TEMA 5. Señalización celular Biología Celular Aplicada (Universidad Autónoma de Madrid

lOMoARcPSD|4940088 TEMA 5. Señalización celular Biología Celular Aplicada (Universidad Autónoma de Madrid) StuDocu no está patrocinado ni avalado por ningún colegio o universidad. Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Bases de la señalización celular La señalización celular es la capacidad que tienen las células para recibir señales desde el medio externo y de emitir una respuesta. Esa señalización no es exclusiva de eucariotas, sino que también la presentan los organismos procariotas. La naturaleza química de las moléculas señal es muy variable. Pueden ser desde simples gases, como el óxido nítrico (NO), que es capaz de actuar sobre las células del endotelio (el principio activo de la viagra por ejemplo aumenta la producción de NO en los cuerpos cavernosos del pene, que se llenan más rápidamente de sangre); otras pueden ser hormonas derivadas del colesterol como la testosterona; proteínas, como por ejemplo los factores de crecimiento; derivados de aa, como la hormona tiroxina (derivado del aa tisorina). La respuesta celular también es muy variable. Puede ser: sobrevivir, proliferar, diferenciarse, suicidarse, cambiar la morfología celular, cambiar el metabolismo…. Y siempre se hace mediante moléculas señalizadoras, moléculas señal, que actúan sobre una célula diana que tiene un receptor específico para esa molécula señal. La señalización es una vía prioritaria en la investigación ya que muchos cánceres surgen por una alteración en las vías de señalización. Existen 2 grandes grupos de señalización 1. Señalización directa por contacto. La molécula señal está en la mp de la célula señalizadora y el receptor de la célula diana también está en la superficie, y se establece un contacto directo para transmitirse la señal. Ejemplos: a. Cadherinas/cateninas. Ruta de las β-cateninas b. Integrinas. 2. Señalización por moléculas secretadas. La célula señalizadora secreta una molécula señal que recorre una cierta distancia hasta unirse con el receptor de la célula diana. Según la distancia que recorran, la señalización puede ser: a. Autocrina: la distancia es mínima, porque la misma célula que fabrica la molécula señalizadora tiene el receptor. Es muy típica de las células tumorales. b. Paracrina: cuando la molécula señal recorre una distancia algo mayor, pero las células diana están relativamente cerca. A esas moléculas señal se les llama mediadores locales. Ejemplo: sinapsis química con neurotransmioses. c. Endocrina: las células señalizadoras fabrican las moléculas señal, que en este caso se llaman hormonas, que pasan a la sangre y pueden recorrer grandes distancias en el organismo hasta que salen del torrente sanguíneo e interaccionan con los receptores de la célula diana. Las células que fabrican las hormonas son las células endocrinas, que forman las glándulas endocrinas. 1 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Principios de la señalización celular → Receptores diferentes pueden activar la misma vía de señalización. → Un receptor puede desencadenar distintas vías de señalización. Esto es un impedimento en la busca de tratamientos. → Receptores que estén activados pueden activar distintas vías de señalización pero que de alguna forma influyen una en la otra. → Una determinada molécula señal puede inducir respuestas diferentes en distintos tipos de células diana. Así, la acetilcolina, por ejemplo, cuando su receptor está en una célula del musculo cardiaco, y se une, produce una disminución de la frecuencia de contracción del músculo cardiaco. Pero si esa misma molécula señal, por el contrario, se une a un receptor del musculo esquelético, induce a la contracción. En sentido genérico, la señalización consta de 3 etapas: 1. Recepción: la molécula señal se une al receptor. 2. Transducción de la señal a través de una determinada vía de señalización que actúa en cascada. 3. Respuesta, en la que en muchas veces hay transcripción y traducción de determinados genes que dan como resultado la formación de nuevas proteínas que se encargan de dar la respuesta. Tipos de receptores: Receptores intracelulares La molécula señal tiene que ser pequeña e hidrofóbica para que pueda atravesar la mp por difusión simple; y el receptor está en el interior de la célula. Dependiendo de la molécula señal, el receptor puede estar en el citosol o en el núcleo. Hay casos en que el receptor está en el citosol, y ya juntos, receptor y ligando, se trasladan al núcleo; y en otros casos, el receptor se localiza en el propio núcleo. Ejemplos: Hormonas esteroides o tiroxina. Receptores de superficie Están en la membrana plasmática, y por tanto, la molécula señal va a ser hidrofílica (no puede atravesar la mp por difusión simple). 