ACIZI NUCLEICI

Conf. Dr. Elena Petrescu

1
 Aspecte generale
• Acizii nucleici dețin roluri esențiale în organism:
- stocarea informației genetice
- expresia informației genetice sub forma
proteinelor

• Există două tipuri distincte, d.p.d.v. chimic, de

acizi nucleici:
- ADN (acid deoxiribonucleic)
- ARN (acid ribonucleic)

• ADN și ARN sunt polimeri ai nucleotidelor

• Un nucleotid este format din:
- bază azotată
- pentoză (riboza sau deoxiriboza)
- grupare fosfat

2
 Structura nucleotidelor
• Baze azotate - purinice: adenina, guanina
- pirimidinice: citozina, uracil, timina
• Nucleozid = bază azotată + pentoză (legătură β-N-glicozidică între C1 al pentozei și N9
al nucleului de purină / N1 al nucleului de pirimidină)
• Nucleotid = nucleozid + acid fosforic (legătură esterică cu gruparea 5’-OH a pentozei)

3
 Structura ADN
• Localizarea ADN (la eucariote):
- în nucleu, separat de restul celulei prin membrana nucleară
- ADN este asociat cu proteine, formând un complex numit cromatină (în cursul
diviziunii celulare se separă în 46 cromozomi)
- < 1% din ADN-ul total al unei celule este prezent în mitocondrii – codifică mai
multe proteine implicate în lanțul respirator

• Structura ADN a fost descoperită de către James Watson și Francis Crick în 1953
(→ premiul Nobel pentru medicină în 1962)
• ADN = dublu helix alcătuit din două lanțuri polinucleotidice răsucite în jurul unui
ax comun, asociate între ele

4
• Fiecare catenă ADN conține
deoxiribonucleotide unite covalent prin
legături 3’-5’ fosfodiesterice

• Secvența nucleotidelor în ADN codifică

informația genetică

• Bazele azotate din ADN sunt:

- purinice - adenina (A), guanina (G)

- pirimidinice - citozina (C), timina (T)

• O catenă ADN este caracterizată de:

- polaritate: o extremitate 5’ și una 3’

- direcție: dinspre capătul 5’ spre capătul 3’

5
• O catenă ADN conține:
- o coloană vertebrală = moleculele de deoxiriboză
+ grupările fosfat (ionizate - încărcate negativ la pH
fiziologic)
- bazele sunt perpendiculare pe coloana vertebrală

Dublul helix ADN

• Cele două catene sunt:

- antiparalele (se desfășoară în sensuri opuse)
- complementare: A cu T, G cu C (o bază purinică și
una pirimidinică)

• Coloana vertebrală hidrofilică a fiecărei catene este

situată la exteriorul moleculei, iar bazele hidrofobe
sunt situate în interior (între bazele de pe aceeași
catenă se formează interacțiuni hidrofobe)

• La suprafața duplexului – incizura majoră și incizura

minoră (groove)
• Perioada dublului helix = 34 Å (10 perechi de baze)
6
• Cele două catene sunt unite prin legături de
hidrogen între bazele complementare:
- între A și T – două legături de H
- între G și C – trei legături de H

• Regulile lui Chargaff – în orice moleculă de

ADN bicatenar:
- numărul de A = numărul de T
- numărul de G = numărul de C
- numărul total de purine = numărul total de
pirimidine

7
Denaturarea ADN
• Când o moleculă de ADN bicatenar este supusă la creșterea temperaturii → cele
două catene se separă datorită ruperii legăturilor de H dintre bazele azotate
• Procesul poate fi urmărit experimental prin măsurarea absorbției luminii UV
(bazele azotate absorb la λ = 260 nm) − ADN monocatenar are o absorbanță mai
mare față de ADN bicatenar
• Când ADN este încălzit, temperatura la care ½ din structura dublu-catenară s-a
pierdut este definită ca temperatură de fuziune, Tm (melting temperature)
• Răcire lentă → cele două catene ADN complementare pot reconstitui dublul helix,
proces numit renaturare

