Caroline Perez Camilo

Estudos epigenéticos em
dependentes de crack e cocaína:
investigação da metilação global do
genoma

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Mestre em Ciências

Programa de Psiquiatria
Orientador: Prof. Dr. Homero Pinto Vallada
Filho

(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de

2011. A versão original está disponível na Biblioteca da FMUSP)

São Paulo
2015
 Caroline Perez Camilo

Estudos epigenéticos em
dependentes de crack e cocaína:
investigação da metilação global do
genoma

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Mestre em Ciências

Programa de Psiquiatria
Orientador: Prof. Dr. Homero Pinto Vallada
Filho

(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de

2011. A versão original está disponível na Biblioteca da FMUSP)

São Paulo
2015
Dedico essa dissertação a um anjo que Deus colocou na

minha vida. Uma irmã, cúmplice e confidente, que de muitas

formas me ajudou, apoiou e incentivou para que fosse

possível a concretização deste trabalho. Que não mediu

esforços para me auxiliar em todo e qualquer momento.

Obrigada, Daiane Cimino.

 AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus pela saúde, fé, perseverança e por iluminar o

meu caminho durante esta caminhada.

Aos meus pais, Ana Maria e Izilmar, por sua história de sucesso na educação

dos filhos diante todas as adversidades. Agradeço pela educação que me deram, pela

confiança, pelas broncas e por tudo que fizeram por mim com o objetivo de me

formar pessoalmente e profissionalmente.

Ao meu irmão, Ronaldo, meu melhor amigo, por seus conselhos, ensinamentos

e por acreditar em mim e no meu potencial em todos os momentos. Aos meus

familiares, por me incentivar nas horas mais difíceis e nas decisões tomadas, por

compartilhar e sempre estar ao meu lado ao longo das minhas conquistas.

Aos amigos, aos que se foram e aos que permanecem em minha vida até hoje,

por todas as palavras de incentivo e persistência.

Ao orientador Professor Doutor Homero Vallada, pelo voto de confiança em me

acolher como orientanda. Por sua paciência, experiência e ensinamentos nessa

jornada. E, principalmente, por incentivar minha maturidade acadêmica e pessoal.

À Banca de qualificação, composta pela Profa. Márcia Scazufca, Prof.

Guilherme Messas e Prof. Hermano Tavares, pelas sugestões e orientações

adequadas ao aprimoramento dessa pesquisa.

 Aos colegas do Laboratório de Patologia Clínica, às colegas Kátia Ichi,

Alessandra Moraes, Débora Zambori, Luciana dos Santos, e todos os colegas do

Instituto de Psiquiatria do HCFMUSP que me ajudaram durante o desenvolvimento e

execução desse trabalho e por me receberem desde o início com carinho e atenção.

À Professora Doutora Helena Brentani, por todo o ensinamento, colaboração e

por me acompanhar no desenvolvimento ideológico da pesquisa. Sua participação foi

fundamental para a realização desse trabalho.

Aos colegas do grupo de genética, Aderbal Ruy, Andressa Zambori, Ana

Carolina Tahira, Bianca Lisboa, Cecília Feio, Henrique Vieira e Viviane Neri.

Agradeço pelas conversas, pelos momentos especiais, pelo amadurecimento e por

tornarem os dias mais felizes e agradáveis. Por sua experiência acadêmica no

convívio e aprendizado e pelo apoio, força e paciência.

Ao suporte financeiro fornecido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado

de São Paulo – Fapesp (processo nº 2013/00659-2) e Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Capes pela bolsa de estudo

concedida.

Meus sinceros agradecimentos a todos os envolvidos nesse projeto.

“O SENHOR é o meu pastor: nada me faltará. Deitar-me faz

em verdes pastos, guia-me mansamente a águas tranquilas.

Refrigera a minha alma; guia-me pelas veredas da justiça,

por amor do seu nome. Ainda que eu andasse pelo vale da

sombra da morte, não temeria mal algum, porque tu estás

comigo; a tua vara e o teu cajado me consolam. Preparas

uma mesa perante mim na presença dos meus inimigos,

unges a minha cabeça com óleo, o meu cálice transborda.

Certamente que a bondade e a misericórdia me seguirão

todos os dias da minha vida: e habitarei na casa do Senhor

por longos dias.” Salmos - 23.

Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento

desta publicação:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors

(Vancouver).

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F.

Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a

ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in

IndexMedicus.
 SUMÁRIO

Lista de figuras

Lista de tabelas

Lista de abreviaturas, símbolos e siglas

Resumo

Abstract

1. INTRODUÇÃO................................................................................................1

1.1. HISTÓRICO............................................................................ ..........................1

1.2. EPIDEMIOLOGIA........................................................................................... ...2

1.3. COCAÍNA E CRACK ......................................................................................... .5

1.3.1. Mecanismos de ação do crack no organismo ........................................ .9

1.4. ESTUDO GENÉTICOS .................................................................................... .11

1.4.1. Estudos Genético Epidemiológicos..................................................... .12

1.4.1.1. Estudos em famílias, gêmeos e adotados ............................................ .12

1.4.2. Estudos Genético Moleculares ............................................................ .13

1.4.2.1. Estudos de ligação e associação .......................................................... .13

1.5. ESTUDOS EPIGENÉTICOS ............................................................................ ...15

1.5.1. Epigenética ........................................................................................ ...15

1.5.2. Epigenética e dependência química .................................................. ...19

1.5.3. Epigenética e o abuso/ dependência de cocaína ................................ ...19

1.5.4. Metilação do DNA e o abuso/ dependência de cocaína .................... ...20

2. JUSTIFICATIVA............................................................................................22

3. OBJETIVOS...................................................................................................23

3.1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................... ...23

3.2. OBJETIVO ESPECÍFICO ................................................................................ ..23

4. MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................24

4.1. METILAÇÃO GLOBAL ................................................................................. ..24

4.1.1. Casos e controles ................................................................................ ..24

4.1.2. Seleção das amostras .......................................................................... ..24

4.1.3. Extração de DNA ............................................................................... ..27

4.1.4. Metilação Global - Procedimento ...................................................... ..27

4.2. APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA ............................................................ ..29

4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 30

4.3.1. Ensaio Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) BeadChip . 30

4.3.2. Análise e interpretação dos dados.........................................................32

4.3.2.1. Pré - processamento ............................................................................. 33

4.3.2.2. Correção e normalização ..................................................................... .34

4.3.2.3. Análise................................................................................................. .35

5. RESULTADOS...............................................................................................37

5.1. Avaliação de qualidade e integridade do DNA............... .......................... ..37

5.2. METILAÇÃO GLOBAL ................................................................................. ..37

5.2.1. Pré processamento .............................................................................. ..37

5.2.2. Estimativa da composição sanguínea e normalização dos valores

gerados pelas sondas InfI e InfII ....................................................................... ..38

5.2.3. Comparação dos grupos ...................................................................... .42

 5.2.3.1. Caracterização dos sítios diferencialmente metilados entre casos e

controles ......................................................................................................... ....42

5.2.3.2. Probe Lasso............................................................................... ...........47

6. DISCUSSÃO..................................................................................................52

7. CONCLUSÃO................................................................................................61

8. ANEXOS........................................................................................................62

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................77
 Lista de figuras
Pag.

Figura 1 - Aumento no consumo de cocaína e seus produtos entre os anos

de 2001 e 2005 e consumo de crack no território nacional........... 3

Figura 2 - Consumo de cocaína aspirada e crack em adultos na população

brasileira em relação ao ano de 2012 para o uso no ‘último ano’
que antecedeu o levantamento e uso ‘na vida’.............................. 4
Figura 3 - Consumo de crack nas cenas de consumo (‘cracolândias’) em
todo o território nacional no ano de 2012, indicando maior
prevalência na região Nordeste do país......................................... 5
Figura 4 - Etapas dos processos físicos/químicos para obtenção da cocaína
e de seus produtos a partir das folhas de coca............................... 7
Figura 5 – Vias de administração de cocaína e suas características quanto a
concentração de cocaína, concentração plasmática, velocidade e
duração dos efeitos, e potencial de dependência........................... 8
Figura 6 – Representação do processo de metilação do DNA, com a adição
de um grupamento metil (CH3) ao carbono da posição cinco da
citosina (C), catalizada pela enzima DNA metiltransferase
(DNMT) em dinucleotídeos CpG.................................................. 17
Figura 7 – Classificação dos indivíduos de acordo com a frequência de uso
da droga para crack e para cocaína, a partir de uma amostra
inicial de 746 usuários/dependentes.............................................. 25
Figura 8 – Seleção das amostras do estudo para a realização do
procedimento de metilação global do DNA.................................. 26
Figura 9 – Lâminas Illumina Infinium Human Methylation450 (450K)
BeadChip no scanner iScan Microarray Scanner para a
genotipagem das amostras por microarray.................................... 29
Figura 10 – Distribuição de regiões em relação ao gene e a ilha CpG............. 30
Figura 11 – Ensaio de metilação Infinium I...................................................... 31
Figura 12 – Ensaio de metilação Infinium II.................................................... 32
Figura 13 – Cálculo de β corresponde a porcentagem de metilação................ 34
Figura 14 - Géis de agarose de parte das amostras demonstrando
uniformidade quanto à qualidade e integridade do DNA.............. 37
Figura 15 - Estimativa da porcentagem celular em cada amostra do estudo
pela função estimatecellcount........................................................ 40
Figura 16 - Gráfico de normalização BMIQ................................................... 41
Figura 17 - Agrupamento hierárquico das amostras baseado nos valores de β
das 446.662 sondas........................................................................ 41

Figura 18 - Gráfico MDS baseado nos valores de β das sondas com maior
variância........................................................................................ 42
Figura 19 - Agrupamento hierárquico representando o padrão de metilação
entre casos e controles utilizando os 250 sítios diferencialmente
metilados........................................................................................ 44
Figura 20 - Disposição dos sítios diferencialmente metilados......................... 45
Figura 21 - Rede PPI do modulo que apresentou hiper-representação dos
genes diferencialmente metilados.................................................. 46
Figura 22 - Boxplot - distância entre os dados de acordo com a sua função
genômica e ilha CpG..................................................................... 48
Figura 23 - Cumulative Quantile Plot - tamanho das janelas empregadas
48
para a busca de DMRs...................................................................
Figura 24 - Gráfico de pontos em escala de tamanho que ilustram o tamanho
das janelas utilizadas no Probe lasso............................................ 49
Figura 25 - Esquemas representativos das localizações das DMRs mapeadas
no UCSC Genome Browser .......................................................... 51
 Lista de tabelas

Pag.

Tabela 1 - Porcentagem das células sanguíneas de acordo com o

38
estimateCellCounts.....................................................................

Tabela 2 - Relação entre os sítios diferencialmente metilados (adjP<10-5)

e os vinte e três genes que se apresentaram com |Δβ| maior ou
igual a 0,1 na comparação entre casos e controles..................... 43

Tabela 3 - Descrição das regiões diferencialmente metiladas (DMRs) e

genes hipometilados na comparação entre casos e controles..... 50
 Lista de abreviaturas, símbolos e siglas

adjP p-valor ajustado

BMIQ Beta mixture quantile

ChAMP Chip Analysis Methylation Pipeline

CpG ‘Citosina-fosfato de ligação Guanina'

DMR Differentially methylated regions

DNA Deoxyribonucleic Acid

InfI Infinium I

InfII Infinium II

MDS Multidimensional scaling

MVP Methylation Variable Positions

NAc Núcleo accumbens

pb pares de base

PCR Polymerase Chain Reaction

PFC Córtex pré-frontal

PPI Protein-protein interaction

SNC Sistema nervoso central

SNPs Single nucleotide polymorphism

TSS Transcription start site

UTR Untranslated region

Resumo

Camilo CP. Estudos epigenéticos em dependentes de crack e cocaína: investigação

da metilação global do genoma [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo; 2015.

INTRODUÇÃO: A expansão e disseminação do consumo de crack e cocaína no

Brasil vem se tornando um grave problema de saúde pública nos últimos vinte anos.

Diferentes abordagens biológicas têm sido investigadas utilizando o fenótipo de

abuso/dependência de crack/cocaína, cujos resultados têm demonstrado a

participação importante do substrato genético, assim como a sua interação com os

fatores ambientais no desenvolvimento desse transtorno. OBJETIVOS: Investigar o

padrão de metilação do DNA do genoma de indivíduos que apresentam

abuso/dependência de cocaína e de crack, comparando ao padrão de metilação de

indivíduos controles. MÉTODOS: Foram selecionados 24 dependentes de cocaína e

crack e 24 controles saudáveis, pareados por sexo e idade. Utilizando amostras de

DNA extraídas de sangue periférico de cada um dos participantes, foi realizada a

técnica de metilação global com o ensaio Illumina Infinium Human Methylation450

(450K) BeadChip. Os resultados iniciais foram normalizados considerando a

heterogeneidade celular e analisados utilizando o pacote ChAMP (Chip Analysis

Methylation Pipeline) para identificar genes e/ou regiões gênicas diferencialmente

metiladas que possam representar fatores de vulnerabilidade para o comportamento

de abuso/dependência do crack e da cocaína. Os processos biológicos e vias celulares

com os quais os sítios diferencialmente metilados estão envolvidos foram explorados

usando as ferramentas disponibilizadas pelo “WebGestalt” e pelo “UCSC Genome

Browser”. RESULTADOS: Foram observados 250 sítios diferencialmente

metilados, associados a 246 genes na comparação dos perfis de metilação entre os

casos e controles, sendo que 49% destes estavam localizados nas regiões promotoras

dos genes, sugerindo que esses sítios podem estar relacionados com a expressão

gênica. Alterações estatisticamente significantes no padrão de metilação entre casos x

controles foram observadas em 23 sítios CpG (p-valor ajustado <10-5 e |Δβ| = 0,1).

Observou-se também que três regiões diferencialmente metiladas foram associadas a

genes hipometilados (BMP8A, GPR88 e RNF166) (p-valor ajustado <0.05), cada

uma com pelo menos três sítios. Alterações estatisticamente significantes também

foram observadas em seis genes hiper-representados: CALCA, NCOA2, DRD2,

EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, envolvidos em processos biológicos

e moleculares. CONCLUSÕES: Observou-se diferenças estatisticamente

significativas no padrão de metilação genômico de usuários/dependentes de crack e

cocaína quando comparados aos controles saudáveis em amostra de DNA extraídas

de sangue periférico. Comparação de estudos de expressão em tecido cerebral

correlacionaram-se parcialmente com os achados apresentados. Outros estudos

utilizando amostras independentes são necessários para confirmar esses achados. A

confirmação desses resultados poderá contribuir na identificação e compreensão dos

mecanismos biológicos envolvidos na dependência do crack/cocaína.

Descritores: epigenética; genética; metilação; metilação do DNA; metiloma; cocaína;

crack.
Abstract

Camilo CP. Epigenetic studies in crack and cocaine dependents: investigation of

global genome methylation [Dissertation]. São Paulo: “Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo”; 2015.

BACKGROUND: The expansion and dissemination of crack and cocaine in Brazil

has become a progressive and serious public health problem during the last twenty

years. Different biological approaches have been investigated using the

crack/cocaine abuser/dependent phenotype, with results confirming the important

role of the genetic component, as well as its interaction with environmental factors.

OBJECTIVES: To investigate the DNA methylation pattern levels in the genome of

individuals with crack and cocaine abuse/dependence and comparing it with the

DNA methylation pattern of the genome of control subjects. METHODS: 24 crack

and cocaine abusers/dependents and 24 healthy controls were selected and matched

by sex and age. Using DNA samples from peripheral blood of each participant, a

global methylation technique was performed using the Illumina Infinium Human

Methylation450 (450K) Bead Chip assay. The initial results were normalized for

cellular heterogeneity and re-analyzed using ChAMP package (Chip Methylation

Analysis Pipeline) to identify differentially methylated genes or/and DNA regions

that may represent biological/genetic risk factors for crack and cocaine

abuse/dependence behavior. The biological processes and cellular pathways were

explored using tools provided by “WebGestalt” and “UCSC Genome Browser”.

RESULTS: 250 differentially methylated sites associated with 246 genes in

methylation comparison profiles between cases and controls were identified, of

which almost half were located in the promoter regions of genes (49%), suggesting

that these sites may be related to gene expression. Statistically significant changes in

the methylation patterns between cases and controls were observed in 23 CpG sites

(adjust p-value <10-5 and |Δβ| = 0.1). In addition, three differentially methylated

regions were associated with hipomethylated genes (BMP8A, GPR88 e RNF166)

(adjust p-value <0.05), each one with at least three sites. Statistically significant

changes were also observe with six hiper-represented genes: CALCA, NCOA2,

DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, which are involved in

biological and molecular processes. CONCLUSIONS: Crack and cocaine

users/dependents presented significant statistical differences in the methylation

pattern when compared to healthy controls in DNA samples extracted from

peripheral blood. Results from gene expression studies using brain tissue can be

correlated with our results. In order to confirm the present findings, future studies

should be replicated using independent samples. The confirmation of these results

will contribute to the understanding of the biological mechanisms involved in

crack/cocaine dependence.

Descriptors: epigenetics; genetics; methylation; DNA methylation; global

methylation; cocaine; crack.

 1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Histórico

A cocaína é um alcalóide extraído dos arbustos das plantas Erythroxylon coca e

Erythroxylon novogranatense, provenientes da América do Sul, principalmente da

Bolívia, Colômbia e Peru (Mata, 2003; Rivera et al., 2005). Há relatos sobre o uso

dessas plantas desde 2500 a.C., época em que os Incas mascavam as folhas desses

arbustos, conhecidas como folhas de coca, para suportar a fadiga durante suas

atividades, como a caça, devido aos efeitos do ar rarefeito das montanhas em que

viviam, e para suportar a fome (Escohotado, 1998; Mejia, Posada, 2008).

