Renato Dissertação final

INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTAVÉL
VALIDAÇÃO DO IMUNOENSAIO PARA IDENTIFICAÇÃO DE

MONENSINA EM RAÇÃO E PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL
Renato Del Alamo Guarda
Nova Odessa
Junho – 2018
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL

Renato Del Alamo Guarda

Orientadora: Dra. Keila Maria Roncato Duarte
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação do
Instituto de Zootecnia,
APTA/SAA,como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre em Produção Animal
Sustentável.
Nova Odessa
Junho – 2018
Ficha Catalográfica elaborada pelo
Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia
Bibliotecária: Flavia Helena Felizardo – CRB 8/8987
G914v Guarda, Renato Del Alamo

Validação do imunoensaio para identificação de monensina em ração e
produtos de origem animal / Renato Del Alamo Guarda.
Nova Odessa, SP: [s.n.], 2018.
65p.; Il.
Dissertação (mestrado) – Instituto de Zootecnia. APTA/SAA, Nova
Odessa.
Orientadora: Dra. Keila Maria Roncato Duarte
1. ELISA 2. Ionóforo 3. Segurança alimentar. I. Duarte, Keila Maria

Roncato.
Folha de Aprovação
Dedico esse trabalho a minha esposa Graziela, que jamais
deixou de me incentivar e acreditar que eu chegaria aqui.
Agradecimentos
A Deus, que sem ele nada seria possível.

A minha família e esposa Graziela, pelo amor, confiança, carinho e apoio em todos os
momentos.
A minha orientadora Dra. Keila Maria Roncato Duarte, pela paciência, atenção e orientação
no árduo processo do aprendizado.
A Sandra Liepkaln dos Reis, pela atenção na secretaria de pós-graduação e pela amizade.
Aos colegas do mestrado e do Instituto de Zootecnia.
As empresas Ceze Rações e Rações Guaçu que forneceram as rações para os animais do
experimento.
A empresa Nuctramix pelo fornecimento de amostras de produto para a realização de testes.
Ao Programa de Pós-Graduação do Instituto de Zootecnia.
Aos pesquisadores: Dra Carla Cachoni Pizzolante, ao Mestre José Evandro de Moraes.
A todos que indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
“Só depois da última árvore derrubada, do último
peixe morto, o homem irá perceber
que dinheiro não se come”.
(Provérbio Indígena)
Sumário
RESUMO .................................................................................................................................................. 9
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 10
CAPÍTULO 1 - MONENSINA: USO, APLICAÇÕES E ESTADO DA ARTE ..................................................... 11
RESUMO ................................................................................................................................................ 11
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 12
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 13
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................................. 15
2.1 Monensina................................................................................................................................... 15
2.2 Uso da monensina na indústria sucroalcooleira ......................................................................... 15
2.3 Vantagens do uso ........................................................................................................................ 17
2.4 Efeitos tóxicos da monensina ...................................................................................................... 19
2.5 Métodos de diagnóstico da monensina por ELISA ...................................................................... 20
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................................................... 23
4. REFERÊNCIAS ................................................................................................................................. 24
CAPITULO 2 - PRODUÇÃO E VALIDAÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE

MONENSINA .......................................................................................................................................... 29
RESUMO ................................................................................................................................................ 29
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 30
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 31
2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................ 33
2.1 Produção de anticorpos anti-monensina .................................................................................... 33
2.2 Amostras biológicas .................................................................................................................... 33
2.3 PTA- ELISA.................................................................................................................................... 34
2.4 Validação do ELISA ...................................................................................................................... 35
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 37
4. CONCLUSÕES ..................................................................................................................................... 44
CAPÍTULO 3 – A monensina no Mercado de rações: conhecimento e percepção de produtores ....... 49
RESUMO ................................................................................................................................................ 49
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 50
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 51
2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................. 53
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 54
4. CONCLUSÕES ................................................................................................................................. 59
5. REFERÊNCIAS ................................................................................................................................. 60
ANEXO I – QUESTIONÁRIO PRODUTORES DE CAMPO. ......................................................................... 62

RESUMO
A identificação correta de resíduos de monensina em alimentos para animais e em carne, ovos

e leite é importante para determinar a quantidade de monensina presente na matriz biológica,
bem como para a certificação de alimentos orgânicos, que devem estar sem monensina. Este
trabalho teve como objetivo validar anticorpos policlonais, produzidos em coelhas da raça
Nova Zelândia, para identificar a monensina por imunoensaio. Para a atividade imunogênica,
a monensina foi purificada a partir de um produto comercial (20% de monensina) e foi
conjugada utilizando o método de bio-conjugação de carbodiimidas, com Soro albumina
bovina e carreador glutaraldeido. Os anticorpos foram produzidos ao longo de 60 dias e
titulados por PTA-ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática com antígeno preso na
placa), lidos a 565 nm, com sistema enzimatico de revelação por peroxidase. Os soros
colhidos a cada 15 dias durante o esquema de imunização foram diluídos a 1: 800 e titulados.
Os valores de densidade óptica (D.O.) foram 0,17, 0,19, 0,22 e 0,23 para os dias 15, 30, 45 e
60, respectivamente. Os anticorpos produzidos foram capazes de identificar monensina em
amostras de ração comercial, farinha de carne e penas, leveduras inativadas seca e em
amostras de leite, a partir de curva padrão de monensina ( analise quantitativa) com
sensibilidade de 10 ug por kg de amostra. A otimização destes ensaios foi realizada com
tempos entre etapas de 1 hora de incubação, temperatura de 37°C. Das 36 amostras de ração
de animais, levedura, farinhas e leite utilizadas, 75 % (27) apresentaram resíduos de
monensina e 25 % (9) foram negativas, incluindo todas as amostras de leite e de ração para
equinos. Outros parâmetros de validação utilizados foram a recuperação de monensina,
utilizando claras de ovos como matriz fortificada, com recuperação media de 93,9% e
precisão e repetibilidade dos imunoensaios, com 5,24 de CV% e desvio padrão de 0,056 , de
forma que este soro policlonal produzido está dentro dos parametros internacionais para
ensaios de triagem inicial com ELISA. A presença de monensina inviabiliza a exportação de
produtos bem como a certificação de rações como orgânicas ou livres de antibióticos.
Palavras-chave: ELISA, ionóforo, segurança alimentar
9
VALIDATION OF NA IMMUNOASSAY TO IDENTIFY MONENSIN IN
FEED AND PRODUCTS FROM ANIMAL ORIGIN
ABSTRACT
The correct identification of monensin residues in meat, milk, egg and animal feed is
important to stablish a quantitative method for its identification in biological matrix, as well
as for the certification of organic food. This experiment raised polyclonal antibodies in female
New Zealand rabbits to identify monensin by immunoassay. For the immunogenic activity,
commercial monensin (premix 20%) was bioconjugated to Bovine sera albumin (BSA) using
the carbodiimides methodology, and glutaraldehyde as carrier. Antibodies were produced for
60 days of immunization and tittered by PTA-ELISA (Plate trapped antigen- enzyme linked
immunosorbent assay) read at 565 nm, horseradish peroxidase, in microplate reader. Sera
were harvested each 15 days, diluted 1:800 and tittered. O.D. (Optical density) values were
0.17; 0.19; 0.22 and 0.23 for days 15, 30, 45 and 60, respectively. Antibodies raised were
able to identify monensin in commercial feed samples, meat and feathers meal, dried yeast
and milk based upon a standard curve built on monensin standard (quantitative data) at
sensibility of 10 ug per kg of sample. Optimization of the immunoassay stablished the
following parameters: one hour of incubation for each step, 37 °C. From 36 feed samples
meat and feathers meal, yeast and milk, 75% (27) presented monensin residues and 25 % (9)
were negative, including all milk samples and equine feed. Other parameters of validation
were the recovery of monensin using spiked egg white, with recovery of 93. 9%and precision
and repeatability of immunoassays with 5.24 of CV% (coefficient of variation) and standard
deviation of 0.056 in the way this sera produced attend the international standards for initial
screening with ELISA. Although this amount of monensin did not present health risks to
animals or humans, unfeasible the exportation of products as well as the organic certification
for feed free of antibiotics.
Key words: ELISA, ionophores, food safety
10
CAPÍTULO 1 - MONENSINA: USO, APLICAÇÕES E ESTADO DA
ARTE
RESUMO
Desde sua descoberta na década de 60, a monensina tem sido amplamente utilizada como
agente coccidiostático em avicultura e em ruminantes sendo muito viável pois ao atuar em
bactérias Gram positivas, consegue modular a produção de ácido propiônico e estabelecer
uma menor relação de acetato:propionato, pois ao aumentar os níveis de propionato melhora-
se o desempenho e produção animal (ácido graxo volátil importante para produção de
proteínas microbianas). Diante de uma grande variedade de coprodutos passiveis de uso na
alimentação animal, alguns ingredientes ricos em proteínas e vitaminas podem conter resíduos
de monensina como leveduras oriundas das usinas sucroalcooleiras e das farinhas de origem
animal, resultado do processamento dos resíduos e sobras dos abatedouros e frigoríficos. Os
produtos que podemos verificar a presença de monensina podem ser em sua maioria as aves e
subprodutos e ruminantes e seus subprodutos. Como a levedura é largamente usada como
fonte de MOS (mananoligossacarídos), podemos usar também para verificar a presença de
leveduras contaminadas com monensina em rações de ruminantes e nos cortes de carne, ovos,
leite e derivados etc. A grande maioria dos trabalhos e laboratórios utilizam cromatografia
para detecção já que os resíduos nos produtos de origem animal podem apresentar sérios
riscos a saúde humana. Objetivou-se fazer uma revisão de literatura sobre monensina, com
informações sobre seu uso, vantagens e desvantagens e aplicações diversas.
Palavras-chave: antimicrobiano, segurança alimentar, resíduo.
11
ABSTRACT
Since its discovery in the 60's, monensin has been widely used as a coccidiostatic agent in
poultry and ruminants production and it has proved very feasible because when acting on
Gram positive bacteria, it can modulate the production of propionic acid and establish a lower
ratio of acetate:propionate, The increase of propionate, increases the performance and animal
production (volatile fat acids important to microbial proteins production). Faced with a wide
variety of co-products that can be used in animal feed, some ingredients rich in proteins and
vitamins may contain monensin residues such as yeast from sugar-alcohol plants and animal
meal resulting from the processing of residues and leftovers from slaughterhouses and
slaughter houses. The products that we can verify the presence may be mostly poultry and by-
products and the ruminants with their by-products. As yeast is widely used as a source of
MOS (mano olygossacharides). We can also use yeast contaminated with monensin it to
check the presence in ruminant feed and cuts of meat, eggs, milk and derivatives etc. The vast
majority of the works and laboratories use chromatography for detection since the residues in
products of animal origin can present serious risks to human health. The objective of the study
was to review the monensin literature, bringing information about use, dosage, advantages
and disadvantages of its use.
Key words: antimicrobian, food safety, residue.
12
1. INTRODUÇÃO
A monensina é um aditivo alimentar bastante ultilizado em vários países (Pereira, 2014),