8
Degradarea ADN
• Nucleaze (DNaze) catalizează scindarea hidrolitică a legăturilor fosfodiesterice din ADN
• Exonucleazele degradează acizii nucleci la una din cele două extremități, îndepărtând
câte un nucleotid – pot acționa în direcția 5’→3’ sau în direcția 3’→5’
• Endonucleazele degradează acizii nucleici la nivelul unor situsuri specifice în interiorul
unor molecule de ADN monocatenar sau dublu-catenar
• Endonucleazele de restricție recunosc și scindează ADN-ul dublu-catenar la nivelul
unor secvențe specifice (numite secvențe de recunoaștere sau situsuri de restricție)
- sunt produse în mod natural de către bacterii → rolul lor biologic este de a
recunoaște și scinda ADN-ul străin (ex. ADN-ul unui virus infecțios – bacteriofag)
- utilizate în tehnologia ADN recombinant și pentru diagnostic molecular

9
 Organizarea ADN în nucleu
• Celulele procariote conțin un singur cromozom alcătuit din ADN dublu-catenar
circular (4 x 106 pb - perechi de baze)
• ADN dintr-o celulă umană conține aprox. 6 x 109 pb și are o lungime totală de
aprox. 2 m
• ADN este împachetat cu proteine numite histone pentru a forma o structură
numită cromatină

➢ Histonele = proteine mici cu caracter bazic (bogate în Arg și Lys)

• Histonele sunt încărcate pozitiv la pH fiziologic → formează legături ionice cu

grupările fosfat încărcate negativ din ADN

• Extremitățile moleculelor de histone pot fi modificate chimic (acetilare, metilare,

fosforilare) → aceste modificări reversibile pot influența puterea asocierii dintre
histone și ADN, în felul acesta afectând expresia unor gene specifice (viteza
procesului de transcripție)
10
➢ Unitatea structurală a cromatinei este nucleosomul:
- o structură de formă cilindrică ce conține 8 molecule histonice (câte două din
următoarele patru tipuri: H2A, H2B, H3 și H4)
- ADN dublu-catenar este răsucit în jurul octamerului histonic (de 1.75 ori,
aprox. 150 pb)
- ADN-ul care unește doi nucleosomi succesivi conține aprox. 50 pb și este
asociat cu o moleculă de histonă H1 (→ aspectul de ”mărgele pe ață”)

• Lanțul de nucleosomi formează fibrila de 10 nm

• Aceasta este supraspiralată pentru a forma fibra cromatiniană de 30 nm
• În cromozomi, fibrele cromatiniene sunt organizate sub forma unor bucle care sunt
ancorate la un ansamblu de proteine ce formează o matrice (sau schelă - scaffold)

11
12
REPLICAREA ADN

13
 Aspecte generale

• Replicarea ADN = sinteza a două molecule de ADN dintr-o

moleculă parentală, având aceeași secvență a bazelor ca
și molecula originală
• Are loc în celulele aflate în diviziune, în cursul fazei S a
ciclului celular
• Fiecare din cele două catene ADN parentale servește ca
matriță pentru sinteza unei catene noi, complementare →
sunt produse două molecule de ADN noi, fiecare având o
catenă nouă și o catenă veche (replicarea este
semiconservativă)

➢ Elemente necesare pentru replicare:

• O catenă de ADN matriță
• Piesele de construcție – sub formă de deoxiribonucleozid-
trifosfați (dNTP)
• Un ansamblu de enzime
14
 Etape în cursul replicării
1. Separarea celor două catene
complementare

• Replicarea începe la nivelul unor secvențe

specifice numite origini de replicare

• La procariote (Pk) – există o singură asemenea

secvență (numită oriC la Escherichia coli), la care
se atașează mai mulți monomeri ai proteinei
DnaA

• La eucariote (Ek) – multiple origini de replicare

de-a lungul ADN-ului (aprox. 100 în fiecare
cromozom) → acestea asociază un set de proteine
(analogi ai proteinei DnaA de la E. coli) care
formează complexul de recunoaștere a originii de
replicare (ORC - origin recognition complex)

