homeostase e inflamação intestinal.
2.1. Objetivos específicos
● Confirmar a deleção específica do NMDAR em células T αβ CD4+ e CD8+ no baço,

timo, lâmina própria e compartimento intraepitelial intestinais, assim como seus
respectivos linfonodos drenantes por citometria de fluxo e no intestino delgado por
imunofluorescência em camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f;
● Quantificar a expressão gênica das isoformas NR2a, NR2b, NR2c e NR2d do NMDAR
em células do baço, linfonodos mesentéricos e compartimento intraepitelial do intestino
delgado em camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f;
● Avaliar a integridade e permeabilidade da barreira mucosa do intestino delgado em
camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f;
● Caracterizar fenotipicamente os linfócitos T αβ CD4+ e CD8+ e linfócitos T γδ na lâmina
própria e compartimento intraepitelial intestinais e seus respectivos linfonodos drenantes
em camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f naïve e após colite por
citometria de fluxo;
● Avaliar a produção intracelular de IL-10, IL-17 e IFN-γ por linfócitos T αβ CD4+ na lâmina
própria e compartimento intraepitelial intestinais e seus respectivos linfonodos drenantes
em camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f naïve e após colite por
citometria de fluxo;
● Avaliar fenotipicamente os linfócitos T αβ CD4+ e CD8+ e linfócitos T γδ e a produção
intracelular de IL-10, IL-17 e IFN-γ por linfócitos T αβ CD4+ no baço de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f após tolerância oral por citometria de fluxo.
34
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos C57BL/6 Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f, de
ambos os sexos, com 8 a 10 semanas de idade. Ambos os animais foram mantidos em
estantes ventiladas sob condições controladas de temperatura, umidade e iluminação (ciclo
claro/escuro) no Biotério do Departamento de Imunologia. Todos os experimentos foram
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto de Ciências Biomédicas
da Universidade de São Paulo (CEUA-ICB/USP) em 12/11/2018, nº de protocolo
1287040618 (Anexo 1). Para o experimento de colite através da transferência de células
T, foram utilizados camundongos machos Rag1-/- de 8 semanas de idade obtidos do
Jackson Laboratory e mantidos no Biotério do Brigham and Women’s Hospital na Harvard
Medical School aprovados pela Comissão de Animais, segundo protocolo 2016N000230
(Anexo 2).
3.2 Tolerância Oral

Camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f de 8 semanas de idade foram
alimentados continuamente com 8 mg/mL de ovalbumina (OVA) em sua água por 5 dias.
Animais controles de ambas as linhagens receberam apenas água comum. Três dias após
a ingestão de OVA, todos os grupos foram imunizados com 50 µg de OVA no adjuvante
completo de Freund (CFA - BD Biosciences, 231131) em seus flancos ventrais, pela via
subcutânea (s.c.). Respostas in vitro e in vivo foram avaliadas 10 dias após a imunização.
Para a análise in vitro, células do baço foram estimuladas com 100 µg/mL de OVA (livre de
LPS) ou com 1 µg/mL de anti-CD3, para a avaliação antígeno-específica ou não,
respectivamente, através da dosagem da incorporação de timidina trifosfato (Sigma,
T0251). Além disso, para as análises in vivo, células do baço também foram avaliadas por
citometria de fluxo, conforme o item 3.10.
3.8 Colite induzida com DSS

Camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f de 8 semanas de idade foram
submetidos ao modelo experimental de colite aguda através da administração de 2.5% de
DSS (Colitis grade, 36.000-50.000, MP Biomedicals, 9011-18-1) em sua água por sete dias
e, após este período, este foi substituído por água normal pelos próximos três dias. No dia
10 após o início do tratamento, os animais foram sacrificados para as análises de histologia
intestinal, conforme o item 3.12, e de células do cólon e linfonodos cecais por citometria de
35
fluxo, conforme o item 3.10. O peso corporal e os seguintes sinais e sintomas clínicos e
macroscópicos foram monitorados diariamente: perda de peso, diarreia, sangue oculto nas
fezes, sangramento retal, comprimento do intestino grosso, adesões e obstruções
intestinais. Para o modelo experimental de colite aguda, camundongos Cd4CrexGrin1f/f e
seus controles Grin1f/f de 8 semanas de idade ingeriram 2.5% de DSS em sua água por
sete dias, em três ciclos. O primeiro e segundo ciclo incluíram sete dias de DSS seguido de
14 dias de repouso, através da substituição por água normal, e o terceiro ciclo consistiu em
sete dias de DSS seguido por três dias de repouso com água normal. Os animais foram
sacrificados no dia 52 para as mesmas análises do modelo de colite aguda.
3.9 Colite induzida por transferência de linfócitos T

Camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f foram sacrificados e o baço e
linfonodos foram coletados para o enriquecimento de células T CD4+ com as microbeads
de isolamento CD4 mouse (MACS, 130-117-043, clone L3T4), seguido pelo cell sorting de
células T CD4+ naïve (CD4+CD45RBhighCD25-) em citômetro FACSAria II cell sorter (BD
Bioscience). Após a separação, as células T CD4+ naïve de ambos os grupos foram
processadas, individualmente e contadas. 0.6x10 6 células, de cada grupo, foram
transferidas ao camundongo receptor Rag1-/- no dia 0 de tratamento. Nas primeiras três
semanas, ambos os grupos receptores Rag1-/- foram monitorados quanto a perda de peso
uma vez por semana. Após a terceira semana da transferência adotiva, os animais
passaram a ser monitorados quanto a perda de peso diariamente, assim também foram
monitorados os sinais e sintomas clínicos da colite crônica. Ambos os grupos foram
sacrificados 12 semanas após a transferência adotiva de células T CD4+ naïve para as
análises de histopatologia e citometria de fluxo, conforme descritas anteriormente.
3.5 Separação magnética de células T CD4+ e CD8+ do baço

Camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f foram sacrificados e o baço
foi coletado e depositado em peneiras de 70 μm (Cell Strainer) para posterior maceração
com êmbolo de seringa de 1 mL em meio RPMI1640 (LGC Biotecnologia). As células em
suspensão foram centrifugadas a 500 g por 5 minutos, a 4 ºC e o sobrenadante foi
descartado. O pellet foi ressuspendido em 1 mL de tampão de lise celular e aguardamos
um minuto para a lise das hemácias. Em seguida, foi adicionado 9 mL de PBS 1x e o tubo
foi novamente centrifugado a 500 g por 5 minutos, a 4 ºC e o sobrenadante foi descartado.
O pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio RPMI completo (1% l-glutamina, 1%
aminoácidos não-essenciais, 1% penicilina/streptomicina, 1% piruvato de sódio, 1% MEM-
36
vitamina e 10% de soro bovino fetal - SBF) para a contagem celular. Para o enriquecimento
e separação de células CD4+ ou CD8+ foram utilizados os kits MagniSort TM Mouse CD4 T
Cell Enrichment Kit e MagniSortTM Mouse CD8 T Cell Enrichment Kit, separadamente. Parte
das células foram ressuspendidas na concentração de 1 x 10 7 células/100 µL e depositadas
em tubo de 5 mL. Em seguida, foi adicionado 20 µL do coquetel de anticorpos de cada kit,
separadamente, a cada 100 µL de suspenção celular e o tubo foi vortexado e incubado por
10 minutos a temperatura ambiente (TA). As células foram lavadas e seus sobrenadantes
descartados. A seguir, foi adicionado a mesma proporção das beads de seleção negativa
e as amostras foram novamente incubadas por 5 minutos a TA. Foi adicionado até 2.5 mL
do volume total do tampão de separação e foi homogeneizado por pipetagem. O tubo foi
inserido dentro do magneto e as amostras foram incubadas por mais 5 minutos a TA. O
sobrenadante foi passado para um novo tubo, vertendo cuidadosamente por 1 segundo.
Nesse sobrenadante estavam contidas as células negativamente selecionadas, CD4+ ou
CD8+. As células foram passadas para novos tubos de 1.5 mL e armazenadas em TRIzol
para posterior análise por PCR em tempo real.
3.6 Obtenção de células do baço, timo, linfonodos mesentéricos e cecais

Após o sacrifício dos animais, o baço, timo, linfonodos mesentéricos e cecais foram
coletados e depositados em peneiras de 70 μm dentro de placas de Petri para maceração
com êmbolo de seringa de 1 mL em meio RPMI. As células em suspensão foram
centrifugadas a 500 g por 5 minutos, a 4 ºC e o sobrenadante foi descartado. As hemácias
provenientes apenas do baço foram lisadas conforme descrito no item acima. Após isso o
pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio RPMI completo para a contagem de células
viáveis coradas com 0,5% de azul de tripan em câmara de neubauer. Posteriormente, as
células foram ou armazenadas em TRIzol® (Invitrogen, EUA) para posterior análise por PCR
em tempo real ou submetidas ao protocolo de marcação extra e intracelular para determinar
sua frequência e fenótipo por citometria de fluxo.
3.7 Obtenção de células da mucosa do intestinal

Após a retirada dos linfonodos mesentéricos, foram coletados o intestino delgado e
grosso. Ambos os intestinos foram depositados em uma placa de Petri contendo 10 mL de
HBSS livre de cálcio e magnésio (-/-) gelado com 5% de SBF e 25 mM de HEPES.
Primeiramente, realizamos a limpeza do tecido através da remoção de todo o tecido
conjuntivo e a gordura do mesentério. Após isso, todas as placas de Peyer foram removidas
do intestino delgado e, ambos os intestinos, foram abertos através de um corte longitudinal.
37
Com os intestinos abertos, as fezes e muco foram removidos. Foram realizados cortes de
1,5 a 2 cm e os pedaços de tecido foram adicionados a um tubo cônico de 50 mL contendo
10 mL de HBSS -/- com 10% de SBF, 15 mM de HEPES, 5 mM de EDTA e 1 mM de DL-
Dithiotreitol (DTT). O tubo foi incubado por 20 minutos em um agitador aquecido à 37 ºC.
As células do epitélio e da lâmina própria foram separadas de acordo com as etapas 3.7.1
e 3.7.2, respectivamente. Passamos os pedaços de intestino delgado sobre uma peneira
de aço inoxidável depositada em um becker de 500 mL para a remoção do sobrenadante,
onde estão contidas as células epiteliais e linfócitos intraepiteliais. Os pedaços do tecido
foram transferidos a um novo tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de HBSS -/- com 2
mM de EDTA e 25 mM de HEPES, livre de SBF e agitados por aproximadamente 30
segundos. O conteúdo foi novamente depositado sobre a peneira. Este procedimento foi
repetido mais duas vezes, para a separação completa das células epiteliais e intraepiteliais.
3.7.1 Linfócitos intraepiteliais intestinais

A suspensão celular contida no sobrenadante foi filtrada em peneira de 70 μm sobre
de um novo tubo cônico de 50 mL e centrifugada a 500 g por 5 minutos, a 4 ºC. O
sobrenadante foi descartado. O pellet foi ressuspendido em 5 mL de Percoll a 37% e, em
seguida, transferido para um novo tubo de 15 mL e centrifugado a 800 g por 20 minutos, a
22 ºC com o freio desligado. Após isso, o sobrenadante foi removido cuidadosamente por
aspiração e o pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio RPMI e, novamente, transferido
para um novo tubo de 15 mL. Foi adicionado mais 9 mL do meio ao tubo e este foi
centrifugado a 500 g por 5 minutos, a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspendido em 1 mL de meio RPMI completo para posterior contagem de células e
armazenagem em TRIzol para posterior análise por PCR em tempo real ou marcação para
análise por citometria de fluxo.
3.7.2 Linfócitos da lâmina própria intestinal