usado inicialmente na avicultura (Rokka et al., 2013) e muito seguro quando trabalhado nas
dosagens recomendadas na espécie alvo (Bezerra Junior et al., 2010).
Os ionóforos poliéteres são antibióticos largamente empregados na alimentação
animal para prevenir e tratar a coccidiose, enfermidade causada por protozoários dos gêneros
Eimeria bovis e Eimeria suernii que residem na mucosa intestinal. Além de serem agentes
anticoccidianos, atuam como promotores de crescimento em bovinos e suínos, melhorando a
eficiência alimentar e a taxa de ganho de peso. Em ruminantes são empregados ainda para
aumentar a produção de leite em vacas em lactação (Pereira et al., 2015).
Com a grande procura de coprodutos da indústria com potencial uso na nutrição
animal, as leveduras residuais do processo de fermentação alcoólica das usinas de cana-de-
açúcar apresentam grande potencial de uso devido às suas características nutricionais que
apresentam, seja pelo teor de proteínas ou pelas propriedades dos componentes da parede
celular. Visando a sustentabilidade do sistema, o produto pode ser usado na alimentação dos
animais e apresenta excelentes resultados na produção e se encaixa no perfil do Tripé da
Sustentabilidade descrito por Elkintong (1994) e representado por Vasques (2014) na Figura
1.
Figura 1. Tripé da Sustentabilidade.Adaptado de Vasquez (2014)
13
De acordo com Rigobello e Millen (2014) alguns países, principalmente os da União
Europeia baniram desde 2006 o uso dos ionóforos como promotores de crescimento, por
serem classificados como antibiótico, e por apresentar potencial de transferência de
resistência antimicrobiana dos animais para os seres humanos.
Segundo Gomes (2004) a presença de resíduos de antibióticos em produtos de origem
animal, como carne, leite e ovos, tem potencial para ocasionar diferentes reações na saúde
humana, dentre elas a hipersensibilidade, tumores e alterações na flora bacteriana normal.
O Objetivo desse trabalho foi realizar uma revisão de literatura sobre monensina, com
informações sobre seu uso, vantagens e desvantagens e aplicações diversas, visando a
segurança alimentar e sustentabilidade do processo, onde apesar da utilização de um resíduo
da usina sucroalcooleira, no caso, as leveduras, constituir-se rica fonte de proteína, vitaminas
e minerais, além da questão de utilização de coprodutos da indústria, o desconhecimento de
contaminantes pode trazer problemas a população sensível ou a animais de produção ou de
companhia que consomem ração com esses resíduos de monensina.
14
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Monensina
Segundo Sitta (2011) os ionóforos são altamente efetivos contra bactérias gram-
positivas, e exibem pouca ou nenhuma atividade contra bactérias gram-negativas.
Com o aumento da demanda de proteína animal e com o mercado cada vez mais
exigente, também há uma demanda do setor de qualidade onde as empresas necessitam de
técnicas laboratoriais para certificarem seus produtos.
Dessa forma, as análises por imunoensaios têm sido bastante procuradas, pois são
técnicas relativamente rápidas de se executar, bastante confiáveis e acessíveis, além da
precisão de detecção das moléculas que se deseja encontrar nas amostras.
2.2 Uso da monensina na indústria sucroalcooleira
De acordo com Rodrigues (2011), existe uma grande contaminação por leveduras
selvagens e por bactérias nas dornas de fermentação e antes do reuso em um novo ciclo
fermentativo é necessário combater esse fatores negativos com o uso de antibióticos (Figura
2).
Figura 2 – Esquema de utilização da levedura excedente em rações e indiretamente, a contaminação por

monensina
15
Para manter o controle de bactérias contaminantes e deixá-las em níveis aceitáveis
utiliza-se, por exemplo, o ionóforo monensina sódica, de ação antibiótica, nas dornas de
fermentação e dessa forma melhorar o rendimento da fermentação alcoólica (Rodero et al.,
2016).
Ferri et al. (2014) realizaram uma pesquisa através de questionários, enviados
eletronicamente a 7 usinas sucroalcooleiras do estado do Mato Grosso do Sul e apontam que 6
delas utilizam antibiótico à base de monensina sódica cristalina para controle de bactérias
contaminantes na fermentação alcoólica.
O uso da monensina na fermentação por si só não acarreta problema algum, já que
consiste num “antibiótico” bastante eficiente para o controle de contaminantes na dorna.
Contudo, o excedente da massa de leveduras da fermentação, na produção de álcool, é seco e
vendido como suplementação para rações de origem animal, já que é uma fonte muito rica em
vitaminas, principalmente do complexo B e de outros nutrientes, além da proteína de elevado
valor agregado (Duarte et al., 2012). Neste contexto, resíduos de monensina podem vir
juntamente com a levedura em formulações pré e próbioticas e, dependendo da finalidade,
constituir em contaminação para produtos de exportação, como aves e suínos ou
contaminantes em rações para animais de companhia, com ingredientes orgânicos descritos
em sua composição.
O Codex Alimentarius (2015) estabelece valores máximos de contaminação para
monensina em produtos de origem animal, que podem ser consumidos de acordo com a
Figura 3.
16
Figura 3 – Tabela tirada do Codex Alimentarius (2015), página 25, com os limites máximos de monensina para
cada tecido animal e espécies de animais de produção, levando em conta o consumo mínimo por individuo
adulto.
2.3 Vantagens do uso
Ribeiro et al. (2000) avaliando os benefícios da suplementação de monensina sobre o

rendimento de carcaças e de cortes de aves mostraram que a administração do ionóforo na
dose de 110 ppm por kg de ração até o abate melhora o rendimento de carcaça, de cortes
principalmente peito e a conversão alimentar do que o grupo que não recebeu o ionóforo.
Leopoldino et al. (2007) avaliando a perda in vitro de potássio (K+) no meio
intracelular de animais tratados com ionóforos e óleo demonstraram que os ionóforos são
eficientes em causar perda de íons no meio extracelular e animais tratados com monensina
não apresentam resistência à lasalocida.
17
Zeoula et al. (2008) avaliaram os efeitos da adição de monensina sódica em bovinos e
bubalinos concluíram que nessas espécies a monensina sódica foi eficiente em reduzir a
degradação ruminal da proteína bruta e aumentar o coeficiente de digestibilidade intestinal da
proteína bruta. Também mostrou que o ionóforo em ração 50% volumoso e 50% concentrado
foi capaz de aumentar os coeficientes da matéria seca, matéria orgânica e do extrato etéreo.
Resultado diferente encontrado por Laguna et al. (2013) que ao avaliarem a suplementação de
vacas leiteiras e adição de monensina em alguns tratamentos, o ionóforo não reduziu o
consumo de matéria seca nem a digestibilidade da matéria seca. Foi verificado que houve
melhora na produção de leite em dietas com adição de suplemento proteico mais monensina o
que possivelmente aumentou o fluxo de aminoácidos essenciais para o intestino.
Comparando o desempenho de novilhas à pasto ou suplementada com farelo de arroz
integral com ou sem ionóforo, Eloy et al. (2014) observaram que novilhas alimentadas com
farelo de arroz integral com ionóforo, não apresentaram diferença em relação ao consumo de
forragem, os autores ressaltam que a adição do ionóforo é uma opção para melhorar o ganho
de peso médio diário.
Ao determinar o efeito da monensina sobre a degradação da proteína de alguns
alimentos, em método in vitro, Lana et al. (2000) observaram que a monensina reduziu a
emissão de gazes os autores demonstraram que a monensina inibe a atividade degradativa das
bactérias, sendo que o ionóforo proporciona maior eficiência na utilização das proteínas.
Oliveira et al. (2006) realizaram um estudo in vitro para avaliar a fermentação ruminal
com a presença de monensina e concluiram que o ionóforo reduziu a produção de gazes pois
inibiu o crescimento de bactérias produtoras de amônia.
Em trabalho com ionóforos e outros aditivos para avaliar o efeito da suplementação
em dietas de bovinos, Rivera et al. (2010) observaram a redução do consumo de matéria seca
de bovinos quando suplementados com monensina e concluiram que o ionóforo altera a
concentração de acetato:propionato resultante da fermentação sendo possível poupar energia
com a inclusão da monensina na dieta em dosagem de 5 g/animal/dia.
Oliveira et al. (2005) observaram que houve aumento da proteína microbiana em
dietas com baixos níveis de PB (proteína bruta) mais monensina e a redução do consumo de
matéria seca quando animais foram alimentados com baixa PB e monensina.
Ao avaliar o efeito da suplementação de fontes de cálcio com ou sem monensina em
ovinos, Gastaldello Junior et al. (2010) observaram que a monensina melhorou a conversão de
cordeiros confinados e é uma opção para melhorar a rentabilidade do sistema de produção.
18
A monensina sódica também foi capaz de reduzir a degradação efetiva da FDN (fibra
em detergente neutro) de bovinos holandeses em silagem de milho em ambiente ruminal
(Katsuki et al., 2006).
O ionóforo monensina não alterou de forma significativa o balanço de nitrogênio dos
animais quando passam por período de restrição. (Costa et al., 2007).
Ao avaliar o desempenho de bezerras holandesas leiteiras de reposição em
crescimento, utilizando-se monensina, Salles et al. (2001) observaram maior crescimento e
maior ganho de peso das novilhas suplementadas nos 90 e 120 dias, sendo o ganho 3,4% e
7,4%, respectivamente, maior que as do grupo controle.
Em uma pesquisa de campo realizada por Millen et al. (2009) por meios eletrônicos
sendo 31 nutricionistas responsáveis por mais de 3.1 milhões de animais em sistema de
confinamento, e observaram que 100% dos que responderam ao questionário utilizavam os
ionóforos como principal aditivo alimentar.
Pereira et al. (2015) mostraram que somente resíduos de monensina puderam ser
detectados em amostras de leite, sendo que de 102 amostras analisadas, 14 apresentaram
resíduos de monensina.
2.4 Efeitos tóxicos da monensina
As intoxicações por ionóforos influenciam a contratilidade do tecido muscular,

