R - D - Zulma Sarmiento Vasquez

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
ZULMA SARMIENTO VÁSQUEZ
VALORIZAÇÃO DE CASCAS DO FRUTO DE CACAU (Theobroma cacao L.):

OBTENÇÃO DE HIDROLISADO DO PRÉ-TRATAMENTO QUÍMICO E
ENZIMÁTICO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO PROPIÔNICO
CURITIBA
2017

ZULMA SARMIENTO VÁSQUEZ
VALORIZAÇÃO DE CASCAS DO FRUTO DE CACAU (Theobroma cacao L.):

OBTENÇÃO DE HIDROLISADO DO PRÉ-TRATAMENTO QUÍMICO E
ENZIMÁTICO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO PROPIÔNICO
Dissertação apresentada como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Engenharia de
Bioprocessos e Biotecnologia, Setor de Tecnologia, da
Universidade Federal do Paraná.
Orientadora:
Profª. Drª. Luciana P. S. Vandenberghe,
Co-orientadores:
Profª. Drª. Cristine Rodrigues
Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol
CURITIBA
2017
Catalogação na Fonte: Sistema de Bibliotecas, UFPR
Biblioteca de Ciência e Tecnologia
V335v Vásquez, Zulma Sarmiento

Valorização de cascas do fruto de cacau (theobroma cacao l.): obtenção de
hidrolisado do pré-tratamento químico e enzimático para a produção de ácido
propiônico / Zulma Sarmiento Vásquez – Curitiba, 2017.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de

Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e
Biotecnologia, 2017.
Orientadora: Luciana P. S. Vandenberghe

Coorientadores: Cristine Rodrigues; Carlos Ricardo Soccol
1. Cacau. 2. Àcido Propiônico. 3. Enzimas. I. Universidade Federal do

Paraná. II. Vandenberghe, Luciana P. S. III. Rodrigues, Cristiane. IV. Soccol,
Carlos
Ricardo. V. Título.
CDD: 624.024
Bibliotecária: Roseny Rivelini Morciani CRB-9/1585

A meus pais, Ricardo e Marina
Dedico.

AGRADECIMENTOS
Aos Diretores, Coordenadores e Professores do Programa de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da

Universidade Federal do Paraná, pela oportunidade de fazer parte do curso e por contribuir com a minha
formação acadêmica e profissional.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de

estudo.
À Professora Luciana Vandenberghe, por sua orientação, exemplo, ensinos, confiança e estímulos para o
desenvolvimento deste estudo. E por ser um suporte importante durante esta etapa do meu desenvolvimento
profissional.
À Professora Cristine Rodrigues, pela co-orientação, pelos conselhos e colaboração em todos os momentos.
À Professora Valcineide Tanobe, pela colaboração nas diversas análises e contribuições neste trabalho.
A meus pais Ricardo e Marina, pelo amor, confiança e apoio. Serão para sempre, o melhor exemplo de vida e
uma das minhas maiores motivações. As minhas irmãs Lucia e Tatiana e ao meu sobrinho Sebastian, pelo
amor e compreensão que nunca faltou, mesmo na distância.
A Luiz Eduardo, Josiane e avó Lizeth pelo amor, compreensão e apoio incondicional, por serem como minha
família. À Judi e Romeu pelo carinho e apoio.
Aos meus amigos na distância: Nidia, Manuela e Andrés, pelo carinho e amizade incondicional. A Deborah,
Mitiyo, Suzan, Vanessa e Andressa pela amizade, suporte e fortaleza em todos os momentos.
Aos colegas do Programa pelas discussões valiosas, apoio no dia-dia e pelo intercâmbio de ideias. Em
especial à Priscilla, Patrick, Dão, Nelson, Juliana, Ana Maria, Marcela, Omar, Emerson, Luis, Estefania, Lina,
Kim, Grecia, Biaane e Oranys.
Aos professores Aristóteles Góes da UFES e ao Professor Hervé Rogez da UFPA, pela disponibilização da
matéria prima utilizada para o desenvolvimento deste projeto.
Às Professoras Silvana Nisgoski e Érika Amano, pelas discussões no tema de anatomia vegetal.
A Mitiyo e ao Otacilío por facilitar e apoiar o desenvolvimento de todas as práticas no laboratório.
Ao laboratório Lacaut, ao Laboratório de Ótica e Instrumentação de raios X do Departamento de Física da

UFPR, ao Laboratório de Biomassa (Biofix) da UFPR, ao Centro de Microscopia Eletrônica da UFPR e ao
Laboratório de Anatomia e Qualidade da Madeira, pelo apoio nas análises de caracterização realizadas para
este trabalho. Em especial aos técnicos Eliane Lopes e Ériko Szameitat.
A todas as pessoas, que contribuíram para que este estudo se desenvolvesse adequadamente, o meu
agradecimento.

RESUMO
A casca de cacau (CC) é considerada um resíduo problemático nas fases iniciais da indústria
de processamento de cacau. As sementes são separadas do fruto e a casca é posteriormente
descartada, originando possíveis focos de doenças fitossanitárias graves, se a disposição final não
for feita adequadamente. Há algum tempo, as cascas têm sido utilizadas como ingrediente na
alimentação animal e como fertilizante. No entanto, nos últimos anos este material despertou o
interesse de pesquisadores de diferentes áreas devido ao seu importante conteúdo em pectina, sua
capacidade antioxidante, potencial energético e suas características para produzir materiais
adsorventes, ou carbono ativado. Assim, esta ampla gama de aplicações torna à CC um subproduto
importante da cadeia produtiva do cacau.
Neste trabalho foi avaliada a possibilidade da produção de biomoléculas a partir da glucose
obtida da hidrólise da CC. Em primeiro lugar, estabeleceram-se os pré-tratamentos alcalino (com
NaOH 2,3% (m/v)) e enzimático, utilizando Cellic® CTec 2 (2,4% (v/v)) para obter glucose a partir
da CC, atingindo concentrações máximas de 60,5 g·L-1 e obtendo-se um rendimento de 305 mg de
glucose/g de CC. Em seguida, utilizando técnicas diferentes, realizou-se a caracterização física e
química da CC in natura e pré-tratada com o propósito de avaliar a efetividade do tratamento. As
alterações estruturais e morfológicas da CC foram examinadas por Microscopia Eletrônica de
Varredura (MEV). Ao mesmo tempo, foram determinados os grupos funcionais das amostras,
mediante a técnica de Infravermelho (FTIR). A difração de raios-X (DRX) permitiu determinar o
índice de cristalinidade (CrI) antes e depois dos tratamentos. Finalmente, a estabilidade térmica e as
propriedades do material lignocelulósico e suas temperaturas de degradação, foram determinadas
por análise termogravimétrica (TG). O hidrolisado obtido da casca de cacau (HCC), foi
caracterizado através da quantificação dos componentes por HPLC. Subsequentemente, foi proposto
um meio de fermentação composto pelo HCC, como matéria-prima de baixo custo, adicionado
glicerol e extrato de levedura, para obtenção de ácido propiônico (AP), utilizando a cepa de
Propionibacterium jensenii DSM 20274 do banco de cepas do PPGEBB da UFPR. A concentração
de AP no meio atingiu um máximo de 10,28 g·L-1 e uma produtividade de 0,079 g·L-1·h-1 após 72 h
de processo. Assim, demostrou-se o potencial da CC para a obtenção de biomoléculas de interesse
agroindustrial utilizando ferramentas biotecnológicas.
Palavras chave: casca de cacau, pré-tratamento básico, pré-tratamento enzimático, ácido

propiônico.

ABSTRACT
Cocoa pod husks (CPH) have been considered a problematic waste in the initial stages of
cocoa processing industry. CPHs are removed from cocoa fruit and are discarded, originating a
possible outbreak of serious phytosanitary diseases if the disposal is not made properly. Initially,
CPH was used as an ingredient in animal feed and as a fertilizer. Nonetheless, in the last years this
material arouse the interest of researchers from different areas due to its important content in pectin,
its antioxidant capacity, energy potential and its characteristics to produce adsorbent materials or
activated carbon. Thus, this wide range of applications makes the CPH an important co-product of
cocoa industry.
In this work, the viability of biotechnological production of biomolecules, using glucose
deriving from cocoa pod husk hydrolysate (CPHH) was tested. Firstly, alkaline (with NaOH 2.3%)
and enzymatic pre-treatment using Cellic® CTec 2 (2.4%), were established to obtain glucose from
CPH reaching maximal concentrations of 60.5 g·L-1 and obtaining a yield of 305 mg glucose/g
CPH. After that, using different techniques, physical and chemical characterization of raw and pre-
treated CPH was completed to assess the effectiveness of treatment: structural and morphological
changes of CPH were examined by Scanning Electronic Microscopy (SEM) verifying that the
alkaline-enzymatic treatment promotes the removal of material such as lignin and hemicelluloses,
since it is possible to observe the micro-fibrils of the cellulosic portion totally exposed. At the same
time, the functional groups by Fourier Transform Infrared (FTIR) were determined. Wide-angle X-
ray scattering patterns of CPH were obtained in the reflection mode, enabling the determination of
the crystallinity index (CrI) before and after treatments. Finally, the thermal stability and properties
of the lignocellulosic material and its degradation temperatures were analyzed by thermo-
gravimetric analysis (TG). The hydrolysate was characterized through quantification of its
components by HPLC. Subsequently, a basal medium composed by CPHH, as low-cost feedstock,
added off glycerol and yeast extract, is proposed to obtain propionic acid using Propionibacterium
jensenii DSM 20274 from strains collection of PPGEBB-UFPR. AP concentration in the proposed
medium, reached a maximum of 10.28 g·L-1 and a yield of 0.079 g·L-1·h-1 after 72 h of process.
Thus, the potential of CPH to obtain biomolecules of agroindustrial interest, was demonstrated
through biotechnological tools.
Key-words: Cocoa pod husk, basic pretreatment, enzymatic pretreatment, propionic acid.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Pesquisa relacionada com a produção biotecnológica de ácido propiônico. 16

Figura 2. Theobroma cacau L. 19
Figura 3. Cadeia de valor do cacau 20
Figura 4. Produção mundial de amêndoas de cacau 2014/2015 20
Figura 5. Histórico de produção de cacau no Brasil. Produção vs. Rendimento 21
Figura 6. Exportações dos produtos de cacau e principais países exportadores em 2015. 22
Figura 7. O fruto do cacau e resíduos 23
Figura 8. Pré-tratamentos para a sacarificação do material lignocelulósico. 26
Figura 9. Comércio internacional do AP, suas sais e seus ésteres. 31
Figura 10. Visão geral do metabolismo de Propionibacterium acidipropionici 34
Figura 11. Aplicação do AP na agricultura e na fabricação de ração animal 36
Figura 12. Etapas de acondicionamento da casca do cacau 38
Figura 13. Fragmento de casca de cacau 45
Figura 14. Meios utilizados no processo de seleção do microrganismo 50
Fluxograma de processo para a produção de AP a partir de hidrolisado da casca pré-tratada
Figura 15. 59
química e enzimáticamente
Superfície de resposta do DCCR para determinação dos parâmetros de processo para o pré-
Figura 16. 61
tratamento alcalino da casca de cacau
Diagrama de Pareto do DCCR para determinação dos parâmetros de processo para o pré-
Figura 17. 61
tratamento alcalino da casca de cacau
Figura 18. Balanço de massa para o tratamento básico-enzimático 64
Figura 19. Identificação mediante microscopia ótica das estruturas presentes na casca do cacau. 65
Figura 20. Micrografia Eletrônica Varredura (MEV) das amostras de casca de cacau 67
Figura 21. Difratogramas DRX de amostras de casca de cacau. 69
Figura 22. Espectros de FTIR das amostras de casca de cacau 71
Figura 23. Curva termogravimétrica das amostras de casca de cacau sem e com pré-tratamento básico 73
Figura 24. Coloração de Gram para Propionibacterium jensenii DSM 20274 (C7) 80
Diagrama de Pareto – Influência de componentes adicionados ao meio para a produção de
Figura 25. 82
AP
Figura 26. DCCR – Estudo da influência das concentrações das fontes de C e N. 84
Cinética de fermentação para a produção de AP, realizada por P. jensenii em meio
Figura 27. contendo hidrolisado de casca de cacau e glicerol como fontes de carbono realizada em 89
frascos do tipo Schott de 100 mL.
Cinética de crescimento de P. jensenii em meio contendo hidrolisado de casca de cacau e
Figura 28. 90
glicerol como fontes de carbono realizada em frascos do tipo Schott de vidro de 100 mL.
Figura 29. Produção de AP em biorreator de bancada de 2 L 91
Cinética de fermentação para a produção de AP, realizada por P. jensenii em meio
Figura 30. contendo hidrolisado de casca de cacau e glicerol como fontes de carbono realizada em 91
biorreator de 2 L.
Cinética de fermentação: consumo de fontes de carbono vs. biomassa de P. jensenii em
Figura 31. meio contendo glucose do hidrolisado de casca de cacau e glicerol como fontes de carbono 92
realizada em biorreator de 2 L.
Placa de Petri para avaliação das propriedades antimicrobianas do meio de fermentação
Figura 32. 94
utilizado por P. jensenii DSM 20274

LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Estudos de pré-tratamentos alcalinos de material lignocelulósico 27

Quadro 2. Propriedades físico- químicas do AP 30
Estudos sobre a produção de AP mediante diferentes sistemas de fermentação e uso de
Quadro 3. 35
diferentes fontes de carbono
Microrganismos do gênero Propionibacterium do banco de cepas do PPGEBB utilizados
Quadro 4. 51
para a produção de AP
Quadro 5. Temperaturas de degradação da análise termogravimétrica 74

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Referências de caracterização físico química da casca de cacau 24

Tabela 2. DCCR - Condições de otimização para o pré-tratamento alcalino da casca de cacau 48
Tabela 3. Meio de fermentação para Propionibacterium 52
Planejamento experimental Plackett & Burman para determinação da influência de
Tabela 4. 53
componentes do meio sobre a produção de AP
Tabela 5. Níveis estudados de glucose e glicerol para a otimização da produção de AP 54
Tabela 6. Variação da relação das fontes de carbono 55
Concentrações das substâncias a analisar para a determinação de atividade
Tabela 7. 58
antimicrobiana do caldo de fermentação
Tabela 8. Resultados DCCR: Determinação das condições de pré-tratamento alcalino 60
Tabela 9. Quantificação de íons solúveis para diferentes amostras de casca de cacau 62
Tabela 10. Quantificação de açúcares solúveis para diferentes amostras de casca de cacau 62
Tabela 11. Parâmetros físico-químicos obtidos para a casca de cacau sem tratamento 75
Resultados de quantificação de lignina e carboidratos estruturais presentes no material
Tabela 12. 76
analisado
Tabela 13. Screening das cepas de Propionibacterium para produção de AP 79
Delineamento experimental e resultados - Influência de componentes adicionados ao
Tabela 14. 81
meio para a produção de AP
Resultados DCCR para a otimização das concentrações das fontes de carbono e
Tabela 15. 83
nitrogênio
Tabela 16. Resultados da variação na concentração das fontes de carbono 85
Tabela 17. Produção de AP utilizando uma relação de fontes de carbono de 1:3 87
Comparação da influência da agitação sobre produção de AP em meio sintético e tubos
Tabela 18. 88
de 21 mL
Comparação da influência da escala na produção de AP com meio com hidrolisado de
Tabela 19. 89
casca de cacau e 50 rpm

SUMÁRIO
1.
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................ 19
2.1. Theobroma cacau L.: produtos e resíduos .................................................................... 19
2.1.1. Descrição da planta ...................................................................................................... 19
2.1.2. Produção e mercado mundial de cacau........................................................................ 19
2.1.3. Comércio internacional de produtos de cacau ............................................................. 21
2.1.4. Geração de resíduos ..................................................................................................... 22
2.1.5. Tipos de pré-tratamento para material lignocelulósico ............................................... 25
2.2. Glicerol ........................................................................................................................... 27
2.3. Ácidos orgânicos ............................................................................................................ 29
2.3.1. Ácido propiônico (AP) .................................................................................................. 30
2.3.1.1. Contexto histórico ......................................................................................................... 30
2.3.1.2. Produção e mercado ..................................................................................................... 31
2.3.1.3. Biossíntese do ácido propiônico ................................................................................... 32
2.3.1.4. Microrganismos usados para a produção de AP ......................................................... 33
2.3.1.4.1. Metabolismo de produção e requerimentos nutricionais .......................................... 33
2.3.1.5. Aplicações industriais ................................................................................................... 35
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 37
3.1. Levantamento de informação – Revisão bibliográfica .................................................... 37
3.2. Recebimento e acondicionamento da casca de cacau ..................................................... 38
3.3. Caracterização físico-química da casca de cacau .......................................................... 38
3.3.1. Determinação de umidade, pH, atividade de água (aw), cinzas, açúcares, íons e
proteínas ......................................................................................................................... 39
§ Sólidos totais e umidade ....................................................................................................... 39
§ Determinação de pH ............................................................................................................ 40
§ Determinação da atividade de água (aw) ............................................................................. 40
§ Determinação do teor de cinzas ........................................................................................... 40
§ Determinação do teor de açúcares redutores ...................................................................... 41
§ Determinação de Íons .......................................................................................................... 41
§ Determinação de proteínas .................................................................................................. 41
3.3.2. Determinação de extraíveis em água, etanol e éter de petróleo................................... 42

3.3.3. Determinação de carboidratos estruturais e lignina .................................................... 43

3.3.4. Análise histológica da casca de cacau ......................................................................... 45
3.3.5. Determinação da morfologia por Microscopia eletrônica de varredura (MEV) .......... 46
3.3.6. Determinação do índice de cristalinidade por difração de raios X ............................. 46
3.3.7. Determinação das propriedades térmicas mediante análises termogravimétricas
(TG/dTg) ......................................................................................................................... 47
3.3.8. Determinação de grupos funcionais por espectroscopia de infravermelho (FTIR) ...... 47
3.4. Determinação das condições de processo para o pré -tratamento químico e
enzimático da casca de cacau ........................................................................................ 47
3.4.1. Planejamento experimental DCCR: condições para o pré-tratamento alcalino
com hidróxido de sódio (NaOH) da casca de cacau ...................................................... 48
3.4.2. Determinação das condições de processo para o tratamento da casca de cacau
com a enzima Cellic® CTec 2. ....................................................................................... 49
3.5. Seleção do microrganismo para produção de ácido propiônico .................................... 50
3.5.1. Meio de reativação e conservação ............................................................................... 50
3.5.2. Meio para produção do inóculo ................................................................................... 51
3.5.3. Meio sintético de fermentação ...................................................................................... 51
3.6. Produção de ácido propiônico ........................................................................................ 52
3.6.1. Produção de ácido propiônico com o hidrolisado obtido a partir da casca de
cacau .............................................................................................................................. 52
3.6.1.1. Planejamento experimental Plackett & Burman: sais necessários ao meio ................ 53
3.6.1.2. Planejamento experimental DCCR: otimização das fontes de carbono e
nitrogênio (C/N) ............................................................................................................. 53
3.6.1.3. Efeito da concentração das fontes de carbono, mantendo a relação C/N.................... 55
3.6.1.4. Determinação da melhor condição de incubação: estática ou agitada ....................... 55
3.6.1.5. Quantificação de biomassa ........................................................................................... 55
3.6.1.6. Fermentação em frasco do tipo Schott de 100 mL ....................................................... 56
3.6.1.7. Fermentação em biorreator agitado ............................................................................. 57
3.7. Quantificação de compostos............................................................................................ 57
3.8. Teste de aplicação: determinação da atividade antimicrobiana do meio fermentado .... 57
3.9. Análise estatística ............................................................................................................ 58
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 60
4.1. CAPÍTULO 1: CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO OBTIDO APÓS
PRÉ-TRATAMENTO BÁSICO-ENZIMÁTICO E DA CASCA DO CACAU ........ 60
4.1.1. Pré-tratamento químico-enzimático de cascas de cacau.............................................. 60
4.1.2. Caracterização do hidrolisado obtido a partir do pré-tratamento da casca de
cacau .............................................................................................................................. 62

4.1.3. Caracterização físico-química da casca de cacau pré-tratada química e

enzimáticamente. ............................................................................................................ 64
4.1.3.1. Análise histológica da casca de cacau ......................................................................... 64
4.1.3.2. Determinação da morfologia por Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV ....... 67
4.1.3.3. Determinação do grau de cristalinidade por difração de raios X ............................... 68
4.1.3.4. Determinação de grupos funcionais por espectroscopia de infravermelho (FTIR) ...... 70
4.1.3.5. Determinação das propriedades térmicas mediante análises termogravimétricas
(TG/dTg) ......................................................................................................................... 72
4.1.3.6. Determinação de parâmetros físico-químicos .............................................................. 75
4.1.3.7. Determinação de carboidratos estruturais e lignina .................................................... 76
4.2. CAPÍTULO 2. PRODUÇÃO DE ÁCIDO PROPIÔNICO A PARTIR DO
HIDROLISADO DO PRÉ-TRATAMENTO QUÍMICO E ENZIMÁTICO DA
CASCA DE CACAU ...................................................................................................... 79
4.2.1. Escolha do microrganismo para produção de ácido propiônico ................................. 79
4.2.2. Otimização da produção de ácido propiônico em meio com hidrolisado obtido a
partir do pré-tratamento básico enzimático da casca de cacau .................................... 80
4.2.2.1. Planejamento experimental Plackett & Burman (P&B): sais necessários ao meio ...... 81
4.2.2.2. Planejamento experimental DCCR: otimização das concentrações das fontes de
carbono e nitrogênio (relação C/N) ............................................................................... 82
4.2.2.3. Efeito da concentração das fontes de carbono ............................................................. 85
4.2.2.4. Determinação da melhor condição de incubação: estática ou agitada ....................... 87
4.2.2.5. Fermentação em frasco do tipo Schott de vidro de 100 mL ......................................... 88
4.2.2.6. Fermentação em biorreator agitado de 2 L .................................................................. 91
4.2.3. Teste de aplicação: determinação da atividade antimicrobiana do meio
fermentado...................................................................................................................... 94
5. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 95
6. PERSPECTIVAS .............................................................................................................. 96
7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 97
8. APÊNDICES ................................................................................................................... 103