Após a separação de células epiteliais e linfócitos intraepiteliais, os pedaços de
intestino delgado e grosso foram transferidos para um novo tubo de 2 mL contendo 1 mL
de HBSS -/- com 2 mM de EDTA e 25 mM de HEPES, livre de SBF. Os tecidos foram
novamente cortados em pedaços menores e os tubos centrifugados a 2000 g por 1 minuto,
a 4 ºC. O sobrenadante, contendo o restante de gordura, foi removido com o auxílio de uma
pipeta Pasteur. Os pellets foram ressuspendidos em 1 mL da solução de digestão recém-
preparada contendo meio X-Vivo, 0.5 mg de Liberase TL Research Grade(Roche-Sigma
Aldrich, 5401020001) e 0.2 mg de DNase do tipo I (Sigma) e, em seguida, transferidos para
38
um novo tubo cônico de 50 mL. Adicionamos mais 9 mL da solução de digestão a cada tubo
e este foram incubados por 35 minutos em um agitador aquecido à 37 ºC. Foi adicionado
10 mL de HBSS com 5 mM de EDTA após a incubação, para estacionar a ação enzimática
da Liberase e DNase, e o conteúdo foi depositado em uma peneira de 100 μm sobre um
novo tubo cônico de 50 mL. O tecido sobre a peneira foi macerado com o auxílio de um
êmbolo de seringa de 1 mL e, em seguida, adicionamos mais 10 mL de HBSS (-/-) com 5%
de SBF e 25 mM de HEPES sobre o tecido. A suspenção foi centrifugada a 500 g por 5
minutos, a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspendido em 5 mL de
Percoll a 37%e, em seguida, transferido para um novo tubo de 15 mL e centrifugado a 800
g por 20 minutos, a 22 ºC com o freio desligado. Após isso, o sobrenadante foi removido
cuidadosamente por aspiração e o pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio RPMI e,
novamente, transferido para um novo tubo de 15 mL. Foi adicionado mais 9 mL do meio ao
tubo e este foi centrifugado a 500 g por 5 minutos, a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e
o pellet ressuspendido em 1 mL de meio RPMI completo para posterior contagem de células
e marcação para análise por citometria de fluxo.
3.8 Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA)

O mRNA foi extraído utilizando a técnica de TRIzol seguindo especificações do
fabricante. Brevemente, foi adicionado 1 mL do reagente TRIzol sobre a suspensão celular
de cada tecido analisado. Posteriormente adicionou-se 500 µL de clorofórmio, após
centrifugação, a fase aquosa foi retirada e transferida para outro tubo seguido da adição de
500 µL de isopropanol. Após 10 minutos a T.A. as amostras foram centrifugadas e o
sobrenadante descartado. Ao pellet, foi adicionado 1 mL etanol 75% e centrifugado, o etanol
foi retirado. A última etapa foi realizada 3x para se obter RNA livre de contaminações. Por
final, após a última centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o tubo mantido invertido
na bancada até a secagem total do pellet. Ao final, adicionou-se ao pellet água ultrapura e
a concentração de RNA total foi determinada em NanoDrop (Thermo) dentro dos
parâmetros de 260/280nm. Para a extração de RNA do soro foi utilizado o kit de extração
QIAmp viral RNA mini (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante.
Para a síntese de cDNA, foi realizada uma reação de transcrição reversa a partir do
RNA total purificado. Para tanto, 2,0 µg de RNA diluídos em 10 µL de água ultrapura foram
adicionados a 10 µL de mix (2 µL RT buffer, 2 µL de RT random primers, 1 µL de multscribe
e 0,8 µL de dNTPs e 4,2 µL de água ultrapura). A síntese de cDNA foi realizada no
termociclador da Applied Biosystems seguindo os seguintes parâmetros: 25°C por 10
minutos; 37° C por 120 minutos; e 85° C por 5 minutos.
39
3.9 Quantificação de mRNA por PCR em Tempo Real

A partir do cDNA obtido, foi avaliada a expressão de mRNA por PCR em tempo real
(pPCR). A cada reação de PCR, foi adicionado 200 µM do primer forward, 200 µM do primer
reverse sintetizados, 5 µL de SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4309155) e 46
ng de cada amostra de cDNA totalizando um volume final da reação de 10 µL. A reação de
qPCR foi realizada no aparelho QuantStudio3 (Applied Biosystems) e submetidas aos
seguintes ciclos: 1 - 50°C por 2 minutos; 2 - 95°C por 2 minutos; 3 - 95°C por 15 segundos
e 4 - 60°C por 1 minutos. Os passos 3 e 4 foram repetidos 40 vezes. As curvas foram
normalizadas pela expressão da β-actina. A expressão gênica foi dada pela fórmula 2–ΔΔCt
(Fold change), onde ΔΔCt = ΔCt (experimental) – ΔCt (controle), e ΔCt é o Ct do gene alvo
subtraído do Ct do gene endógeno. Segue abaixo a lista dos genes e as sequências dos
primers utilizados para avaliação dos genes que compõem a subunidade NR2 (Grin2) do
NMDAR e genes relacionados as subpopulações de linfócitos T helper (Tabela 1).
Gene Espécie Sequência Forward Sequência Reverse

Actb camundongo GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
Grin2a camundongo ACGTGACAGAACGCGAACTT TCAGTGCGGTTCATCAATAACG
Grin2b camundongo GCCATGAACGAGACTGACCC GCTTCCTGGTCCGTGTCATC
Grin2c camundongo GCCCTGCTTCTCACTTCACTC GTTGGTATTGTTGACCCCGAT
Grin2d camundongo TGGAGGAGTACGACTGGACAT CGCACTGACACTACGGAGC
Il2 camundongo TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC
Il6 camundongo GCCTTCTTGGGACTGATGCT TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG
Il17 camundongo TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA CTTTCCCTCCGCATTGACAC
Foxp3 camundongo CCCATCCCCAGGAGTCTTG ACCATGACTAGGGGCACTGTA
Tbx21 camundongo AGCAAGGACGGCGAATGTT GGGTGGACATATAAGCGGTTC
Tabela 1. Lista de primers utilizados para avaliação de mRNA dos genes em interesse.
3.10 Citometria de fluxo

As suspensões celulares do baço, timo, lâmina própria (LP) e linfócitos intraepiteliais
(IEL) do intestino delgado, cólon-LP e IEL, céco-LP, linfonodos mesentéricos e linfonodos
cecais foram submetidas ao protocolo de marcação de superfície ou estimuladas por 3
horas com 50 ng/mL de PMA (Sigma), 1 µM de ionomicina (Sigma-Aldrich) e 1 mg/mL de
monensina ou Golgi Stop (BD Biosciences) em estufa a 37 ºC, contendo 5% de CO 2, para
marcação de citocinas intracelulares. Para a marcação de superfície, as células foram
40
incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente com 1:1000 de Zombie Aqua Fixable
Viability (Biolegend), para exclusão de células mortas. Em seguida, as células foram
lavadas com FACS Buffer (HBSS -/-, 2% de SBF, 2 mM de EDTA e 25 mM de HEPES) e
incubadas com o coquetel de anticorpos anti-mouse: CD4 (1:300 - BV605), CD8a (1:300 -
BV711), CD8b (1:300 - APC-Cy7), CD25 (1:200 - PE), CD45 (1:300 - BUV395), CD103
(1:200 - BUV496), TCRβ (1:200 - PE-Cy7) e TCRγδ (1:200 - PercP) (Biolegend) por 30
minutos a 4 ºC, diluídos em FACS Buffer. Para a marcação do NMDAR foi utilizado 1:100
do anticorpo biotinelado anti-NMDAR1 (Biolegend, 818606), junto com os marcadores de
superfície, seguido pela incubação por mais 30 minutos a 4 ºC com 1:300 da estreptavidina
(BV421, Biolegend, 405226). Após as incubações relatadas, as células foram novamente
lavadas com FACS Buffer e o sobrenadante removido. As suspensões utilizadas para o
painel de marcação de NMDAR1 foram em seguida adquiridas, sem fixação. As demais
células foram fixadas por 20 minutos a temperatura ambiente com o fixador
Cytoperm/Cytofix Transcriptional Factor Staining Buffer Set (eBioscience-Invitrogen, 00-
5523-00) e lavadas e ressuspendidas em FACS Buffer para então serem adquiridas. Para
a marcação intracelular, após a incubação de três horas as células passaram pelas mesmas
etapas descritas acima (marcação de viabilidade, coquetel de anticorpos de superfície e
fixação). As células foram permeabilizadas com Perm/Wash Buffer (eBioscience) e lavadas
em seguida a fixação. O sobrenadante foi removido e, em seguida, foi adicionado o seguinte
coquetel de anticorpos intracelulares anti-mouse: IL-10 (1:100 - PE-TexasRed), IL-17 (1:100
– BV711), IFN-γ (1:100 - BV421) e FoxP3 (1:100 - AlexaFluor 488) (Biolegend) diluídos em
Perm/Wash, e as células foram incubadas de 30 minutos a 1 hora a 4 ºC. A seguir, as
células foram lavadas novamente e ressuspendidas em FACS ou Perm/Wash Buffer. As
aquisições de citometria de fluxo foram realizadas no citômetro FortessaLSR ou Symphony
(BD Biosciences) utilizando o software DIVA (BD Biosciences). Todos os dados foram
analisados no software FlowJo versão X.07 (TreeStar Inc.).
3.11 Permeabilidade e trânsito intestinal

Os animais foram mantidos em jejum absoluto por 6 horas e, após este período, foi
administrado 150 µL (120 µg) de Dextran-FITC 4-kDa diluído em água via intragástrica por
gavagem e a água e ração repostas. Os animais foram sacrificados após 2 horas da
administração por deslocamento cervical e o sangue total foi coletado por punção cardíaca,
adicionado a um tubo de 1.5 mL e o soro foi separado após centrifugação a 2000 g por 5
minutos, em temperatura ambiente. Em seguida, foi realizado a perfusão do animal com
PBS 1x e o intestino delgado foi coletado e posicionado em uma placa de Petri contendo
41
aproximadamente 10 mL de PBS 1x gelado. Com o intestino ainda inteiro, os segmentos

intestinais duodeno, jejuno e íleo foram separados e colocados em seus respectivos tubos
de 1.5 mL contendo 1 mL de PBS 1x. O tecido intestinal foi cortado com o auxílio de uma
tesoura cirúrgica em pedaços pequenos, os conteúdos luminais liberados foram
homogeneizados por 45 segundos e as partículas grossas foram removidas por
centrifugação a 300 g por 5 minutos, a 4 ºC. O sobrenadante foi utilizado para mensurar o
Dextran-FITC. Para a mensuração por fluorescência, o soro foi diluído 1:5 em água Milli-Q
e o sobrenadante dos conteúdos intestinais foi diluído 1:100 também em água Milli-Q. A
fluorescência foi medida pelo espectrofotômetro em placa de 96 wells branca na excitação
de 485 nm e emissão em 525 nm. As concentrações de Dextran-FITC foram determinadas
de acordo com a curva padrão também diluída em água Milli-Q de 0 a 500 µg/mL. Os sinais
de emissão no plasma e no sobrenadante dos conteúdos intestinais de animais tratados
apenas com água foram subtraídos dos camundongos tratados com Dextran-FITC 4-kDa.
3.12 Histologia do cólon