produzindo efeitos farmacológicos agudos sobre o sistema cardiovascular, com aumento do
fluxo e dilatação coronariana. Vítimas de doença coronariana arterial podem ser mais
susceptíveis a efeitos adversos. São relatados na literatura casos de exposição acidental de
seres humanos, levando à insuficiência cardíaca e renal aguda, seguida de óbito (Pereira et al.,
2015).
Pavarini et al. (2011) observaram em surto de intoxicação por monensina, com valores
de 117 ppm do ionóforo, obtido por HPLC (High Performance Liquid Chromatography), em
rações comerciais para bovinos que foram consumidas por outras espécies animais. Eles
atribuem que o uso de rações de espécies diferentes e a mais provável causa de intoxicação
por ionóforos em animais de produção. A dose letal 50 (DL50), dose suficiente para levar a
óbito 50% da população de animais, para equinos é de 2-3 g/kg/peso vivo (PV), sendo essa
espécie a mais sensível.
19
Além dos efeitos tóxicos em equinos, espécie altamente sensível à monensina, o
aditivo também pode provocar intoxicações em bovinos quando em altas dosagens,
apresentando poucos relatos na literatura (Pereira, 2014).
Os sinais clínicos de intoxicação em equinos compreendem apatia, falta de
coordenação motora, relutância em andar e redução do apetite em sua fase inicial. Após
incapacidade de movimentar, apresentam decúbito esternal e lateral. Nos estágios finais
apresentaram sudorese, congestão das mucosas, taquicardia, respiração ofegante sons
abdominais diminuídos, gemidos, ranger de dentes e pedaleios (Bezerra Júnior et al., 2000).
Deljou et al. (2014) observaram os sinais clínicos de intoxicação por monensina em
caprinos e constataram taquicardia e diarreia. Monensina causou aumento no batimento
cardíaco e redução da contração ruminal. Houve aumento da temperatura nos 4 primeiros dias
e voltou ao normal após esse período. Também houve aumento nos níveis de parâmetros
sanguíneos quando comparados ao período prévio da administração da monensina. O estudo
sugere que a monensina causa danos no coração, nos músculos esqueléticos e nos rins.
Kouyoumdjian et al. (2001) descrevem que sinais clínicos em humanos são os mesmos
descritos na literatura para intoxicação em animais, sendo necrose muscular, insuficiência
renal e óbito, 13 vezes maior que a recomendação para bovinos que é entre 22,4 e 39,8 mg/kg
de peso vivo (PV).
Em 2008, o Codex Alimentarius, através do Comitê de Especialistas em Aditivos
Alimentares e Contaminantes (JECFA) avaliou alguns ionóforos poliéteres no que diz
respeito à toxicidade e segurança e Limite Médio Residual (LMR) de 2 μg/kg para a
substância monensina em leite para consumo humano, que posteriormente foi também
adotado pela Comissão Europeia (Pereira et al., 2015).
Não existindo antídoto para intoxicações por ionóforos, é possível fazer tratamentos
suporte com óleo mineral para evitar a absorção pelo intestino, soroterapia para combater a
desidratação e choque hipovolêmico (Nogueira et al., 2009).
2.5 Métodos de diagnóstico da monensina por ELISA
Os imunoensaios constituem na principal técnica utilizada para triagem inicial da

presença de monensina em amostras de origem animal (Crooks et al., 1997). A palavra
imunoensaio significa ensaio baseado na reação antígeno-anticorpo (Ag/Ac) que é a base da
imunologia e produção de vacinas (Duarte et al., 2006).
20
O Ensaio ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ou ensaio de
imunoabsorção enzimática, introduzido por Hommel em 1978, é uma metodologia que
permite a realização de grande número de exames em curto espaço de tempo, apresentando
alta sensibilidade (Barrichelo, 2010).
O ELISA é bastante sensível, fácil de ser executado e passível de automação,
possibilitando o exame de grande número de amostras (Oliveira, 2010).
Nesse teste, é necessário produzir o anticorpo contra a molécula que se pretende
detectar. Os anticorpos produzidos podem ser policlonais, quando se trata de soro de coelha
ou galinha, ou monoclonais quando são produzidos por fusão de baço de camundongo e
células de mieloma, que irão formar hibridomas e depois a seleção dos clones (Duarte et al.,
2002).
A identificação de resíduos, principalmente antibióticos e substancias antibióticas
classificadas como ionóforos é realizada quase que totalmente por imunoensaios, geralmente
do tipo ELISA por ser considerado um painel inicial de como estão as amostras quanto a
contaminação. Neste caso, o ELISA serve como base para depois as amostras positivas serem
submetidas a um teste confirmatório, como cromatografia, por exemplo.
Dolliver et al. (2006) avaliaram um imunoensaio do tipo ELISA para detecção de
monensina em amostras de alimentos de animais para determinar a monensina em água, solo e
estrume e demonstram que o uso do imunoensaio pode ser confiável para detecção de
monensina em amostras ambientais.
O imunoensaio também apresentou resposta positiva quando Makvandi-Nejad et al.
(2010) trabalharam com seleção de cadeia de fragmentos de anticorpos para verificar qual
sequência apresentaria melhor resposta em detecção da monensina mostrada pelo ensaio com
reação cruzada.
Devido ao uso dos ionóforos monensina e salinomicina na avicultura e as dosagens
usadas poderem apresentar problemas para outras espécies animais, Stanker et al. (1994)
desenvolveram imunoensaios com anticorpos monoclonais para detecção dos ionóforos pois
apresentam a vantagem da individualidade do imunoensaio quando comparados com outros
métodos.
Mount e Failla (1987) já descreviam um ensaio imunológico, baseado em anticorpos
produzidos em coelhas para identificação de monensina em soro e urina com limite de
detecção de 2 ɳg por mL de amostra.
21
De acordo com Crooks et al. (1997) um ELISA competitivo foi desenvolvido, baseado em
anticorpos policlonais para identificação de monensina em fígado de frangos. Nestes ensaios,
amostras positivas continham cerca de 2,91 g/kg (g de monensina por kg de fígado), mas com
amostras de até 102 g por kg. Os controles positivos foram obtidos utilizando o método de
fortificação de amostras (20 g/kg) para determinação da curva padrão e dos parâmetros de
validação do ensaio.
Em 1998, Crooks et al. (1998) desenvolveram um ensaio imunofluorimétrico para melhor
determinar monensina em amostras de soro de frango de corte. Os ensaios foram realizados
alimentando as aves com ração suplementada com monensina e depois comparações com o
imunoensaio e cromatografia tipo LC-MS foram realizadas. Hagren et al. (2006) desenvolveram
um ELISA para identificação de monensina em ovos de frangos de corte, baseados em anticorpos
policlonais e ensaio de competição. Neste trabalho foi determinado o limite de detecção de 2 g/kg
de amostra.
A cromatografia é uma metodologia também utilizada para análises de
monensina em amostras biológicas, como visto em Pereira et al. (2015) que utilizaram o
método HPLC para analisar amostras de leite contendo resíduo de monensina, por Pavarini et
al. (2011) que utilizaram a cromatografia do tipo HPLC para detecção em alimentos para
confirmar surtos de intoxicação e Lopes et al. (2008) que identificaram a monensina por
cromatografia massa/massa.
São vários os tipos de cromatografia utilizados para a detecção de poliéter em
amostras biológicas, como descrito por Pereira et al. (2015) que utilizaram cromatografia do
tipo LC-MS/MS (Liquid Chromatography Mass-Mass) para detectar resíduo de monensina
em amostras de aves, que utilizou HPLC para detectar resíduos de monensina em amostras de
leite, por Rokka et al. (2013) que validou uma metodologia LC-MS para detecção em
amostras de tecidos animal com a retirada do ionóforo em diferentes horas antes do abate.
A mesma análise LC-MS/MS foi utilizada pela comunidade europeia (EFSA, 2006)
para determinação dos limites de resíduos em tecidos animais e que é a base de estudo de
vários outros trabalhos.
22
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2017)

dispõe sobre limites de monensina que podem ser encontrados em carnes de suínos e aves, na
concentração de 10 ng por kg, e podem ser consumidos sem problemas para a saúde da
população. A Comunidade Europeia (EFSA, 2006) proíbe o uso de monensina, seja na
produção de suínos, aves ou na suplementação animal de bovinos. Desta forma, nosso
mercado exportador deve atender as normas internacionais e o grande desafio encontra-se em
identificar de forma eficiente resíduos de monensina como também encontrar meios de
substituir seu uso por produtos alternativos naturais de igual eficiência, principalmente
quando a monensina está contaminando ingredientes de forma indireta, através da levedura,
que constituem-se num excelente suplemento para ração animal.
23
4. REFERÊNCIAS
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28
CAPITULO 2 - PRODUÇÃO E VALIDAÇÃO DE ANTICORPOS
POLICLONAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE MONENSINA
RESUMO
A identificação correta de resíduos de monensina em alimentos para animais e carne, ovos e