1. INTRODUÇÃO

A busca de sistemas alternativos de produção eficiente e sustentável de todo tipo de
produtos, obedece principalmente o surgimento de duas problemáticas de ordem mundial de grande
incidência: o crescimento populacional e a deterioração do meio ambiente (com a consequente
limitação da disponibilidade de recursos naturais). Com um crescimento populacional de 58% em
meio século, passando de 3.065 milhões de pessoas em 1960 a 7.347 milhões em 2015 (Banco
Mundial, 2017), é necessário a otimização de processos industriais com o propósito de conseguir
uma produção equitativa, limpa e eficiente de alimentos. Estes processos de produção, tanto dos
alimentos, quanto dos insumos empregados, devem utilizar apropriadamente os recursos naturais
sem afetar o meio ambiente, reduzindo a geração de resíduos e dispondo dos gerados
adequadamente. Neste tipo de desafio, o compromisso e investimento da empresa pública e privada,
a intervenção das comunidades, a geração de políticas eficazes, a geração de novos conhecimentos
mediante a pesquisa e a criação, adaptação e implementação de tecnologias eficientes, serão
importantes para disponibilizar alternativas de produção que permitam suprir as necessidades de
cada vez mais pessoas no planeta Terra mantendo o equilíbrio com a natureza.
Com uma maior demanda por alimentos de todo tipo, as indústrias que fornecem insumos
para seu processamento ou fabricação, experimentam em consequência, a mesma dinâmica de
crescimento. Como exemplo, levando em conta que uma das principais fontes de proteína (existe
proteína de origem animal e vegetal) na alimentação humana é a carne de origem bovina (22 g de
proteína para 100 g de carne, segundo Latham (2002), indústrias dedicadas à fabricação de
substâncias para a conservação de ensilagem e produtos concentrados (que por sua vez são fonte de
alimento para o gado) são cada vez mais solicitadas no mercado.
Dentre os compostos usados como conservantes, os ácidos orgânicos representam grande
porção da demanda atual. Os ácidos mais utilizados neste segmento são o fórmico, o butírico, o
acético, o sórbico, o benzóico e o propiônico (BASF, 2013). O ácido propiônico (AP), objeto desde
estudo, tem mostrado um crescimento das exportações de 71% em valor (dólares) e de 63% em
quantidade (toneladas), no período de 2001 – 2015 (ITC, 2017).
Alguns ácidos orgânicos são produzidos exclusivamente por síntese química usando como
matéria prima o petróleo, gerando certa preocupação pela incerteza sobre a disponibilidade futura
deste recurso não renovável. Sendo assim, a procura de novas rotas de produção baseando-se em
matérias primas alternativas e com implicações ambientais de menor relevância, têm sido
intensificada ao longo dos últimos anos. Embora os processos de síntese química sejam criticados
por ocasionar poluição ambiental, no caso da produção de AP e outros compostos para os quais
estão sendo desenvolvidas as técnicas de produção biotecnológica, por enquanto, a rota original,

continua sendo a melhor alternativa. No estudo de Tufvesson et al., (2013), efetuado por simulação
de computador, no qual foi realizada uma Avaliação de Ciclo de Vida (ACV) sobre a produção de
AP a partir de matérias primas renováveis e através de processos de produção por via fermentativa
em grande escala, são apresentados resultados conclusivos. Assumindo concentrações de pelo
menos 50 g·L-1 ao final da fermentação, a produção biológica de AP por um lado, geraria custos de
produção estimados em 2,5 €·Kg-1 enquanto que o custo de produção mediante síntese química está
entre 1-2 €·Kg-1. Tal fato é um desincentivo aos investimentos necessários para dar início a este
método de produção. Por outro lado, e tendo hipóteses estabelecidas para dito estudo, a produção
biológica do AP, daria origem a emissões de gases efeito estufa (expressos em equivalentes de CO2)
50% a mais do que as produzidas na rota de síntese química a partir de combustíveis fósseis, isto
devido principalmente ao alto consumo de energia e água durante o processo de downstream.
Apesar do processo de fermentação para produção de AP ter sido descrito desde 1923 (Boyaval,
1995), ainda são necessários mais estudos que permitam implementar a produção de maneira
sustentável e economicamente viável.
Para ilustrar melhor a relevância deste tema, uma revisão bibliográfica foi conduzida na
base de dados de revistas científicas indexadas no Science Direct (https://www.sciencedirect.com/),
usando a seguinte combinação de palavras chave no campo “all fields”: “fermentation”, “propionic
acid”, “production” e “biotechnology”. A busca resultou em 2005 artigos; destes, 440 artigos foram
publicados antes de 1997, e os restantes 1.565 no período de 1998 até 2017 (primeiros três meses).
Como é apresentado na Figura 1, durante os últimos 10 anos os artigos publicados sobre o tópico,
ocorreu um crescimento de 85%, passando de 30 artigos em 2006 para 203 em 2016; e durante os
primeiros três meses de 2017, já foram publicados 112 artigos relacionados com este tema. Espera-
se que em um futuro próximo o conhecimento construído em torno do processo de produção, possa
ser implementado industrialmente para benefício das múltiplas áreas produtivas e econômicas que
estão relacionadas com este composto.
FIGURA 1. PESQUISA RELACIONADA COM A PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE AP

FONTE: dados Science Direct. Ilustração: A autora (2017)

De acordo com publicações mais recentes, os principais desafios para pesquisas futuras
estão relacionados com i) aumento da produtividade e dos rendimentos, através da implementação
de sistemas de fermentação que favoreçam o processo; ii) uso de matérias-primas com importante
conteúdo de fontes de carbono, fontes de nitrogênio e micronutrientes para promover o
metabolismo dos microrganismos utilizados no processo e iii) melhoramento genético dos
microrganismos que venham a apresentar características desejáveis para a produção do AP.
Dentre as matérias primas alternativas para o desenvolvimento de processos de produção,
encontram-se aquelas de natureza lignocelulósica. Estes materiais são considerados resíduos sem
valor, provenientes de outros processos de produção agroindustrial, que na maioria dos casos gera
problemas fitossanitários e de salubridade dentro das plantações ou são inconvenientes devido ao
volume que podem chegar a ocupar e aos possíveis custos de descarte. O uso de material
lignocelulósico (cana-de-açúcar, palma, farelo de soja, etc.) em processos biotecnológicos têm sido
explorado há várias décadas e tem mostrado resultados relevantes para diferentes indústrias.
Utilizando o material lignocelulósico como matéria prima é possível, por um lado reduzir os custos
de produção, e por outro, dar continuidade à implementação do conceito de biorefinarias, que cada
vez está tomando mais força no âmbito industrial e agroindustrial.
Um material lignocelulósico pouco explorado e significativamente problemático dentro
das plantações, é a casca do fruto do cacau (Theobroma cacao L.). Neste fruto, a semente
corresponde só a 15-20% da biomassa total do fruto, deixando 75-80% (Prabhakaran, 2010) de
material considerado até pouco tempo, como resíduo. O principal produto do cultivo do cacau, o
chocolate, provém da fermentação das sementes. Em 2016, as exportações de chocolate atingiram
um valor $25.700 milhões de dólares equivalentes a mais de 5,4 milhões de toneladas do produto
(ITC, 2017). Em países como Suíça, o consumo per capita chegou a ser de 8,8 Kg em 2016,
enquanto que na América Latina, durante o mesmo período, Chile ocupou o primeiro lugar em
consumo per capita com um total de 2,1 Kg (Worldatlas, 2017).
Neste estudo “Valorização de cascas do fruto de cacau (Theobroma cacao L.): obtenção
de hidrolisado do pré-tratamento químico e enzimático para a produção de ácido propiônico” faz
parte do projeto Rede Integrada de Programas de Pós-graduação em Biotecnologia para o
Desenvolvimento Científico, Tecnológico, de Inovação e Formação de Recursos na Cadeia
Produtiva do Cacau – BIOCAU com apoio financeiro da CAPES-PROCAD 2013, e do subprojeto 2
intitulado “Aproveitamento da casca de cacau”.
Neste estudo, e de maneira inédita, pretende-se explorar o aproveitamento dos compostos
da casca do fruto do cacau para a produção de biomoléculas de interesse agroindustrial, por meio da
aplicação de técnicas biotecnológicas. A obtenção do AP foi desenvolvida usando o microrganismo

Propionibacterium jensenii (DSM 20274) para a fermentação com o uso de um meio de produção
cujo principal componente é o hidrolisado produzido mediante a hidrólise química e enzimática da
casca do cacau, o glicerol e o extrato de levedura.
O objetivo deste trabalho é valorizar as cascas de cacau por meio do pré-tratamento
químico e enzimático e produzir AP, considerado como uma biomolécula de médio a alto valor
agregado. Para alcançar este alvo, foram propostos os seguintes objetivos específicos: Caracterizar
físico-químicamente a casca do fruto de cacau procedente do estado do Pará; Determinar as
melhores condições de hidrólise química e enzimática das cascas de cacau; Analisar o material pré-
tratado e in natura (MEV, FTIR, DRX, TG e outras técnicas); Selecionar cepas produtoras de AP
disponíveis no banco de cepas do PPGEBB da UFPR; Estudar a produção de AP a partir de
hidrolisado químico e enzimático de cascas de cacau.
Finalmente, com este trabalho aspira-se contribuir com os conhecimentos relacionados às
alternativas de produção e avanços no uso de um dos resíduos agroindustriais de relevância no
Brasil, a casca do cacau, para a geração de biomoléculas de grande importância econômica e
industrial ao nível mundial.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Theobroma cacau L.: produtos e resíduos
2.1.1. Descrição da planta
Theobroma cacao L.

(Figura 2) é uma árvore perene
que atinge alturas entre 8 e 15 m e
cujo habitat natural está
localizado na bacia amazônica e
outras áreas tropicais de América
Central e do Sul. Também é
cultivado em áreas tropicais do
continente africano. Atinge a fase
adulta aos 10 anos, podendo
chegar a 50 anos de idade. É uma
árvore sensível a variações
FONTE: SEP (2013)
climáticas e adaptada a solos
profundos e férteis, com incidência de chuvas regulares (Ceplac, 2012). O fruto desta árvore é o
cacau. Existem três variedades deste fruto: Forastero, que fornece aproximadamente 95% da
demanda mundial de cacau; Criollo que é uma variedade originalmente cultivada no Norte, Centro e
Sul da América e, finalmente a variedade Trinitário que é produto da hibridização das variedades
anteriores e junto com a produção da variedade Criollo, representando o 5% restante da produção
mundial de amêndoas. Dependendo da variedade, os frutos apresentam uma pigmentação
característica. Por exemplo, os frutos da variedade Criollo apresentam variação de cor entre
vermelhos escuro e cor vinho, os da variedade Forasteiro normalmente são verdes ou amarelos e os
da variedade Trinitário, apresentam qualquer uma destas cores, antes mencionadas (Lima et al,
2011).
2.1.2. Produção e mercado mundial de cacau
O fruto de cacau tem relevância devido ao uso comercial que é atribuído às sementes,
principalmente na indústria de alimentos. Após diferentes etapas de processamento como é
apresentado na Figura 3, são obtidos a manteiga e pasta de cacau, o cacau em pó e o chocolate. O

cultivo do cacau também é importante para muitas das regiões produtoras em diferentes países,
devido a que a lavoura cacaueira encontra-se baseada em sistemas de agricultura familiar,
sustentabilidade e práticas agrícolas com baixas emissões de gases de efeito estufa (Sebrae, 2014).
FIGURA 3. CADEIA DE VALOR DO CACAU

FONTE: A autora (2017)
Segundo os dados publicados pela Organização Internacional do Cacau (ICCO), na safra

2014/2015 a produção de sementes de cacau foi estimada em 4 milhões de toneladas, sendo África
o maior produtor mundial com 73% da participação da produção, seguido pela América com 18%
da participação e, finalmente, Ásia e Oceania com um percentual estimado em 9% (Figura 4). Na
América, os principais produtores são Equador e Brasil.
FIGURA 4. PRODUÇÃO MUNDIAL DE AMÊNDOAS DE CACAU 2014/2015

FONTE: dados ICCO. Ilustração: A autora (2017)

Nos anos 70 o Brasil era o segundo maior produtor mundial de cacau, com uma produção
de cerca de 350 mil toneladas/ano. Os produtores de cacau foram gravemente atingidos pelas perdas
ocasionadas com a doença causada pelo fungo conhecido popularmente como vassoura da bruxa
(Moniliophtora perniciosa), e a produção do país diminuiu consideravelmente, passando a ser
importador da amêndoa. Atualmente, e graças aos estudos e pesquisas desenvolvidos sobre o
controle fitossanitário do fungo, à assessoria técnica para o manejo adequado da lavoura, bem como
à expansão do cacau na Amazônia, o Brasil tem se recuperado (Sebrae, 2014).
Segundo os dados publicados pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE,
2016), em 2016 a produção nacional atingiu um total de 215 mil toneladas de amêndoas de cacau,
com rendimento de 304 Kg·ha-1. Entretanto, em 2015 a produção tinha sido calculada em 273 mil
toneladas com um rendimento de 403 Kg·ha-1, apresentando para a última safra uma diminuição de
33% em rendimento (Figura 5). Esta importante queda, está relacionada ao comportamento das
principais variáveis climáticas que afetam a lavoura cacaueira nas principais zonas de produção do
país (Bahia e Pará), nas quais os níveis de pluviosidade, temperaturas e umidade apresentaram uma
influência importante sobre os rendimentos do cultivo do cacau, segundo os diferentes relatórios
publicados em 2016 e 2017 pela Ceplac (Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira).
FIGURA 5. HISTÓRICO DA CULTURA DE CACAU NO BRASIL: PRODUÇÃO VS.

RENDIMENTO

FONTE: dados IBGE. Ilustração: A autora (2017)
2.1.3. Comércio internacional de produtos de cacau
Estimativas do Centro de Comércio Internacional (ITC), para o ano de 2015 relatam que
$47,5 milhões de dólares foram contabilizados para as exportações mundiais dos produtos das
sementes do cacau, e classificados nas seguintes posições tarifárias: sementes, cascas, pasta de

cacau, manteiga, cacau em pó e chocolate. O chocolate é o principal produto comercializado, com

54,3% da participação em valor exportado em nível mundial (Figura 6). De forma geral, os
principais exportadores mundiais dos derivados da semente do cacau são Alemanha com 12% e
Costa do Marfim e Holanda com 11% cada um.
FIGURA 6. EXPORTAÇÕES DOS PRODUTOS DE CACAU E PRINCIPAIS PAÍSES

EXPORTADORES EM 2015
FONTE: dados ITC. Ilustração: A autora (2017)
2.1.4. Geração de resíduos

Uma vez que a amêndoa do cacau é extraída para iniciar o processo de fermentação, o
material que a acompanha (Figura 7): casca externa do fruto (epicarpo), a casca que cobre a
amêndoa (endosperma) e a mucilagem externa da mesma (mesocarpo), são descartados e
considerados na maioria dos casos como resíduo com pouco ou nenhum valor comercial.
Do fruto do cacau e segundo o reportado por Prabhakaran Nair, (2010), entre 70% e 75%
da massa seca do fruto corresponde à casca externa ou epicarpo. Conforme o mesmo autor relata, os
frutos de cacau têm forma ovalada, com tamanhos que variam segundo a variedade, e que podem
estar entre 15-30 cm de comprimento, entre 8–10 cm de largura e a espessura da casca do fruto
entre 0,1 e 0,15 cm. As cores também dependem da variedade, e se observam colorações verde

durante o crescimento e no processo de amadurecimento os frutos mostram cores amarelo,

vermelho ou cor de vinho.
FIGURA 7. FRUTO DO CACAU E RESÍDUOS

FONTE: A autora (2017).
Atualmente, as cascas de cacau representam para algumas plantações, um problema

fitossanitário dadas as grandes quantidades produzidas e a falta de mecanismos de disposição do
resíduo, que até agora são implementados em algumas fazendas como material de queima para
combustível ou como material de compostagem. Tais processos não representam esforços e custo
dentro da área de produção; ou em outros casos, como por exemplo acontece em Gana, a casca
torna-se matéria prima na fabricação de ração animal (Afoakawa, 2010).
Surpreendentemente, a casca do fruto do cacau, é um produto que atualmente está sendo
comercializado mundialmente por mais de 40 países. Em 2015, o ITC reportou que foram
exportadas 214 mil toneladas de casca de cacau, sendo os principais exportadores Costa de Marfim,
Holanda e Alemanha com participações de 45%, 18% e 14% respectivamente, agrupando mais de
76% da participação do mercado mundial para este produto. Da mesma forma, os principais
importadores neste período foram Holanda com 18% da participação e França e Bélgica com
participação de 14% cada um, agrupando assim quase 50% do total mundial importado em
quantidade. O valor atingido para as exportações de casca de cacau em 2015 foram de $277 milhões
de dólares. Os dados, tanto de produção quanto de comércio internacional, permitem projetar que
devido à grande disponibilidade da casca do fruto de cacau, é possível e necessário um
aproveitamento eficiente e comercialmente atrativo deste resíduo agroindustrial. Diante deste
cenário, o presente projeto visa aproveitar os compostos constitutivos da casca do cacau para a
produção de biomoléculas mediante a implementação de técnicas e ferramentas biotecnológicas. É
importante ressaltar que até a presente data, não foram encontradas referências que utilizassem este
material para tal propósito. Atualmente existem poucos estudos sobre as características físico-
químicas da casca de cacau. Os trabalhos que proporcionam resultados a este respeito, apresentam-
se na Tabela 1.

TABELA 1. REFERÊNCIAS DE CARACTERIZAÇÃO FÍSICO QUÍMICA DA CASCA DE CACAU

Componente Valores Referências
4,21 ± 0,16* Martínez et al., 2012
Proteína 8,6 ± 0,09* Vriesmann et al., 2011
10,74* Ofori-Boateng e Lee, 2013
6,7 ± 0,02* Vriesmann et al., 2011
8,42 ± 0,10* Martínez et al., 2012
Cinzas 9,1* Mansur et al., 2014
13,5*** Syamsiro, et al. 2012
Gorduras 2,34 ± 0,08* Martínez et al., 2012
29,04 ± 0,18* Martínez et al., 2012
Carboidratos
32,3 ± 1,8* Vriesmann et al., 2011
6,53 ± 0,13** Martínez et al., 2012
8,5 ± 0,06** Vriesmann, et al, 2011
Umidade
10,5*** Ofori-Boateng e Lee, 2013
16,1*** Syamsiro, et al. 2012
35,0* Mansur et al., 2014
Celulose
Hemicelulose
Lignina 21,4 ± 0,6* Vriesmann et al., 2011
Pectina 6,1* Mansur et al., 2014
Lipídeos 1,5 ± 0,13* Vriesmann et al., 2011
Açúcares redutores 10,4 ± 0,7* Vriesmann et al., 2011
Fibra dietética total 36,6 ± 0,01* Vriesmann et al., 2011
Teobromina 0,34* Ofori-Boateng e Lee, 2013
Minerais (mg/100 g d.m.)
Ca 254,0 ± 11,31
Fe 5,8 ± 0,11
Vriesmann et al., 2011
K 2768,0±51,97
Mg 110,9 ± 0,01
Na 10,5 ± 0,60
Minerais (mg·Kg-1 d.m.)
Cu 6,18 ± 0,02
Mn 35,72 ± 0,03 Vriesmann et al., 2011
Se 0,01 ± 0,006
Zn 39,74 ± 0,06
d.m. = matéria seca (* g·100 g-1 d.m; ** g·100 g-1; ***massa%)

O objetivo do trabalho apresentado por Martínez et al., (2012), foi determinar as

propriedades químicas, tecnológicas e in vitro da casca do fruto, da casca e mucilagem das sementes
do cacau, para estabelecer o potencial de uso como fonte de fibra dietética para enriquecer
alimentos. Nesse trabalho apresentam-se resultados das diferentes frações do fruto do cacau
(“complejo nacional x trinitário”) cultivado nas zonas de Taura e Cone, localizadas no Equador. Já,
Ofori-Boateng e Lee (2013), utilizam a casca para mostrar seu potencial como base sólida catalítica
para a transesterificação de óleo de soja em biodiesel. A matéria prima utilizada por eles é
proveniente de Gana. Por outro lado, o trabalho publicado por Mansur et al., (2014), pretende
viabilizar o uso da casca de cacau proveniente do ocidente da Indonésia, como material base para a
produção de químicos, uma vez que passa por um processo de pirólise. O objetivo de Vriesmann et
al., (2011) foi pesquisar sobre a utilidade da casca de cacau (proveniente da Bahia, Brasil) como
matéria prima para a obtenção de pectinas. Porém, os estudos dedicados à descrição e aplicação da
casca de cacau, mesmo que poucos, trazem informações de grande utilidade para o planejamento de
novas pesquisas.
2.1.5. Tipos de pré-tratamento para material lignocelulósico
A casca do fruto de cacau pode ser considerada como biomassa agrícola residual primária.
É biomassa de natureza lignocelulósica, constituída por três frações principalmente: celulose,
hemicelulose e lignina, além da presença de compostos como material inorgânico (cinzas),
proteínas entre outros, em menores quantidades. Esta composição, permite considerar o resíduo
como matéria prima de baixo custo para outros processos de obtenção de compostos que
comercialmente possam ser considerados de maior valor agregado. A lignina é um polímero
ramificado conformado principalmente por compostos aromáticos. A hemicelulose é um
copolímero de pentoses e hexoses. Finalmente, a celulose é um polímero de glucose que pode ser
transformada para o posterior uso dos monómeros em fermentações para a geração de diversos
compostos de valor agregado (Brar et al., 2014).
Com o intuito de aproveitar o conteúdo de compostos químicos da casca do cacau, a
separação das frações do material lignocelulósico é uma etapa transcendental para a transformação
deste resíduo, considerado neste estudo como matéria prima. Mediante a implementação de
diferentes técnicas de pré-tratamento (físico, químico, biológico e misturas entre estes) se faz
possível a obtenção dos componentes de interesse.
Os tipos de pré-tratamentos implementados em materiais lignocelulósicos são
apresentados na Figura 8. Estes tratamentos podem ser classificados como físicos, químicos, físico-
químicos e biológicos. Cada uma destas estratégias de pré-tratamento têm uma subclassificação que

varia nas técnicas, compostos e microrganismos utilizados para a obtenção das frações requeridas
provenientes do material lignocelulósico.
FIGURA 8. PRÉ-TRATAMENTOS PARA A SACARIFICAÇÃO DO MATERIAL
LIGNOCELULÓSICO

Para o presente estudo, o levantamento bibliográfico realizou-se com base em pesquisas
feitas para a produção de bioetanol a partir do material lignocelulósico, com o objetivo de comparar
os tipos de pré-tratamento e os rendimentos obtidos.
Esta revisão permitiu determinar que partindo de material lignocelulósico (como é a casca
de cacau) considerado como resíduo agroindustrial, os melhores rendimentos apresentavam-se
quando se aplicava sucessivamente um pré-tratamento mecânico e químico com reativos de
natureza alcalina, tais como o hidróxido de sódio, cálcio e potássio ou com amônio. No Quadro 1,
são apresentados os rendimento da sacarificação de material lignocelulósico de origem diversa,
efetuados com diferentes compostos químicos de natureza alcalina, em variadas concentrações e
tempos de processamento. Estes rendimentos podem estar na faixa de 30% - 92%.
Como exemplo da aplicação deste tipo de tratamento em material lignocelulósico, Kim et

al., (2015), apresentam condições de reação para o pré-tratamento alcalino, nas quais os intervalos
de concentração do reagente varia entre 0,5 e 10% em temperaturas de processamento entre 60 e
180 ˚C, considerando relações entre 10 e 30% (m/v). Nestas faixas de processamento, eles reportam

50% de dissolução da hemicelulose, entre 60 e 80% de deslignificação e taxas importantes de

reação, mas com dificuldades na recuperação do NaOH.
QUADRO 1. ESTUDOS DE PRÉ-TRATAMENTOS ALCALINOS DE MATERIAL

