"Año del Diálogo y Reconciliación Nacional"

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

CUARTO LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

RECUENTO TOTAL DE MICROOGANISMOS

EN PLACAS PETRI. EXPRESION DE RESULTADOS DE COLONIAS.

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS DE MEDIO SÓLIDO A MEDIO
LÍQUIDO. COMPORTAMIENTO DE BACTERIAS EN CALDO NUTRITIVO Y
BMI

INTEGRANTES:

• CASO-CALIZAYA-HENRY LENYN - 20171517B

• MORALES NAVARRO IVON FIORELLA - 20171364A

DOCENTE:

Martin Martínez Vila

Lima, Perú
 INDICE

1) RESUMEN

……………………………………………………………………………………….

2) INTRODUCCION

…………………………………………………………………………………….

3) OBJETIVOS

…………………………………………………………………………………………..

4) MARCO TEORICO

…………………………………………………………………………………………

5) RESULTADOS

……………………………………………………………………………………………

6) DISCUCIONES Y OBSERVACIONES

……………………………………………………………………………………………

7) CONCLUSIONES Y APLICACIONES

…………………………………………………………………………………………….

8) ANEXOS

…………………………………………………………………………………………..

9) BIBLIOGRAFIA

…………………………………………………………………………………………….
 RESUMEN

En la siguiente práctica de laboratorio se puso a prueba La técnica en contar las

“unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de
muestra. Consideramos que cada colonia que se desarrolla en el medio de
cultivo respectivo en un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada,
proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, sobre la muestra
bajo estudio; dichos microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir
una a lo que conocemos como UFC (unidades formadoras de colonias). Las
colonias a contar son aquella que pertenecía en el rango de [30,300] de ahí que
se considera contable las colonias. Además se pasó a la etapa de la
caracterización de los microorganismo por ejemplo: la forma, fusiforme,
consistencia, color, Olor y ect.

INTRODUCCION

Cuando se requiere saber acerca del contenido de microorganismos en la

muestra que sea dejado, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa.
Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero
el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno,
permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante conocer
en nuestras muestras por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o
mesófilos aerobios son un indicador general de la población que pueden estar
presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado
el producto.

Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero

para algunos productos, también es importante determinar la presencia de
bacterias termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para predecir la estabilidad
del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La técnica básica
es la misma, pero cambian las condiciones de incubación, medios de cultivo y
algunos otros detalles, que se mencionan en la técnica.

Si se modifican las condiciones de incubación o se somete la muestra a algún

tratamiento previo, el método puede aplicarse también a la detección de otros
grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada selección
de medios de cultivo. El método permite numerosas fuentes de variación,
algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores
por lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente
las condiciones.
 OBJETIVOS:

 Establecer la caracterización de colonias

 Aprender la técnica de microorganismos de un medio solido a líquido.
 Determinar la carga microbiana.
 Siembra de microorganismos de medio sólido a líquido.
 Comportamiento de bacterias en caldo BHI y caldo nutritivo.

RECUENTO TOTAL DE MICROOGANISMOS

EN PLACAS PETRI. EXPRESION DE RESULTADOS DE COLONIAS. SIEMBRA DE
MICROORGANISMOS DE MEDIO SÓLIDO A MEDIO LÍQUIDO. COMPORTAMIENTO
DE BACTERIAS EN CALDO NUTRITIVO Y BMI

I. Marco Teórico

Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de

una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de
tamaño generalmente es visible a simple vista

Generalmente se reporta la morfología colonial tal como uno la percibe, por ejemplo si
se ves que las colonias bacterianas son como puntitos, pues reportan que son
puntiformes, si son lisas pues reportan que son lisas.

Si observas que están como moco, pues reportan que están mucosas, si su color es
amarillento pues reportan que son de color amarillento, y así sucesivamente., también
puedes agregar características que consideres importante para identificarlas, por
ejemplo el olor., Aun así checa las siguientes imágenes para orientarte.
Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y
combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven
para identificar bacterias en cultivos mezclados.

Recuento de microorganismos

La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes

en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el
medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura
adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra
bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia,
es decir una UFC.

Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones
decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica
para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de
alimentos para su análisis microbiológico”

Para hacer el cálculo se tienen que contar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias
aisladas ya que por encima de 300 el número es demasiado elevado para hacer un
recuento fiable y por debajo de 30 no tiene valor estadístico.

UFC/ml de muestra = (Número de colonias x factor de dilución) /ml sembrados en la

placa

Siembra por estría

Usada para el aislamiento de cultivos, es un método útil de sembrar en placa. Un

alambre con un aro en la punta (asa de cultivo) se esteriliza e introduce en una
suspensión, convenientemente me diluida de organismos y se utiliza luego para hacer
una serie de estrías paralelas, no supuesta sobre una placa. Se inocula la muestra
sobre un extremo de la placa con un ansa y se extiende formando estrías sobre la
superficie en varios sentidos, cada célula aislada se multiplicará formando una colonia
independiente, cada colonia representa un cultivo puro.

I. Procedimiento Experimental
MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVO Y EQUIPOS

 Incubadora
 Contador de colonias
 Algodón
 Papel Kraft
 Mechero bunsen
 Encendedor
 Rejillas
 Pipetas
 Pabilos
 Gradillas
 tubos de ensayos
 placas Petri.
 Asa de siembra

METODOLOGÍA:

Calculo para el recuento estándar en placa.