leite é primeiro passo para determinar a quantidade de monensina presente na matriz
biológica, bem como para a certificação de alimentos orgânicos, que devem estar sem
monensina. Este trabalho teve como objetivo validar anticorpos policlonais, produzidos em
coelhas da raça Nova Zelândia, para identificar a monensina por imunoensaio. Para a
atividade imunogênica, a monensina foi purificada a partir de um produto comercial (20% de
monensina) e foi conjugada utilizando o método de bio-conjugação de carbodiimidas, com
Soro albumina bovina e carreador glutaraldeido. Os anticorpos foram produzidos ao longo de
60 dias e titulados por PTA-ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática com antígeno preso
na placa), lidos a 565 nm, com sistema enzimatico de revelação por peroxidase. Os soros
colhidos a cada 15 dias durante o esquema de imunização foram diluídos a 1: 800 e titulados.
Os valores de densidade óptica (D.O.) foram 0,17, 0,19, 0,22 e 0,23 para os dias 15, 30, 45 e
60, respectivamente. Os anticorpos produzidos foram capazes de identificar monensina em
amostras de ração comercial, farinha de carne e penas, leveduras liofilizadas e em amostras de
leite, a partir de curva padrão de monensina ( analise quantitativa) com sensibilidade de 10
µg/kg de amostra. A otimização destes ensaios foi realizada com tempos entre etapas de 1
hora de incubação, temperatura de 37°C. Das 36 amostras de ração de animais, levedura,
farinhas e leite utilizadas, 75% (27) apresentaram residuos de monensina e 25% (9) foram
negativas, incluindo todas as amsotras de leite e de ração para equinos. Outros parâmetros de
validação utilizados foram a recuperação de monensina, utilizando claras de ovos como
matriz fortificada, com recuperação media de 93,9% e precisão e repetibilidade dos
imunoensaios, com 5,24 de CV% e desvio padrão de 0,056 , de forma que este soro policlonal
produzido está dentro dos parametros internacionais para ensaios de triagem inicial com
ELISA. Embora a presença de monensina, nestas quantidades não represente risco a saúde,
inviabiliza a exportação de produtos bem como a certificação de rações como orgânicas ou
livres de antibióticos.
Palavras-chave: ELISA, ionóforo, segurança alimentar
29
PRODUCTION AND VALIDATION OF POLYCLONAL ANTIBODIES
TO IDENTIFY MONENSIN
ABSTRACT
The correct identification of monensin residues in meat, milk, egg and animal feed is
important to stablish a quantitative method for its identification in biological matrix, as well
as for the certification of organic food. This experiment raised polyclonal antibodies in female
New Zealand rabbits to identify monensin by immunoassay. For the immunogenic activity,
commercial monensin (produto comercial 20%) was bioconjugated to Bovine sera albumin
(BSA) using the carbodiimides methodology, and glutaraldehyde as carrier. Antibodies were
produced for 60 days of immunization and tittered by PTA-ELISA (Plate trapped antigen-
enzyme linked immunosorbent assay) read at 565 nm, horseradish peroxidase, in microplate
reader. Sera were harvested each 15 days, diluted 1:800 and tittered. O.D. (Optical density)
values were 0.17; 0.19; 0.22 and 0.23 for days 15, 30, 45 and 60, respectively. Antibodies
raised were able to identify monensin in commercial feed samples, meat and feathers meal,
dried yeast and milk based upon a standard curve built on monensin standard (quantitative
data) at sensibility of 10 µg/kg of sample. Optimization of the immunoassay stablished the
following parameters: one hour of incubation for each step, 37 °C. From 36 feed samples
meat and feathers meal, yeast and milk, 75% (27) presented monensin residues and 25 % (9)
were negative, including all milk samples and equine feed. Other parameters of validation
were the recovery of monensin using spiked egg white, with recovery of 93. 9%and precision
and repeatability of immunoassays with 5.24 of CV% (coefficient of variation) and standard
deviation of 0.056 in the way this sera produced attend the international standards for initial
screening with ELISA. Although this amount of monensin did not present health risks to
animals or humans, unfeasible the exportation of products as well as the organic certification
for feed free of antibiotics.
Key words: ELISA, ionophores, food safety
30
1. INTRODUÇÃO
A monensina faz parte da classe dos ionóforos poliéteres (figura 1), que são
antibióticos largamente empregados na alimentação animal para prevenir e tratar a coccidiose,
enfermidade causada por protozoários dos gêneros Eimeria bovis e Eimeria suernii que
residem na mucosa intestinal. Além de serem agentes anticoccidianos, os ionóforos atuam
como promotores de crescimento em diversos animais de produção, como bovinos e suínos,
melhorando a eficiência alimentar e a taxa de ganho de peso. Em ruminantes são empregados
ainda para aumentar a produção de leite em vacas em lactação (Pereira et al., 2015). Seu uso
contudo, foi banido pela Comunidade Europeia desde 2006 (Rigobello e Millen, 2014)
Figura 1. Estrutura molecular da Monensina Sódica

Fonte: PubChem (2016).
A identificação de resíduos sejam eles antibióticos, hormônios, ionóforos, etc., pode

ser realizada de diferentes modos. Os imunoensaios do tipo ensaio imunoenzimatico em
suporte solido (ELISA) constituem em metodologia prática, rápida e com inúmeras vantagens
sobre outras, como custo e repetibilidade (Duarte et al., 2006)
A palavra imunoensaio significa ensaio baseado na reação antígeno-anticorpo (Ag/Ac)
que é a base da imunologia e produção de vacinas (Duarte et al, 2006). É uma metodologia
que permite a realização de grande número de exames em curto espaço de tempo,
apresentando alta sensibilidade (Barrichelo, 2010).
31
O ELISA é bastante sensível, fácil de ser executado e passível de automação,
possibilitando o exame de grande número de amostras (Duarte et al, 2002; Oliveira et al.,
2010).
O teste do tipo ELISA também é considerado uma maneira adicional de se verificar a
presença de imunidade pela presença de um aumento no nível de anticorpos na titulação
(Bertolini, 2014).
Atualmente, a recomendação que se faz é de que os resultados positivos do teste de
ELISA devem ser acompanhados de técnicas cromatográficas instrumentais mais especificas
para devida confirmação (Motta e Duarte, 2010).
Segundo Pereira (2014) o uso da monensina pode ser tóxico para outras espécies,
principalmente os equinos. O aditivo pode causar intoxicações em bovinos quando em altas
dosagens, porém é pouco descrito na literatura. O autor relata que existe uma preocupação da
população com relação sobre a excreção da monensina e que uma parte pode ser acumulada
no tecido muscular e provocar uma possível resistência de certos microorganismos.
Na Instrução Normativa n°09, de 21 de abril de 2017 (BRASIL, 2017) referente ao
Plano Nacional de Controle de Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal –
PNCRB, os limites de resíduos de monensina em 10µg por kg, para amostras de carne de
suínos e aves, sem referência a ração, leite ou outras matrizes biológicas, em contraposto com
as diretrizes europeias que proíbem o uso deste antibiótico na comunidade Europeia desde
2006 (Pereira et al, 2015).
Esse tipo de teste poderia ser utilizado pelos órgãos reguladores do governo, pois
possibilita manter controle de produtos exportados para países onde a monensina não é mais
permitida na produção animal, como países da União Europeia e até mesmo por empresas
certificadoras de produtos livres de antibióticos, nesse caso a monensina.
Objetivou-se com o trabalho produzir anticorpos contra monensina e validar uma
metodologia baseada em imunoensaios para verificar a presença ou a ausência de monensina
em amostras biológicas com baixo custo e de forma rápida para obtenção de resultados,
visando à saúde das pessoas e dos animais que são sensíveis ao ionóforo.
32
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Produção de anticorpos anti-monensina
A produção de anticorpos policlonais seguiu protocolos rígidos aprovados por CEEA

(Comitê de Ética e Experimentação Animal do IZ, 047/07). Para a produção dos anticorpos
policlonais foi usado um produto comercial com 20% de monensina total. O experimento foi
realizado no Laboratório de Produção de Anticorpos e Imunoensaios do IZ, Nova Odessa-SP.
A bioconjugação foi feita pelo método das carbodiimidas, permitindo que houvesse
resposta imunológica e consequentemente produção de anticorpos anti-monensina. Foram
usadas 25 mg de monensina em 2,25 mL de dimetilformamida, adicionadas de 25 mg de 1-
etil-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide HCL (EDC) e 50mg de Soro albumina Bovina-
fração V (BSA) dissolvidas em 2,5 mL de Tampão fosfato 0,5M (pH 7.0). Agitou-se por 3
dias a 4°C. Em seguida foi dialisado contra NaHCO3 0,05M por 72 horas (Hermanson, 1996;
Hagren et al., 2006).
Foram usadas duas coelhas da raça Nova Zelândia, com 45 dias de idade para
obtenção de anticorpos policlonais anti-monensina. As imunizações foram feitas por via
intramuscular no dorso. Cada animal recebeu 4 imunizações intercaladas quinzenalmente,
segundo metodologia descrita por Duarte et al. (2007). As doses das imunizações foram de
0,2 mL por coelha, sendo que ½ dose é do conjugado e a outra metade de Adjuvante
Completo de Freund (Sigma F5881), na primeira imunização.
Antes de cada imunização foram coletadas amostras sanguíneas para titulação dos
anticorpos, através de pequenas punções na orelha de cerca de 0,5 mL de sangue. As
titulações foram realizadas por Ensaios Imunoenzimáticos que foram otimizados conforme
protocolos descritos anteriormente (Crowther, 2009). Nestes ensaios foram avaliados: diluição
dos antissoros, sistema de bloqueio do ensaio (soro albumina bovina (BSA)), concentração
dos reagentes de coloração e melhor sistema de PTA- ELISA (Plate Trapped Antigen ELISA)
com Peroxidase (HRP) onde as absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro do tipo leitor
de microplacas Biorad, a 565 nm. Os tempos para cada passo do ensaio também foram
otimizados, de modo a permitir uma melhor visualização dos resultados.
2.2 Amostras biológicas
33
Amostras de ração comercial destinadas a diversos animais de produção e de
companhia (Tabela 1) foram obtidas em estabelecimentos comerciais e em agropecuárias,
assim como amostras de farinha de carne e ossos e vísceras. As amostras de leveduras foram
obtidas de usinas de cana de açúcar, que destinam esse resíduo para indústrias de suplemento
vitamínico mineral de ração. No laboratório, 1 g de cada amostra foi pesada em frasco limpo,
ressuspendida em 9 mL de tampão PBS (Tampão fosfato) e agitadas até completa dissolução
de sólidos e congeladas a -20 0C em alíquotas de 1 mL para posterior uso nos ensaios de
ELISA. Embora exista uma carência de informações nas embalagens, a adição de leveduras
na formulação era informada pelos fabricantes nos rótulos de alguns produtos.
Assim, as amostras continham em suas embalagens a descrição dos componentes básicos
e em sua grande maioria apresentavam leveduras e/ou subprodutos como prébioticos. Uma
amostra das rações para cães continha os dizeres “orgânico” no rótulo (composição).
2.3 PTA- ELISA
Os ensaios imunoenzimáticos foram realizados no Laboratório de Cana, APTA/SAA,

