Sortni vonj vina ali napaka

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO Mojca JENKO, Franc ČUŠ, Tatjana KOŠMERL SORTNI VONJ VINA ALI NAPAKA Študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina Ljubljana, 2011 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Avtorji: Mojca Jenko, univ. dipl. inž. živ. tehnol. doc. dr. Franc Čuš, univ. dipl. inž. agr., univ. dipl. inž. živ. tehnol. prof. dr. Tatjana Košmerl, , univ. dipl. inž. živ. tehnol. Naslov: SORTNI VONJ ALI NAPAKA: Študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina Recenzenta: prof. dr. Rajko Vidrih, univ. dipl. inž. živ. tehnol. doc. dr. Barbara Jeršek, univ. dipl. inž. živ. tehnol. Izdajatelj: Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 663.2:543.92(0.034.2) JENKO, Mojca, 1984Sortni vonj vina ali napaka [Elektronski vir] : študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina / Mojca Jenko, Franc Čuš, Tatjana Košmerl. - El. knjiga. - Ljubljana : Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Način dostopa (URL): http://www.bf.uni-lj.si/knjiznice/o-knjiznicah/organiziranost/knjiznicaodd-za-zivilstvo/ucbeniki-v-elektronski-obliki.html ISBN 978-961-6333-94-8 (html) 1. Čuš, Franc, 1972- 2. Košmerl, Tatjana 257738496 Vse pravice pridržane. Ponatis (grafični, elektronski ali mehanski, vključno z razmnoževanjem, snemanjem ali prenosom v baze podatkov) celote ali posameznih delov ni dovoljen brez pisnega soglasja nosilca avtorskih pravic. II Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 KAZALO VSEBINE AROMATIČNE SPOJINE V VINU....................................................................................... 1 PRIMARNE (SORTNE) AROME VINA .............................................................................. 1 1. Terpeni............................................................................................................................... 1 1.1 ß-glukozidazna aktivnost kvasovk ................................................................................ 3 1.2 Kvasovke in »de novo« sinteza terpenov ...................................................................... 4 1.3 Drugi dejavniki, ki vplivajo na koncentracijo terpenov v vinu..................................... 6 2. Norizoprenoidi .................................................................................................................. 6 3. Metoksipirazini ................................................................................................................. 7 4. Hlapni tioli......................................................................................................................... 8 5. C6 aldehidi ....................................................................................................................... 10 FERMENTACIJSKE AROME ............................................................................................ 11 1. Višji alkoholi.................................................................................................................... 11 2. Estri .................................................................................................................................. 13 3. Hlapne kisline.................................................................................................................. 15 4. Acetaldehid ...................................................................................................................... 16 5. Diacetil ............................................................................................................................. 16 6. Hlapni fenoli .................................................................................................................... 17 7. Žveplove spojine.............................................................................................................. 18 7.1 Vodikov sulfid in merkaptani...................................................................................... 18 7.2 Druge žveplo-vsebujoče organske spojine.................................................................. 18 GLUTATION IN OHRANJANJE AROMATIČNIH SPOJIN ......................................... 19 1. Oksidacija vina in GSH.................................................................................................. 21 2. Kvasovke in GSH............................................................................................................ 21 3. Dodajanje GSH v mošt in vino ...................................................................................... 22 4. Baker in GSH .................................................................................................................. 22 5. Dušik in GSH................................................................................................................... 22 LITERATURA ......................................................................................................................... 24 III Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Kazalo slik Slika 1: Mešana kultura kvasovk med AF mošta sorte traminec nacepljena na WL gojišče; (a) mikroskopska slika kolonije kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae (400x povečava); (b) mikroskopska slika kolonije kvasovk vrste Torulaspora delbrueckii (400x povečava) (Foto: Franc Čuš in Mojca Jenko) ........................................................................................................ 4 Slika 2: Biosinteza sterolov in tvorba terpenov (Swiegers in sod., 2005) ...............................................5 Slika 3: Strukturni formuli 3-isobutil-2-metoksipirazina (IBMP) in 3-izopropil-2-metoksipirazina (IPMP) (Candelon in sod., 2010)...............................................................................................7 Slika 4: Koncentracija hlapnih tiolov (4MMP, 3MH in 3MHA) v vinih sorte sauvignon, pridelanih z različnimi komercialnimi sevi kvasovk v 20 L mošta. Rezultati so povprečja treh paralelk (Swiegers in sod., 2009) ............................................................................................................ 9 Slika 5: Sposobnost pretvorbe 3MH v 3MHA v vinih sorte sauvignon z delovanjem različnih komercialnih sevih kvasovk (Swiegers in sod., 2006).............................................................10 Slika 6: Splošni prikaz tvorbe višjih alkoholov iz prekurzorskih aminokislin in α-keto kislin (Fugelsang, 1997) ....................................................................................................................12 Slika 7: Koncentracija acetatov in etilnih estrov v vinu, pridelanem z različnimi komercialnimi sevi kvasovk (Torrens in sod., 2008). .............................................................................................14 Slika 8: Tvorba etilfenolov iz prekurzorskih hidroksicimetnih kislin (Suárez in sod., 2007) ...............17 Slika 9: Strukturna formula GSH v reducirani (b) in oksidirani obliki (a) (http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Glutathione-skeletal.png)...................................... 19 Slika 10: Shematski prikaz antioksidativnega delovanja GSH v prisotnosti oksidiranih fenolnih spojin (Bowyer in sod., 2010) ............................................................................................................ 20 Slika 11: Koncentracije GSH (mg/L) med alkoholno fermentacijo in nadaljnjim zorenjem na drožeh (Bowyer in sod., 2010) ............................................................................................................ 20 Slika 12: Povezava med koncentracijo prostega aminokislinskega dušika v grozdnem soku in koncentracijo GSH v vinu (Bowyer in sod., 2010).................................................................. 23 Kazalo preglednic Preglednica 1: Razdelitev nekaterih sort grozdja glede na koncentracijo monoterpenov (Mateo in sod., 2000).................................................................................................................................2 Preglednica 2: Senzorični opisi in prag zaznave monoterpenskih alkoholov v vinu (Ribéreau Gayon in sod., 2006).........................................................................................................................2 Preglednica 3: Višji alkoholi, njihove prekurzorske aminokisline in koncentracije (Bavčar, 2009).....12 Preglednica 4: Glavni estri v vinu: njihov senzoričen opis, povprečne koncentracije v vinu in prag senzorične zaznave (Sumby in sod., 2010) .................................................................... 13 Preglednica 5: Koncentracija acetaldehida v nekaterih alkoholnih pijačah (Liu in sod., 2000).............16 IV Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 AROMATIČNE SPOJINE V VINU Vino vsebuje veliko kemijskih spojin, ki prispevajo k barvi, aromi in okusu vina. V zadnjih desetletjih je aroma vina postala predmet številnih raziskav, pri katerih so identificirali številne komponente, ki vplivajo na različne senzorične lastnosti vina, tako pozitivne kot negativne (Sumby in sod., 2010). Koncentracija vseh aromatičnih snovi v vinu je približno 0,8-1,2 g/L. Višji alkoholi, ki nastajajo med alkoholno fermentacijo (AF), predstavljajo 50 % te vrednosti. Ostale aromatične spojine so zastopane v koncentracijah med 10-4 in 10-9 g/L. Prag zaznavanja določene aromatične spojine je tista najmanjša koncentracija, pri kateri je prišlo do odziva čutilnega organa in se zelo razlikuje med posameznimi spojinami (10-4 in 10-12 g/L) (Košmerl, 2007). Aromatične spojine v vinu uvrščamo v naslednje kategorije:  Primarne ali sortne arome – aromatične spojine, ki izvirajo iz grozdja  Fermentacijske arome – aromatične spojine, ki nastanejo med alkoholno fermentacijo  Zorilne arome – aromatične spojine, ki nastanejo med zorenjem vina Koncentracija aromatičnih spojin v vinu je odvisna od številnih dejavnikov, predvsem pa od okolja (klima in tla), sorte grozdja, stopnje zrelosti, pogojev fermentacij (pH, temperatura, sev kvasovk, prehrana kvasovk), postopkov predelave grozdja (enološki postopki) ter zorenje in staranje vina (Košmerl, 2007). PRIMARNE (SORTNE) AROME VINA Primarne ali sortne arome vina so tiste spojine, ki jih najdemo v nepoškodovani grozdni jagodi in med predelavo grozdja (pecljanje, drozganje, maceracija, stiskanje) preidejo v mošt, kjer potekajo kemijske in encimske reakcije. Med primarne arome prištevamo terpene, ki so značilni za muškatne sorte, metoksipirazine in prekurzorje hlapnih tiolov, ki so značilen del arome vina sorte sauvignon, v manjši meri pa tudi sort cabernet sauvignon, cabernet franc in merlot, norizoprenoide, ki pomembno vplivajo predvsem na aromo sort chardonnay, sauvignon, renski rizling in nekaterih rdečih sort in C6 aldehide, ki so posledica pridelave vina iz nezrelega grozdja ali prisotnosti zelenih delov grozdov, mladik in listov med stiskanjem. 