2 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Transducción de señales La transducción de señales es el conjunto de reacciones en cadena/cascada que se producen después de que la molécula señal se haya unido a su receptor. En esa transducción, van a participar moléculas grandes, fundamentalmente proteínas, pero también moléculas pequeñas que reciben el nombre de segundos mensajeros: AMPc, Ca2+, IP 3 , DAG… Al final, cuando haya actuado la cascada de señales, tendremos la respuesta, que puede ser: transcripción de genes, supervivencia, movimiento, muerte, cambios en el metabolismo, etc. Obviamente, el segundo mensajero participa en la transducción, por lo que el primer mensajero es la molécula señal. Conforme la molécula señal se une al receptor, hay que reclutar a las diferentes proteínas que participan en la cascada, para que estén juntas o cerca. Hay que ir haciendo reacciones en cadena hasta que muchas veces una de las proteínas que se activa entra en el núcleo. En esa transducción de señales, van a intervenir proteínas con distintas funciones: unas actúan de armazón y permiten la transmisión de la señal, otras integran señales que vienen de distintas rutas, otras difunden la señal, otras sirven de anclaje, y algunas, activadas, tienen la capacidad de entrar al núcleo y de activar la transcripción de determinados genes de la propia célula diana. Hay proteínas que intervienen en la transducción que se tienen que ir activando y que están muy próximas entre sí porque están ligadas a una proteína armazón. También vamos a encontrar receptores inactivos y moléculas señalizadoras de esa transducción de señales que están inactivas. Pero son capaces varias moléculas de unirse a una misma proteína por distintos sitios. Esto también es una manera rápida de transmitir la señal. Así van a funcionar los RTKs. Cuando esas 3 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR moléculas no tienen fosfato, se encuentran perdidas por el citosol, sueltas; en el momento en que la molécula señal se une al receptor, se produce una fosforilación, y entonces ya se le pueden unir. También se pueden formar complejos de señalización que varias proteínas estén juntas cuando se produce una unión a fosfolípidos hiperfosforilados de la monocapa interna de la bicapa lipídica. Esta vía es fundamental. Hay receptor inactivo, y en la monocapa interna, los fosfolípidos de inositol llevan 2 fosfatos, y las proteínas de señalización están a su aire. Cuando llega la molécula señal, activa al receptor de superficie, y ese receptor, directa o indirectamente, le añade un grupo fosfato extra al inositol, que pasa a tener 3P. Este paso de tener 2P a tener 3, va a hacer que se puedan unir y activar las proteínas señalizadoras qu participan en esa transducción. De esta manera, gracias a la hiperfosfoliración, se activan proteínas que, además, por proximidad pueden activar a otras proteínas La transducción de señales se basa en interacciones entre los dominios de unión y los motivos de reconocimiento. Los dominios de unión es un dominio o una zona determinada de la molécula que es capaz de reconocer y de unir un motivo determinado que haya en otra proteína. 4 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR → Dominios de unión: o PH: dominio de homología con la plecstrina que reconoce al motivo de un fosfolípido de inositol hiperdosforilado. o Dominios PTB (dominio de unión a fosfotorisinas) y SH2 (dominio de homología Src2) reconocen fosfotirosinas. o El dominio SH3 (dominio de homología Src 3) reconoce un motivo de la proteína que sea rico en prolinas. Interruptores moleculares en las vías de señalización Son proteínas de señalización intracelular que actúan como interruptores moleculares, activando y/o desactivando proteínas que forman parte de la ruta de transducción. Se habla de ON y de OFF. Hay dos grandes grupos: 1. Señalización por fosforilación. Actúan las quinasas que añaden grupos P (ON). Para apagar la señalización, las fosfatasas quitan los grupos P (OFF). 2. Señalización por unión de GTP. Intervienen proteínas de unión a GTP. Una proteína está en OFF cuando lleva GDP, pero cuando cambia el GDP por GTP (se intercambia entero uno por otro), esa proteína se activa. Para regresar al estado inactivo se tiene que hidrolizar un fosfato del GTP. a) Proteínas G monoméricas. b) Proteínas G triméricas. 5 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Quinasas Las quinasas siempre añaden grupos P a partir de la hidrólisis de ATP y por la actuación de una fosfatasa. En la mayoría de los casos, una proteína está inactiva (OFF) y se activa (ON) por una quinasa cuando le añade P, y se inactiva cuando actúa la fosfatasa; pero hay unos pocos casos donde es al revés, en los que una proteína está activa (ON) cuando está desfosforilada e inactiva (OFF) cuando está fosforilada. GTP La proteína tiene que estar inactiva cuando está unida a GDP. Cuando sale el GDP y se une GTP, la proteína se activa. No se fosforila el GDP, sino que sale el GDP y entra GTP (se intercambian uno por otro). Para inactivarse, se hidroliza el GTP a GDP, sin intercambio esta vez. Proteínas G monoméricas Las proteínas G monoméricas en estado inactivo llevan unido un GDP. Para que se activen tiene que intercambiar el GDP y entrar el GTP. Esto se hace de manera muy lenta. Necesita que participe un GEF (factor intercambiador de nucleótidos de guanina). GEF favorece/acelera la salida de GDP para que entre GTP. Una vez activa, tiene que desactivarse. La hidrolisis del GTP es lenta y necesitan la ayuda de un GAP que ayuda a aumentar la actividad GTPasa intrínseca que tienen las proteínas G monoméricas. Las GAP hacen una rápida hidrólisis del GTP, para que se libere el P y la proteína G quede inactiva. 