Polo Regional Centro Sul (Piracicaba, SP) e foram otimizados de acordo com Crowther
(2009) com adaptações. No PTA- ELISA, as análises foram feitas em triplicata em placas de
microtitulação de 96 cavidades fundo chato (Corning High Binding, EUA).
As placas foram sensibilizadas com 100 µL de antígeno (monensina sódica e
amostras) e deixadas em temperatura ambiente overnight, o bloqueio foi feito usando 200uL
de PBS (Solução Tampão Fosfato), adicionado de Soro albumina Bovina (BSA) 1% e
incubado por uma hora a 37 °C. Em seguida adicionou-se 100 µL do soro anti-monensina
(1:500), e incubado novamente por uma hora a 37 °C. Após foi lavadas três vezes com PTG
(PBS, Tween 20 a 0,05% e 0,25 % Gelatina) e adicionado conjugado “goat High bind IgG”
anti-coelho marcado com fosfatase alcalina, depois de uma hora a 37 °C, foram lavadas
novamente três vezes com PTG e reveladas com PNPP (p-nitrophenil phosfate), incubadas
por 30 minutos e a leitura realizada a 420 ɳm em leitor de microplacas, Biorad (Benetau-
Pelissero et al., 2003; Pongkitwitoon et al., 2010; Shinkaruk et al., 2008). Os dados foram
tabulados para posterior análise.
34
2.4 Validação do ELISA
A validação do ELISA foi realizada com os parâmetros de sensibilidade e

repetibilidade do ensaio.
Para quantificação e determinação da sensibilidade do teste, uma curva padrão foi
construída com diluição a partir da solução estoque de monensina utilizada nas imunizações
de coelhas. Partindo de uma solução padrão contendo 1 grama de monensina, diluições em
série, na base 10 foram realizadas até 10-6. Foi então determinado um intervalo onde os pontos
da curva melhor se interpolavam numa diluição entre 0,0002 e 0,4 g/kg. Cada solução foi
usada para curva de quantificação de monensina, no ELISA onde foram obtidos equação da
curva e regressão.
Sensibilidade do ELISA foi realizado com o ensaio de fortificação de amostras,
segundo metodologia descrita em Harlow e Lane (1988) para determinação dos parâmetros de
validação, conforme descrito em Paschoal et al. (2004) e Paschoal et al. (2008) utilizando
clara de ovos. Os ovos orgânicos foram obtidos no mercado local, de produtores certificados.
Seis claras de ovos foram separadas das gemas, homogeneizadas e alíquotas de 1 grama foram
estocadas congeladas a -20°C. As alíquotas foram descongeladas e dissolvidas em 9 mL de
PBS. Novamente as amostras foram aliquotadas em tubos de1 mL e acrescidas de
concentrações conhecidas de monensina e, então foram tituladas em PTA-ELISA, conforme
protocolo descrito anteriormente, utilizando Fosfatase Alcalina como sistema enzimático e
lidas a 420 ɳm em leitor de microplacas.
A repetibilidade foi realizada com amostras de monensina e de leveduras de usina,
devidamente pesadas (1 g de amostras em 9 mL de PBS), em ELISA com 7 repetições. A
análise dos dados foi realizada com coeficiente de variação e desvio padrão para determinar a
precisão do ensaio (Paschoal et al., 2004).
35
Tabela 1 – Amostras biológicas (matriz) utilizadas nos imunoensaios, conforme animal, contendo ou não
leveduras adicionadas e características constantes nos rótulos.
Ração Espécie Levedura Características Marca

Cão Sim Prebiotico a
Cão Sim Gourmet a
Cão Sim Prebiotico a
Cão sim Orgânico a
Cão ... ... c
Gato Sim Filhote b
Gato Sim Frango e arroz a
Gato Sim Salmão a
Suíno ... ... d
Suíno ... Creche inicial d
Suíno ... Creche inicial d
Frango postura ... ... d
Frango corte ... Inicial c
Frango corte ... Engorda c
Frango poedeira ... ... c
Frango corte ... Inicial c
Frango corte ... Engorda c
Equino ... 14 % pb d
Equino ... 15% pb d
Equino ... 18% pb – 1 d
Equino ... 18% pb – 2 d
Bovino ... ... d
Bezerro ... ... d
Coelho ... ... c
outras matrizes- sem informação
sobre acréscimo de leveduras
Bovina e
Farinhas de origem
Bovina f
animal
Bovina g
Peixes
Frango
Suplemento mineral Controle

negativo
UHT h
Leite
UHT i
UHT j
Levedura
Usina1 k
Usina2 k
*Marca das rações, diferenciadas por letras, de dez marcas comerciais. O sinal “...” representa ausência de
informações.
36
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Figura 2, anticorpos foram produzidos em coelhas contra o bioconjugado BSA-

monensina e apresentaram resposta imunológicas com titulação por PTA-ELISA. Resultados
similares foram obtidos por Hagren et al. (2006). Após as imunizações, uma das coelhas foi
escolhida para completa exsanguinação e, após centrifugação, coleta e alíquotas de soro foram
armazenadas a -20°C (Figura 2).
0,25
0,20
D.O. a 565 nm
0,15
coelho 1
0,10
coelho 2
0,05
0,00
s1 s2 s3 s4
Titulação a cada 15 dias
Figura 2 – Titulação por PTA-ELISA de soros coletados a cada 15 dias ( S1= soro 1; S2= soro 2; S3= soro 3 e;
S4= soro 4) de coelhas imunizadas com monensina bioconjugada com BSA. Valores expressos em D.O a 565
nm.
A monensina foi aliquotada para obtenção de uma curva de calibração, pelo ELISA,
para validação do ensiao quantitativo (baseado na equação da curva de monensina sódica).
Resultados (Figura 3) podem ser visualizados, com R= 0,9986.
37
0,045
0,040
y = 0,0489x2 - 0,0458x + 0,0153
0,035 R² = 0,932
g de monensina / kg 0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0,00 0,50 1,00 1,50
D.O. a 420 nm
Figura 3: Titulação por PTA-ELISA da curva de monensina (g por kg de ração comercial) expressos em D.O. a
420 nm
A partir da curva de calibração de monensina, as amostras de ração foram tituladas por PTA-
ELISA para verificação de monensina em sua fórmula. As amostras foram consideradas
positivas quando o resultado superava a amostra negativa vezes dois (no caso, D.O. a 420 ɳm
de 0,172), procedimento adotado anteriormente para ensaios deste tipo (Sutula, 1986). Das 36
amostras testadas, 9 apresentaram-se negativas para monensina, sendo três as amostras de
leite e três as amostras de ração de equinos. Isto é muito positivo, uma vez que os equinos são
extremamente sensíveis a monensina (Pavarini et al., 2011) e o leite é alimento destinado a
alimentação humana.
38
1,40
1,20
1,00
D.O. 420 nm
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
6
34
1
2
3
4
5
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
35
36
lev1
lev2
monensina
matriz biologica utilizada ( ração, leite, levedura, farinha de visceras)
Figura 4: Titulação da monensina presente em amostras de ração (1 a 20; 27; 30 a 32) e em duas amostras de
levedura seca; 7 amostras de farinha de vísceras (23 a 26 e 28) e amostras de leite (34 a 36): controles negativos
(29 e 33); controle positivo: monensina Comercial com concentração de 40 mg por kg no ensaio. Barras em
amarelo representam amostras negativas para monensina.
Conforme a Figura 4, foi construída uma tabela (Tabela 2) com os valores corrigidos
de mg de monensina po kg de amostra de ração, tituladas por ELISA e convertidas em mg/kg
(ppm). As demais amostras, de acordo com Sutula et al. (1986) foram consideradas positivas
para monensina. Estes resultados mostram que a contaminação deste ionóforo aparece em
pequenas quantidades em amostras de ração, sejam vindas da levedura adicionada seja por
outras fontes de contaminação (outros ingredientes das formulações).
No caso das rações, apesar das concentrações serem pequenas, abaixo do limite
estabelecido pelo MAPA (BRASIL, 2017) de 10 µg/kg, o fato do comerciante desconhecer tal
fato é que preocupa o consumidor final. Para o mercado de Pet, essa informação não tem
muita relevância, mas para o mercado de alimentação humana (carne suína, frangos e carne
bovina), o fato de rações serem comercializadas com resíduos de ionóforos, ou seja,
antibióticos pode se tornar fato preocupante devido a induzir resistência no indivíduo que
consome esses alimentos. Felizmente não houve resíduos nas amostras de leite analisadas
(Pereira et al., 2015).
39
Tabela 2- Quantificação de monensina das amostras de ração (1 a 20; 27; 30 a 32) e em duas amostras de
levedura seca; 7 amostras de farinha de vísceras (23 a 26 e 28) e amostras de leite; controle negativo (29);
Padrão: monensina comercial com concentração de 4 mg ajustado pela equação da curva .
amostra mg/kg amostra mg/kg