1. Terpeni Skupina terpenov je zelo velika in šteje več kot 4000 spojin. Med terpene, ki jih zaznamo z vonjem, prištevamo monoterpene (spojine z 10 ogljikovimi atomi) in seskviterpene (spojine s 15 ogljikovimi atomi). Monoterpeni se v grozdju in vinu nahajajo v obliki enostavnih ogljikovih hidratov (limonen, mircen, itn.), aldehidov (linalal, geranial, itn.), alkoholov (linalool, geraniol, itn.), kislin (linolna, geraniolska, itn.) in celo estrov (linalil acetat, itn.). V grozdju so določili okrog 40 terpenskih spojin. Najbolj aromatični so nekateri monoterpenski alkoholi (monoterpenoli), kot so linalool, α-terpineol, nerol, geraniol, citronelol in hotrineol, ki se med seboj razlikujejo po položaju hidroksilne (OH) skupine na sredinskem ogljikovodikovem obroču. Njihovi pragi zaznave so zelo nizki od 50 do 400 µg/L, najbolj aromatična predstavnika pa sta citronelol in linalool (Ribéreau Gayon in sod., 2006; Bavčar, 2009). 1 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Terpeni so nosilci sortne arome in so odločilni za tipičen aromatski profil grozdja in vina v skupini muškatov, kot sta rumeni muškat in muškat ottonel. S svojim muškatnim tonom lahko pomembno vplivajo tudi na druge sorte vina, kot so renski rizling, traminec, sivi pinot, scheurebe in rizvanec. Pri sortah z enostavno aromatiko, kot so sauvignon, cabernet sauvignon, cabernet franc in merlot, pa so v koncentracijah pod mejo zaznave (Bavčar, 2009). O koncentraciji monoterpenov v različnih sortah grozdja so poročale že številne raziskave, vendar so eksperimentalni podatki pridobljeni s pomočjo različnih tehnologij pridelave in vzorcev iz različnih vinogradniških področij, zato je direktna primerjava teh podatkov nerealna. V grobem pa lahko razdelimo sorte glede na njihovo aromatičnost v naslednje razrede (preglednica 1) (Mateo in sod., 2000): 1. intenzivno aromatične muškatne sorte, pri katerih lahko skupna koncentracija prostih monoterpenov doseže 6 mg/L; 2. ne-muškatne, aromatične sorte s koncentracijo skupnih monoterpenov 1-4 mg/L; 3. ne-aromatične sorte, pri katerih koncentracija monoterpenov nima bistvenega vpliva na aromo. Preglednica 1: Razdelitev nekaterih sort grozdja glede na koncentracijo monoterpenov v vinu (Mateo in sod., 2000) 1. muškatne sorte kanadski muškat dišeči traminec aleksandrijski muškat frontignanski muškat rumeni muškat hamburški muškat muškat ottonel italijanski muškat 2. ne-muškatne aromatične sorte traminec huxel kerner muškat morio laški rizling scheurebe silvanec wurzer 3. nevtralne sorte bakus cabernet sauvignon chardonnay merlot sauvignon shiraz ruländer semillon O koncentraciji monoterpenov v slovenskih vinih v literaturi ni veliko podatkov. V nedavnih raziskavah so določali koncentracijo prostih monoterpenov v vinih sort cipro, klarnica, malvazija, pinela, rebula in šipon. Večje koncentracije linaloola, α-terpineola, citronelola in nerola so določili le v vinih sorte cipro. Pri ostalih analiziranih sortah je le en vzorec vina sorte klarnica vseboval linalool in dva vzorca sorte malvazija α-terpineol (Čuš in sod., 2009). Terpeni se v grozdju in moštu nahajajo v vezani (glikozidni) in prosti (hlapni) obliki. Posamezni prosti terpeni značilno dišijo, kot je prikazano v preglednici 2. Nehlapni, na sladkorje (glukozo, arabinozo, apiozo in ramnozo) vezani terpeni, se med vinifikacijo sprostijo s pomočjo delovanja glikozidaz, ki izvirajo iz grozdja, kvasovk in bakterij. S povečanjem aktivnosti teh encimov lahko izboljšamo terpenske arome vina (Swiegers in sod., 2005). Preglednica 2: Senzorični opisi in prag zaznave monoterpenskih alkoholov (Ribéreau Gayon in sod., 2006) Monoterpen geraniol citronelol linalool nerol α-terpineol Senzorični opis cvetlični, vrtnica, citrusi prijetno dišeč, vrtnica, citrusi cvetlični, svež, koriander, lipa cvetlični, svež, po zelenem španski bezeg Prag zaznave (µg/L) 130 18 50 400 400 2 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Encimska hidroliza monoterpenov vključuje dva koraka (Lecas in sod., 1991): 1. Cepitev 1,6-glikozidne vezi z α-L-ramnozidazo in α-L-arabinofuranozidazo ali β-D-apiofuranozidazo (odvisno od strukture terpenskih molekul) 2. Sprostitev monoterpenov iz monoterpenil-β-D-glukozidov z β-glukozidazo. Učinkovitost hidrolize monoterpenil-β-D-glukozidov s pomočjo β-glukozidaz je odvisna od izvora encima in strukture terpenske molekule. Pri zorenju grozdja sprožijo endogene β-glukozidaze iz grozdja cepitev monoterpenil-β-D-glukozidov. Te β-glukozidaze lahko sprostijo geraniol, citronelol in nerol iz njihovih prekurzorjev, medtem ko linaloola in α-terpineola praktično ne morejo sprostiti. Aktivnost teh encimov v moštu in vinu je skoraj nična, saj je inhibirana s strani glukoze, nizkega pH in velike koncentracije etanola (Mateo in sod., 2000). 1.1 ß-glukozidazna aktivnost kvasovk Nekateri sevi kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae imajo β-glukozidazno aktivnost (Hernández in sod., 2003), vendar je le-ta razmeroma nizka, saj je encim inhibiran pri večjih koncentracijah sladkorja (200 g/L) in že pri 5 vol.% alkohola. Zato je dodatek funkcionalnih β-glukozidaz med AF najbolj učinkovit način izboljšanja hidrolize glikokonjugiranih aromatičnih komponent, s čimer izboljšamo aromo vina (Mateo in sod., 1997). Glede na rezultate številnih raziskav imajo večjo β-glukozidazno aktivnost ne-Saccharomyces kvasovke vrst Kloeckera apiculata, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Candida guilliermondii in Candida pulcherrima (Mendes Ferreira in sod., 2001; FernándezGonzález in sod., 2003; Rodríguez in sod., 2007). Pri določanju sposobnosti hidrolize terpenskih glikozidov komercialnih sevov vinskih kvasovk vrste S. cerevisiae (AR2, NT 116 in QA23) so ugotovili, da je največ α-terpineola, citronelola in nerola iz mošta sprostil sev kvasovk QA23, največ linaloola in farnezola pa sev NT116. Vsi vzorci vina, pridelanega z omenjenimi sevi kvasovk, so imeli cvetlično aromo, ostali deskriptorji pa so bili odvisni od posameznega seva (Loscos in sod., 2007). V zadnjem času je vedno večji trend uporaba mešanih starterskih kultur kvasovk rodov Saccharomyces in ne-Saccharomyces za izpeljavo AF mošta terpenskih sort z namenom povečanja koncentracije prostih terpenov v vinu. Na sliki 1 je prikazana kultivacija mešane kulture kvasovk rodov Saccharomyces in ne-Saccharomyces, ki je bila prisotna v fermentirajočem moštu sorte traminec ter mikroskopski posnetki posameznih kolonij kvasovk. 3 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 (a) (b) Slika 1: Mešana kultura kvasovk med AF mošta sorte traminec nacepljena na WL gojišče; (a) mikroskopska slika kolonije kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae (400x povečava); (b) mikroskopska slika kolonije kvasovk vrste Torulaspora delbrueckii (400x povečava) (Foto: Franc Čuš in Mojca Jenko) V številnih študijah so preverjali β-glukozidazno aktivnost kvasovk različnih rodov in vrste z namenom poiskati alternativo komercialno pripravljenim encimskim preparatom z β-glukozidazami, ki izvirajo predvsem iz plesni. Raziskave so pokazale, da je encimski preparat kvasovk vrste Debaryomyces pseudopolymorphus primerljiv komercialno pripravljenim encimskim preparatom, saj ima veliko afiniteto do terpenskih molekul grozdja, optimalno aktivnost pri pH vina (2,5-3,8), odpornost na prisotnost glukoze in visoko odpornost (toleranco) na etanol. Z dodatkom tega encima med AF mošta sorte chardonnay se je povečala koncentracija citronelola, nerola in geraniola v vinu (Cordero Otero in sod., 2003; Villena in sod., 2006). 1.2 Kvasovke in »de novo« sinteza terpenov Nekatere kvasovke rodov Saccharomyces in ne-Saccharomyces lahko v določenih razmerah sintetizirajo manjše količine monoterpenov. Le-ti izhajajo iz poti za biosintezo sterolov, v kateri se iz izopentenil pirofosfata sintetizira geranil pirofosfat s pomočjo encima geranil pirofosfat sintaze (Carrau in sod., 2005). Posamezni monoterpeni nato nastanejo z različnimi kemijskimi ali encimskimi transformacijskimi reakcijami (slika 2), ki vključujejo izomerizacijo, redukcijo in ciklizacijo. Seskviterpen farnezol izhaja iz intermediata (vmesnega produkta) farnesil pirofosfat in je delno izomeriziran v neroldiol. Geraniol je intermediat v biosintezi ergosterola, citronelol pa nastane z redukcijo geraniola in nerola (Mateo in sod., 2000; Ugliano in sod., 2009). 4 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Slika 2: Biosinteza sterolov in tvorba terpenov (Swiegers in sod., 2005) Nativni sevi kvasovk vrste S. cerevisiae so sposobni le manjše tvorbe monoterpenov, medtem ko so ne-Saccharomyces vrste kvasovk, kot so Kluyveromyces lactis, Torulaspora delbrueckii in Ambrosiozyma monospora, sposobni bistveno večje tvorbe monoterpenov (Swiegers in sod., 2005). Kvasovke vrste Kluyveromyces lactis v aerobnih razmerah tvorijo monoterpene citronelol (do 50 µg/L), linalool (do 50 µg/L) in geraniol (v sledovih). Tvorba monoterpenov se še poveča pri višjih temperaturah (27 °C) in dodatku asparagina kot vira dušika. Ob dodatku geraniola v vino kvasovke vrste K. lactis pretvorijo celotno količino le-tega v citronelol, kar izboljša senzorično kakovost vina (Drawert in sod., 1978). Raziskave nativnih sevov vinskih kvasovk S. cerevisiae iz grozdja v Urugvaju so pokazale, da so te kvasovke sposobne tvorbe večjih koncentracij monoterpenov. Kvasovke so producirale največ linaloola (5 µg/L) in α-terpineola (4 µg/L), kljub razmeroma velikim koncentracijam sintetiziranega geraniola (1,5 µg/L) pa so ga le malo pretvorile v citronelol. Ostale terpene, kot so nerol, hotrienol in linalool oksid, so tvorile le v sledovih (manj kot 0,5 µg/L) (Carrau in sod., 2005). Vinske kvasovke lahko tudi učinkovito pretvarjajo monoterpene iz ene oblike v drugo z različnimi reakcijami. Reakcije, ki jih katalizirajo kvasovke, so izomerizacija geraniola v nerol, izomerizacija nerola v linalool, izomerizacija linaloola v α-terpineol, izomerizacija nerola v α-terpineol, hidracija α-terpineola v terpin hidrat in izomerizacija nerola v geraniol. Te reakcije pomembno vplivajo na senzorično kakovost vina – pretvorba linaloola v α-terpineol vpliva negativno na senzorično kakovost vina, pretvorba nerola v linalool pa pozitivno. Reakcije, ki jih katalizirajo kvasovke, v glavnem vodijo v tvorbo linaloola in α-terpineola (King in sod., 2000). 