6 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR El ejemplo más importante que tenemos en señalización es la proteína G monomércia Ras. Ras es una proteína que se encuentra unida covalentemente a ácidos grasos en la monocapa interna de la mp. Esa proteína, está en su estado inactivo con un GDP unido. Para que se active la proteína Ras, tiene que salir el GDP y entrar el GTP, por lo que necesita una proteína que actúe de GEF, que en este caso particular, esa proteína es la Sos. Para desactivarse necesita una GAP que favorezca la hidrolisis del GTP. Este ciclo está alterado en muchos tumores humanos, estando Ras activa constantemente. Las proteínas Ras son una superfamilia y tiene funciones muy diversas. Proteínas G triméricas Son grandes porque son triméricas. Estas proteínas G triméricas están formadas por 3 subunidades proteicas (α, β y γ). También es una proteína periférica unida covalentemente a ácidos grasos de la monocapa interna de la mp, y es la subunidad α la que presenta un dominio de unión al GDP. Tipos de receptores de superficie A. Receptores acoplados a canales iónicos. B. Receptores acoplados a proteínas G. C. Receptores acoplados a enzimas. A. Receptores acoplados a canales iónicos El receptor es un canal regulado por ligando. Cuando la molécula señal se una a ese receptor, se va abrir el canal y permitirá el paso de un determinado ion, que producirá una respuesta celular. La unión neuromuscular es el ejemplo clásico. La molécula señal es la acetilcolina, liberada a la hendidura sináptica, que se une al receptor de la mp del músculo y permite que se abra y entren iones Na2+. B. Receptores acoplados a proteínas G ( GPCR) Es uno de los grupos más diversos y mayores de proteínas codificadas por el genoma humano. Se calcula que tenemos unos 800 genes que codifican para estos receptores. La molécula señal es variada: hay hormonas, neurotransmisores, estímulos sensoriales (luz, sonido)… Estos receptores controlan funciones fisiológicas muy diversas desde la neurotransmisión, la liberación de hormonas y enzimas de las glándulas, 7 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR la respuesta inmune, la contracción muscular… Son tantas y tan variadas las funciones que controlan, que se calcula que más del 60% de los fármacos que tomamos van dirigidos a receptores acoplados a proteínas G que no están funcionando correctamente. Estos receptores son una gran familia de proteínas transmembrana que atraviesan 7 veces la bicapa lipídica en alfa hélice, que tienen el extremo N en el medio externo y el extremo C en el citosol. El receptor está acoplado a una proteína G. Esa proteína G está inactiva porque llevará GDP. Cuando la molécula señal se une al receptor, va a permitir que la proteína G interaccione con él, porque hay un cambio conformacional, y va a actuar de GEF, facilitándole que salga el GDP y entre el GTP para que la proteína G se active. Cuando se activa, se separan la subunidad α de la β-γ, y pueden, cada una de ellas, activar otras enzimas. Es decir, la unión a la molécula señal induce cambios conformacionales en este receptor, lo que permite que pueda interaccionar con las proteínas G heterotriméricas. Por tanto, en realidad estos receptores están actuando de GEF para la proteína G. Cuando la molécula señal se une al receptor, se produce un cambio de conformación en el dominio citosólico que permite la interacción con una proteína G inactiva. Al actuar el receptor de GEF, sale el GDP, entra el GTP y la proteína G heterotrimérica se activa, separándose la subunidad α, que lleva GTP, de la subunidad β-γ. Tanto una como la otra pueden activar otras rutas. Hay 4 grandes familias de proteínas G heterotriméricas, y cada familia tiene varias subfamilias. Algunas de ellas activan rutas de señalización, y se les suele llamar proteínas G s ; otras inhiben y se llaman G i ; y otras son capaces de activar a unas fosfolipasas y entonces suelen ser del tipo G q . Actúan de forma distinta. Por distintas vías, siempre se puede llegar a la transcripción de determinados genes. Y la respuesta puede ser: proliferación, supervivencia, diferenciación, migración, degradación de la MEC, angiogénesis, metástasis, cáncer. Por tanto, estas rutas son importantes porque cuando están alteradas tienen una relación con el cáncer. Entre otras, existen 3 grandes rutas de señalización que se pueden activar cuando la proteína G está activa: 1. Activación de la adenililciclasa. 2. Activación de la fosfolipasa Cβ (PLC β). 3. Apertura/activación de canales iónicos. 