Se consideran “representativas “las cajas que tienen un número de colonias dentro del
rango de sensibilidad del método, en este caso, entre 25 y 250 UFC.
Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se aplica
el factor de dilución, que es el inverso y se redondea el número a 2 cifras significativas
(o dígitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dígito del promedio es 4 o menor, se
omite dejando el número de 2 cifras significativas. Por ejemplo, si en una caja se
cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X 101, porque el tercer dígito es 2 y se
redondea al segundo dígito. Cuando el tercer dígito es 5 o superior, el segundo dígito
se redondea al siguiente, por ejemplo, si en una caja se cuantifican 199 UFC se
reportará como 20 x 101 UFC, porque el tercer dígito es superior a 5. En el ejemplo 5
del cuadro 2, el promedio es de 237.5 en la dilución 10-3, por lo que se reportará como
24 x 104 UFC.
Cuando las 2 placas de una dilución contienen un número de colonias características
dentro del rango de sensibilidad del método, se promedian los números y se multiplica
por el inverso de la dilución.
Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran ésta ni su
duplicado.
Cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no, se
consideran ambas y se promedian.

Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se promedian cada

una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se aplica el factor de dilución a
cada una y luego se promedia nuevamente.

Si en las placas no hay colonias (o no son características del grupo en estudio),

reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la más baja utilizada), por
ejemplo < 100 / g si la dilución más baja fue 10-2 ó < 1 / mL si la muestra se sembró
directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda: “valor estimado”.

Si no hay placas representativas, pero hay alguna con un número menor de UFC., se
consideran las de la menor dilución y se agrega “valor estimado”.

Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en
aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias.
Contar, por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el
valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos
cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65
cuadros de la cuadrícula del contador. Agregar la leyenda "valor estimado".

Técnica de siembra de microorganismos de un medio liquido un medio solido

Después de realizar las diluciones y luego obtener un crecimiento microbiano en las

placas, pasamos a realizar el conteo de colonias visibles. Luego escogemos 9 colonias
y pasamos sembrarlos en el caldo nutritivo ya preparado y esterilizado. A esto
llamaremos cultivo puro.

Para realizar el cultivo mixto tomamos muestras del sarro dental y de las manos de un
compañero de laboratorio con un hisopo estéril, Este debe estar embebido con agua
peptonada, luego de pasarlo por el sarro dental colocarlo en el caldo BHI. De igual
forma con otro algodón estéril y embebido con agua peptonada pasarlo por los
pliegues, uñas y palma de la mano; luego colocar este en el caldo BHI. Rotular.
Incubar a 35 °C por 48 horas.

Después de incubar por 48 horas, sacamos las muestras y observamos las

características del crecimiento microbiano en el caldo Nutritivo y BHI. Observamos si
presenta turbidez, floculo, película o sedimento.

Luego de observar, con la ayuda del asa de siembra transferimos microorganismos del
medio líquido a otro medio sólido inclinado, se realizará siembra por estriado en el
agar TSA. Esto se realizó para caldo BHI y Nutritivo.

Rotular e incubar el agar TSA por 24 horas. Después de trascurrido el tiempo

necesario, observar el crecimiento microbiano luego cubrirlos con papel Kraft.

RESULTADOS

Después de obtener el crecimiento microbiano, se contabilizo las colonias visibles en

cada placa y para cada uno de los métodos. Se obtuvo diferentes cantidades en cada
uno de las diluciones y método.

METODO 1 METODO 2

DILUCIONES COLONIAS DILUCIONES COLONIAS

VISIBLES VISIBLES

10-5 120 colonias 10-5 96 colonias

10-4 No se pudo observar 10-4 87 colonias

10-3 No se pudo observar 10-3 No se pudo

observar

10-2 265 colonias 10-2 323 colonias

10-1 600 colonias 10-1 1000colonias

CONTROL DE Observaciones CONTROL DE Observaciones

ESTERILIDAD ESTERILIDAD

AP+APC 63 colonias. AP+APC

Presencia de bacilo
37 colonias.
Presencia de
levadura

AP 53 colonias. AP
Presencia de
levadura 490 Colonias
 MORFOLOGIA COLONIAL BACTERIANA

Nº METODO FORMA SUPERFICIE BORDE ASPECTO TAMAÑO COLOR

1 M1 Fusiforme Fusiforme Redondeado Opaco Pequeño Blanco

2 M1 Circular Circular Ondulado Brilloso Pequeño Amarillo

3 M1 Fusiforme Fusiforme Ondulado Transparente No Blanco

visible

4 M1 Filamentosa Filamentosa Filamentoso Transparente No Amarillo

visible

5 M1 Fusiforme Fusiforme Redondeado Riguroso Mediano Amarillo

1 M2 Filamentosa Filamentosa Lobulado Brilloso Pequeño Blanco

2 M2 Circular Circular Redondeado Opaco Mediano Blanco

3 M2 Circular Circular Especulado Transparente No Amarillo

visible

4 M2 Filamentosa Filamentosa Ondulado Opaco Pequeño amarillo

5 M2 irregular puntiforme Especulado Opaco Pequeño Amarillo

Para obtener estos resultados. De entre todas las colonias que se obtuvieron en placa
se pasó a seleccionar solo 9 colonias. Caracterizamos cada uno de ellas de acuerdo a
su morfología superficie, forma y borde Después de haber caracterizado cada uno de
las nueve colonias se pasó a sembrar en caldo nutritivo, en el caso de la muestra de
mano y sarro dental en el caldo BHI.