Padrão 3,604 18 0,534
1 1,957 19 0,519
2 0,660 20 0,703
3 0,570 lev1 3,169
4 0,495 lev2 0,452
5 0,896 23 0,586
6 2,706 24 1,241
7 0,576 25 0,504
8 2,922 26 1,592
9 1,359 27 0,065
10 0,485 28 0,445
11 0,451 29 0,171
12 0,814 30 0,467
13 0,858 31 0,794
14 0,586 32 0,665
15 1,165 leite 0,085
16 1,475 leite 0,074
17 0,532 leite 0,072
A recuperação de amostras (Tabela 3) segue protocolos de validação, onde as medias

devem estar entre 2 a 7 % de diferença da curva padrão (Paschoal et al. 2004).
Nesta tabela (Tabela 3) pode-se também observar que a sensibilidade do método chega
a 0,001 g/kg, uma vez que o valor menor não atinge boa recuperação (maior que 7%), na
tabela valor de diluição de 0,0001 g/kg, recuperação 86,86% menor que 93%.
40
Tabela 3 – Fortificação de amostras de clara de ovos, comparadas com curva padrão de monensina sódica,
diluída em tampão PBS. Clara fortificada com mesma curva de monensina sódica e % de recuperação de
monensina nas amostras de clara.
monensina clara fortificada % recuperação*

g/kg D.O. D.O.
0,1 1,364 1,307 95,82111437
0,01 1,36 1,288 94,70588235
0,001 1,345 1,264 93,97769517
0,0001 1,309 1,137 86,86019862
*porcentagem de recuperação dentro do limite de 7%, descrito em

Paschoal et al, 2004
A precisão do ensaio foi avaliada com PTA-ELISA de amostras de monensina

comercial 20 % e amostras de levedura da Usina onde, segundo a Tabela 4, o coeficiente de
variação ficou em 5,24%, muito bom considerando as repetições (sete) e o ensaio de ELISA
proposto, com desvio padrão 0,056, sendo considerados com boa precisão e alta
repetibilidade.
Tabela 4 – Parâmetros de avaliação de precisão dentre de ensaio. PTA-ELISA com sete repetições (n).Placa 1:
monensina comercial 20% e placa 2 e 3, leveduras de diferentes usinas.
Coef. variação
placa n min max media desvio padrão (C.V.) %
1 7 1,1403 1,338 1,215 0,086 7,0781893
2 7 1,048 1,157 1,121 0,045 4,014272971
3 7 0,782 0,894 0,821 0,038 4,628501827
Média do C.V 5,24%
Segundo a EFSA (2006) a monensina sódica é absorvida de forma limitada (11-31%)

e eliminada principalmente pelas fezes (99% depois de 48 horas) sendo que a excreção biliar
representa 10 a 15%. Também cita um experimento em que grupos de frangos de corte,
compostos por três fêmeas e três machos, receberam ração contendo 125 ppm de monensina
41
durante 35 dias e em seguida foram abatidos após zero, um, dois e quatro dias da retirada da
ração medicada, para pesquisa de resíduos no fígado, rins, músculo, pele e gordura, por LC-
MS/MS. Na coleta do dia zero do período de retirada, resíduos de monensina foram
detectados em todos os tecidos e a concentração encontrada no músculo foi de 10 µg.kg-1 Nas
demais coletas, resíduos da droga foram encontrados apenas na pele e na gordura, sugerindo
que houve excreção da monensina.
Devido à presença de monensina em várias rações comerciais que não apresentam o
ionóforo em sua composição, um fator importante a se considerar também é a contaminação
cruzada em linhas de produção nas fábricas que produzem suplemento vitamínico mineral,
pois segundo Lima (2016) o uso de somente uma linha para a fabricação de rações para várias
espécies pode permitir que resíduos de anti-coccidiostáticos de uma ração passem para outra
que será produzida.
As observações de Rokka et al. (2013) com resíduos de monensina em amostras
obtidas nas fábricas de ração em concentrações variando entre 0,025 a 0.73 mg.kg-1 podem
explicar a presença da monensina nas amostras de ração pois, segundo o autor, após a
passagem de 3,2 toneladas de ração pela linha de mistura, foram encontradas concentrações
entre 0,025 a 0,27 mg.kg-1 de monensina, o que mostra a possibilidade de contaminação
durante a fabricação de ração, o que reforça a necessidade de um bom processo de limpeza e
desinfecção da linha e acompanhamento de controle de resíduos.
Em um estudo sobre processo de limpeza das linhas em fábricas de ração, Borges
(2010) relata métodos de limpeza para fábrica de Suplemento vitamínico mineral, onde alguns
tipos de limpeza seriam eficientes, porém devido ao tipo de equipamento usado na produção
não são totalmente aplicáveis. Nesse caso as práticas comuns de limpeza seriam a limpeza
manual, onde equipamentos precisam ser desmontados e devido ao tempo gasto com
paralisação da produção acarreta em custos para a fábrica. Outra prática descrita é a de
“flushing”, que consiste em passar uma quantidade de um ingrediente na linha para realizar
um arraste de resíduos e posterior descarte ou reprocesso em produtos que utilizam o ionóforo
em sua formulação. Martinez-Kawas (2008) recomenda que uma quantidade de material para
“flushing” entre 10 e 15% da capacidade do misturador seria capaz de promover um arraste de
90% do material contaminante.
Um ponto crítico para monitorar é a presença da monensina nos coprodutos da
indústria sucroalcooleira, pois a presença em duas amostras analisadas corroboram com os
dados de Ferri et al. (2014) onde a grande maioria das usinas utilizam o ionóforo para controle
42
de possíveis contaminações por bactérias não desejáveis ao processo fermentativo ou por
leveduras selvagens.
Os resíduos de monensina encontrados nas amostras também podem ser explicados
pela possível inclusão de coproduto de abatedouros de animais que foram abatidos sem o
devido tempo de suspensão do ionóforo, ou seja, o período de carência, como relata Okada et
al. (1980) que após horas de suspensão de retirada do ionóforo da dieta, encontrou-se 10ug/kg
monensina nos tecidos nos animais que foram abatidos sem a retirada do ionóforo da dieta
(Lima, 2016).
43
4. CONCLUSÕES
Foram produzidos anticorpos para identificação de monensina em amostras biológicas.

Os parâmetros de validação encontrados foram: sensibilidade de 10 mg/kg de amostra;
recuperação de 93, 9% e repetibilidade com desvio padrão de 0,056 e coeficiente de variação
de 5,24%. O teste foi validado e poder ser aplicado como uma opção de triagem pelos órgãos
reguladores para realizar amostragem inicial, com baixo custo, em produtos destinados à
exportação e pelas certificadoras de produtos livres de antibióticos, no caso para monensina.
44
5. REFERÊNCIAS
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ELISA data and establishing the positive negative threshold. Plant Disease, v.70, p.722-726,
1986.
48
CAPÍTULO 3 – A monensina no Mercado de rações: conhecimento e
percepção de produtores
RESUMO
Diante da grande oferta de rações, suplemento vitamínico mineral e aditivos que são
constituintes das rações oferecidas aos animais de produção e de companhia, principalmente a
levedura que carrega resíduos de monensina do processo fermentativo da indústria
sucroalcooleira, é grande a falta de conhecimento é grande a falta de conhecimento sobre os
ingredientes que compõem as rações e alimentos dos animais. Com o objetivo de avaliar o
conhecimento sobre monensina e seu possível risco na alimentação, desenvolveu-se um
ensaio piloto através de questionários feitos a pequenos produtores pertencentes às regiões de
Limeira, Piracicaba, Mogi Mirim e Campinas. Para levantar tais informações foi realizado um
questionário com 14 perguntas que caracterizam a propriedade, o tipo de alimentação,
assistência de profissional qualificado e o conhecimento sobre adição de monensina e seus
possíveis riscos na alimentação dos animais. Nesse ensaio, 18 pessoas foram entrevistadas,
satisfazendo o conceito conhecido como critério de saturação já que as repostas se repetiam e
não mudariam o resultado final. Foi verificado que a predominância de criação é de bovinos
de corte com 43% dos entrevistados nessa atividade, seguida por criação de equinos com 39%
do total de por criadores de aves com 33%. Desse total 78% dos entrevistados possuem
assistência de zootecnistas ou de médico veterinário, sendo 22% e 56% respectivamente. Os
produtores em sua maioria, 78% desconhecem a adição de levedura, 72% não sabem se é
adicionado monensina no suplemento vitamínico mineral, 67% não conhecem sobre resíduo
de monensina e quando questionados sobre riscos do resíduo de monensina na ração, 72%
nunca ouviram falar, 28% somente conhecem a intoxicação em equinos e destes, 6% dizem
conhecer alergia e intoxicação em humanos e 6% relatam conhecer que é problema para
exportação. Foi observado que embora os produtores possuem assistência qualificada existe a
falta de conhecimentos sobre a composição das rações e os aditivos utilizados na sua
composição e sobre os riscos que a monensina pode trazer para saúde dos animais dos
humanos.
Palavras-chave: questionário, ionóforo, intoxicação, produtor rural
49
ABSTRACT
Facing the wide demand for animal feed, premix and additives that are constituents of feed
offered to livestock and pets, yeast is one of the most important ingredient added but it can
carries monensin residues, from the fermentative process from alcoholic-sugar industry and
the lack of information of the farmers related to the feed given to their animals or raised as
pets is huge. This study aimed to evaluated, by questionaries, the knowledge about monensin,
it risks for animal and human health among small farmers, from region of Limeira, Piracicaba,
Mogi Mirim and Campinas. In order to raise such information a quiz with 14 questions were
elaborated to characterize size of property, kind of feed obtained, species raised, presence of a
technician in the farm, knowledge about monensin addition on the feed and possible risks to
livestock. In total, 18 farmers were interviewed, satisfying the principle of saturation, where
answers repeated did not change the final results. It was verified that is a predominance of
beef cattle, with 43%, followed by equine 39% and poultry, 33%. From all interviewed
farmers, 78% had a technical assistance, being 56% from a veterinarian and 22% from a
Zootechnist. The majority of farmers does not know the yeast addition to feed (78%) and 72%
does not know about monensin addition to premix; 67% does not know about the risks of
monensin contamination. 72% never heard about; 28% know about equine intoxication and
from them, 6% have some knowledge about allergies and human intoxications and 6% show a
concern about exportations. It was observed that although farmers count on technical
assistance, there is a lack of knowledge about feed compositions, supplements and additives
used, as well as the risks of monensin to animal and human health.
Key-words: quiz, ionophores, intoxication, farmer
50
1. INTRODUÇÃO
A indústria de rações de pets e animais de produção constitui-se num mercado cada