8 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Vía de la adenililciclasa Implica la formación de AMPc y la activación de la PKA. Esta es la ruta que hacen muchas hormonas. La proteína G activada, con GTP en la susbunidad α, activa a la adenililciclasa, que es una enzima de la mp. Esta enzima cataliza el paso de ATP a AMPc (un nucleótido), aumentando los niveles de éste último. El AMPc es un segundo mensajero, que es capaz de activar a la PKA (proteín kinasa A), que está inactiva. Cada molécula de PKA está formada por dos subunidades catalíticas y dos reguladoras. Dos moléculas de AMPc se unen a cada subunidad reguladora y las dos subunidades catalíticas se separan, quedan activas y fosforilan a otras proteínas. La PKA es capaz de entrar en el núcleo y activar, por fosforilación, la transcripción de determinados genes. Esos receptores no pueden estar mucho tiempo funcionando, y la manera que hay de inactivarlos es con unas quinasas que le añaden fosfatos, a esos fosfatos se le une la proteína arrestina, y se va a favorecer la endocitosis de esos receptores. 9 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Vía de la fosfolipasa Cβ (PLC β) Implica la formación de DAG (diacilglicerol), IP 3 (inositol trifosfato) e iones Ca2+. Los tres son segundos mensajeros. En esta vía, la fosfolipasa Cβ va a hidrolizar un fosfolípido que hay en la monocapa interna (fosfatidilinositol bifosfato - PIP 2 ) en 2 moléculas: DAG e IP 3 . Con esto consigo que se active la PKC y que haya un aumento de Ca2+. Entonces, el fosfolípido de la monocapa interna llamado fosfatidilinositol bifosfato (PIP 2 ), es hidrolizado por la fosfolipasa Cβ activada. Este fosfolípido es hidrolizado en DAG, que se queda en la monocapa interna, y en IP 3 . IP 3 es una molécula soluble que se mueve por el citosol hasta llegar a la membrana del RE, donde se une a un canal regulado por ligando que hay en la membrana del RE (el IP 3 es el ligando). Al activar el canal con IP3, salen iones Ca2+ del RE. Estos iones Ca2+ son unos segundos mensajeros muy importantes en la célula. Siempre que aumentan los niveles Ca2+ en el citosol hay una respuesta celular. Una de esas funciones del Ca2+ es, junto al DAG, activar a la PKC (proteín kinasa C). Esa PKC fosforilará activando a otras proteínas. Además, los iones Ca2+ pueden unirse a la proteína calmodulina (CaM). En concreto, 4 iones Ca2+ activan a la calmodulina, que a su vez es capaz de activar a las proteínas quinasas dependientes de Ca2+/calmodulina, lo que se llaman CaM-quinasas. Activación de canales iónicos Tenemos un receptor acoplado a una proteína G, y el ejemplo clásico que se pone es el de la acetilcolina en la unión neuromuscular. La acetilcolina va a activar una proteína G, que hará su intercambio de GDP por GTP, pero ahora va a ser la subunidad βγ la que va a abrir un canal iónico que permite la salida de iones K+, y la respuesta celular es que hay una reducción de la frecuencia del ritmo cardiaco 10 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR La señalización por los receptores acoplados a proteínas G puede desactivarse cuando el receptor es fosforilado por un grupo de quinasas específico, para fosforilar por el dominio del citosol al receptor. Ese grupo de quinasas se llaman GRK, que son quinasas de los receptores acoplados a proteínas G. Una vez que el receptor está fosforilado, hace que la proteína G deje de ser activa, se le une la proteína arrestina y se produce una endocitosis mediada por clatrina que va a internalizar a ese receptor. Una vez internalizado, podrá degradarse en el lisosoma o podrá ser reciclado otra vez a la mp. Este grupo de GRK son un grupo de mucha investigación. Las vías de señalización de los GPCR están implicadas en el crecimiento de la tumorogénesis del cáncer. C. Receptores acoplados a enzimas Son proteínas transmembrana que por su dominio citosólico poseen ellos mismos actividad enzimática o se asocian directamente a una enzima. Estos receptores pueden activar algunas rutas que también activan los GPCR. Hay distintas clases y son todas importantes, pero los más abundantes son los receptores tirosina quinasa (RTKs). Los RTK tienen como molécula señal muchos de los llamados factores de crecimiento, que se requieren a concentraciones muy bajas (10-9-10-11 M). La respuesta celular es lenta (hasta horas) y es variada: crecimiento, proliferación, diferenciación, cambios en el citoesqueleto, movimiento, supervivencia. Las alteraciones de estos receptores o de las rutas que desencadenan están directamente implicadas en el cáncer. 11 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Hay varios tipos de estos receptores. Los más importantes son: 1. Factor de crecimiento epidérmico (EGF): esa molécula señal estimula crecimiento, supervivencia y proliferación de distintos tipos celulares. Va a haber 4 RTKs que reciben los nombres de: EGFR (que también se conoce como HER1), HER2, HER3 y HER4. 2. Factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF): este factor de crecimiento va a inducir angiogénesis, es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos. Existen 58 RTKs codificados en el genoma humano. La mayoría son proteínas transmembrana de paso único, excepto el receptor de la insulina, que es un dímero. Activación de los RTKs El RTK va a estar en un modo inactivo, pero cuando llega la molécula señal, en general un factor de crecimiento, este factor suele dimerizar y el receptor también lo hace. Por tanto: primero, dimerización del receptor y tienen que estar juntos. Cuando los receptores están cerca, una de las moléculas del receptor puede fosforilar residuos de tirosina en varios lugares del dominio citosólico del receptor que tiene al lado, lo que se conoce como una autofosforilación trans o fosforilación cruzada. Así pues, se generan en el RTK varios dominios con las tirosinas fosforiladas que son dominios de unión específicos para distintas proteínas que contendrán un motivo que reconozca esos dominios tirosina fosforilados. Esto implica que hay un ensamblaje transitorio de un conjunto de moléculas señalizadoras que difunden esa señal por medio de distintas rutas. El receptor al fosforilarse ha conseguido crear unos puntos de anclaje 12 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR para reclutar a las proteínas necesarias para transmitir la señal, y que estén juntas y cerca de la mp, de tal manera que esta señal que había entrado del medio externo por la molécula señal, ahora puede transmitirse al interior celular. La célula controla estrictamente la abundancia de RTKs en la superficie celular, ya que si hay pocos receptores, les cuesta dimerizar y la señal no se va a propagar, aunque llegue. Sin embargo, cuando a la célula le interese, hay una mayor cantidad de RTKs en la membrana para que se encuentren fácilmente, puedan dimerizar y la señal se pueda propagar. Ese control exige que en una célula normal, cuando sobrepasa un número de receptores, y le interese que la señal ya no se siga transmitiendo, los va a internalizar y los degradará o reciclará por endocitosis mediada por clatrina. En las células tumorales suele haber una sobreexpresión de RTKs y además suelen fallar en los mecanismos de internalización. Rutas que puede desencadenar un RTK activado 1. Activación de Ras: se desencadena la ruta de la MAP quinasa. 2. Activación de la PI3K (fosfatidilinositol 3-quinasa), que da lugar a la formación de PIP 3 y activación de PKB/Akt. 3. Activación de la fosfolipasa Cγ (PLC γ). 1. Activación de Ras Los miembros de la superfamilia de GTPasas monoméricas Ras que participan en la señalización de los RTKs son: H-Ras, K-Ras y N-Ras. Ras es una GTPasa monomérica anclada a la monocapa interna de la mp y que en su forma inactiva lleva unida GDP. Para activarse se necesita un GEF que intercambie el GDP por GTP. Para que Ras deje de estar activo en un momento dado, tiene que intervenir un GAP que acelere la hidrolisis de GTP a GDP. La activación de Ras consta de los siguientes pasos: 1. Al RTK activado se le une la proteína adaptadora Grb2, que reconoce el motivo fosfotirosina del receptor gracias a que tiene un dominio SH2. 13 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR 2. Esa proteína adaptadora Grb2, es capaz de unir a la proteína Sos, que presenta motivos ricos en prolina que reconocen un dominio SH3 de la proteína Grb2. Es decir, Grb2 consigue que la proteína Sos este cerca de la mp. Esto es interesante porque Sos es la GEF de Ras, y dado que Ras está en la membrana, Sos tiene que acercarse a ésta. 3. Sos permite la salida de GDP en Ras y la entrada de GTP. Ya tenemos la proteína Ras activada, y a partir de ahí habrá una cascada de señalización. Una vez que Ras está activado, una de las rutas que puede seguir es desencadenar la ruta de la MAP quinasa. Es una cascada de señalización, muy conservada en la evolución, que incluye la fosforilación secuencial de 3 quinasas: 1. MAP quinasa quinasa quinasa (MAPKKK): Raf. Raf es fosforilada por Ras activada. 2. MAP quinasa quinasa (MAPKK): MEK. MEK es fosforilada por Raf. 3. MAP quinasa: ERK. ERK es fosforilada por MEK. ERK fosforilada se trasloca al núcleo, donde fosforila y activa factores de transcripción que controlan la expresión de genes que se requieren para el crecimiento celular, diferenciación y supervivencia. 14 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR La respuesta celular de la MAP quinasa de esta ruta es proliferación, supervivencia, diferenciación; por lo tanto, una activación constante de esta ruta hace que haya un incremento de la proliferación y de la supervivencia, y por lo tanto, que se desarrolle un cáncer. La ruta deja de estar activa porque va a participar un conjunto de GAP que van a hidrolizar un P del GTP de Ras. Cuando la proteína Ras está mutada, la proteína GAP no puede funcionar, por lo que no se hidroliza el GTP, y en consecuencia, Ras se mantiene activo constantemente. En este escenario, Ras va a estar continuamente señalizando la ruta de la MAP quinasa, y por tanto, aumenta constantemente la proliferación y la supervivencia. Ras está mutado en el 30% de los tumores humanos. Más concretamente, en los cánceres de páncreas, KRas esta mutado en el 90% de los casos. También es muy importante la mutación de Raf en el melanoma. Casi el 50% de los casos lo tienen mutado. Si esta ruta está mutada en las células tumorales, los grupos