Dos meados do século XIX aos primeiros anos do século XX, o substrato da

folha de coca, a cocaína, começou a ser utilizado popularmente na indústria Européia

e Norte Americana. Nesse mesmo período, seu uso abusivo e nocivo foi reconhecido,

tornando a comercialização dessa substância proibida em diversos países. Mas, em

1960, seu consumo se popularizou novamente e o seu uso prejudicial adquiriu, em

1980, o status de dependência para a nosologia psiquiátrica (Washton, 1989; Karch,

2006).

A partir de 1984, surgiu em bairros pobres de cidades americanas uma nova

forma de consumo da cocaína, a forma fumada, conhecida como ‘crack’ (Reinarman,

Levine, 1997).
 2

1.2. Epidemiologia

Os primeiros casos sobre o uso da forma fumada da cocaína no Brasil foram

observados a partir de 1989 (Nappo et al., 1994; Dunn et al., 1996). Por ser uma

droga de baixo preço e efeitos bem mais intensos que as drogas comumente

consumidas na época (ex: maconha, solventes, pó de cocaína, etc.), o uso do crack se

disseminou progressivamente por todo o território nacional (Dunn, Laranjeira, 1999).

A partir da década de 1990, surgiram os primeiros estudos estimando a

prevalência do consumo da cocaína e do crack na população brasileira. Esses estudos

englobam tanto avaliações regionais (Ferri et al., 1997; Ferri, Gossop, 1999; Silva et

al., 2006; Dias et al., 2011; Wagner et al., 2012) quanto nacionais. Os levantamentos

epidemiológicos nacionais, abordam a prevalência do consumo de drogas no âmbito

nacional da população geral ou em populações específicas, como em estudantes do

ensino médio e fundamental (Galduróz et al., 1997; Galduróz et al., 2004; Carlini et

al., 2010), estudantes universitários (Oliveira et al., 2013) e em crianças e

adolescentes em situação de rua (Noto et al., 1997; Noto et al., 2003).

Os primeiros levantamentos nacionais foram organizados pelo Centro Brasileiro

sobre Drogas Psicotrópicas (CEBRID) da Universidade Federal de São Paulo

(UNIFESP), que realizou dois levantamentos domiciliares, em 2001 e 2005,

conhecidos como ‘I e II Levantamento Domiciliar Sobre o Uso de Drogas

Psicotrópicas no Brasil’ (Carlini et al., 2001a; Carlini et al., 2007). Esses dois

levantamentos envolveram as 107 maiores cidades do Brasil e constataram um

aumento no consumo de cocaína e crack (‘uso na vida’) em todo o território nacional,

 3

com destaque para aumento do consumo de crack principalmente nas regiões Sul e

Suldeste (Figura 1).

FONTE: Adaptado de Carlini et al., 2001a; Carlini et al., 2007

Figura 1. A: Aumento no consumo de cocaína e crack (‘uso na vida’) entre os anos de 2001
e 2005; B: Consumo de crack no território nacional, indicando aumento principalmente nas
regiões Sul e Suldeste

Outro importante levantamento nacional de base populacional foi realizado em

2006 pelo Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia para Políticas Públicas do

Álcool e Outras Drogas (INPAD), da UNIFESP, o ‘I Levantamento Nacional sobre

os padrões de consumo de álcool na população brasileira (I LENAD)’ (Laranjeira et

al., 2007). Em 2012, foi realizado o ‘II Levantamento Nacional de Álcool e Drogas

(II LENAD)’. A comparação dos resultados entre esses dois levantamentos mostrou

que o consumo de crack aumentou no país. No II LENAD, observou-se que pelo

menos 6,1% da população brasileira já fez o uso de cocaína na vida (entre

adolescentes e adultos), e aproximadamente 2,9 % já fizeram o uso de suas outras

formas de consumo, como o crack (2,1%) e o oxi (0,8%) (Laranjeira et al., 2014).
 4

Esse estudo também revelou que 0,7% da população brasileira de adultos

consumiu crack nos últimos 12 meses, o que equivale a aproximadamente 800 mil

brasileiros. Para o uso na vida, essa prevalência foi de 1,3%, representando 1,7

milhões de brasileiros (Laranjeira et al., 2014) (Figura 2).

FONTE: Adaptado de Laranjeira et al., 2014

Figura 2 - Consumo de cocaína aspirada e crack em adultos na população brasileira em
relação ao ano de 2012 para o uso no ‘último ano’ que antecedeu o levantamento e uso ‘na
vida’

De acordo com a Organização das Nações Unidas (ONU), o Brasil é o 2º maior

mercado de cocaína do mundo (2,8 milhões de pessoas) ficando abaixo apenas dos

EUA (4,1 milhões de pessoas). Em 2013, a United Nations Office on Drugs and

Crime (UNODC), apontou o Brasil como uma das nações emergentes onde o uso da

cocaína em suas diferentes formas de consumo está aumentando, enquanto há uma

diminuição no consumo dessas drogas em outros países (Laranjeira et al., 2014).

O mais recente estudo epidemiológico, realizado pela Fundação Oswaldo Cruz

em 2012, titulado como ‘Pesquisa Nacional sobre o uso de crack: quem são os

usuários de crack e/ou similares do Brasil? Quantos são nas capitais brasileiras?’,
 5

analisou a prevalência do consumo de crack e outras drogas na população em

situação de rua, especificamente nas cenas de uso do crack, denominadas

popularmente como ‘cracolândias’ (Bastos, Bertoni, 2014). Esse levantamento

apontou dados sobre o ‘uso recente’ (últimos 6 meses) de drogas e trouxe resultados

relevantes a cerca do consumo de crack e seus similares (merla, oxi e pasta base de

cocaína, formas fumadas da cocaína assim como o crack). A prevalência do consumo

de crack nessa população em geral foi de 0,54% (247.773 usuários) e de 0,81% para

os similares (366.598 usuários). A região com maior prevalência de consumo foi a

região Nordeste, com 1,29% (Figura 3).

FONTE: Adaptado de Bastos, Bertoni, 2014

Figura 3. Consumo de crack nas cenas de consumo (‘cracolândias’) em todo o território
nacional no ano de 2012, indicando maior prevalência na região Nordeste do país

1.3. Cocaína e crack

Através dos estudos epidemiológicos apresentados, observa-se que o consumo

de cocaína e sua forma fumada, o crack, vem apresentando expansão no Brasil ao

 6

longo das últimas duas décadas. Além do desafio de se apresentar políticas eficazes

no manejo, controle e prevenção do consumo de cocaína e crack, é igualmente

importante investigar e compreender a ação da cocaína sobre a saúde do indivíduo,

assim como o impacto das diferentes formas de apresentação da droga sobre o

organismo.

Para a obtenção da cocaína e crack através das folhas de coca, são necessários

diversos processos físicos e químicos. A Figura 4 demonstra os processos para a

produção dessas drogas. Resumidamente, esse processo consiste na adição de ácidos

e bases que alteram a composição química das substâncias subsequentes e a pureza

das drogas, pois quanto mais refinado, mais pura e maior a concentração de cocaína

em cada produto (Chasin et al., 2008; Oliveira, Nappo, 2008; Ribeiro et al., 2012).

Além das diferenças nas etapas químicas decorrentes da produção, a cocaína e

suas diferentes formas de apresentação, como o crack, a merla e o oxi, diferenciam -

se em características físicas, e são essas diferenças que vão definir a via de

administração para o consumo de cada produto (Chasin et al., 2008). Seguindo o

esquema da Figura 4, quando o produto obtido é o ‘cloridrato de cocaína’, esse é

popularmente conhecido como ‘pó de cocaína’. A merla e o oxi, produzidos a partir

da pasta de cocaína, possuem formato de ‘pedra’, assim como o crack, mas a merla

possui densidade menor que o oxi e crack, sendo comumente misturada com cigarro

ou maconha (combinação conhecida como ‘mesclado’). Uma observação importante

sobre a produção do crack é que pode ser produzido em diversas etapas do processo,

a partir da ‘pasta de cocaína’, da ‘pasta base de cocaína’ e, muito raramente, do

‘cloridrato de cocaína’, tornando esse produto mais fácil de ser produzido e mais
 7

disponível para o consumo (Chasin et al., 2008; Mejia, Posada, 2008; Oliveira,

Nappo, 2008; UNODC, 2008; UNODC, 2009).

FONTE: Adaptado de Ribeiro et al., 2012

Figura 4 – Etapas de processos físicos/químicos para obtenção da cocaína e de seus
produtos a partir das folhas de coca

Quanto às vias de administração de cada produto, o ‘cloridrato de cocaína’

(‘pó’) pode ser utilizado pela via intranasal (cheirada) e via intravenosa (injetável). A

outra via de utilização é a pulmonar (fumada), utilizada para o consumo da merla, do

oxi e do crack. A via de administração escolhida pelos usuários para o consumo

 8

dessas drogas influencia na velocidade e duração dos efeitos, assim como no

potencial de dependência das drogas, como pode ser visto na Figura 5 (Lizasoain et

al., 2002; Oliveira, Nappo, 2008).

FONTE: Adaptado de Lizasoain et al., 2002

Figura 5 - Vias de administração de cocaína e suas características quanto à concentração de
cocaína, concentração plasmática, velocidade e duração dos efeitos, e potencial de
dependência

Dentre as vias de administração de cocaína, nota - se pela Figura 5 que o crack,

além de ser mais disponível pela facilidade de sua produção, destaca-se entre as

outras vias pelo conjunto de curto tempo para atingir sua concentração plasmática,

rápida e imediata duração do efeito e seu alto índice de concentração (40 - 85% de

cocaína), fazendo com que os usuários sofram um grande potêncial de dependência

(Lizasoain et al., 2002; Ministério da Saúde, 2010; Marques et al., 2012).

A ‘pedra’ do crack é pouco solúvel em água e por ser uma substância volátil

passa da forma sólida para gasosa quando aquecida em temperatura por volta 95 °C,
 9

o que a diferencia do ‘cloridrato de cocaína’, que apresenta ponto de fusão mais

elevado (197 °C) (Negrete, 1992; Carlini et al., 2001b; Oliveira, Nappo, 2008).

O crack é utilizado através de cachimbos ou recipientes improvisados pelos

usuários que possam imitar o uso de um cachimbo. Quando o usuário fuma a pedra

de crack, o vapor produzido é absorvido pelos pulmões. Seus efeitos ocorrem

instantâneamente, mas com curta duração (5 - 10 minutos) (Ellenhorn, 1997; Jones,

1997; Carlini et al., 2001b; Lizasoain et al., 2002).

1.3.1. Mecanismos de ação do crack no organismo

Visto que o crack e os outros produtos similares são a cocaína sob formulação

molecular distinta do pó de cocaína, sua ação no organismo é semelhante, sendo as

diferenças decorrentes da via de administração. Assim, utilizaremos como termo

geral ‘cocaína’ para exemplificar a atuação dessas diferentes apresentações no

organismo.

A absorção da cocaína pelo organismo ocorre em cerca de uma hora e sua

concentração sérica é determinada principalmente pela via de administração. Uma

vez absorvida, a cocaína se liga a proteínas plasmáticas, com maior afinidade pela α-

1-glicoproteína ácida (Heard et al., 2008). A apresentação inicial da cocaína na sua

fórmula molecular é C17H21N4, na forma de benzoilmetilecgonina, principal

metabólito. A meia-vida biológica é de uma hora e seus metabólitos são eliminados

pela saliva, suor, cabelo e, principalmente, pela urina. Cerca de apenas 10% da

cocaína é excretada inalterada (Chasin et al., 2008). Há um metabólito que diferencia

 10

a via pulmonar das demais vias de administração de cocaína, o metilecgonidina,

também chamado de anidroecgonina metil éster (AEME), que ocorre a partir da

pirólise da cocaína. Assim, indivíduos que usam o crack além da exposição à cocaína

também estão expostos a esse composto, pois ambos são inalados ao mesmo tempo

(Paul et al., 2005).

A fumaça inalada pelo usuário durante o uso do crack é composta de partículas

e vapores de cocaína, que atingem a extensa área de trocas gasosas dos alvéolos e

capilares pulmonares, sendo rapidamente absorvida pela circulação pulmonar e

difundindo – se ao ventrículo esquerdo, chegando rapidamente à circulação cerebral

(Ellenhorn, 1997; Jones, 1997).

Ao atingir a circulação cerebral, a cocaína chega ao Sistema Nervoso Central

(SNC), agindo em diversos neurotransmissores, como nos dopaminérgicos,

serotoninérgicos e noradrenérgicos. A ação mais conhecida da cocaína no SNC é

sobre o sistema dopaminérgico, principalmente sobre o sistema mesolímbico –

mesocortical, conhecido como sistema de recompensa, composto pela área tegmentar

ventral, núcleo accumbens (NAc) e córtex pré-frontal (PFC), responsável pelos

estímulos excitatórios (Marqueza, Cruzb, 2000; Carlini et al., 2001b).

O mecanismo molecular de ação da cocaína no sistema dopaminérgico ocorre

através do bloqueio de recaptação de dopamina na fenda sináptica pela inibição dos

transportadores de dopamina, fazendo com que a dopamina fique acumulada na

fenda sináptica, causando uma sensação de euforia e bem estar (Kreek et al., 2005) e

para compensar esse aumento, os receptores pré-sinápticos são ativados, levando a

uma diminuição na sua liberação (Lizasoain et al., 2002; O’Brien, 2006). A quebra
 11

de equilíbrio de produção, ação, e degradação nos níveis de dopamina cerebral pode,

dependendo da intensidade e frequência, contribuir para o aparecimento de sintomas

ou transtornos psiquiátricos como a ansiedade, depressão, alucinação e delírio

(O’Brien, 2006).

Tais evidências apontam que a rápida e imediata duração do efeito dessa droga

no organismo, associada com a sensação de prazer, euforia e poder que a droga

proporciona, e seu alto índice de concentração, tornam a cocaína fumada, ou crack,

uma droga com alto potencial de uso nocivo e dependência quando comparado às

outras vias de administração (Ribeiro et al., 2012).

1.4. Estudo Genéticos

Teoricamente, nenhuma dependência química poderá ser determinada

exclusivamente pela genética, pois sempre será necessária a substância que gera

dependência, encontrada no ambiente. No entanto, mais recentemente tem-se

postulado para dependência química, que esse comportamento se instala através de

uma complexa interação entre fatores genéticos/biológicos e fatores ambientais,

como fatores sócio econômicos, acessibilidade e disponibilidade da droga, assim

como na iniciação do uso de substâncias (Koob, LeMoal, 2006).

A constante evolução do consumo de drogas e o rápido desenvolvimento da

genética aumentaram o interesse dos pesquisadores pelos mecanismos moleculares

envolvidos na dependência química, procurando identificar desde regiões

cromossômicas até genes responsáveis. Estudos genético epidemiológicos se

 12

propõem a investigar a etiologia, distribuição e controle de uma doença em grupos de

familiares e dos determinantes de genéticos de uma doença na população. Por meio

desses, é possível identificar a participação da influência genética e ambiental.

1.4.1. Estudos Genético Epidemiológicos

1.4.1.1. Estudos em famílias, gêmeos e adotados

A dependência possui um alto fator de herdabilidade. Estudos genético

epidemiológicos em famílias mostram, por exemplo, maior prevalência para a

dependência em descendentes de pais e parentes de 1º grau portadores de

dependência química (Bierut et al., 1998), como parentes de probandos com

dependência de cocaína e de heroína (Merikangas et al., 1998; Duaux et al., 2000).

Para determinar a relação gene-ambiente, estimar a herdabilidade e o tamanho

do efeito genético, são realizados estudos com gêmeos, que comparam a

concordância entre gêmeos monozigóticos e dizigóticos. Em relação à

vulnerabilidade para o uso de drogas, esses estudos mostram que o componente

genético é significativo e que a diferença de resultados com gêmeos dizigóticos

rejeita a idéia do abuso de substâncias ser causado somente por um determinante

genético, incluindo assim a ação do ambiente (Duaux et al., 2000).

Gêmeos monozigóticos apresentaram maior concordância para a dependência

de drogas quando comparados aos gêmeos dizigóticos, 26,2% e 16,5%,

respectivamente (Tsuang et al., 1996). E, coortes de gêmeos revelaram alta taxa de

herdabilidade, 79% para a dependência de cocaína (Agrawal, Lynskey, 2008).

 13

Como grande parte da agregação familiar para a dependência pode ser explicada

por fatores genéticos em contraposição às influências familiares não-genéticas

(Gynther et al., 1995; Kendler et al., 2000), indivíduos adotados, por exemplo,

herdam os genes de sua família biológica e sua experiência de vida ocorre em outra

família, tornando possível verificar se há essa interação entre a influência genética e

os fatores ambientais.

Os problemas relacionados à família adotiva podem levar a adversidades no

ambiente familiar. Se há a presença de um risco biológico em um ambiente adverso,

é esperada maior probabilidade de um indivíduo ter um problema como a

dependência de substâncias (Langbehn et al., 2003).

Em relação às drogas em geral, indivíduos adotados apresentam risco maior

para dependência, 50,5%, enquanto não adotados apresentam risco de 35,4%. Para a

dependência de cocaína, esse risco é maior também para os adotados quando

comparados a não adotados, 6,6 % e 2,7 %, respectivamente (Yoon et al., 2012).

1.4.2. Estudos Genético Moleculares

1.4.2.1. Estudos de ligação e associação

Diante a alta taxa de herdabilidade para o abuso/dependência de cocaína,

pesquisadores buscam identificar genes responsáveis pela variância desse tipo de

comportamento. Estudos de ligação (ou “linkage”) procuram identificar um único

gene, ou locus de risco, que pode fornecer localizações cromossômicas com base na
 14

observação de alelos marcadores e o traço de determinada doença na família

(Gelernter, Kranzler, 2010).