LIGNOCELULÓSICO

Da mesma forma, McIntosh e Vancov (2010), reportam condições de pré-tratamento com

diferentes compostos alcalinos incluído o NaOH, em concentrações de 2% à temperatura de 60 ˚C e
entre 90 minutos de processamento, obtendo um incremento de 4,3 vezes de açúcares totais.
Os artigos revisados indicam que tratamentos com reagentes alcalinos, são fáceis de
efetuar e seguros para quem os realiza; da mesma forma, os compostos alcalinos têm um custo
menor no mercado comparado com os reagentes ácidos, além de serem algumas vezes menos
corrosivos. Em conclusão, a hidrólise alcalina para o pré-tratamento da casca de cacau (com
posterior sacarificação enzimática) e seguido aproveitamento do hidrolisado na produção de
biomoléculas de interesse comercial, é uma opção viável e por isso implementada neste estudo.
2.2. Glicerol
O glicerol (também nomeado de glicerina) é um subproduto indesejável do processamento

do biodiesel. Para cada 10 kg de biodiesel produzido a partir de óleo vegetal, aproximadamente é
gerado 1 kg deste subproduto (Knothe et al., 2015). Em 2015 o comércio internacional do glicerol
atingiu um total de 25.814 milhões de dólares e os principais países exportadores são Arábia
Saudita, Estados Unidos e Singapura (ITC, 2017). Em 2015, o Brasil gerou 347 mil m3 de glicerol a
partir da produção de biodiesel, segundo o informe publicado pela Agencia Nacional do Petróleo
(ANP, 2016). Como glicerina bruta, tem sido comercializado com um valor de 220 R$/tonelada em

2017, segundo os indicadores de preços reportado pelo Centro de Referência da Cadeia de Produção
de Biocombustíveis para a Agricultura Familiar do Brasil.
A expansão do mercado de biodiesel conduziu a um incremento na quantidade de glicerol
gerado e disponível no mercado. Como exemplo disso, no Brasil durante o período de 2006 - 2015 a
produção de glicerol teve um incremento de 97,3%, coincidindo com o aumento da produção
nacional de biodiesel, que no mesmo período teve uma percentagem de variação de 98,2%. Como
subproduto, o glicerol precisa ser utilizado e aproveitado da melhor maneira possível, pois sua
utilização em outros processos é mais desejável ambiental e economicamente do que descartá-lo.
Este composto é muito versátil e amplamente utilizado em nível industrial, devido às suas
características físico-químicas, fácil manuseio e alta compatibilidade com muitas outras substâncias,
pois é miscível em água e álcool. Não é tóxico para a saúde humana nem para o meio ambiente, não
é irritante, é viscoso, incolor, inodoro, higroscópico e com um alto ponto de ebulição (290°C).
Quimicamente pode ser classificado como um álcool tri-hidratado e é obtido por saponificação,
hidrólise ou transesterificação de gorduras e óleos (SDA, 1990).
Segundo a National Biodiesel Board (2013), dentre as indústrias que utilizam o glicerol
encontram-se: as de bebidas e alimentos (como produto intermediário; para umedecer, adoçar ou
preservar os produtos); as de cosméticos e artigos de limpeza pessoal (usado como agente
umectante e emoliente); as de fabricação de papel e manufatura de tintas (para amaciar e reduzir o
encolhimento durante a fabricação do papel); a têxtil (usado para dimensionar e suavizar fios e
tecidos e para lubrificar muitos tipos de fibras em operações de fiação, tricô e tecelagem); as de
fabricação de dinamite; as de produção de tabaco (utilizado como umectante, amaciante e para
prevenir a quebra e desintegração durante o processamento); e as indústrias farmacêuticas (como
composto de cápsulas e recobrimentos, como emoliente e como veículo de antibióticos e
antissépticos).
Pesquisas científicas em desenvolvimento tentam ampliar as aplicações benéficas
alternativas do glicerol. O campo da biotecnologia por sua vez, tem achado aplicações para o uso
deste composto como fonte de carbono nos processos de fermentação para a produção de compostos
de relevância econômica como o etanol e o hidrogênio (Peiter et al., 2016).
Dentre os compostos produzidos utilizando o glicerol, encontra-se também o AP (Zhuge
et al., 2014). Uma das características mais importantes para considerar sua aplicação na produção
de biomoléculas através do uso de microrganismos e pelo qual foi considerado como substrato neste
estudo, é seu potencial de redução químico (k=4,7) que comparado com o grau de redução da
glucose ou da xilose (k=4) por exemplo, promove a produção de metabólitos mais reduzidos (Zhang
et al., 2015). Isto provoca uma fermentação com menor geração de subprodutos, tais como o ácido

acético (Clomburg e Gonzalez., 2013), o que é conhecido como fermentação homo-propiônica

(Dishisha, et al., 2012). Desta forma e segundo Barbirato et al., (1997), que foram uns dos
primeiros em utilizar este substrato para produção de compostos por meio de processos
fermentativos, o glicerol pode ser considerado como um melhor substrato do que as fontes de
carbono tradicionais até a data já utilizados para a produção de AP.
2.3. Ácidos orgânicos
Os ácidos orgânicos são um grupo de compostos, cuja principal característica química é

possuir na sua estrutura, um grupo funcional carboxila (COOH-), que proporciona a respectiva
acidez (Theron e Lues, 2010). Os ácidos de natureza orgânica, são produtos finais ou intermediários
do metabolismo biosintético celular primário (Schaechter, 2009). Mesmo que a produção da maioria
de ácidos orgânicos seja realizada industrialmente tanto por rotas sintéticas químicas quanto por
síntese microbiológica, nos últimos anos os processos fermentativos têm ganhado preferência no
mercado. O processo fermentativo é uma etapa fundamental na produção dos ácidos orgânicos e
tanto a fermentação submersa quanto em estado sólido, têm sido aplicada industrialmente. Esta
última apresenta especialmente a vantagem de utilizar substratos alternativos, de baixos custos e
disponíveis em grandes quantidades, sendo os resíduos agrícolas os ideais para o estabelecimento de
processos em escala industrial (Pandey et al., 2008).
Dentre os ácidos orgânicos de maior relevância encontram-se os ácidos acético, ascórbico,

benzóico, cítrico, fumárico, lático, málico, propiônico, succínico, dentre outros (Theron e Lues,
2010). A aplicação de ácidos orgânicos e seus derivados, engloba uma grande quantidade de
indústrias incluído o uso como moléculas intermediárias na produção de polímeros, e na indústria
alimentícia, pois são empregados como acidulantes e conservantes, devido às suas propriedades
antimicrobianas e bacteriostáticas (Davidson et al., 2005). Devido a esta mesma caraterística,
chegam a ser importantes na indústria de fabricação de ração animal, conseguindo, além de proteger
os produtos do ataque de microrganismos indesejáveis, preservar o valor nutricional da ração,
garantindo a saúde intestinal de suínos e aves, assegurando melhores rendimentos na criação das
espécies obtendo finalmente uma maior rentabilidade. Na indústria de elaboração de alimentação
animal os principais ácidos utilizados são os ácidos propiônico, fumárico, fórmico e láctico
(Feedinfo, 2014).

2.3.1. Ácido propiônico (AP)

O ácido propiônico – AP (ácido propanóico C3H6O2) é um ácido mono-carboxílico fraco,

de aparência líquida e transparente, de odor rançoso, sem cor e corrosivo. As principais
propriedades físicas e químicas deste composto são apresentadas no Quadro 2.
QUADRO 2. PROPRIEDADES FÍSICO- QUÍMICAS DO AP

Acidez (pKa): 4,87
Viscosidade: 1,09 cP
Massa molecular: 74,08 g/mol
Ponto de ebulição: 141°C
Ponto de fusão: -21°C
Densidade relativa: 0,99 g/cm3 (20°C)
Miscível em água, etanol,
Solubilidade:
éter e clorofórmio.
Pressão de vapor, 20
2,4 mmHg
°C:
Ponto de fulgor: 54°C
Classificação: Ácido carboxílico
Formula molecular: C3H6O2 / CH3CH2COOH
FONTE: Adaptado de DOW (2015).
2.3.1.1. Contexto histórico
Existem relatos sobre o AP desde 1844, quando Johann Gottlieb identificou pela primeira
vez sua produção por via bacteriana a partir da degradação de açúcares (Schaechter, 2009).
Posteriormente, outros químicos tentaram sua produção por síntese química, sem resultados
satisfatórios, pois não conseguiam obter a mesma substância. Três anos depois o químico Jean-
Baptiste Dumas identificou que todas as tentativas de produção daquele composto, tinham
produzido uma mesma substância que finalmente foi nomeada como AP.
É reportado também que, em 1941, Walter Reppe estabeleceu a síntese do AP a partir de

etileno o que permitiu que a produção industrial começasse a ser desenvolvida rapidamente. Já por
volta de 1960, a multinacional BASF ativou a primeira planta de manufatura de AP em grande
escala. Atualmente essa empresa é uma das principais empresas produtoras em nível mundial e,
desde 2008 conta com uma capacidade atual de produção anual de 110.000 toneladas (BASF,
2008).

2.3.1.2. Produção e mercado
As exportações de AP durante 2015 atingiram um total de 309 mil toneladas

correspondentes a um total de 406 milhões de dólares, segundo as informações de comércio
internacional publicadas em 2017 (ITC, 2017). Os principais países exportadores deste produto são
Estados Unidos, Alemanha, Bélgica, Holanda e Suécia, os quais agrupam 88% em valor, das
exportações mundiais, conforme se vê na Figura 9. A taxa de crescimento anual entre 2011 e 2015
foi de 2% em valor e de 6% em quantidade; enquanto que, para o período 2014-2015 apresentou um
decréscimo de 10% em seu valor.
FIGURA 9. COMÉRCIO INTERNACIONAL DO AP, SUAS SAIS E SEUS ÉSTERES.

FONTE: dados ITC. Ilustração: A autora (2017)
Por outro lado, os principais países importadores do produto representados em valor

(USD$) são Bélgica (12,3%), Holanda (8,2%), Espanha (7,1%), Estados Unidos (5,5%) e Brasil
(5,2%). Em 2015, as importações de AP do Brasil representaram 5,2% do total mundial em valor
com USD$ 22,287 milhões e 4,53% do total mundial em quantidade com 13,913 toneladas. O
Brasil tem apresentado uma taxa de crescimento anual em valor entre 2011 – 2015, igual a 12%.
Brasil não produz atualmente este composto, por isso suas exportações são desprezíveis (ITC,
2017).
Empresas como BASF, Dow, Eastman Chemical Company, Perstorp, A.M. Food
Chemicals, Biomin Holdings Gmbh, Krishna Chemicals and Macco Organiques são reconhecidas
por serem as principais produtoras e comercializadoras do AP em nível mundial (Feedinfo, 2014).

2.3.1.3. Biossíntese do ácido propiônico
Desde o descobrimento dessa substância em 1844, a produção de AP foi direcionada

totalmente para síntese química. As principais vias de síntese química utilizadas industrialmente são
o processo de Reppe (partindo de etileno, monóxido de carbono e vapor); o processo de Larson
(partindo de etanol e monóxido de carbono, usando trifluoreto de boro como catalisador) e o
processo de Fischer-Tropsch, por oxidação de propionaldeído como subproduto na síntese de
combustível (Furia, 1973).
Apesar de atualmente a totalidade do AP ser produzido industrialmente a partir de síntese
química, as pesquisas relacionadas com a produção por meio de processos fermentativos, cresceu
significativamente durante os últimos anos. Como foi descrito previamente na introdução, a
preocupação pela dependência do petróleo motiva a desenvolver novas tecnologias para
implementar de maneira eficiente e competitiva bioprocessos alternativos que proporcionem
soluções ambientalmente favoráveis e sustentáveis.
Dentre as principais desvantagens que apresenta a produção industrial do AP por meio de

fermentação podem ser mencionadas: i) as baixas produtividades quando implementado o sistema
de fermentação em batelada (Parizzi et al., 2012): < 1 Kg·m3·h-1.; ii) as baixas concentrações: <50
kg·m-3; iii) a inibição dos microrganismos ocasionada pelo produto (Zhu et al., 2010); iv) a geração
de outros produtos em concentrações consideráveis durante a fermentação (ácido acético, succínico,
lático, pirúvico, málico, fumárico, isovalérico e fórmico, propanol e CO2) e finalmente v) é um
processo com alta demanda de energia para os processos de downstream (Rodríguez et al., 2014) o
que incrementa significativamente os custos de produção. A produção do propionato apresenta a
seguinte estequiometria de acordo com a rota da glicólise e o ciclo de Wood-Werkman (Rodríguez
et al., 2014):
1,5 Glucose + 6 ADP + 6 Pi Acetato + 2 Propionato + CO2 + 6 ATP + 2 H2O
Cabe citar que entre dos rendimentos obtidos nas pesquisas mais recentes, são reportados
valores entre 0,59 e 0,72 mol de AP por mol de glicerol, utilizando diferentes biorreatores com
células imobilizadas e células livres (Dishisha et al, 2012). Igualmente, variando as concentrações
de fontes de carbono (glicerol) são obtidos rendimentos que estão entre 0,4 e 0,79 gramas de AP por
grama de glicerol para sistema em batelada e de 0,40 e 0,56 gramas de AP por grama de glicerol
quando implementado o sistema de batelada alimentada (Zhu et al., 2010).

2.3.1.4. Microrganismos usados para a produção de AP
A biossíntese do AP é efetuada por diferentes microrganismos pertencentes aos gêneros

Clostridium, Fusobacterium, Selenomona, Megasphaera e Propionibacterium, sendo este último
um dos mais referenciados nas pesquisas. Dentre as espécies mais citadas desde gênero encontram-
se as Propionibacterium freudenreichii, acidipropionici, jensenii e thoenii, conhecidas como “Dairy
propionic acid bacteria” (Turgay et al., 2016) e P. shermanii, as quais desenvolvem o processo em
condições de anaerobiose. Para este trabalho, o microrganismo considerado será do gênero
Propionibacterium, bactéria com forma bacilar, não ciliada, Gram positiva, não esporulada,
anaeróbia facultativa ou aerotolerante (Parizzi et al., 2012).
2.3.1.4.1. Metabolismo de produção e requerimentos nutricionais
Com relação à composição do meio de produção, as pesquisas desenvolvidas atualmente

apresentam como compostos básicos o extrato de levedura, tripticase/triptona, fosfato monobásico
de potássio, fosfato dibásico de potássio tanto para o pré-cultivo ou desenvolvimento do inóculo,
como para o meio de fermentação (Goswami e Srivastava, 2000). Cabe ressaltar que, o
escalonamento industrial do processo utilizando estes compostos como parte do meio de produção
tornariam sua implementação inviável, pois os custos destes representariam uma alta porcentagem
do custo total de produção.
Como fontes de carbono têm sido avaliados diferentes compostos, uma vez que os
microrganismos utilizados aceitam uma ampla variedade destes componentes que são
transformados através da rota metabólica de ácidos dicarboxílicos (Figura 10).
Dentre os compostos que se destacam encontram-se o glicerol, glucose, lactato, sucrose e

xilose, resíduos agroindustriais como os resíduos de polpa de madeira, glúten de milho, soro de
leite, hidrolisados de amido, águas residuais com sulfitos, material lignocelulósico, entre outros
(Parizzi et al., 2012). Todos são utilizados com o objetivo de diminuir os custos de produção, tendo
como principais características o custo baixo ou inexistente, a disponibilidade (em grandes
quantidades e de forma constante ao longo do ano), além de fornecer altos rendimentos e facilidade
de processamento. Como foi mencionado previamente, o glicerol tem sido considerado como uma
matéria prima promissora para ser amplamente utilizada como fonte de carbono na obtenção do AP
por via biológica (Zhang et al., 2015), pois apresenta todas as características necessárias e citadas
anteriormente.

FIGURA 10. VISÃO GERAL DO METABOLISMO DE Propionibacterium acidipropionici

FONTE: Parizzi et al., (2012)
Diferentes sistemas de fermentação têm sido testados na escala de bancada com o

propósito de estabelecer as condições e parâmetros ótimos de processo. Inúmeros trabalhos
referenciando a implementação de sistema em batelada, batelada alimentada, fermentação extrativa,
biorreatores de membranas, leito fibroso entre outros (Pandey et al., 2015), mostraram bons
resultados na produção do AP. No Quadro 3 são apresentados alguns exemplos dos estudos
realizados ao respeito.

QUADRO 3.ESTUDOS SOBRE A PRODUÇÃO DE AP MEDIANTE DIFERENTES SISTEMAS DE

FERMENTAÇÃO E USO DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO
2.3.1.5. Aplicações industriais

O ácido propiônico é utilizado atualmente como sustância pura, na forma do ânion
CH3CH2COO- ou na forma de sais ou ésteres conhecidos como propionatos, em diferentes
indústrias. Por um lado, as indústrias de alimentação humana e fabricação de ração animal utilizam
o AP devido às suas propriedades antimicrobianas e antifúngicas. Por outro lado, as indústrias de
plásticos, perfumaria e farmacêutica, utilizam este insumo como composto promotor de reações
dentro do processo de fabricação (Schaechter, 2009).
Na agricultura e na indústria de fabricação de ração animal, este composto apresenta os

benefícios listados na Figura 11.

FIGURA 11. APLICAÇÃO DO AP NA AGRICULTURA E NA FABRICAÇÃO DE RAÇÃO

ANIMAL
FONTE: Adaptado de BASF (2008)

3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Levantamento de informação – Revisão bibliográfica

Durante o desenvolvimento deste trabalho, realizou-se uma busca constante de referências
bibliográficas relacionadas com os procedimentos, técnicas, conceitos e temas que permitiram
encaminhar adequadamente a pesquisa. Dessa forma, em três momentos específicos, foi preciso
desenhar e efetuar a busca exaustiva de informação com o propósito de conhecer a fundo o estado
de arte dos seguintes temas: 1. Uso da casca de cacau; 2. Tratamentos de sacarificação para material
lignocelulósico e 3. Produção de ácido propiônico (AP).
A seguir, à título de exemplo, descreve-se a metodologia utilizada para a busca de
informações relacionadas com o tema de produção de AP. A revisão bibliográfica foi conduzida na
base de dados de revistas científicas indexadas Science Direct (https://www.sciencedirect.com/),
usando a seguinte combinação de palavras chave no campo “all fields”: “fermentation”, “propionic
acid”, “production” e “biotechnology”. A busca resultou em 2020 artigos; destes, 440 artigos foram
publicados antes de 1997, e os restantes 1580 no período de 1998 até 2017. Após a revisão descrita
previamente, foi realizada uma busca avançada aplicando filtros para depurar os resultados obtidos,
com o objetivo de selecionar apenas os artigos mais relevantes relacionados com o tema. A busca
foi refinada em duas etapas utilizando-se a opção “advanced search” e preenchendo os campos
“title” e “abstract-title-keywords”. Primeiramente, de acordo com o título da publicação (title),
selecionando as seguintes palavras: “{propionic acid}” usando o conector “AND” e “production”.
Em seguida, combinando os resultados com o conector “AND” seguido do campo “abstract-title-
keywords” preenchendo o espaço da seguinte maneira: [biotechnology OR Propionibacterium AND
fermentation AND NOT {vitamin B12} OR cheese OR yogurt]. Utilizando o conetor “AND NOT” os
termos que se encontram depois dele, são excluídos automaticamente da pesquisa. As palavras aqui
excluídas estão relacionadas com áreas de fabricação de alimentos ou farmacologia, as quais não
aportam maior informação para o trabalho atual.
Uma primeira triagem foi realizada com base na leitura do título de cada um dos artigos
que atenderam aos critérios de seleção estabelecidos previamente. Para os títulos que não
apresentaram nenhum dos termos da busca, foi feita uma verificação no resumo/conteúdo do
documento. Se efetivamente este não estava relacionado com o tema em questão, o artigo foi
excluído. Desta forma, o refinamento da pesquisa inicial mostrou como resultado final 14
documentos, cujo conteúdo foi considerado útil uma vez feita a leitura dos mesmos. Com os
documentos selecionados, elaborou-se uma base de dados com a informação chave contida nos
artigos (objetivos, métodos, resultados, etc.), o que facilitou o uso e eficaz e posterior consulta das

informações obtidas. Procedimentos similares foram efetuados para os outros temas relacionados
com esta pesquisa.
3.2. Recebimento e acondicionamento da casca de cacau
Os frutos de cacau empregados neste estudo foram recebidos da região de produção do

Pará, graças ao apoio das Universidades parceiras, Universidade Federal do Pará e Universidade
Federal da Bahia da rede de pesquisa do projeto CAPES PROCAD 2013 - Biocau. Uma vez que os
frutos do cacau chegam às instalações da UFPR, verificava-se visualmente o estado externo da
casca do fruto procurando algum tipo de lesão mecânica ou ocasionada pela ação de
microrganismos desenvolvida durante o transporte. Os frutos em bom estado físico, eram então
lavados cuidadosamente e abertos fazendo-se um corte transversal mediante uso de facas, para a
extração imediata das amêndoas.
Em seguida, aplicou-se a metodologia estabelecida na norma NREL/TP-510-42620
(Hames et al., 2008) de preparação das amostras para posterior análise de composição e uso do
material. Inicialmente a casca passou por um processo de secagem a 45 ± 3°C durante 48-72 horas.
Posteriormente o material seco foi triturado manualmente, para depois ser processado no moinho
elétrico de facas Marconi-MA 580/E. Peneirou-se o material com tamanho reduzido, para posterior
utilização da fração com tamanho de partícula entre 0,84 – 2,00 mm, remanescente na malha
USS/ASTM No. 20. Em todas as análises descritas a seguir, empregou-se o material com o tamanho
de partícula aqui descrito. A Figura 12 ilustra as etapas do processo até aqui descritas.
FIGURA 12. ETAPAS DE ACONDICIONAMENTO DA CASCA DO CACAU
3.3. Caracterização físico-química da casca de cacau

O primeiro e mais importante processo a ser realizado cada vez que foi recebido um lote
de matéria prima, foi a caracterização da mesma, com o intuito de predizer, dentre as etapas

posteriores do processo, possíveis alterações que influenciem os parâmetros de rendimento ou

produtividade ou até mesma a qualidade do produto final. A caracterização físico-química da
matéria prima, forneceu informações importantes sobre composição elementar, e permitiu
acondicionar adequadamente o material antes de iniciar o processo de produção. Particularmente, o
material de origem biológica apresenta maiores variações devido à grande quantidade de variáveis
que influenciam sua composição durante o desenvolvimento do organismo. No caso da planta do
cacau, dentre os fatores que influenciam a composição final da casca neste caso específico,
encontram-se a variedade da planta, a composição do solo, o manejo fitossanitário da lavoura, as
temperaturas e umidade apresentadas durante o desenvolvimento da planta, a quantidade de água
recebida durante o crescimento, os nutrientes fornecidos durante a cultura e o manuseio durante e
após da colheita. Por estes motivos, procurou-se realizar as análises básicas de caracterização da
casca com a chegada de cada lote de material novo.
Considerando a natureza sólida da biomassa a analisar, precisou-se da preparação de um
extrato aquoso para o desenvolvimento de alguns dos procedimentos próprios da caracterização que
serão descritos a continuação. Desta forma, para o acondicionamento da casca e posterior obtenção
deste extrato aquoso, adicionou-se 1 g de casca de cacau em 50 mL de água deionizada contidos em
um copo de Becker. Durante 10 minutos a mistura foi aquecida em banho-maria com agitação
magnética constante do conteúdo e depois, foi esfriada até atingir a temperatura ambiente.
Transferiu-se cuidadosamente o conteúdo do Becker para um balão volumétrico de 100 mL e
completou-se o volume com água deionizada. Finalmente, filtrou-se a amostra utilizando papel
filtro qualitativo e armazenou-se adequadamente em geladeira em temperatura de 4ºC .
3.3.1. Determinação de umidade, pH, atividade de água (aw), cinzas, açúcares,