de investigación lo que hacen es buscar fármacos que bloqueen y hagan OFF en esta ruta. 2. Activación de la PI3-K Un receptor RTK activado también puede activar a la enzima PI3K (fosfatidilinositol 3-quinasa). La PI3K también puede ser activada por un GPCR. La PI3K es una quinasa especial que añade un grupo P a un fosfolípido de la monocapa interna, el PIP 2 , formando PIP 3 (fosfatidilinositol-trifosfato). Ese PIP 3 va a permitir que se le unan 2 proteínas que son PDK1 y Akt. Son capaces de unirse porque ambas tienen un dominio de homología con la plecstrina (dominio PH), que reconoce y une un motivo que es ese PIP3. PDK1 junto con otro complejo proteico, mTORC2, se encargan de fosforilar a Akt. De esta forma, Akt pasa a un estado activo, se separa de la mp, y activa múltiples vías de señalización. Esta vía de la PI3K es inactivada por la proteína PTEN, que es una fosfatasa. 15 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Akt es capaz de regular numerosas funciones celulares como: → → → → → → → → Angiogénesis. Metabolismo. Crecimiento. Proliferación. Supervivencia. Síntesis de proteínas. Transcripción. Inhibición de la apoptosis. 3. Activación de la fosfolipasa Cγ La PLCγ, al igual que ocurría con la PLCβ, se va a encargar de hidrolizar el PIP 2 en DAG, que se queda en la mp, y en IP 3 . El IP 3 difunde y llega a la membrana del RE, donde abre un canal regulado por ligando, permitiendo la salida de iones Ca2+. Como conclusión de este proceso, se activa la PKC, y además, esos iones Ca2+ pueden activar a la calmodulina, que también controla muchas rutas de señalización. Ras no solo activa la ruta de la MAP quinasa, sino que Ras también es capaz de activar a la PI3K y a la fosfolipasa Cε. Un receptor acoplado a una proteína G también puede activar la vía de señalización de Ras. RESUMEN: 16 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Señalización por integrinas Las integrinas no solo participan en la adhesión, sino que también intervienen en la señalización. Lo consiguen porque, principalmente, a través de las integrinas se activa la proteína FAK (quinasa de adhesión focal). Cuando FAK se une e interacciona con el dominio citosólico de las integrinas, se producen fosforilaciones cruzadas entre las moléculas de FAK, y eso crea dominios fosfotirosina que permiten la unión o el anclaje de distintas proteínas implicadas directamente en la señalización, incluyendo a Sos (a través de Grb2) y a la PI3K. Al unirse Sos, se puede activar por tanto la ruta de señalización de Ras. Si se pierde totalmente la adhesión a la MEC, la célula pierde las señales que activan las rutas de Ras, señales de supervivencia, y por tanto la célula entra en anoikis. Las células tumorales consiguen evadir la muerte aun cuando han perdido la adhesión. Mecanismos de muerte celular. Apoptosis Existen o se han identificado distintos mecanismos de muerte celular. Los 4 más importantes son: → → → → Apoptosis. Autofagia. Necrosis. Catástrofe mitótica. Cada uno de ellos tiene sus características morfológicas especiales para que se puedan identificar. 17 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Las células que entran en apoptosis, se redondean, se reduce el volumen celular, el núcleo se fragmenta, los orgánulos mantienen su morfología durante bastante tiempo y la mp, que mantiene su integridad, genera una serie de burbujas. En el caso de la catástrofe mitótica, suele aparecer multinucleación. Son células con husos multipolares. Apoptosis Las células que se mueren por apoptosis son: • • • • Células perjudiciales para el organismo: células con el DNA dañado, células infectadas, portadoras de virus… Células innecesarias (ej: células de las membranas interdigitales). Células que han finalizado su función (ej: colas de renacuajo). Células que mueren por agentes quimioterapéuticos. Es la forma en la que actúan estos agentes en las terapias contra el cáncer. La apoptosis es un proceso muy conservado en la evolución, y conforme el individuo es más complejo, las rutas de la apoptosis también lo son. Se da en todos los animales pluricelulares. Este proceso es fundamental para mantener la homeostasis celular, que consiste en mantener en equilibrio las células que mueren en un tejido en relación con las que se reponen. Esta homeostasis celular la tienen que conservar todos los tejidos y órganos del organismo. Cuando esa homeostasis se altera porque hay un incremento de divisiones respecto a las que mueren, se origina el cáncer. Si por el contrario se mueren sin reponer, tenemos por ejemplo Alzheimer (neuronas) o SIDA (linfocitos). 