Em relação à dependência de cocaína, poucos estudos foram realizados

utilizando a abordagem investigativa dos estudos de ligação. Em 2005, Gelernter et

al. identificaram regiões cromossômicas relacionadas com distúrbios de substâncias,

encontrando resultados sugestivos para a dependência de cocaína relacionados a

locus no cromossomo 10 e no cromossomo 3. Foi encontrada também uma relação

entre o uso pesado de cocaína e o marcador D12S346 do cromossomo 12.

Outro tipo de estudo que busca genes responsáveis para determinada doença é o

estudo de associação, que identifica a frequência de um locus e compara a frequência

de uma variante genética em grupos afetados e não afetados (caso x controle).

Até o momento, diferentes genes e variantes têm sido estudadas para a

vulnerabilidade ao abuso/dependência de cocaína, e mais recentemente de crack

(Stolf et al., 2014). A maioria desses genes está relacionado aos principais

neurotransmissores que integram o sistema de recompensa dopaminérgico, como as

monoaminas, com o gene que codifica o transportador da serotonina, SLC6A4 (Solute

Carrier Family 6, member 4) (Patkar et al., 2001; Patkar et al., 2002; Tristán-

Noguero et al., 2013), as catecolaminas (noradrenalina, adrenalina e dopamina), com

os genes COMT (catecol-O-metiltransferase) (Lohoff et al., 2008), os receptores de

dopamina DRD2 (dopamine receptor D2) (Noble et al., 1993; Gelernter et al., 1999;

Messas et al., 2005; Fernàndez-Castillo et al., 2010; Lohoff et al., 2010) e DRD3

(dopamine receptor D3) (Messas et al., 2005; Bloch et al., 2009), o gene do

transportador de dopamina SLC6A3 (solute carrier family 6 (neurotransmitter

 15

transporter), member 3) (Guindalini et al., 2006b; Fernàndez-Castillo et al., 2010;

Lohoff et al., 2010), assim como o gene responsável pelo metabolismo de dopamina

DβH (dopamina β-hidroxilase) (Fernàndez-Castillo et al., 2010). Em menor

proporção, são estudados os genes do sistema opióide, como o PDYN (prodynorphin)

(Chen et al., 2002; Dahl et al., 2005).

1.5. Estudos Epigenéticos

Por muitos anos os estudos em abuso e dependência química concluem que os

fatores etiológicos são decorrentes da complexa interação genético-ambiental.

Entretanto, apenas recentemente descobriu-se como essa interação poderia ocorrer a

nível molecular, passando a ser chamado de “efeito epigenético” (Wong et al., 2011;

Duncan, Keller, 2011).

1.5.1. Epigenética

Epigenética é uma série de processos bioquímicos que alteram a expressão de

genes de um organismo sem alterar a sequência de DNA (Deoxyribonucleic Acid/

Ácido desoxirribonucléico). É produto da interação do ambiente com o genoma do

indivíduo, que determinam o aspecto funcional na saúde e na doença (Nielsen et al.,

2012; Vassoler et al., 2014; Nestler, 2014). Essas alterações podem ser mantidas por

vários anos, inclusive passados de uma geração a outra, persistindo durante as

divisões celulares por meio da mitose e da meiose (Portela, Esteller, 2010).

 16

A epigenética engloba modificações no DNA e em histonas, proteínas que

juntamente com o DNA formam a estrutura global da cromatina. Modificações

epigenéticas nessas estruturas, DNA ou histonas, regulam a expressão dos genes

atuando em diversos processos como a diferenciação celular (Goldberg et al., 2007;

McQuown, Wood, 2010).

Como a principal modificação epigenética investigada no presente estudo é a

metilação do DNA, as modificações das histonas serão brevemente citadas apenas

para exemplificar outros mecanismos epigenéticos.

As histonas são proteínas no qual o DNA se enrola para a formação do

nucleossomo, apresentando um importante papel na regulação e expressão gênica. As

principais modificações nas histonas incluem a acetilação, que está relacionada com

a descompactação e condensação da cromatina, promovendo a atividade de

transcrição (Feng, Nestler, 2013); a fosforilação, associada também à inibição ou

ativação da cromatina e ativação da transcrição; e a metilação, processo

correlacionado com a ativação ou repressão da expressão gênica (Nielsen et al.,

2012). Há uma hipótese chamada de ‘Código de Histonas’, que propõe que a soma

dessas modificações em uma região promotora específica define um estado

epigenético de ativação ou silenciamento do gene (Wong et al., 2011).

Outros mecanismos como ubiquitinação, sumoilação, citrulinação, e ADP-

ribosilação ainda são pouco compreendidos (Tsankova et al., 2007; Yuferov et al.,

2010; Wong et al., 2011; Feng, Nestler, 2013).

 17

A metilação do DNA é a modificação epigenética mais estável quando

comparada com as modificações das histonas, que são consideradas reversíveis, pois

regula a plasticidade da transcrição do genoma (Wong et al., 2011). Consiste na

adição de um grupamento metil (CH3) ao carbono da posição cinco da citosina (C),

catalizada pela enzima DNA metiltransferase em dinucleotídeos CpG, que são

regiões em que uma citosina (C) precede uma guanina (G) na sequência de DNA ('C-

fosfato de ligação G') (Figura 6) (Goldberg et al., 2007; Anier et al., 2010; Yuferov

et al., 2010; Robison, Nestler, 2011; Feng, Nestler, 2013; Fragou et al., 2013;

Nestler, 2014).

FONTE: Wong et al., 2011

Figura 6 – Representação do processo de metilação do DNA, com a adição de um
grupamento metil (CH3) ao carbono da posição cinco da citosina (C), catalizada pela enzima
DNA metiltransferases (DNMT) em dinucleotídeos CpG

A metilação é comum em todo o genoma e aproximadamente 3% de todas as

citosinas no DNA humano e cerca de 70% dos dinucleotídeos CpG estão metilados.

Esses dinucleotídeos se agrupam no genoma, em regiões conhecidas como ilhas

 18

CpG, que contém pelo menos 200 pares de base e um conteúdo G+C maior que 50%.

Em humanos, existem aproximadamente 45.000 ilhas CpG, que estão localizadas, em

sua maioria, em regiões promotoras de genes. A metilação nessas regiões está

associada ao silenciamento gênico e, quando essas ilhas CpG não estão metiladas,

são relacionadas à expressão gênica (Oliveira et al, 2010; Portela, Esteller, 2010;

Yuferov et al., 2010).

Dinucletídeos encontrados fora de ilhas, em regiões conhecidas como "margens

da ilha CpG", discutidas posteriormente, são menos metilados quando comparadas

com as ilhas em si (Tsankova et al., 2007; Robison, Nestler, 2011; Nielsen et al.,

2012) e também estão associadas com a inativação transcricional. Quando a

metilação ocorre no corpo dos genes, é correlacionada também com a expressão do

gene (Doi et al., 2009; Irizarry et al., 2009; Portela, Esteller, 2010). Uma fração de

CpGs, que estão profundamente metiladas, encontradas em elementos repetitivos,

são responsáveis pela proteção da integridade genômica e evitam a instabilidade

cromossômica, translocações e quebras gênicas (Esteller, 2007).

A compreensão do processo de desmetilação é ainda estudado. O que sabemos

até o momento, é que pode ocorrer de forma ativa ou passiva. A desmetilação ativa

ocorre pela ação da enzima demetilase, que remove o grupo CH3 (Robison, Nestler,

2011; Fragou et al., 2013). A forma passiva é realizada pela ação das proteínas de

translocação ten-eleven (TET), que reparam a citosina formando a 5-

hidroximetilcitosina (5hmC). A 5hmC é mais abundante no cérebro em comparação

com outros órgãos e está relacionada com os processos de aprendizagem e memória

(Feng et al., 2015).

 19

1.5.2. Epigenética e dependência química

A metilação do DNA e as modificações nas histonas, diretamente afetadas por

drogas de abuso, contribuem para o uso crônico de substâncias quando alteradas nas

regiões de recompensa do cérebro, pois fazem a mediação entre o vício e a resposta

neurobiológica (Agrawal, Lynskey 2008; Wong et al., 2011), regulando a ação da

droga e induzindo mudanças altamente estáveis, que podem determinar a

vulnerabilidade do indivíduo à exposição e dependência de drogas (Robison, Nestler,

2011; Feng, Nestler, 2013; Nestler, 2014).

Modificações relacionadas com a cromatina e padrões de expressão de genes

são importantes para os efeitos de longa duração de psicoestimulantes no cérebro.

Neuroadaptações induzidas por essa classe de drogas estão relacionadas, por

exemplo, com a acetilação e fosforilação das histonas (Anier et al., 2010; LaPlant,

Nestler, 2011). A acetilação das histonas têm sido demonstrada em vários genes

candidatos no NAc como resposta à exposição aguda ou crônica a estimulantes, e

essas mudanças se correlacionam com a expressão gênica alterada (Feng, Nestler,

2013).

1.5.3. Epigenética e o abuso/ dependência de cocaína

Em relação à cocaína, diversos estudos mostram, em sua totalidade em modelo

animal, a relação entre a dependência dessa droga e alterações epigenética,

principalmente relacionadas a modificações nas histonas e fatores de transcrição.

 20

Muitos promotores de genes específicos regulam mudanças na acetilação das

histonas após a exposição à cocaína. Em geral, os genes ativados pelo uso de cocaína

são marcados pelo aumento da acetilação das histonas, enquanto genes que são

reprimidos são marcados pela metilação das histonas (McQuown, Wood, 2010).

Os fatores de transcrição mais estudados nessa interação são o fator de

transcrição ΔfosB, que é acumulado lentamente após cada exposição à droga e

altamente estável por meses após a interrupção (Tsankova et al., 2007; LaPlant,

Nestler, 2011); CREB (cAMP response element binding protein), que é induzido

rapidamente nas regiões do cérebro relacionadas com a recompensa, como o NAc

após cada exposição à droga (McQuown, Wood, 2010; Feng, Nestler, 2013); e

BNDF (Brain-derived neurotrophic factor), que tem seus níveis aumentados no

hipocampo após exposição crônica à cocaína e têm sido relacionado ao processo de

recaída, pois seus níveis não diminuem após a retirada da droga (Tsankova et al.,

2007; Robison, Nestler, 2011; Vassoler et al., 2014).

1.5.4. Metilação do DNA e o abuso/ dependência de cocaína

Em uma revisão da literatura, foi possível observar que os estudos sobre as

mudanças de metilação de DNA encontrados em toxicodependência sugerem o

possível papel da epigenética na predisposição de uma maior vulnerabilidade para a

dependência (Robison, Nestler, 2011; Nielsen et al., 2012). Assim como a

remodelação da cromatina, essas alterações podem ocorrer em resposta ao uso de

drogas e contribuir para a consolidação da memória no hipocampo e no córtex de

 21

armazenamento, processos críticos na dependência (Nielsen et al., 2012; Fragou et

al., 2013).

Estudos sobre a metilação do DNA em relação ao abuso/ dependência de

cocaína em humanos são escassos e esse tipo de estudo em relação ao abuso/

dependência de crack ainda não foi relatado.

 22

2. JUSTIFICATIVA

A expansão e disseminação do consumo de cocaína e crack no Brasil têm se

tornado um crescente problema de saúde pública durante os últimos vinte anos. Não

há tratamento médico específico para esses dependentes, sendo as intervenções

biológicas ainda limitadas. Uma compreensão mais aprofundada dos mecanismos

envolvidos na interação entre os fatores biológicos e os fatores ambientais poderá

contribuir com soluções mais eficazes de prevenção e tratamento dos dependentes de

cocaína/crack. Os estudos sobre a metilação do DNA no genoma de indivíduos

abusadores/dependentes de cocaína em humanos são escassos e não há qualquer

relato para os dependentes de crack. Dessa forma, o presente projeto procurou

realizar análises epigenéticas buscando identificar alterações nos níveis de metilação

global do DNA para o abuso/ dependência de cocaína e crack quando comparados

com um grupo controle.

 23

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

O objetivo do presente estudo foi investigar o padrão de metilação de DNA de

todo o genoma de indivíduos dependentes de cocaína e crack e comparar com o

padrão de metilação de DNA de indivíduos controle.

3.2. Objetivo Específico

A partir dos resultados do estudo de metilação global, identificar os genes,

regiões gênicas e vias biológicas que possam estar diferencialmente metiladas entre

os dois grupos.
 24

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Metilação Global

4.1.1. Casos e controles

Para essa pesquisa, foram selecionados casos de abuso/dependência de cocaína

e crack e indivíduos controle provenientes do banco de DNA do Programa de

Genética e Farmacogenética (ProGene) do Instituto de Psiquiatria do Hospital das

Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (IPq-HCFMUSP).

A descrição detalhada da seleção e avaliação dos indivíduos dependentes de

cocaína/crack (casos) e dos controles encontram-se no Anexo A.

4.1.2. Seleção das amostras

A partir de uma amostra total de 746 indivíduos dependentes de cocaína e/ ou

crack, dividimos esses indivíduos quanto ao modo de uso das drogas: “uso

contínuo”, “várias vezes”, “poucas vezes” e “nunca”. Em seguida, diferenciamos

aqueles que faziam uso somente de cocaína, somente de crack e usuários de ambas as

formas (Figura 7).

Dentre os grupos formados selecionamos o grupo identificado como “uso

contínuo” de ambas as drogas (Figura 7), composto por 209 indivíduos, pois o uso

concomitante do crack e da cocaína pode trazer prejuízos maiores do que o uso

 25

isolado de ambas as drogas, tornando o prejuízo neurobiológico desses indivíduos

mais grave (Leonard et al., 2008).

Figura 7 – Classificação dos indivíduos de acordo com a frequência de uso da droga para
crack e para cocaína, a partir de uma amostra inicial de 746 usuários/dependentes

Como parte da seleção dessas amostras para o estudo de metilação global do

genoma, buscando homogeneidade entre os 209 indivíduos, pois diferenças inter-

individuais e fatores ambientais podem influenciar a metilação do DNA (Sarter et al.,

2005). Os três critérios utilizados foram o sexo, o tempo de uso das drogas e a idade.

Em relação ao sexo, optamos pelos indivíduos do sexo masculino, já que dentre

os 209 indivíduos da amostra de dependentes de cocaína e crack, 201 são do sexo

masculino e apenas oito são do sexo feminino. Para o segundo critério de seleção,

baseado no tempo de uso das drogas, dos 201 indivíduos, o tempo de uso de crack e

cocaína poderia variar até 17 anos de uso. Identificamos 38 indivíduos que

 26

apresentavam uso prolongado e com pouca variabilidade no tempo de uso (8 a 10

anos). Como as marcas epigenéticas mudam ao longo do tempo (Madrigano et al.,

2012), o terceiro critério de seleção foi a idade, que entre o grupo selecionado até o

momento variava entre 22 e 42 anos. Selecionamos aqueles indivíduos que estavam

dentro da variabilidade mínima possível que foi de seis anos em relação à idade (23 a

29 anos – média de idade: 26 anos), e o total de casos ao final foi de 26 indivíduos,

posteriormente reduzido para 24 participantes devido a problemas técnicos (ex.

concentração/quantidade inadequada de DNA). Os casos selecionados foram

pareados com os controles por sexo, etnia e idade. A amostra final foi composta por

48 indivíduos, sendo 24 do grupo de casos e 24 do grupo controle (Figura 8).

Figura 8 – Seleção das amostras do estudo para a realização do procedimento de metilação

global do DNA
 27

4.1.3. Extração de DNA

A descrição sobre a coleta dessas amostras e extração de DNA também estão

descritas no Anexo A. Resumidamente, o DNA foi extraído a partir do sangue total

utilizando o método Fenol/Clorofórmio e, o método “Salting Out”, descrito por

Miller et al. (1988). Todas as amostras de DNA foram avaliadas quanto à sua

concentração e pureza por meio da densidade óptica (DO) em espectrofotômetro

(NanoDrop® 2000, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), sendo o

resultado expresso em ng/ul. Foram utilizados 2 µl de cada amostra para a

quantificação. A pureza do DNA é estabelecida pela relação de absorbância entre os

comprimentos de onde de 260 e 280 nm, sendo o valor ideal de aproximadamente

1,8. Uma medida secundária também foi utilizada para verificar a pureza do DNA,

estabelecida pela relação de absorbância entre os comprimentos de onda 260 e 230

nm, sendo a escala ideal de pureza compreendida entre 1,8 e 2,2 (Thermo Fisher

Scientific, 2009). A integridade foi verificada através de eletroforese, em gel de

agarose a 1,5% corado com Brometo de Etídio. As amostras diluídas a 100ng/ul e um

marcador de 100 pb foram aplicados juntamente com o Loading Buffer no gel de

agarose por aproximadamente 40 minutos (Waltrick-Zambuzzi et al., 2012).

4.1.4. Metilação Global - Procedimento

O procedimento de avaliação da metilação global foi realizado pelo laboratório

Deoxi Biotecnologia (www.deoxi.com.br). Para o experimento, foram utilizados 500

ɳg de DNA. As amostras de DNA passaram por tratamento com bissulfito de sódio

(EZ DNA methylation kit. Zymo Research. Cat. No. D5004, Irvine, California, USA),
 28

de acordo com as recomendações do fabricante, que consiste na conversão de bases

citosina não metiladas em uracila, enquanto as bases citosina metiladas permanecem

inalteradas. O DNA bissulfito convertido foi desnaturado, neutralizado e amplificado

em uma PCR (Polymerase Chain Reaction/ Reação em cadeia de polimerase)

isotérmica, por aproximadamente 16 horas, com perfil de incubação de 16 ciclos a 95

°C durante 30 segundos, 50 °C durante 60 minutos e um passo final de realização de

4 °C durante 10 minutos. O produto amplificado foi fragmentado por um processo de

hidrólise enzimática para evitar o excesso de fragmentação da amostra. Após uma

precipitação com isopropanol, o DNA fragmentado foi recolhido por centrifugação a

4 ºC e ressuspenso em tampão para hibridização.