O cólon dos animais provenientes dos modelos de colite aguda e crônica, através da
administração de DSS e transferência adotiva de células T, foram extraídos e, em seguida,
realizamos a abertura e limpeza das fezes e muco. Em seguida, o tecido intestinal foi fixado
em paraformaldeído 4% gelado diluído em PBS 1x durante 24 a 48 horas a 4 ºC. Após a
fixação, foi utilizada a técnica de Swiss Roll para enrolar o cólon e os tecidos foram
adicionados ao álcool 70%. As amostras foram enviadas ao serviço de histologia da
Harvard Medical School para serem seccionadas em 5 μm de espessura em micrótomo
automático (Leica Biosystems). Lá, as lâminas também foram coradas com hematoxilina e
eosina (H&E) e avaliadas por patologistas treinados quanto aos seguintes parâmetros para
a análise do escore histológico da colite através do dano tecidual: 0 - normal; 1 - foco isolado
de dano epitelial e presença de neutrófilos na lâmina própria; 2 - erosões e ulcerações na
mucosa, com infiltrado mononuclear; 3 - dano tecidual extenso, hiperplasia de epitélio,
perda de células caliciformes e abcessos nas criptas; 4 - inflamação transmural. Em
seguida, realizamos o escaneamento das lâminas em microscópio DMi8 Widefield (Leica
Biosystems) no aumento de 20X. As imagens foram analisadas através da plataforma
online eSlide Manager (Aperio).
3.13 Imunofluorescência do intestino delgado

O intestino delgado de camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f naïve
foram e, em seguida, realizamos a abertura e limpeza das fezes e muco. Em seguida, o
42
tecido intestinal foi segmentado em duodeno, jejuno e íleo e fixado em paraformaldeído 4%

gelado diluído em PBS 1x durante 24 a 48 horas a 4 ºC. Após a fixação, foi utilizada a
técnica de Swiss Roll para enrolar cada segmento individualmente e os tecidos foram então
desidratados em um gradiente de sacarose, sendo a primeira concentração a 15% por 12
horas e a segunda concentração a 30% por 24 a 36 horas a 4 ºC, em tubos cônicos de 15
mL. Após isso, as amostras foram congeladas em OCT TissueTek (Sakura) com gelo seco
e mantidas no freezer -80 ºC. Em seguida, as amostras foram seccionadas em micrótomo
automático (Leica Biosystems) em 18 μm de espessura e posicionadas sobre lâminas
polarizadas SuperFrost Plus (VWR International). Após a secagem das lâminas, foi
adicionado acetona para fixação dos segmentos intestinais, até sua total evaporação. Após
esta etapa, as lâminas foram lavadas com PBS 1x por 5 minutos a temperatura ambiente
três vezes. Em seguida, foi realizado o bloqueio com a solução de PBS 1x contendo 10%
de soro normal de cavalo (NHS), 2% de albumina sérica bovina (BSA), 1% de glicina e 0.1%
de Triton X-100 por 1 hora a temperatura ambiente. Foram adicionados os anticorpos
primários hamster anti-mouse CD3e (BD Pharmingen, 553057, 1:300) e rabbit anti-mouse
NMDAR1 (Abcam, ab109182, 1:100) diluídos em PBS 1x com 5% de NHS e 2% de BSA, e
as lâmina foram incubadas overnight a 4 ºC. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas
com PBS 1x por 5 minutos a temperatura ambiente três vezes e os anticorpos secundários
goat anti-rabbit AlexaFluor488 (Abcam, ab150077, 1:500) e goat anti-hamster Cy5 (Jackson
ImmunoResearch, 112-175-143, 1:500) foram adicionados e as lâminas incubadas por 1
hora a temperatura ambiente. Por fim, removemos os anticorpos secundários, as lâminas
foram secas e adicionamos o meio de montagem com DAPI (Invitrogen), para a marcação
dos núcleos celulares. Em seguida, foram adicionadas lamínulas sobre as lâminas e o
escaneamento foi realizado através do microscópio confocal LSM710 (Zeiss). As imagens
foram analisadas no software ImageJ.
3.14 Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do software computacional
GraphPad Prism (GraphPad Software Incorporation) versão 8.0. O método utilizado para
comparação entre duas condições foi o teste t-Student e a significância entre os grupos foi
estatisticamente considerada quando P0.05.
43
4. RESULTADOS
4.1 Expressão de NMDAR por linfócitos T αβ

Camundongos Cd4CrexGrin1f/f foram gerados através do cruzamento das linhagens
Cd4Cre e Grin1f/f. Vale ressaltar que a linhagem Cd4Cre promove a deleção do gene floxeado
(Grin1 - NMDAR) não somente em linfócitos T CD4+, mas também em linfócitos T CD8+.
Isto se deve ao fato de timócitos expressarem ambos os correceptores (CD4+ e CD8+) no
estágio duplo positivo de seu desenvolvimento no timo.
Inicialmente, avaliamos a expressão de NMDAR em linfócitos T αβ CD4+ (Figura 4)
e CD8+ (Figura 5) do baço, timo, linfonodos mesentéricos e cecais, lâmina própria e
compartimento intraepitelial dos intestinos delgado e cólon em camundongos
Cd4CrexGrin1f/f e seus controles Grin1f/f através da técnica de citometria de fluxo.
Figura 4: Avaliação da expressão de NMDAR por linfócitos T αβ CD4+ no baço, timo, linfonodos
mesentéricos e cecais, lâmina própria e compartimento intraepitelial do intestino delgado e cólon.
Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com 8 semanas de idade e todos os tecidos citados
foram removidos. O percentual da subunidade NR1 do NMDAR em células T αβ CD4+ foi avaliado por
citometria de fluxo. Foram utilizados de 2 a 5 camundongos por grupo, provenientes de dois experimentos
independentes.
44
Figura 5: Avaliação da expressão de NMDAR por linfócitos T αβ CD8+ no baço, timo, linfonodos
mesentéricos e cecais, lâmina própria e compartimento intraepitelial do intestino delgado e cólon.
Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com 8 semanas de idade e todos os tecidos citados
foram removidos. O percentual da subunidade NR1 do NMDAR em células T αβ CD8+ foi avaliado por
citometria de fluxo. Foram utilizados de 2 a 5 camundongos por grupo, provenientes de dois experimentos
independentes. *Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
Todos os tecidos linfoides de camundongos Cd4CrexGrin1f/f, com exceção dos

linfonodos mesentéricos (Figura 1C e 2C) apresentaram níveis reduzidos, mas não
estatisticamente diferentes, da proteína NMDAR em linfócitos T αβ CD4+ e CD8+ quando
comparados ao grupo controle Grin1f/f. Apenas a expressão de NMDAR em linfócitos T
CD8+ presentes no timo se mostrou estatisticamente reduzida no grupo experimental
(Figura 2B).
Devido ao fato de linfócitos T αβ CD4+ e CD8+ expressarem em maiores níveis o
NMDAR quando encontrados em ambos os compartimentos (lâmina própria e linfócitos
intraepiteliais) dos intestinos delgado e cólon, também avaliamos a expressão do NMDAR
por células T αβ presentes nos segmentos duodeno, jejuno e íleo do intestino delgado por
imunofluorescência (Figura 3). É possível notar que células T αβ (CD3 - marcação em
vermelho) expressam NMDAR (NR1 - marcação em verde), representados em laranja
através das setas brancas, apenas em camundongos do grupo controle Grin1f/f (Figura 3A)
e não em camundongos Cd4CrexGrin1f/f (Figura 3B). Assim sendo, observamos a deleção
condicional de NMDAR em linfócitos T αβ CD4+ e CD8.
45
Figura 6: Expressão de NMDAR por linfócitos T αβ no intestino delgado. Camundongos Grin1f/f e

Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com 8 semanas de idade e o intestino delgado foi removido e processado
para histologia, conforme descrito no item 3.13 de materiais e métodos. A expressão de NMDAR em células
T αβ totais presentes no duodeno, jejuno e íleo foi avaliada por imunofluorescência. A subunidade NR1 (e
verde) do NMDAR, as células T αβ totais CD3+ (em vermelho) e a co-expressão de ambos os marcadores
apontados pelas setas brancas (em laranja) estão representados acima. Sendo A representativo do
camundongo controle Grin1f/f e B representativo do grupo experimental Cd4CrexGrin1f/f. As imagens foram
adquiridas no microscópio confocal LSM710 (Leica) e analisadas através do software ImageJ.
46
A fim de compreendermos se a deleção do NMDAR especificamente em linfócitos T

αβ pode interferir na expressão gênica das outras subunidades que compõem este
receptor, avaliamos a expressão gênica das isoformas NR2 (Grin2a, b, c e d) no baço,
linfonodos mesentéricos e intestino delgado de camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus
controles Grin1f/f por qPCR (Figura 7). Não foi possível identificar a expressão gênica das
subunidades NR2a (Grin2a) nas subpopulações de linfócitos T αβ CD4+ provenientes do
baço de ambos os grupos. Observamos um aumento na expressão gênica da subunidade
NR2d (Grin2d) em linfócitos T αβ CD4+ do baço e em células totais dos linfonodos
mesentéricos de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em comparação a seus controles Grin1f/f
(Figura 7C e K). Além disso, células totais dos linfonodos mesentéricos de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f também expressam o gene da subunidade NR2c (Grin2c) em níveis
aumentados (Figura 7J). Não notamos alterações na expressão gênica das isoformas NR2
em células T αβ CD8+ derivadas do baço e em linfócitos intraepiteliais do intestino delgado
entre os grupos.
4.2 Alteração na expressão de genes relacionados ao fenótipo Th1, Th17 e Treg no

baço, linfonodos mesentéricos e compartimento intraepitelial do intestino delgado
de camundongos Cd4CrexGrin1f/f
Com o intuito de determinar o fenótipo das células T αβ CD4+ do baço, linfonodos
mesentéricos e compartimento intraepitelial do intestino delgado, avaliamos a expressão
de genes para citocinas e fatores de transcrição envolvidos com as subpopulações de
linfócitos Th1 (Il2, Tbx21), Th17 (Il6, Il17) e Treg (Foxp3) em camundongos Cd4CrexGrin1f/f
e seus controles Grin1f/f através da técnica de PCR em tempo real (Figura 8). Foi possível
observar que linfócitos T αβ CD4+ do baço e células totais dos linfonodos mesentéricos de
camundongos Cd4CrexGrin1f/f expressam Tbx21 em níveis aumentados (Figura 8E e J),
sugerindo um aumento do fator de transcrição Tbet responsável pela diferenciação da
subpopulação Th1.
Além disso, células totais derivadas dos linfonodos mesentéricos também
apresentaram um aumento na expressão dos genes Il6 (Figura 8G) e Il17 (Figura 8H) em
camundongos Cd4CrexGrin1f/f quando comparados ao grupo controle, sugerindo também
um aumento na diferenciação da subpopulação Th17.
Já os linfócitos intraepiteliais do intestino delgado de camundongos Cd4CrexGrin1f/f
mostraram um aumento na expressão gênica de Il2 (Figura 8K) e Il6 (Figura 8L), sugerindo
uma possível modulação das subpopulações Th1 e Th17.
47
Figura 7: Expressão gênica das isoformas NR2a, NR2b, NR2c e NR2d do NMDAR no baço, linfonodos
mesentéricos e intestino delgado. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com 8
semanas de idade e foram removidos o baço, os linfonodos mesentéricos e o intestino delgado. Os linfócitos
T αβ CD4+ e CD8+ do baço foram separados por coluna magnética, enquanto foram avaliadas as suspensões
celulares totais dos linfonodos mesentéricos e do compartimento intraepitelial do intestino delgado. As
suspensões celulares de cada tecido foram armazenadas em TRIzol para posterior extração do mRNA. Em
seguida, foi realizado a síntese do cDNA de cada respectiva amostra e o PCR em tempo real para a análise
dos genes Grin2a, Grin2b, Grin2c e Grin2d. Foram utilizados de 6 a 17 camundongos por grupo, provenientes
de três experimentos independentes. *Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
48
Figura 8: Expressão gênica de Il2, Il6, Il17, Foxp3 e Tbx21 no baço, linfonodos mesentéricos e intestino
delgado. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com 8 semanas de idade e foram
removidos o baço, os linfonodos mesentéricos e o intestino delgado. Os linfócitos T αβ CD4+ do baço foram
separados por coluna magnética, enquanto foram avaliadas as suspensões celulares totais dos linfonodos
mesentéricos e do compartimento intraepitelial do intestino delgado. As suspensões celulares de cada tecido
foram armazenadas em TRIzol para posterior extração do mRNA. Em seguida, foi realizado a síntese do
cDNA de cada respectiva amostra e o PCR em tempo real para a análise dos genes Il2, Il6, Il17, Foxp3 e
Tbx21. Foram utilizados de 4 a 6 camundongos por grupo, provenientes de três experimentos independentes.
Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
4.3 A deleção de NMDAR especificamente em linfócitos T αβ não prejudica a