5 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 1.3 Drugi dejavniki, ki vplivajo na koncentracijo terpenov v vinu Koncentracija monoterpenov v vinu je poleg sorte in uporabljenega seva kvasovk odvisna tudi od številnih drugih dejavnikov, kot so zdravstveno stanje grozdja, stopnja zrelosti, zemlja, mikroklimatski vplivi in ampelotehnični postopki, kot so vršičkanje, delno odstranjevanje listov in izsuševanje. Plesen vrste Botrytis cinerea zmanjša vsebnost monoterpenov zaradi razgradnje glavnih aromatičnih monoterpenskih alkoholov. Potrjen je tudi vpliv postopkov med pridelavo in nego vina, predvsem maceracije, ekstrakcije, uporabe bentonita in pektolitičnih encimov (Bavčar, 2009). Številni razmere med alkoholno fermentacijo vplivajo na tvorbo monoterpenov pri kvasovkah. Pri veliki koncentraciji dušika (400 mg/L) in v mikroaerobnih razmerah fermentacije se tvorba monoterpenov bistveno poveča. Tvorba seskviterpenov pa se poveča pri manjših koncentracijah dušika in v anaerobnih razmerah (Carrau in sod., 2005). 2. Norizoprenoidi C13-norizoprenoidi nastajajo iz karotenoidov pod vplivom svetlobe, temperature in kisika. Pomembno vplivajo na aromo sort chardonnay, sauvignon, renski rizling in nekaterih rdečih sort. Najpomembnejši C13-norizoprenoidi, ki vplivajo na aromo vina, so ß-damascenon, ß-ionon, vitispiran in norizoprenoid TND (Bavčar, 2009):  ß-damascenon z vonjem po tropskem sadju ali kuhanem jabolku ima relativno nizek prag zaznave v modelni alkoholni raztopini (40-60 ng/L). Njegova povprečna koncentracija v sortah belih vin, kot so renski rizling, scheurebe in rumeni muškat, precej niha, bolj pa je stabilna v rdečih sortah, kot so merlot, cabernet sauvignon in cabernet franc. Daleč največje vsebnosti ß-damascenon vsebujejo sladka muškatna vina.  ß-ionon z vonjem po vijolicah ima relativno nizek prag zaznave v modelni alkoholni raztopini (120 ng/L). Najprej je bil določen v belih sortah vin, v zadnjem času pa mu večjo senzorično vlogo pripisujejo v rdečih.  Norizoprenoid TND je tipična spojina staranih vin. S svojim tipičnim vonjem po kerozinu oz. petroleju daje značilen vonj staranim vinom sorte renski rizling. V grozdju in mladem vinu ga v prosti obliki skoraj ni, pojavlja pa se predvsem pozneje med staranjem vin v steklenici. Prag zaznave je približno 20 μg/L, v vinu pa so bile določene tudi desetkrat večje koncentracije. Norizoprenoid TDN se pojavlja hitreje, če se vino v steklenicah stara pri temperaturi nad 15 °C.  Vitispiran se prav tako v večjih koncentracijah razvije med zorenjem in staranjem vina. Pojavlja se v cis in trans izomerah, ki jima raziskovalci pripisujejo zaznave po evkaliptusu, kafri in celo krizantemah. Verjetno ima negativno vlogo v prehitrem staranju vin. Na splošno se koncentracija C13-norizoprenoidov povečuje z dozorevanjem grozdja, po spremembi barve grozdne jagode pa se povečuje le vsebnost C13-norizoprenoidov v vezani glikozidni obliki. Več sončne svetlobe pospeši razpadanje karotenoidov in s tem povečanje koncentracije C13-norizoprenoidov, odstranjevanje listov pa dokazano poveča koncentracijo C13-norizoprenoidov v vezani glikozidni obliki. Podobno kot pri terpenih lahko na njihovo ekstrakcijo iz grozdja vplivamo s trajanjem in temperaturo maceracije, saj se nahajajo predvsem v jagodni kožici. 6 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 V kislem mediju, kot je vino, so norizoprenoidi podvrženi različnim modifikacijam. Tako se nekateri nearomatični oksidirani C13-norizoprenoidi v seriji reakcij spremenijo v aromatične C13-norizoprenoide, kot je npr. ß-damascenon. Za druge se predpostavlja, da nastajajo podobno kot prosti terpeni iz glikozidnih oblik, kot npr. norizoprenoid TDN (Bavčar, 2009). 3. Metoksipirazini Metoksipirazini so heterociklične spojine z dušikom (slika 3), ki nastanejo kot posledica presnove aminokislin vinske trte. Povezujemo jih z zelenimi, rastlinskimi aromami. V senzorično zaznavnih koncentracijah so prisotni predvsem v vinih sorte sauvignon, kjer imajo vlogo pozitivne aromatične spojine. Njihova zaznava v rdečih vinih (cabernet sauvignon, cabernet franc in merlot) je običajno posledica pridelave vina iz nezrelega grozdja in je pogosto neželena (Bavčar, 2009). Za aromatiko vina sta najpomembnejša metoksipirazina:  3-isobutil-2-metoksipirazin (IBMP), ki se povezuje z zelenimi, zeliščnimi ali rastlinskimi aromami in  3-izopropil-2-metoksipirazin (IPMP), ki se povezuje z bolj zemeljskimi in zelenjavnimi aromami. Metoksipirazini so spojine z izredno močno aromo in imajo izjemno nizek prag zaznave (515 ng/L). V raziskavi so z dodajanjem IBMP in IPMP v vino sorte sauvignon ugotovili, da v koncentracijah nad 8 ng/L pomembno prispevata k rastlinski (vegetativni) aromi vina. V koncentracijah metoksipirazinov, ki so naravno prisotne v vinu, se vina z manjšimi (<12 ng/L) in večjimi (>26 ng/L) koncentracijami metoksipirazinov značilno razlikujejo po sortni vegetativni in pirazinski aromi (Allen in sod., 1991). Slika 3: Strukturni formuli 3-isobutil-2-metoksipirazina (IBMP) in 3-izopropil-2-metoksipirazina (IPMP) (Candelon in sod., 2010) Vsebnost metoksipirazinov v grozdju je v veliki meri odvisna od sorte in zrelosti grozdja (časa trgatve), klimatskih razmer in vinifikacijskih postopkov (Belancic in Agosin, 2007; Candelon in sod., 2010). V grozdnih jagodah se prične kopičenje metoksipirazinov ob tvorbi jagod, največja količina pa se jih akumulira v času med 30. in 50. dnevom zorenja. Akumulacija se ustavi po približno 50 dneh zorenja jagod oz. z začetkom zmanjševanja koncentracije jabolčne kisline. Koncentracija metoksipirazinov v grozdni jagodi se začne zmanjševati 1-2 tedna pred polno zrelostjo grozdja kot posledica povečanja grozdnih jagod in s tem razredčenja njihove koncentracije (Scheiner in sod., 2009). Med dozorevanjem grozdja se koncentracija 7 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 metoksipirazinov torej zmanjšuje. Če jih želimo ohraniti, je tehnološka zrelost grozdja sorte sauvignon pred polno zrelostjo (Bavčar, 2009). Koncentracija metoksipirazinov se poveča predvsem prvi dan po pecljanju in stiskanju grozdja, kar je posledica večjega kontakta jagodnih kožic, pečk in pecljevine z grozdnim sokom, pri čemer metoksipirazini preidejo v mošt. Trajanje maceracije torej pomembno vpliva na koncentracijo metoksipirazinov v moštu (Sala in sod., 2005). Koncentracija metoksipirazinov se zmanjšuje počasneje, če je temperatura med dozorevanjem grozdja nižja. Tako se v hladnejših pridelovalnih območjih ohrani več metoksipirazinov. Prav tako je koncentracija metoksipirazinov večja v moštih iz grozdja, pridelanega v namakanih vinogradih in z večjo gostoto trt na površino. Vina iz teh moštov so imela značilno vegetativno aromo (Sala in sod., 2005; Bavčar, 2009)). Neposredna osvetlitev grozdja pospešuje razpad metoksipirazinov zaradi njihove občutljivosti na svetlobo (fotodegradacija). Z odstranjevanjem listov torej pospešimo razpad metoksipirazinov, hkrati pa odstranjujemo zrele liste, ki vsebujejo do desetkrat več metoksipirazinov kot grozdje samo. Iz listov metoksipirazini prehajajo tudi v grozdne jagode. Končna koncentracija metoksipirazinov v grozdju je torej odvisna od sinteze v listih, prenosa v grozdje in razpada pod vplivom svetlobe (Bavčar, 2009). 4. Hlapni tioli Hlapni tioli prispevajo k tropskemu karakterju vina. Najpomembnejši hlapni tioli v vinu so:  4-merkapto-4-metilpentan-2-on (4MMP), ki prispeva k aromi po pušpanu in pasijonki,  3-merkaptoheksan-1-ol (3MH) in aroma po pasijonki, grenivki, kosmuljah in guavi  3-merkaptoheksil acetat (3MHA). Ti hlapni tioli imajo izredno močen vonj, s pragovi zaznave 3 ng/L (4MMP), 60 ng/L (3MH) in 4 ng/L (3MHA). V vinih sorte sauvignon pomembno vplivajo na sortno aromo, pomembni pa so tudi za aromatiko sort renski rizling, scheurebe, traminec, sivi pinot, v vinih posebne kakovosti in rose vinih sort merlot in cabernet sauvignon. V prevelikih koncentracijah pa hlapni tioli prispevajo k močni, sladkasti aromi, ki spominja na mačji urin (Dubourdieu in sod., 2000; Bavčar, 2009). Hlapni tioli so v grozdnem soku skoraj neobstojni in nastanejo šele med AF, ko jih kvasovke sprostijo iz njihovih nehlapnih, nearomatičnih prekurzorjev, kot sta S-4-(4-metilpentan-2-on)L-cistein (Cis-4MMP) in S-3-(heksan-1-ol)-L-cistein (Cis-3MH), z odcepitvijo cisteina s pomočjo liaz. 3MHA pa nastane iz 3MH z delovanjem kvasnih encimov alkoholacetiltransferaz (Darriet in sod., 1995). Vinske kvasovke imajo omejeno sposobnost sproščanja tiolov. V raziskavah so namreč ugotovili, da se je le manjši delež (1,6 %) dodanega Cis-3MH pretvoril v 3MH med AF (Dubourdieu in sod., 2000). Te podatke potrjuje tudi raziskava, v kateri so ugotovili, da se je pri vinih sorte cabernet sauvignon in merlot sprostilo le okrog 3,2 % 3MH iz vse razpoložljive količine Cis-3MH v moštu. Pri tej raziskavi so ugotovili tudi, da je skupna količina sproščenega 3MH odvisna od količine prisotnih prekurzorjev – večja kot je koncentracija prekurzorjev v grozdju, večja je koncentracija tiolov v vinu (Murat in sod., 2001a). 