15
• Separarea celor două catene parentale (prin ruperea
legăturilor de H dintre bazele complementare) și
desfacerea dublului helix este realizată de ADN
helicază, cu consum de energie furnizată de ATP

• Mai multe molecule de proteine SSB (single-stranded

DNA binding proteins) se atașează la ADN
monocatenar și:
- mențin cele două catene ADN separate
- le protejează de enzime care pot cliva ADN
monocatenar

• Separarea celor două catene parentale creează două

regiuni în formă de “Y” numite furci de replicare →
acestea se deplasează în ambele sensuri distal față
de originea de replicare (replicarea ADN dublu-
catenar este bidirecțională)

16
Rezolvarea suprarăsucirilor:
• Separarea celor două catene ale dublului helix generează suprarăsuciri
(superspiralări) pe direcția de înaintare a furcii de replicare → acestea creează o
tensiune și pot împiedica desfacerea în continuare a dublului helix
• Această problemă este rezolvată de enzime numite ADN topoizomeraze, care
îndepărtează superspiralările:
- tipul I – scindează o singură catenă → cealaltă catenă de ADN trece prin breșa
creată → catena scindată este resigilată
- tipul II – scindează ambele catene → o altă porțiune a ADN-ului dublu catenar
este trecută prin breșă → la final breșa este resigilată (cu consum de ATP)
✓ Topoizomeraza II de la bacterii (ADN giraza) este inhibată de antibioticele din clasa
fluorochinolonelor (ex. ciprofloxacin) → replicarea și transcripția vor fi inhibate

Acțiunea topoizomerazei tip I 17

2. Începerea sintezei ADN necesită un
primer ARN

• Sinteza ADN este catalizată de ADN polimeraze

• Aceste enzime nu pot iniția sinteza unei catene noi

de ADN (pornind de la un prim nucleotid pe care
să-l lege de un al doilea)

• => ADN polimerazele necesită prezența unei

grupări 3’-OH libere pentru a funcționa → aceasta
este furnizată de un primer ARN: un oligo-
ribonucleotid (10-20 nucleotide) care este
sintetizat în sensul 5’→3’ de către primază -
enzimă cu funcție ARN polimerazică ce copie
primele 10-20 de nucleotide de la capătul 3’ al
catenei de ADN matriță

• ADN polimeraza adaugă inițial un deoxi-

ribonucleotid la extremitatea 3’-OH a primerului

18
3. Elongarea catenei sub acțiunea ADN polimerazei

• Ulterior, ADN polimeraza continuă să adauge deoxiribonucleotide la capătul 3’ al

catenei în curs de sinteză, pe baza complementarității cu nucleotidele din catena
matriță
• Sensul sintezei de ADN este 5’→3’
• Catena matriță este citită în sensul 3’→5’
• Catena nou sintetizată este antiparalelă cu catena matriță

19
➢ Formarea unei noi legături fosfodiesterice sub acțiunea ADN polimerazei:

• Noul nucleotid care participă la sinteză (sub formă de dNTP – deoziribonucleozid

trifosfat) formează o legătură de H cu nucleotidul complementar din catena matriță

• Gruparea 3’-OH de la capătul 3’ al catenei în curs de sinteză exercită un atac

nucleofilic asupra fosfatului α din dNTP → legătura dintre grupările fosfat α și β este
scindată și se formează o nouă legătură 3’-5’ fosfodiesterică
• Scindarea legăturii macroergice din dNTP furnizează energia pentru formarea noii
legături fosfodiesterice din ADN
• Pirofosfatul (grupările fosfat β și γ) este eliberat și apoi hidrolizat de către
pirofosfatază → reacția devine favorabilă energetic și dirijată net în sensul direct

• Viteza sintezei de ADN este de aprox. 50-100 nucleotide/sec (Ek), 1000 nt/sec (Pk)
(mai mică la eucariote datorită împachetării ADN-ului cu proteinele histonice; la
procariote, ADN nu este asociat cu proteine)