permeabilidade e o trânsito intestinal
Em seguida, investigamos o papel do NMDAR expresso por linfócitos T αβ no
controle da barreira mucosa intestinal, uma vez que o glutamato desempenha funções na
homeostase de células epiteliais intestinais. Para tanto, realizarmos análises de
permeabilidade e trânsito intestinal em camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles
Grin1f/f. Ambos os grupos foram submetidos ao jejum absoluto por 6 horas e, em seguida,
foi administrado 12 µg Dextran-FITC/animal. Após o período de duas horas, o qual coincide
com o pico de Dextran-FITC no sangue, foram coletados o sangue total por punção cardíaca
e o intestino delgado. O intestino delgado foi segmentado nas porções duodeno, jejuno e
49
íleo e seu conteúdo luminal foi quantificado por fluorescência, determinando assim o
trânsito intestinal. Na Figura 9A está ilustrado o desenho experimental. Foi possível notar
uma concentração de Dextran-FITC semelhante no soro dos animais de ambos os grupos,
sugerindo assim que não houve alterações na permeabilidade intestinal (Figura 9B), em
decorrência da deleção do NMDAR em linfócitos T αβ. O mesmo foi notado na concentração
de Dextran-FITC presente no conteúdo luminal dos segmentos duodeno, jejuno e íleo do
intestino delgado avaliados (Figura 9C), novamente sugerindo que não houve mudanças
no trânsito intestinal entre os grupos.
A.
Figura 9: Avaliação da permeabilidade e trânsito intestinal. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f de 8

semanas de idade foram mantidos em jejum por 6 horas. Foi administrado via intragástrica (gavagem) 12 µg
de Dextran-FITC 4-kDA por animal e a água e ração foram repostas. Após duas horas, os camundongos
foram sacrificados e o sangue total e intestino delgado foram removidos. O soro e o conteúdo luminal dos
segmentos duodeno, jejuno e íleo intestinais foram analisados quanto a concentração de Dextran-FITC pelo
ensaio fluorescência através de espectofotometria. Foram utilizados de 12 a 14 camundongos por grupo,
provenientes de três experimentos independentes.
50
4.4 A deleção de NMDAR especificamente em linfócitos T αβ leva a distribuição

alterada das subpopulações CD4+ e CD8+ em tecidos linfoides de camundongos
naïve
Avaliamos o efeito da deleção do NMDAR em linfócitos T αβ na distribuição de
linfócitos T αβ CD4+ e CD8+, assim como linfócitos T γδ, nos tecidos linfoides primário
(timo) e secundários (linfonodos mesentéricos e cecais) de camundongos naïve. No timo
de camundongos Cd4CrexGrin1f/f, encontramos uma redução na frequência de ambas as
subpopulações de linfócitos T αβ CD4+ (Figura 10B) e CD8+ (Figura 10C), seguido de um
aumento na frequência de linfócitos T γδ (Figura 10D). Já nos órgãos linfoides secundários
de camundongos Cd4CrexGrin1f/f, notamos uma diminuição na frequência de linfócitos T
CD4+ nos linfonodos mesentéricos (Figura 10J), porém esta mesma população celular se
encontra aumentada nos linfonodos cecais (Figura 10N). Enquanto isso, a frequência de
linfócitos T CD8+ de camundongos Cd4CrexGrin1f/f encontra-se reduzida no baço (Figura
10G) e aumentada nos linfonodos mesentéricos (Figura 10K) em comparação ao grupo
controle. Como observado no timo, a frequência de linfócitos T γδ também se encontra
aumentada no baço de camundongos Cd4CrexGrin1f/f (Figura 10H).
Em seguida, avaliamos as mesmas populações celulares presentes na lâmina
própria e no compartimento intraepitelial do intestino delgado e cólon de camundongos
naïve Cd4CrexGrin1f/f e seu grupo controle Grin1f/f. Não observamos diferenças entre os
grupos avaliados na frequência de linfócitos T αβ totais (TCRβ+), assim como nas
subpopulações CD4+ e CD8+, e na frequência de linfócitos T γδ (Figura 11).
Também avaliamos as subpopulações de linfócitos T CD8+ intraepiteliais típicos
(CD8ab+) e atípicos (CD8aa+) no intestino delgado e cólon. Nenhuma diferença foi
encontrada entre os camundongos naïve Cd4CrexGrin1f/f e seu grupo controle Grin1f/f
(Figura 12).
Em conjunto, estes achados mostram um padrão alterado na distribuição de
linfócitos T αβ CD4+ e CD8+ e linfócitos T γδ nos tecidos linfoides, mas não nos
compartimentos da mucosa em decorrência da deleção do NMDAR em linfócitos T αβ.
51
Figura 10: Distribuição de linfócitos T αβ e T γδ em órgãos linfoides primários e secundários de

camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com 8 semanas
de idade e foram removidos o timo, baço, os linfonodos mesentéricos e cecais. As frequências de linfócitos T
αβ totais (A, E, I e M), CD4+ (B, F, J e N), CD8+ (C, G, K e O) e linfócitos T γδ (D, H, L e P) foram avaliadas
por citometria de fluxo de acordo com cada tecido linfoide. Foram utilizados de 2 a 5 camundongos por grupo,
provenientes de dois experimentos independentes. *Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
52
Figura 11: Distribuição de linfócitos T αβ e T γδ na lâmina própria e compartimento epitelial dos

intestinos de camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com
8 semanas de idade e o intestino delgado e cólon foram removidos. As frequências de linfócitos T αβ totais
(A, E, I e M), CD4+ (B, F, J e N), CD8+ (C, G, K e O) e linfócitos T γδ (D, H, L e P) foram avaliadas por
citometria de fluxo de acordo com cada compartimento intestinal. Foram utilizados de 2 a 5 camundongos por
grupo, provenientes de dois experimentos independentes.
53
Figura 12: Distribuição de linfócitos T αβ CD8+ intraepiteliais típicos e atípicos de camundongos

Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com 8 semanas de idade e o
intestino delgado e cólon foram removidos. As frequências de linfócitos T αβ CD8ab+ típicos (A e C) e CD8aa+
atípicos (B e D) foram avaliadas por citometria de fluxo de acordo com cada compartimento do intestino
delgado e cólon. Foram utilizados de 2 a 5 camundongos por grupo, provenientes de dois experimentos
independentes.
4.5 Papel do NMDAR na inflamação intestinal

Seguindo as investigações em camundongos naïve, ou livre da indução de doenças,
definirmos por investigar se a deleção de NMDAR especificamente em linfócitos T αβ
afetaria a patogênese das doenças inflamatórias intestinais (IBD), uma vez que observamos
que os compartimentos do intestino possuem a maior expressão destes receptores quando
comparados aos tecidos linfoides avaliados. Camundongos Cd4CrexGrin1f/f e seu grupo
controle Grin1f/f foram tratados com DSS por 7 dias, de acordo com o item 3.3 de materiais
e métodos. Ambos os grupos foram sacrificados no dia 10 de tratamento e, como mostrado
na Figura 13A, a perda de peso iniciou no dia 5 do tratamento com DSS em ambos os
grupos avaliados. Coletamos o intestino grosso (céco e cólon) de todos os animais, como
representado na Figura 13B, e medimos seu peso (Figura 13C) em g, assim como o
comprimento do cólon (Figura 13D) em cm. Também observamos a atividade da colite pela
histologia do cólon (Figura 13E) e pelo escore histológico (Figura 13F), conforme descrito
em detalhes no item 3.3. Nenhuma diferença foi observada entre os grupos tratados com
DSS.
54
Figura 13: Sinais e sintomas da colite aguda induzida por DSS em camundongos Cd4CrexGrin1f/f.
Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram tratados ou não com DSS a 2.5% por 7 dias e sacrificados no
dia 10 de tratamento para a coleta do intestino grosso. O percentual de perda de peso está representado em
A e os intestinos grossos de todos os grupos representados em B. As análises de peso do intestino grosso e
comprimento do cólon encontram-se em C e D, respectivamente. Em E a representação histológica do cólon
distal de ambos os grupos tratados com DSS e em F está representado o escore histológico da colite aguda
de acordo com as classificações relatadas no item 3.12 de materiais e métodos. Foram utilizados 10
camundongos por grupo, provenientes de dois experimentos independentes. *Considerado estatisticamente
diferente quando P≤0.05.
Logo após as análises macro e microscópicas, também avaliamos a distribuição e

fenótipo de linfócitos T nos órgãos afetados pelo modelo de colite aguda, que são os
linfonodos cecais (ceLN), lâmina própria (cólon-LP) e linfócitos intraepiteliais do cólon
(cólon-IEL) por citometria de fluxo (Figura 14). Não encontramos diferença na frequência
de células T αβ totais nos tecidos avaliados de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em
comparação ao grupo controle Grin1f/f (Figura 14A, M e S). O percentual de linfócitos T
CD4+ encontra-se aumentado apenas no compartimento intraepitelial do cólon de
camundongos Cd4CrexGrin1f/f (Figura 14T). Também avaliamos a expressão da molécula
CD25 e do fator de transcrição FoxP3, como marcadores de células Treg. Não foram
observadas diferenças na expressão de CD25 nos tecidos avaliados, porém notamos uma
tendência na redução de FoxP3 nos ceLN e cólon-LP, sendo significativamente reduzido
no cólon-IEL (Figura 14V). Os linfócitos T CD8+ intraepiteliais do cólon (cólon-IEL)
encontram-se extremamente reduzidos (Figura 14W), sem diferenças nos ceLN e cólon-
55
LP. No entanto, também observamos uma redução na frequência de linfócitos T γδ

presentes na lâmina própria do cólon (cólon-LP) de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em
comparação ao grupo controle Grin1f/f (Figura 14R). Os dados do modelo de colite aguda
aqui mostrados e discutidos derivam-se de dois experimentos distintos. No primeiro
experimento notamos uma diferença na morfologia do ceco nos camundongos
Cd4CrexGrin1f/f quando comparados ao grupo controle. Em razão disso, no segundo
experimento realizado também avaliamos as células presentes na lâmina própria do ceco
(ceco-LP) de ambos os grupos tratados com DSS. Os linfócitos T αβ totais (Figura 14G),
assim como a subpopulação CD4+ (Figura 14H) e a expressão de CD25 por estas células
(Figura 14I) derivados do ceco-LP de camundongos Cd4CrexGrin1f/f encontram-se
aumentados em comparação com o grupo controle. Também notamos um aumento na
frequência de linfócitos T γδ (Figura 14L) e uma redução na frequência de linfócitos T CD8+
(Figura 14K) na lâmina própria do ceco destes animais.
56
Figura 14: Distribuição e fenótipo de linfócitos T αβ e T γδ nos tecidos afetados pelo modelo de colite
aguda induzido por DSS em camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram
sacrificados com 8 semanas de idade e foram tratados com DSS a 2.5% por 7 dias e sacrificados no dia 10
de tratamento. Os linfonodos cecais, ceco e cólon foram coletados. As frequências de linfócitos T αβ totais
(A, G, M e S), CD4+ (B, H, N e T), CD4+CD25+ (C, I, O e U), CD4+FoxP3+ (D, J, P e V), CD8+ (E, K, G e W)
e linfócitos T γδ (F, L, R e X) foram avaliadas por citometria de fluxo de acordo com ceLN, ceco-LP, cólon-LP
e cólon-IEL. Foram utilizados de 5 a 10 camundongos por grupo, provenientes de dois experimentos
independentes. *Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
Também avaliamos a produção intracelular das citocinas anti e pró-inflamatórias, IL-