18 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Características morfológicas y bioquímicas de la apoptosis → Reducción del volumen celular. → La mp y los orgánulos mantienen su integridad. → La fosfatidilserina pasa a la monocapa externa. Hay un ensayo para detectar este fosfolípido en la monocapa externa, que es el ensayo de la anexina V. La anexina es una proteína que se une específicamente a la fosfatidilserina, y que lleva incorporado un fluorocromo. Una célula normal, al hacer este ensayo sale negativo, no se ve fluorescencia. Sin embargo, en una célula que esté en apoptosis, la anexina va a reconocer y unir a la fosfatidilserina, y esto te marca la mp con el color del fluorocromo. Este paso de la fosfatidilserina a la monocapa externa se dice que lo que hace es indicar a otras células de que esa célula se está muriendo. → Deformaciones de la mp a modo de burbujas. → Condensación y fragmentación de la cromatina. → Fragmentación del DNA entre nucleosomas (patrón en escalera en la electroforesis de DNA). Se activa una DNAsa que corta entre nucleosomas. → Formación de cuerpos apoptóticos (fragmentos celulares rodeados de mp), fagocitados por células vecinas o macrófagos. No hay una respuesta inflamatoria porque no se libera nada del contenido al medio externo. Caspasas Son proteasas responsables de las características morfológicas de la célula apoptótica, que tienen cisteína en el centro activo y que rompen por ácido aspártico. En mamíferos se han identificado 14 genes para las caspasas. Algunas de ellas participan en la apoptosis y otras en la respuesta inflamatoria. El número de caspasas ha cambiado evolutivamente. Estas proteasas son las responsables de todas las manifestaciones morfológicas y alteraciones bioquímicas que caracterizan a la apoptosis; es decir, son las que se encargan de fragmentar el DNA, el núcleo (porque van a degradar las laminas nucleares), el citoesqueleto y además son responsables también del burbujeo de la mp y de la fragmentación de orgánulos como el Golgi. Hay 2 tipos de caspasas: caspasas iniciadoras y las caspasas ejecutoras o efectoras. 1. En general, las caspasas iniciadoras tienen largos prodominios y son capaces de autoactivarse cuando están cerca varias moléculas de esa caspasa iniciadora. 2. Las caspasas ejecutoras/efectoras, tienen cortos prodominios, no son capaces de autoactivarse, lo tienen que hacer a través de las iniciadoras, y son las responsables de las alteraciones que caracterizan a la apoptosis. Es decir, las caspasas iniciadoras se autoactivan y se encargan de activar a las caspasas efectoras, que son las que llevan a cabo las funciones finales. El inicio de la cascada se produce en respuesta a estímulos que disparan el proceso de la apoptosis. En una célula en estado normal, las caspasas se encuentran en estado inactivo, como zimógenos. Para que una caspasa se active, necesita que se escindan determinados sitios de su molécula y que se reúnan dos subunidades grandes y dos subunidades pequeñas. 19 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Proteínas Bcl-2 Es una familia de proteínas que regula la apoptosis. Se clasifican en 3 grupos: 1. Proteínas antiapoptóticas, ej: Bcl2. Tienen 4 dominios BH. 2. Proteínas proapoptóticas, ej: Bax. Tiene sólo 3 de los dominios BH, le falta el BH4. 3. Proteínas proapoptóticas “sólo BH3”, ej: Bid. Sólo tienen el dominio BH3. Las proteínas Bcl2 antiapoptóticas, como Bcl2, suelen estar ancladas a la membrana mitocondrial externa; sin embargo, todos los miembros proapoptóticos suelen localizarse en el citosol. Sólo después de que se haya desencadenado un estímulo apoptótico, se translocan hacia la mitocondria, en concreto, hacia la membrana mitocondrial externa. Es allí donde oligomeriza la proteína Bax (se insertan en la membrana mitocondrial externa varias moléculas de Bax) y eso permite la liberación (salida) del citocromo C desde el espacio intermembrana hacia el citosol. El citocromo C es uno de los componentes de la cadena respiratoria, por lo que participa tanto en la síntesis de ATP como en la apoptosis. Existen dos grandes rutas de desencadenamiento de la apoptosis: 1. La vía extrínseca o de los receptores de muerte: Los receptores de muerte son proteínas transmembrana que tienen un dominio extracelular para unir a su ligando, un dominio transmembrana de paso único, y un dominio citosólico que se llama dominio de muerte. Este dominio de muerte es capaz de reconocer a una proteína adaptadora que a su vez permite que se le una una caspasa iniciadora que se denomina procaspasa 8. Estos receptores son homotriméricos, es decir, que la misma molécula está agrupada de 3 en 3. 20 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR El resultado es que la unión del ligando a los receptores ha permitido que se acople la proteína adaptadora y que venga la procaspasa 8. Como las moléculas de caspasa 8 están cercas unas de otras, se pueden autoactivar. Una vez activada la caspasa 8, se activan las caspasas ejecutoras, principalmente la 3, que se encargan de ejecutar todo lo que hemos dicho anteriormente, y la célula diana se habrá muerto por apoptosis. 2. Vía intrínseca o mitocondrial. En este caso, se produce una liberación del citocromo C desde la mitocondria hasta el citosol. Ese citocromo C, junto con la proteína Apaf-1, forma una plataforma de muerte que tiene forma de rueda con 7 radios, y que, junto con el ATP, forma el llamado apoptosoma. El apoptosoma recluta a la procaspasa 9, que es la caspasa iniciadora de esta ruta. Juntos, se activan. Se activa la caspasa 9, que a su vez activará a las caspasas ejecutoras, principalmente la 3. El sentido que tiene la formación de esa plataforma de muerte es que las moléculas de caspasa iniciadora estén cerca para que se puedan activar unas a otras. 