íons e proteínas
Sólidos totais e umidade
Adotou-se a metodologia estabelecida na norma NREL/TP-510-42621 (Sluiter et al.,

2008), para a determinação dos sólidos totais e umidade na casca de cacau, como é descrito a
seguir. Em estufa a 105 ± 3ºC secou-se o papel filtro qualitativo durante 4 h; em seguida transferiu-
se para dessecador até atingir temperatura ambiente. Determinou-se a massa em balança analítica e
registrou-se o valor determinado em balança analítica. Sobre o papel filtro seco e tendo tarado a
balança, depositou-se 1,0 g de casca de cacau, e levou-se para estufa a 105 ± 3ºC durante 8 h. Em
seguida, transferiram-se as amostras para o dessecador até atingir temperatura ambiente. Na
sequência, determinou-se as massas das amostras e após atingirem massa constante, registrou-se o

valor determinado na balança analítica, e calcularam-se os valores correspondentes aos sólidos

totais e umidade, utilizando a Equação 1 e 2:

(Eq. 1)

(Eq. 2)

Determinação de pH
Determinou-se o pH do extrato aquoso da casca de cacau, mediante o uso do pHmetro

mPA210 da MS Tecnopon. Antes de cada medição, realizou-se a respectiva calibração do
equipamento com soluções padrão de pH 4 e 7.
Determinação da atividade de água (aw)
O parâmetro atividade de água (aw) é definido como a relação da pressão de vapor da água
contida no material à pressão de vapor da água à mesma temperatura:

(Eq. 3)

Onde PA = pressão de vapor da água no alimento; PAS = pressão de vapor da água pura na
mesma temperatura, que deve sempre ser especificada. A atividade de água tem índice que varia de
0 a 1, que quanto mais próximo de 1 for o valor obtido na análise, maior será o teor de água livre.
Definiu-se o valor de atividade de água por meio de método direto mediante o analisador AquaLab
CX-2, da Decagon Devices, Inc., utilizando 3 g de casca de cacau. Calibrou-se o equipamento antes
de submeter a teste as amostras, utilizando uma solução padrão de cloreto de lítio 8,5 M e cloreto de
sódio 6 M.
Determinação do teor de cinzas

Aplicou-se a metodologia estabelecida na norma NREL/TP-510-42622 (Sluiter et al.,
2008) para a determinação de cinzas na casca de cacau, como é descrito a seguir. Calcinaram-se os
cadinhos de porcelana (devidamente identificados) a ser utilizados para a análise, com o propósito
de eliminar possíveis interferentes, colocando-os na mufla à 575 ± 25°C por 4 horas. Transferiram-
se os cadinhos após esse tempo para o dessecador até atingir temperatura ambiente. Seguidamente,
determinou-se a massa inicial usando uma balança analítica. Os cadinhos com 1,0 g de amostra de
casca de cacau, previamente medida em balança analítica, foram levados para mufla a 575 ± 25°C
durante 6 horas, verificando-se que a amostra no final do processo, adquirisse coloração
branco/acinzentada. Após a calcinação das amostras, os cadinhos foram transferidos para o

dessecador até alcançar temperatura ambiente. Finalmente foi determinado e registrado a massa dos
cadinhos com as amostras em balança analítica. A porcentagem de cinzas da amostra foi calculada
de acordo com a Equação 4.

(Eq. 4)

Determinação do teor de açúcares redutores

Escolheu-se o método de DNS (Ácido 3,5 – dinitrosalicílico) proposto por Miller (1959),
para a determinação de açúcares presentes na amostra devido à faixa de detecção dos açúcares
redutores que se presume conter a casca de cacau de acordo com a literatura consultada (Tabela 11).
Inicialmente, elaborou-se uma curva padrão com 5 pontos a partir de uma solução mãe de glucose
com uma concentração de 1 g·L-1 e determinou-se a absorbância a 535 nm no espectrofotômetro
Spectrumlab 22PC. Posteriormente, realizou-se a hidrólise ácida de uma amostra de casca de cacau
para quantificação de açúcares não redutores e para os açúcares redutores, empregou-se o extrato
aquoso da casca de cacau.
Determinação de Íons
Realizou-se a quantificação de ânions e cátions para cada amostra de extrato aquoso da

casca. Para cada análise diluiu-se a amostra de extrato aquoso, na razão de 1:10. Utilizou-se o
equipamento Ion analysis Metrohm CH-9101. Para a análise de cátions utilizou-se a coluna
Metrosep C3 250/4.0 (250mmL x 4,0mm ID; No. 5607002), com as seguintes condições de análise:
eluente 5,0 mM HNO3; vazão: 1,0 mL· min-1; detector: CD; temperatura 40ºC; volume de injeção:
20 µL. Para a análise de ânions utilizou-se a coluna Metrosep A Supp 5 250/4.0 (250 mmL x 4,0
mm ID; No. 7610789), com as seguintes condições de análise: eluente 3,2 mM Na2CO3 + 1,0 mM
NaHCO3; vazão: 0,7 mL· min-1; detector: supressed CD; temperatura ambiente (25ºC); volume de
injeção: 20 µL.
Determinação de proteínas totais

Para a quantificação de proteínas implementou-se o método proposto por Bradford (1976).
Este método é baseado na observação de que o Comassie Brilliant Blue G-250 existe em duas
colorações diferentes, vermelho e azul. No pH de reação, a interação entre a proteína de massa
molecular alta e o corante provoca o deslocamento do equilíbrio do corante da forma aniônica
(vermelha) para a forma catiônica (azul), que absorve fortemente na região de comprimento de onda

no ultravioleta-visível em 595 nm (Zaia et al., 1998). O complexo proteínas-corante tem um

coeficiente de extinção alto, proporcionando uma maior sensibilidade na dosagem da proteína.
Elaborou-se a curva padrão usando uma solução padrão de BSA de 100 μg·mL-1 e
analisou-se a absorbância em um comprimento de onda igual a 595 nm no espectrofotómetro
Spectrumlab 22PC. Posteriormente, analisaram-se as amostras de extrato aquoso de casca de cacau
(1 g de casca de cacau em 10 mL de água deionizada) para a quantificação de proteínas solúveis
presentes na amostra.
3.3.2. Determinação de extraíveis em água, etanol e éter de petróleo
Para a determinação de extraíveis na casca de cacau, adotou-se a metodologia estabelecida

na norma NREL/TP-510-42619 (Sluiter et al., 2005) descrita a seguir.
a. Preparação da amostra para extração

Com as amostras processadas para a determinação de extraíveis, determinou-se ao mesmo
tempo sólidos totais e umidade (procedimentos descritos previamente).
b. Extração pelo método de Soxhlet

Secaram-se em estufa a 105 ± 5ºC durante 12 h, as peças de vidro do equipamento a
utilizar. Estas foram transferidas para um dessecador, posteriormente, até atingir temperatura
ambiente. Adicionaram-se pérolas de vidro nos frascos de depósito do solvente e registrou-se a
massa. A seguir, adicionaram-se 190 ± 5 mL de água deionizada. Imediatamente, adicionaram-se
4,00 g de casca de cacau dentro de cada cartucho de extração, registrou-se a massa e colocou-se
dentro do equipamento. Com todas as peças e conexões dispostas corretamente, iniciou-se o
processo de extração durante 8 h.
Retirou-se a maior quantidade possível de água antes de montar o equipamento para

extração com o próximo solvente. Posteriormente, adicionaram-se 190 ± 5 mL de etanol no frasco
de depósito do solvente previamente tarado. Com todas as peças (incluindo o cartucho de extração
com a amostra previamente processada com água) e conexões dispostas corretamente, iniciou-se o
processo de extração durante 8 h. Repetiu-se o procedimento descrito para a extração com água e
realizaram-se os mesmos passos de montagem do equipamento para a extração final com éter de
petróleo. Ao final da extração com este último solvente, a amostra restante contida no cartucho
transferiu-se para um papel filtro qualitativo previamente seco e com massa conhecida (sendo
lavada a amostra com 100 mL de água), e levou-se para estufa a 105 ± 5ºC durante 12 h.

c. Remoção dos solventes

Os solventes foram extraídos dos frascos de vidro mediante evaporação em estufa com
circulação de ar. Após de 12 h, os recipientes foram transferidos para o dessecador até atingir
temperatura ambiente e em seguida, registrou-se a massa.
Realizaram-se os cálculos de extraíveis da biomassa, empregando as equações 5 e 6:

(Eq. 5)

(Eq. 6)

3.3.3. Determinação de carboidratos estruturais e lignina
Para a determinação de carboidratos estruturais e lignina na casca de cacau, adotou-se a

metodologia estabelecida na norma NREL/TP-510-42618 (Sluiter et al., 2011) descrita a seguir.
a. Preparação da amostra para análise e hidrólise

Secaram-se os cadinhos durante 4 h em mufla a 575 ± 25°C e após esse tempo, foram
transferidos para um dessecador durante 1 h, e determinou-se a massa em balança analítica, sendo
registrado a massa (W1). As amostras foram transferidas de novo para a mufla durante 1 h e, após
esse tempo, foram levadas para o dessecador durante 1 h e a massa foi registrada. Este
procedimento foi repetido até se atingir o massa constante (variação da massa menor a ± 0,3 mg
após de reaquecimento dos cadinhos na mufla). Foram depositadas 0,3 ± 0,01 g de casca de cacau
em frascos do tipo Schott de 100 mL. Adicionaram-se 3,00 ± 0,1 mL de H2SO4 72% e durante 1 min
o conteúdo do frasco do tipo Schott foi misturado utilizando um bastão de vidro. Os frascos foram
dispostos em um banho-maria a 30 ± 3°C para hidrólise durante 1 h, agitando-se o conteúdo do
frasco com um bastão de vidro a cada 10 min sem retirá-los do banho-maria. Após esse tempo,
retiraram-se os frascos do banho-maria e adicionaram-se 84,00 ± 0,04 mL de água deionizada. Com
os frascos fechados adequadamente homogeneizou-se o conteúdo até a separação de fases entre as
camadas de concentração alta e baixa dos ácidos desaparecer.
Preparou-se 10 mL de uma solução padrão de açúcares (glucose, xilose, galactose
arabinose e manose) que foi posteriormente utilizada para fazer a correção de possíveis perdas
ocasionadas durante a hidrólise ácida. Adicionaram-se 348 µL de H2SO4 72% nesta solução, e
transferiu-se para o frasco do tipo Schott, fechado adequadamente. Levaram-se as amostras à
autoclave também a solução padrão de açúcares que foram incubadas durante 1 h a 121°C. Os
frascos foram esfriados até atingir a temperatura ambiente.

b. Análise do conteúdo de lignina ácido insolúvel (AIL)

Filtraram-se as amostras através do papel filtro qualitativo previamente seco e de massa
conhecida, e adicionaram-se 50 mL de água deionizada. Armazenou-se uma amostra de 50 mL do
líquido filtrado para a análise posterior de carboidratos e de lignina solúvel. Transferiram-se os
papeis filtro com as amostras filtradas para uma estufa a 105 ± 3ºC. Passaram-se para o dessecador
durante 30 min e registrou-se a massa (W2). Repetiu-se o processo de secagem até atingir massa
constante.
Transferiram-se cuidadosamente as amostras para os cadinhos secos e de massas
conhecidas. Colocaram-se os cadinhos na mufla a 575 ± 25°C durante 8 h. Completado o tempo,
foram passados para o dessecador até atingir temperatura ambiente. Determinou-se a massa e levou-
se de volta para a mufla durante 1 h cada amostra, e repetiu-se o processo até atingir massa
constante. Registrou-se a massa final como W3. Calculou-se a porcentagem de resíduos á o
conteúdo de lignina ácido insolúvel conforme a Equações 9:

(Eq. 7)

ODW: Massa seca em estufa (Oven dry weight)

(Eq. 8)

AIR: Resíduo ácido-insolúvel (Acid Insoluble Residue)

(Eq. 9)

AIL: Lignina ácido-insolúvel (Acid insoluble lignin)
c. Determinação do conteúdo de lignina ácido solúvel (ASL)

Analisou-se uma amostra de água deionizada no espectrofotômetro UV-Visível e
considerou-se como branco. A absorbância do extrato da hidrólise foi lida no comprimento de onda
UV-VIS de 240 nm. Quando necessário, dilui-se as amostras com água deionizada ou com ácido
sulfúrico 4% para obter uma absorbância na faixa de 0,7–1,0 registrando a diluição feita. O mesmo
solvente foi utilizado como branco. Este procedimento foi efetuado no período de tempo
compreendido entre a hidrólise ácida e até 6 h depois do procedimento. Calculou-se a lignina ácido
solúvel conforme a Equação 10.

(Eq. 10)

ASL: Lignina ácido solúvel (Acid soluble lignin)

UVabs: Média da absorbância UV-Vis para a amostra a um comprimento de onda apropriado
Volumefiltrado: Volume do filtrado, 86,73 mL

ε: Absorbância da biomassa para uma longitude de onda específica.

ODW amostra: Massa da amostra em miligramas
Pathlength= comprimento do percurso da cubeta de quartzo
(Eq. 11)

(Eq. 12)

d. Determinação de carboidratos estruturais

Preparou-se uma solução padrão de calibração (CVS, calibration verification standard)
contendo os compostos a ser quantificados (celobiose, glucose, xilose, galactose, arabinose,
manose), determinando 4 pontos de calibração.
Transferiram-se 20 mL do extrato da hidrólise (Descrita no parágrafo b.: Análise do
conteúdo de lignina ácido insolúvel) para um frasco de Erlenmeyer de 50 mL. Neutralizou-se até
pH 5-6 utilizando carbonato de cálcio e agitação constante (adicionando-se o carbonato devagar, até
atingir pH 4). Deixou-se decantar a amostra. Depois deste processo o pH do líquido permaneceu 7.
Preparou-se a amostra para o análise em HPLC, filtrando o líquido obtido na etapa anterior em um
filtro de 0,2 μm e transferindo-o para um vial. Analisaram-se o padrão de calibração, o CVS e as
amostras no equipamento HPLC usando uma coluna Shodex sugar SP0810 ou uma coluna Biorad
Aminex HPX-87-P.
3.3.4. Análise histológica da casca de cacau
FIGURA 13. FRAGMENTO Aplicando técnicas histológicas de coloração, e

DE CASCA DE CACAU
empregando os corantes safranina (1%) e azul de Astra (1%),

identificaram-se as estruturas anatômicas presentes na casca do
fruto maduro de cacau.

Iniciou-se o procedimento com um corte de 3 cm de altura

por 3 cm de comprimento da casca de cacau fresca (Figura 13).
Fragmentos deste material foram submersos em uma solução de

etanol 70% para evitar a degradação do material e assim
conseguir preservar a aparência original das estruturas. Após 24 h
de contato com a solução, a suspensão foi filtrada e retirou-se o
excesso remanescente sobre os pedaços com papel toalha. Um
fragmento, foi depositado em um recipiente com solução de NaOH 2,3% com o propósito de
verificar as modificações estruturais que provocava o composto alcalino sobre as estruturas do
material, simulando de alguma forma, o pré-tratamento alcalino desenvolvido neste estudo.

Do corte de casca, usando lâminas de bisturi a mão livre, foram obtidos cortes finos (25
μm de espessura). Em seguida, os fragmentos resultantes foram submersos em álcool durante 10
minutos e lavados com água deionizada duas vezes. Posteriormente, submergiram-se os fragmentos
em hipoclorito de sódio comercial diluído durante 2 horas, e na sequência, efetuaram-se duas
lavagens sucessivas com água deionizada.
Na sequência, submergiram-se os fragmentos descoloridos durante 1 hora em uma solução
diluída de safranina e azul de Astra (misturados na razão de 1:1) . Após este tempo, distribuíram-se
os fragmentos sobre lâminas semipermanentes de vidro e cobriram-se com lamínulas para a
posterior observação em microscópio ótico (MO) binocular marca Leica, DM/LS. (Jensen, 1962).
As imagens obtidas foram obtidas através do software ToupView.
3.3.5. Determinação da morfologia por Microscopia eletrônica de varredura

(MEV)

A morfologia da casca de cacau antes e depois do pré-tratamento básico-enzimático, foi
analisada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) no equipamento Teskan mod Vega 3
LMO (Oxford instruments), operando a 15 keV, do Centro de Microscopia Electrónica (CME) da
UFPR. A montagem das fibras foi efetuada no sentido longitudinal sobre suportes de alumínio e
foram fixadas com fita dupla-face de cobre. Previamente à análise, as amostras foram secas em
estufa a 45°C durante 4 h e recobriram-se posteriormente com uma fina camada de 30 nm de ouro
usando um metalizador em câmara de vácuo.
3.3.6. Determinação do índice de cristalinidade por difração de raios X

As análises de difração de raios-X das amostras de casca de cacau com e sem pré-
tratamento, foram obtidas mediante um difratômetro Shimadzu XRD 700 Maxima e analisadas com
a emissão de radiação de Cu (CuKα, λ=1,5418 Å). O equipamento do Laboratório de Ótica e
Instrumentação de raios X, do Departamento de Física da UFPR foi utilizado para as análises.
Analisou-se o resultado no intervalo do ângulo 2θ entre 5 e 40 graus, com varredura de 2 graus por
minuto, e operou-se o gerador a temperatura ambiente em 40 kV e 20 mA. Os resultados obtidos,
foram processados pelo software analisador de gráficos OriginLab 7.0 o índice de cristalinidade foi
determinado mediante a Equação 13 (Buschle-Diller; Zeronian, 1992).

(Eq. 13)

Onde:
ICR = Índice de cristalinidade

I022 = Intensidade no plano (022) intensidade máxima de difração

Ima = Intensidade do material amorfo em 2θ = 18°
3.3.7. Determinação das propriedades térmicas mediante análises

termogravimétricas (TG/dTg)
A estabilidade térmica por termogravimetria (TG) das amostras de casca de cacau com e
sem pré-tratamentos, foi analisada no equipamento Setaram (Setsys Evolution TG / DTA / DSC) do
Laboratório de Biomassa (Biofix) da UFPR, sob atmosfera de N2 de 20°C até 800ºC e fluxo de gás
de 20 mL·min -1.
3.3.8. Determinação de grupos funcionais por espectroscopia de infravermelho

(FTIR)

As amostras de casca de cacau com e sem pré-tratamentos, foram caracterizadas por
espectroscopia de infravermelho FTIR em um equipamento Vertex 70 (Bruker), com o acessório
DRIFTS (reflectância difusa) com 64 scaners, resolução 4 cm-1, sem a eliminação da compensação
atmosférica na região entre 4000 a 400 cm-1.
As amostras foram previamente secas a uma temperatura de 45°C durante 24 horas;
depois foram moídas e misturadas a homogeneidade em KBr espectroscópico e colocadas em
acessórios DRIFTS para a aquisição dos espectros. Os resultados obtidos, foram analisados com o
software OriginLab 7.0.
3.4. Determinação das condições de processo para o pré -tratamento químico e

enzimático da casca de cacau

Como é afirmado por Kim et al., (2015), o alvo principal de qualquer pré-tratamento
aplicado em material lignocelulósico é melhorar a hidrólise enzimática dos carboidratos presentes,
para que em consequência a eficiência da bioconversão dos açúcares seja mais eficiente.
Com a informação recopilada durante a revisão bibliográfica sobre os diferentes tipos de
pré-tratamento implementados para a disponibilização e obtenção dos açúcares presentes em
material lignocelulósico de diferentes origens (lembrando que não existem referências prévias de
pré-tratamentos de sacarificação, específicas para o aproveitamento do hidrolisado obtido partir da
casca de cacau), procedeu-se a determinação as condições ótimas para o pré-tratamento químico-
enzimático da casca de cacau. Desta forma, foi realizado um tratamento químico com hidróxido de
sódio (NaOH) na casca de cacau, o qual promove a remoção principalmente de lignina presente na
biomassa de natureza lignocelulósica. Segundo os resultados reportados na literatura, existe uma

ampla possibilidade de combinações de fatores como a concentração do NaOH, a concentração de

biomassa, os tempos e temperaturas de processamento.
3.4.1. Planejamento experimental DCCR: condições para o pré-tratamento

alcalino com hidróxido de sódio (NaOH) da casca de cacau
O Delineamento Composto Central Rotacional-DCCR realizou-se com o intuito de

determinar as melhores condições de tratamento químico das cascas de cacau na concentração fixa
de 10% (m/v), utilizando duas variáveis e três pontos centrais, resultando em treze experimentos.
As variáveis selecionadas foram: tempo de processamento (30 a 120 minutos) e concentração de
NaOH (0,5% a 4,0%) tendo como parâmetro de resposta a quantidade de celulose no material pré-
tratado quimicamente. Os níveis das variáveis estudadas estão apresentados na Tabela 2.
Os ensaios descritos no planejamento foram realizados em frascos do tipo Schott de
volume de 100 mL com tampa, com as concentrações de NaOH especificadas e uma relação de 10%
(m/v) em cada caso. Os frascos foram levados a autoclave atingindo uma temperatura de 120ºC
durante os tempos estabelecidos no desenho experimental. Terminado o processo na autoclave,
permitiu-se que o material atingisse a temperatura ambiente. Em seguida, filtrou-se a casca de cacau
pré-tratada, através de papel filtro qualitativo (previamente seco em estufa a 80 ± 3ºC e com massa
conhecida). Trasladaram-se os papéis filtro com as amostras para uma estufa a 80 ± 3ºC.
TABELA 2. DCCR - CONDIÇÕES DE OTIMIZAÇÃO PARA O PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO

DA CASCA DE CACAU

Passaram-se para o dessecador durante 30 min e registrou-se a massa. Até atingir massa
constante, repetiu-se o processo de secagem. Com o material seco, procedeu-se a realizar a
determinação da celulose. Para este fim, utilizou-se a enzima Cellic® CTec 2 em excesso para

retirar completamente o conteúdo de celulose presente na casca e determinar por gravimetria a

diferença de massa.
3.4.2. Determinação das condições de processo para o tratamento da casca de

cacau com a enzima Cellic® CTec 2.