8 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Številne raziskave so pokazale, da je količina sproščenega 4MMP v vinu odvisna od seva vinskih kvasovk, ki jih uporabimo za AF (Dubourdieu in sod., 2000; Howell in sod., 2004, 2005). Tako sprosti sev kvasovk VL3 več hlapnih tiolov kot seva kvasovk VL1 in 522d. Prav tako sevi kvasovk vrste S. bayanus sprostijo več 4MMP kot sev kvasovk VL3 (Murat in sod., 2001b). V raziskavi v AWRI so testirali sedem komercialnih sevov kvasovk na njihovo sposobnost sproščanja hlapnih tiolov med AF vina sorte sauvignon. Testirani sevi so bili VIN7, VIN13, NT116, VL3, X5, QA23 in L2056. Pri AF manjših volumnov (20 L) se je izkazalo, da največ 4MMP sprosti sev VIN7, kateremu sledita seva VIN13 in VL3. Največ 3MH je sprostil sev kvasovk VIN13, ki mu sledita VIN7 in X5. Rezultati so prikazani na sliki 4. Pri AF večjih volumnov (5000 L) so v vinu, pridelanem s sevom kvasovk VIN7, prav tako določili največjo koncentracijo 4MMP, sledila pa sta mu seva X5 in VIN13. Največ 3MH je v velikih fermentorjih sprostil sev kvasovk VIN7, sledili pa so mu sevi X5, VL3 in VIN13. Čeprav je prišlo do razlik med sposobnostjo sproščanja hlapnih tiolov v majhnih fermentorjih v primerjavi z velikimi, se je pokazal značilen trend, ki razdeli seve kvasovk na skupino, ki sprosti veliko tiolov in skupino, ki jih sprosti malo, ne glede na volumen AF (Swiegers in sod., 2009). sev kvasovk sev kvasovk sev kvasovk Slika 4: Koncentracija hlapnih tiolov (4MMP, 3MH in 3MHA) v vinih sorte sauvignon, pridelanih z različnimi komercialnimi sevi kvasovk v 20 L mošta. Rezultati so povprečja treh paralelk (Swiegers in sod., 2009) Isti raziskovalci so preverili koliko 3MH lahko različni komercialni sevi kvasovk pretvorijo v 3MHA v modelnih AF. V nekaterih primerih ta sposobnost ni korelirala s sposobnostjo sproščanja hlapnih tiolov. V enem primeru je komercialni sev kvasovk izkazal visoko sposobnost pretvorbe 3MH v 3MHA, vendar pa isti sev ni imel sposobnosti sproščanja značilnih količin tiolov. Koncentracija 3MHA določena po AF manjših volumnov vina sorte sauvignon je bila zelo različna glede na uporabljen sev kvasovk. Največje koncentracije 3MHA v vinu so dobili s sevom kvasovk VIN7, ki mu sledita QA23 in NT116. Pri določanju razmerja 3MHA:3MH so ugotovili, da ima največjo sposobnost pretvorbe sev kvasovk QA23, ki mu sledita NT116 in VL3, kot prikazuje slika 5 (Swiegers in sod., 2006). 9 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 sev kvasovk Slika 5: Sposobnost pretvorbe 3MH v 3MHA v vinih sorte sauvignon z delovanjem različnih komercialnih sevih kvasovk (Swiegers in sod., 2006) Vendar pa velika koncentracija 3MHA v vinu ne pomeni nujno, da ima sev kvasovk visoko sposobnost pretvorbe 3MH v 3MHA, saj se mora 3MH najprej sprostiti, da se lahko nato pretvori v 3MHA. Sev kvasovk VIN7 sprosti veliko 3MH in je tako na voljo veliko tega tiola, ki se lahko pretvori v 3MHA. Čeprav VIN7 ni nujno najboljši pretvornik 3MH v 3MHA, imajo vina, pridelana z VIN7, velike koncentracije 3MHA preprosto zato, ker sprostijo veliko 3MH, iz katerega nastane 3MHA. Raziskava je pokazala, da imata dva seva kvasovk z najmanjšo sposobnostjo sproščanja tiolov, največjo sposobnost pretvorbe 3MH v 3MHA. Zato gredo raziskave v smer, da bi še povečali koncentracijo 3MHA z uporabo kombinacije sevov kvasovk z visoko sposobnostjo sproščanja tiolov in pretvorbe 3MH v 3MHA. Na ta način bi povečali aromatiko vina, saj ima 3MHA nižji prag zaznave kot 3MH (ima močnejši vonj). Ena od rešitev bi bila lahko ko-inokulacija sevov kvasovk z veliko sposobnostjo pretvorbe 3MH v 3MHA, kot so QA23 ali NT116, s sevi kvasovk z veliko sposobnostjo sproščanja 3MH, kot so VIN7, VIN13, VL3 ali X5 (Swiegers in sod., 2006). V raziskavi so ugotovili, da s sevom kvasovk VIN7 pridelamo vina z najbolj intenzivno aromo po pasijonki, pušpanu in znoju. Aroma po pušpanu spominja na mačji urin, ki je pogosto povezan z veliko koncentracijo tiolov v vinu sorte sauvignon. Aroma po pušpanu v vinih, pridelanih s sevom VIN7, je posledica velike koncentracije 4MMP v teh vinih, medtem ko je aroma po pasijonki verjetno posledica visokih koncentracij vseh treh hlapnih tiolov. Vina, pridelana s sevom X5 so imela intenzivno aromo po pasijonki in nekoliko po zeleni papriki. Tudi vina, pridelana s sevom QA23, so imela tipično aromo po zeleni papriki. Glede na celokupno aromo so bila degustatorjem najbolj všeč vina, pridelana s sevom VIN7 (Swiegers in sod., 2006). Koncentracijo hlapnih tiolov v vinu lahko povečamo tudi z maceracijo grozdja, s katero pridobimo več tiolskih prekurzorjev v moštu ter ustrezno zaščito pred kisikom med celotno pridelavo vina, s čimer zaustavimo počasno oksidacijo tiolov, ki povzroča izgubo tipičnega vonja vina sauvignon med zorenjem in staranjem vina (Bavčar, 2009). 5. C6 aldehidi Večina aldehidov, ki izhaja iz grozdja, se v vinu ne ohrani, saj se med AF reducirajo v alkohole. Ohranijo se le C6 aldehidi, heksanali in heksenali, ki dajejo vinu vonj po zelenem in po travi. Njihova prisotnost v vinu je lahko posledica pridelave iz nezrelega grozdja ali prisotnosti zelenih delov trte med stiskanjem, saj pri stiskanju listov in celih grozdov v mošt preideta linolenska in linolna kislina, ki se pod vplivom oksidacijskih encimov pretvarjata v C6 alkohole in aldehide (Bavčar, 2009). 10 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 FERMENTACIJSKE AROME Fermentacijske arome predstavljajo aromatične spojine, ki nastanejo med alkoholno fermentacijo in so pomemben del vinske arome. Poleg etanola, glicerola, diolov in višjih alkoholov, se pod vplivom kvasovk tvorijo še druge spojine, predvsem kisline, estri, aldehidi, ketoni in žveplove spojine (Košmerl, 2007). Na aromo, ki nastaja med AF, vpliva več dejavnikov. Ob vrsti kvasovk, ki so ključnega pomena za nastanek spojin med AF, so pomembni tudi fermentacijski pogoji: - temperatura, - koncentracija kisika oz. vrednost rH, - koncentracija ogljikovega dioksida in - sestava mošta (pH, koncentracija kvasovkam dostopnega dušika in sestava aminokislin). Selekcija kvasovk se razvija v smeri nastanka čim manjših koncentracij hlapnih kislin, predvsem ocetne kisline, aldehidov in vodikovega sulfida, torej za kakovost vina čim manj negativnih spojin ter hlapnih kislinskih estrov, ki zmanjšujejo kakovost vina. Raziskave so pokazale, da kvasovke vrste S. cerevisiae na splošno dajejo boljšo kakovost vina kot kvasovke vrst S. uvarum, S. bayanus in S. chevalieri (Košmerl, 2007). Pomemben vpliv na fermentacijsko aromo ima tudi aminokislinska sestava mošta. Aminokisline imajo pomemben delež pri direktni asimilaciji dušika, so pa tudi prekurzorji pri sintezi nekaterih hlapnih spojin, predvsem višjih alkoholov pri AF. Aminokisline predstavljajo 60-90 % vsega dušika v grozdnem soku. Najbolj zastopane aminokisline v grozdnem soku so: prolin, arginin, glutamin, alanin, glutaminska kislina, treonin, serin in α-amino butanojska kislina. Te predstavljajo 80-90 % vseh aminokislin v grozdju. Raznolikost sestave aminokislin v grozdnem soku je odvisna od sorte, letnika, količine pridelka, prehrane vinske trte, sestave in obdelave tal, dozorelosti in zdravstvenega stanja grozdja ter mikroklimatskih razmer (Košmerl, 2007). 1. Višji alkoholi Višji alkoholi (VA) kvantitativno predstavljajo približno 50 % vseh aromatičnih snovi v vinu, če ne upoštevamo etanola. Delimo jih na alifatske in aromatske alkohole. Med alifatske alkohole prištevamo propanol s težkim ostrim vonjem, izoamilalkohol z ostrim vonjem po odstranjevalcu laka za nohte, izobutanol s hlapnim alkoholnim vonjem in aktivni amil alkohol. Aromatska alkohola pa sta 2-feniletanol s cvetlično aromo po vrtnicah in tirozol. Pri koncentracijah pod 300 mg/L dajejo VA vinu želeno kompleksnost in izboljšajo senzorično kakovost vina, v še večjih koncentracijah pa so lahko sporni ali pa je njihova prisotnost moteča. V starejši literaturi je naveden tudi nivo sprejemljivosti VA v vinu, ki je 400 mg/L (Rapp in Mandery, 1986; Swiegers in sod., 2005). Višji alkoholi so sekundarni metaboliti kvasovk in se delno sintetizirajo po Erlichovi poti, ki vključuje razgradnjo ustreznih (prekurzorskih) aminokislin in delno iz sladkorjev (Swiegers in sod., 2005). 11 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Slika 6: Splošni prikaz tvorbe višjih alkoholov iz prekurzorskih aminokislin in α-keto kislin (Fugelsang, 1997) Največ VA nastane med AF, saj njihova sinteza poteka vzporedno s sintezo alkohola. Višji alkoholi lahko nastanejo iz ustreznih aminokislin (10 %), iz drugih aminokislin (65 %) in iz sladkorja (25 %). Tisti, ki nastanejo iz ustreznih aminokislin (preglednica 3), se v encimskih reakcijah transaminirajo, dekarboksilirajo in reducirajo. Kvasovke lahko tudi povečajo tvorbo VA zaradi stresa ob pomanjkanju sladkorjev na koncu AF. Med AF se v vinu tvorijo predvsem izoamil alkohol, aktivni amil alkohol, izobutanol in n-propanol. Izoamil alkohol predstavlja več kot 50 % vseh višjih alkoholov. Zaradi razlik v tehnoloških postopkih imajo bela vina običajno manjšo skupno koncentracijo VA kot rdeča vina (Bavčar, 2009). Preglednica 3: Višji alkoholi, njihove prekurzorske aminokisline in koncentracije (Bavčar, 2009) Višji alkohol izoamil alkohol aktivni amil alkohol izobutanol 2-feniletanol tirozol Aminokislina levcin izolevcin valin fenilalanin tirozin Koncentracija (mg/L) 80-300 30-100 50-150 10-100 20-50 Različni sevi kvasovk v veliki meri vplivajo na profil in koncentracijo VA v vinu. V zadnjem času je iz različnih enoloških vidikov zanimiva AF z mešano kulturo kvasovk Saccharomyces in ne- Saccharomyces. V številnih raziskavah so izvedli fermentacije z mešanimi kulturami kvasovk ne-Saccharomyces, kot sta vrsti Pichia fermentans in Hanseniaspora guilliermondii, s kvasovkami vrste S. cerevisiae. V pridelanem vinu so določili bistveno večje koncentracije VA, kot so 1-propanol, n-butanol in 1-heksanol, kot v fermentacijah s kulturo kvasovk vrste S. cerevisiae samo (Clemente-Jimenez in sod., 2005; Moreira in sod., 2011). 12 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta 13 in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Proučen je bil tudi vpliv kvasovk s povečano transaminazno aktivnostjo na tvorbo VA v vinu in destilatih. Transaminazno aktivnost so s povečanjem ekspresije BAT1 in BAT2 genov inducirali v komercialnem sevu kvasovk. Ugotovili so, da so vina, pridelana s tem sevom kvasovk, vsebovala večje koncentracije izoamilalkohola in v manjši meri tudi izoamil acetata, z vonjem po bananah in hruškah. Prav tako so vsebovala večje koncentracije izobutanola ter izobutirične in propionske kisline. Vina, pridelana s tem sevom kvasovk, so bila opisana kot bolj sadna z aromo po breskvah in marelicah (Lilly, 2004). 