vez maior e com adição de suplementos ricos e de diferentes fontes de nutrientes, trazendo a
ração final acréscimos nutricionais agregadores de características diversas, como por
exemplo, vitaminas, sais minerais, pro e pré-bióticos, fontes de selênio, zinco e outros
minerais, etc. Neste contexto, a adição de levedura seca a rações animais, tanto de cães e
gatos como de bovinos e ovinos, vem se tornando uma atividade promissora, uma vez que a
levedura é um coproduto da fermentação de açúcar e álcool, indústria de grande expoente no
mercado brasileiro. A levedura, na usina, é acrescida de um agente coccidiostático, com
potencial de ação em bactérias Gram positivas, a monensina, utilizada em grande parte das
usinas do setor sucroalcooleiro para combater as bactérias contaminantes do processo (Ferri et
al, 2014).
Para que ocorra a produção de etanol nas usinas, elas utilizam leveduras que
fermentam o mosto nas dornas e ao final de cada processo, uma parte das leveduras, de 25 a
40 g por litro de etanol produzido, é descartada, para que ocorra o crescimento de novas
leveduras e assim o processo de fermentação apresente os resultados esperados em todas as
suas etapas (Rodrigues, 2011). As leveduras que são descartadas, aproximadamente 10%,
constituem em um coproduto de interesse na indústria de nutrição animal, pois apresentam
altos níveis de proteína bruta (PB), bom balanço de aminoácido e é rica em vitaminas
principalmente do complexo B (Yamada et al, 2003). Por isso as empresas a utilizam como
suplemente em suas rações.
A monensina sódica é um ionóforo dos grupos dos poliéter e desde sua descoberta na
década de 70 é largamente utilizada na alimentação animal como promotor de crescimento
segundo (Ribeiro et al, 2000) e também utilizada como agente coccidiostático em frangos
(Ribeiro et al., 2000), como modulador das proporções de acetato:propionato em bovinos
(Rivera et al., 2010), melhora digestibilidade intestinal de PB em dietas com baixo nível de
PB (Zeoula et al., 2008) além da melhora na conversão alimentar de ovinos (Gastaldello
Junior et al, 2010).
Diante do conceito de sustentabilidade o uso desse coproduto na nutrição animal
contempla os três pilares da sustentabilidade (economicamente viável, socialmente justo e
ecologicamente correto), pois um resíduo que seria descartado no meio ambiente passa a ser
parte de uma nova cadeia produtiva, a da nutrição animal e se apresenta com valor acessível
51
aos produtores e fábricas de ração, emprega pessoas para trabalhar com os processos de
transformação da levedura filtrada na usina em leveduras secas e derivados e evitam que um
alto volume de resíduos sejam descartados no meio ambiente.
Um ponto importante para destacar é o uso de monensina nas usinas (Figura 1) onde
foi adicionado o ionóforo como antibiótico nas dornas de fermentação e se torna contaminante
dos coprodutos que são comercializados como ingrediente ou aditivos para nutrição animal e
podem causar diversos danos tanto aos animais que são sensíveis, caso dos equinos onde
doses de 2 a 4 ppm podem levá-los à morte, ou até em humanos sensíveis à monensina ao
consumirem produtos com resíduo do antibiótico (Pavarini et al, 2011).
Figura 1. Esquema de utilização de Monensina nas usinas sucroalcooleiras.
Esse coproduto resultante do processo fermentativo pode conter traços de monensina

que ao ser administrado aos animais via suplemento vitamínico mineral ou suplemento serão
eliminados em sua maioria pelas fezes e urina. Outra pequena parte absorvida poderá ser
eliminada via leite (Pereira et al., 2015) e ser consumida pela população sem o conhecimento
dos riscos.
De acordo com o IBGE (IBGE, 2006), como mostrado na Figura 2, o número de
animais predominantes no estado de São Paulo é de bovinos com 10.506.430 de cabeças. Os
equinos são representados por 302.282 animais, ocupando a 4ª posição e as aves representam
236.149 cabeças na 5ª posição. Uma grande parte dos animais são criados em pequenas
52
propriedades como cultura de subsistência, onde aves e ruminantes são abatidos para o
próprio consumo.
Figura 2. Censo Agropecuário IBGE (2006), adaptado do site oficial.
A pesquisa em forma de questionário, de natureza aplicada, realizada diretamente aos

produtores rurais nos permite saber como está o nível de conhecimento em relação à produção
e alimentação animal e traz a percepção sobre os produtos utilizados na criação, além de
colaborar para levantar dados que experimentos não trazem para a literatura.
É comum o uso de produtos por indicações de profissionais que visam lucro de
empresas do setor e muitas vezes não apresentam o preparo necessário para atender à
demanda de informações que o pequeno produtor necessita. Dessa forma os produtos
contendo resíduos de monensina são adicionados à cadeia produtiva sem o conhecimento do
produtor que por sua vez continua com o ciclo produtivo dos animais sem maiores cuidados.
Objetivou-se com o estudo avaliar através de questionário o nível de informação que
produtores apresentam em relação à monensina e seus efeitos tóxicos quando adicionado a
ração.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Durante os meses de agosto a dezembro de 2017, foram entrevistados 18 produtores

nas cidades delimitadas no mapa da Figura 3 pertencentes às regiões de Limeira, Piracicaba,
Mogi Mirim e Campinas onde predominam pequenos produtores geralmente voltados à
53
agricultura familiar e de subsistência. Esse número foi considerado adequado e suficiente,
pois satisfaz o critério de saturação. Esse critério consiste em realizar entrevistas até o
momento que se percebe que não são coletadas informações novas (SÁ, 1998). Em Artur
Nogueira e Cosmópolis, os produtores foram entrevistados em casas agropecuárias e na
cidade de Mogi Mirim no balcão de vendas de uma fábrica de ração, onde foi possível
entrevistar pessoas de diferentes cidades da região (Figura 3 – Mapa da região).
Figura 3 – Mapa do Estado de São Paulo, delimitando a área onde foram aplicados os questionários.
O questionário (Anexo I) aplicado e respondido pelos produtores era composto por 14

perguntas simples, de fácil entendimento e preenchimento e contemplava perguntas referentes
à propriedade e aos animais, à alimentação, à assistência de profissional qualificado e sobre os
benefícios e os riscos da monensina. A palavra “premix” usada no questionário refere-se ao
suplemente vitamínico mineral usado pelas fábricas de ração com a finalidade de enriquecer e
balancear as rações comerciais.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Tabela 1 podemos observar que o tamanho médio da propriedade foi de 20

hectares, as principais espécies criadas foram bovinos de corte, equinos e aves com 44, 39 e
54
33% respectivamente. Para esse resultado, foi considerado que seis entrevistados responderam
criar mais de uma espécie na propriedade, sendo duas respostas bovinos de corte e bovinos de
leite, duas respostas bovinos de corte e equinos, duas respostas aves e equinos.
Tabela 1 – Caracterização das propriedades rurais dos entrevistados

Característica Média Mínimo Máximo
Tamanho (ha) 20.08 0,035 116,16
Espécies N % do total
Bovinos Corte 8 44
Bovinos Leite 2 11
Caprinos/Ovinos 1 6
Aves 6 33
Suínos 0 0
Equinos 7 39
Outros 0 0
Como é possível observar o consumo de ração por essas espécies (Figura 4), o
consumo de ração é relativamente baixo em ruminantes e aves, que pode ser justificado pela
criação de bovinos em pastagem e das aves a alimentação junto com milho grão. Já em
equinos, espécie mais sensível a alimentação ocorre principalmente via ração.
6%
Até 100 kg
17% 28%
100-500 kg
500-1000 kg
mais de 1000 kg
28%
22% Outros
Figura 4. Consumo de ração, segundo informações do questionário.
55
outros Até 100
22% 28%
kg
23%
mais de
1000
11% 72%
Sim
500- 100-500 Não
1000 22%
22%
Figura 5. Consumo de ração, segundo questionário aplicado. Lado esquerdo apresenta o consumo de ração com
suplemento vitamínico mineral e do lado direito se o produtor sabe a composição do suplemento vitamínico
mineral.
Quando questionados sobre a composição da ração e do suplemento vitamínico

mineral, 72% dos produtores dizem não saber o que tem (Figura 5), e o uso em 50% dos casos
é decorrente de técnico de campo que ofertou o produto, 17% de vizinho que usa e
recomendou, 6% por recomendação da loja agropecuária e 28% dizem não usar.
O acompanhamento de profissional acontece em 78% dos casos, sendo 22% dos
entrevistados assistidos por zootecnistas e 56% por médicos veterinários (Figura 6). Um dos
entrevistados disse ter assistência de um médico veterinário e um zootecnista juntos. A
informações “outros” representa a fração dos entrevistados que não possuem assistência
técnica.
60% 56%
50%
40%
30% 28%
22%
20%
10%
0% 0%
0%
Zootecnista Veterinário Agrônomo Técnico outro
agropec.
Figura 6. Classes profissionais que prestam assistência aos produtores, segundo questionário aplicado.
56
Pelo questionário, 78% dos produtores dizem não saber ou não têm conhecimento
sobre a adição de leveduras ou derivados no suplemento vitamínico mineral nem nas rações e
somente 22% conhecem sobre sua adição. Desta porcentagem, 17% acreditam que a as
leveduras são fontes de proteína, 22% fontes de vitaminas, 72% não sabem a finalidade da
adição de leveduras e ninguém citou fonte de fibra (Figura 7). Dois entrevistados disseram ser
fonte de fibra e de vitaminas na mesma pergunta.
Figura 7. Conhecimento dos produtores entrevistados sobre adição de leveduras e seus benefícios.
Com o foco em saber o conhecimento sobre os aditivos, os produtores foram

questionados sobre adição de monensina nos suplemento vitamínico mineral que constituíam
a ração, o motivo da adição de monensina se sabiam da importância dos resíduos da
monensina e os principais riscos de apresentar resíduos do ionóforo nas dietas dos animais
(Tabela 2).
Tabela 2- Nível de conhecimento dos produtores entrevistados, quanto a adição de monensina nas rações e seus
possíveis riscos à saúde animal e humana.
Tem conhecimento sobre adição de monensina? Sim Não

