Introdução À HPLC

INTRODUO CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE OU HPLC)
Marilena Meira
Histrico
Origem da Cromatografia Lquida: Em 1900 - Mikhail S. Tswett . Separao de pigmentos com uso de solvente em colunas de CaCO3 e alumina.
DEFINIO
HPLC - tipo de cromatografia que emprega uma fase mvel lquida e uma fase estacionria finamente dividida e que, para ter um fluxo razovel, opera a presses elevadas.
High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography
MECANISMO DA SEPARAO DA HPLC

CC, CCD, HPLC Distribuio dos componentes entre a fase estacionria e a fase mvel lquida. Diferentes interaes com a fase estacionria. Diferenas de velocidade
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PARTES DO CROMATGRAFO (HPLC)

Sistema de Solventes Bombas Injetor Coluna Detector Registrador.
SISTEMA DE SOLVENTES
Degaseificao: Remoo de gases O2 e N2 Purga: a cada troca de solventes. Elimina bolhas na linha Bolhas na bomba e na FM: irreprodutibilidade do fluxo. Bolhas no detector: Baixa estabilidade da linha base, pico para baixo, O2 absorve em < 215 nm.
DEGASEIFICAO
Ultra-som: Muito lento, requer agitao, pouco eficiente. Vcuo: Lento, requer agitao, pode alterar a composio da FM preparada. Vcuo + ultra-som + agitao: Necessita reaplicar de 12 em 12 horas. Degaseificador: Contnuo, remove o ar ante da bomba. Melhor opo.
TIPOS DE ELUIES
Eluio isocrtica: Composio FM constante. Eluio por gradiente: Composio FM varia.
ELUIO ISOCRTICA
A composio da fase mvel permanece constante durante a separao Vantagens: maior rapidez No necessita de recondicionar a coluna Menor consumo de solventes Desvantagem No resolve misturas complexas
ELUIO POR GRADIENTE

A composio da fase mvel varia ao longo da separao Vantagem: Elevada resoluo Desvantagens: Maior tempo de anlise Maior consumo de solventes A variao da composio da FM pode ser por patamares ou de forma linear
Gradiente por patamares
PURIFICAO PRVIA DA AMOSTRA

Reteno irreversvel na fase estacionria. mais fcil limpar a amostra que comprar outra coluna. NO INJETAR EXTRATOS. PURIFICAO: submeter a amostra a CC antes da injeo no HPLC.
ESCOLHA DA FASE MVEL

A amostra deve se dissolver completamente na fase mvel ou acontecer sua precipitao no interior da coluna.
FLUXO DA FASE MVEL

Fluxo timo depende do dimetro interno e comprimento da coluna: Consultar especificaes do fabricante. Menor fluxo, maior eficincia.
MODOS DE SEPARAO
FASE NORMAL:FM apolar, FE polar. FASE REVERSA: FM polar, FE apolar.
FASE NORMAL:
Pouco utilizado, recomendado para compostos polares. A FM geralmente hexano com outro solvente mais polar. FE slica pura ou slicas modificadas com cianopropil ou aminopropil. Compostos mais polares tendem a ficar mais retidos na coluna. Mecanismo de interao: pontes de hidrognio ou interaes dipolo-dipolo.
TIPOS PRINCIPAIS DE RECHEIO EM FASE NORMAL

CIANOPROPIL
Si O Si
CN
AMINOPROPIL
Si O Si
NH2
FASE REVERSA
Geralmente utilizado em mais de 70 % das aplicaes. FE: slica modificada com grupos octil (C-8) ou octadecil (C-18); Polmeros orgnicos (exemplo: Poliestireno) FM: Mistura de gua com: acetonitrila, metanol ou THF. Compostos apolares tendem a ficar mais retidos na coluna. Mecanismo de interao: Foras de Van der Waals.
TIPOS PRINCIPAIS DE RECHEIO EM FASE REVERSA

R1 Si-OH + Cl-Si R2 R3 R1 SiO Si R2 R3
R1 e R3= CH3 ou OCH3, R2= C-18, C-8, C4, C2
DILUENTE DA AMOSTRA
Fase normal: dissolver a amostra na FM ou em um solvente mais apolar que FM. Fase reversa: dissolver a amostra na FM ou em um solvente mais fraco (menor % de orgnico)
FILTRAO DA AMOSTRA
Para no entupir o filtro de entrada da coluna. Filtrao em filtro de seringa de 0,45 m. Os filtros so DESCARTVEIS. Uso nico.
VOLUME MXIMO DE INJEO