CULTIVO PURO(CALDO NUTRITIVO)

Nº DE TUBO CARACTERISTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

1 Se observó que sedimento y estaba turbio

2 Crecimiento ligero
 3 Se sedimento y estaba turbio

4 Se observa bastante turbidez

5 Ligero crecimiento microbiano

6 Poco sedimento y turbidez

7 Crecimiento ligero

8 Muy turbio sin nasa de sedimento

9 Presenta turbidez y sedimento

10 Ligero crecimiento y presencia de turbidez

CULTIVO MIXTO(CALDO BHI)

TIPO DE CARACERISTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

MUESTRA

BOCA Se observó un ligero crecimiento que sedimento y estaba turbio

MANO Había crecimiento en la superficie de opaco a traslucido y nada

de sedimento.

I. Discusión de Resultados

 Se notó que en el conteo de colonias visibles, que conforme la dilución aumenta

la cantidad de número de colonias visibles disminuye, por el contrario la
separación entre estas aumenta
 Se tuvo dificultades al identificar el aspecto y la elevación de las bacterias ya
que estas se encontrabas demasiada pequeñas. Nos tuvimos que guiar de una
sola agrupación de colonia
 La siembra en el caldo BMI requiere una alta destreza para llevarlo de forma
adecuada, así también, como para evitar contaminación de las colonias.
 Para realizar el recuento se tuvo que entender los métodos y así poder realizar
o establecer las Unidades formadoras de colonia (UFC), en el caso de la dilución
10-4 (método 1) se contabilizo una menor cantidad de la adecuada, esto es
debido a que en el momento de añadir el APC , este estaba aún caliente.
 En el caso de la dilución 10-1 (método 2) esto se debe a que en la placa hay
mucha carga microbiana, lo cual puede generar a que las colonias estén muy
juntas y sean incontables.
  Al momento de añadir el agar en las placas que estaba destinadas al control de
esterilidad hubo un error en la manipulación, porque después de incubarlos se
evidencio levadura y bacilos.

CONCLUSIONES:

Conocer el método para determinar el número de microorganismos viables.

Realizar un recuento de bacterias mesófilas viables en el agua de consumo humano

Como un indicador microbiano de la calidad.

BIBLIOGRAFIA

NCYT. (15 de mayo del 2018). como las bacterias se organizan para formar
colonias. NCYT Amazings . Noticias de ciencia y tecnologia Recuperado de
http://noticiasdelaciencia.com/not/7374/como-las-bacterias-se-organizan-
para-formar-colonias/
ANEXOS:

En la Placa de Petri se seleccionó 7 tipos de colonias para su

previo análisis.
Agitando El tubo de ensayo que contiene la El hisopo que se utilizó para sacar la muestra
muestra para sacar una muestra microbiana en la mano y boca.
representativa.

El traslada del microorganismo a un medio de

cultivo en presencia de una adecuada En la Placa de Petri se seleccionó 7 tipos de
temperatura. colonias para su previo análisis.
 "Año del Diálogo y Reconciliación Nacional"

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

QUINTO LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

SIEMBRA, AISLAMIENTO, TRASPLANTE Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS DE

BACTERIAS

INTEGRANTES:

• CASO-CALIZAYA-HENRY LENYN - 20171517B

• MORALES NAVARRO IVON FIORELLA - 20171364A

DOCENTE:

Martin Martínez Vila

Lima, Perú

INDICE
1) RESUMEN

……………………………………………………………………………………….

2) INTRODUCCION

…………………………………………………………………………………….

3) OBJETIVOS

…………………………………………………………………………………………..

4) MARCO TEORICO

…………………………………………………………………………………………

5) RESULTADOS

……………………………………………………………………………………………

6) DISCUCIONES Y OBSERVACIONES

……………………………………………………………………………………………

7) CONCLUSIONES Y APLICACIONES

…………………………………………………………………………………………….

8) ANEXOS

…………………………………………………………………………………………..

9) BIBLIOGRAFIA

…………………………………………………………………………………………….
 RESUMEN

Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el filamento a
un tubo que contenga agar nutritivo estéril para cultivar esa colonia aislada; este
procedimiento se conoce como trasplante. Para garantizar la pureza del cultivo
obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir el
proceso de aislamiento antes descrito. Se considerará que se ha obtenido un
cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas
presenten las mismas características. El medio de cultivo utilizado en el proceso
de aislamiento dependerá, entre otros factores, de los requerimientos
nutricionales de los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de
microorganismos que, por sus características y/o por la cantidad en que se
encuentren en la muestra, dificulten la obtención del microorganismo objeto del
aislamiento. En este último caso, se deben utilizar medios de enriquecimiento y
medios selectivos que inhiban el desarrollo de gérmenes contaminantes. La
temperatura y otras condiciones de incubación, variarán según los
microorganismos, usualmente la temperatura óptima de los microorganismos
patógenos para el hombre oscila entre 30 y 40ºC. Cuando el microorganismo
que se intenta aislar es anaeróbico, deben tomarse las precauciones necesarias
a fin de eliminar la presencia de oxígeno en el ambiente donde se desarrollará el
mismo. Basándose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los
posibles microorganismos que se encuentran presentes en la misma, y ese
conocimiento ayudará en la selección del medio y las condiciones de cultivo
adecuadas. Para iguales fines, es de gran utilidad el conocimiento de los
síntomas de la enfermedad que padece la persona de quien se obtuvo la muestra
analizada.