Hidayat et al., (2012) afirma que a hidrólise enzimática das ligações glicosídicas entre os
monômeros de glucose da cadeia de celulose, é uma etapa transcendental no processamento da
celulose proveniente da biomassa vegetal. As formulações de celulase contêm um amplo espectro
de enzimas chamadas endoglucanases, celobiohidrolases e ß-glucosidase, que trabalham
sinergicamente para converter a celulose em açúcares mais simples (Rodrigues et al., 2015). As
endoglucanases atuam clivando as ligações ß-glucosídicas internas na cadeia de celulose,
permitindo a posterior entrada e ação da celobiohidrolase sobre as extremidades da cadeia. A
celobiose produzida é finalmente dividida em unidades de glucose mediante a ação da ß-glucosidase
(Yennamalli et al., 2013)
Para este estudo foi utilizada a enzima comercial Cellic® CTec 2 da empresa Novozymes
A/S (Dinamarca). Segundo o fabricante (Novozymes - Ficha técnica, 2010), esta enzima é uma
mistura complexa de celulases agressivas, com um alto conteúdo de ß-glucosidases e hemicelulases.
A Cellic® CTec 2 tem um elevado rendimento de conversão, é eficaz em altas concentrações do
substrato, tolerante a inibidores, compatível com várias matérias primas e apresenta alta
estabilidade.
Tendo como referência as condições de hidrólise enzimática (concentração da enzima,
concentração de material lignocelulósico no meio e tempo de processamento) definidas por
Campioni (2014) para os EFB (Empty fruit bunch) da palma, realizaram-se testes para determinar os
parâmetros a serem aplicados para o tratamento enzimático da casca de cacau. No estudo citado as
condições de processamento foram 2,4% de concentração para a enzima, 15% (m/v) para
concentração de EFB no meio, 39 h de processamento em banho-maria a 50ºC e com uma agitação
de 100 rpm, obtendo como resultado um rendimento de 63,5% de conversão da celulose presente no
EFB.
As amostras de casca de cacau pré-tratada alcalinamente nas diferentes condições
estabelecidas no planejamento experimental, submeteram-se a tratamento com a enzima Cellic®
CTec 2 seguindo as etapas descritas a seguir. Em frasco Erlenmeyer de 125 mL adicionou-se uma
concentração da enzima Cellic® CTec 2 de 2,4% (v/v) em solução de tampão citrato com pH 4,8,
considerando uma relação de 10% (m/v) para a quantidade de casca de cacau pré-tratada
alcalinamente, processada durante 24 h e mantendo uma temperatura constante de 50ºC (em banho-

maria) com agitação de 100 rpm. Em seguida, filtrou-se o hidrolisado obtido a partir da casca de
cacau através de papel filtro qualitativo e assim, a fração liquida ou hidrolisado, foi utilizado
posteriormente como fonte de glucose para a preparação do meio de fermentação.
3.5. Seleção do microrganismo para produção de ácido propiônico

Para este trabalho, decidiu-se utilizar os microorganismos do género Propionibacterium.
Foram utilizados meios diferentes para a reativação das cepas e para a produção do inóculo, como
recomendado pela literatura e posteriormente empregou-se um meio sintético adicional (Zhong,
1997; Coral et al., 2008; Chena et al., 2012) para realizar testes iniciais de fermentação e produção
de AP (Figura 14). Selecionaram-se as cepas que apresentaram a maior produção de AP a partir do
meio contendo o hidrolisado da casca de cacau.
FIGURA 14. MEIOS UTILIZADOS NO PROCESSO DE SELEÇÃO DO MICRORGANISMO
Meio de produção Meio de

Meio de reativação do inóculo fermentação

3.5.1. Meio de reativação e conservação
Reativaram-se nove cepas do gênero Propionibacterium (Quadro 4) proporcionadas pelo

banco de cepas do Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da UFPR.
Utilizou-se o meio líquido sintético de reativação proposto por Goswami e Srivastava (2000) que é
composto pelos seguintes elementos: 5 g·L-1 de extrato de levedura, 40 g·L-1 de lactose, 2 g·L-1 de
(NH4)2PO4; 1 g·L-1 de KH2PO4, 0,01 g·L-1 de MgSO4, 0,01 g·L-1 de CaCl2, g·L-1 de CoCl2, 0,005
g·L-1 de FeSO4 e 0,0025 g·L-1 de MnSO4.

QUADRO 4. MICRORGANISMOS DO GÊNERO PROPIONIBACTERIUM DO BANCO DE CEPAS

DO PPGEBB, UTILIZADOS PARA A PRODUÇÃO DE AP
Código Microrganismo
C1 Propionibacterium acidopropionici. DSM 20273 /ATCC 4965
C2 Propionibacterium jensenii. DSM 20535 / ATCC 4868
C3 Propionibacterium acidopropionici. DSM 4900 / ATCC 25562
C4 Propionibacterium acidopropionici. DSM 20272 /ATCC 4875
C5 Propionibacterium thoenii. DSM 20276 / ATCC 4874
C6 Propionibacterium freudenreichii spp. Shermanii. DSM 4902/ATCC 9614
C7 Propionibacterium jensenii. DSM 20274 / ATCC 4964
C9 Propionibacterium freudenreichii shermanii. NRRL 4327
C11 Propionibacterium freudenreichii. NRRL 3523
Empregaram-se tubos de ensaio de 21 mL com tampa de rosca previamente esterilizados,

utilizando o volume total permitido pelo recipiente com o propósito de manter as condições de
micro-aeração. Posteriormente os tubos foram incubados a uma temperatura de 33°C durante 48 h.
Utilizou-se este mesmo meio para a conservação das cepas durante a realização do projeto. As
cepas foram armazenadas neste meio sob refrigeração a 4ºC re-inoculando novo meio com uma
frequência semanal.
3.5.2. Meio para produção do inóculo
Posteriormente para a produção do inóculo, repicaram-se as cepas relacionadas no Quadro

4, em tubos de ensaio de 21 mL com tampa rosca, previamente esterilizados, contendo o meio
líquido proposto por Coral, (2008) e composto por 10 g·L-1 de extrato de levedura, 40 g·L-1 de
lactose, 5 g·L-1 de tripticase; 1 g·L-1 de KH2PO4, 0,01 g·L-1 de MgSO4, 0,01 g·L-1 de CaCl2, g·L-1 de
CoCl2, 0,005 g·L-1 de FeSO4 e 0,0025 g·L-1 de MnSO4. Os tubos foram incubados a uma
temperatura de 33°C durante 48 h.
3.5.3. Meio sintético de fermentação

Para a seleção das cepas produtoras utilizou-se o meio líquido de cultivo sintético (Tabela
3) proposto por Coral (2008), com a seguinte composição: glicerol 15 g·L-1; extrato de levedura 10
g·L-1; (NH4)2HPO4 2 g·L-1; KH2PO4 1 g·L-1; MgSO4 · 7 H2O; 0,01 g·L-1; CaCl2 · 6 H2O 0,01 g·L-1;
CoCl2 · 6 H2O; 0,01 g·L-1; FeSO4 · 7 H2O; 0,005 g·L-1 e MnSO4 · H2O 0,0025 g·L-1, distribuído em
balões de fundo chato de 100 mL previamente esterilizados. A esterilização do meio realizou-se em
autoclave a 121 ˚C e 1 atm., durante 15 minutos. Desenvolveu-se a fermentação em balões de fundo
chato de 100 mL com tampa de borracha previamente esterilizados; com 15% (v/v) de inóculo de
cada uma das cepas, incubaram-se a 33 ˚C, durante 48 h.

Para posterior análise cromatográfica, centrifugaram-se as amostras a 2300 RCF por 15

minutos em tubos tipo Falcon de 15 mL. Separou-se a fração sobrenadante, filtrou-se (através de
um filtro de 0,2 μm) e armazenou-se sob refrigeração a 4ºC em vials de 2 mL. Determinou-se a
concentração de AP produzido por cada uma das cepas testadas, mediante leitura em um
Cromatógrafo HPLC Agilent technology, (coluna C18, 230 mm; fase móvel: ácido fórmico 0,1%;
metanol 30%; vazão: 0,9 mL·min-1) baseando-se em uma curva de calibração com diferentes
diluições de AP de grau analítico da Sigma-Aldrich. O tempo de retenção nesta coluna foi de 2 min
5 seg.
TABELA 3. MEIO DE FERMENTAÇÃO PARA PROPIONIBACTERIUM
FONTE: Coral (2008)
3.6. Produção de ácido propiônico
3.6.1. Produção de ácido propiônico com o hidrolisado obtido a partir da casca de

cacau

Com as cepas produtoras de AP, previamente identificadas e selecionadas, realizou-se um
teste inicial de produção do ácido, utilizando o hidrolisado obtido mediante a hidrólise química-
enzimática da casca de cacau. Para tal fim, testou-se um meio de fermentação composto pelos
mesmos elementos que conformam o meio sintético descrito previamente, mas ao invés de utilizar
15 g·L-1 de glicerol, incluiu-se no meio 7,5 g·L-1 de glicerol e hidrolisado diluído de forma a se
obter 7,5 g·L-1 dos açúcares (obtido conforme item 3.4.1 e 3.4.2). O meio foi preparado com a
seguinte composição: glicerol 7,5 g·L-1; concentração dos açúcares do hidrolisado 7,5 g·L-1; extrato
de levedura 10 g·L-1; (NH4)2HPO4 2 g·L-1; KH2PO4 1 g·L-1; MgSO4 · 7 H2O; 0,01 g·L-1; CaCl2 · 6
H2O 0,01 g·L-1; CoCl2 · 6 H2O; 0,01 g·L-1; FeSO4 · 7 H2O; 0,005 g·L-1 e MnSO4 · H2O 0,0025 g·L-1.
Distribuiu-se este meio em tubos de ensaio 21 mL com tampa rosca previamente esterilizados, com
10% (v/v) de inóculo da cepa C6 e da cepa C7, incubados a 33°C, durante 60 h. Após este tempo, as
amostras foram centrifugadas a 2300 RCF por 15 minutos em tubos tipo Falcon de 15 mL. O

sobrenadante foi passado por filtros de 0,2 μm e posteriormente analisado no HPLC Agilent 1260
Infinity.
3.6.1.1. Planejamento experimental Plackett & Burman: sais necessários ao meio

Para os sais necessários para a produção de AP foi realizado um planejamento
experimental Plackett & Burman com 7 variáveis e 3 pontos centrais, resultando em 11 ensaios, e
sendo a concentração de AP, a variável de resposta (Tabela 4). O meio de fermentação era
composto de glicerol 7,5 g·L-1, concentração dos açúcares do hidrolisado 7,5 g·L-1 (obtido conforme
item 3.4.1 e 3.4.2); extrato de levedura 10 g·L-1, em ausência ou presença dos sais (NH4)2HPO4 (2
g·L-1), KH2PO4 (1 g·L-1), MgSO4 (0,10 g·L-1), CaCl2 (0,10 g·L-1), CoCl2 (0,10 g·L-1), FeSO4 (0,005
g·L-1) e MnSO4 (0,0025 g·L-1). Desenvolveu-se a fermentação em tubos de ensaio 21 mL com
tampa rosca previamente esterilizados, com 10% (v/v) de inóculo da cepa C6 e da cepa C7, incubado
a 33°C, durante 60 h. Após este tempo, as amostras foram centrifugadas a 2300 RCF por 15
minutos em tubos tipo Falcon de 15 mL. O sobrenadante foi passado por filtros de 0,2 μm e
posteriormente analisado no HPLC Agilent 1260 Infinity. Analisaram-se os resultados através do
software Statistica® 5.0.
TABELA 4. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL PLACKETT & BURMAN PARA

DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DE COMPONENTES DO MEIO SOBRE A PRODUÇÃO DE
AP

3.6.1.2. Planejamento experimental DCCR: otimização das fontes de carbono e

nitrogênio (C/N)
Na sequência dos experimentos, determinou-se a relação ótima carbono/nitrogênio, para o

adequado desenvolvimento do microrganismo e produção do AP. Assim, mediante o software

Statistica® 5.0 criou-se o desenho experimental para obter a informação desejada. Empregou-se
um Delineamento Composto Central Rotacional 23 (DCCR) com três variáveis e três pontos
centrais, resultando em dezenove experimentos, onde a variável resposta foi a concentração de AP
obtida após da fermentação. Levando em conta o conteúdo e concentrações das fontes de carbono e
nitrogênio do meio de cultivo sintético, determinaram-se as concentrações dos compostos a estudar
apresentadas na Tabela 5.
Realizou-se o processo de fermentação com a cepa selecionada C7 em tubos de ensaio de
21 mL com tampa, previamente esterilizados sob condições de incubação de 33ºC, durante 60 h e
inóculo inicial de 10% (v/v). Após este tempo, as amostras foram centrifugadas a 2300 RCF por 15
minutos em tubos tipo Falcon de 15 mL. O sobrenadante foi filtrado em membranas de 0,2 μm. As
amostras foram armazenadas sob refrigeração a 4ºC em vials de 2 mL, para serem posteriormente
analisadas em HPLC Agilent 1260 Infinity. Analisaram-se os resultados com o software Statistica®
5.0.
TABELA 5. NÍVEIS ESTUDADOS DE GLUCOSE E GLICEROL PARA A OTIMIZAÇÃO DA

PRODUÇÃO DE AP
a.
b.

3.6.1.3. Efeito da concentração das fontes de carbono, mantendo a relação C/N

Após determinar a melhor relação C/N para a produção de AP, procedeu-se na verificação
de qual a melhor quantidade no meio das fontes de carbono (glicerol e hidrolisado). Partindo dos
dados de literatura, determinaram-se as relações apresentadas na Tabela 6 para ser avaliadas,
determinando-se como a variável de resposta, a concentração de AP e a quantidade de biomassa
produzida.
TABELA 6. VARIAÇÃO DA RELAÇÃO DAS FONTES DE CARBONO
A produção de AP foi realizada, em triplicata, pela cepa C7 em tubos de ensaio de 21 mL

com tampa, previamente esterilizados e posteriormente inoculado com 10% (v/v) da cepa C7, sob
condições de incubação de 33ºC, durante 60 h conforme as condições apresentadas.
3.6.1.4. Determinação da melhor condição de incubação: estática ou agitada

Considerando que a cepa de Propionibacterium jensenii DSM 20274 (cepa C7) é
anaeróbia facultativa, testou-se o desenvolvimento do microrganismo sob condições de agitação
branda e moderada, com o propósito de avaliar como esta variável de incubação poderia influenciar
na produção de AP. Os tubos de ensaio de 21 mL contendo o meio sintético, previamente
esterilizados foram inoculados em uma taxa de 10% (v/v). Posteriormente foram incubados durante
60 h. Para implementar a condição de agitação, utilizou-se uma incubadora com agitação orbital
incorporada da Novatecnica, com controle de temperatura e agitação automáticas, reguladas em
33ºC e 50 e 100 rpm respectivamente. Para posterior análise cromatográfica, separou-se a fração
sobrenadante, filtrou-se (através de um filtro de 0,2 μm) e armazenou-se sob refrigeração a 4ºC em
vials de 2 mL. As amostras foram posteriormente analisadas em HPLC Agilent 1260 Infinity.
3.6.1.5. Quantificação de biomassa
Quantificou-se a biomassa microbiana através do método direto de massa seco. Tubos

Falcon previamente identificados e sem tampa, foram acondicionados em estufa a 80°C durante
pelo menos 12 h. Completado o tempo, foram levados para um dessecador até atingirem a
temperatura ambiente, e registrou-se a massa determinada mediante o uso de balança analítica. 10

mL do meio fermentado foram transferidos para cada tubo (garantindo iguais massa dos tubos para
posterior centrifugação) e centrifugou-se o material a 6000 RCF durante 20 min. Em seguida,
retirou-se o sobrenadante cuidadosamente. Empregou-se este sobrenadante para análises posteriores
em HPLC e para a determinação do pH. Sobre o material remanescente no tubo Falcon,
adicionaram-se 10 mL de água deionizada e homogeneizou-se o conteúdo utilizando um vortex. Na
sequência, centrifugou-se de novo o material a 6000 RCF durante 20 min e descartou-se o
sobrenadante. Repetiu-se este último passo uma vez mais com o intuito de eliminar qualquer
interferente. Finalizado o processo de centrifugação, secaram-se os tubos Falcon contendo a
biomassa em estufa a 80°C durante pelo menos 12 h. Os tubos foram levados a um dessecador e
mantidos até atingirem temperatura ambiente. Registrou-se a massa em balança analítica. O cálculo
de biomassa por massa seca foi determinada conforme o indicado na Equação 14.

) (Eq. 14)

3.6.1.6. Fermentação em frasco do tipo Schott de 100 mL
Estabelecidas as melhores condições de produção do AP, procedeu-se o aumento de

escala, passando de tubos de ensaio de 21 mL a frascos do tipo Schott de vidro de 100 mL. Para os
experimentos realizados neste recipiente, tentou-se manter o mínimo de headspace possível para
não exceder as condições de micro-aeração máximas que o microrganismo toleraria, adicionando
100 mL do meio de fermentação. Os experimentos foram realizados por duplicata. O meio de
fermentação consistindo de glicerol 32 g·L-1; concentração dos açúcares do hidrolisado de casca de
cacau 8 g·L-1; extrato de levedura 10 g·L-1, CaCl2 · 6 H2O 0,01 g·L-1 e CoCl2 · 6 H2O. Para
implementar a condição de agitação, utilizou-se uma incubadora com agitação incorporada da
marca Novatecnica com controle de temperatura e agitação automáticas, reguladas em 33ºC e 50
rpm. Os frascos do tipo Schott, previamente esterilizados inocularam-se em uma taxa de 10% (v/v).
Durante esta etapa, acompanhou-se o desenvolvimento da fermentação com a quantificação de
biomassa, medição de pH, e quantificação de compostos (açúcares, AP, produtos secundários e
glicerol) através de análise em HPLC e construiu-se uma cinética de fermentação retirando em
intervalos de tempos preestabelecidos, alíquotas do meio até completar 156 h de processo. Para
posterior análise cromatográfica, separou-se a fração sobrenadante, filtrou-se (através de um filtro
de 0,2 μm) e armazenou-se sob refrigeração a 4ºC em vials de 2 mL. Analisou-se posteriormente
cada amostra em HPLC Agilent 1260 Infinity.

3.6.1.7. Fermentação em biorreator agitado
Como etapa final, desenvolveu-se a fermentação em biorreator de marca Inceltech LH

SG1 com capacidade total de 2 L e agitação de 50 rpm. O meio de fermentação consistindo de
glicerol 32 g·L-1; concentração dos açúcares do hidrolisado de casca de cacau 8 g·L-1; extrato de
levedura 10 g·L-1, CaCl2 · 6 H2O 0,01 g·L-1 e CoCl2 · 6 H2O. A temperatura do processo foi 33ºC e
uma taxa de inóculo de 10%. Acompanhou-se o desenvolvimento da fermentação com análise de
quantificação de biomassa, medição de pH, e quantificação de compostos (açúcares, AP, AA, AS e
glicerol) através de análise por HPLC e construiu-se uma cinética de fermentação retirando em
intervalos de tempos pré-estabelecidos alíquotas do meio até completar 156 h de processo. Para
posterior análise cromatográfica, separou-se a fração sobrenadante, filtrou-se (através de um filtro
de 0,2 μm) e armazenou-se sob refrigeração a 4ºC em vials de 2 mL. Analisou-se posteriormente
cada amostra no HPLC Agilent 1260 Infinity.
3.7. Quantificação de compostos
Realizou-se a quantificação dos compostos presentes tanto no hidrolisado da casca de

cacau pré-tratada química e enzimáticamente (açúcares), quanto nos meios de fermentação e meios
fermentados produzidos durante este trabalho (açúcares, glicerol, AP, ácido succínico (AS), ácido,
acético (AA)) no equipamento HPLC Agilent 1260 Infinity, do laboratório de Química Analítica
Avançada do PPGEBB da UFPR. As condições de processo foram: coluna Hi-Plex 300 x 7,7 mm;
Fase móvel H2SO4 0,005 M; Isocrático; Vazão 0,6 mL·min-1; temperatura 60ºC coluna; TRI: 50ºC.
3.8. Teste de aplicação: determinação da atividade antimicrobiana do meio

fermentado

Para estabelecer e desenhar o teste atividade antimicrobiana do caldo fermentado obtido,
utilizou-se como referência o Manual de provas de Susceptibilidade antimicrobiana (Cavalieri et al.,
2005).
Em primeiro lugar, reativaram-se as cepas refrigeradas de Aspergillus flavus e Cândida
albicans utilizando o meio líquido Sabouraud Dextrosa (SD) seguindo as indicações do fabricante.
48 h depois, realizou-se um repique no mesmo meio para fortalecer as cepas e posteriormente,
repicaram-se em meio Sabouraud Dextrosa agar (SDA). Transcorridas 24 h, foi preparada uma
suspensão padronizada do inóculo a partir de 3-5 colônias de cada microrganismo, como é descrito
a seguir. Em solução salina, suspenderam-se as colônias selecionadas com ajuda de um swap. Em
seguida, patronizou-se a turbidez da suspensão segundo a escala de 0,5 Mc Farland (que

corresponde aproximadamente a 1,5 x 108 UFC·mL-1). Utilizou-se suspensão nos 15 min seguintes
como inóculo.
Sobre placas de Petri descartáveis (diâmetro de 9 cm) com 18 mL meio Müller-Hinton
(MH) solidificado (assegurando uma profundidade de 4 mm), espalhou-se uniformemente com
ajuda de uma alça de Drigalski o inóculo de cada microrganismo testado. Na sequência, e com
ajuda de ponteiras descartáveis de 1 mL esterilizadas (cuja ponta foi previamente cortada a 1,5 cm)
foram formados sobre o meio MH de cada placa de Petri, cinco poços para as diferentes
concentrações das substancias determinadas na Tabela 7. Em cada poço depositaram-se 200 μL da
substância a testar. Nos 15 minutos seguintes à preparação do inóculo (incluindo o espalhamento do
inóculo na placa contendo o meio MH e elaboração dos poços), incubaram-se as placas durante 18 h
a 37ºC. Transcorrido o tempo de incubação realizou-se a leitura dos resultados de cada placa,
verificando-se em primeiro lugar que o crescimento tivesse sido uniforme e que não se houvesse
contaminação.
TABELA 7. CONCENTRAÇÕES DAS SUBSTÂNCIAS A ANALISAR PARA A DETERMINAÇÃO

DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO CALDO DE FERMENTAÇÃO
3.9. Análise estatística

Utilizou-se o software Statistica® 5.0 para a análise dos resultados dos delineamentos
experimentais. Os valores reportados em tabelas e figuras representam a média dos experimentos
realizados por triplicata ou duplicata, segundo especificado em cada caso e apresenta-se o desvio
padrão para cada resultado. As barras de erro representam o desvio padrão (±).
A seguir, apresenta-se o fluxograma (Figura 15) de processo seguido neste estudo, com as
etapas básicas estabelecias para atingir os objetivos marcados inicialmente

FIGURA 15. FLUXOGRAMA DE PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE AP A PARTIR DE

HIDROLISADO DA CASCA DE CACAU PRÉ-TRATADA QUÍMICA E ENZIMÁTICAMENTE


4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. CAPÍTULO 1: CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO OBTIDO

APÓS PRÉ-TRATAMENTO BÁSICO-ENZIMÁTICO E DA CASCA DO
CACAU
4.1.1. Pré-tratamento químico-enzimático de cascas de cacau

Desenhou-se o planejamento experimental (DCCR) considerando as faixas de
concentração do NaOH, as relações de massa-volume, os tempos e temperaturas de processamento
reportados na literatura e apresentados previamente na revisão bibliográfica, que permitiu
determinar as condições ótimas para o pré-tratamento da casca de cacau.
Os resultados da porcentagem de celulose após o pré-tratamento químico (conforme

condições definidas no item 3.4.1) são apresentados na Tabela 8. A análise de resultados realizada
mediante o software Statistica® 5.0 gerou a superfície de resposta (Figura 16) e o diagrama de
Pareto (Figura 17) que permitiram analisar os resultados do experimento.
TABELA 8. RESULTADOS DCCR: DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE PRÉ-

TRATAMENTO ALCALINO

De acordo com o diagrama de Pareto (Figura 17), com um nível de significância de 95%,
a concentração do NaOH pode ser considerada como relevante no tratamento da casca de cacau,
dentre as variáveis estudadas.
FIGURA 16. SUPERFÍCIE DE RESPOSTA DO FIGURA 17. DIAGRAMA DE PARETO DO DCCR

DCCR PARA DETERMINAÇÃO DOS PARA DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS DE
PARÂMETROS DE PROCESSO PARA O PRÉ- PROCESSO PARA O PRÉ-TRATAMENTO
TRATAMENTO ALCALINO DA CASCA DE ALCALINO DA CASCA DE CACAU
CACAU

Com os resultados apresentados na Tabela 8, e como é observado na superfície de resposta

(Figura 16) a quantidade de celulose removida está diretamente relacionada com a concentração do
NaOH utilizada para o pré-tratamento. Desta forma, os tratamentos com menor concentração de
NaOH (0,5% - 1,0%) permitem remover uma quantidade de celulose entre 19,95% e 20,49% que
estão entre as menores obtidas no experimento.
Em contrapartida, a concentração alta de NaOH (3,5%), apresenta os maiores
porcentagens de remoção de celulose (até 31,7%). Quando é utilizada uma porcentagem de NaOH
igual a 2,3%, a porcentagem de celulose obtida após do tratamento corresponde em média a 27,2%.
Devido a que uma concentração intermediária de NaOH (2,3%) permite uma remoção semelhante
de celulose comparando com altas concentrações do reagente, foi selecionada esta condição e a
opção com menor tempo (considerando que não é uma variável significativa) de pré-tratamento em
autoclave (30 min), afim de diminuir o consumo de energia do processo.
Durante o experimento detectou-se que as perdas de material após da hidrólise com NaOH
correspondem em média a 60%. O que quer dizer que para cada grama de casca de cacau fresca que
é submetida ao pré-tratamento alcalino, 0,4 gramas podem ser posteriormente tratadas
enzimáticamente e o restante (0,6 g) é solubilizado no hidróxido de sódio e na águas de lavagem,
para posterior descarte.