2. Estri Estri so aromatične spojine, ki se v vinu posamično pojavljajo le v sledovih, skupno pa le redko presežejo koncentracijo 100 mg/L. V vinu je več kot 160 estrov, a je večina v premajhnih koncentracijah za zaznavo. So primarni nosilci sadnih arom. Odločilno vplivajo na aromatični profil vina , saj pogosto sinergistično delujejo z različnimi estri in tako vplivajo na posamezne arome, ki so veliko pod mejo zaznave. Večina estrov je prisotna v koncentracijah okrog njihovega praga zaznave, zato lahko že manjša sprememba v njihovi koncentraciji znatno vpliva na aromo vina (Gurbuz in sod., 2006). Preglednica 4: Glavni estri v vinu: njihov senzoričen opis, povprečne koncentracije v vinu in prag senzorične zaznave (Sumby in sod., 2010) Spojina Etilni estri etil izobutirat etil-2-metilbutanoat etil izovalerat etil laktat etil-3-hidroksibutanoat etil-4-hidroksibutanoat dietil sukcinat dietil malat etil butanoat etil heksanoat etil oktanoat etil dekanoat etil dihidroksicinamat etil cinamat etil vanilat Acetatni estri etil acetat izobutil acetat izoamil acetat etil-2-fenilacetat 2-feniletil acetat heksil acetat * - ni podatka Povprečna koncentracija v vinu (mg/L) Prag zaznave (mg/L) sadje, jagode, limone po sladkem, jabolka, jagode, janež sladko sadje, ananas, limona, janež po milu, mleku, maslu, saden po sadnem, zelenem, po gobah karamela saden, fermentacijski, cvetličen po sladkem, rjavi sladkor po sladkem, cvetličen, saden, jagode saden, jagode, zeleno jabolko po sladkem, saden, zrelo sadje saden, cvetličen, oljnat cvetličen med, cimet cvetličen, saden, po sladkem, vanilija 0,01-0,48 sledovi-0,03 sledovi-0,07 3,05-297,5 0,05-0,58 6,61 1,21-61,11 0,81 0,07-0,53 0,15-1,64 0,14-2,61 0,01-0,70 sledovi-0,003 sledovi-0,01 0,46 0,015 0,018 0,003 150 20 NP* NP* NP* 0,02 0,85 0,58 0,51 0,002 0,048 NP* saden, hlapen, balzamičen saden, jabolka saden, banane cvetličen, vrtnica cvetličen, vrtnica po zelenem, po travi 5,0-63,5 sledovi-0,17 0,03-5,52 0,03-0,39 sledovi-0,26 sledovi-3,90 12,27 NP* 0,16 NP* 1,80 2,4 Senzorični opis Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Estri nastajajo z reakcijami med karboksilno skupino organskih kislin in hidroksilno skupino alkoholov (alifatski estri) ali fenolov (fenolni estri). Pomembnejši so alifatski, saj je fenolnih estrov manj in so večinoma manj hlapni. Med alifatskimi so najpomembnejši estri, ki nastanejo z reakcijo med etanolom in nasičenimi maščobnimi kislinami, kot so etil heksanoat, etil oktanoat in etil dekanoat. Prav tako so pomembni tisti, ki so posledica reakcije med ocetno kislino in etanolom ali VA. To so predvsem etil acetat, izoamil acetat, izobutil acetat, 2-feniletil acetat in heksil acetat. Slednje najpogosteje povezujemo s sadno cvetlično aromo belih mladih vin, kot je na primer izoamil acetat z vonjem po bananah, in jih zato večkrat imenujemo kar sadni estri. Estri z nasičenimi maščobnimi verigami (daljšimi verigami), kot sta etil heksanoat in etil oktanoat, dajejo vinu bolj milnat vonj, estri z najdaljšo verigo pa dišijo po masti oz. slanini (Bavčar, 2009). Preglednica 4 prikazuje glavne estre v vinu. Povprečna tvorba estrov in relativni delež posameznih estrov je v veliki meri odvisen od seva kvasovk. Razlike med sevi so posledica razlik v ekspresiji njihovih genov povezanih s tvorbo estrov (Vilanova in sod., 2007). Kvasovke vrste S. cerevisiae tvorijo različne koncentracije estrov, kot so izoamil acetat, heksil acetat, etil heksanoat in etil oktanoat, ki lahko vplivajo na aromo vina. Tudi številne ne-Saccharomyces kvasovke lahko vplivajo na koncentracijo estrov v vinu. V številnih raziskavah so pri alkoholni fermentaciji z mešano kulturo ne-Saccharomyces in Saccharomyces kvasovk dobili večje koncentracije acetatnih estrov, kot v AF samo s kvasovkami Saccharomyces (Rojas in sod., 2003). Slika 7 prikazuje rezultate raziskav, v katerih so preverjali sposobnost komercialnih sevov kvasovk za tvorbo etilnih estrov in acetatov. Bistvene razlike med kvasovkami so se pokazale v koncentracijah posameznih estrov, kot tudi v koncentracijah skupnih etilnih estrov in acetatov, kar je razvidno iz slike 7. Slika 7: Koncentracija acetatov in etilnih estrov v vinu, pridelanem z različnimi komercialnimi sevi kvasovk (Torrens in sod., 2008) Ko so v raziskavi preverjali vinske kvasovke tako Saccharomyces kot ne-Saccharomyces vrst o njihovi sposobnosti tvorbe acetatnih estrov so ugotovili, da je aktivnost tvorbe acetatnih estrov kvasovk rodov Hanseniaspora (H. guilliermondii in H. uvarum) in Pichia (P. anomala) odvisen od sestave mošta in da lahko tvorijo etil acetata, geranil acetata, izoamil acetata in 2-feniletil acetata. Pri ugotavljanju vpliva zračenja na tvorbo acetatnih estrov so kvasovke kultivirali na sintetičnem mikrobiološkem mediju. Kvasovke vrste S. cerevisiae so 14 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 tvorile manjše koncentracije acetatnih estrov pri močni aeraciji, medtem ko so pri istih razmereh kvasovke vrst H. guilliermondii in P. anomala tvorile večje koncentracije 2-feniletil acetata in izoamil acetata (Rojas in sod., 2001). V kasnejših raziskavah so zato izvedli kombinirane AF s sevoma, ki sta se izkazala za dobra tvorca acetatnih estrov, H. guilliermondii in P. anomala, skupaj s sevom S. cerevisiae. Vina, pridelana z mešano kulturo teh treh sevov kvasovk, so imela povprečne koncentracije acetaldehida, ocetne kisline, glicerola in skupnih višjih alkoholov, koncentracije acetatnih estrov pa so bile večje. Največ se je tvorilo etil acetata, izoamil acetata in 2-feniletil acetata. Kvasovke vrste H. guilliermondii so tvorile največ 2-feniletil acetata, tako v AF čisto kot v AF z mešano kulturo. Vrsta S. cerevisiae je tvorila največ etilnih estrov, na koncentracijo katerih mešana kultura ni vplivala (Rojas in sod., 2003). V podobni raziskavi, v kateri so ugotavljali vpliv kvasovk na koncentracijo etil acetata in izoamil acetata, so ugotovili, da vrsta Klockera apiculata tvori največje koncentracije acetatnih estrov. Vrste Hansenula subpelliculosa, Kluyveromyces marxianus, Torulaspora delbrueckii in S. cerevisiae so tvorile povprečne koncentracije acetatnih estrov, Pichia membranaefaciens in Candida guilliermondii pa sta tvorili izredno majhne koncentracije merjenih acetatnih estrov (Plata in sod., 2003). 3. Hlapne kisline Hlapne kisline v vinu predstavlja skupina hlapnih organskih kislin, ki se v vinu običajno nahajajo v koncentracijah 500-1000 mg/L in jih v več kot 90 % zastopa ocetna kislina. Ostale hlapne kisline, kot sta propionska in heksanojska, nastanejo z delovanjem metabolizma maščobnih kislin pri kvasovkah in bakterijah. Ocetna kislina je pomembna aromatična spojina vina, vendar v povečanih koncentracijah daje vinu vonj po kisu in postane moteča pri koncentracijah 0,8 g/L in več, odvisno od stila vina. Kvasovke tvorijo večje koncentracije ocetne kisline v vinih posebne kakovosti, kot sta suhi jagodni izbor in ledeno vino. Optimalna koncentracija ocetne kisline v vinu je 0,2-0,7 g/L (Erasmus in sod., 2004). Različni sevi kvasovk vrste S. cerevisiae tvorijo med AF zelo različne koncentracije ocetne kisline. Kvasovke, uporabljene v pridelavi belih suhih vin, tvorijo manjše koncentracije ocetne kisline, v pridelavi sladkih vin pa večje, celo do 2 g/L. Sevi kvasovk vrst S. bayanus in S. uvarum značilno tvorijo manj ocetne kisline kot sevi S. cerevisiae (Erasmus in sod., 2004). Za zmanjšanje koncentracije ocetne kisline v vinu so Comitini in sod. (2011) predlagali uporabo mešanih kultur Saccharomyces in ne-Saccharomyces kvasovk za izvedbo AF. V raziskavi so namreč pokazali, da mešana kultura ne-Saccharomyces rodu kvasovk (Lachancea thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii) s Saccharomyces (EC1118) kvasovkami tvori manjše koncentracije ocetne kisline v vinu kot čista kultura kvasovk iz rodu Saccharomyces. Čeprav lahko kvasovke rodu Saccharomyces tvorijo ocetno kislino, je njena povečana koncentracija v vinu večinoma posledica delovanja ocetnokislinskih bakterij. 15 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 4. Acetaldehid Acetaldehid daje vinu aromo po naribanih jabolkih in oreščkih ter je v večjih koncentracijah znak oksidacije vina. V vinu je normalno prisoten v koncentracijah 10-75 mg/L in je senzorično zaznaven pri koncentraciji 100 mg/L. Dokler ne preseže koncentracije 100 mg/L pozitivno prispeva predvsem h kompleksnosti rdečega vina (Mateos in sod., 2006). Izmerjene koncentracije acetaldehida v nekaterih vinih in drugih alkoholnih pijačah so podane v preglednici 5. Preglednica 5: Koncentracija acetaldehida v nekaterih alkoholnih pijačah (Liu in sod., 2000) Pijača Rdeča vina Bela vina Sladka vina Sherry Brandy Konjak Koncentracija acetaldehida (mg/L) 4-212 11-493 188-248 90-500 63-308 105 Med AF se acetaldehid hitro akumulira v fazi, ko je sproščanje CO2 največje, nato pa se njegova koncentracija drastično zmanjša proti koncu AF. Je eden od glavnih metabolnih intermediatov kvasovk, zato je njegova koncentracija odvisna od uporabljenega seva kvasovk (6-190 mg/L). Piruvat, ki je končni produkt glikolize, se pretvori v acetaldehid s pomočjo encimov piruvat dekarboksilaz. Acetaldehid se nato pretvori v etanol s pomočjo encimov alkohol dehidrogenaz. Kasneje se njegova koncentracija sčasoma spet poveča kot posledica kemijske oksidacije etanola ali delovanja oksidativnih kvasovk in bakterij (Mateos in sod., 2006). V raziskavi so s spremljanjem glavnih hlapnih spojin (acetaldehid, etil acetat in nekateri višji alkoholi) med AF mošta različnih sort grozdja z inokulacijo izbranih sevov kvasovk vrste S. cerevisiae ugotovili, da je tvorba omenjenih hlapnih komponent v največji meri odvisna od sestave mošta in razmer med fermentacijo. Količina določenih hlapnih spojin pa je bila odvisna tudi od seva kvasovk, uporabljenega za AF. Rezultati so pokazali obratno razmerje med tvorbo acetaldehida in izobutanola ter med tvorbo etil acetata in skupnih višjih alkoholov. Prav tako so določili direktno povezavo med senzorično kakovostjo vina in koncentracijo etil acetata. Najbolje ocenjena vina so bila pridelana s sevi kvasovk, ki niso tvorili velikih koncentracij katerekoli od preiskovanih spojin, najslabše pa so bila ocenjena tista, ki so bila pridelana s sevi, ki so tvorili velike koncentracije acetaldehida in višjih alkoholov (Mateos in sod., 2006). 