10, IL-17 e IFN- γ, por linfócitos T CD4+ dos linfonodos cecais, lâmina própria do ceco e
cólon e compartimento intraepitelial do cólon de camundongos Cd4CrexGrin1f/f após indução
de colite aguda através da técnica de citometria de fluxo (Figura 15). Nenhuma alteração
foi observada, por exceção de um aumento na produção de IL-17 por linfócitos T CD4+ do
ceco-LP em camundongos Cd4CrexGrin1f/f quando comparados ao grupo controle (Figura
15E),
57
Figura 15: Produção intracelular de Il-10, IL-17 e IFN-γ por linfócitos T αβ CD4+ nos tecidos afetados
pelo modelo de colite aguda induzido por DSS em camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f
e Cd4CrexGrin1f/f foram sacrificados com 8 semanas de idade e foram tratados com DSS a 2.5% por 7 dias e
sacrificados no dia 10 de tratamento. Os linfonodos cecais, ceco e cólon foram coletados. As células totais
dos ceLN, ceco-LP, cólon-LP e cólon-IEL foram estimuladas com PMA, ionomicina e monensina por três horas
e, em seguida, avaliadas quanto a produção de IL-10 (A, D, G e J), IL-17 (B, E, H e K) e IFN-γ (C, F, I e L)
por citometria de fluxo. Foram utilizados de 5 a 10 camundongos por grupo, provenientes de dois
experimentos independentes. *Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
O modelo de colite aguda induzida por DSS é mediado principalmente por células
imunes inatas. Assim sendo, avaliamos o papel da deleção do NMDAR em linfócitos T αβ
em um modelo de colite crônica também induzido por DSS, onde células T desempenham
um papel importante na patogênese da inflamação intestinal. Para isso, camundongos
Cd4CrexGrin1f/f e seu grupo controle Grin1f/f foram tratados com DSS por 7 dias, de acordo
com o item 3.3 de materiais e métodos, seguidos por 14 dias de repouso e então novamente
tratados com DSS por mais dois ciclos. Os camundongos foram sacrificados no dia 52 de
tratamento. Como mostrado na Figura 16A, apesar de ambos os grupos de camundongos
tratados com DSS perderem peso em todos os ciclos, não foram observadas diferenças
entre os camundongos Cd4CrexGrin1f/f e o grupo controle Grin1f/f. Em conjunto, também não
foram observadas diferenças entre os grupos em relação ao peso do intestino grosso
(Figura 16C) e comprimento do cólon (Figura 16D), nem mesmo diferenças no escore
histológico (Figura 16E).
58
Figura 16: Sinais e sintomas da colite crônica induzida por DSS em camundongos Cd4CrexGrin1f/f.
Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram tratados ou não com DSS a 2.5% por 7 dias durante três ciclos
e sacrificados no dia 52 de tratamento para a coleta do intestino grosso. O percentual de perda de peso está
representado em A e os intestinos grossos de ambos os grupos representados em B. As análises de peso do
intestino grosso e comprimento do cólon encontram-se em C e D, respectivamente. Em E a representação
histológica do cólon distal de ambos os grupos tratados com DSS e em F está representado o escore
histológico da colite crônica de acordo com as classificações relatadas no item 3.12 de materiais e métodos.
Foram utilizados 9 camundongos por grupo, provenientes de apenas um experimento. *Considerado
estatisticamente diferente quando P≤0.05.
Em seguida, avaliamos a distribuição e fenótipo de linfócitos T nos tecidos afetados

pela colite crônica e não foram observadas diferenças entre os grupos na frequência de
células T αβ totais (TCRβ+), linfócitos Treg (CD4+FoxP3+), linfócitos T CD8+ e linfócitos T
γδ em todos os tecidos avaliados (Figura 17). A única diferença encontrada no modelo de
colite crônica induzido por múltiplos ciclos de DSS foi uma redução na frequência de
linfócitos T CD4+ (Figura 17N), assim como a expressão de CD25 também se encontra
reduzida nestas células (Figura 17O) em camundongos Cd4CrexGrin1f/f em comparação ao
grupo controle Grin1f/f.
59
Figura 17: Distribuição e fenótipo de linfócitos T αβ e T γδ nos tecidos afetados pelo modelo de colite
crônica induzido por DSS em camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f foram
tratados ou não com DSS a 2.5% por 7 dias durante três ciclos e sacrificados no dia 52 de tratamento. Os
linfonodos cecais, ceco e cólon foram coletados. As frequências de linfócitos T αβ totais (A, G, M e S), CD4+
(B, H, N e T), CD4+CD25+ (C, I, O e U), CD4+FoxP3+ (D, J, P e V), CD8+ (E, K, G e W) e linfócitos T γδ (F,
L, R e X) foram avaliadas por citometria de fluxo de acordo com ceLN, ceco-LP, cólon-LP e cólon-IEL. Foram
utilizados 9 camundongos por grupo, provenientes de apenas um experimento. *Considerado estatisticamente
Também investigamos a produção intracelular das citocinas IL-10, IL-17 e IFN-γ por
linfócitos T CD4+ dos linfonodos cecais, lâmina própria do ceco e cólon, e compartimento
intraepitelial do cólon no modelo de colite crônica através da técnica de citometria de fluxo
(Figura 18). Por conta dos baixos números de linfócitos intraepiteliais do cólon, as análises
não foram satisfatórias e não serão mostradas a seguir. Nenhuma diferença foi observada
a não ser pelo aumento na produção de IFN-γ por linfócitos T CD4+ presentes na lâmina
própria do cólon de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em comparação ao grupo controle Grin1f/f
(Figura 18I).
pelo modelo de colite crônica induzido por DSS em camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f
e Cd4CrexGrin1f/f foram tratados ou não com DSS a 2.5% por 7 dias durante três ciclos e sacrificados no dia
52 de tratamento. Os linfonodos cecais, ceco e cólon foram coletados. As células totais dos ceLN, ceco-LP e
cólon-LP foram estimuladas com PMA, ionomicina e monensina por três horas e, em seguida, avaliadas
quanto a produção de IL-10 (A, D e G), IL-17 (B, E e H) e IFN-γ (C, F e I) por citometria de fluxo. Foram
utilizados 9 camundongos por grupo, provenientes de apenas um experimento. *Considerado estatisticamente
60
Investigamos também o papel da deleção de NMDAR em linfócitos T αβ no modelo

conhecido de colite mediada pela transferência de células T, conforme descrito no item 3.4
de materiais e métodos. Este modelo consiste na transferência adotiva de células T αβ
CD4+CD45RBhigh (linfócitos T CD4+ naïve) para camundongos receptores deficientes de
linfócitos T e B (Rag1-/-), o que permite a investigação de células imunes adaptativas
durante a indução e progressão da inflamação intestinal. Resumidamente, camundongos
doadores de ambos os grupos (Cd4CrexGrin1f/f ou controles Grin1f/f) foram sacrificados e os
linfócitos T CD4+ naïve do baço e linfonodos foram separados através de FACS cell sorting.
Por fim, células T de ambos os grupos doadores foram transferidas a camundongos
receptores Rag1-/-, individualmente.
Como mostrado na Figura 19A, ambos os grupos receptores Rag1-/- iniciaram a
perda de peso corporal a partir da terceira semana após a transferência adotiva de células
T. No final do período avaliado, total de 12 semanas, notamos que os camundongos Rag1-
/- que receberam células T do grupo controle Grin1f/f perderam mais peso que os
camundongos Rag1-/- receptores de células T do grupo experimental Cd4CrexGrin1f/f.
Porém, nenhuma diferença foi encontrada nas análises de peso do intestino grosso (Figura
19C), comprimento do cólon (Figura 19D) e, até mesmo, no escore histológico (Figura
19F).
61
Figura 19: Sinais e sintomas da colite crônica induzida por transferência de células T de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f de 8 semanas de idade foram sacrificados e o baço e
linfonodos inguinais, axilares e cervicais foram coletados. Após cell sorting, células T CD4+ naïve de ambos
os grupos foram transferidas adotivamente a camundongos Rag1-/- receptores. Camundongos Rag1-/-
receptores foram sacrificados 12 semanas após a transferência e o intestino grosso foi coletado. O percentual
de perda de peso está representado em A e os intestinos grossos de ambos os grupos representados em B.
As análises de peso do intestino grosso e comprimento do cólon encontram-se em C e D, respectivamente.
Em E a representação histológica do cólon distal de ambos os grupos e em F está representado o escore
histológico da colite crônica de acordo com as classificações relatadas no item 3.12 de materiais e métodos.
Foram utilizados 5 camundongos por grupo, provenientes de apenas um experimento.
Em seguida, analisamos a frequência e fenótipo de linfócitos T αβ CD4+ nos tecidos

acometidos pelo modelo de colite crônica induzido pela transferência adotiva de células T.
Foi observado que os camundongos Rag1-/- receptores de células T do grupo experimental
Cd4CrexGrin1f/f possuem uma redução marcante de linfócitos T αβ totais (TCRβ+) em ambos
os compartimentos avaliados do cólon, LP (Figura 20K) e IEL (Figura 20P), em
comparação com camundongos Rag1-/- receptores de células T do grupo controle Grin1f/f.
Em contrapartida, os linfonodos mesentéricos (mLN) e cecais (ceLN) de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f -> Rag1-/- mostraram um aumento na frequência de linfócitos T CD4+
(Figura 20B e G), em comparação ao grupo controle. Não foram observadas alterações na
expressão de CD25 (Figura 20C, H, M e R) e FoxP3 (Figura 20D, I, N e S), em todos os
tecidos avaliados. O que mostra que não houve modulação de células Treg neste modelo
de colite crônica induzido pela transferência de células T. Investigamos também a
expressão da molécula CD103, integrina αEβ7 expressa por linfócitos T que se liga a E-
caderina expressa por células epiteliais intestinais, promovendo assim, a retenção de
linfócitos T residentes de memória (Trm) no intestino. Observamos que os linfócitos T CD4+
presentes nos mLN (Figura 20E), ceLN (Figura 20J) e lâmina própria do cólon (Figura
20O) de animais Cd4CrexGrin1f/f -> Rag1-/- expressam níveis extremamente baixos de
CD103 quando comparados ao grupo controle Grin1f/f -> Rag1-/-. Não avaliamos a
expressão de CD103 em linfócitos intraepiteliais do cólon de ambos os grupos.
62
Figura 20: Distribuição e fenótipo de linfócitos T αβ CD4+ nos tecidos afetados pelo modelo de colite
crônica induzido por transferência de células T de camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f
e Cd4CrexGrin1f/f de 8 semanas de idade foram sacrificados e o baço e linfonodos inguinais, axilares e cervicais
foram coletados. Após cell sorting, células T CD4+ naïve de ambos os grupos foram transferidas adotivamente
a camundongos Rag1-/- receptores. Camundongos Rag1-/- receptores foram sacrificados 12 semanas após a
transferência e os linfonodos mesentéricos, linfonodos cecais e cólon foram coletados. As frequências de
linfócitos T αβ totais (A, F, K e P), CD4+ (B, G, L e Q), CD4+CD25+ (C, H, M e R), CD4+FoxP3+ (D, I, N e S)
e CD4+CD103+ (E, J e O) foram avaliadas por citometria de fluxo de acordo com mLN, ceLN, cólon-LP e
cólon-IEL. Foram utilizados 5 camundongos por grupo, provenientes de apenas um experimento.
*Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
Ao avaliarmos a produção intracelular de citocinas, não notamos diferenças na