As amostras de DNA fragmentadas e em ressuspensão foram dispensadas nas

lâminas do ensaio Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) BeadChip

(Illumina Inc, San Diego, California, USA), seguindo o protocolo de Metilação

Illumina Infinium HD. Doze amostras foram aplicadas em cada lâmina, quatro no

total, e essas lâminas preparadas foram incubadas overnight, por aproximadamente

20 horas a 37 ºC, no Illumina Hybridization Oven (Illumina Inc, San Diego,

California, USA).

As lâminas foram inseridas no scanner iScan Microarray Scanner (Illumina Inc,

San Diego, California, USA) (Figura 9), que digitalizou o ‘BeadChip’, usando um

laser para excitar o fluoróforo do produto de extensão de uma base única nas sondas.

Essa extensão de base única incorpora marcadores detectáveis utilizando o DNA

capturado como modelo e determina o nível de metilação dos CpGs. O scanner

 29

registrou imagens de alta resolução da luz emitida a partir dos fluoróforos. Todas os

ensaios passaram pelo padrão de controle de qualidade Illumina.

Figura 9 – Lâminas Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) BeadChip são

inseridas no scanner iScan Microarray Scanner para o a genotipagem das amostras por
microarray

4.2. Aprovação do Comitê de Ética

O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade

de Medicina da Universidade de São Paulo (CEP-FMUSP) segundo o protocolo

número 143/13 (Anexo B).

 30

4.3. Análise estatística

4.3.1. Ensaio Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) BeadChip

A análise de metilação com o ensaio Illumina Infinium Human Methylation450

(450K) BeadChip (Illumina Inc, San Diego, California, USA) analisa 485.577 sítios,

dos quais 482.421 são CpGs, 3.091 não-CpGs e 65 são sondas de controle. Essa

lâmina abrange a cobertura tanto de genes quanto de ilhas CpG. Em relação ao gene,

cobre 99% de todos os genes RefSeq, que são sequências de referência com múltiplas

sondas por gene (Bibikova et al., 2011). A distribuição genômica é dividida em sítios

de início da transcrição (TSS - transcription start site) TSS200 e TSS1500, que são

as regiões promotoras separadas em 200 e 1500 pares de base (pb), 5' e 3' UTR

(untranslated region), primeiro éxon, corpo do gene e a região intergênica. A

cobertura relacionada às ilhas CpG é de 96% de todo o genoma e seu conteúdo é

dividido em ilhas e regiões localizadas nas margens nas ilhas, chamadas de ‘shore’

(até 2000 pb), ‘shelf’ (2000 a 4000 pb) e ‘open sea’ (mais de 4000 pb) (Figura 10)

(Bibikova et al., 2011; Dyson et al., 2014).

FONTE: Dyson et al., 2014

Figura 10. Distribuição de regiões em relação ao gene e a ilha CpG
 31

A plataforma Infinium HumanMethylation450K consiste em dois ensaios

químicos diferentes que reportam a informação sobre o estado de metilação,

chamados de Infinium I (InfI) (135.501 sondas) e Infinium II (InfII) (350.076 sondas)

(Dedeurwaerder et al., 2014). O ensaio InfI segue a tecnologia de seu precursor, o

Infinium HumanMethylation27 BeadChip, que consiste em duas sondas, uma para o

locus 'metilado' e uma para o locus 'não-metilado'. Essas sondas são desenhadas para

parear com os conteúdos C (citosina - metilado) e T (timina - não metilado)

resultantes da conversão de bissulfito (Figura 11).

FONTE: Adaptado de Bibikova et al., 2011; Fortin, 2013

Figura 11. Ensaio de metilação Infinium I (InfI). A: Sondas sintéticas presentes nas lâminas
que servem como base para a ligação do DNA bissulfito convertido; B: As duas sondas do
ensaio InfI para o locus não metilado (U) e para o locus metilado (M); C: Hibridização do
locus não metilado – ambos incorporam o mesmo tipo de nucleotídeo, mas a ligação do
locus não metilado ocorre na sonda com a base CA, impedindo a formação das bases CG; D:
Hibridização do locus metilado - como na figura B, ambos incorporam o mesmo tipo de
nucleotídio, mas o locus metilado se liga a sonda que permite a formação das bases CG.
 32

O ensaio Infinium II (InfII) utiliza um único tipo de sonda que complementa a

base anterior do sítio em questão e a adição de uma base é marcada com um

fluoróforo. É a intensidade desses fluoróforos, com a cor verde para metilado e

vermelho para não metilado, que permite calcular a quantidade de sondas metiladas e

não metiladas (Figura 12) (Bibikova et al., 2011; Touleimat, Tost, 2012;

Dedeurwaerder et al., 2014).

FONTE: Adaptado de Bibikova et al., 2011; Fortin, 2013.

Figura 12. Ensaio de metilação Infinium II (InfII). A: Sonda do ensaio InfII; B: Ligação do
locus não metilado na sonda com a incorporação da base única A (adenina), corada com o
fluoróforo vermelho, no sítio não metilado T (timina); C: Hibridização do locus metilado –
Ligação do locus metilado na sonda com a incorporação da base única G (guanina), corada
com o fluoróforo verde, no sítio metilado C (citosina), permitindo a formação das bases CG.

4.3.2. Análise e interpretação dos dados

Os dados da metilação do DNA seguem um fluxo de análise que compreende as

etapas de pré-processamento dos dados, correção e controle de qualidade,

 33

normalização, análise estatística, validação e interpretação dos resultados (Bock,

2012; Pidsley et al., 2013). Para a análise dos dados da nossa pesquisa optamos pelo

pacote ChAMP (Chip Analysis Methylation Pipeline), um pipeline que integra os

métodos de análise de 450K methylation BeadChip atualmente disponíveis e inclui o

método para identificação das regiões diferencialmente metilados (DMRs), chamado

Probe Lasso (Morris et al., 2014; Morris, Beck, 2015).

4.3.2.1. Pré - processamento

A informação sobre a intensidade dos sinais verde e vermelho estão contidas em

arquivos chamados IDAT, gerados para cada amostra pela quantificação dos sinais

durante a varredura no iScan Microarray Scanner. Cada IDAT é composto pela

identificação da amostra, a média e o desvio padrão do sinal de intensidade e o

número de sondas de cada tipo (Ex: 5859594006_R01C01_Grn, onde 5859594006

corresponde a identificação da lâmina, R01C01 localização da amostra, Grn

corresponde ao sinal verde e Red corresponde ao sinal vermelho) (Smith et al. 2013).

A leitura desses dados foi realizada com a ferramenta illuminaio, implementada no

pacote MINFI, convertendo os dados em valores Beta. Esses valores Beta (β), ou

seja, o nível de metilação de CpG, podem assumir valores contínuos entre o intervalo

0 (não metilado) e 1 (completamente metilado), calculados pela razão entre a

intensidade da sonda metilada e a intensidade total (Figura 13) (Bibikova et al., 2006;

Du et al., 2010; Touleimat, Tost, 2012).

 34

FONTE: Adaptado de Du et al., 2010

Figura 13: Cálculo de β corresponde a porcentagem de metilação; M – metilado; U – Não
metilado

Para o pré-processamento dos dados, que consiste na verificação da qualidade

das amostras, é realizada a filtragem das sondas para evitar os viéses das variações

não relacionadas com diferenças de metilação de DNA e com o contexto biológico

do estudo. São filtrados os sítios com menos de três beads em mais de duas amostras

(Morris et al., 2014; Morris, Beck, 2015) e sondas com detecção de p-valor <0,01,

por apresentarem baixa detecção de fluorescência. Para a detecção da baixa

qualidade das amostras foram geradas três imagens: um gráfico mostrando a

densidade dos valores β sem normalização, um gráfico MDS (multidimensional

scaling) que permite a visualização da similaridade entre as amostras, e um gráfico

‘cluster’ que também permite visualizar a similaridade das amostras por meio de um

agrupamento hierárquico (Bibikova et al., 2011; Morris et al., 2014).

4.3.2.2. Correção e normalização

Após o pré processamento, realiza-se a correção baseada no cálculo esperado de

metilação pela celularidade. Como o sangue é um conjunto heterogêneo de diferentes

tipos de células, cada uma com um perfil de metilação do DNA diferente, essa

correção se faz necessária para identificar diferenças reais na metilação entre os

 35

casos e controles, sem o viés dessa metilação estar relacionada com a contagem de

células sanguíneas diferentes. Para a realização dessa correção, é utilizada a função

estimateCellCounts, do pacote MINFI, que estima a porcentagem das células TCD4,

TCD8, células B, monócitos, ‘natural killer’ e granulócitos para cada CpG e corrige

através da identificação de 600 sondas pré discriminadas para cada tipo, recalculando

o valor de β de acordo com essa porcentagem (Houseman et al., 2012; Jaffe, Irizarry,

2014).

Para tornar possível uma medição comparável entre as amostras, realiza-se a

normalização dos dados pelo método BMIQ (Beta mixture quantile), que reconhece

as diferenças entre as sondas Infinium I e II e aproxima as sondas InfII para ter uma

distribuição próxima das sondas InfI. Para cada amostra, as sondas individuais são

classificadas como não metilada, hemimetilada (meio metilada) e metilada. Quando a

sonda do tipo InfI foi classificada como hemimetilada, foi ajustada para medir o

intervalo entre metilada e não metilada (Wu et al., 2014). São geradas três imagens

semelhantes às imagens apresentadas no pré processamento (gráfico de densidade,

gráfico MDS e gráfico ‘cluster’) representando os dados normalizados (Morris et al.,

2014).

4.3.2.3. Análise

Após as etapas descritas acima, realiza - se a análise dos dados utilizando o

MVP (Methylation Variable Positions) e o Probe Lasso, ambos utilizando a função

Limma do pacote Bioconductor. O MVP é um método que busca a metilação

 36

diferencial em um único sítio CpG e sua análise consiste em calcular o p-valor

diferencial de metilação. Essa análise mostra também quantos MVPs são encontrados

entre os grupos estudados e os dados são filtrados por um p-valor de interesse,

incluindo para cada sonda, o valor médio de β para cada grupo e o valor beta delta

para os dois grupos usados (Δβ) na comparação (Rakyan et al., 2011; Morris et al.,

2014).

Se o DNA diferencialmente metilado for encontrado em vários sítios CpG,

caracterizam-se então as chamadas regiões diferencialmente metiladas (DMRs -

Differentially methylated regions), que podem variar até 1000 pb (Rakyan et al.,

2011). O Probe Lasso (Probe Lasso – DMR Hunter) é um método do pacote ChAMP

que tem como função reunir essas sondas diferencialmente metiladas em sítios CpG

e seus entornos para formar as DMRs. Assim, considerando as características

genômicas e a densidade das sondas dos dados, um laço é lançado em torno de cada

sonda CpG significativa e captura o número de sondas adequadas para formar

DMRs. Esses dados são revertidos em um quadro com informações estatísticas e de

associação genômica para cada MVP (Morris et al., 2014; Butcher, Beck, 2015). Um

p-valor é calculado para cada DMR e os resultados são convertidos em três gráficos:

um gráfico ‘Boxplot’ com a distância entre os dados de acordo com a sua função

genômica e ilha CpG, um gráfico ‘Cumulative Quantile Plot’ que ilustra o tamanho

de todas as janelas empregadas para cada DMR, e um gráfico de pontos, com pontos

em escalas de tamanho que ilustram o tamanho das janelas de acordo com a

característica genômica (Morris, Beck, 2015).

 37

5. RESULTADOS

5.1. Avaliação de qualidade e integridade do DNA

Todas as 48 amostras apresentaram concentração e pureza adequadas e dentro

dos pararâmetros estabelecidos. O DNA íntegro pode ser visto como uma grande e

única banda na região superior do gel de agarose (Figura 14).

Figura 14 – Géis de agarose a 1,5% de parte das amostras utilizadas no presente projeto
demonstrando uniformidade quanto à qualidade e integridade do DNA. Na primeira coluna
está representado o marcador de peso molecular que varia de 1000-100pb

5.2. Metilação Global

5.2.1. Pré processamento

Do total de sítios analisados (485.512, excluindo os 65 controles internos da

lâmina), foram retiradas da amostra 1.272 sondas por apresentarem baixa qualidade

de fluorescência com p-valor de detecção >0,01 e 284 sítios representados por menos

de três beads em mais de duas amostras. Adicionalmente, foram filtrados 28.792

SNPs (Single nucleotide polymorphism/ Polimorfismo de nucleotídeo único) e 8502

 38

sondas inespecíficas por se alinharem em múltiplos locais no genoma (Nordlund et

al., 2015). Desta forma, restaram 446.662 sondas que foram analisadas nas 48

amostras.

5.2.2. Estimativa da composição sanguínea e normalização dos valores

gerados pelas sondas InfI e InfII

A função estimateCellCounts estimou a porcentagem das células sanguíneas

(Tabela 1), de acordo com o valor de β para cada sítio e para cada amostra após a

correção da composição sanguínea. As amostras são plotadas baseado nos valores de

intensidade das 600 sondas selecionadas pelo estudo original (Houseman et al.,

2012), que são capazes de discriminar os diferentes tipos celulares sanguíneos

(Figura 15).

Tabela 1: Porcentagem das células sanguíneas de acordo com o estimateCellCounts

TCD8 TCD4 ‘Natural killer’ Células B Monócitos Granulócitos

U1 9% 15% 4% 4% 4% 64%
U2 9% 18% 6% 1% 7% 58%
U3 3% 15% 8% 2% 9% 61%
U4 11% 15% 6% 7% 10% 51%
U5 7% 16% 9% 5% 4% 59%
U6 6% 19% 0% 4% 8% 63%
U7 5% 15% 5% 3% 10% 60%
U8 7% 20% 3% 5% 9% 56%
U9 4% 7% 1% 5% 9% 76%
U10 8% 19% 0% 6% 6% 62%
U11 2% 5% 2% 2% 11% 78%
Legenda: U - Usuários; C - Controles. continua
 39

Tabela 1 (conclusão): Porcentagem das células sanguíneas de acordo com o

estimateCellCounts

TCD8 TCD4 ‘Natural killer’ Células B Monócitos Granulócitos

U12 5% 11% 6% 5% 9% 63%
U13 8% 10% 5% 2% 7% 67%
U14 2% 5% 8% 2% 10% 73%
U15 10% 15% 4% 8% 8% 55%
U16 15% 18% 4% 6% 13% 45%
U17 6% 13% 10% 6% 6% 57%
U18 5% 15% 1% 7% 8% 63%
U19 7% 11% 5% 4% 6% 67%
U20 3% 3% 2% 1% 8% 84%
U21 10% 23% 0% 6% 6% 54%
U22 14% 25% 1% 9% 8% 44%
U23 7% 12% 5% 2% 6% 70%
U24 8% 12% 13% 5% 9% 52%
C1 7% 13% 3% 5% 9% 64%
C2 7% 20% 9% 7% 6% 51%
C3 7% 7% 6% 2% 7% 72%
C4 6% 6% 7% 3% 8% 69%
C5 7% 8% 4% 4% 9% 69%
C6 11% 15% 2% 9% 9% 55%
C7 7% 5% 0% 3% 9% 76%
C8 5% 11% 4% 5% 13% 62%
C9 2% 6% 2% 3% 8% 78%
C10 3% 20% 5% 6% 6% 59%
C11 7% 20% 1% 7% 8% 58%
C12 8% 16% 0% 5% 6% 67%
C13 10% 12% 1% 7% 11% 58%
C14 3% 5% 6% 2% 6% 78%
C15 0% 0% 0% 2% 9% 89%
C16 4% 11% 1% 5% 6% 71%
C17 1% 12% 4% 4% 7% 70%
C18 3% 10% 2% 3% 8% 74%
C19 7% 21% 7% 5% 7% 52%
C20 14% 14% 3% 5% 11% 52%
C21 6% 10% 5% 4% 10% 64%
C22 5% 11% 3% 4% 8% 68%
C23 6% 10% 8% 0% 12% 62%
C24 6% 20% 9% 4% 9% 52%
Legenda: U - Usuários; C - Controles.
 40

Figura 15 – Estimativa da porcentagem celular em cada amostra do estudo pela função

estimatecellcount. Os pontos pretos representam as 48 amostras do estudo e os pontos
coloridos representam a distribuição das células isoladas utilizadas na realização do cálculo
para cada componente sanguíneo: Vermelho – células B; Verde – células T do tipo CD4;
Azul - células T do tipo CD8; Azul claro: granulócitos; Rosa – monócitos e; Amarelo –
células “natural killers”

Com a normalização dos dados pelo método BMIQ, analisamos os gráficos

gerados para avaliar se as sondas InfII obtiveram uma distribuição idêntica às sondas

InfI (Figura 16), para que ambos tipos de sondas tenham características estatísticas

semelhantes. Todas as 48 amostras apresentaram normalização adequada e não

precisaram ser retiradas do estudo.

Esse método de normalização gerou também um ‘cluster’ demonstrando a

similaridade das amostras, por meio de um agrupamento hierárquico, baseado nos

valores das 446.662 sondas (Figura 17). Os agrupamentos indicam que, levando em

consideração todos os sítios analisados, há similaridade entre os grupos do estudo.