5. Diacetil Diacetil je ena od pomembnejših karbonilnih komponent v vinu in mu daje vonj po maslu. V majhnih koncentracijah daje vonj po oreščkih in toastu, v koncentracijah 1-4 mg/L pa postane senzorično zelo neželen. Kvasovke biosintetizirajo le manjše količine diacetila (0,2-0,3 mg/L) v vinu, za večje koncentracije so odgovorne mlečnokislinske bakterije s svojo presnovno aktivnostjo (Bartowsky in Henschke, 2004). 16 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 6. Hlapni fenoli Hlapni fenoli, ki nastanejo med AF s pretvorbo prekurzorskih hidroksicimetnih kislin v grozdnem moštu, imajo relativno nizek prag zaznave. Čeprav lahko hlapni fenoli pozitivno vplivajo na aromo nekaterih vin, so bolj poznani po negativnih aromah po obližu, skednju in hlevu. Pomembna etilfenola sta 4-etilfenol, s senzoričnim pragom zaznave 230 μg/L, in 4-etilgvajakol, s senzoričnim pragom zaznave 47 μg/L. Vinilfenoli, predvsem 4-vinilfenol in 4-vinilgvajakol, dajejo predvsem belim vinom vonj po medicinskem in zdravilih. V rdečih vinih je več etilfenolov, v belih pa več vinilfenolov (Bavčar, 2009; Oelofse in sod., 2009). V grozdnem moštu je prisotna le manjša količina hlapnih fenolov, večji del jih sintetizirajo kvasovke med AF. Neflavonoidni prosti hidroksicimetni kislini, kot so p-kumarna in ferulna kislina, kvasovke dekarboksilirajo s pomočjo dveh encimov (slika 8). Najprej hidroksicimetna dekarboksilaza pretvori omenjene hidroksicimetne kisline v hidroksistirene (vinilfenole), ki se nato reducirajo do etil derivatov s pomočjo encima vinilfenol reduktaze. Encim, ki omogoča dekarboksilacijo, je prisoten v številnih bakterijah, plesnih in kvasovkah, sledečo redukcijo pa lahko izvedejo le vrste Dekkera bruxellensis, Dekkera anomala, Pichia guillermondii, Candida versatilis, Candida halophila in Candida mannitofaciens (Oelofse in sod., 2009). Slika 8: Tvorba etilfenolov iz prekurzorskih hidroksicimetnih kislin (Suárez in sod., 2007) Znano je, da kvasovke rodu Dekkera/Brettanomyces tvorijo večje koncentracije hlapnih fenolov v vinu in zato veljajo za kvarljivke, ki dajejo vinu vonj po obližu, po medicinskem, zdravilih, po skednju, konjih, znoju, usnju, po mišjem urinu, mokrem psu,... Pojavljajo se predvsem v rdečih vinih, zorenih v lesenih sodih, saj se te kvasovke v ne dobro opranih sodih hitro razmnožijo in nato v vinu tvorijo hlapne fenole. Različni sevi kvasovk rodu Brettanomyces tvorijo različne koncentracije hlapnih fenolov v vinu, s tem da so v rdečih vinih bolj zaznavni, kot v belih (Suárez in sod., 2007; Oelofse in sod., 2009). 17 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 7. Žveplove spojine Žveplo vsebujoče spojine se v vinu običajno nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, imajo zelo nizek prag zaznave in imajo lahko negativen ali pozitiven vpliv na senzorično kakovost vina. Glede na kemijsko strukturo jih delimo na sulfide, polisulfide, heterociklične spojine, tioestre in tiole. Te spojine zelo različno vplivajo na senzorično kakovost vina - številne žveplove spojine, kot so vodikov sulfid in merkaptani, so povezane z negativnimi opisi, kot so vonj po zelju, gnilih jajcih, žveplu, česnu, čebuli in gumi, nekatere, kot so hlapni tioli, pa prispevajo k pozitivnim aromam vina z aromami po tropskem sadju, pasijonki in grenivki (Vermeulen in sod., 2005). 7.1 Vodikov sulfid in merkaptani Najbolj znana žveplova spojina v vinu je vodikov sulfid, ki je izjemno hlapen, z vonjem po gnilih jajcih in zelo nizkim pragom zaznave (50-80 μg/L). Zaradi pogostega pojava in nizkega praga zaznave je eden od najbolj pogostih problemov vinskih kleti. Pri manjših koncentracijah (20-30 μg/L) lahko vodikov sulfid spominja na kvasovke in tako igra pomembno vlogo pri kompleksnosti vina. V kolikor pa ne ukrepamo, se nadaljujejo kemijske reakcije vodikovega sulfida z različnimi sestavinami vina (acetaldehidom, metioninom), pri čemer nastanejo merkaptani, ki imajo še bolj neželene lastnosti – etilmerkaptan z vonjem po gumi, kavčuku ali česnu je zaznaven pri koncentracijah okrog 1,1 μg/L, metilmerkaptan pa ima senzorični prag zaznave že pri koncentraciji 0,02 μg/L in daje vinu vonj po gnilih jajcih, kuhanem zelju ali ohrovtu (Spiropoulos in sod., 2000; Košmerl, 2007). Vodikov sulfid tvorijo kvasovke iz anorganskih žveplovih spojin, sulfatov in sulfitov, ter organskih žveplovih spojin, cisteina in glutationa. Različni sevi kvasovk tvorijo različne koncentracije žveplovega sulfida, kar je odvisno od njihove genske zasnove in metabolizma (Spiropoulos in sod., 2000). Koncentracija vodikovega sulfida v vinu je odvisna tudi od količine dostopnih žveplovih spojin, kemijske sestave mošta in vina, oksidacijsko-redukcijskega stanja mošta in vina, fizikalnih parametrov (vsebnost suspendiranih motnih delcev, temperatura AF), pogojev fermentacije in količine hranilnih spojin (Spiropoulos in sod., 2000; Košmerl, 2007). 7.2 Druge žveplo-vsebujoče organske spojine  Dimetildisulfid (DMDS): je spojina, katere vonj spominja na čebulo, kuhano zelje ali ohrovt. Domnevno nastaja z oksidacijo metil merkaptana. Običajno se v vinih nahaja v koncentracijah manj kot 2 μg/L, senzorični prag zaznave v vinu pa je 29 μg/L (Košmerl, 2007).  Dietildisulfid (DEDS): je spojina, katere vonj spominja na česen ali ožgano gumo. Nastaja z oksidacijo metilmerkaptana, senzorični prag zaznave v vinu pa je 4,3 μg/L (Košmerl, 2007).  Tioestri: so redkeje prisotni v vinih. Njihove senzorične lastnosti spominjajo na čebulo in sir, pogosto s karakteristiko po zažganem. 18 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 GLUTATION IN OHRANJANJE AROMATIČNIH SPOJIN Glutation ali γ-L-glutamil-L-cisteinilglicin je najbolj razširjena neproteinska tiolna spojina, ki je prisotna v živih organizmih, tako v prokariontih kot v evkariontih. Je antioksidant, ki je naravno prisoten v grozdju in kvasovkah (Rollini in Manzoni, 2006). Je tripeptid, ki ga sestavljajo tri aminokisline – glutaminska kislina, cistein in glicin. Pojavlja se v dveh oblikah – oksidirani (ena molekula GSH) in reducirani (dve molekuli GSH, ki sta med seboj povezani s svojima S-skupinama) (slika 9) . Reducirana oblika je aktivna oblika. Vsebnost reducirane oblike GSH se povečuje z zorenjem grozdja in doseže koncentracije 10-30 mg/L (Dubourdieu in sod., 2004). (b) (a) glutamat cistein glicin Slika 9: Strukturna formula GSH v reducirani (b) in oksidirani obliki (a) (http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Glutathione-skeletal.png) GSH je dober antioksidant ravno zato, ker v molekuli vsebuje tiolno skupino. Tioli so odgovorni za številne močne sadne arome, ki jih najdemo npr. v vinih sorte sauvignon. Te arome pa so bolj dovzetne za oksidacijo prav zaradi tega, ker so dobri antioksidanti, tako kot GSH. Ko le-te reagirajo kot antioksidanti, je njihov prispevek k aromi vina ničen ali spremenjen, zato se kakovost vina zmanjša (Bowyer in sod., 2010). Glutation deluje kot nukleofil in obnavlja številne kinone in hidrokinone, ki so oksidirane oblike fenolov. Končni rezultat je tipično antioksidativno delovanje, pri čemer se oksidirana oblika molekule reducira nazaj v originalno obliko fenola, GSH pa se pri tem veže na jedro fenola in tako tvori grozdni reakcijski produkt ali »grape reaction product« (GRP). Na ta način se »obnovi« aromatski potencial vina (Bowyer in sod., 2010). 19 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Slika 10: Shematski prikaz antioksidativnega delovanja GSH v prisotnosti oksidiranih fenolnih spojin (Bowyer in sod., 2010) Vsebnost GSH v vinu je vedno manjša kot v grozdnem soku, saj ga kvasovke med alkoholno fermentacijo porabljajo. Na začetku alkoholne fermentacije, ko se kvasne celice razmnožujejo, GSH skoraj popolnoma izgine iz mošta, nato pa se njegova koncentracija spet poveča na koncu fermentacije in v prvih nekaj mesecih zorenja na drožeh, saj se z avtolizo kvasovk sprosti nazaj v vino. To smo pokazali tudi v našem dosedanjem delu v okviru poskusov za doktorsko disertacijo, v katerem smo spremljali koncentracijo GSH med AF mošta sorte traminec z uporabo različnih komercialnih sevov kvasovk oz. njihovih kombinacij. GSH je kot večina tiolov občutljiv na oksidacijo, kar prav tako prispeva k manjši vsebnosti GSH v vinu v primerjavi z grozdnim sokom (Dubourdieu in sod., 2004; Dubourdieu in Lavigne-Cruege, 2004). Slika 11: Koncentracije GSH (mg/L) med alkoholno fermentacijo in nadaljnjim zorenjem na drožeh (Bowyer in sod., 2010) Načini povečanja koncentracije GSH v vinu:  Zagotavljanje reduktivnih razmer. Reduktivne razmere morajo biti zagotovljene tekom celotnega procesa pridelave vina, vključno s stekleničenjem in ne samo med alkoholno fermentacijo. Reduktivna pridelava vina pa lahko poveča potencialno možnost rožnatega obarvanja belih vin ali »pinking«.  Uporaba sevov kvasovk, s katerimi dobimo večje koncentracije GSH v vinu.  Dodatek nenaktivnih kvasovk, obogatenih z GSH, v grozdni sok pred alkoholno fermentacijo (O´Kennedy, 2010) 20 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 1. Oksidacija vina in GSH Oksidativni kvar tako belih kot rdečih vin je dobro znan problem v vinarstvu. V prvi stopnji oksidacije poteče transformacija aromatskih spojin, kar vodi v izgubo karakteristične arome vina in posledično v nastanek novih arom, ki so značilne za stara vina ali pa se pojavi neznačilen starikav ton. Zadnja stopnja oksidacije pa je oksidativno porjavenje (Papadopoulou in Roussis, 2008). Ker so aminokisline z SH-skupino dobri inhibitorji encimskega in neencimskega porjavenja, z ohranjanjem večjih koncentracij GSH v vinu preprečimo zmanjšanje hlapnih estrov in terpenov med skladiščenjem belih vin. Predvsem se ohranijo vsebnosti hlapnih spojin vina, kot so izoamil acetat, etil heksanoat, etil oktanoat, etil dekanoat in linalool (Papadopoulou in Roussis, 2008). Ko so v raziskavi ugotavljali vpliv kisika na koncentracijo GSH v moštu in vinu sort sauvignon in colombard so ugotovili, da se z alkoholno fermentacijo in dodatkom O2 (3,54 mg/L) v mošt zmanjša koncentracija GSH v reducirani obliki v vinu. Koncentracija GSH v reducirani obliki je bila znatno večja le v vinih, pridelanih iz reduktivnih grozdnih sokov (s koncentracijo raztopljenega O2 manj kot 0,3 mg/L), ki so imeli največje začetne koncentracije reduciranega GSH v grozdju. Z reduktivno pridelavo mošta lahko torej pridelamo vina z bistveno večjo vsebnostjo GSH, s čimer se izboljšajo seveda tudi senzorične lastnosti vina (Lisjak in sod., 2007). 