4.1.2. Caracterização do hidrolisado obtido a partir do pré-tratamento da casca

de cacau

Desde o planejamento do estudo, presumiu-se que a fração líquida obtida após do
tratamento básico-enzimático fosse rica em açúcares e, por isso, poderia ser utilizada
posteriormente como fonte de carbono nas fermentações para a produção da biomolécula de
interesse. Após a aplicação dos pré-tratamentos, realizou-se a caracterização do hidrolisado,
obtendo os resultados apresentados a seguir. Com o propósito de verificar a efetividade do processo,
a composição dos íons e açúcares solúveis presentes no hidrolisado, foi comparada com a
composição do extrato aquoso obtido diretamente da casca de cacau in natura (como foi descrito na
seção 3.3).
Segundo os resultados obtidos para a quantificação de sais (Tabela 9) e comparando com
os dados obtidos para o extrato aquoso, a concentração da maioria dos sais aumentou após a
realização do pré-tratamento. Este fato pode ser explicado por, principalmente, duas razões: a
primeira, está relacionada com a ação que o hidróxido de sódio exerce sobre a estrutura do material,
uma vez que promove a quebra de ligações intermoleculares por exemplo, entre a lignina e os
carboidratos (Grupta, 2008), além de promover a clivagem das ligações éster dos lipídeos do
material pré-tratado, assim como o aumento do pH, que ocasiona a hidrólise e liberação de diversos
elementos ligados à estrutura original, antes insolúveis. O segundo fator, estaria relacionado à
composição do meio no qual encontra-se a enzima solubilizada para o pré-tratamento e de outros
compostos que são solubilizados no meio após o tratamento.
TABELA 9. QUANTIFICAÇÃO DE ÍONS TABELA 10. QUANTIFICAÇÃO DE

SOLÚVEIS PARA DIFERENTES AMOSTRAS AÇÚCARES SOLÚVEIS PARA DIFERENTES
DE CASCA DE CACAU AMOSTRAS DE CASCA DE CACAU

Em outros casos os sais solúveis que estavam presentes no extrato aquoso original não
foram quantificados no hidrolisado. Isto poderia ser produto da solubilização daqueles elementos
durante o processo de lavagens sucessivas após do pré-tratamento alcalino.
Com a informação obtida sobre a composição de íons do hidrolisado, foi possível
determinar posteriormente se na composição do meio de fermentação seria necessária a adição de
sais fundamentais para o metabolismo e crescimento do microrganismo.
Dentre os açúcares identificados na casca de cacau, com e sem pré-tratamento, encontram-
se os quantificados na Tabela 10 e foram também identificados, frutose, arabinose e celobiose em
menores concentrações (dados não inclusos).
Para as amostras analisadas na Tabela 10, pode-se verificar a efetividade do pré-
tratamento básico-enzimático, que para o caso da glucose, passou a apresentar uma concentração de
93,6 mg/g casca (bs) (partindo do extrato aquoso) até atingir uma concentração de 275,03 mg/g casca
(bs) (análise feita a partir do hidrolisado e calculada levando em conta a quantidade de casca
necessária para completar os processos de hidrólise básica e enzimática). No caso dos resultados de
quantificação para a casca de cacau com pré-tratamento básico, os valores diminuíram em relação
aos obtidos para a casca sem tratamento, chegando a ser 54,43 mg de glucose por grama de casca de
cacau em base seca, o que obedece ao fato de uma grande quantidade dos açúcares solúveis terem
sido eliminados da amostra quando tratado com o hidróxido e submetido a inúmeras lavagens com
água até atingir a neutralidade da amostra e não chegam a ser tão altos quanto os determinados para
a casca com o pré-tratamento enzimático devido a ser esta a função da enzima: converter a celulose
presente na casca em glucose para posterior aproveitamento.
Finalmente, vale a pena considerar a presença da xilose nas amostras, que mesmo
mantendo uma concentração relativamente estável ao longo dos pré-tratamentos, já para a etapa
final da hidrólise enzimática não tem mudança o que ratifica que a Cellic® CTec 2 não age sobre as
hemiceluloses, devido a que é um complexo enzimático conformado por endoglucanases,
celobiohidrolases e ß-glucosidases, que trabalham sinergicamente para converter a celulose em
açúcares mais simples, permitindo portanto a liberação só de glucose.
Apresenta-se na Figura 18, um balanço de matéria para o processo, partindo de 5 g inicias
da casca de cacau in natura, até a obtenção do hidrolisado.

FIGURA 18. BALANÇO DE MASSA PARA O TRATAMENTO BÁSICO-ENZIMÁTICO.

4.1.3. Caracterização físico-química da casca de cacau pré-tratada química e

enzimáticamente.
Tanto o material pré-tratado quimicamente com NaOH (em concentração de 2,3% (m/v)
durante 30 min em autoclave a 120˚C) e, posteriormente, com a enzima Cellic® CTec 2, quanto a
casca sem tratamento, foram caracterizados utilizando as técnicas que são descritas a seguir, com o
propósito de determinar as mudanças estruturais e físico-químicas do material de interesse.
4.1.3.1. Análise histológica da casca de cacau
A seguir, apresenta-se a descrição das características morfológicas encontradas nas

amostras de casca ou epicarpo de cacau fresca. Através de métodos de coloração e obtenção de
imagens mediante microscopia ótica (MO) analisaram-se as amostras. As imagens obtidas
permitiram acompanhar facilmente a descrição das estruturas e a sua relação com os tratamentos
aplicados.
Na Figura 19 (a), observa-se a distribuição organizada e compacta das células da casca
fresca. Na Figura 19 (b), pode-se observar o corte longitudinal de um vaso condutor tratado com
safranina e azul de Astra em excesso. Para algumas amostras de casca de cacau fresca foram
identificadas estruturas traqueais espiraladas (Figura 19 (c)) e estruturas traqueais com padrão de
pontuação (Figura 19 (d)). Na 19 (e), pode-se observar uma única estrutura traqueal espiralada sem
alteração.

FIGURA 19. IDENTIFICAÇÃO MEDIANTE MO DAS ESTRUTURAS CELULARES

PRESENTES NA CASCA DO CACAU. FONTE: A Autora (2017). a. Distribuição das células
vegetais (4x); b. Corte longitudinal de um vaso condutor (4x); c. Feixe de estruturas traqueais
espiraladas (10x); d. Feixe de estruturas traqueais pontoadas (10x); e. Estruturas traqueal espiralada
conservada(10x); f. ) Estrutura traqueal espiralada alongada produto da ação do NaOH (10x).
b.
a.
c. d.
e. f.

FIGURA 19. CONTINUAÇÃO. IDENTIFICAÇÃO MEDIANTE MO DAS ESTRUTURAS

CELULARES PRESENTES NA CASCA DO CACAU g. Distribuição das células vegetais (10x); h.
Distribuição das células vegetais alteradas produto da ação do NaOH (10x)
g. h.
É interessante observar a conformação desta estrutura e a capacidade de alongamento que

possui, demonstrando sua resistência mecânica e flexibilidade para cumprir as funções dentro do
tecido vegetal. Na Figura 19 (f), encontra-se esta mesma estrutura, mas desta vez alterada uma vez
que foi submersa na solução de NaOH. Estas mesmas estruturas foram achadas mediante análise de
microscopia eletrônica de varredura, o que permitiu verificar, mediante a aplicação das duas
técnicas, maiores detalhes sobre cada uma. Tal fato propiciou a comparação do efeito que os
tratamentos exercem sobre a estrutura vegetal, além de permitir abstrair as etapas pelas quais passa
o material antes da obtenção do hidrolisado. A coloração permitiu diferenciar qualitativamente a
distribuição da lignina e a celulose nas estruturas vegetais da casca. A safranina possibilita
identificar a presença de lignina enquanto que o azul de Astra facilita o reconhecimento da celulose
(Cutler et al., 2007). Como é explicado por Chung et al., (2008) a lignina presente no fruto está
associada covalentemente com os polissacarídeos da parede celular e encontram-se, principalmente,
nas fibras do floema e nos condutos impermeáveis do xilema. Estes são encarregados pelo
transporte de água e sendo um suporte estrutural. Estes condutos estão conformados, entre outro
tipo de células, pelas estruturas traqueais que podem apresentar por sua vez, conformações anelais,
espiraladas, reticulada ou pontoada. Este mesmo autor determinou que este tipo de elementos
traqueais encontram-se conformados por 36,1 ± 0,3% de lignina. Na Figura 19 (e - h), realizou-se a
descoloração das amostras seguida com uma coloração com safranina para identificar as estruturas
descritas por Chung et al., (2008) com maior facilidade. Na Figura 19 (g) observa-se a distribuição
das células vegetais que conformam a casca do cacau tal e como recebida e na Figura 19 (h) é

possível observar o efeito que o hidróxido de sódio exerce sobre as paredes celulares expandindo
estas e alterando a distribuição nativa.
4.1.3.2. Determinação da morfologia por Microscopia Eletrônica de Varredura -

MEV
Análises de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) foram realizadas para amostras

sem e com pré-tratamento básico-enzimático. Na Figura 20 (a1) é exibida a micrografia obtida
mediante microscopia eletrônica de varredura em aumento de 50x, da casca de cacau após da
ruptura mecânica feita com moinho de rotor de facas.
FIGURA 20. MICROGRAFIA POR MEV DAS AMOSTRAS DE CASCA
DE CACAU
a1. Casca sem tratamento (50x); a2. Casca sem tratamento (1.000x); a3. Casca sem
tratamento (2.000x); b1. Casca pré-tratada alcalinamente (50x).

FIGURA 20. CONTINUAÇÃO. MICROGRAFIA POR MEV DAS

AMOSTRAS DE CASCA DE CACAU. b2. Casca com pré-tratamento básico-
enzimático (500x); b3. Casca com pré-tratamento básico-enzimático (3.000x).


Observam-se fragmentos irregulares, com aspecto fibroso e poroso. A observação deste
mesmo material em um aumento de 1000x (Figura 20 (a2)), apresenta uma superfície externa
compacta e rugosa com presença de alguns grânulos de material particulado resultante do processo
de moagem. Já com um aumento de 2000x identifica-se sobre a superfície externa e rugosa da casca
de cacau in natura, o depósito de ceras epicuticulares do fruto (Figura 20 (a3)).
Os resultados das micrografias permitem verificar como o pré-tratamento altera a estrutura

superficial e interna da casca de cacau. Com o pré-tratamento alcalino e posterior tratamento
enzimático, a porosidade superficial das partículas da casca de cacau aumenta com relação ao
material original (Figura 20 (b1)). Na Figura 20 (b2) apresenta-se a visão longitudinal do material
pré-tratado química e enzimáticamente, na qual é possível observar claramente um feixe vascular
exposto devido à ação do pré-tratamento. Na visão longitudinal apresentada na Figura 20 (b3)
observa-se o tecido vascular da casca de cacau, apresentando configuração pontoada e reticulada,
próprias de elementos traqueais do metaxilema e da mesma forma, observa-se uma conformação
estrutural espiralada própria dos elementos traqueais do protoxilema, descrita também no trabalho
de Chung et al., (2008) para a casca do cacau.
4.1.3.3. Determinação do grau de cristalinidade por difração de raios X
A principal aplicação desta técnica é a identificação de compostos cristalinos, sejam eles

inorgânicos ou orgânicos. O índice de cristalinidade indica a quantidade de celulose que se encontra

em estado cristalino, e em consequência a celulose em estado amorfo. Este índice é um dos fatores
importantes para se determinar as propriedades mecânicas dos materiais lignocelulósicos. Para o
presente estudo, esta análise permitiu relacionar o nível de efetividade do tratamento com NaOH
sobre o material e a disponibilidade da fração de celulose amorfa à qual as enzimas teriam acesso
para realizar a respectiva hidrólise.
A Figura 21 mostra o difratograma das amostras de casca de cacau. O índice de

cristalinidade calculado mediante a Equação 13, para a amostra de casca de cacau sem tratamento é
65%, enquanto que para a amostra de casca com pré- tratamento básico o índice é igual a 28% e
para a amostra com tratamento básico enzimático este índice é de 11%.
FIGURA 21. DIFRATOGRAMAS DRX DE AMOSTRAS DE CASCA DE CACAU.

(a) Casca de cacau sem tratamento; (b) Casca de cacau com tratamento básico; (c) Casca de
cacau com tratamento básico-enzimático


No estudo publicado por Maryana et al., (2014) no qual foi realizado o tratamento com
NaOH em bagaço de caca de açúcar, o índice de cristalinidade também apresentou uma queda após
o pré-tratamento. Acredita-se que a redução do índice de cristalinidade, uma vez aplicado o pré-
tratamento, é devido ao efeito que exerce o NaOH na estrutura lignocelulósica, a qual interage e
ocasiona a alteração dos enlaces da lignina, concordando com os resultados expostos por Alvira et
al., (2010). Uma vez modificada a lignina do material, que é a que fornece a rigidez e principal
proteção para este tipo de material, a hemicelulose e a celulose se tornam expostas e vulneráveis à

ação do reagente alcalino, porém o efeito dele sobre estas estruturas é menos drástico. Maryana et
al., (2014) postula que os danos sofridos pela cadeia de celulose como resultado do pré-tratamento,
têm como consequência uma série de rearranjos que alteram a estrutura cristalina da mesma,
tornando-a amorfa e por este motivo o índice de cristalinidade diminui.
Desta forma, os resultados obtidos mediante a análise de difração por raio X para a
determinação do índice de cristalinidade da casca de cacau com tratamento básico e básico-
enzimático, permitiram verificar a efetividade dos mesmos. Em primeiro lugar, a casca pré-tratada
alcalinamente encontra-se corretamente condicionada para o posterior tratamento enzimático, pois a
fração amorfa da celulose aumentou consideravelmente, e de acordo com o argumentado por
inúmeros estudos atuais sobre o tema (e entre eles, o publicado por Park et al., 2012), este fato
permite que a digestibilidade enzimática aumente, possibilitando a recuperação de uma maior
quantidade de açúcares presentes na biomassa. Em segundo lugar, e já com a celulose exposta e
degradada, a enzima agiu sobre esta, clivando diversos tipos de ligações do polímero, para liberar a
glucose, aumentando ainda mais os domínios amorfos da amostra, e em consequência, diminuindo o
índice de cristalinidade.
4.1.3.4. Determinação de grupos funcionais por espectroscopia de infravermelho

(FTIR)

Com o propósito de verificar mudanças químicas ocorridas na casca de cacau após realizar
o pré-tratamento alcalino e o tratamento básico-enzimático, efetuou-se a análise de espectroscopia
comparada com a amostra sem tratamento. Esta técnica permite obter facilmente, informações
diretas sobre os grupos funcionais que integram o material estudado. Os resultados para a casca de
cacau sem tratamento e submetida a pré-tratamentos, são apresentados na Figura 22.
Os espectros obtidos para as três amostras permite evidenciar a complexidade da

composição da biomassa estudada, pois é identificada uma gama de grupos funcionais que
comumente constituem o material lignocelulósico, como por exemplo, C-H, C-O, C=O, O-H, C-O-
C. Utilizando como referência as tabelas de análise de espectros FTIR reportadas por Silverstein et
al., (2005), descreve-se a seguir os resultados obtidos para as amostras observadas.
Na Figura 22 (a), na região entre 3600 até 3000 cm-1 (atribuídas à vibração de estiramento
grupos OH), na amostra sem tratar (linha azul), a banda é larga e intensa. Nas amostras com pré-
tratamento, apresentaram-se alterações que atuaram diretamente nestes grupos fazendo que a

intensidade desta região diminuísse consideravelmente. Na região entre 2925–2885 cm-1 é possível
verificar a presença de duas bandas pouco intensas e estreitas atribuídas ao estiramento simétrico e
assimétrico das ligações C-H dos grupos CH3, CH2 e CH, conforme também observado por Tinwala
et al (2015).
FIGURA 22. ESPECTROSCOPIA POR INFRAVERMELHO DAS AMOSTRAS DE CACAU.

(a)Espectroscopia por infravermelho entre 3800-500 cm-1, das amostras de casca de cacau sem e com pré-
tratamento. (b) – Espectro de FTIR das amostras de casca de cacau entre 1850-600 cm-1
a.
b.
A região entre 1800 e 900 cm-1 é conhecida como a “impressão digital” e aqui é possível
identificar as diferenças mais importantes entre as amostras e com o proposito melhorar a análise

dos resultados, esta região foi ampliada (Figura 22 (b)). Primeiramente na região de 1735 cm-1 é
observada, para a amostra sem tratar (linha azul) uma banda estreita e de média intensidade, e na
mesma região para as outras amostras, esta banda é sutil. As alterações nesta região são atribuídas
ao grupo carbonila não conjugado das hemiceluloses (Xu et al., 2013). Na região compreendida
entre 1700 e 1500 cm-1 (atribuída aos grupos C=O e C=C) é possível verificar que a amostra sem
tratamento existe uma banda larga e intensa quando comparada com as amostras com tratamento;
ocorre ainda outro fenômeno: na amostra pré-tratada alcalinamente (linha verde) não há definição
de ligações específicas, embora existam sutis picos para o tratamento básico-enzimático (linha
vermelha) e na amostra sem tratar. A amostra com pré-tratamento básico apresenta um pico em
1504 cm-1 e a amostra com pré-tratamento básico enzimático em 1508 cm-1, que pode ser atribuído
as vibrações C=C de anéis aromáticos presentes na lignina. Na região de 1440-1184 cm-1 aparecem
alterações originadas com os pré-tratamentos, e atribuídas à deformação dos grupos C-H, O-H de
celuloses, hemiceluloses e ligninas. Para a amostra com pré-tratamento básico na região de 1215
cm-1 aparece uma banda característica do estiramento das ligações C-C e C-O da lignina. Na região
de 1184 a 960 cm-1 a banda é muito mais larga para a amostra sem tratar quando comparada com as
amostras com pré-tratamento, o que corresponderia ao estiramento assimétrico das ligações C-O-C
de celuloses e hemiceluloses. Para as amostras com pré-tratamentos, na região de 893 cm-1 aparece
uma banda definida e com intensidade média, que corresponde à alteração das ligações glicosídicas.
Finalmente na região de 675 cm-1 para as três amostras, é evidenciada a vibração de torção de =C-
H.
Em resumo, comparando os espectros obtidos é possível ratificar o efeito dos pré-
tratamentos sobre a casca de cacau, pois as bandas que inicialmente apareciam no material sem
tratar foram alteradas, o que significa que ocorreram novas ligações e rompimento de enlaces
originais. Segundo a literatura, o pré-tratamento alcalino age sobre as estruturas conformadas por
lignina e polissacarídeos presente no material lignocelulósico (Garima et al., 2014) o que para este
estudo é de grande importância pois a diminuição da recalcitrância do material, gerada em grandes
quantidades pelo conteúdo de lignina, facilita posteriormente a acessibilidade da enzima aos
compostos celulósicos.
4.1.3.5. Determinação das propriedades térmicas mediante análises

termogravimétricas (TG/dTg)
A termogravimetria, segundo o explicado por Earnest (1988), é uma técnica na qual, a

variação da massa de uma substância é continuamente monitorada em função da temperatura (ou
tempo) mediante o controle da atmosfera e da temperatura. Esta técnica é rápida, precisa e

reprodutível para a determinação das temperaturas e as taxas de reação derivadas das mudanças da
massa do material analisado. Nas curvas termogravimétricas (ou simplesmente curvas TG)
resultantes da análise, observa-se o perfil de decomposição térmica do material em diferentes etapas
e encontra-se diretamente relacionada com compostos específicos, que para o caso da biomassa
vegetal, estariam classificados como hemicelulose, celulose e lignina. Na Figura 23 são
apresentadas as curvas TG obtidas para as amostras de casca de cacau in natura (linha azul), para a
casca de cacau pré-tratada com NaOH (linha verde) e para a casca de cacau com pré-tratamento
básico enzimático (linha laranja) e suas respectivas derivadas (dTG).
FIGURA 23. CURVA TERMOGRAVIMÉTRICA DAS AMOSTRAS DE CASCA DE CACAU