 41

Figura 16 – Gráfico de normalização BMIQ. A: Amostras pré normalização; B: Amostras

pós normalização

Figura 17 – Agrupamento hierárquico das amostras baseado nos valores de β das 446.662
sondas, demonstrando a similaridade entre as amostras. A: pré normalização e; B: pós
normalização; A cor laranja representa os usuários (casos) e a cor verde os controles

Para confirmar que não há viés entre os grupos amostrais, as 1000 sondas que

apresentaram maior variância entre todas as amostras, observadas pelo desvio

padrão, foram usadas para plotar o gráfico MDS possibilitando avaliar o nível de

similaridade entre as amostras (Figura 18). No gráfico é possível verificar a

homogeneidade das amostras.

 42

Figura 18 – Gráfico MDS baseado nos mil valores de β das sondas com maior variância. A:
MDS pré normalização; B: MDS pós normalização

5.2.3. Comparação dos grupos

5.2.3.1. Caracterização dos sítios diferencialmente metilados entre casos e

controles

A comparação dos perfis de metilação entre os casos e controles revelou 250

sítios diferencialmente metilados p-valor ajustado (adjP) <10-5 que estão associados

a 246 genes. Destes sítios, 108 apresentaram-se hipermetilados e 142 hipometilados

em casos em relação a controles (Anexo C). Destes, 23 genes apresentaram-se com

|Δβ| maior ou igual a 0,1 (Tabela 2).

A análise de agrupamento hierárquico (Figura 19) para ilustrar o padrão de

metilação entre casos e controles, através da plotagem dos 250 sítios

diferencialmente metilados, foi realizada utilizando a distância euclidiana (média) e

os sítios normalizados por Z-Score. Esta análise demonstrou que há diferença no

padrão de metilação global entre indivíduos usuários/dependentes de crack/cocaína e

controles saudáveis.
 43

Tabela 2: Relação entre os sítios diferencialmente metilados (adjP <10-5) e os vinte e três genes que se apresentaram com |Δβ| maior ou
igual a 0,1 na comparação entre casos e controles
ProbeID adj.P.Val CHR Gene Nome do gene Relação ao β Β Δβ
gene_ilha CpG Casos Controles
cg10633981 2,50E-018 11 C11orf58 chromosome 11 open reading frame 58 3'UTR - open sea 0,647 0,482 0,17
cg01775802 8,34E-015 14 RGS6 regulator of G-protein signaling 6 Corpo do gene - open sea 0,416 0,268 0,15
cg19933985 1,50E-017 5 SPRY4 sprouty homolog 4 (Drosophila) IGR - shelf 0,667 0,524 0,14
cg23797200 7,57E-018 17 NKIRAS2 NFKB inhibitor interacting Ras-like 2 Corpo do gene - shelf 0,518 0,392 0,13
cg01287788 1,58E-017 2 SNORD94 small nucleolar RNA, C/D box 94 TSS200 - open sea 0,630 0,507 0,12
cg05590156 3,15E-012 5 TRIO trio Rho guanine nucleotide exchange factor Corpo do gene - open sea 0,769 0,647 0,12
cg03150409 1,38E-010 4 WHSC1 Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1 5'UTR - open sea 0,553 0,440 0,11
cg03726791 2,90E-016 2 THAP4 THAP domain containing 4 Corpo do gene - open sea 0,711 0,601 0,11
cg15897635 2,78E-014 1 MARK1 MAP/microtubule affinity-regulating kinase 1 IGR - shelf 0,418 0,309 0,11
cg05648964 5,20E-010 12 RIMKLB ribosomal modification protein rimK-like family IGR - open sea 0,724 0,616 0,11
member B
cg02308712 2,07E-018 12 C12orf80 chromosome 12 open reading frame 80 IGR - open sea 0,616 0,508 0,11
cg01736133 1,80E-013 4 LOC645513 uncharacterized LOC645513 IGR - open sea 0,699 0,594 0,11
cg27379715 5,83E-017 2 SNTG2 syntrophin, gamma 2 IGR - open sea 0,650 0,545 0,10
cg14387505 7,36E-008 16 AHSP alpha hemoglobin stabilizing protein TSS1500 - open sea 0,507 0,404 0,10
cg04623165 1,23E-011 2 MIR4261 microRNA 4261 IGR - open sea 0,724 0,621 0,10
cg14497545 7,46E-020 4 MAML3 mastermind-like 3 (Drosophila) Corpo do gene - open sea 0,482 0,379 0,10
cg01994308 4,01E-012 8 PLAG1 pleiomorphic adenoma gene 1 5'UTR - shore 0,536 0,642 -0,11
cg04981696 2,48E-009 16 ABCC1 ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), Corpo do gene - shore 0,337 0,452 -0,12
member 1
cg07920855 4,74E-008 1 IVNS1ABP influenza virus NS1A binding protein TSS200 - Ilha 0,236 0,354 -0,12
cg12065531 3,21E-013 6 RING1 ring finger protein 1 1º Éxon - Ilha 0,214 0,334 -0,12
cg03252499 2,06E-010 11 OR8B8 olfactory receptor, family 8, subfamily B, member 8 IGR - open sea 0,502 0,638 -0,14
cg11878675 1,58E-017 2 DGUOK deoxyguanosine kinase IGR - Ilha 0,203 0,342 -0,14
cg17479131 7,30E-014 7 ATP6V0E2-AS1 ATP6V0E2 antisense RNA 1 Corpo do gene - shelf 0,484 0,625 -0,14
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adj.P.Val - p-valor ajustado; CHR - Cromossomo; β - Beta; Δβ - Delta Beta.
 44

Figura 19 – Agrupamento hierárquico representando o padrão de metilação entre casos e

controles utilizando os 250 sítios diferencialmente metilados. A cor azul representa os sítios
hipometilados e a cor vermelha representa os sítios hipermetilados. O agrupamento superior
representa os indivíduos da amostra nomeados na parte inferior, onde - U:usuários e C:
controles. Os sítios são identificados do lado direito do cluster e o agrupamento destes está
demontrado à esquerda. O nível de metilação é observado através da intensidade das cores

Os sítios diferencialmente metilados estão representados tanto em relação ao

gene quanto em relação a ilha CpG (Figura 20). Em ambos os casos, é possível

observar que a maior parte dos sítios está localizado próximo ou nas regiões

promotoras dos genes.

 45

Figura 20 – Disposição dos sítios diferencialmente metilados. A: Em relação à localização

gênica; B: Em relação à ilha CpG

Os genes relacionados aos sítios diferencialmente metilados foram anotados

funcionalmente usando o WebGestalt (Wang et al., 2013), com os parâmetros ’Top

10’, método estatístico hipergeométrico para análise de avaliação de enriquecimento,

teste mútiplo BH (FDR - False discovery rate) para ajustar os p-valores e com pelo

menos cinco genes em cada categoria. Dentre os processos biológicos que

apresentaram hiper-representação de genes estão a regulação negativa de processo

metabólico de composto nitrogenado (28 genes; adjP 2.20e-03), regulação negativa

de processo biossintético (32 genes; adjP 6.00e-04) e regulação negativa de

processos metabólicos celulares (39 genes; adjP 6.00e-04). Em relação à função

molecular, a atividade de proteína cinase apresentou hiper-representação (18 genes;

adjP 2.24e-02) e o corpo celular neuronal estava hiper-representado (10 genes; adjP

3.30e-02) no componente celular. Quando realizada a análise de associação a drogas

encontramos hiper-representadas a glutationa (10 genes; adjP e-04) e a adenosina (9

genes; adjP 3,2e-03). A análise de módulos de interação proteína-proteína (PPI)

 46

também apresentou hiper-representação (Figura 21), com 10 genes (adjP 1.40e-03)

no módulo Hsapiens_Module_361 (Anexo D). Todos os processos hiper-

representados estão descritos no Anexo D.

Figura 21 – Rede PPI do módulo Hsapiens_Module_361 (adjP 1.40e-03) que apresentou

hiper-representação dos genes diferencialmente metilados. Em verde estão representados os
10 genes identificados na análise de diferença de metilação caso e controle
 47

Para a análise de enriquecimento de vias moleculares, utilizamos o banco de

dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Para essa análise

utilizamos p-valor < 0,05 e no mínimo cinco genes por categoria. Para os 246 genes

diferencialmente metilados foram encontrados oito vias enriquecidas: via de

sinalização de MAPK (6 genes; adjP 4.7e-04), leucemia mieloide crônica (6 genes;

adjP 3.65e-05), vias de câncer (9 genes; adjP 3e-04), câncer de prostata (5 genes;

adjP 3e-04), via de sinalização de insulina (6 genes; adjP 3e-04), via de sinalização

de ErbB (5 genes; adjP 3e-04), Gap junctions (5 genes; adjP 3e-04), via de

sinalização de receptores de célula T (5 genes; adjP 6e-04) (Wang et al., 2013).

5.2.3.2. Probe Lasso

Em busca de regiões de relevância biológica com um maior poder estatístico, a

partir dos sítios diferencialmente metilados com adjP<0.05, as DMRs foram

agrupadas pelo método Probe Lasso, que leva em consideração as características

genômicas e a densidade das sondas dos dados.

O primeiro gráfico gerado, um ‘boxplot’, mede a distância entre os dados de

acordo com a sua função genômica e ilha CpG (Figura 22), o segundo um

‘Cumulative Quantile Plot’, mostra o tamanho de todas as janelas empregadas para

cada DMR (Figura 23) e um gráfico de pontos, ilustrando o tamanho das janelas de

acordo com a característica genômica (Figura 24).

 48

Figura 22 – Boxplot mostrando a distância entre os dados de acordo com a sua função
genômica e ilha CpG. As cores variam de acordo com a disposição genômica. No eixo Y
está representada a distância entre as sondas

Figura 23 – Cumulative Quantile Plot - tamanho das janelas empregadas para a busca de
DMRs. No eixo Y está a distância (pares de bases) do lasso
 49

Figura 24 – Gráfico de pontos - pontos em escala de tamanho que ilustram o tamanho das
janelas utilizadas no probe lasso. As cores variam de acordo com a disposição genômica. O
eixo Y está demonstrado a distância (pares de bases) do lasso

Foram identificadas três DMRs que estão relacionadas a três genes: BMP8A

(bone morphogenetic protein 8A), com quatro sítios diferencialmente metilados e

tamanho de 104 pb, GPR88 (G protein-coupled receptor 88), com três sítios

diferencialmente metilados em 159 pb e RNF166 (ring finger protein 166), com três

sítios diferencialmente metilados em 108 pb (Tabela 3).

 50

Tabela 3 – Descrição das regiões diferencialmente metiladas (DMRs) entre casos e controles

probeID adj.P.Val CHR Gene Relação ao dmr.start dmr.end dmr.size Δβ

gene_ilha -pb
CpG
cg09547767 0.0353 1 BMP8A 1º Éxon - Ilha 39957342 39957445 104 -0.03

cg13806070 0.0565 1 BMP8A 1º Éxon - Ilha 39957342 39957445 104 -0.04

cg03664992 0.0005 1 BMP8A 1º Éxon - Ilha 39957342 39957445 104 -0.03

cg25139493 0.0012 1 BMP8A 1º Éxon - Ilha 39957342 39957445 104 -0.03

cg22602002 0.0473 1 GPR88 Corpo do 101005372 101005530 159 -0.02

gene- Ilha
cg07706463 0.0156 1 GPR88 Corpo do gene 101005372 101005530 159 -0.01
- Ilha
cg11882432 0.0186 1 GPR88 Corpo do gene 101005372 101005530 159 -0.01
- Ilha
cg23392782 2,49E-05 16 RNF166 1º Éxon - Ilha 88772602 88772709 108 -0.02

cg08873779 0.0002 16 RNF166 1º Éxon - Ilha 88772602 88772709 108 -0.02

cg04297258 0.0002 16 RNF166 1º Éxon - Ilha 88772602 88772709 108 -0.03

Legenda: probeID - Sítio diferencialmente metilado; adj.P.Val - P-valor ajustado; CHR -

Cromossomo em que a DMR está localizada; gene.1 - Gene em que está localizada a DMR;
feat.cgi - Posição da DMR em relação à ilha CpG e em relação ao gene; dmr.start - Posição de
início da DMR; dmr.end - Posição do fim da DMR; dmr.size - Tamanho da DMR em pares de
base; deltaBeta - média do valor de β.

As 3 DMRs foram mapeadas no UCSC Genome Browser (Karolchik et al.,

2014) para visualização dos sítios diferencialmente metilados em relação às posições

no genoma e ilhas CpGs identificadas in silico (Figura 25). Também estão

identificados os resultados de dois projetos, o UCSC Brain DNA Methylation, que

gerou dados por MeDIP-seq (Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing),

MRE-seq (Methylation-sensitive Restriction Enzyme Sequencing), trimetilação da

lisina 4 na histona H3 (H3K4me3) e expressão gênica de amostra do PFC de um

homem de 57 anos de idade com o objetivo de investigar o possível papel da

metilação intragênica e tecido-específica no controle da expressão gênica (Maunakea

et al., 2010). E um segundo estudo, Brain Histone H3K4me3 ChIP-Seq, que mostra o
 51

mapeamento da histona H3K4me3 em cérebros de diversos indivíduos com idade de

0 a 69 anos, medidos por imunoprecipitação seguido por sequenciamento de alta

cobertura (Chip-seq). Esses experimentos foram feitos em neurônios e outros tipos

celulares do PFC (Cheung et al., 2010).

A B

Figura 25 – Esquemas representativos das localizações das DMRs mapeadas no UCSC

Genome Browser dos genes BMP8A (A), GPR88 (B) e RNF166 (C). Na figura é possível
observar do topo ao fundo: em preto as sondas que fazem parte da DMR; em cinza a banda
cromossômica; em azul a anotação do gene; em verde escuro as ilhas CpG definidas por
Gardiner-Garden e Frommer (1987). Referentes aos estudos UCSC Brain DNA
Methylation: em verde o estudo da H3K4me3; em verde escuro MRE-seq; em marrom
MeDIP-seq e em azul o RNAseq. As barras de verde claro a azul escuro correspondem ao
estudo da H3K4me3 do Brain Histone H3K4me3 ChIP-Seq (Cheung et al., 2010),
indivíduo a indivíduo.
 52

6. DISCUSSÃO

O presente estudo, até onde vai o nosso conhecimento, é o primeiro a

demonstrar a alteração dos padrões globais de metilação do DNA em indivíduos

dependentes de crack e cocaína quando comparados a indivíduos saudáveis, pareados

por sexo e idade.

Os resultados evidenciaram que 250 sítios, relacionados a 246 genes, diferem

em níveis de metilação (adjP<10-5) entre os grupos de pacientes e controles. Esses

sítios podem estar relacionados com a expressão gênica devido sua localização em

regiões promotoras (49%) e no corpo do gene (27%). Cerca de 37% desses sítios,

encontrados nas margens das ilhas CpGs, ‘shore’ e ‘shelve’, podem ser relacionados

à inativação transcricional (Portela, Esteller, 2010).

Os sítios hipermetilados podem estar relacionados com alterações na regulação

transcricional, tanto para a inativação, com 10% dos sítios localizados em regiões

promotoras do gene (5’UTR, TSS200 e TSS1500), quanto para a transcrição

facilitada, com 44% dos sítios no corpo do gene (Portela, Esteller, 2010).

Na análise entre o padrão de metilação do DNA entre casos e controles, 23

genes diferencialmente metilados (adjP<10-5) apresentaram-se com |Δβ| maior ou

igual a 0,1. São eles: ABCC1 (ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP)

member 1), AHSP (alpha hemoglobin stabilizing protein), ATP6V0E2-AS1

(ATP6V0E2 antisense RNA 1), C11orf58 (chromosome 11 open reading frame 58),

C12orf80 (chromosome 12 open reading frame 80), DGUOK (deoxyguanosine

 53

kinase), IVNS1ABP (influenza virus NS1A binding protein), LOC645513

(uncharacterized LOC645513), MAML3 (mastermind-like 3 (Drosophila)), MARK1

(MAP/microtubule affinity-regulating kinase 1), MIR4261 (microRNA 4261),

NKIRAS2 (NFKB inhibitor interacting Ras-like 2), OR8B8 (olfactory receptor,

family 8, subfamily B, member 8), PLAG1 (pleiomorphic adenoma gene 1), RGS6

(regulator of G-protein signaling 6), RIMKLB (ribosomal modification protein rimK-

like family member B), RING1 (ring finger protein 1), SNORD94 (small nucleolar

RNA, C/D box 94), SNTG2 (syntrophin, gamma 2), SPRY4 (sprouty homolog 4

(Drosophila)), THAP4 (THAP domain containing 4), TRIO (trio Rho guanine

nucleotide exchange factor), WHSC1 (Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1).

Dos 246 genes relacionados aos sítios diferencialmente metilados anotados

funcionalmente com o parâmetro ’Top 10’ (Wang et al., 2013) do WebGestalt, três

estão relacionados a pelo menos quatro processos metabólicos e biológicos hiper-

representados: CALCA (calcitonin-related polypeptide alpha), um gene já associado

à doença de Parkinson e enxaqueca. É antagonista de um neuropeptídeo expresso em

neurônios de gânglios trigeminais que é o principal mediador da dilatação das

artérias cerebrais humanas (Menon et al., 2011).

NCOA2 (nuclear receptor coactivator 2), gene envolvido na regulação

hormonal, com a expressão no córtex pré-frontal dorsolateral em pacientes com

transtorno bipolar (Nurnberger et al., 2011).