2. Kvasovke in GSH GSH je v velikih koncentracijah (do 10 mM) prisoten v kvasnih celicah. Igra ključno vlogo v zaščiti kvasnih celic pred oksidacijo, prostimi radikali in alkilirajočimi agensi, zato v kvasovkah predstavlja glavni neencimski zaščitni sistem pred oksidacijo. GSH odstrani radikale kisika in vzdržuje redoks stanje v kvasnih celicah, saj ima izjemno nizek redoks potencial (E0'=-240 mV). Povezan je s temeljnimi celičnimi funkcijami, vzdrževanjem mitohondrijske strukture, integriteto membrane ter s celično diferenciacijo in razvojem (Pócsi in sod., 2004; Walker, 1998). Objav o vplivu različnih sevov komercialnih kvasovk na koncentracijo GSH v vinu ni veliko. Dokazali so, da so nekateri sevi kvasovk bolj sposobni ohraniti koncentracijo GSH v vinu kot drugi ter da ga nekateri sevi lahko tudi sintetizirajo in se pri avtolizi kvasovk sprosti v vino. (Du Toit, 2007). Tudi v našem dosedanjem delu smo v okviru poskusov za doktorsko disertacijo pokazali, da različni sevi komercialnih kvasovk pomembno vplivajo na koncentracijo GSH v vinih sorte sauvignon. Na univerzi v Stellenboschu v Južnoafriški republiki so v raziskavi ugotavljali vpliv različnih sevov kvasovk na vsebnost GSH v vinih sorte sauvignon, ki so jih pridelali v oksidativnih in reduktivnih razmerah. Vina, ki so bila pridelana v reduktivnih razmerah, so imela kot pričakovano veliko večjo vsebnost GSH v primerjavi z vini, pridelanimi v oksidativnih razmerah. Od preiskovanih devetih sevov kvasovk je bila največja koncentracija GSH v vinih, pridelanih s sevoma kvasovk Cross Evolution in VIN7. Med alkoholno fermentacijo v oksidativnih razmerah je sev kvasovk VIN7 tudi sintetiziral nekaj GSH (Du Toit, 2007). 21 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 3. Dodajanje GSH v mošt in vino GSH se bo kmalu lahko uporabljal v pridelavi vina kot naravni antioksidant, ki ohranja arome vina, ki so občutljive na oksidacijo, na ta način pa se bo upočasnil tudi proces staranja vina. Z dodatkom GSH v vino se ohrani svežina vina in se mu tako podaljša življenjska doba (Bowyer in sod., 2010). Trenutno dodatek GSH v mošt oz. v vino še ni dovoljen, saj je predlog dodatka GSH v koncentracijah do 20 mg/L v mošt oziroma vino šele v tretji etapi sprejetja s strani OIV. GSH lahko dodajamo med samo alkoholno fermentacijo v obliki komercialnih pripravkov hrane za kvasovke, kot je na primer BIOAROM®, ki je bogat z redoks-aktivnimi spojinami, kot so GSH, cistein in N-acetil cistein, ki izvirajo iz kvasovk. Dokler se med alkoholno fermentacijo ne pretvori 2/3 reducirajočih sladkorjev, kvasovke asimilirajo GSH, zato je uporaba takšnih dodatkov smiselna šele v zadnji tretjini alkoholne fermentacije (Bowyer in sod., 2010). Z dodatkom GSH v vino pred stekleničenjem se dlje časa ohrani sadnost vina, saj preprečuje oksidacijo aromatičnih estrov in terpenov, predvsem izoamil acetata, etil heksanoata, etil oktanoata, etil dekanoata, linaloola in α-terpineola. Zmanjša se neznačilen starikav ton in preprečeno je porjavenje vina, saj GSH preprečuje oksidacijo fenolnih spojin. S povečanjem vsebnosti GSH lahko torej izboljšamo potencial belih vin za zorenje. Raziskave so pokazale, da je ta učinek dosežen z dodatkom GSH 10-20 mg/L (Dubourdieu in sod., 2004). Dodatek GSH v vino je tudi dobra alternativa dodatku SO2, ki pri nekaterih ljudeh povzroča alergične ali preobčutljivostne reakcije, kot so glavobol, bolečine v trebuhu in vrtoglavica. Številne raziskave so potrdile, da je GSH primerljiv ali celo boljši reducent kot SO2 in učinkovito ščiti polifenole pred oksidacijo, predvsem katehin in kavno kislino, tako, da reagira s kinoni in jih reducira nazaj v polifenole ali pa se z njimi združi in tvori nove žveplove in GSH-derivate (Makhotkina in Kilmartin, 2009). GSH ima večji učinek kot SO2 tudi pri zaščiti fenolnih spojin med oksigenacijo mošta belih vinskih sort (Vaimakis in Roussis, 1996; El Hosry in sod., 2009). 4. Baker in GSH Dodatki bakrovih ionov v obliki bordojske brozge, ki jih uporabljajo kot sanacijske ukrepe v vinarstvu (v vinogradu za zaščito vinske trte, v vinarstvu pa kot Cu-sulfat ali Cu-citrat za odstranjevanje H2S), sposobni vezave in popolne inaktivacije GSH (Zoecklein, 2007). Baker namreč tvori s tiolnimi spojinami v vinu netopen kompleks, kar lahko vodi v popolno izgubo tipične arome vina (Dubourdieu in Darriet, 1993). 5. Dušik in GSH Koncentracija GSH v vinu je v veliki meri odvisna tudi od vsebnosti dušikovih spojin v moštu, ki ga kvasovke lahko izkoriščajo (FAN). Mošti z manjšimi vsebnostmi FAN imajo tudi manjše vsebnosti GSH, saj ga kvasovke porabijo kot vir dušika (Dubourdieu in LavigneCruege, 2004; Bowyer in sod., 2010). 22 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Slika 12 prikazuje primer povezave med koncentracijo FAN in koncentracijo GSH. Kadar je koncentracija FAN v grozdnem soku zadostna, je vsebnost GSH v grozdnem soku in pridelanem vinu približno enaka. Kadar je koncentracija FAN manjša kot 100 mg/L, pa ostane v vinu le manjša koncentracija GSH. Slika 12: Povezava med konc. FAN v grozdnem soku in konc. GSH v vinu (Bowyer in sod., 2010) Gnojenje trt z dušikom (N) poveča koncentracijo GSH v moštu. Najbolj se poveča koncentracija GSH s poznim gnojenjem trte z dušikom (ob začetku tvorbe grozdnih jagod), vendar se zmanjša koncentracija fenolov (Chone in sod., 2006). Vina, pridelana iz grozdja trt, gnojenih z N, vsebujejo večjo koncentracijo GSH in hlapnih tiolov v primerjavi z vini iz grozdja negnojenih trt (Lacroux in sod., 2008). 23 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 LITERATURA Allen M.S., Lacey M.J., Harris R.L.N., Brown W.V. 1991. Contribution of methoxypyrazines to sauvignon blanc wine aroma. American Journal of Enology and Viticulture, 42, 2: 109-112 Bartowsky E.J., Henschke P.A. 2004. The »buttery« attribute of wine – diacetyl – desirability, spoilage and beyond. International Journal of Food Microbiology, 96: 235-252 Bavčar D. 2009. Kletarjenje danes. 2. Dopolnjena izdaja. Kmečki glas: 80-82 Belancic A., Agosin E. 2007. Methoxypyrazines in Grapes and Wines of Vitis vinifera cv. Carmenere. American Journal of Enology and Viticulture, 58, 4: 462-469 Bowyer P.K., Murat M.L., Moine-Ledoux V. 2010. Glutathione: aroma preservation in white/rosé wines. Practical Winery & Vineyard, maj/junij 2010 Candelon N., Shinkaruk S., Bennetau B., Bennetau-Pelissero C., Dumartin M.L., Degueil M., Babin P. 2010. New approach to asymmetrically substituted methoxypyrazines, derivatives of wine flavors. Tetrahedron, 66: 2463-2469 Carrau F. M., Medina K., Boido E., Farina L., Gaggero C., Dellacassa E., Versini G., Henschke P. A. 2005. De novo synthesis of monoterpenes by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts. FEMS Microbiology Letters, 243, 1: 107-115 Chone X., Lavigne-Cruege L., Tominaga T., van Leeuwen C., Castagnede C., Saucier C., Dubourdieu D. 2006. Effect of vine nitrogen status on grape aromatic potential: flavor precursors (S-cysteine conjugates), glutathione and phenolic content in Vitis vinifera L. cv. Sauvignon Blanc grape juice. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 40, 1: 1-6 Clemente-Jimenez J.M., Mingorance-Cazorla S., Martinez-Rodriguez S., Las Heras-Vazquez F.J., RodriguezVico F. 2005. Influence of sequential yeast mixtures on wine fermentation. International Journal of Food Microbiology, 98: 301-308 Comitini F., Gobbi M. Domizio P., Romani C., Lencioni L., Mannazzu I., Ciani M. 2011. Selected nonSaccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Food Microbiology, 26, 5: 873-882 Cordero Otero R. R. C., Iranzo J. F. U., Briones-Perez A. I., Potgieter N., Villena M. A., Pretorius I.S., van Rensburg P. 2003. Characterization of the β-glucosidase activity produced by enological strains of nonSaccharomyces yeasts. Journal of Food Science, 68: 2564–2569 Čuš F., Baša Česnik H. 2009. Povezava med koncentracijo nekaterih prostih terpenov in senzorično kakovostjo vina. Vinarski dan 2009. Kmetijski inštitut Slovenije: 5-18 Darriet P., Tominga T., Lavigne V., Boidron J., Dubourdieu D. 1995. Identification of a powerful aromatic compound of Vitis vinifera L. var. Sauvignon wines: 4-Mercapto-4-methylpentan-2-one. Flavour Fragrance Journal, 10: 385-392. Drawert F., Barton H. 1978. Biosynthesis of flavor compounds by microorganisms. 