produção de IL-10. IL-17 e IFN-γ por células T CD4+ presentes nos mLN, ceLN, cólon-LP
e cólon-IEL de ambos os grupos Rag1-/- receptores (Figura 21). Interessantemente,
notamos uma população de linfócitos T CD4+ produtores de ambas as citocinas IL-17 e
IFN-γ, simultaneamente, neste modelo de colite crônica induzida através da transferência
de células T, o que já havia sido relatado na literatura (Harbour et al., 2015). Notamos que
camundongos Rag1-/- que receberam células T do grupo experimental Cd4CrexGrin1f/f
resultaram na redução de linfócitos T CD4+ duplo positivos para IL-17/IFN-γ em ambos os
63
linfonodos mesentéricos (Figura 21D) e cecais (Figura 21H), em comparação ao grupo

controle Grin1f/f -> Rag1-/-.
pelo modelo de colite crônica induzido por transferência de células T de camundongos Cd4CrexGrin1f/f.
Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f de 8 semanas de idade foram sacrificados e o baço e linfonodos
inguinais, axilares e cervicais foram coletados. Após cell sorting, células T CD4+ naïve de ambos os grupos
foram transferidas adotivamente a camundongos Rag1-/- receptores. Camundongos Rag1-/- receptores foram
sacrificados 12 semanas após a transferência e os linfonodos mesentéricos, linfonodos cecais e cólon foram
coletados. As células totais dos mLN, ceLN, cólon-LP e cólon-IEL foram estimuladas com PMA, ionomicina e
monensina por três horas e, em seguida, avaliadas quanto a produção de IL-10 (A, E, I e M), IL-17 (B, F, J e
N), IFN-γ (C, G, K e O) e IL-17/IFN-γ (D, H, L e P) por citometria de fluxo. Foram utilizados 5 camundongos
por grupo, provenientes de apenas um experimento. *Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
64
4.6 Papel do NMDAR na tolerância oral

Por fim, decidimos investigar a deleção específica de NMDAR em linfócitos T αβ na
indução de tolerância oral (OT), modelo o qual linfócitos T desempenham papel importante
na manutenção da homeostase intestinal e na prevenção da inflamação intestinal contra
antígenos ingeridos. Resumidamente, a tolerância oral foi induzida através da ingestão
contínua por cinco dias de OVA na água de camundongos Cd4CrexGrin1f/f e Grin1f/f, seguido
da imunização subcutânea deste camundongos com OVA emulsificado em CFA, conforme
descrito em detalhes no item 3.2 de materiais e métodos. Dez dias após a imunização, os
camundongos foram sacrificados e o baço foi coletado para análises de proliferação in vitro
e análises fenotípicas de linfócitos T através da técnica de citometria de fluxo. Notamos
que, apesar da ingestão oral de OVA ter gerado a tolerância oral como quantificado pela
redução na proliferação de células T estimuladas com OVA, não foram observadas
diferenças na indução de tolerância oral entre os grupos Cd4CrexGrin1f/f e seus controles
Grin1f/f (Figura 22).
Figura 22: Avaliação da tolerância oral em camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Camundongos Grin1f/f e

Cd4CrexGrin1f/f de 8 semanas de idade ingeriram OVA ou não em sua água por 5 dias. Interrompemos a
ingestão de OVA por dois dias e, em seguida, os camundongos foram imunizados com OVA/CFA. 10 dias
após a imunização, os camundongos foram sacrificados e o baço foi coletado. Células totais do baço foram
estimuladas in vitro com 100 µg/mL de OVA por 48 horas e a proliferação de células T foi avaliada através da
incorporação de timidina. Foram utilizados de 5 a 10 camundongos por grupo, provenientes de apenas um
experimento. *Considerado estatisticamente diferente quando P≤0.05.
65
Não encontramos diferenças na frequência de linfócitos T αβ totais (Figura 23A),

linfócitos T CD4+ (Figura 23C), linfócitos T CD8+ (Figura 23D) e na expressão de CD25
(Figura 23E) e FoxP3 (Figura 23F) por células Treg nos grupos experimentais através da
análise pela técnica de citometria de fluxo. A única diferença encontrada foi uma redução
na frequência de linfócitos T γδ presentes no baço de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em
comparação ao grupo controle Grin1f/f, ambos os grupos que ingeriram apenas água e não
OVA.
66
Figura 23: Distribuição e fenótipo de linfócitos T αβ e T γδ no baço de camundongos Cd4CrexGrin1f/f

em modelo de tolerância oral. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f de 8 semanas de idade ingeriram
OVA ou não em sua água por 5 dias. Interrompemos a ingestão de OVA por dois dias e, em seguida, os
camundongos foram imunizados com OVA/CFA. 10 dias após a imunização, os camundongos foram
sacrificados e o baço foi coletado. A frequência de células T αβ totais TCRβ+ (A), T γδ (B), e as subpopulações
de linfócitos T CD4+ (C), linfócitos T CD8+ (D), assim como a expressão de CD25 (E) e FoxP3 (F) por linfócitos
T CD4+ foram avaliadas por citometria de fluxo. Foram utilizados de 5 a 10 camundongos por grupo,
Finalmente, também avaliamos a produção intracelular de IL-10, IL-17 e IFN-γ por

linfócitos T CD4+ do baço de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em comparação ao grupo
controle Grin1f/f, após indução de tolerância oral. Novamente, nenhuma diferença foi
observada entre os grupos (Figura 24).
Figura 24: Produção intracelular de IL-10, IL-17 e IFN-γ por linfócitos T αβ CD4+ no baço de
camundongos Cd4CrexGrin1f/f em modelo de tolerância oral. Camundongos Grin1f/f e Cd4CrexGrin1f/f de 8
semanas de idade ingeriram OVA ou não em sua água por 5 dias. Interrompemos a ingestão de OVA por dois
dias e, em seguida, os camundongos foram imunizados com OVA/CFA. 10 dias após a imunização, os
camundongos foram sacrificados e o baço foi coletado. As células totais do baço foram estimuladas com PMA,
ionomicina e monensina por três horas e, em seguida, avaliadas quanto a produção de IL-10 (A), IL-17 (B),
IFN-γ (C) e IL-17/IFN-γ (D) por citometria de fluxo. Foram utilizados de 5 a 10 camundongos por grupo,
67
5. DISCUSSÃO
Com o decorrer dos anos, nosso grupo vem estudando o receptor ionotrópico de
glutamato NMDAR no SNC em um modelo experimental de Esclerose Múltipla, chamado
de encefalomielite autoimune experimental (EAE). Nosso grupo já demonstrou que o
bloqueio do NMDAR, através de seu antagonista específico MK801, foi capaz de reduzir o
escore clínico da EAE em camundongos imunizados com MOG35-55, o que se dá pela
redução da excitotoxicidade causada pela ativação deste receptor (manuscrito em
preparação).
Por outro lado, pouco se sabe sobre o papel do NMDAR em células T, mesmo sendo
estudado por mais de 20 anos e mesmo tendo sido mostrado sua expressão por estas
células há mais de 10 anos (Mashkina, Cizkova et al. 2010).
Baseado nestes fatos, nossos estudos primeiramente visavam compreender o papel
do NMDAR especificamente em linfócitos T αβ no contexto da fisiopatologia da EAE e
durante o desenvolvimento destes linfócitos T no timo, visto que os timócitos em
desenvolvimento expressam este receptor e que sua deleção possa influenciar seu
repertório.
As funções do receptor ionotrópico de glutamato NMDAR em células imunes,
principalmente em linfócitos T, vêm sendo descritas ao longo dos últimos anos. Este
receptor é responsável por aumentar os níveis de Ca2+ intracelular logo após a ativação de
linfócitos T (Miglio, Varsaldi et al. 2005), o que pode levar a ativação da PKC dependente
de Ca2+, aumento nos níveis de espécies reativas de oxigênio e indução de corpos
apoptóticos ou necróticos nestas células (Boldyrev, Carpenter et al. 2005).
Durante todos estes anos, o papel do glutamato e de seu receptor ionotrópico
NMDAR têm sido principalmente investigados no contexto da fisiopatologia de doenças
neurodegenerativas, como Alzheimer e Esclerose Múltipla (Lowinus, Bose et al. 2016;
McFarland and Martin 2007).
Contudo, recentemente foi relatado a função do glutamato como o principal
combustível responsável pela homeostase do tecido intestinal seja este proveniente da
dieta (Tomé 2018) ou, até mesmo, produzido pelos neurônios do sistema nervoso entérico,
podendo agir sobre as células imunes presentes na lâmina própria intestinal (Swaminathan,
Hill-Yardin et al. 2019).
Devido a isto e ao fato de que o intestino é o principal órgão linfoide que abriga
células T em todo o corpo, nossos estudos e foco tomaram esta direção.
Primeiramente, confirmamos a deleção específica do NMDAR em linfócitos T αβ
68
CD4+ e CD8+ de camundongos Cd4CrexGrin1f/f naïve, através da citometria de fluxo. Todos