DRD2 (dopamine receptor D2), gene envolvido na modulação da locomoção,

reforço, memória e aprendizagem e têm sido associado à diversas patologias

psiquiátricas na literatura como, por exemplo, esquizofrenia (Lencz et al., 2015; Yao
 54

et al., 2015), depressão (Savitz et al., 2013; Pearson-Fuhrhop et al., 2014); jogo

patológico (Hillemacher et al., 2015) e dependência de álcool (Delis et al., 2015),

nicotina (Ahrens et al., 2015; Ma et al., 2015), opiáceos (Nelson et al., 2014; Levran

et al., 2015), maconha (Colizzi et al., 2015; DiNieri et al., 2015) e cocaína (Noble et

al., 1993). A relação entre o gene DRD2 e o abuso/dependência de cocaína têm sido

investigada em diversos estudos em animais (Lee et al., 2006; Bertran-Gonzalez et

al., 2008; Lawhorn et al., 2013) e humanos. Os estudos de associação vem sendo

uma abordagem muito utilizada para estudar a relação entre o DRD2 e o

abuso/dependência de cocaína, porém apresentaram resultados divergentes,

demonstrando associação positiva (Noble et al., 1993), assim como estudos que não

reportaram esse achado (Gelernter et al., 1999; Messas et al., 2005; Lohoff et al.,

2010; Fernàndez-Castillo et al., 2010).

Além do gene DRD2, diferentes genes e variantes têm sido associadas à

vulnerabilidade para o abuso/dependência de cocaína. No sistema de recompensa do

cérebro, a cocaína inibe diretamente o transportador de dopamina levando a um

aumento dos níveis desse neurotransmissor na fenda sináptica, o que causa um

acúmulo deste neurotransmissor, que não pode ser recapturado. Esse acúmulo é

responsável pelo estresse oxidativo que pode levar, por exemplo, à

neurodegeneração. Por outro lado, em usuários de crack, um estudo recente de 2014

mostrou uma correlação entre a condição de estresse oxidativo e a gravidade dos

sintomas de abstinência (Zaparte et al., 2014).

A cerca disso, um achado importante no presente trabalho foi a hiper-

representação da glutationa e adenosina na análise de associação a drogas pelo

 55

WebGestalt. A glutationa tem ação antioxidante e atua como protetor celular contra

esses danos oxidativos. O gene que codifica a GSTP1 (glutathione S-transferase pi

1), integrante da família das glutationas-S-transferases, enzimas que desempenham

um papel importante na redução do estresse oxidativo, apresentou-se hipometilado

nos casos em nossos resultados (Uys et al., 2011). Esse gene protege o DNA desses

danos oxidativos e foi relatado na literatura com associação à dependência de

cocaína. Em um estudo da população brasileira, o tipo selvagem para o polimorfismo

funcional GSTP1 Ile105Val foi encontrado associado a usuários de cocaína,

sugerindo a relevância deste gene no mecanismo de resposta à droga (Guindalini et

al., 2005). A adenosina é um nucleosídeo que atua como neuromodulador endógeno

e têm sido implicado em processos patofisiológicos como a dependência química.

Seu receptor antagonista A(2A) é altamente expresso no SNC, principalmente no

NAc, estriado ventral e dorsal, onde forma unidades funcionais com o receptor de

dopamina DRD2 alterando sua ligação e sinalização, inibindo a adenosina endógena

por aumentar o efeito da dopamina nesses receptores (Lopes et al., 2011; Lane et al.,

2012). Estudos em modelo animal têm mostrado um papel importante do A(2A) na

modulação dos efeitos agudos da cocaína, principalmente sobre os efeitos

comportamentais nos animais. Wells e colaboradores (2012) relataram diminuição na

transmissão dopaminérgica no núcleo accumbens de camundongos tratados com

cocaína e o papel do A(2A) na modulação dos efeitos agudos da droga, como na

regulação da hiperlocomoção.

Na análise de enriquecimento de doenças, estão hiper-representados os

transtornos psiquiátricos: tique, estresse, transtorno psicótico induzido e abuso de

maconha. Notavelmente, o transtorno psicótico induzido e o abuso de maconha

 56

estavam representados pelos mesmos genes, o DRD2, citado anteriormente; EHMT1

(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1) e EHMT2 (euchromatic histone-

lysine N-methyltransferase 2). Os genes EHMT1 e EHMT2, também representados

na rede PPI, são histonas metiltransferases cujas proteínas as quais codificam estão

envolvidas na repressão da transcrição e já foram relacionados com transtornos como

a esquizofrenia (Balan et al., 2014). O gene EHMT2, encontrado hipometilado na

região promotora, e o EHMT1, encontrado hipermetilado no corpo do gene, já foram

associados com o uso prolongado de cocaína e a expressão gênica, demonstrada em

cérebro de camundongos (NAc), por estar sendo influenciada pelo uso desta droga

(Maze et al., 2010; 2014; Covington et al., 2011).

O resultado dessa análise de enriquecimento para doenças corrobora com um

estudo caso/ controle recente que avaliou a interação do gene DRD2 em casos de

pacientes com dependência de maconha, controles com traços esquizotípicos em

relação ao desenvolvimento de transtorno psicótico. Os autores relataram que a

interação entre o gene DRD2 e o uso de maconha pode influenciar a probabilidade de

um transtorno psicótico, e os controles saudáveis que carregavam o mesmo alelo do

gene DRD2 que os casos tinham risco aumentado para esquizotipia quando

comparados com os controles que não carregavam esse alelo (Colizzi et al., 2015).

Em relação ao estresse, outro transtorno psiquiátrico revelado nessa análise, os

principais genes relacionados foram MAP2K1 (mitogen-activated protein kinase

kinase 1), MAPK3 (mitogen-activated protein kinase 3) e MAPK1 (mitogen-activated

protein kinase 1) relacionados à cascata de sinalização MAPK, processos

intracelulares envolvidos na diferenciação, proliferação, regulação de transcrição,

 57

sobrevivência celular e desenvolvimento neuronal (Rubinfeld, Seger, 2005). Esses

três genes também apresentaram hiper-representação nos processos biológicos e

moleculares e em vias depositadas no banco de dados KEGG. A cascata de

sinalização MAPK foi hiper-representada e os genes estavam presentes em mais sete

processos: leucemia mieloide crônica, vias de câncer, câncer de prostata, via de

sinalização de insulina, via de sinalização de ErbB, Gap junctions e via de

sinalização de receptores de célula T. desse banco de dados. Em relação à cocaína, a

via MAPK é ativada pelo aumento de dopamina extracelular no corpo estriado em

resposta ao abuso da droga, desempenhando um importante papel na regulação

gênica por ativação direta de fatores de transcrição e na remodelação da cromatina

(Brami-Cherrier et al., 2009). Esses dados corroboram com nossos achados, uma vez

que esse gene encontra-se hipometilado na região promotora, fazendo com que haja

um provavel aumento da expressão nos pacientes dependentes da droga.

Interessantemente, um estudo com modelos animais mostrou a relação da cocaína e

da metilação do gene MAPK1 quando observou a prole masculina de camundongos

de mães expostas à droga (Novikova et al., 2008). MAPK1, encontrado hipometilado

no promotor e MAPK3 hipometilado no corpo do gene, foram encontrados

envolvidos na regulação dos efeitos da cocaína (Ferguson et al., 2006). A inibição da

cascata Raf-MEK-ERK modula a sensibilização ao desenvolvimento psicomotor à

cocaína (Pierce et al., 1999; Valjent et al., 2005).

Um estudo post mortem avaliou o córtex pré-frontal dorsolateral, entre grupos

de dependentes de cocaína e controles, encontraram o aumento da expressão gênica

de MAPK3 e MAP2K1, sendo este último também hiper expresso em pacientes que

faziam uso de crack (Lehrmann et al., 2003).

 58

Encontramos três genes hipometilados relacionados a três DMRs, cada uma

com pelo menos três sítios díferencialmente metilados. As DMRs se encontram nos

genes BMP8A (bone morphogenetic protein 8A), membro de uma grande família de

moléculas de sinalização de polipeptídeos extracelulares, relacionados com a

transformação do fator de crescimento β (TGF-β), envolvido na proliferação,

diferenciação e sobrevivência celular (Chung et al., 2015); GPR88 (G protein-

coupled receptor 88), que tem expressão elevada no SNC em paralelo com a

expressão do gene DRD2, sugerindo um papel na regulação dopaminérgica. A

expressão desse gene está relacionada também com uma variedade de distúrbios

psiquiátricos, incluindo o transtorno bipolar, depressão e esquizofrenia (Dzierba et

al., 2015). E, representando a terceira DMR, o gene RNF166 (ring finger protein

166), envolvido na regulação da ativação de células T (Giannini et al., 2008).

No resultado apresentado pelo GenomeBrowser, somente o gene GPR88

apresentou uma baixa intensidade de sinal das três sondas para o experimento de

MRE-seq, entretanto foi possível identificar um sinal para a região regulatória

H3K4me3 e de expressão no RNA-seq. Isto sugere que o baixo sinal de metilação

apresentado no UCSC Brain Methylation corrobora com o sinal de H3K4me3, o qual

está relacionado com regiões promotoras ativas (Shlyueva et al., 2014), e a expressão

do transcrito identificada pelo RNA-seq. Em relação aos genes RNF166 e BMP8A,

somente o sinal para H3K4me3 é encontrado, sugerindo que a região está ativa para a

transcrição, o que está de acordo com o baixo sinal de regiões de DNA metilado

(MRE-seq e MeDIP), entretanto não foi possível detectar o transcrito por RNA-seq. É

importante ressaltar que estes resultados são provenientes de apenas um indivíduo do

 59

sexo masculino de 57 anos sem dados clínicos e epidemiológicos, portanto, esses

dados precisam ser melhor avaliados.

Comparando os resultados obtidos com estudos de expressão gênica que

avaliam o uso/abuso de cocaína em tecido cerebral de modelo animal, o gene STX1A

(Syntaxin 1A (brain)), um gene do sistema nervoso implicado na afinidade de ligação

das vesículas sinápticas com a membrana plasmática pré-sináptica, e que estava

hipometilado em casos na nossa pesquisa, apresentou baixa expressão gênica no

núcleo accumbens de camundongos tratados com solução salina e cocaína quando

comparados com camundongos tratados com soro fisiológico estéril e S-

adenosilmetionina (Anier et al., 2013).

Em relação a estudos em humanos, especificamente em tecidos post mortem de

dependentes de cocaína, encontramos semelhança entre alguns genes nos resultados.

Dos genes encontrados diferencialmente metilados, encontramos uma sobreposição

com a literatura de 10 genes. Destes, oito possuem diferença de expressão

concordante com o padrão de metilação encontrada nas amostras do presente

trabalho. São eles: AEBP2 (AE binding protein 2), CDHR5 (cadherin-related family

member 5), HIPK3 (homeodomain interacting protein kinase 3), KLF13 (Kruppel-

like factor 13), LMTK2 (lemur tyrosine kinase 2), STMN1 (stathmin 1), MAP2K1 e

MAPK3, todos hipermetilados na nossa amostra e relacionados à hiper expressão nos

estudos encontrados. E, o gene UBE2V2 (ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant

2), hipometilado e relacionado a baixa expressão gênica (Zhou et al., 2011).

Pouco se sabe sobre a relação entre as alterações no padrão de metilação global

do DNA em tecidos cerebral e como essas correspondem aos padrões observados nos
 60

tecidos periféricos facilmente acessíveis, tais como o sangue. Davies e colaboradores

(2012) buscaram evidenciar essa relação em tecido cerebral e sangue periférico e

encontraram variações inter-individuais em ambos tecidos. Outro estudo, abordando

a relação do padrão de metilação sobre o envelhecimento, concluiu que os efeitos da

idade sobre os perfis de metilação do DNA podem ser avaliados pelo sangue,

considerando que o sangue pode ser um substituto promissor para o tecido cerebral

(Horvath et al., 2012). Um estudo mais recente, avaliando essas diferenças para a

esquizofrenia, identificou marcadores CpG encontrados através da metilação em

sangue periférico que evidenciam uma alta correlação com marcadores de metilação

do DNA do cérebro, assim como a identificação de vias biológicas cerebrais afetadas

pela esquizofrenia que podem ser identificadas por meio de tecidos periféricos

(Walton et al., 2015).

Finalmente, como toda investigação possui algumas limitações metodológicas,

o presente estudo segue a regra. Algumas das limitações deste estudo se referem a

população e amostra. A população definida para esse estudo de dependentes de

cocaína e crack, assim como essa população no geral, não segue um padrão definido

de uso/abuso de drogas. Há a droga de preferência entre todas as outras drogas

disponíveis e o indivíduo é considerado como dependente preferencialmente da

droga de escolha, mas essa preferência não anula a possibilidade de comorbidade

com outras drogas. A definição da amostra também pode ser considerada como

limitante que, ao seu número reduzido de 48 indivíduos, permite considerar os

resultados encontrados para a população em questão. Entretanto, para a seleção da

amostra, foram definidos critérios buscando a homogeneidade entre os indivíduos, o

que pode reduz vieses sobre as interferências individuais.

 61

7. CONCLUSÃO

A investigação de metilação global do DNA entre usuários/dependentes de

crack e cocaína e controles saudáveis mostrou diferenças estatisticamente

significantes no padrão de metilação genômico. Essas alterações estão associadas a

genes hiper-representados em processos biológicos e moleculares, e envolvidas com

a regulação transcricional.

A observação desses resultados em comparação com estudos de expressão em

tecido cerebral já foi relatada na literatura para o abuso/dependência de cocaína e as

alterações observadas em estudos anteriores indicam que há uma correlação entre a

expressão gênica no cérebro e genes diferencialmente metilados, e que a metilação

global do DNA pode ser detectada em sangue periférico.

 62

8. ANEXOS

ANEXO A. Origem dos pacientes/ amostras do banco de DNA (biorepositório) do

ProGene (IPq HCFMUSP) – Casos e controles

Os casos de abuso/dependência de cocaína/crack e controles provenientes

do banco de DNA do Programa de Genética e Farmacogenética (ProGene) do

Instituto de Psiquiatria do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo (IPq-HCFMUSP). Esse banco de amostras

(biorepositório) já foram utilizados em estudos anteriores, gerando três teses, uma

dissertação e publicações desses resultados em diversas revistas internacionais. O

primeiro desses estudos relata o papel do polimorfismo Bal I no gene que codifica o

receptor de dopamina DRD3 na dependência de cocaína (Messas et al., 2005), o

segundo estudo descreve a importância do efeito da estratificação populacional em

estudos de associação e posteriormente a investigação de genes candidatos para a

dependência de cocaína (Guindalini et al., 2005; Guindalini et al., 2006(a);

Guindalini et al., 2006(b); Guindalini et al., 2007; Guindalini et al., 2008). Em 2006,

Cunha apresentou a sua dissertação sobre o papel dos genes que codificam a MAO-A,

COMT e 5-HTT na dependência de cocaína (Cunha, 2006). Recentemente, Negrão e

colaboradores relataram a importância de variantes do gene que codifica a

butirilcolinesterase no comportamento de abuso/dependência de crack/cocaína

(Negrão et al., 2013).

 63

Casos. Os usuários/dependentes de cocaína/ crack participaram

originalmente de um estudo para avaliação do perfil de usuários graves de cocaína na

cidade de São Paulo (Dunn, Laranjeira, 1999), aprovado pelo Comitê de Ética

Médica da Escola Paulista de Medicina – UNIFESP. Esse estudo foi realizado pelo

Centro de Estudos de Epidemiologia Clínica (GRIDEC) e pela Unidade de Pesquisa

em Álcool e Drogas (UNIAD), ambos pertencentes à Escola Paulista de Medicina

(EPM) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), com a participação de sete

serviços de atendimento a dependentes de drogas na região metropolitana de São

Paulo: Casa de Saúde Santana, Centro Psiquiátrico de São Bernardo do Campo,

Hospital Geral de Taipas, Sanatório Charcot, Hospital Psiquiátrico da Água Funda,

Comunidade Terapêutica Bezerra de Menezes e a Unidade de Pesquisa em Álcool e

Drogas (UNIAD) em regime ambulatorial. Esses serviços foram selecionados por um

levantamento de instituições de saúde especializadas no atendimento hospitalar a

usuários/dependentes de drogas na região metropolitana de São Paulo, durante o ano

de 1996, baseado no Sistema de Informações Hospitalares do Sistema Único de

Saúde (SIH/SUS) do Ministério da Saúde.

A identificação dos serviços foi baseada no registro de internações de

pacientes com qualquer diagnóstico da Classificação Internacional de Doenças, nona

edição (CID 9, então vigente) relacionado ao uso de substâncias químicas.

Inicialmente, foram detectadas 36 instituições e a partir desse resultado, foram

selecionadas aquelas que apresentaram pelo menos 50 internações no ano de 1996.

Serviços não conveniados ao SUS que apresentaram mais de 50 internações ou

atendimentos em 12 meses também foram selecionados. Após este processo, todos

 64

os serviços selecionados receberam um ofício com a cópia e justificativa do projeto e

uma solicitação para realização da pesquisa em suas enfermarias/ ambulatório.

Os pacientes submetidos a tratamento nestas instituições, de ambos os

sexos, com mais de 17 anos, moradores da região metropolitana de São Paulo e em

condições físicas e mentais de participarem da entrevista foram selecionados.

Pacientes com história exclusiva de dependência de álcool ou drogas de

administração por via oral foram excluídos. Todos os pacientes selecionados

satisfizeram os critérios de dependência de cocaína a partir das diretrizes da CID10,

complementados por informações colhidas a partir de um questionário desenvolvido

e validado em uma população de dependentes químicos em São Paulo (Dunn,

Laranjeira, 2000). Este questionário foi respondido por cada paciente a partir de uma

entrevista conduzida individual e reservadamente no local do tratamento psiquiátrico

pela equipe de trabalho do projeto anteriormente treinada e sob supervisão do

pesquisador responsável por essa sessão do trabalho. As informações sobre dados

sócio-demográficos desses indivíduos, assim como o uso de drogas lícitas e ilícitas,

início do uso de cocaína, transições na via de administração da droga e atividades

criminais foram descritas na tese de doutoramento já citada (Guindalini, 2005).