SEM E COM PRÉ-TRATAMENTO BÁSICO
Na Figura 23, para cada curva TG das amostras de casca de cacau é possível identificar
três eventos térmicos, característicos de material lignocelulósico. No caso do termograma da casca
in natura (linha azul), o primeiro evento térmico (Zona 1) de degradação da amostra, pode ser
observado entre 29ºC e 125ºC. Nesta faixa, ocorre perda de massa relacionada com a evaporação
dos compostos voláteis de baixa massa molar e da água adsorvida. Na região compreendida entre
125ºC e 500°C encontra-se o segundo e mais importante evento térmico (Zona 2), onde é gerada a
degradação ou despolimerização dos compostos de hemicelulose, celulose e lignina e que
corresponde com a maior perda de massa (Chen et al., 2015). Para esta amostra a porcentagem de

variação de massa corresponde aproximadamente a 64%. Perto de 500°C e até 800°C, o material é
transformado em cinzas. Durante este último evento térmico (Zona 3) é possível localizar a
degradação total do material, resultando em óxidos ou cinzas dos elementos inorgânicos que
constituem o material. O material residual para esta amostra corresponde a 28,1%.
Na curva TG da amostra de casca de cacau com pré-tratamento básico (linha verde),

observa-se que o processo de degradação, possui os três mesmos eventos térmicos. O primeiro deles
(Zona 1) apresenta-se na região entre 34°C – 152°C onde é possível determinar a perda de voláteis
(água adsorvida, água absorvida e voláteis de baixa massa molar). A segunda região (Zona 2)
compreendida entre 152°C e 500°C corresponde à degradação ou despolimerização das frações
lignocelulósicas com uma perda aproximada de massa de 54%. Finalmente (Zona 3) a degradação
total do material tem lugar entre 500ºC e 800ºC, onde a amostra é transformada em material
inorgânico e com uma porcentagem residual de 34,9.
A curva TG obtida para a amostra de casca de cacau com pré-tratamento básico-

enzimático (linha laranja), apresenta o primeiro evento térmico (Zona 1) entre 20°C – 120ºC onde é
identificada a perda de compostos voláteis. A segunda região (Zona 2) compreendida entre 120ºC e
500°C corresponde à degradação ou despolimerização das frações lignocelulósicas com uma perda
aproximada de massa de 59%. Finalmente, entre 500ºC e 800ºC observa-se a degradação total do
material (Zona 3) onde a amostra é transformada em material inorgânico correspondente a 32,5% do
material inicial de análise.
Como foi identificado em cada curva TG e segundo a informação exposta no Quadro 5, a
maior perda de massa corresponde a amostra sem pré-tratamento.
QUADRO 5. TEMPERATURAS DE DEGRADAÇÃO DA ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA DAS

AMOSTRAS DE CASCA DE CACAU.
Temperaturas de degradação (ºC)

Amostra de casca de cacau Perda de
Zona I Zona II Zona III
massa (%)
In natura 29 – 125 125 – 500 500 – 800 71,9
Tratamento básico 34 – 152 152 – 500 500 – 800 65,1
Tratamento básico-enzimático 20 - 120 120 - 500 500 - 800 67,5
Comparando esta amostra com o material pré-tratado e como esperado, a perda de massa é
maior, pois parte do material foi previamente retirado com os processos químicos e biológicos
respetivamente efetuados sobre o material analisado. Na Figura 21 também é possível identificar

através de cada um das derivadas geradas (linhas descontínuas) para as amostras com pré-
tratamento, alterações durante o processo de degradação. No caso do pré-tratamento alcalino com
NaOH (linha descontínua verde), observa-se a surgimento de um “ombro” entre as temperaturas
260°C - 270ºC o que se supõe, poderia corresponder a degradação de material residual depositado
na amostra de casca e relacionado com o hidróxido de sódio. No caso da amostra da casca com pré-
tratamento básico-enzimático entre 200°C e 250ºC este mesmo “ombro” é observado e
possivelmente poderia associar-se com a presença de resíduos dos compostos da formulação
enzimática utilizada para o pré-tratamento.
O resultado desta análise permite concluir que a estabilidade térmica das amostras de
casca de cacau é afetada pelos tratamentos tanto básico como básico-enzimático quando
comparados com a casca de cacau in natura.
4.1.3.6. Determinação de parâmetros físico-químicos
Os resultados da determinação dos parâmetros físico-químicos: pH, atividade de água

(aw), umidade, cinzas, quantificação de açúcares, íons e proteínas obtidos para a casca de cacau in
natura foram realizados logo após a chegada da matéria prima. Estes estão apresentados na Tabela
11. O extrato aquoso da casca de cacau apresentou um pH de 6,18 e a casca de cacau uma atividade
de água após a secagem igual a 0,283 ± 0,004, o que permite armazenar o material em condições
herméticas, sem correr o risco de crescimento de microrganismos. Os sólidos totais da casca,
quantificados em 96,79 ± 0,3 e a umidade determinada em 3,21 ± 0,3, correspondem, por uma parte
à quantidade de sólidos remanescentes após aquecimento da amostra a 105ºC até massa constante.
Por outra parte, o teor de umidade é uma medida da quantidade de água (e outros componentes
volatilizados a 105ºC) presente na amostra de casca de cacau. As cinzas correspondem ao material
inorgânico (principalmente minerais) residual contido na amostra após incineração a 575ºC.


Nas referências disponíveis na Tabela 1, o conteúdo de cinzas encontram-se numa faixa

entre 6,7 e 13,5% e para este estudo o teor de cinzas foi de 10,98 ± 0,25 %. Os açúcares totais aqui
apresentados foram quantificados pelo método de DNS e correspondem a um valor de 12,95 ± 0,55
(g/100gbs). Vriesmann et al., 2011 por sua vez reportou os dados de açúcares redutores presentes na
casca de cacau com um valor de 10,4 ± 0,7 (g/100gbs), enquanto que para este trabalho
corresponderam a 4,62 ± 0,005 (g/100gbs). As proteínas quantificadas neste estudo correspondem a
5,15 ± 0,05 g/100g(bs), valor que está próximo aos valores reportados na literatura que estão na faixa
de 4 -10 g proteína/100g(bs).
4.1.3.7. Determinação de carboidratos estruturais e lignina

Na Tabela 12, são apresentados os resultados obtidos para a quantificação de lignina e
carboidratos estruturais presentes na casca de cacau antes e depois do pré-tratamento. Em geral,
após do tratamento básico, a presença de compostos como lignina, extraíveis e resíduos ácido
insolúveis, diminuíram consideravelmente. Este resultado é coerente, considerando que para a
obtenção do material, após da moagem, a casca (fração sólida) inicialmente deve ser tratada com
NaOH e posteriormente passar por sucessivas lavagens. Em cada uma destas etapas, o material
passa por modificações estruturais e alterações na composição, o que é refletido nos resultados aqui
obtidos.
TABELA 12. RESULTADOS DE QUANTIFICAÇÃO DE LIGNINA E CARBOIDRATOS
ESTRUTURAIS PRESENTES NAS AMOSTRAS DE CASCA DE CACAU ANALISADAS

A prévia quantificação de lignina e segundo a norma NREL/TP-510-42618, a biomassa

deve ser condicionada retirando os compostos extraíveis. Segundo a norma NREL/TP-510-42619 os
extraíveis podem ser definidos como “...o material presente na biomassa que é solúvel em água ou
etanol durante a extração exaustiva. Os extraíveis incluem componentes não-estruturais da
biomassa que poderiam interferir em análises posteriores”.
A quantificação deste material foi realizada utilizando os solventes éter, etanol e água.
Determinou-se importante empregar estes solventes, pois cada um deles consegue retirar compostos
de diferente natureza. O éter de petróleo permite retirar compostos não polares como os óleos
vegetais; o etanol solubiliza material como clorofila, ceras, taninos ou outros componentes menores
e a água permite remover material inorgânico, açúcares não estruturais, material nitrogenado entre
outros compostos. Da casca de cacau in natura foi extraído um total de 27,86% de compostos
extraíveis, enquanto que da casca submetida ao pré-tratamento básico foi extraído só 2,43%, o que,
como já foi explicado, era de se esperar, pois os compostos inicialmente contidos na casca sem
tratar, foram progressivamente retirados em cada uma das etapas do tratamento aplicado.
A efetividade do processo é demonstrada com uma variação de 19% entre o material
original e o material pré-tratado, passando de 26,2% para 21,2% respectivamente. A redução da
presença de lignina após do tratamento é atribuída à ação do hidróxido de sódio sob as condições
estabelecidas, que permitiram mediante o processo de saponificação, como é relatado na literatura, a
ruptura de ligações intermoleculares de tipo éster que se encontram articulando a lignina e parte da
hemicelulose (Chiaramonti et al., 2012). As referências bibliográficas reportadas na Tabela 1 têm
reportado faixas entre 14 e 26% no conteúdo de lignina para a casca de cacau, portanto o resultado
obtido concordaria com estudos prévios, mas não tendo referências previas sobre a efetividade do
pré-tratamento básico efetuado sobre este material, a redução de 19% do conteúdo de lignina, seria
um dado inicial à espera de ser verificado em estudos posteriores.
A análise de carboidratos estruturais das amostras permitiu identificar glucose, xilose e
celobiose (este último açúcar é um indicador de hidrólise incompleta) mediante a leitura no HPLC.
Para a casca sem tratar a porcentagem de carboidratos estruturais foi de 16,25% enquanto que foi
quantificado 45,5% para casca de cacau após o pré-tratamento, e segundo os açúcares identificados,
foi a glucose que contribuiu em maior medida a este importante incremento (Tabela 10). Este fato
ratifica a efetividade do tratamento básico, pois cumpriu-se o propósito de reduzir o conteúdo de
lignina e aumentar a porosidade do material para a posterior ação da lignina.
O resumo da análise composicional da casca de cacau tratada alcalinamente e in natura
apresentada na Tabela 12, incluiu outros itens, que correspondem à fração de compostos que não
foram quantificados neste estudo. Análises como a determinação da porcentagem de acetato, de

acetil, de ácido levulínico, de ácidos urónicos e hexaurônicos não foram efetuadas. Recomenda-se
para futuros estudos, incluir a quantificação de outros compostos que permitam conhecer essa
porcentagem de forma desagregada.

4.2. CAPÍTULO 2. PRODUÇÃO DE ÁCIDO PROPIÔNICO A PARTIR

DO HIDROLISADO DO PRÉ-TRATAMENTO QUÍMICO E ENZIMÁTICO
DA CASCA DE CACAU
4.2.1. Escolha do microrganismo para produção de ácido propiônico
Do banco de cepas do PPGEBB foram selecionadas as cepas de Propionibacterium,

avaliando-se as nove disponíveis e utilizando um meio de reativação e, posteriormente um meio
para a preparação do pré-inóculo e um meio de fermentação sintético, tal e como foi descrito na
seção 3.6. O critério de seleção dos microrganismos foi a produção de AP. Os resultados são
apresentados na Tabela 13.
TABELA 13. SCREENING DAS CEPAS DE PROPIONIBACTERIUM PARA PRODUÇÃO DE AP

Entre as nove cepas ensaiadas, só duas delas conseguiram adaptar-se e produzir AP. Desta
forma, nas etapas posteriores foram utilizadas as cepas pertencentes as espécies P. freudenreichii
spp. shermanii ATCC 9614 (C6) e P. jensenii DSM 20274 / ATCC 4964 (C7) as quais produziram
3,82 e 4,99 g·L-1 de AP respectivamente após de 48 h de incubação em meio sintético (Tabela 14).
Depois de desenvolver diferentes processos de fermentação com as duas cepas selecionadas
inicialmente, a cepa P. jensenii DSM 20274 / ATCC 4964 (C7) apresentou sempre as produções de
AP com maiores concentrações no meio e menor geração de subprodutos como ácido succínico
(AS), ácido acético (AA) e maior consumo de glicerol. Por este motivo, decidiu-se continuar o
estudo com a cepa de P. jensenii DSM 20274 / ATCC 4964 (C7) (Figura 24).

FIGURA 24. COLORAÇÃO DE GRAM PARA PROPIONIBACTERIUM JENSENII DSM

20274 (C7). OBJETIVA DE IMERSÃO (1.000x).

Inicialmente, utilizando a cepa selecionada, foi desenvolvida uma prova simples de

fermentação do extrato aquoso da casca de cacau. Com o propósito de verificar se o microrganismo
era capaz de produzir AP a partir do extrato, foi adicionado glicerol 7,5 g·L-1 e extrato de levedura
10 g·L-1 e foi inoculado em uma taxa de 10% (v/v) e incubado durante 48 h. A análise efetuada
sobre o caldo após do tempo de incubação, demostrou que a produção de AP foi de 0,88 g·L-1.
Assim, foi comprovado que o extrato aquoso da casca de cacau por si só, não é um meio adequado
para o desenvolvimento e produção de AP. Acredita-se que uma das características do extrato
aquoso que poderia ter dificultado o desenvolvimento do microrganismo, é a importante
viscosidade observada que este possui, atribuída a presença de pectina.
4.2.2. Otimização da produção de ácido propiônico em meio com hidrolisado

obtido a partir do pré-tratamento básico enzimático da casca de cacau

Uma vez reativadas e identificadas as cepas capazes de produzir AP em meio sintético,
procedeu-se à utilização do hidrolisado de casca de cacau como parte do meio de fermentação. Em
primeiro lugar, estabeleceu-se um planejamento experimental do tipo Plackett & Burman para a
definição dos compostos necessários para produção de AP. Em segundo lugar, foi otimizada a
relação carbono/nitrogênio do meio de fermentação, para definir qual seria a melhor proporção das
fontes de carbono, pois utilizou-se glicerol além dos açúcares presentes no hidrolisado obtido a
partir da casca do cacau.

4.2.2.1. Planejamento experimental Plackett & Burman (P&B): sais necessários ao

meio

Baseando-se nos resultados apresentados por P. Harada (2012), que definiu que os sais do
meio de pré-inóculo não possuíam influência significativa na produção de biomassa para as mesmas
nove cepas de Propionibacterium avaliadas neste projeto, decidiu-se realizar um experimento para
verificar estes resultados, mas desta vez investigaram-se o meio de pré-inóculo e o meio de
fermentação com o hidrolisado de casca de cacau. Sendo assim, foi inicialmente mensurada a
adaptação da cepa C7. Em seguida, delineou-se um experimento P&B com 7 variáveis
(correspondentes aos sais) e 3 pontos centrais, resultando em 11 ensaios (Tabela 14), por meio do
qual foi possível verificar o efeito de cada componente individualmente sobre a produção de AP
pela cepa C7.
TABELA 14. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS - INFLUÊNCIA DE

COMPONENTES ADICIONADOS AO MEIO PARA A PRODUÇÃO DE AP
Os resultados do efeito dos componentes avaliados sobre a produção de AP estão expostos

na Figura 23. Com estes resultados e segundo a análise de variância, concluiu-se que os sais
empregados para a produção de AP (NH4)2HPO4, KH2PO4 e CaCl2 possuem significância estatística
(p=0,05). Por um lado, os sais (NH4)2HPO4 e KH2PO4, apresentaram uma influência negativa sobre
a produção sob as condições testadas, pois o valor negativo do efeito estimado ultrapassou a linha
de significância (p=0,05). Por outro lado, com um nível de significância de 95% a adição do sal
CaCl2 resultou ser importante para a produção de AP.

FIGURA 25. DIAGRAMA DE PARETO–INFLUÊNCIA DE COMPONENTES ADICIONADOS AO

MEIO PARA A PRODUÇÃO DE AP
(1)(NH4)2PO4 -4,8949
(4)CaCl2 3,890915
(2)KH2PO4 -3,24701
(3)MgSO4 ,4812358
(6)MnSO4 -,468879
(5)CoCl2 ,4094125
(7)FeSO4 ,2076506
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Considerando que o meio de fermentação estava conformado, entre os outros compostos,

pelo hidrolisado da casca de cacau pré-tratada, o resultado mostrando que é recomendável reduzir a
adição do sal (NH4)2HPO4 é coerente com os dados obtidos na caracterização realizada para o
hidrolisado. Como foi apresentado na Tabela 9, o conteúdo do íon NH4+ no hidrolisado é
equivalente a 0,65 g·L-1, que comparado com a composição do meio, no qual são adicionadas 2 g·L-
1
deste sal no meio permite concluir que o hidrolisado por si só, já está suprindo as necessidades
mínimas do microrganismo para este sal. Este mesmo fato ocorre com o sal KH2PO4, pois o
hidrolisado já contém o cátion K+ em uma concentração de 0,025 g·L-1, e o ânion de PO-34 em uma
concentração de 0,03 g·L-1 o que explica o fato da adição destes compostos não ser necessária.
Como resultado, o meio que foi utilizado para os próximos estudos teve a seguinte
composição: glicerol 7,5 g·L-1; glucose (do hidrolisado de casca de cacau) 7,5 g·L-1 (obtido
conforme item 3.4.1 e 3.4.2); extrato de levedura 10 g·L-1 e o sal CaCl2 0,01 g·L-1.
4.2.2.2. Planejamento experimental DCCR: otimização das concentrações das fontes

de carbono e nitrogênio (relação C/N)

Na sequência, foram determinadas as concentrações ótimas das fontes de carbono, glicerol
e glucose (proveniente do hidrolisado), e a concentração da fonte de nitrogênio (que para este caso é
o extrato de levedura), com o propósito de proporcionar os nutrientes adequados para o melhor
desempenho da cepa C7 durante a produção do AP. Assim, implementou-se o delineamento
composto central rotacional-DCCR 23 com três variáveis e três pontos centrais, resultando em
dezenove experimentos, onde a variável resposta foi a concentração de AP obtida após da

fermentação (Tabela 5 (a)). Considerando o conteúdo e concentrações das fontes de carbono e

nitrogênio para o meio de cultivo sintético (Tabela 3 na seção de 3.5.3), determinaram-se as
concentrações de glicerol, de hidrolisado e de extrato de levedura para este experimento, e que
foram apresentadas na seção de materiais e métodos (Tabela 5 (b.)).
Os resultados do planejamento experimental DCCR sobre o estudo da influência das
concentrações das fontes de carbono e nitrogênio, são apresentados na Tabela 15 e representados no
diagrama de Pareto (Figura 26 (a.)) e na superfície de resposta gerados (Figura 26 (b.)). Para este
experimento foi realizado um controle de fermentação com o meio composto por glicerol 7,5 g·L-1;
glucose (do hidrolisado de casca de cacau) 7,5 g·L-1, extrato de levedura 10 g·L-1 e o sal CaCl2 0,01
g·L-1, com uma concentração de AP igual a 1,90 g·L-1.
TABELA 15. RESULTADOS DCCR PARA A OTIMIZAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DAS

FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO
As maiores concentrações de AP alcançadas (entre 1,86 g·L-1 e 2,30 g·L-1) foram obtidas
para os pontos centrais do planejamento experimental, que correspondem a uma concentração de 8
g·L-1 de glucose proveniente do hidrolisado da casca de cacau, 32 g·L-1 de glicerol e 10 g·L-1 de
extrato de levedura. Para os pontos centrais a relação C/N é de 4:1. Outros estudos já têm utilizado
esta relação C/N usando glicerol ou glucose, junto com extrato de levedura (Dishisha et al., 2012;
Zhang et al., 2015). Por outro lado, a menor concentração de AP (0,68 g·L-1 ) apresentou-se para
uma relação C/N 8:1. O estudo que até agora, reporta a maior relação C/N foi elaborado por Liu et
al., 2012 e correspondeu a 5:1.

FIGURA 26. DCCR – ESTUDO DA INFLUÊNCIA DAS CONCENTRAÇÕES DAS FONTES

DE CARBONO E NITROGÊNIO. a. Diagrama de Pareto – Efeitos das concentrações de fontes de
carbono e nitrogênio sobre a produção de AP; b. Superfície de Resposta – DCCR – Estudo da influência das
concentrações das fontes de carbono e nitrogênio (Glucose x Extrato de levedura).
a.
b.
No diagrama de Pareto é possível verificar que com um nível de significância de 95% as

três variáveis estudadas possuem um efeito sobre a produção de AP, devido a que diminuem a
concentração do produto quando são incrementadas as concentrações dos compostos avaliados, e
quando usada a menor concentração dos compostos favoreceu-se o aumento da produção da
biomolécula. Mediante o diagrama de Pareto, também é possível verificar que a única interação
entre as variáveis que é significativa, é a concentração de glucose e a concentração de extrato de
levedura, ocasionando um efeito positivo sobre a produção de AP. Com estes resultados, a próxima

etapa de experimentos foi a definição da melhor concentração da glucose (proveniente do

hidrolisado) e do glicerol, mantendo-se a relação C/N identificada nesta etapa.
4.2.2.3. Efeito da concentração das fontes de carbono
Uma vez conhecida que a relação C/N ótima para a produção de AP é de 1:4, procedeu-se
verificar se incrementando a quantidade de carbono presente no meio (mantendo a relação C/N de
4:1), a produção de AP conseguia ser incrementada na mesma proporção. Desta forma, para o total
das fontes de carbono adicionadas no meio analisaram-se as concentrações de 40 g·L-1, 80 g·L-1 e
110 g·L-1. Seguindo a metodologia proposta na seção 3.6.1.4, obtiveram-se os dados apresentados
na Tabela 16.
TABELA 16. RESULTADOS DA VARIAÇÃO NA CONCENTRAÇÃO DAS FONTES DE
CARBONO
A análise dos resultados permite determinar que em resumo, a melhor condição é a

nomeada como Experimento 1 (Tabela 16) para a produção de AP. Nesta condição é utilizada uma
concentração de 8 g·L-1 da glucose proveniente do hidrolisado da casca de cacau e uma
concentração de 32 g·L-1 para o glicerol. A concentração de AP obtida com estas concentrações, foi
de 4,20 ± 0,07 g·L-1 e um rendimento de 0,47 g AP/g de substrato. O rendimento aqui obtido,

encontra-se próximo do reportado como teóricos por Parizzi et al., (2012) com 55% de rendimento
quando produzido a partir de glucose exclusivamente, o que pode ser considerado como um
parâmetro guia para este trabalho. A concentração e rendimentos de AP para os experimentos 2 e 3
são a metade em relação com a obtida no experimento 1, nos quais a produção foi de 2,12 ± 0,04
g·L-1 (rendimento de 0,20 g AP/g de FC) e 1,34 ± 0,25 g·L-1 (rendimento de 0,08 g AP/g de FC)
respectivamente. Este fato pode ser atribuído às elevadas concentrações de compostos no meio
(identificada a partir de 80 g·L-1 da fonte de carbono e 20 g·L-1 de extrato de levedura) o que poderia
ter ocasionado uma certa repressão ou intolerância do microrganismo nesta condição.
Com relação à variação do pH no meio de fermentação, o Experimento 1 apresentou
menor pH final com um valor de 4,34 ± 0,01 e a biomassa final atingiu um total de 1,53 ± 0,2 g·L-1
que para o caso, não é a maior concentração de todos os experimentos, como sim o é para o
experimento 2 com um total de 1,61 ± 0,04 g·L-1 de biomassa.
Analisando o consumo da origem da FC, é no experimento 1 onde o consumo de glucose
proveniente do hidrolisado é a maior com 18,14 ± 0,01% e um consumo de glicerol igual a 23,60 ±
0,004% que comparado com os experimentos 2 e 3 resulta ser a maior.
No que se refere a geração de subprodutos, os experimentos 2 e 3 apresentam as maiores
concentrações tanto para o AS (0,83 ± 0,57 g·L-1 e 0,45 ± 0,02 g·L-1 respectivamente) quanto para o
AA (0,24 ± 0,04 g·L-1 e 0,27 ± 0,10 g·L-1 respectivamente) em comparação com o experimento 1
que gerou 0,35 ± 0,01 g·L-1 de AS e 0,18 ± 0,04 g·L-1 de AA. Verificando assim, que quando a
concentração das fontes de carbono aumenta, em consequência a concentração dos subprodutos,
também aumenta como é possível verificar nos experimentos 2 e 3 (Tabela 16).
Com os resultados aqui apresentados e tendo como principais critérios de seleção, a
quantidade de AP produzido e o rendimento obtido, além da porcentagem de glucose (proveniente
do hidrolisado de cacau) consumida, o Experimento 1 é o que forneceu os melhores resultados e
para tanto foram estas as condições com as quais foram planejados os experimentos posteriores.
Conhecendo que o consumo de glicerol no experimento apresentado na Tabela 16, foi no
máximo de 23,6% efetuou-se um experimento adicional com o propósito de determinar se
modificando a relação das fontes de carbono, que para o experimento anterior correspondeu a uma
relação 1:4 (1 g·L-1 de glucose para cada 4 g·L-1 de glicerol), conseguia-se simultaneamente
incrementar o consumo do microrganismo destes substratos, sem afetar a produção de AP. Assim,
foi avaliada a relação 1:3 para as fontes de carbono, mantendo a relação C/N de 1:4, previamente
estabelecida. Os resultados desta prova encontram-se na Tabela 17.