20
 DNA polymerases in eukaryotes • Există mai multe tipuri de ADN
Polymerase Function Exonuclease polimeraze:
activity - la Pk – I, II, III
Pol α Primase activity None
Synthesizes RNA - la Ek – α, β, γ, δ, ε, etc.
primers of Okazaki
fragments
Pol β DNA repair None
Pol γ DNA replication in 3’ to 5’
mitochondria
Pol δ Replication of the 3’ to 5’
leading and lagging
strand
Pol ε Replication 3’ to 5’
(sometimes it takes
the place of Pol δ)
DNA repair

21
 Eliminarea erorilor de împerechere (fidelitatea replicării ADN)

• Este extrem de important ca secvența nucleotidică a ADN să fie replicată cu cât mai
puține erori posibil
• Erorile de împerechere pot duce la apariția de mutații cu consecințe severe

• Pentru a asigura fidelitatea replicării, multe ADN polimeraze au, pe lângă activitatea
polimerazică, o activitate de verificare a corectitudinii replicării (proofreading) și de
corectare a erorilor (funcție 3’→5’ exonucleazică)

• Pe măsură ce fiecare nucleotid este adăugat, ADN polimeraza verifică dacă acesta
este cel corect (complementar cu nucleotidul corespunzător din catena matriță)
• Dacă nucleotidul nu este cel corect, activitatea 3’→5’ exonucleazică a ADN
polimerazei îl îndepărtează
• Apoi, prin activitatea 5’→3’ polimerazică a aceleiași enzime, este adăugat
nucleotidul corect

22
• La E. coli: rata erorilor în cursul replicării este de una la 109 -1010 nucleotide adăugate
• ADN polimerazele inseră un nucleotid greșit la 104-105 nucleotide corecte
• Activitatea de corectare îmbunătățește acuratețea reacției de polimerizare de 102-
103 ori → ADN polimerazele lasă în urmă o eroare la fiecare 106-108 baze adăugate
• Acuratețea suplimentară este asigurată de un mecanism care repară erorile de
împerechere rămase după replicare (MMR – mismatch repair)

23
4. Sinteza semi-discontinuă a ADN

• Moleculele de ADN sunt dublu-catenare și cele două catene sunt antiparalele

• Replicarea ADN are loc pe ambele catene simultan și ADN polimerazele pot acționa
numai în sensul 5’→3’ => cele două catene ADN nou sintetizate nu pot crește în
același sens concomitent, într-o manieră continuă

• Cele două catene ADN sunt replicate în moduri diferite:

- una dintre catene (catena “leading”) este replicată într-o manieră continuă în
sensul 5′→3′, spre furca de replicare – de către Pol δ (la Ek), Pol III (la Pk)
- cealaltă catenă (catena “lagging”) este replicată într-o manieră discontinuă, sub
formă de fragmente scurte de 150-200 nucleotide la Ek (1000-2000 nt la Pk), tot
în sensul 5′→3′, dar depărtându-se de furca de replicare (fragmente Okazaki)

• Sinteza fiecărui fragment Okazaki este inițiată de Pol α prin subunitatea sa cu

activitate de primază → primerii ARN sunt elongați de către Pol δ (Pol α nu are
activitate de corectare 3’→5’ exonucleazică, deci nu este adecvată pentru
replicarea cu înaltă fidelitate a ADN)

24
Excizia primerilor ARN și înlocuirea lor cu ADN:
• Pe măsură ce replicarea avansează, primerii ARN sunt excizați din fragmentele
Okazaki prin acțiunea ADN polimerazei I (la Pk), având activitate 5’→3’ exonucleazică
• Pe măsură ce îndepărtează ribonucleotidele, Pol I le înlocuiește cu deoxiribo-
nucleotide, utilizând activitatea sa 5’→3’ polimerazică (elonghează fragmentul
Okazaki precedent)
• ADN ligaza unește fragmentele Okazaki adiacente prin formarea unei legături
fosfodiesterice (energia este furnizată de scindarea ATP în AMP + PPi)