Resumidamente, essa amostra é constituída na sua maioria por indivíduos do sexo

masculino (95%) e solteiros (60%), tendo cursado o primeiro grau ou menos (62%) e

predominantemente caucasianos (70%). No que tange à droga de escolha, 70% fazem

tanto uso de cocaína inalada como na forma fumada, o crack. Em relação à

criminalidade, 53% do total da amostra relata ter sido detida pelo menos uma vez

durante a vida.
 65

Controles. Os controles utilizados nesse estudo são indivíduos

voluntários que foram recrutados no Banco de Sangue do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (PROSANGUE). Todos os

voluntários doadores de sangue são submetidos a um questionário para investigação

de doenças contagiosas e uso de substâncias químicas (fármacos e outras

substâncias). Indivíduos com relato de história pregressa de uso abusivo ou contato

recente com qualquer droga de potencial abuso são impedidos de realizar a doação.

Durante o ato de coleta de sangue, uma breve entrevista complementar com cada

doador foi realizada, investigando a presença de algum diagnóstico psiquiátrico ao

longo da vida. Doadores que apresentaram informações positivas para alguma

condição psiquiátrica atual ou com história de internação psiquiátrica em algum

momento da vida foram excluídos do estudo.

Coleta de amostras e extração de DNA. A avaliação e coleta de material

biológico foi realizada no período de agosto de 1997 e cada paciente (casos e

controles) assinou um termo de consentimento após esclarecimentos sobre os

objetivos do projeto. Foram coletados 35 ml de sangue periférico de cada paciente,

com material estéril e descartável (Tubos Vacutainer). Destes 35 ml de sangue, 27 ml

(sem anticoagulante) foram destinados a exames sorológicos pertinentes a outros

estudos associados e 8 ml contendo EDTA (anti-coagulante) foram preservados para

a extração de DNA. O DNA genômico foi extraído a partir do sangue total utilizando

– se os métodos se Fenol/Clorofórmio ou “Salting Out”, descrito por Miller et al.

(1988). Após a extração, a viabilidade de material extraído foi vizualizada em gel de

agarose 0,8% e a concentração foi obtida por leitura em espectrofotômetro Gene

Quant (Amersham Pharmacia Biotech Inc, Piscataway, New Jersey, USA).

 66

ANEXO B. Aprovação do pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Meducuna - FMUSP
 67

ANEXO C.

Tabela 1 - Relação dos sítios e genes hipermetilados (adjP<10-5)

Probe ID adj.P.Val CHR Gene Relação ao gene_ilha β β Δβ

CpG Casos Controles
cg14091531 3,01E-007 1 PDPN IGR - Ilha 0,822 0,805 0,02
cg03511735 6,72E-006 8 PTP4A3 IGR - shelf 0,893 0,868 0,02
cg01934856 1,20E-006 1 CASZ1 Corpo do gene - Ilha 0,877 0,851 0,03
cg02431780 3,15E-006 5 LOC648987 IGR - open sea 0,661 0,633 0,03
cg04736453 1,14E-008 16 EEF2K IGR - shelf 0,815 0,786 0,03
cg01747978 2,03E-006 7 GJC3 IGR - open sea 0,842 0,813 0,03
cg10335230 3,87E-006 11 LOC283177 IGR - shelf 0,680 0,650 0,03
cg17113878 5,84E-006 1 VPS45 Corpo do gene - shelf 0,887 0,856 0,03
cg00471142 6,21E-006 19 LRFN1 TSS1500 - shore 0,903 0,871 0,03
cg12190125 7,57E-007 12 OR9K2 IGR - open sea 0,618 0,585 0,03
cg08849635 5,26E-006 10 SFRP5 TSS1500 - shore 0,631 0,598 0,03
cg11569703 3,07E-008 11 OVOL1 Corpo do gene - shore 0,829 0,796 0,03
cg09507215 4,89E-006 13 ATP11A Corpo do gene - shelf 0,741 0,707 0,03
cg00642607 5,08E-006 10 PFKP IGR - open sea 0,886 0,852 0,03
cg21671386 8,65E-006 11 DRD2 3'UTR - open sea 0,846 0,810 0,04
cg24904863 9,97E-006 8 MIR4472-1 IGR - open sea 0,749 0,711 0,04
cg04607032 5,47E-006 17 SEPT9 IGR - open sea 0,895 0,857 0,04
cg26758810 1,10E-007 6 RP11-162J8.2 IGR - shelf 0,802 0,764 0,04
cg24007084 1,03E-007 17 FOXN1 TSS200 - open sea 0,783 0,745 0,04
cg12619612 1,10E-007 7 SLC12A9 IGR - shelf 0,912 0,874 0,04
cg02578321 1,12E-007 1 C1orf229 TSS200 - shore 0,714 0,674 0,04
cg13315471 2,63E-008 2 TMEM214 Corpo do gene - shelf 0,717 0,677 0,04
cg03528519 6,68E-006 1 SCP2 3'UTR - open sea 0,821 0,780 0,04
cg23681110 2,78E-006 8 TRAPPC9 Corpo do gene - open sea 0,811 0,770 0,04
cg00962799 1,92E-008 X SSX8 TSS200 - open sea 0,731 0,689 0,04
cg04282029 7,63E-008 1 SV2A TSS1500 - open sea 0,839 0,796 0,04
cg10839502 3,30E-008 10 DIP2C Corpo do gene - shelf 0,874 0,831 0,04
cg02158565 5,15E-007 7 AGAP3 Corpo do gene - shelf 0,794 0,750 0,04
cg00811382 2,78E-006 7 LMTK2 Corpo do gene - shelf 0,897 0,853 0,04
cg13801510 1,48E-006 6 RNASET2 IGR - Ilha 0,644 0,600 0,04
cg23995169 2,95E-009 2 SRBD1 5'UTR - shelf 0,778 0,733 0,04
cg24141153 7,17E-008 19 CBLC IGR - shelf 0,852 0,806 0,05
cg04205664 5,62E-008 7 CLEC2L Corpo do gene - shore 0,291 0,246 0,05
cg25426044 1,52E-011 8 GEM IGR - open sea 0,765 0,719 0,05
cg11961642 6,21E-006 12 DNAH10 Corpo do gene - Ilha 0,842 0,795 0,05
cg19890431 1,63E-007 11 ART5 3'UTR - shelf 0,634 0,585 0,05
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adj.P.Val - p-valor ajustado; CHR - Cromossomo; continua
Δβ - Delta Beta.
 68

Tabela 1 (cont.) - Relação dos sítios e genes hipermetilados (adjP<10-5)

Probe ID adj.P.Val CHR Gene Relação ao gene_ilha β- β- Δβ

CpG Casos Controles
cg21886089 7,72E-007 7 WBSCR17 Corpo do gene - open sea 0,754 0,704 0,05
cg25333056 1,80E-010 10 TUBGCP2 Corpo do gene - shelf 0,745 0,694 0,05
cg07009968 5,12E-008 15 MIR1469 IGR - open sea 0,569 0,518 0,05
cg01959896 2,95E-007 6 PDSS2 Corpo do gene - open sea 0,884 0,831 0,05
cg00800759 6,23E-009 16 CRYM 5'UTR - shelf 0,572 0,517 0,05
cg14923379 1,45E-006 X FAM123B 5'UTR - shelf 0,808 0,751 0,06
cg04581293 3,22E-010 3 CCNL1 IGR - shelf 0,730 0,673 0,06
cg27404272 4,39E-006 2 MIR2467 IGR - shore 0,803 0,746 0,06
cg18219180 6,17E-007 2 ICOS TSS1500 - open sea 0,808 0,750 0,06
cg04945626 2,15E-007 4 RP3-513G18.2 IGR - shelf 0,864 0,806 0,06
cg04930982 3,79E-008 6 UST Corpo do gene - shelf 0,895 0,835 0,06
cg04224041 4,80E-006 4 CTBP1 Corpo do gene - shore 0,791 0,731 0,06
cg16975981 1,14E-008 X PAGE5 5'UTR - open sea 0,654 0,593 0,06
cg01810623 8,42E-006 12 IL26 IGR - open sea 0,761 0,699 0,06
cg07086224 8,03E-006 2 FAM82A1 Corpo do gene - open sea 0,790 0,728 0,06
cg11158902 6,51E-011 4 MAN2B2 IGR - open sea 0,731 0,666 0,07
cg16101278 5,94E-007 6 LY86 Corpo do gene - open sea 0,337 0,271 0,07
cg07449447 1,36E-015 14 SAMD4A Corpo do gene - shore 0,750 0,684 0,07
cg25612480 7,55E-010 8 UBE2V2 TSS1500 - shore 0,521 0,454 0,07
cg18301538 9,85E-007 10 GBF1 Corpo do gene - open sea 0,770 0,703 0,07
cg26288370 4,95E-008 6 KIAA1244 Corpo do gene - shelf 0,862 0,795 0,07
cg20001070 1,55E-007 7 UPP1 5'UTR - shore 0,317 0,250 0,07
cg02771392 1,02E-012 7 ZNF273 TSS1500 - open sea 0,624 0,556 0,07
cg13701768 5,97E-009 9 PAX5 Corpo do gene - Ilha 0,835 0,765 0,07
cg02732134 2,30E-011 10 DNMBP 5'UTR - open sea 0,501 0,430 0,07
cg06631999 7,96E-013 1 STMN1 Corpo do gene - open sea 0,895 0,823 0,07
cg25009327 2,85E-013 7 ZNF425 Corpo do gene - shelf 0,292 0,219 0,07
cg06106839 3,15E-012 12 TUBA1C IGR - open sea 0,812 0,739 0,07
cg21565415 3,45E-008 11 MUPCDH Corpo do gene - shore 0,526 0,452 0,07
cg05106659 2,44E-010 4 PET112L TSS1500 - shore 0,879 0,805 0,07
cg26706961 6,25E-013 2 OLA1 IGR - open sea 0,709 0,634 0,07
cg02047661 4,34E-006 3 RRP9 TSS1500 - shore 0,696 0,621 0,08
cg13810766 2,14E-013 7 PRKAG2 Corpo do gene - open sea 0,413 0,337 0,08
cg01219670 2,06E-009 7 ZP3 Corpo do gene - open sea 0,727 0,651 0,08
cg14221700 6,65E-008 1 KCNA2 IGR - shelf 0,685 0,608 0,08
cg02246683 2,61E-007 8 NCOA2 5'UTR - open sea 0,792 0,714 0,08
cg09656541 7,39E-007 10 C10orf118 5'UTR - shore 0,390 0,311 0,08
cg08169830 1,78E-010 7 LMTK2 Corpo do gene - shore 0,808 0,729 0,08
cg13610622 3,51E-009 10 USP6NL Corpo do gene - shore 0,820 0,740 0,08
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adj.P.Val - p-valor ajustado; CHR - Cromossomo; continua
Δβ - Delta Beta.
 69

Tabela 1 (conclusão) - Relação dos sítios e genes hipermetilados (adjP<10-5)

Probe ID adj.P.Val CHR Gene Relação ao gene_ilha β- β- Δβ

CpG Casos Controles
cg25884442 2,81E-013 12 VWF Corpo do gene - open sea 0,545 0,464 0,08
cg07437919 8,85E-009 8 SLC45A4 Corpo do gene - shore 0,428 0,348 0,08
cg07892139 2,90E-008 X UBE2DNL IGR - shelf 0,745 0,664 0,08
cg14269096 1,05E-010 18 ZNF532 5'UTR - shore 0,756 0,673 0,08
cg24044028 6,01E-006 12 E2F7 IGR - open sea 0,772 0,688 0,08
cg01074676 8,41E-008 14 C14orf135 3'UTR - open sea 0,747 0,664 0,08
cg00192773 3,84E-010 16 MAPK3 Corpo do gene - shelf 0,704 0,618 0,09
cg11049075 1,15E-007 17 HDAC5 5'UTR - shore 0,672 0,584 0,09
cg14495033 6,23E-009 9 EHMT1 Corpo do gene - shore 0,686 0,597 0,09
cg14380444 5,44E-006 1 RERE Corpo do gene - open sea 0,610 0,519 0,09
cg07343790 4,47E-008 13 ATP11A Corpo do gene - open sea 0,263 0,170 0,09
cg03027241 3,40E-017 20 KCNG1 3'UTR - Ilha 0,471 0,378 0,09
cg15285494 6,37E-008 4 FAT1 IGR - shore 0,644 0,550 0,09
cg08257600 3,21E-013 19 ADCK4 Corpo do gene - shelf 0,740 0,646 0,09
cg21937244 1,26E-015 14 CDC42BPB Corpo do gene - Ilha 0,735 0,640 0,10
cg22534759 8,52E-008 10 KIF5B IGR - shelf 0,739 0,642 0,10
cg04250181 8,66E-011 12 SLCO1B3 5'UTR - open sea 0,763 0,665 0,10
cg14497545 7,46E-020 4 MAML3 Corpo do gene - open sea 0,482 0,379 0,10
cg04623165 1,23E-011 2 MIR4261 IGR - open sea 0,724 0,621 0,10
cg14387505 7,36E-008 16 AHSP TSS1500 - open sea 0,507 0,404 0,10
cg27379715 5,83E-017 2 SNTG2 IGR - open sea 0,650 0,545 0,10
cg01736133 1,80E-013 4 LOC645513 IGR - open sea 0,699 0,594 0,11
cg02308712 2,07E-018 12 C12orf80 IGR - open sea 0,616 0,508 0,11
cg05648964 5,20E-010 12 RIMKLB IGR - open sea 0,724 0,616 0,11
cg15897635 2,78E-014 1 MARK1 IGR - shelf 0,418 0,309 0,11
cg03726791 2,90E-016 2 THAP4 Corpo do gene - open sea 0,711 0,601 0,11
cg03150409 1,38E-010 4 WHSC1 5'UTR - open sea 0,553 0,440 0,11
cg05590156 3,15E-012 5 TRIO Corpo do gene - open sea 0,769 0,647 0,12
cg01287788 1,58E-017 2 SNORD94 TSS200 - open sea 0,630 0,507 0,12
cg23797200 7,57E-018 17 NKIRAS2 Corpo do gene - shelf 0,518 0,392 0,13
cg19933985 1,50E-017 5 SPRY4 IGR - shelf 0,667 0,524 0,14
cg01775802 8,34E-015 14 RGS6 Corpo do gene - open sea 0,416 0,268 0,15
cg10633981 2,50E-018 11 C11orf58 3'UTR - open sea 0,647 0,482 0,17
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adj.P.Val - p-valor ajustado; CHR - Cromossomo;Δβ - Delta Beta.
 70

Tabela 2 - Relação dos sítios e genes hipometilados (adjP<10-5)

Probe ID adj.P.Val CHR Gene Relação ao gene_ilha β β Δβ

CpG Casos Controles
cg11878675 3,43296E-18 2 DGUOK gene 0,203 0,342 -0,14
cg17479131 2,47874E-22 7 LOC401431 1º Éxon - Ilha 0,484 0,625 -0,14
cg03252499 2,8652E-14 11 OR8B8 IGR - Ilha 0,502 0,638 -0,14
cg12065531 2,15621E-17 6 RING1 5'UTR - shore 0,214 0,334 -0,12
cg07920855 1,28445E-11 1 IVNS1ABP TSS200 - Ilha 0,236 0,354 -0,12
cg04981696 4,43768E-13 16 ABCC1 IGR - Ilha 0,337 0,452 -0,12
cg01994308 3,58687E-16 8 PLAG1 1º Éxon - Ilha 0,536 0,642 -0,11
cg17528648 3,49649E-14 5 OSMR IGR - open sea 0,151 0,251 -0,10
cg17520314 1,62727E-13 17 NPLOC4 IGR - open sea 0,262 0,360 -0,10
cg01684248 2,74647E-19 16 FOXF1 5'UTR - open sea 0,465 0,564 -0,10
cg23505966 1,29034E-13 3 CEP97 IGR - shore 0,135 0,233 -0,10
cg19015611 7,10001E-13 2 VAX2 TSS1500 - shore 0,679 0,777 -0,10
cg19349861 1,67445E-21 11 OPCML IGR - Ilha 0,252 0,348 -0,10
cg21107223 1,69536E-10 15 MPI TSS200 - shore 0,157 0,250 -0,09
cg07920148 1,11823E-14 11 HIPK3 1º Éxon - Ilha 0,264 0,357 -0,09
cg22603710 8,83752E-10 3 EPHB1 TSS200 - shore 0,295 0,385 -0,09
cg10684905 8,26326E-11 12 TULP3 TSS200 - Ilha 0,194 0,284 -0,09
cg17258551 2,89463E-15 19 KCNN1 Corpo do gene - shore 0,287 0,376 -0,09
cg18089569 9,4739E-14 11 CALCA IGR - Ilha 0,311 0,400 -0,09
cg05887304 1,9078E-11 X PRPS2 Corpo do gene - shore 0,381 0,468 -0,09
cg06009330 2,43957E-17 2 PCYOX1 1º Éxon - Ilha 0,282 0,368 -0,09
cg02711976 9,65577E-13 1 NCDN TSS200 - Ilha 0,195 0,279 -0,08
cg18048953 2,02527E-13 12 CDKN1B 5'UTR - Ilha 0,461 0,545 -0,08
cg06348038 5,9471E-11 1 IL20 1º Éxon - Ilha 0,226 0,309 -0,08
cg11815057 1,52824E-13 1 NPR1 1º Éxon - Ilha 0,345 0,428 -0,08
cg05629721 4,68261E-17 6 PSMB8 1º Éxon - Ilha 0,199 0,280 -0,08
cg08081407 1,49557E-15 3 ARF4 TSS200 - Ilha 0,353 0,433 -0,08
cg01204305 3,93526E-15 3 AMIGO3 5'UTR - Ilha 0,509 0,589 -0,08
cg10810752 4,85917E-14 1 TAL1 TSS200 - Ilha 0,231 0,309 -0,08
cg12484756 4,515E-10 19 ILF3 TSS1500 - Ilha 0,109 0,186 -0,08
cg03909902 3,27274E-15 12 PRDM4 5'UTR - Ilha 0,327 0,403 -0,08
cg07392601 3,8734E-18 9 LOC100272217 Corpo do gene - shelf 0,165 0,241 -0,08
cg02181963 1,48341E-12 13 CARS2 TSS1500 - Ilha 0,224 0,300 -0,08
cg20095036 4,19028E-14 4 FBXW7 5'UTR - Ilha 0,228 0,303 -0,07
cg01801101 1,29334E-17 7 AMZ1 TSS200 - shore 0,248 0,322 -0,07
cg04957198 4,62992E-15 10 PRTFDC1 1º Éxon - Ilha 0,228 0,301 -0,07
cg19423543 8,85868E-14 5 NKX2-5 Corpo do gene - Ilha 0,154 0,227 -0,07
cg10373645 5,75264E-15 2 DUSP11 TSS1500 - Ilha 0,167 0,239 -0,07
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adj.P.Val - p-valor ajustado; CHR - Cromossomo; continua
Δβ - Delta Beta.
 71