INTRODUCCION

En todos los ambientes naturales habitan múltiples microorganismos de diversos

tipos y actividad fisiológica. Para efectuar el estudio de un organismo particular
es necesario separarlo de la población mixta en la que se encuentra. Para tal fin
se emplean técnicas de aislamiento que conduzcan a la obtención de un cultivo
puro. De manera general los métodos de aislamiento incluyen: 1. Separación
física de los microorganismos mediante: a) Diluciones seriadas y siembra por
vertido en placa. b) Siembra por agotamiento. 2. Utilización de medios de cultivo
selectivo y diferencial. 3. Aprovechamiento de características particulares de los
microorganismos, tales como la formación de esporas, el metabolismo anaerobio
y/ o facultativo, la capacidad para utilizar sustratos poco comunes, etc. Para
facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados, frecuentemente
se emplean combinaciones de las técnicas anteriores.

OBJETIVOS:

 Practicar la siembra en medios de cultivos previamente esterilizados y

adecuados para la bacteria que se desea aislar
  Emplear instrumentos estériles
 No contaminar ni destruir los microorganismos
 Depositar los microorganismos asépticamente en los medios de cultivo
 Esterilizar los instrumentos empleados, inmediatamente después de
cada operación
 Aislamiento por agotamiento de estrías.

SIEMBRA, AISLAMIENTO, TRASPLANTE Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS DE

BACTERIAS

MARCO TEÓRICO:
CRECIMIENTO MICROBIANO

Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganismos a

lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un único
microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demográfico de una
población. Nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace
puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos.

Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo

del ciclo celular tiene lugar la replicación del material genético, la síntesis de
componentes celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar un tamaño doble del
inicial y su división por bipartición para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo
celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismos
factores de los que depende este. El crecimiento de una población resulta de la suma
de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población.

Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes

números en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los
microorganismos es en la mayoría de los casos depende de su número, entender
cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir
sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados

MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición química

se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por
mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne,
etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade
algún agente solidificaste que no sea consumible por los microorganismos
(normalmente agar). En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los
medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos
microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para
clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las
colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para
identificar colonias de microorganismos hemolíticos), selectivo-diferenciales cuando
combinan las dos características anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para
identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo
determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran
tamaño.

Caldo BHI (Infusión Cerebro Corazón)

Es un medio líquido usado para cultivar microorganismos patógenos y no patógenos,
incluyendo bacterias aerobias y anaerobias, además también es usado en la
preparación de inóculos en pruebas de susceptibilidad microbiana. Es un medio de
cultivo nutritivo que contiene infusión de cerebro, tejido de corazón y peptonas que
proporcional proteínas y otros nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de
microorganismos patógenos y no patógenos.

Caldo Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de
microorganismos con escasos requerimientos nutricionales.
Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y
otros materiales de importancia sanitaria.

Agar Nutritivo
Es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es
muy útil porque permanece sólido incluso a relativamente altas temperaturas. Además,
el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen
mejor las colonias pequeñas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia
espesa, con colonias difícilmente observables.

Agar EMB
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de
rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae.

Agar Endo
Es un medio de cultivo microbiológico de color rosa pálido. Fue originalmente
desarrollado para el aislamiento de Salmonella typhi, pero ahora es usado mayormente
como un medio para coliformes. La mayoría de los organismos gram negativos crecen
bien en este medio, mientras que otros organismos gram positivos son inhibidos
Agar Manitol Salado
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de
estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir
de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos, etc.
También puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, si no se dispone
de medios apropiados, aunque algunas especies pueden no desarrollar.

CULTIVO PURO

Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganismos.

Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los
individuos del mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros son
esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poder
identificarlos con seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce más sobre el
funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre
el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que, por
consiguiente, la fisiología de los microorganismos en ambientes naturales puede ser
diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros.

SIEMBRA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un
medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicación.
Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el
crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
● Que se efectúen asépticamente
● Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
● Que se realicen solo los manipuleos indispensables
● Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un
mechero o bien Flujo laminar.

El resultado de una siembra se llama: Cultivo

Las siembras pueden ser:
- Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez
- Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria

AISLAMIENTO
Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que
le acompañan. El método más usual es la siembra por estría sobre un medio de cultivo
sólido adecuado dispuesta en una placa de Petri. Para ello se toma una pequeña
cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del medio de
cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las células bacterianas. El
aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro se realiza principalmente
en un medio sólido. Se inicia por la separación de una sola célula a partir de una
población y requiere también que la colonia que surja de esta célula se mantenga
separada de otras células o colonias.

El aislamiento de un cultivo puro puede hacerse también en medios líquidos, siempre

que el organismo predomine en el material de partida.
Tras la incubación en condiciones adecuadas, cada célula viable origina una colonia
visible resultado de sucesivas divisiones celulares.
Cada colonia bacteriana tiene unas características determinadas en cuanto a su forma,
borde, elevación, tamaño, consistencia, etc.
Los tipos de bacterias presentes en la muestra original son visibles como tipos diferentes
de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo
puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original.
Por lo tanto el objetivo de la práctica es reconocer las técnicas de aislamiento para
obtener cultivos puros, ya sea por estría simple o compuesta.
TRANSPLANTE
Consiste en colocar al microorganismo ya aislado en un nuevo medio de cultivo a fin de
conservarlo a través del tiempo. Llamado también repique, el cual consiste en tomar una
muestra de las colonias donde la siembra se realiza en un medio diferencial o selectivo.