21 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Estas dos rutas, extrínseca e intrínseca, no son independientes, porque la proteína proapoptótica BID, puede activarse mediante una hidrólisis de su molécula, formando el llamado tBID (BID truncado), por acción de la caspasa 8. tBID se va hasta la mitocondria, se inserta, y se consigue la liberación del citocromo C. Nuevos enfoques para el tratamiento del cáncer Hoy en día en oncología se tiende a hacer tratamientos o medicina personalizada, un nuevo enfoque en función de las características moleculares (o perfil molecular) del tumor de cada paciente. Se detecta que proteínas o que genes están alterados, y eso permite dar desde un determinado pronóstico, a la selección de los mejores fármacos que haya según lo que tenga el paciente… Según el tipo de perfil molecular que tenga un determinado tipo de cáncer, se le da un tratamiento determinado, personalizado. Lo que se persigue es conseguir una mayor eficacia, una menor toxicidad y un menor coste. 22 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Eso se ha conseguido bastante con las pacientes de cáncer de mama, porque se ha estudiado mucho como desactivar esas vías de los RTKs. Hasta hace unos años, todos los fármacos quimioterapéuticos o afectaban al DNA (que se intercalan en el DNA impidiendo la replicación y la transcripción y la célula acaba muriendo) o bien a los microtúbulos (consiguiendo que las células no se puedan dividir). A muchos pacientes con cáncer se les sigue dando cisplatino, que interactúa con el DNA y evita que esa célula se divida. Dentro de los microtúbulos, a los pacientes se les trata con derivados del taxol, que inhiben la dinámica de los MTs. La cosa se ha afinado mucho más, y como han visto que la ruta de los RTKs está alterada en muchos tipos de cáncer, muchos laboratorios están buscando inhibidores de esa ruta de los RTKs. Esto se ha conseguido en el cáncer de mama. Los receptores de la familia HER son receptores RTK; son proteínas transmembrana con un dominio extracelular, uno transmembrana y otro citosólico. Tiene 4 miembros. Descubrieron que el 25% de las pacientes con cáncer de mama son HER2+, lo que significa que sobreexpresan mucho HER2 en la superficie de las células tumorales. Y existe un medicamento específico para los pacientes con cáncer de mama que sean HER2+. Este medicamento es el Trastuzumab (Herceptin®), que es un anticuerpo que se une específicamente al receptor HER2. El trastuzumab se une al receptor e impide la dimerización. Si el receptor no puede dimerizar, no se activa la vía. Además, han comprobado que a las pacientes a las que se les suministra la herceptina, es capaz ese anticuerpo de atraer a células del sistema inmune y se acaba induciendo la muerte de las células tumorales. Hoy en día, este medicamento se utiliza como coadyuvante; esto quiere decir que, además de la quimio normal, se les dará este fármaco. El problema de la quimio es la resistencia. Las células tumorales se pueden hacer resistentes a la quimio. Otra cosa que se está haciendo es coger un anticuerpo para alguna proteína que esté sobreexpresada, como HER2, y para no darle la quimio convencional, se le pone un linker, un enlace covalente, con una droga quimioterapéutica que afecte a los MTs; es decir, un anticuerpo al que se le ha unido covalentemente una sustancia que interacciona con MTs. Lo que hacen es inyectarte el anticuerpo con esa unión de la droga, que ha de ser una unión covalente, pues si no al rato de inyectar se pueden separar. La droga es tóxica. De alguna manera, el anticuerpo se une al receptor, bloqueando la señalización intracelular e inhibiendo la proliferación; pero además, todo ese complejo se endocita, se fusiona con un lisosoma, se degrada el anticuerpo, se rompe el enlace covalente y se libera la droga, por lo que ahora la droga puede actuar desde dentro. Esto es una manera de dirigir la terapia y que sea más selectiva para las células tumorales, porque si no, todas las demás cosas que se emplean en quimioterapia afectan también a las células sanas, causando todos los efectos secundarios indeseados derivados de un tratamiento de quimioterapia: vómitos, diarrea, caída del pelo, cansancio… 23 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com) lOMoARcPSD|4940088 BIOLOGÍA CELULAR APLICADA TEMA 5: SEÑALIZACIÓN CELULAR Lo que puede revolucionar la quimio son las nanopartículas, que son plataformas que pueden ser un liposoma, una micela, albúmina… y es lo más puntero actualmente. En un liposoma podemos poner varias drogas y, como tiene una bicapa lipídica, podemos poner una molécula que dirija de alguna manera el liposoma a la célula tumoral. Con esto se consigue llevar fármacos en mayor cantidad a la célula tumoral produciendo menos efectos secundarios. El objetivo es evadir la resistencia. 24 Descargado por Alexy Silva (alexy.silva00@gmail.com)