Tabela 2 (cont.) - Relação dos sítios e genes hipometilados (adjP<10-5)

Probe ID adj.P.Val CHR Gene Relação ao gene_ilha β β Δβ

CpG Casos Controles
cg23894553 5,6601E-10 22 ZNRF3 TSS1500 - Ilha 0,169 0,240 -0,07
cg17074213 3,20066E-11 1 TGFBR3 IGR - open sea 0,262 0,334 -0,07
cg11921473 2,85548E-15 2 POLR2D TSS200 - Ilha 0,141 0,212 -0,07
cg07761912 7,49287E-11 1 TOR1AIP2 IGR - Ilha 0,241 0,312 -0,07
cg23606385 1,21421E-15 7 AGFG2 5'UTR - Ilha 0,224 0,295 -0,07
cg18528640 7,95699E-11 1 MSTO1 5'UTR - Ilha 0,307 0,377 -0,07
cg08118344 1,39181E-11 1 RAP1GAP TSS200 - Ilha 0,397 0,467 -0,07
cg04438595 1,69558E-11 1 SPEN Corpo do gene - shelf 0,317 0,386 -0,07
cg05047319 1,27019E-12 11 TMEM135 5'UTR - Ilha 0,232 0,300 -0,07
cg14078059 1,60191E-09 12 TBC1D30 TSS1500 - shore 0,120 0,188 -0,07
cg15534212 2,16221E-09 5 CPEB4 Corpo do gene - Ilha 0,228 0,295 -0,07
cg14787155 4,71485E-11 3 DZIP3 1º Éxon - Ilha 0,267 0,334 -0,07
cg25826973 6,61646E-13 6 EHMT2 Corpo do gene - shore 0,114 0,180 -0,07
cg11932961 1,96867E-12 4 PHF17 1º Éxon - Ilha 0,186 0,252 -0,07
cg07737236 4,30557E-16 3 C3orf57 5'UTR - shore 0,242 0,307 -0,06
cg26250609 3,52091E-10 11 GSTP1 TSS200 - open sea 0,351 0,414 -0,06
cg02008544 1,17955E-12 8 TNFRSF10B 1º Éxon - Ilha 0,225 0,288 -0,06
cg02266452 3,43754E-09 11 ANKRD42 Corpo do gene - Ilha 0,290 0,352 -0,06
cg01469421 1,88955E-15 19 ZNF419 TSS1500 - shore 0,292 0,355 -0,06
cg24449302 5,1438E-12 15 MAP2K1 5'UTR - shore 0,312 0,375 -0,06
cg21786114 1,5994E-09 6 EHMT2 TSS200 - shore 0,309 0,371 -0,06
cg01073178 5,09326E-19 12 TESC TSS1500 - Ilha 0,314 0,376 -0,06
cg03518179 9,86057E-11 1 MEF2D 1º Éxon - Ilha 0,129 0,191 -0,06
cg07089783 2,92887E-10 10 ZEB1 Corpo do gene - Ilha 0,315 0,376 -0,06
cg05258489 6,56118E-16 8 CHD7 1º Éxon - shore 0,262 0,323 -0,06
cg21685750 2,46979E-10 2 STRN Corpo do gene-open sea 0,112 0,172 -0,06
cg22876894 2,50894E-11 20 LOC100289473 Corpo do gene - shore 0,278 0,338 -0,06
cg03519263 3,55784E-12 14 RNASE4 TSS1500 - Ilha 0,183 0,243 -0,06
cg17104026 4,46162E-09 20 STK4 Corpo do gene - shore 0,193 0,253 -0,06
cg14100214 3,16836E-11 7 ZNF273 5'UTR - Ilha 0,407 0,466 -0,06
cg25858983 4,66174E-12 17 UBTF TSS200 - shore 0,265 0,323 -0,06
cg17958798 2,57842E-13 17 YBX2 IGR - shelf 0,213 0,271 -0,06
cg02228815 1,95902E-10 15 KLF13 5'UTR - Ilha 0,293 0,351 -0,06
cg07705810 1,28152E-10 5 MYO10 TSS1500 - Ilha 0,194 0,251 -0,06
cg12839172 1,82072E-13 4 PROM1 TSS200 - shore 0,276 0,332 -0,06
cg22352273 5,5752E-19 2 SCLY TSS1500 - shore 0,318 0,374 -0,06
cg17139369 1,88849E-12 19 MARCH2 TSS200 - Ilha 0,110 0,165 -0,06
cg10708793 5,96064E-11 17 DHX58 TSS1500 - open sea 0,164 0,219 -0,05
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adj.P.Val - p-valor ajustado; CHR - Cromossomo; continua
Δβ - Delta Beta.
 72

Tabela 2 (cont.) - Relação dos sítios e genes hipometilados (adjP<10-5)

Probe ID adj.P.Val CHR Gene Relação ao gene_ilha β β Δβ

CpG Casos Controles
cg01525244 1,00859E-17 22 CBX7 TSS1500 - Ilha 0,257 0,311 -0,05
cg22256027 1,97198E-10 4 MSX1 IGR - Ilha 0,278 0,332 -0,05
cg00513467 1,49201E-12 9 KLHL9 TSS1500 - Ilha 0,207 0,260 -0,05
cg15825264 9,66257E-10 17 ELP2P TSS200 - Ilha 0,096 0,149 -0,05
cg12810548 1,23901E-09 4 SNORA26 Corpo do gene - shore 0,267 0,320 -0,05
cg25422943 2,7842E-09 13 PCDH9 1º Éxon - Ilha 0,168 0,221 -0,05
cg02204205 1,12512E-10 7 GRB10 1º Éxon - Ilha 0,233 0,284 -0,05
cg08161947 9,72917E-11 12 AEBP2 IGR - Ilha 0,265 0,315 -0,05
cg25152348 2,1221E-18 22 NCAPH2 TSS200 - Ilha 0,428 0,478 -0,05
cg02581963 3,61889E-10 10 C10orf75 1º Éxon - Ilha 0,106 0,156 -0,05
cg26979339 3,97847E-09 12 RIC8B Corpo do gene - shore 0,363 0,412 -0,05
cg12753606 1,73231E-09 6 MYB IGR - Ilha 0,145 0,193 -0,05
cg14409559 2,34865E-09 8 MSC IGR - open sea 0,151 0,199 -0,05
cg16676413 7,15537E-12 7 STX1A TSS200 - Ilha 0,151 0,199 -0,05
cg09844907 5,51541E-17 16 MPV17L 5'UTR - shore 0,386 0,434 -0,05
cg02490708 6,58945E-11 1 MIR5087 5'UTR - Ilha 0,111 0,158 -0,05
cg24109273 4,5565E-09 6 YIPF3 Corpo do gene - shelf 0,119 0,166 -0,05
cg02850329 4,29727E-09 1 RCAN3 IGR - shore 0,253 0,299 -0,05
cg20982606 6,04856E-18 12 UNG IGR - Ilha 0,380 0,425 -0,05
cg22843446 3,06131E-12 11 ASAM TSS200 - shelf 0,238 0,283 -0,04
cg19934366 1,23546E-09 17 C17orf68 1º Éxon - Ilha 0,164 0,208 -0,04
cg24769879 8,82276E-11 19 CCDC61 TSS1500 - Ilha 0,230 0,274 -0,04
cg11853667 1,75092E-10 3 VGLL4 Corpo do gene - Ilha 0,140 0,183 -0,04
cg08206623 3,37994E-12 11 CDKN1C Corpo do gene - shore 0,418 0,461 -0,04
cg12855008 3,13585E-11 22 DGCR6 IGR - shore 0,120 0,160 -0,04
cg04937402 3,28728E-12 14 PPP1R3E TSS1500 - shore 0,107 0,146 -0,04
cg14414971 1,79454E-09 7 SDK1 Corpo do gene - shore 0,120 0,159 -0,04
cg09700085 1,95232E-12 3 SLC6A20 TSS200 - Ilha 0,348 0,386 -0,04
cg23842796 4,14084E-09 1 C1orf61 TSS1500 - Ilha 0,120 0,158 -0,04
cg06808467 3,57753E-19 18 LOC339290 IGR - shelf 0,392 0,430 -0,04
cg23681311 1,07174E-10 22 MAPK1 TSS1500 - Ilha 0,087 0,125 -0,04
cg20544651 1,064E-11 15 SCG3 TSS200 - shore 0,253 0,290 -0,04
cg12026095 1,86823E-12 19 FTL TSS200 - Ilha 0,404 0,441 -0,04
cg03468541 9,46574E-13 14 ZC3H14 TSS1500 - shore 0,388 0,424 -0,04
cg03864326 1,29885E-09 16 PSKH1 5'UTR - open sea 0,112 0,148 -0,04
cg17458653 2,2241E-11 2 MIR548N 1º Éxon - shore 0,153 0,189 -0,04
cg06082548 1,00601E-11 10 NKX6-2 TSS200 - Ilha 0,452 0,488 -0,04
cg18008019 9,28998E-11 13 ZIC2 Corpo do gene - shore 0,291 0,327 -0,04
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adj.P.Val - p-valor ajustado; CHR - Cromossomo; continua
Δβ - Delta Beta.
 73

Tabela 2 (conclusão) - Relação dos sítios e genes hipometilados (adjP<10-5)

Probe ID adj.P.Val CHR Gene Relação ao gene_ilha β β Δβ

CpG Casos Controles
cg05920635 3,76707E-09 6 HCRTR2 Corpo do gene - shore 0,207 0,241 -0,03
cg26618056 5,07028E-09 16 LOC554206 5'UTR - Ilha 0,279 0,311 -0,03
cg10246531 7,42059E-10 16 CYBA 5'UTR - Ilha 0,287 0,318 -0,03
cg25229015 4,38624E-09 15 WDR61 1º Éxon - Ilha 0,086 0,117 -0,03
cg15699874 4,83329E-09 11 TIRAP TSS200 - Ilha 0,131 0,162 -0,03
cg03972606 2,01726E-10 2 HJURP Corpo do gene - shore 0,838 0,869 -0,03
cg05484393 3,67842E-09 3 RPL22L1 5'UTR - Ilha 0,186 0,216 -0,03
cg21295467 5,53991E-09 11 VWA5A IGR - Ilha 0,083 0,113 -0,03
cg05570707 2,01181E-12 2 C2orf44 5'UTR - Ilha 0,131 0,161 -0,03
cg17940190 1,04035E-11 20 ADNP Corpo do gene - Ilha 0,180 0,208 -0,03
cg11706469 2,50629E-11 10 FGF8 Corpo do gene - Ilha 0,288 0,315 -0,03
cg22768502 2,9161E-09 6 PRSS35 TSS1500 - Ilha 0,125 0,152 -0,03
cg13003239 9,05145E-12 3 WDR6 Corpo do gene - shore 0,492 0,518 -0,03
cg01320048 3,66013E-09 10 VWA2 TSS200 - Ilha 0,424 0,449 -0,02
cg10679076 1,16493E-09 22 CYTSA 1º Éxon - Ilha 0,090 0,114 -0,02
cg11085408 1,54487E-09 3 PRKCI TSS200 - Ilha 0,207 0,230 -0,02
cg23033759 4,38757E-09 14 C14orf109 5'UTR - open sea 0,077 0,101 -0,02
cg14047339 1,96346E-09 6 RUNX2 TSS200 - Ilha 0,459 0,483 -0,02
cg14165241 6,09526E-11 9 SPTAN1 5'UTR - open sea 0,089 0,112 -0,02
cg07630649 3,29558E-09 16 GABARAPL2 TSS200 - shore 0,088 0,110 -0,02
cg22793136 4,38288E-09 12 PLXNC1 1º Éxon - Ilha 0,252 0,273 -0,02
cg21313137 3,107E-09 20 SNX21 TSS200 - open sea 0,156 0,176 -0,02
cg13898548 3,95694E-10 5 PDLIM7 TSS200 - Ilha 0,102 0,122 -0,02
cg15901997 1,00617E-09 18 MEX3C TSS200 - Ilha 0,057 0,078 -0,02
cg27066239 2,44569E-09 7 FAM40B 1º Éxon - Ilha 0,090 0,110 -0,02
cg14911132 4,45249E-09 11 FADS2 5'UTR - Ilha 0,185 0,205 -0,02
cg26797661 2,97315E-10 1 LYSMD1 Corpo do gene - Ilha 0,125 0,143 -0,02
cg05134026 1,28607E-09 14 TTC5 TSS200 - Ilha 0,137 0,154 -0,02
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adj.P.Val - p-valor ajustado; CHR - Cromossomo; Δβ - Delta Beta.
 74

ANEXO D.

Figura 1- Processos biológicos e moleculares (GO-Gene ontology) hiper-

representados anotando os genes funcionalmente usando o WebGestalt (Wang et al.,
2013).
 75

Tabela 1 - Genes hiper-representados na rede de interação de proteínas usando o

WebGestalt (Wang et al., 2013)

Database: PPI (Protein Interaction Network Module Analysis)

C=173; O=10; E=2.19; R=4.56; rawP=7.24e-05; adjP=0.0014
Gene Nome do gene
1 MSX1 msh homeobox 1
2 RUNX2 runt-related transcription factor 2
3 AEBP2 AE binding protein 2
4 EHMT2 euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2
5 EHMT1 euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1
6 KLF13 Kruppel-like factor 13
7 ZEB1 zinc finger E-box binding homeobox 1
8 OVOL1 ovo-like 1(Drosophila)
9 CTBP1 C-terminal binding protein 1
10 TAL1 T-cell acute lymphocytic leukemia 1
Legenda: Database: PPI (Protein Interaction Network Module Analysis) - Base de dados
Módulo de análise de interação de proteínas em rede; C - número de genes de referência na
categoria; O - número de genes no conjunto de genes e na categoria; E - número esperado na
categoria;R: relação de enriquecimento; rawP - p-valor de teste hipergeométrico; adjP: p-
valor ajustado pelo ajuste de múltiplo teste.

Tabela 2 - Genes hiper-representados na análise de associação a droga glutationa

usando o WebGestalt (Wang et al., 2013)

Database: drug Nome: glutationa

C=341; O=10; E=1.91; R=5.23; rawP=2.61e-05; adjP=0.0001
Gene Nome do gene
1 CYBA cytochrome b-245, alpha polypeptide
2 STX1A syntaxin 1A (brain)
3 KLF13 Kruppel-like factor 13
4 MAPK1 mitogen-activated protein kinase 1
5 GSTP1 glutathione S-transferase pi 1
6 CTBP1 C-terminal binding protein 1
7 HDAC5 histone deacetylase 5
8 NCOA2 nuclear receptor coactivator 2
9 ABCC1 ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 1
10 MAPK3 mitogen-activated protein kinase 3
Legenda: Database: drug (Drug association analysis) - Base de dados Análise de associação
a droga; C - número de genes de referência na categoria; O - número de genes no conjunto de
genes e na categoria; E - número esperado na categoria;R: relação de enriquecimento; rawP
- p-valor de teste hipergeométrico; adjP: p-valor ajustado pelo ajuste de múltiplo teste.
 76

Tabela 3 - Genes hiper-representados na análise de associação a droga adenosina

usando o WebGestalt (Wang et al., 2013)

Database: drug Nome: adenosina

C=477; O=9; E=2.68; R=3.36; rawP=0.0016; adjP=0.0032
Gene Nome do gene
1 KIF5B kinesin family member 5B
2 PRKAG2 protein kinase, AMP-activated, gamma 2 non-catalytic subunit
3 POLR2D polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide D
4 OLA1 Obg-like ATPase 1
5 ATP11A ATPase, class VI, type 11A
6 NCAPH2 non-SMC condensin II complex, subunit H2
7 NPLOC4 nuclear protein localization 4 homolog (S. cerevisiae)
8 EEF2K eukaryotic elongation factor-2 kinase
9 ABCC1 ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 1
Legenda: Database: drug (Drug association analysis) - Base de dados Análise de associação
a droga; C - número de genes de referência na categoria; O - número de genes no conjunto de
genes e na categoria; E - número esperado na categoria;R: relação de enriquecimento; rawP
- p-valor de teste hipergeométrico; adjP: p-valor ajustado pelo ajuste de múltiplo teste.
 77

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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