• La Ek, polimerazele nu au activitate 5'→3' exonucleazică pentru a degrada primerii

ARN → enzime separate (FEN-1 = flap endonuclease-1 și RNaza H) degradează ARN
→ Pol δ completează golurile rămase în urma îndepărtării primerilor

25
Replicarea catenei leading și a catenei lagging

26
 Proteine implicate în replicarea ADN

ADN polimeraze Adaugă nucleotide în catena de ADN nou sintetizată în

sensul 5’→3’, citind catena matriță în sensul 3’→5’

Primaza Sintetizează primerii ARN

Helicaza Separă catenele ADN parentale, prin desfacerea dublului
helix (ruperea legăturilor de H dintre bazele azotate
complementare)
Proteine SSB Previn reasocierea monocatenelor ADN
Topoizomeraze Îndepărtează tensiunile asociate suprarăsucirii dublului
helix (cauzată de înaintarea furcilor de replicare)
Enzime care FEN-1 și RNaza H (la eucariote)
îndepărtează primerii
ARN
ADN ligaza Unește, prin formarea unei legături fosfodiesterice, două
fragmente ADN care sunt asociate la aceeași matriță

27
 Repararea ADN
• Moleculele de ADN pot suferi leziuni sub acțiunea unor agenți genotoxici diverși:
- Factori chimici – prezenți în alimente, țigări, medicamente, aerul poluat sau
generați în cursul metabolismului celular
- Factori fizici: radiațiile – radiații ionizante (radiația cosmică, radiațiile X utilizate în
investigațiile medicale) și radiațiile UV

Tipuri de leziuni ADN:

• Modificarea bazelor azotate
- dezaminare – cauzată de agenții dezaminanți (ex. acidul nitros derivat din nitriți)
- lezare oxidativă – cauzată de speciile reactive de oxigen
• Pierderea bazei azotate (datorită hidrolizei legăturii N-glicozidice dintre bază și
deoxiriboză) → formarea unui situs apurinic/apirimidinic
• Dimerii de timină – conexiune covalentă formată între două baze pirimidinice
adiacente din aceeași catenă ADN (sunt cauzați de radiațiile UV)
• Rupturi catenare – monocatenare sau dublu-catenare (cauzate de radiațiile ionizante)
28
29
 Mecanisme de reparare a leziunilorADN

• Menținerea integrității informației înscrise în ADN este esențială pentru organism

• Există mai multe mecanisme de reparare a leziunilor ADN:

- Reparare prin excizia bazei (BER) – în cazul modificării bazelor azotate
- Reparare prin excizia nucleotidelor (NER) – când leziunea este mai severă și
produce o distorsiune a catenei ADN (ex: dimerii de timină)
- Recombinarea omologă – repară rupturile ADN dublu-catenare

• Dacă mecanismele de reparare eșuează și leziunile ADN rămân nereparate, acestea

pot duce la:
- moarte celulară
- modificări permanente ale informației genetice numite mutații (modificări ale
secvenței de nucleotide):
- mutații în celulele germinale → boli genetice
- mutații în celulele somatice → implicate în oncogeneză

30
Etapele principale ale mecanismelor de
reparare a ADN (exemplificare pentru NER):

• Proteine specifice recunosc leziunea ADN sau

distorsiunea în helixul ADN cauzată de leziune
• Regiunea ce conține leziunea este îndepărtată
sub acțiunea unor endonucleaze și
exonucleaze
• Golul rămas în catena lezată este completat
de către o ADN polimerază de reparare care
utilizează catena intactă, nelezată, ca matriță
• Continuitatea catenei reparate este asigurată
de o ADN ligază

• În cazul rupturilor dublu-catenare –

recuperarea corectă a informației gentice este
realizată prin utilizarea, ca matriță intactă, a
cromatidei surori sau a cromozomului omolog

31