1% DO VOLUME INTERNO DA COLUNA Vi = V. 0,01 Vi = .R2.L.0,01 Vi =Volume mximo de injeo Vi = Volume da coluna R= Raio L= Comprimento da coluna
Volume mximo de injeo para uma coluna 4,6mmx250mm

1% DO VOLUME INTERNO DA COLUNA Vi = V. 0,01 Vi = .R2.L.0,01 Vi = 3,14.(2,3)2.(250).0,01 Vi = 41mm3 = 41l
SOBRECARGA DE AMOSTRA
Peso mximo depende: da rea superficial do suporte e volume da coluna. No exceder 2mg/g de fase estacionria.
INJETOR
O loop usado deve ser adequado quantidade injetada pela microseringa.
ESCOLHA DA COLUNA
Recheio: Fase estacionria. Slido finamente dividido (Analtica e preparativa Fase normal e reversa Granulometria 3 a 10 m
VANTAGENS E DESVANTAGENS DA SLICA

Vantagens: Grande resistncia a altas presses; Tem grande rea superficial; diversas granulometrias, pode ser modificada. Desvantagens: silanois residuais podem causar adsoro excessiva de compostos bsicos. Estabilidade qumica limitada em pH<2 e pH > 8.
DANOS COLUNA
Acima de 8: A slica se dissolve. Abaixo de pH 2 A reao de silanizao se reverte.
R1 Si-OH + Cl-Si R2 R3 R1 SiO Si R2 R3
R1 SiO Si R2 + R3
HCl
R1 Si-OH + Cl-Si R2 R3
SLICAS MODIFICADAS COM GRUPOS ORGNICOS

C8
C18
SLICAS MODIFICADAS SEM SILANOL LIVRE (CAPEAMENTO)

C8
C18
DETECTOR
Detector UV: Mede a capacidade da amostra para absorver luz em um ou mais comprimento de onda. Pode ser: Comprimento de onda fixo: Mede apenas um comprimento de onda. Comprimento de onda varivel: Mede um comprimento de onda por vez, mas pode detectar uma larga faixa. Arranjo de diodos: Mede um espectro de comprimentos de onda simultaneamente.
LIMPEZA DE COLUNA FN
Passar a seqncia de solventes: Hexano/octano/heptano Diclorometano Isopropanol, acetetato de etila, THF Metanol Diclorometano Fase mvel
LIMPEZA DE COLUNAS FR
Correr acetonitrila:gua 80:20 como fase mvel e fazer injees grandes (200 l) de solventes fortes (THF, DMF, IPA, acetato de etila). Pode aquecer a coluna a 40-50 C. Para remoo de material orgnico o melhor solvente o THF Metanol no um solvente forte para limpeza de material orgnico lipoflico devido sua alta polaridade.
ARMAZENAGEM DE COLUNAS FN
Manter as colunas bem fechadas com os parafusos. Armazenar em hidrocarboneto saturado como iso-octano, heptano, hexano (menos voltil, melhor).
ARMAZENAGEM DE COLUNAS FR
Manter as colunas bem fechadas com os parafusos de compresso No armazenar com gua sem solvente orgnico: Pode criar fungos. Usar pelo menos 20% de orgnico. Se o recheio secar = coluna morta Se usar forno: Deixar a coluna esfriar antes de desconectar e guardar.

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ELUIO POR GRADIENTE

Gradiente por patamares

PURIFICAO PRVIA DA AMOSTRA

ESCOLHA DA FASE MVEL

FLUXO DA FASE MVEL

FASE NORMAL:FM apolar, FE polar. FASE REVERSA: FM polar, FE apolar.

TIPOS PRINCIPAIS DE RECHEIO EM FASE NORMAL

TIPOS PRINCIPAIS DE RECHEIO EM FASE REVERSA

R1 e R3= CH3 ou OCH3, R2= C-18, C-8, C4, C2

VOLUME MXIMO DE INJEO

Volume mximo de injeo para uma coluna 4,6mmx250mm

VANTAGENS E DESVANTAGENS DA SLICA

SLICAS MODIFICADAS COM GRUPOS ORGNICOS

SLICAS MODIFICADAS SEM SILANOL LIVRE (CAPEAMENTO)

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