En función de los tipos de características del microorganismo será el número de

repiques a realizar para llegar a obtener un cultivo puro. El repique consiste en extraer
del borde de la colonia un trozo de agar con micelio, sembrarlo en otra placa de Petri
conteniendo medio nutritivo para hongos pero sin sustancias bacteriostáticas, e incubar
las placas a 20 o 25ºC durante el tiempo que demore la formación de las estructuras
reproductivas necesarias para la identificación del hongo.

MÉTODO DE ESTRÍAS POR AGOTAMIENTO

Con el asa ya esterilizada se tomó una porción de una de las colonias presentes en el
cultivo, y se depositó en un costado de la caja de Petri (contenía agar nutritivo), a partir
de ese punto se hicieron estrías pasando el asa suevamente en forme de zigzag por la
superficie del agar sin rasparlo. Luego se tapó la caja de Petri, se quemó el asa y se
incubo a 37Oc/ 24 horas. Este procedimiento se realizó al pie del mechero.

SIEMBRA EN FONDO EN TUBO, POR PICADURA

Con un asa previamente esterilizado se tomó una pequeña cantidad de la muestra a

examinar, se inclinó el tubo de ensayo (contenía agar) y se introdujo la punta del asa en
este; llegando al fondo, pero sin tocar el tubo. Se sacó el asa por el mismo canal y al
llegar a la superficie inclinada, se practicaron estría.

SIEMBRA EN CALDOS

Al pie del mechero y con un asa esterilizada se tomó la muestra a examinar, se inclinó
el tubo con el caldo y en el espacio desocupado por la inclinación del líquido se colocó
la muestra en la pared del tubo, se enderezo y se mezcló por rotación, posteriormente
se tapó con algodón
 I. Procedimiento Experimental
MATERIALES:

 Placas Petri
 Asa de inoculación
 Mechero de bunsen
 Incubadora
 Agar ENDO
 Agar EMB
 Agar manitol salado
 Agar nutritivo
 Caldo BHI
 Caldo nutritivo
 Papel Kraft

METODOLOGIA

Método del Estriado

Procedimientos:

Se empleará las colonias de los cultivos sembrados en caldo nutritivo y caldo BHI, así
como las colonias sembradas en agar TSA a partir de los caldos. Asimismo, empleará
los cultivos mixtos de boca y mano y emplearán la técnica de aislamiento por estriado o
por estría cruzada.

Técnica de estriado:

 En la parte posterior y exterior de la placa Petri, divida en tres o cuatro

cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular
la muestra haciendo 7-8 estriadas simples muy juntas de lado a lado sobre el
primer cuadrante de la placa cerrarla.
  Flamear el asa de inoculación y hacer girar la placa Petri un cuarto de vuelta.
Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del
medio lejos de la zona de estrías recién hechas.
 Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un
segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior.

 Repetir el procedimiento b y c en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en

el último cuadrante, no se deberá flamear el asa de siembra y se hará una estría
más abierta (simple).

Las placas son, rutinariamente, incubadas invertidas a 37°C por 24-48 horas.

Placas Petri con medios de cultivos para siembra por estriado:

Medios: agar ENDO, Agar EMB, Agar Manitol Salado, Agar Nutritivo. Dividir placas en
cuadrantes y anotar número de colonia.

Cultivos: colonias en caldos BHI, Nutritivo y en Agar TSA, sembrarlas en los medios
indicados según técnica, incubar placas invertidas a 37°C por 24-48 horas, guardar
placas en papel Kraft en la refrigeradora.

PROCEDIMIENTOS DE CÁLCULO:

Agar EMB:

Colocar los frascos cerrados en baño maría y llevar a ebullición para fundir el medio de
cultivo sólido contenido en los mismos. Una vez que se ha fundido el medio de cultivo,
retirar cuidadosamente los frascos del baño maría y dejar enfriar. Cuando alcanzan
temperatura 45-50 ºC, abrirlos y distribuir aproximadamente 15 ml en placas de Petri
estériles.

Agar ENDO:

Suspender 51 g del polvo en 1 L de agua destilada que contiene 20 ml de etanol al 95

% Mezclar bien. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto para
disolver completamente el polvo. No esterilice en autoclave. Las muestras de ensayo
del producto acabado para el rendimiento usando cultivos de control estables, típicos.

Agar Nutritivo:
Suspender 31g de polvo en un litro de agua purificad. Mezclar y dejar reposar 5 minutos.
Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 o 2 minutos hasta su dilución total. Distribuir
en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.

Agar Manitol Salado:

Suspender 111g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos y agitar con
agitación frecuente, llevando a ebullición durante 1 o 2 minutos para disolución total.
Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15
minutos. Enfriar y distribuir en placas Petri.