os tecidos avaliados (baço, timo, linfonodos mesentéricos, linfonodos cecais, lâmina própria
e compartimento intraepitelial dos intestinos delgado e cólon, exceto os linfonodos
mesentéricos, apresentaram níveis mais baixos de NMDAR em ambas as subpopulações
CD4+ e CD8+ de animais Cd4CrexGrin1f/f. Também buscamos a expressão do NMDAR em
células T (CD3+) nos diferentes segmentos (duodeno, jejuno e íleo) do intestino delgado
destes animais e do grupo controle, por imunofluorescência. Encontramos que apenas
células T de animais controle co-expressam CD3+ e a subuhnidade NR1 do NMDAR em
todos os segmentos do intestino delgado avaliados. Esses achados foram importantes para
a validação da deleção condicional do NMDAR em células T CD4+ e também, porém em
menores quantidades, em células T CD8+.
Em seguida, avaliamos a expressão das isoformas da subunidade NR2 do NMDAR
compostas pelos genes Grin2a, Grin2b, Grin2c e Grin2d, em animais deficientes do
NMDAR especificamente em linfócitos T αβ. Em concordância com a literatura, a
subunidade NR2 requer a expressão da subunidade invariante NR1 para dar origem ao
NMDAR e este ser expresso na superfície da célula (García-Gallo and Díaz-Guerra 2001).
Portanto, em nossos dados podemos identificar a expressão do mRNA das isoformas
NR2a, b, c e d, mesmo não havendo a geração de um receptor maduro e funcional. Não foi
possível identificar a expressão da subunidade NR2a em células T CD4+ do baço de
camundongos Cd4CrexGrin1f/f. Podemos notar que apenas a subunidade NR2d se encontra
mais expressa em células T CD4+ do baço, assim como as subunidades NR2c e NR2d se
encontram mais expressas nas células totais dos linfonodos mesentéricos nestes animais.
Acreditamos que esse fenômeno possa ocorrer de maneira compensatória ao deletar a
expressão gênica da subunidade NR1 de linfócitos T αβ, levando em consideração que a
forma mais encontrada deste receptor possui um dímero de NR1 em conjunto com outro
dímero da subunidade NR2 (Schorge and Colquhoun 2003; Papadakis, Hawkins et al. 2004;
Schüler, Mesic et al. 2008). Inesperadamente, as isoformas da subunidade NR2 não foram
reguladas nas células intraepiteliais do intestino delgado em camundongos Cd4CrexGrin1f/f.
Após isto, verificamos a morte celular, mais especificamente apoptose e necrose, de
linfócitos T CD4+ e CD8+ de camundongos controle após cultivo in vitro com o agonista
seletivo do NMDAR (NMDA) por citometria de fluxo. Testamos 5 diferentes concentrações
de NMDAR, porém não foram notadas diferenças na morte de ambos os linfócitos T CD4+
e CD8+. Dados não mostrados.
Também avaliamos a expressão de genes relacionados as subpopulações de
linfócitos Th1, Th17 e Treg (Il2, Il6, Il17, Foxp3 e Tbx21) e podemos observar que células
69
T CD4+ do baço possuem um perfil gênico Th1 aumentado, enquanto células dos
linfonodos mesentéricos e do compartimento intraepitelial do intestino delgado possuem um
perfil misto Th1/Th17 aumentado.
O ensaio utilizado para avaliação da permeabilidade intestinal foi desenhado de
acordo com Cifarelli et al., 2017, que demonstrou que o pico de Dextran-FITC 4-kDa no
soro de camundongos background C57BL/6 ocorre após 2 horas de sua administração.
Contudo, nossos resultados sugerem que os animais Cd4crexGrin1flox possuem
permeabilidade intestinal semelhante aos animais do grupo controle Grin1f/f. Nossas
análises para determinação do trânsito intestinal, conforme Woting et al., 2018, sugerem
que o trânsito intestinal em ambos os animais avaliados ocorre de maneira semelhante e,
após duas horas da administração do Dextran-FITC, este é identificado nas porções finais
ou distais do intestino delgado, seguindo para o cólon e intestino grosso. Podemos notar
que todos os segmentos do intestino delgado avaliados (duodeno, jejuno e íleo) apresentam
uma tendência no aumento da concentração de Dextran-FITC, sugerindo assim, uma
possível disfunção na barreira mucosa, apesar de a permeabilidade intestinal não estar
alterada devido ao resultado da concentração de Dextran-FITC no soro destes animais.
Adicionalmente, camundongos Cd4CrexGrin1f/f mostraram uma redução na
frequência de linfócitos T CD4+ e CD8+ no órgão primário timo, o que sugere uma redução
na maturação destas células ou, até mesmo, uma migração maior destas para a periferia.
Notamos ainda um aumento de linfócitos T γδ neste tecido em comparação ao grupo
controle. Já nos órgãos linfoides secundários, notamos um aumento na frequência de
linfócitos T γδ e uma redução em linfócitos T CD8+ presentes no baço de animais que não
possum o NMDAR em linfócitos T αβ. Nos linfonodos mesentéricos houve uma redução em
linfócitos T CD4+ e um aumento em linfócitos T CD8+. Por outro lado, nos linfonodos cecais,
que drenam o ceco e cólon, notamos uma redução na frequência de linfócitos T CD4+. Não
foram observadas alterações linfócitos T αβ CD4+ e CD8+, assim como T γδ presentes na
lâmina própria ou entre o epitélio dos intestinos delgado e cólon. Estes dados sugerem que
a deleção de NMDAR em linfócitos T αβ causam diferenças na distribuição de,
principalmente, linfócitos T CD4+ e CD8+ em órgãos linfoides primários e secundários,
porém não nos intestinos.
Por conta da alta expressão do NMDAR em linfócitos T CD4+ e CD8+ dos intestinos,
nós investigamos se sua deleção poderia afetar a inflamação intestinal em modelos
experimentais de colite aguda e crônica. Embora tenhamos encontrado poucas alterações
no modelo de colite aguda e crônica mediadas por DSS, nós notamos que no modelo de
colite induzida pela transferência de células T CD4+ naïve os animais Rag1-/- que
70
receberam células do grupo controle Grin1f/f desenvolveram uma colite pior que o grupo
receptor de células Cd4CrexGrin1f/f. Ainda assim, camundongos receptores de células
Cd4CrexGrin1f/f mostraram redução na produção de IL-17 e IFN-γ por células T CD4+ dos
linfonodos mesentéricos e cecais em comparação ao grupo controle, o que sugere que o
NMDAR expresso por células T CD4+ possui um papel importante neste modelo,
considerando ainda que não foram observadas alterações na diferenciação in vitro de
linfócitos Th1 e Th17 provenientes de camundongos Cd4CrexGrin1f/f, dados não mostrados.
Estes linfócitos T CD4+ duplo positivos para Il-17 e IFN-γ já foram relatos com patogênicos
neste modelo de colite (Harbour et al., 2015). Além disso, notamos uma redução nas células
T CD4+ de memória presentes nos linfonodos mesentéricos e cecais e também na lâmina
própria dos camundongos receptores de célula T CD4+ que não expressam NMDAR. Estas
células são consideradas importantes na regulação da inflamação intestinal causada neste
modelo específico de colite (Annacker et al., 2005; Bottois et al., 2020).
Devido ao fato de que os modelos de colite permitem apenas a avaliação da
inflamação do cólon, nós, por fim, investigamos o modelo de tolerância oral que permite a
avalição da função do intestino delgado, local onde os antígenos alimentares são
absorvidos. Não encontramos diferenças entre os grupos ao realizarmos a tolerância oral
a OVA. Esses resultados ressaltam a regulação da mucosa intestinal em prevenir
perturbações causadas pela falta do receptor ionotrópico NMDAR, o que sugere ainda o
envolvimento de mecanismos compensatórios desenvolvidos por células intestinais na
ausência de NMDAR em células T αβ.
Em conjunto, nossos resultados demonstram que a deleção do receptor ionotrópico
de glutamato NMDAR em linfócitos T αβ impacta a compartimentalização de linfócitos T
CD4+ e CD8+ em órgão linfoides primários e órgão linfoides secundários, como os
linfonodos que drenam os intestinos delgado e cólon (mesentéricos e cecais). Nossos
resultados ainda apontam para um papel importante do NMDAR expressos por células T
αβ no controle da inflamação intestinal no modelo de colite induzido pela transferência
adotiva de células T. Em suma, nossos dados auxiliaram na compreensão do papel do
receptor ionotrópico NMDAR em células T αβ no controle da homeostase e inflamação
intestinal.
71
6. CONCLUSÕES
A deleção do NMDAR especificamente em linfócitos T αβ gerou:
✓ Um aumento na expressão gênica da isoforma NR2d em células CD4+ do baço, NR2c

e NR2d em células dos linfonodos mesentéricos, enquanto nenhuma alteração das
isoformas foi observada para células intraepiteliais do intestino delgado;
✓ Um aumento na expressão gênica de Tbx21 em células T CD4+ do baço, Il6, Il17 e
Tbx21 em células dos linfonodos mesentéricos e Il2 e Il6 em células intraepiteliais do
intestino delgado.
✓ Uma redução na frequência de linfócitos T CD4+ e CD8+ e um aumento na frequência
de linfócitos T γδ no timo de animais naïve;
✓ Uma redução na frequência de linfócitos T CD8+ e um aumento na frequência de
linfócitos T γδ no baço de animais naïve;
✓ Uma redução na frequência de linfócitos T CD4+ e um aumento na frequência CD8+
nos linfonodos mesentéricos de animais naïve;
✓ Uma redução na frequência de linfócitos T CD4+ nos linfonodos cecais de animais
naïve;
✓ No modelo de colite aguda induzido por DSS, um aumento de células T γδ e T αβ totais
assim como a subpopulação CD4+ e a expressão de CD25, seguido por redução da
subpopulação CD8+ e ne produção de IL-17 por células T CD4+ na lâmina própria do
ceco. O aumento na frequência de CD4+ e redução de CD8+ também foi notado no
compartimento intraepitelial do cólon. Também gerou uma redução de linfócitos T γδ na
lâmina própria do cólon;
✓ No modelo de colite crônica induzido por DSS, uma redução na frequência de linfócitos
T CD4+ e na expressão de CD25, porém um aumento na produção de IFN-γ por estas
células na lâmina própria do cólon;
✓ No modelo de colite crônica induzido pela transferência adotiva, um aumento na
frequência de linfócitos T CD4+ e redução de CD103 e na produção de Il-17 e IFN-γ nos
linfonodos mesentéricos e cecais. Redução na frequência de linfócitos T αβ totais na
lâmina própria e compartimento intraepitelial do cólon.
72
Condição naïve T αβ total T αβ CD4+ T αβ CD8+ T γδ

Baço s/a s/a
Timo s/a s/a
mLN s/a s/a
ceLN s/a s/a s/a
Intestino delgado-LP s/a s/a s/a s/a
Intestino delgado-IEL s/a s/a s/a s/a
Cólon-LP s/a s/a s/a s/a
Cólon-IEL s/a s/a s/a s/a
Tabela 2: Frequência de linfócitos T αβ (CD4+ e CD8+) e T γδ nos órgãos linfoides de camundongos

Cd4CrexGrin1f/f naïve. Resumo dos achados encontrados no baço, timo, linfonodos mesentéricos e cecais,
lâmina própria e compartimento intraepitelial do intestino delgado e cólon de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em
comparação ao grupo controle Grin1f/f. Seta para cima, aumento da frequência; seta para baixo, diminuição
da frequência; s/a, sem alteração na frequência.
DSS agudo T αβ T CD4+ T CD4+ T CD4+ T CD8+ T γδ

CD25+ FoxP3+
ceLN s/a s/a s/a s/a s/a s/a
Ceco-LP s/a
Cólon-LP s/a s/a s/a s/a s/a s/a
Cólon-IEL s/a s/a s/a
DSS crônico T αβ T CD4+ T CD4+ T CD4+ T CD8+ T γδ
CD25+ FoxP3+
ceLN s/a s/a s/a s/a s/a s/a
Ceco-LP s/a s/a s/a s/a s/a s/a
Cólon-IEL s/a s/a s/a s/a s/a s/a
Transferência T αβ T CD4+ T CD4+ T CD4+ T CD4+
adotiva CD25+ FoxP3+ CD103+
mLN s/a s/a s/a
ceLN s/a s/a s/a
Cólon-LP s/a s/a s/a
Cólon-IEL s/a s/a s/a n/a
73
Tabela 3: Frequência de linfócitos T αβ (CD4+ e CD8+) e linfócitos T γδ e expressão de CD25, FoxP3 e