TABELA 17. PRODUÇÃO DE AP UTILIZANDO UMA RELAÇÃO DE FONTES DE CARBONO DE

1:3 (GLUCOSE: GLICEROL)
Neste caso, a produção de AP foi de 4,09 ± 0,13 g·L-1 com um rendimento de 0,43 g AP/
g de substrato. Comparativamente, o resultado do experimento anterior, a concentração foi igual a
4,20 ± 0,07 g·L-1 de AP com um rendimento de 0,47 g AP/ g de substrato, pelo que a geração do
produto se mantem relativamente constante. Enquanto ao consumo das fontes de carbono, a
utilização do glicerol por parte do microrganismo passou a ser 28,85%, quando previamente tinha
atingido um total de 23,6% pelo que é evidente que a redução da relação das fontes de carbono
contribui com o maior consumo de glicerol. Não obstante, é importante ver que o consumo da
glucose foi reduzido de forma importante passando de 18,14 ± 0,01% no experimento anterior, para
7,69 ± 0,08% quando usada uma relação menor das fontes de carbono. Devido a que o principal fim
é o aproveitamento da glucose proveniente do hidrolisado para a obter as melhores produções de
AP, para os próximos experimentos decidiu-se manter a relação 1:4 para as fontes de carbono
glucose e glicerol no meio de fermentação.
4.2.2.4. Determinação da melhor condição de incubação: estática ou agitada
Aproveitando a características da cepa Propionibacterium jensenii DSM 20274 (C7) de ser

anaeróbia facultativa, avaliou-se o desenvolvimento do microrganismo sob condições de agitação
branda (50 rpm) e moderada (100 rpm), com o propósito de avaliar a influência desta variável sobre
a produção de AP. Após o período de incubação ainda em tubo de 21 mL e utilizando meio

sintético, nas condições relatadas na seção 3.6.1.3. obtiveram-se os resultados de produção de AP,
biomassa e subprodutos apresentados na Tabela 18.
TABELA 18. COMPARAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA AGITAÇÃO SOBRE PRODUÇÃO DE AP EM

MEIO SINTÉTICO E TUBOS DE 21 ML
Ocorreu um aumento de 30% na concentração de AP (passando de 2,87 ± 0,04 g·L-1 para

4,1087 ± 0,07 g·L-1) quando aplicada agitação de 50 rpm. Considera-se que a condição de agitação
branda, propicia uma melhor homogeneização e suspenção celular com a melhoria das
transferências de massa, sem promover a aeração, além de levar a menores concentrações dos
subprodutos, comparado com a condição com agitação de 100 rpm. Porém, a biomassa nesta
condição (0,24 ± 0,1 g·L-1) apresentou uma queda significativa, sendo que em 100 rpm a produção
de biomassa foi de 0,51 ± 0,13 g·L-1 o que pode estar relacionado com a preferência metabólica pelo
desenvolvimento de biomassa. Contudo, o rendimento não se viu afetado negativamente na
condição com 50 rpm, o que permitiu empregar esta condição em próximas etapas de fermentação
em volumes maiores, com o propósito de evitar a acumulação ou sedimentação de material durante
o processo.
4.2.2.5. Fermentação em frasco do tipo Schott de vidro de 100 mL
Em seguida considerou-se o aumento de escala para o processo de fermentação passando

de frascos de 21 mL de capacidade para frascos do tipo Schott de vidro de 100 mL. Esta etapa foi
desenvolvida com agitação branda (50 rpm), e as demais condições já citadas na seção 3.6.1.3.
Desta vez, foi utilizado o hidrolisado obtido da casca de cacau pré-tratada química e
enzimáticamente. Os resultados são apresentados na Tabela 19. Tanto a concentração quanto o
rendimento de AP em substrato apresentaram melhores resultados quando realizada a fermentação
em frascos Schott de vidro de 100 mL obtendo uma concentração final de 5,06 ± 0,6 g·L-1
comparados com 4,20 ± 0,07 g·L-1 obtidos no tubo de 21 mL (aumento de 17%). Com um volume
maior o rendimento de AP melhorou, e as concentrações de subprodutos não aumentaram
significativamente, como é desejado neste tipo de fermentação.

TABELA 19. COMPARAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA ESCALA NA PRODUÇÃO DE AP COM

MEIO COM HIDROLISADO DE CASCA DE CACAU E 50 RPM
É importante destacar que, quando o volume de fermentação aumentou (de 21 mL para

100 mL), o consumo de glucose aumentou 60% enquanto que, o consumo de glicerol diminuiu
38%.
Posteriormente, e uma vez conhecidas as melhores condições de processo, uma cinética de
produção de AP foi conduzida durante 156 h sob as condições apresentadas na seção 3.6.1.6. A
cinética de fermentação encontra-se representada na Figura 27.
FIGURA 27. CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE AP, REALIZADA POR P.

jensenii DSM 20274 EM MEIO CONTENDO HIDROLISADO DE CASCA DE CACAU E
GLICEROL COMO FONTES DE CARBONO REALIZADA EM FRASCOS DO TIPO SCHOTT DE
100 ML.

Após de 156 h de processo, a concentração de AP no meio atingiu um máximo de 10,28
g·L-1 e a melhor produtividade foi de 0,079 g·L-1·h-1 após 72 horas. O melhor rendimento em

substrato foi de 0,59 g AP/g de substrato após de 108 h de processo. Nesse momento, atingiu-se a
maior concentração de AS com 0,68 g·L-1, enquanto que a maior concentração de AA (0,8 g·L-1) foi
registrada após de 156 h de processo. Coral, (2008) utilizando esta mesma cepa, conseguiu uma
produtividade máxima de 0,064 g·L-1·h-1 e uma concentração de AP igual a 8,98 g·L-1 utilizando
como fonte de carbono glicerol e melaço de cana. Liu et al., (2016) atingiram concentrações de
26,95 de AP depois de 228 h de processo, também com uma cepa de P. jensenii (ATCC 4868) com
fermentação em batelada alimentada, utilizando como única fonte de carbono glicerol. Zhuge et al.,
(2015), conseguiram uma concentração de 21,38 g·L-1 de AP, após 156 h de processo, utilizando a
cepa P. jensenii proporcionando glicerol como fonte de carbono. Mesmo que as diferenças sejam
significativas, convém ressaltar que as concentrações de AP obtidas nesta etapa de estudo ainda não
foram otimizadas, possibilitando melhorias neste respeito.
Durante esta fermentação, um dos parâmetros acompanhados foi o pH. Com um pH inicial
de 6,45 do meio e um pH final de 3,96 considera-se que a evolução deste parâmetro junto com os
que serão apresentados a seguir, está dentro do esperado. O seguinte parâmetro acompanhado foi a
produção de biomassa e é exibida na Figura 28. Nesta curva de crescimento do microrganismos P.
jensenii DSM 20274 é possível diferenciar com clareza as etapas de desenvolvimento do
microrganismo durante a fermentação, onde a etapa de adaptação é rápida, e seguida pela etapa de
crescimento exponencial, atingindo seu máximo após 72 h, para logo alcançar o estado estacionário.
FIGURA 28. CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE P. JENSENII DSM 20274 EM MEIO CONTENDO

HIDROLISADO DE CASCA DE CACAU E GLICEROL COMO FONTES DE CARBONO
REALIZADA EM FRASCOS DO TIPO SCHOTT DE VIDRO DE 100 ML.


4.2.2.6. Fermentação em biorreator agitado de 2 L

FIGURA 29. PRODUÇÃO DE AP EM BIORREATOR DE BANCADA DE 2 L

Finalmente, a produção de AP foi avaliada em um biorreator de bancada agitado de 2 L
(Figura 29). Com os resultados obtidos durante a fermentação, nas condições de processo descritas
na seção 3.6.1.7., a Figura 30, apresenta o comportamento dos parâmetros investigados durante as
156 h de fermentação.
FIGURA 30. CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE AP, REALIZADA POR P.

jensenii DSM 20274 EM MEIO CONTENDO HIDROLISADO DE CASCA DE CACAU E
GLICEROL COMO FONTES DE CARBONO REALIZADA EM BIORREATOR DE 2 L.

Da mesma forma que na cinética de fermentação realizada em frascos do tipo Schott de

vidro de 100 mL, para esta fermentação já em escala maior, procedeu-se a quantificar em intervalos
de tempo determinados, os parâmetros de pH, biomassa, consumo de fonte de carbono e produção
de AP e de subprodutos.
A concentração máxima de AP foi obtida no final da fermentação após de 156 h de
processo com um valor de 6,42 g·L-1, enquanto que a maior produtividade, foi alcançada em um
tempo de 36 h de fermentação com um valor de 0,068 g·L-1·h-1; o maior rendimento: 0,65(g de AP
/g de substrato) após 84 h de processo.
Como é apresentado na Figura 31, a produção de biomassa do microrganismos P. jensenii
DSM 20274 atingiu uma concentração de 1,92 g·L-1. Identifica-se o crescimento exponencial
durante as primeiras 48 h de processo, para depois alcançar uma fase estacionária desde às 48 h até
as 84 h, tempo a partir do qual aparece uma nova etapa de crescimento do microrganismo e que
coincide exatamente com o esgotamento da fonte de carbono proveniente da glucose e o início do
consumo acelerado do glicerol (incremento de 5% no consumo), apresentando-se assim, uma fase
de readaptação metabólica para uma fonte de carbono. A partir das 132 h, parece que o
microrganismo entra de novo em uma fase estacionaria.
FIGURA 31. CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO: CONSUMO DE FONTES DE CARBONO VS.

BIOMASSA DE P. JENSENII DSM 20274 EM MEIO CONTENDO GLUCOSE DO HIDROLISADO
DE CASCA DE CACAU E GLICEROL COMO FONTES DE CARBONO REALIZADA EM
BIORREATOR DE 2 L.


O consumo de glucose no final do processo foi 80,8% e de 22,5% para o glicerol. Em total
a fonte de carbono restante no meio após das 156 h de fermentação correspondeu a 67,9%. Neste
caso o microrganismo não conseguiu utilizar totalmente a fonte de carbono, presumivelmente pela
falta de acesso a esta, pois durante o processo foi observada uma acumulação de material no fundo
do biorreator. Lembrando que, o tipo de agitação foi branda e correspondeu a 50 rpm o que poderia
ter influenciado neste fato, pelo que é sugerido para estudos posteriores, a otimização desta variável.
As máximas concentrações de AS e AA foram iguais a 0,25 g·L-1 e 1,09 g·L-1 respectivamente.
Para esta cinética de fermentação, o pH do meio iniciou 7,02 e finalizou com um pH de 4,25.
Os resultados atingidos neste estudo para a concentração e produtividades de AP
produzidos a partir do hidrolisado da casca de cacau e o glicerol, poderiam ser melhorados,
considerando a implementação de diferentes estratégias relacionadas com o tipo de fermentação e
controle da atmosfera de fermentação mediante a injeção de N2. Para este estudo, a implementação
do sistema de batelada alimentada não se considerou como viável, toda vez que as fontes de
carbono não foram totalmente consumidas durante o processo de fermentação, no entanto, se propõe
como técnica importante a ser considerada para estudos futuros. A seguir, se citam alguns exemplos
sobre estudos relevantes sobre a produção de AP.
Estudos previamente publicados têm obtido concentrações de até 136,23 ± 6,77 g·L-1 de
AP após de 240 h (a maior até agora reportada) com uma produtividade de 0,57 ± 0,03 g·L-1·h-1,
implementando o sistema de batelada alimentada e imobilização de células mediante a cepa P.
freudenreichii CCTCC M207015 e utilizando glucose como fonte de carbono (Chena et al., 2012).
Também mediante o sistema de batelada alimentada Liu et al., (2012) conseguiram atingir uma
concentração de 53,2 g·L-1 de AP, com a cepa P. acidipropionici ATCC 4875 e utilizando
hemiceluloses como fonte de carbono. Previamente, realizaram uma fermentação em batelada e
obtiveram concentrações de AP de 13,3 g·L-1. Em um estudo prévio, Suwannakham (2005) com
esta mesma cepa e usando também xilose, mas desta vez em sistema de batelada, atingiu uma
concentração de 18,5 g·L-1 . Com estas referências, vale a pena considerar para futuros estudos a
implementação do sistema de fermentação de batelada alimentada. Nos estudos aqui citados, as
técnicas de estabelecimento de anaerobiose usadas, foram a geração de vácuo ou o espargimento de
nitrogênio. No Quadro 3 apresentam-se diversos exemplos de outros estudos realizados sobre a
produção de AP a partir de diferentes fontes de carbono e implementando vários tipos de sistemas
de fermentação.

4.2.3. Teste de aplicação: determinação da atividade antimicrobiana do meio

fermentado

O AP (e seus sais) é um dos ácidos orgânicos de maior importância nos últimos anos
como parte dos compostos que apresentam prioridade no desenvolvimento de produção devido à
sua dependência do petróleo para ser produzido. Diversas indústrias utilizam este composto, entre
as que cabe citar a de fabricação de alimentos para consumo humano (especificamente para a
conservação de produtos cárneos e de padaria), indústria farmacêutica (como intermediário de
reações para a produção de compostos), a indústria de perfumaria, de fabricação de herbicidas e de
fabricação de ração animal. Como parte deste estudo, considerou-se a opção de ensaiar o caráter
antimicrobiano do meio fermentado por Propionibacterium jensenii DSM 20274. Para tal fim, foi
planejado um experimento de avaliação da inibição que poderia ocasionar o caldo fermentado
(previamente filtrado, 0,2 μm) sobre microrganismos que provocam problemas sérios sobre os
alimentos de consumo animal (especialmente para suínos e aves) o que conduziu a utilizar as cepas
dos fungos Aspergillus flavus e Cândida albicans HC. Como foi citado por Haque et al., (2009)
comprovou-se a efetividade do AP como inibidor destes dois microrganismos, em provas
desenvolvidas pela empresa BASF.

FIGURA 32. PLACA DE PETRI Seguiu-se a metodologia descrita na seção 3.8 e foi
PARA AVALIAÇÃO DAS
PROPRIEDADES verificado que o caldo fermentado, usado tal e como é obtido
ANTIMICROBIANAS DO uma vez finalizado o processo, não possui propriedades
MEIO DE FERMENTAÇÃO
UTILIZADO POR P. jensenii antifúngicas, pois não foram achados halos de inibição nas
DSM 20274.
placas. Ao invés dos halos de inibição, em alguns dos poços
observou-se um crescimento maior do microrganismo utilizado,
o que obedeceria provavelmente à disponibilidade de nutrientes
ainda remanescentes no meio. Contrário ao esperado, não foi
observado um efeito de inibição nos poços contendo AP de grau
comercial, utilizado como controle. Levando em conta isto,
conclui-se que as concentrações estabelecidas para este
experimento, não foram as mínimas necessárias para provocar a
inibição dos microrganismos utilizados na prova. Finalmente e

conhecendo esta informação, para ensaios posteriores,
recomenda-se determinar a concentração mínima inibitória de AP necessária para os
microrganismos testados e também investigar o uso do meio uma vez tenha sido concentrado ou
purificado para obter novas informações sobre este tema.

5. CONCLUSÕES

• Demostrou-se que as cascas de cacau, consideradas como um resíduo agrícola
primário, têm potencial agroindustrial para a produção biotecnológica de
compostos de médio a alto valor agregado.
• A comparação da caracterização físico-química mediante diferentes técnicas
qualitativas (coloração histológica-MO, MEV, FTIR, DRX e TG) e
quantitativas da casca de cacau in natura e pré-tratada, permitiu verificar as
diversas alterações (estrutura morfológica, conformação química, grau de
cristalinidade, estabilidade térmica e de resistência mecânica) ocasionadas pela
ação dos compostos químicos e enzimáticos utilizados durante o estudo, o que
ratificou para cada caso a eficácia dos processos.
• As condições de hidrólise química e enzimática estabelecidas para o pré-
tratamento da casca de cacau (NaOH 2,3% (m/v), durante 30 minutos em
autoclave a 120ºC e 1 atm.; seguida por hidrólise com a enzima Cellic® CTec 2
em concentração de 2,4% (v/v), substrato 10% (m/v), 50ºC e 100 rpm),
permitiram obter um hidrolisado com uma maior concentração de glucose,
quando comparada com as concentrações obtidas para o extrato aquoso, para a
posterior obtenção de uma biomolécula de valor agregado.
• Produziu-se AP a partir do hidrolisado das cascas de cacau obtido do pré-
tratamento químico e enzimático, com os seguintes valores:
o Frasco tipo Schott de 100 mL:
Concentração máxima: 10,28 g·L-1
Produtividade: 0,079 g·L-1·h-1
Rendimento: 0,59 g de AP/ g de substrato
o Biorreator agitado de 2 L:
Concentração máxima: 6,42 g·L-1
Produtividade: 0,068 g·L-1·h-1
Rendimento: 0,65 g de AP/ g de substrato
• Cumpriram-se todos os objetivos específicos estabelecidos para o
desenvolvimento deste projeto.

6. PERSPECTIVAS

• As diferentes frações residuais (líquidas e sólidas) obtidas ao longo do processo
de obtenção do hidrolisado, permitem propor o estabelecimento de uma
biorefinaria com o propósito de valorizar ainda mais este resíduo. Como
exemplo, se propõe aproveitar o efluente gerado após do tratamento químico da
casca de cacau (presumivelmente rico em ligninas e hemiceluloses) e o resíduo
sólido remanescente após do pré-tratamento enzimático.
• Sugere-se estudar a viabilidade da recuperação e reutilização de compostos
utilizados durante o tratamento da casca de cacau (NaOH utilizado para o pré-
tratamento alcalino e enzima residual)
• Otimizar a produção de AP em biorreator mediante a implementação de sistema
de fermentação de batelada alimentada, o controle da atmosfera de fermentação
mediante a injeção de N2 ou CO2.
• Avaliar o possível uso dos subprodutos AA e AS obtidos durante a produção de
AP.
• Concentrar e purificar os caldos de fermentação obtidos para verificar a ação
antimicrobiana do AP, iniciando com testes Mínima Concentração Inibitória
(MCI).
• Utilizar o hidrolisado para a produção de outras biomoléculas de interesse
industrial (exemplo etanol).

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8. APÊNDICES
A. Imagens MEV da casca de cacau com diversos pré-tratamentos

Durante o desenvolvimento deste estudo, diferentes pré-tratamentos foram testados para
verificar o efeito sobre a casca de cacau. A seguir, apresentam-se as micrografias MEV dos
tratamentos básico, ácido, básico-ácido, ácido-enzimático e micrografias adicionais do tratamento
básico-enzimático com as respetivas descrições das estruturas vegetais identificadas e as mudanças
estruturais observadas.
Micrografia por MEV da casca de cacau com pré-tratamento ácido
Micrografia por MEV da casca de cacau com pré-tratamento básico-ácido

Micrografia por MEV da casca de cacau com pré-tratamento ácido-enzimático
Micrografia por MEV da casca de cacau com pré-tratamento básico

Micrografia por MEV da casca de cacau com pré-tratamento básico
Micrografia por MEV da casca de cacau com pré-tratamento básico-enzimático



B. Pré-tratamentos químicos para material lignocelulósico

Durante a revisão bibliográfica, compilaram-se os resultados mais relevantes sobre o pré-tratamento (ácido, básico e ácido-básico) de
material de natureza lignocelulósica para a produção de etanol (como molécula de referência). A seguir os resultados:

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

ZULMA SARMIENTO VÁSQUEZ

VALORIZAÇÃO DE CASCAS DO FRUTO DE CACAU (Theobroma cacao L.):

ZULMA SARMIENTO VÁSQUEZ

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Quadro 1. Estudos de pré-tratamentos alcalinos de material lignocelulósico 27

Tabela 1. Referências de caracterização físico química da casca de cacau 24

3.3.3. Determinação de carboidratos estruturais e lignina .................................................... 43

4.1.3. Caracterização físico-química da casca de cacau pré-tratada química e

2.1. Theobroma cacau L.: produtos e resíduos

2.1.1. Descrição da planta

Theobroma cacao L.    

2.1.2. Produção e mercado mundial de cacau

FIGURA 3. CADEIA DE VALOR DO CACAU

Segundo os dados publicados pela Organização Internacional do Cacau (ICCO), na safra

FIGURA 4. PRODUÇÃO MUNDIAL DE AMÊNDOAS DE CACAU 2014/2015

FIGURA 5. HISTÓRICO DA CULTURA DE CACAU NO BRASIL: PRODUÇÃO VS.

2.1.3. Comércio internacional de produtos de cacau

cacau, manteiga, cacau em pó e chocolate. O chocolate é o principal produto comercializado, com

FIGURA 6. EXPORTAÇÕES DOS PRODUTOS DE CACAU E PRINCIPAIS PAÍSES

FONTE: dados ITC. Ilustração: A autora (2017)

2.1.4. Geração de resíduos

durante o crescimento e no processo de amadurecimento os frutos mostram cores amarelo,

Atualmente, as cascas de cacau representam para algumas plantações, um problema

TABELA 1. REFERÊNCIAS DE CARACTERIZAÇÃO FÍSICO QUÍMICA DA CASCA DE CACAU

O objetivo do trabalho apresentado por Martínez et al., (2012), foi determinar as

2.1.5. Tipos de pré-tratamento para material lignocelulósico

FONTE: A autora (2017).

Como exemplo da aplicação deste tipo de tratamento em material lignocelulósico, Kim et

50% de dissolução da hemicelulose, entre 60 e 80% de deslignificação e taxas importantes de

QUADRO 1. ESTUDOS DE PRÉ-TRATAMENTOS ALCALINOS DE MATERIAL

Da mesma forma, McIntosh e Vancov (2010), reportam condições de pré-tratamento com

O glicerol (também nomeado de glicerina) é um subproduto indesejável do processamento

acético (Clomburg e Gonzalez., 2013), o que é conhecido como fermentação homo-propiônica

2.3. Ácidos orgânicos

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2.3.1. Ácido propiônico (AP)

O ácido propiônico – AP (ácido propanóico C3H6O2) é um ácido mono-carboxílico fraco,

QUADRO 2. PROPRIEDADES FÍSICO- QUÍMICAS DO AP

2.3.1.1. Contexto histórico

É reportado também que, em 1941, Walter Reppe estabeleceu a síntese do AP a partir de

2.3.1.2. Produção e mercado

As exportações de AP durante 2015 atingiram um total de 309 mil toneladas

Por outro lado, os principais países importadores do produto representados em valor

Theobroma cacao L.

(Eq. 11)