3. Production of monoterpenes by the yeast Kluyveromyces lactis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 26, 3: 765– 766 Dubourdieu D., Darriet P. 1993. Research of the varietal aroma of Sauvignon. Vignevini, 20, 7-8: 38-41 Dubourdieu D., Tominaga T., Masneuf J., Peyrot de Gachons C., Murat M.L. 2000. The role of yeasts in grape flavor development during fermentation: The example of Sauvignon Blanc. American Society of Enology and Viticulture 50th Annual Meeting. Seattle, Washington, junij 19-23, 2000: 196-203 Dubourdieu D., Lavigne-Cruege V. 2004. The role of glutathione on the aromatic evolution of dry white wine. Vinidea.net Wine Internet Technical Journal, 02, 2 Dubourdieu D., Marullo P., Bely M., Masneuf-Pomarède I., Aigle M. 2004. Inheritable nature of oenological quantitative traits is demonstrated by meiotic segregation of industrial wine yeast strains. FEMS Yeast Research, 4: 711-719 Du Toit W. 2007. Glutathione report of different yeast strains conducted for Anchor Yeast (http://www.newworldwinemaker.com/articles/view?id=324) El Hosry L., Auezova L., Sakr A., Hajj-Moussa E. 2009. Browning susceptibility of white wine and antioxidant effect of glutathione. International journal of food science and technology, 44, 12: 2459-2463 Erasmus D.J., Cliff M., van Vuuren H.J.J. 2004. Impact of yeast strain on the production of acetic acid, glycerol, and the sensory attributes of icewine. American Journal of Enology and Viticulture, 55, 4: 371-378 Fernández-González M., Di Stefano R., Briones A. 2003. Hydrolysis and transformation of terpene glycosides from muscat must by different yeast species. Food Microbiology, 20, 1: 35-41 Fugelsang K.C. 1997. Wine Microbiology, New York, Chapman & Hall: str. 125 Gurbuz O., Rouseff J.M., Rouseff R.L. 2006. Comparison of aroma volatiles in commercial merlot and Cabernet Sauvignon wines using gas chromatography-alfactometry and gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 11: 3990-3996 24 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Hernández L. F., Espinosa J. C., Fernandez-Gonzalez M., Briones, A. 2003. β-Glucosidase activity in a Saccharomyces cerevisiae wine strain. International Journal of Food Microbiology, 80: 171-176 Howell K.S., Swiegers J.H., Elsey G.M., Siebert T.E., Bartowsky E.J., Fleet G.H., Pretorius I.S., de Barros Lopes M.A. 2004. Variation in 4-mercapto-4-methyl-pentan-2-one release by different wine strains. FEMS, 240: 125-129 Howell K.S., Klein M., Swiegers J.H. Hayasaka Y., Elsey G.M., Fleet G.H., Høj P.B., Pretorius I.S., de Barros Lopes M.A. 2005. Genetic determinants of volatile thiol release by Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation. Applied and Enviromental Microbiology, 71: 5420-5426. King A., Dickinson J. R. 2000. Biotransformation of monoterpene alcohols by Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii and Kluyveromyces lactis. Yeast, 16, 6: 483 – 580 Košmerl T. 2007. Senzorične lastnosti mošta in vina: študijsko gradivo za pokuševalce vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina, 2. izd. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 60 str. Lacroux F., Tregoat O., van Leeuwen C., Pons A., Tominaga T., Lavigne-Cruege V., Dubourdieu D. 2008. Effect of foliar nitrogen and sulphur application on aromatic expression of Vitis vinifera L. cv. Sauvignon Blanc. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 42, 3: 125-132 Lecas M., Gunata Z. Y., Sapis J. C., Bayonove C. L. 1991. Purification and partial characterization of βglucosidase from grape. Phytochemistry, 30, 2: 451-454 Lilly M. 2004. The development of yeasts for the optimal production of flavour-active esters and higher alcohols in wine and destillates. PhD Thesis (Stellenbosch University: South Africa). Lisjak K., du Toit W.J., Stander M., Prevoo D. 2007. Using LC-MSMS to assess glutathione levels in South African white grape juices and wines made with different levels of oxygen. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 8: 2765-2769 Liu S.Q., Pilone G.J. 2000. An overview of formation and roles of acetaldehyde in winemaking with emphasis on microbiological implications. International Journal of Food Science and Technology, 35: 49-61. Loscos N., Hernandez-Orte P., Cacho J., Ferreira V. 2007. Release and formation of varietal aroma compounds during alcoholic fermentation from nonfloral grape odorless flavor precursors fractions . Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 16: 6674–6684 Makhotkina O., Kilmartin P.A. 2009. Uncovering the influence of antioxidants on polyphenol oxidation in wines using an electrochemical method: Cyclic voltammetry. Journal of Electroanalytical Chemistry, 633, 1: 165174 Mateo J.J., Jiménez M. 2000. Monoterpenes in grape juice and wines. Journal of Chromatography A, 881, 12:557-567 Mateo J. J., Di Stefano R. 1997. Description of theβ-glucosidase activity of wine yeasts. Food Microbiology, 14, 6: 583-591 Mateos J.A.R., Pérez-Nevado F., Fernández M.R. 2006. Influence of Saccharomyces cerevisiae yeast strain on the major volatile compounds of wine. Enzyme and Microbal Technology, 40: 151-157 Mendes Ferreira A., Clímaco M.C., Mendes Faia A. 2001. The role of non-Saccharomyces species in releasing glycosidic bound fraction of grape aroma components — a preliminary study. Journal of Applied Microbiology, 91, 1,: 67–71 Moreira N., Pina C., Mendes F., Couto J.A., Hogg T., Vasconcelos I. 2011. Volatile compounds contribution of Hanseniaspora guilliermondii and Hanseniaspora uvarum red wine vinifications. Food Control, 22: 662-667 Molina A., Swiegers J., Varela C., Pretorius I., Agosin E. 2007. Influence of wine fermentation temperature on the synthesis of yeast-derived volatile aroma compounds. Applied Microbiology and Biotechnology, 77, 3: 675-687. Murat M.L., Tominaga T., Dubourdieu D. 2001a. Assessing the aromatic potential of Cabernet Sauvignon and Merlot musts used to produce rosé wine by assaying the cysteinylated precursor of 3-mercaptohexan-I-ol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49: 5412-5417. Murat M.L., Masneuf I., Darriet P., Lavigne V., Tominga T., Dubourdieu D. 2001b. Effect of Saccharomyces cerevisiae yeast strains on the liberation of volatile thiols in Sauvignon blanc wine. American Journal of Enology and Viticulture, 52: 136-139. Oelofse A., Lonvaud-Funel A., du Toit M. 2009. Molecular identification of Brettanomyces bruxellensis strains isolated from red wines and volatile phenol production. Food Microbiology, 26, 4: 377-385 O'Kennedy K. 2010. The role of glutathione in winemaking. New-WORLD winemaker.com Plata C., Millán C., Mauricio J.C., Ortega J.M. 2003. Formation of ethyl acetate and isoamyl acetate by various species of wine yeasts. Food Microbiology, 20:217-224 Papadopoulou D., Roussis I.G. 2008. Inhibition of the decrease of volatile esters and terpenes during storage of a white wine and a model wine medium by glutathione and N-acetylcysteine. International journal of food science & technology, 43, 6: 1053-1057 Pócsi I., Prade R.A., Penninckx M.J. 2004. Glutathione, altruistic metabolite in fungi. Advances in Microbial Physiology, 49: 1-76 25 Jenko M., Čuš F., Košmerl T. Sortni vonj ali napaka: študijsko gradivo za dodatno izobraževanje pokuševalcev vina, mošta in drugih proizvodov iz grozdja in vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2011 Rapp A., Mandery H.. 1986. Wine aroma. Experientia. 42, 873-884 Ribéreau Gayon, P., Glories, Y., Maujean, A., Dubourdieu, D. 2006. Handbook of Enology: Vol. 2: The Chemistry of Wine. Stabilization and Treatments. Chichester [etc.], John Willey & Sons, Ltd.: 441 str. Rodríguez M.E., Lopes C., Valles S., Giraudo M.R., Caballero A. 2007. Selection and preliminary characterization of β-glycosidases producer Patagonian wild yeasts. Enzyme and Microbial Technology, 41, 6-7: 812-820 Rojas V., Gil J.V., Piñaga F., Manzanares P. 2001. Studies on acetate ester production by non-Saccharomyces wine yeasts. International Journal of Food Microbiology, 70: 283-289 Rojas V., Gil J.V., Piñaga F., Manzanares P. 2003. Acetate ester formation in wine by mixed cultures in laboratory fermentations. International Journal of Food Microbiology, 86: 181-188 Rollini M., Manzoni M. 2006. Influence of different fermentation parameters on glutathione volumetric productivity by Saccharomyces cerevisiae. Process Biochemistry, 41, 7: 1501-1505 Sala C., Busto O., Guasch J., Zamora F. 2005. Contents of 3-alkyl-2-methoxypyrazines in musts and wines from Vitis vinifera variety Cabernet Sauvignon: influence of irrigation and plantation density. Journal of Food and Agriculture, 85: 1131-1136 Scheiner J.J., Sacks G.L., Vanden Heuvel J.E. 2009. How viticultural factors affect methoxypyrazines. Wines & Vines, november 2009. Spiropoulos A., Tanaka J., Flerianos I., Bisson L.F. 2000. Characterization of hydrogen sulfide formation in commercial and natural wine isolates of Saccharomyces. American Journal of Enology and Viticulture, 51: 233-248 Suárez R., Suárez-Lepe J.A., Morata A., Calderón F. 2007. The production of ethylphenols in wine by yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera: A review. Food Chemistry, 102: 10-21 Sumby K.M., Grbin P.R., Jiranek V. 2010. Microbal modulation of aromatic esters in wine: Current knowledge and future prospects. Food chemistry, 121: 1-16 Swiegers J.H., Willmott R., Hill-Ling A., Capone D.L., Pardon K.H., Elsey G.M., Howell K.S., de Barros Lopes M.A., Sefton M.A., Lilly M., Pretorius I.S. 2005. Modulation of volatile thiol and ester aromas in wine by modified wine yeast. Proceedings of the Weurman Flavour Research Symposium, Roskilde, Denmark, Junij 2005: 21-26 Swiegers J.H., Francis I.L., Pretorius H., Pretorius I.S. 2006. Meeting consumer expectations through management in vineyard and winery: the choice of yeast for fermentation offers great potential to adjust the aroma of Sauvignon Blanc wine. Wine Industry Journal, 21, 1: 34-42 Swiegers J.H., Kievit R.L., Siebert T., Lattey K.A., Bramley B.R., Francis I.L., King E.S., Pretorius I.S. 2009. The influence of yeast on the aroma of Sauvignon Blanc wine. Food Microbiology, 26: 204-2011 Torrens J., Urpi P., Riu-Aumatell M., Vichi S., López-Tamames E., Buxaderas S. 2008. Different commercial yeast strains affecting the volatile and sensory profile of cava base wine. International Journal of Food Microbiology, 124: 48-57. Ugliano M., Henschke P. A. 2009. Wine Chemistry and Biochemistry. Chapter 8D: Yeasts and Wine Flavour. Part II. Springer New York: 313-392 Vaimakis V., Roussis I.. 1996. Must oxygenation together with glutathione addition in the oxidation of white wine. Food Chemistry, 57, 3: 419-422 Vermeulen C., Gijs L., Collin S. 2005. Sensorial contribution and formation pathways of thiols in foods: A review. Food Reviews International, 21: 69-137 Vilanova M., Ugliano M., Varela C., Siebert T., Pretorius I., Henschke P. 2007. Assimilable nitrogen utilisation and production of volatile and non-volatile compounds in chemically defined medium by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology, 77, 1: 145-157 Villena M.A., Iranzo J.Ú., Pérez A. B. 2006. Relationship between Debaryomyces pseudopolymorphus enzymatic extracts and release of terpenes in wine. Biotechnology Progress, 22, 2: 375-381 Walker G.M. 1998. Yeast physiology and biotechnology. Chichester, John Wiley & Sons, Ltd.: 168-169 26