CD103 por linfócitos T CD4+ nos órgãos linfoides de camundongos Cd4CrexGrin1f/f submetidos a três
modelos distintos de colite. Resumo dos achados encontrados nos linfonodos mesentéricos, linfonodos
cecais, lâmina própria do ceco e cólon e compartimento intraepitelial do cólon de camundongos Cd4CrexGrin1f/f
em comparação ao grupo controle Grin1f/f. Seta para cima, aumento da frequência; seta para baixo,
diminuição da frequência; s/a, sem alteração na frequência; n/a, não avaliado.
DSS agudo IL-10 IL-17 IFN-γ

ceLN s/a s/a s/a
Ceco-LP s/a s/a
Cólon-LP s/a s/a s/a
DSS crônico IL-10 IL-17 IFN-γ
ceLN s/a s/a s/a
Ceco-LP s/a s/a s/a
Cólon-LP s/a s/a
Transferência IL-10 IL-17 IFN-γ IL-17/
adotiva IFN-γ
mLN s/a s/a s/a
ceLN s/a s/a s/a
Cólon-IEL s/a s/a s/a s/a
Tabela 4: Produção intracelular de IL-10, IL-17 e IFN-γ por linfócitos T CD4+ de camundongos
Cd4CrexGrin1f/f submetidos a três modelos distintos de colite. Resumo dos achados encontrados nos
linfonodos mesentéricos, linfonodos cecais, lâmina própria do ceco e cólon e compartimento intraepitelial do
cólon de camundongos Cd4CrexGrin1f/f em comparação ao grupo controle Grin1f/f. Seta para cima, aumento
da frequência; seta para baixo, diminuição da frequência; s/a, sem alteração na frequência.
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82
APÊNDICES
Artigos completos publicados em periódicos durante o doutorado
1) Lira, A. A. L.; De Oliveira, M. G.; Inoue, A. H. S.; Beltrame, G. R.; Duarte, A. J. S.; Victor,
J. R. . Preconceptional allergen immunization can induce offspring IL-17 secreting B cells
(B17): do they share similarities with regulatory B10 cells?. Allergologia Et
Immunopathologia, p. 454-459, 2018 (Anexo 3).
2) De Oliveira, M. G.; De Lima Lira, Aline Aparecida; Da Ressureição Sgnotto, Fábio; Inoue,
Amanda Harumi Sabô; Beltrame, Giovanna Rossi; Da Silva, Débora; Menghini, Ricardo
Palamar; Da Silva Duarte, Alberto José; Russo Victor, Jefferson. . Maternal immunization
down-regulates offspring TCD4 regulatory cells (Tregs) thymic maturation without
implications for allergy inhibition. Scandinavian Journal Of Immunology, v. 88, p. e12721,
2018 (Anexo 4).
3) De Oliveira, M. G.; Lira, A. A. L.; Sgnotto, F. R.; Inoue, A. H. S.; Duarte, A. J. S.; Victor,
J. R. . Preconception immunization can modulate intracellular Th2 cytokine profile in
offspring: in vivo influence of interleukin 10 and B/T cell collaboration. Central European
Journal of Immunology, v. 43, p. 378-388, 2018 (Anexo 5).
4) De Oliveira, M. G.; Lira, Aline A. L.; Sgnotto, Fábio R.; Inoue, Amanda H. S.; Santos,
Ludimila S.; Nakamatsu, Bernardo Y.; Duarte, Alberto J. S.; Leite'de'moraes, Maria;
Victor, Jefferson R. . Maternal IgG impairs the maturation of offspring intrathymic IL-17-
producing γδT cells: Implications for murine and human allergies. Clinical And
Experimental Allergy, v. 49, p. 454-459, 2019 (Anexo 6).
5) De Oliveira, M. G.; Sgnotto, F. R.; De sousa, T. R.; Fagundes, B. O.; Duarte, A. J. S.;
Victor, J. R. . Preconceptional immunization with an allergen can inhibit offspring Th17
maturation without influence Th1 and Th2 cells. European Cytokine Network, v. 31, n. 3,
p. 113-117, 2020 (Anexo 7).
6) Brandão, W. N.; De Oliveira, M. G.; Andreoni, R. T.; Nakaya, H.; Farias, A. S.; Peron, J.
P. S. . Neuroinflammation at single cell level: What is new? Journal of Leukocyte Biology,
v. 108, i. 4, p. 1129-1137, 2020 (Anexo 8).
7) Inoue, A. H. S.; Lira, A. A. L.; De Oliveira, M. G.; De Sousa, T. R.; Sgnotto, F. R.; Duarte,
A. J. S.; Victor, J. R. . The Potential of IgG to Induce Murine and Human Thymic
Maturation of IL-10+ B Cells (B10) Revealed in a Pilot Study. Cells, v. 9, p. 2239, 2020
(Anexo 9).
83
8) Polonio, C. M.; De Freitas, C. L.; De Oliveira, M. G.; Rossato, C.; Brandão, W. N.;
Zanluqui, N. G.; De Oliveira, L. G.; Mimura, L. A. N.; Silva, M. B. B.; Calich, V. L. G.;
Nisenbaum, M. G.; Halpern, S.; Evangelista, L.; Maluf, M.; Perin, P.; Czeresnia, C. E.;
Peron, J. P. S. . Murine endometrial-derived mesenchymal stem cells suppress
experimental autoimmune encephalomyelitis depending on indoleamine-2,3-
dioxygenase expression. Clinical Science, v. 135, i. 9, p. 1065-1082, 2021 (Anexo 10).
9) De Freitas, C. L.; Polonio, C. M.; Brandão, W. N.; Rossato, C.; Zanluqui, N. G.; De
Oliveira, L. G.; De Oliveira, M. G.; Evangelista, L. P.; Halpern, S.; Maluf, M.; Czresnia,
C. E.; Perin, P.; De Almeida, D. C.; Peron, J. P. S. . Human Fallopian Tube - Derived
Mesenchymal Stem Cells Inhibit Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by
Suppressing Th1/Th17 Activation and Migration to Central Nervous System. Stem Cell
Reviews and Reports, v. 17, p. 1, 2021 (Anexo 11).
10) De Oliveira, M. G., Angelo, Y. S, Yamamoto, P., Carregari, V. C., Reis-de-Oliveira,
F. C. G., Costa, L., Vendramini, P. H., Duque, E. A., dos Santos, N. B., Firmino, E. M.,
Paiva, I. M., Almeida, G. M., Sebollela, A., Polonio, C. M., Zanluqui, N. G., de Oliveira,
M. G., et al. SARS-CoV-2 infection impacts carbon metabolism and depends on
glutamine for replication in Syrian Hamster astrocytes. Journal of Neurochemistry. 26;
10.1111, 2022 (Anexo 12).
11) Rafael M. Rezende, Laura M. Cox, Thais G. Moreira, Shirong Liu, Selma Boulenouar,
Fyonn Dhang, Danielle S. LeServe, Brenda N. Nakagaki, Juliana R. Lopes, Bruna K.
Tatematsu, Luisa Lemos, Julia Mayrink, Eduardo L. C. Lobo, Lydia Guo, Marilia G.
Oliveira, Chantal Kuhn & Howard L. Weiner. Gamma-delta T cells modulate the
microbiota and fecal micro-RNAs to maintain mucosal tolerance. Microbiome, 2023
(Anexo 13).
Artigos/ capítulos de livros em preparação e/ou submetidos para publicação
● Zanluqui N. G.; Oliveira L. G.; Polonio C. M.; França T. T.; De Souza G. P.; Muraro S. P.;
Amorim M.R.; Carregari V. C.; Brandão-Teles C.; Da Silva Patrick; De Oliveira M. G.;
França R. F.; Cunha M. P.; Nogueira M. L.; Martins-de-Souza D.; Condino-Neto A.;
Proença-Modena J. L.; Peron J. P. S. . Zika Virus infection of murine and human neutrophils
and their function as trojan horses to the placenta. Sciences Advances. Submetido.
● Yassin, T., Moreira, T. G., De Oliveira, M. G., Rezende, R. M., Weiner, H. L. . Nasal anti-
CD3 ameliorates traumatic brain injury by inducing IL-10-dependent Tregs that modulate
microglia inflammation. Nature Immunology. Submetido.
84
● Moreira, T. G., Cox, L. M., Murphy, L., Lobo, E. L. C., Silva, P., Lanser, T., Gauthier, C.
D., Mangani, D., Wasen, C., De Oliveira, M. G., Ekwudo, M. N., Liu, S., Menezes, G.,
Ferreira, E., Gabriely, G., Anderson, A. C., Faria, A. M. C., Rezende, R. M., Weiner, H. L. .
Dietary protein antigens modulate intestinal dendritic cells to control mucosal homeostasis.
Submetido.
Capítulos de livros publicados
● Zanluqui, N. G.; Polonio, C. M.; De Oliveira, M. G.; De Oliveira, L. G.; De Faria, L. C.;
Peron, J. P. S.. Microglia and Border-Associated Macrophages in the Central Nervous
System. Macrophage Book. Elsevier, 2021.
85
Anexo 1
86
87
Anexo 2
88
Anexo 3
89
Anexo 4
90
Anexo 5
91
Anexo 6
92
Anexo 7
93
Anexo 8
94
Anexo 9
95
Anexo 10
96
Anexo 11
97
Anexo 12
98
Anexo 13

Marilia Oliveira Doutorado Original Integral

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MARÍLIA GARCIA DE OLIVEIRA

PAPEL DO RECEPTOR IONOTRÓPICO DE GLUTAMATO NMDAR EM

Tese apresentada ao Programa de Pós-

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

MARÍLIA GARCIA DE OLIVEIRA

PAPEL DO RECEPTOR IONOTRÓPICO DE GLUTAMATO NMDAR EM

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Área de concentração: Imunologia

Orientador: Prof. Dr. Jean Pierre

Aos meus pais, meus irmãos, minhas

Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Figura 1: Estrutura do NMDAR...........................................................................................21

AMPA - do inglês, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid Receptor

iTreg - do inglês, Induced regulatory T cell

SNE - Sistema Nervoso Entérico

4.4 A deleção de NMDAR especificamente em linfócitos T αβ leva a distribuição alterada

DE OLIVEIRA, M.G. Papel do receptor ionotrópico de glutamato NMDAR em células T

Plexos ganglionares formados por redes de interconexão entre neurônios do sistema

Palavras-chave: linfócitos T, glutamato, NMDAR, mucosa intestinal, colite.

Ganglionic plexuses formed by interconnecting networks between neurons of the enteric

Keywords: T cells, glutamate, NMDAR, intestinal mucosa, colitis.

Há alguns anos nosso grupo vem estudando o papel do receptor ionotrópico de

1.1 Glutamato e NMDAR

Hertz, 2006). Durante processos inflamatórios do SNC, o glutamato é responsável por

Recentemente, tem se observado que determinadas conformações do NMDAR

1.2 Microbiota e o sistema imune no GALT

como, digestão de compostos da dieta para aumentar posteriormente a absorção do

funções, as células caliciformes, células enteroendócrinas, células de Paneth, células M e

Salmonella enterica Typhimurium e também é dependente de interações com células

1.3 Doenças inflamatórias intestinais

Diversas células do sistema imune participam do processo de patogênese nas IBD,

Figura 2: Células imunes da mucosa intestinal na homeostase e inflamação. a) Na presença de uma

Contudo, considerando o papel de células T na patogênese de IBD, muito pouco se

1.4 O sistema nervoso entérico

encontrados nos intestinos delgados e grosso: o plexo mioentérico ou plexo de Auerbach;

estudamos o papel do NMDAR na imunobiologia de linfócitos T da lâmina própria intestinal

Levando em consideração que fibras nervosas dos plexos submucoso e mioentérico

fenotipicamente, porém com poucas descrições sobre suas funções na imunobiologia da

Investigar o papel do receptor ionotrópico de glutamato NMDAR presente em células

2.1. Objetivos específicos

● Confirmar a deleção específica do NMDAR em células T αβ CD4+ e CD8+ no baço,

3.2 Tolerância Oral

3.8 Colite induzida com DSS

3.9 Colite induzida por transferência de linfócitos T

3.5 Separação magnética de células T CD4+ e CD8+ do baço

3.6 Obtenção de células do baço, timo, linfonodos mesentéricos e cecais

3.7 Obtenção de células da mucosa do intestinal

3.7.1 Linfócitos intraepiteliais intestinais

3.7.2 Linfócitos da lâmina própria intestinal

3.8 Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA)

3.9 Quantificação de mRNA por PCR em Tempo Real

Gene Espécie Sequência Forward Sequência Reverse

3.10 Citometria de fluxo

3.11 Permeabilidade e trânsito intestinal

aproximadamente 10 mL de PBS 1x gelado. Com o intestino ainda inteiro, os segmentos

3.12 Histologia do cólon

3.13 Imunofluorescência do intestino delgado

tecido intestinal foi segmentado em duodeno, jejuno e íleo e fixado em paraformaldeído 4%

3.14 Análise estatística