COLONIA AGAR NUTRITIVO AGAR ENDO AGAR EMB AgarMonitol

Salado

1 No se Los Bordes
El crecimiento
observa estaban rojos.
regular, No hay
crecimiento. Las colonias
colonias muy crecimiento
Destrucción de están grandes y
pequeñas y juntas.
medio muy juntas.
2 Crecimiento
moderado.
Colonias
Las
El Agar estaba pequeñas, un
colonias son
No hay crecimiento muy poco
medianas y están
destruido. separadas.
muy aisladas.
Centro rojo
forma
circular.
3 Crecimiento Abundante
mediano, crecimiento
colonias moderado.
pequeñas y Colonias
Un cambio de color
Colonias muy medianas. pequeñas,
pero no hay
pequeñas y Consistencia algunas
crecimiento
alejadas. mucosa. puntiformes.
Superficie Están muy
umblicada cercanas.
confluentes. Color rojo.
4 No hay Crecimiento
crecimiento. abundante.
Presencia de y grandes
Colonias
hongo colonias de
circulares y
No hay crecimiento blanco. tipo frijoide
puntiformes. Y
Superficie plana circulares,
creció poco.
y bordes pupiladas,
redondeadas. planas,
Color opaco. olor terroso.
5 Poco crecimiento Crecimiento
o regular,
No hay
en toda placa. No hay crecimiento colonias
crecimiento
Colonias circulares
irregulares. planas.
 6
Colonias
Colonias
puntiformes
Se observó puntiformes
de
abundante puntos de consistencia
No hay crecimiento consistencia
que turbio la seca
seca
muestra y de color
y de color
púrpura Poco
púrpura Poco
crecimiento.
crecimiento
7 Buen crecimiento, No hay crecimiento No hay
colonias grandes y crecimiento
pequeñas formas No hay
espiculadas, crecimiento
textura
mucosa.

CONCLUSIONES:

A partir del anterior laboratorio y a través de la bibliografía citada

podemos concluir los siguientes puntos:

 La utilización de medios de cultivos es de gran importancia en la

industria de alimentos, nos permite conocer las condiciones en las
cuales se desarrolla los microorganismos tales como bacterias,
hongos, algas, levaduras, etc.
 La esterilidad es uno de los requisitos necesarios que deben cumplir los
medios de cultivos para que se dé el crecimiento adecuado de las
bacterias.
 Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de
cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas,
así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
 Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.
 En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos
materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre
completa, bilis, etc.
 Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para
detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que
ayuden a identificarlos.
 El suero y la sangre completa se añaden para promover el
crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

BIBLIOGRAFIA
 ANEXOS:

La imagen se muestra la placa Petri después La imagen se muestra la placa Petri después
de unos días del estrillado. de unos días del estrillado.
La imagen se muestra la
placa Petri después de unos
días del estrillado.

La imagen se muestra la
placa Petri después de unos
días del estrillado.
La imagen se muestra la placa
Petri después de unos días del
estrillado.

La imagen se muestra la
placa Petri después de unos
días del estrillado.

La imagen se muestra la
placa Petri después de unos
días del estrillado.
El traslada del microorganismo
a un medio de cultivo en
presencia de una adecuada
temperatura.

El traslada del microorganismo a

un medio de cultivo en
presencia de una adecuada
temperatura.
 "Año del Diálogo y Reconciliación Nacional"

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

SEXTO LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

TECNICAS DE COLORACION DE BACTERIAS EN MUESTRAS AMBIENTALES

.TINCION POR EL METODO DE GRAM

INTEGRANTES:

• CASO-CALIZAYA-HENRY LENYN - 20171517B

• MORALES NAVARRO IVON FIORELLA - 20171364A

DOCENTE:

Martin Martínez Vila

Lima, Perú

INDICE
1) RESUMEN

……………………………………………………………………………………….

2) INTRODUCCION

…………………………………………………………………………………….

3) OBJETIVOS

…………………………………………………………………………………………..

4) MARCO TEORICO

…………………………………………………………………………………………

5) RESULTADOS

……………………………………………………………………………………………

6) DISCUCIONES Y OBSERVACIONES

……………………………………………………………………………………………

7) CONCLUSIONES Y APLICACIONES

…………………………………………………………………………………………….

8) ANEXOS

…………………………………………………………………………………………..

9) BIBLIOGRAFIA

…………………………………………………………………………………………….
 RESUMEN

En el siguiente informe se presenta la descripción de un procedimiento en el cual

se llevó a cabo la tinción de Gram con el fin de contrastar las bacterias presentes
en una UFC (unidad formadora de colonia) de una muestra de suelo, para
identificar la presencia de bacterias según su grupo taxonómico: Gram positivas
y Gram negativas. En este procedimiento, en una porta objetos limpio y seco,
se agregó una gota de agua destilada y posteriormente se colocó una UFC
(unidad formadora de colonia) encima de esta gota con un asa de siembra
previamente esterilizada; seguidamente se calentó suavemente en la llama de
un mechero para fijar la muestra. Posteriormente se tiño con cristal violeta de
Hucker, luego se lavó con agua destilada, nuevamente se tiño con lugol y
seguidamente se lavó con alcohol para retirar el exceso de colorante, después
se aplicó fucsina básica para contrastar y por último se lavó con agua corriente
y se dejó secar la muestra. Finalmente se procedió a la identificación la
presencia de bacterias según su grupo taxonómico: Gram positivas o Gram
negativas presentes en la UFC a través del microscopio con el objetivo de 100x
obteniendo Staphylococcus sp Gram positivos y baterías Gram negativas con
forma de bacilo.