22% 72%
Sabe por que é adicionado monensina? Sim Não

28% 72%
Já ouviu falar em resíduo de monensina? Sim Não
57
33% 67%
Quais os problemas que conhece sobre Nunca ouviu falar 72%

monenensina? Intoxicação em equinos 28%
somente
Alergia e intoxicação em 6%
humanos
Problemas para exportação 6%
Outro 0%
Chagas (2000) reúne uma serie de fatores para se elaborar um bom questionário e nos
traz pontos que devemos observar para que a pesquisa seja bem conduzida. Entre eles estão
listados os componentes da elaboração, quais passos são interessantes para se obter ligação do
problema com a pesquisa e como as perguntas e respostas devem ser elaboradas.
De forma a obter informações sobre o uso de ionóforos em confinamentos, e qual
deles é usado, Millen et al. (2009) aplicaram questionários a nutricionistas que foram
enviados eletronicamente. Do total, 98,7% dos entrevistados disseram usar algum ionóforo
como principal aditivo alimentar. Mesmo de forma eletrônica e online, o questionário trouxe
informações da realidade de confinamentos e pode demonstrar a situação daquele momento
para aquele público alvo.
Em uma pesquisa de percepção ambiental, aplicado a donas de casa, sobre o uso de
produtos químicos, o questionário de Nóbrega et al. (2010), mostraram que a percepção por
donas de casa que utilizam produtos químicos não conhecem seu uso e a correta disposição.
Foi observado a falta de informações sobre os problemas que esses produtos podem provocar.
O questionário foi aplicado na região de Natal-RN e foi respondido justamente por quem usa
esses tipos de produtos químicos para limpeza.
No mesmo modelo de coletar informações, Ferri et al. (2014) também coletou
informações com usinas produtoras de etanol no estado do Mato Grosso do Sul e através das
perguntas foi possível observar que das 7 usinas que responderam ao questionário, 6
utilizavam monensina como principal forma para combater organismos contaminantes nas
dornas de fermentação.
58
De grande importância para obter informações reais sobre o conhecimento de
pequenos produtores, Veríssimo et al. (2016) realizaram pesquisa de campo com produtores
de leite na região oeste do estado de São Paulo para saber se produtores de leite realizavam
controle de carrapatos ou outros parasitas. De 40 entrevistados, sendo 20 produtores com
assistência da CATI Leite e outros 20 sem assistência, puderam observar diversos fatores
reais como a alta frequência de aplicação de carrapaticidas sem os critérios técnicos, meios de
aplicação e principal problema de saúde encontrado, no caso a tristeza parasitária. A pesquisa
trouxe informações sobre o nível educacional da propriedade e do grau de tecnificação que
elas possuem.
Dessa forma a aplicação de questionários se mostra uma importante ferramenta para
tomadas de decisões e orientação dos produtores com relação ao correto uso de produtos,
alimentos, ingredientes e coprodutos para otimizar a produção animal e tornar a atividade
sustentável.
4. CONCLUSÕES
Para pequenos produtores rurais, com propriedades pequenas e animais que

supostamente são para subsistência ou venda regional, exceto equinos, a falta de informação
sobre a alimentação desses animais, os componentes da dieta e a falta de instrução do
profissional que presta assistência técnica aos produtores nos indica que existe uma distância
grande entre os produtores rurais e as informações necessárias para evitarmos os riscos de
contaminação por monensina em alimentos que dificilmente serão analisados antes do
consumo pelos seres humanos. No caso dos equinos, animais sensíveis à monensina, existe a
possibilidade de aumentar os riscos caso esses animais sejam expostos a níveis maiores de
monensina provenientes das leveduras e seus derivados pois os produtores (criadores)
desconhecem esses riscos.
59
5. REFERÊNCIAS
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bubalinos e bovinos. Revista Brasileira de Zootecnia, v.37, n.3, p.563-571, 2008.
61
ANEXO I – QUESTIONÁRIO PRODUTORES DE CAMPO.
Rua Heitor Penteado 56 – Cx.P. 60-Nova Odessa-São Paulo
Centro Pesquisa e Desenvolvimento em Genética e Reprodução Animal
Fone: (19) 34669400
Questionário – Produtores de Campo

1- Qual o tamanho da propriedade? Onde está localizada?
R: __________________________________________________________________
2- Qual o tamanho do rebanho?

0 a 50 animais
50 a 200
200 a 500
500 ou mais
Outro: ________________
3- Qual espécie cria?

Bovinos Corte Aves Outros:
Bovinos Leite Suínos ___________
Caprinos/Ovinos Equinos
4- Quanto consome de ração por mês?

Até 100 kg 500 a 1000 kg Outro:
100 a 500 kg Mais de 1000 kg _____________
5- Quanto consome de ração com premix?

Até 100 kg 500 a 1000 kg Outro:
100 a 500 kg Mais de 1000 kg _____________
6- Sabe o que tem no premix?

Sim Não
62
7- Por que usa premix?
Vizinho usa e recomendou
Loja agropecuária recomendou
Vendedor me visitou e vendeu o premix
Técnico de campo (zootecnista/veterinário/agrônomo) recomendou
Outro: _____________
8- Tem acompanhamento de algum profissional?

Zootecnista Agrônomo Outro: _______
Veterinário Técnico em agropecuária
9- Tem conhecimento sobre adição de leveduras ou derivados?

Sim Não
10- Se sim, sabe por que é adicionado levedura?

Fonte de Proteína Fonte de Vitaminas Outro: _____________
Fonte de Fibras Enchimento do produto
11- Tem conhecimento sobre adição de monensina?

Sim Não
12- Se sim, sabe por que é adicionado monensina?

Sim Não
13- Já ouviu falar de resíduo de monensina?

Sim
Não
14- Quais os problemas que conhece sobre monensina?

Nunca ouvi falar
Intoxicação em cavalos somente
Alergia e intoxicação em seres humanos
Problemas para exportação
Outro: _________
63
64

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INSTITUTO DE ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTAVÉL

VALIDAÇÃO DO IMUNOENSAIO PARA IDENTIFICAÇÃO DE

Renato Del Alamo Guarda

VALIDAÇÃO DO IMUNOENSAIO PARA IDENTIFICAÇÃO DE

Renato Del Alamo Guarda

G914v Guarda, Renato Del Alamo

Orientadora: Dra. Keila Maria Roncato Duarte

1. ELISA 2. Ionóforo 3. Segurança alimentar. I. Duarte, Keila Maria

A Deus, que sem ele nada seria possível.

CAPÍTULO 1 - MONENSINA: USO, APLICAÇÕES E ESTADO DA ARTE ..................................................... 11

2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................................. 15

2.2 Uso da monensina na indústria sucroalcooleira ......................................................................... 15

2.3 Vantagens do uso ........................................................................................................................ 17

2.4 Efeitos tóxicos da monensina ...................................................................................................... 19

2.5 Métodos de diagnóstico da monensina por ELISA ...................................................................... 20

3. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................................................... 23

CAPITULO 2 - PRODUÇÃO E VALIDAÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE

2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................ 33

2.1 Produção de anticorpos anti-monensina .................................................................................... 33

2.2 Amostras biológicas .................................................................................................................... 33

2.3 PTA- ELISA.................................................................................................................................... 34

2.4 Validação do ELISA ...................................................................................................................... 35

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 37

2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................. 53

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 54

ANEXO I – QUESTIONÁRIO PRODUTORES DE CAMPO. ......................................................................... 62

A identificação correta de resíduos de monensina em alimentos para animais e em carne, ovos

Palavras-chave: ELISA, ionóforo, segurança alimentar

Key words: ELISA, ionophores, food safety

Palavras-chave: antimicrobiano, segurança alimentar, resíduo.

Key words: antimicrobian, food safety, residue.

A monensina é um aditivo alimentar bastante ultilizado em vários países (Pereira, 2014),

Figura 1. Tripé da Sustentabilidade.Adaptado de Vasquez (2014)

2.2 Uso da monensina na indústria sucroalcooleira

Figura 2 – Esquema de utilização da levedura excedente em rações e indiretamente, a contaminação por

2.3 Vantagens do uso

Ribeiro et al. (2000) avaliando os benefícios da suplementação de monensina sobre o

2.4 Efeitos tóxicos da monensina

As intoxicações por ionóforos influenciam a contratilidade do tecido muscular,

2.5 Métodos de diagnóstico da monensina por ELISA

Os imunoensaios constituem na principal técnica utilizada para triagem inicial da

No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2017)

BEZERRA JUNIOR, P. S.; ILHA, M. R. S.; LANGOHR, I. M.; BARROS, C. S. L.

BARICHELLO. F. F. G. Avaliação da resposta imunológica de cães vacinados com vacina

BRASIL. Instrução Normativa N° 09, de 21 de fevereiro de 2017. Diário Oficial da

CODEX ALIMENTARIUS. Maximum Residue Limits (MRLS) and risk management

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