INTRODUCCION

El principal impedimento en la observación de bacterias en microscopio óptico

es la falta de contraste entre la célula en observación y el medio que la rodea, la
manera más simple de facilitar el contraste es la utilización de colorantes,
revelando la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria,
etc. Para bacterias, el proceso de fijación por calor es lo más habitual, aunque
también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y
alcoholes. Después de esto se añade el colorante. La fijación produce
habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace
que las células parezcan mayores de lo que son realmente. La mayoría de los
colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad por los
materiales celulares.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada
con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia
se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente
se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí
podrá atacar el colorante. Una técnica de coloración y la más conocida es la
tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram,
quien desarrollo esta técnica en 1844. Sobre la base de la tinción de gran, las
bacterias se clasifican en dos grupos: gran positivos y gran negativos. En cuanto
a la tinción de gran la secuencia es la siguiente: el frotis bacteriano se fija con
calor se tiñe con cristal violeta por min, se lava con agua, se la aplica un
mordiente por 1 min y se lava nuevamente con agua, después se decolora con
una mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con safranina (color de
contraste) durante 1 min lavar y secar. Las bacterias Gram positiva y Gram
negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para
definir su tamaño y su forma al organismo así como para prevenir la lisis
osmótica. La pared de las células Gram positivas es gruesa y consiste en varias
capas interconectadas de peptidoglicano (cadenas lineales de un polisacárido
formado por residuos alternativos de N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico
unidos mediante un enlace)

Y un poco de ácido teicoico (forman parte de la gruesa capa de peptidoglicano

que rodea a la membrana plasmática y están directamente unidos a él mediante
un enlace fosfodiéster. De este modo pueden conectar varias capas de
peptidoglicano), mientras que las bacterias gram negativas se componen de una
capa delgada de peptidoglicano y está rodeada por una capa exterior de
lipopolisacáridos (forma parte de la pared de la pared celular de las bacterias
Gram-negativas. Tienen carácter anfipático, presentan carga negativa, y repelen
moléculas hidrofóbicas. Son tóxicos para el hombre, y también se llaman
endotoxinas) por lo cual estas dos tipos de bacterias se tiñen de diferente color
y es posible identificarlas como Gram positiva o Gram negativa.

OBJETIVOS:

 Aprender y aplicar la técnica gram para diferencian Gram + y Gram –.

 Observar las esporas por técnica de Wintz.
 Poder diferenciar en el microscopio los diferentes tipos de bacterias por
su coloración.
 TECNICAS DE COLORACION DE BACTERIAS EN MUESTRAS AMBIENTALES
.TINCION POR EL METODO DE GRAM

MARCO TEORICO

La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared

celular. Básicamente, se diferencian según su forma en cocos (esféricas u ovaladas),
bacilos (cilíndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); dentro de estas
últimas se encuentran: Treponema, Borrelia y Leptospira (ver figura 1). Las espirilos
varían en el número de vueltas,desde pocas (Borrelia) a muchas (Treponema). Las
bacterias pueden mantenerse unidas unas con otras después de la división celular,
pero conservando siempre la independencia celular. Si el plano de división es único,
podemos encontrar diplococos o cocos en cadena (microorganismos del género
Streptococcus). Si los planos de división son muchos, los cocos pueden agruparse en
tétradas o en racimos (Staphylococcus). Los bacilos pueden ser muy cortos
(cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden ser redondeados o rectos; pueden
estar aislados, en cadenas, en filamentos o formando letras chinas (Corynebacterium).
Los bacilos curvos pueden tener forma de coma (Vibrio cholerae).

La morfología bacteriana debe ser observada con el microscopio óptico o el

microscopio electrónico, dado el tamaño pequeño de estos microorganismos. El más
usado en el laboratorio es el microscopio óptico de campo claro, pero existen otros
como el microscopio óptico de campo oscuro en los que los organismos aparecen
brillantes en fondo oscuro. Este microscopio permite la visualización de bacterias
difíciles de colorear como el Treponema pallidum, agente de la sífilis.

Las bacterias pueden observarse sin tinción (examen en fresco) si se las coloca en
glicerol o soluciones no acuosas que aumenten el índice de refracción o con tinción
usando distintas coloraciones que mejoran su visualización ya que son células
incoloras. Dichas tinciones se basan en la afinidad que presentan los colorantes por
las estructuras bacterianas. Los colorantes catiónicos por ejemplo, son atraídos por los
componentes de carga negativa como los ácidos nucleicos y los polisacáridos.
Ejemplo de este tipo son: el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina

Cocos : Son las bacterias de forma esférica se les denomina y pueden aparecer
aislados o en grupos de dos (diplococos), formando cadenas arrosariadas
(estreptococos), grupos arracimados (estafilococos) o masas tridimensionales en
forma de cubo (sarcinas).

Bacilos: son bacterias de forma cilíndrica y alargadas, y a veces se presentan en

cadenas lineales o ramificadas.

Espirilos: Algunos bacilos curvados que tiene formas espirales.

Vibrios: son cortos y curvados, con forma de coma.

AGRUPACIÓN BACTERIANA

Algunos géneros bacterianos se agrupan de una manera característica. Esta

agrupación se debe a la tendencia de las células hijas a permanecer parcialmente
adheridas después de la división celular.

Los cocos pueden disponerse:

 de a pares y se los llama diplococos

 si se disponen en cadena se llaman estreptococos
 cuatro células esféricas conforman una tétrada
 en forma de racimo o irregular se llaman estafilococos
 en paquetes cúbicos se denominan sarcinas

Los bacilos pueden disponerse:

 aislados
 adosados a lo largo, de forma paralela formando una agrupación en
empalizada (Haemophilus)
 pueden quedar adheridos por sus extremos y tomar apariencias de letras
chinas (Corynebacterium)

La morfología y agrupación bacteriana se ponen de manifiesto por la observación

microscópica de frotis teñidos. El método de coloración más utilizado en bacteriología
es la coloración de Gram.

Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos teniendo en cuenta el

comportamiento de las mismas frente al procedimiento de coloración de Gram:

Gram positivas: G (+), se tiñe de color violeta.

Gram negativas: G (-), se tiñen de color rojo o fucsia.

FROTIS: Método de exploración microscópica de un fragmento de tejido o secreción
que consiste en realizar una extensión sobre un portaobjetos y examinarla con el
microscopio.

TINCIONES: Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se

utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde
hace más de un siglo han ayudado al diagnóstico de enfermedades infecciosas y en la
caracterización de nuevas especies. Existe una gran variedad de tinciones, que se han
ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se
incluyen bacterias, parásitos y hongos. La tinción de Gram se considera básica en la
valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras que la tinción de
Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el campo
de la parasitología.

COLORANTES:

Según la estructura que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se han

clasificado en : coloraciones simples, en las que sólo se emplea un colorante para el
proceso, ejemplo azul de metileno; coloraciones compuestas y diferenciales, en las
cuáles se usa más de un colorante y con la misma coloración , las células se tiñen de
manera diferente, ejemplo Gram, Ziehl Neelsen, y coloraciones especiales que
permiten la observación de estructuras especiales de la bacteria como endosporas,
glicocaliz, capsulas, flagelos (3,4).

ALCOHOL ISOPOPROPILICO

El alcohol isopropílico (también conocido como isopropanol, propanol-2-ol, 2-propanol,

alcohol o API) es el nombre común de un compuesto químico de la fórmula molecular
C3H8O. Se trata de un compuesto químico incoloro, inflamable y con un fuerte olor.

CRISTAL VIOLETA

El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana, es

el nombre dado a un grupo de compuestos químicos empleados como indicadores de
pH y colorantes

LUGOL
El lugol o disolución de Lugol es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico
KI en agua destilada. Se preparó por primera vez en 1829 y recibe su nombre en
honor al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol.

Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antiséptico, para la

desinfección de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba del yodo en
análisis médicos y de laboratorio.

También se ha usado para cubrir deficiencias de yodo; sin embargo, se prefiere el uso
de yoduro potásico puro debido a la ausencia de yodo diatómico, forma molecular
cuyo consumo puede resultar tóxico.

ALCOHOL ACETONA

Es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo

cristal violeta-lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias Gram positivas, hay
varias explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas.

-Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los

microorganismos grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una
barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-lugol. En la pared de las
bacterias gramnegativas hay poco péptido glicano y una gran cantidad de lípidos estos
últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo
cristal violeta-lugol.

-Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de
peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los
cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de barrera en la
pared bacteriana que no permite la sálida del complejo cristal violeta-lugol por ende se
retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloración.

SAFRANINA

Es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen
compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas
se tiñen de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se tiñen debido a
que su pared celular está saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la
entrada de la safranina.

TINCION DIFERENCIAL

Es una técnica rápida y económica, se identifican microorganismos patógenos; fue

descrita por primera vez por los médicos alemanes, el bacteriólogo Franz Ziehl y el
patólogo Friedrich Neelsen.

TINCION GRAM

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las
tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos
bacterianos de menos de 24 horas en bacterias Gram positivas y Gram negativas. La
reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se
encuentra en las paredes celulares de estas bacterias
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES EQUIPOS
 Mechero de Bunsen o de alcohol  Microscopio
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Asa de siembra REACTIVOS
 Pinza metálica  Aceite de inmersión
 Alcohol de isopropilico
 Cristal violeta
 Lugol
 Alcohol acetona
 Fucsina o Safranina

PROCEDIMIENTO

Establecer una zona aséptica entre dos mecheros encendidos sobre la mesa de
trabajo previamente desinfectada con alcohol. Realizar todas las operaciones y
aislamiento bajo esta zona aséptica.

1. Colocar en el portaobjeto 2 o 3 gotas de agua destilada y lo mezclamos con el

cultivo sólido. Si el cultivo es líquido solo añadimos en el portaobjeto 2 o 3
gotas de este.
2. Secamos la muestra en el mechero de Bunsen.
3. Cubrimos la muestra con cristal violeta y dejamos reposar por 1 minuto.
4. Lavamos la muestra con agua corriente
5. Cubrimos la muestra con lugol y dejamos reposar por 1 minuto.
6. Lavar con agua corriente la muestra.
7. Cubrimos con alcohol acetona inclinando la muestra unos 45º gota a gota y
dejamos reposar por 30s.
8. Lavar la muestra con agua corriente.
9. Cubrimos la muestra con safranina y dejamos reposar por 30s.
10. Lavamos la muestra con agua corriente
11. Levamos al mechero de Bunsen para secarlo
12. Añadimos aceite de inmersión
13. Miramos el portaobjeto en un microscopio de 1000xRe.

RESULTADOS

Medio solido: Agar TSA

MUESTRA FORMA AGRUPACION GRAM

AMBIENTAL
Tubo Nº3 En cadenas Bacilos negativos
Tubo Nº5 Agrupaciones cocos negativos
ovaladas
Tubo Nº6 Circular Estreptococos y positivos
filamentosa cocos
 Sarro dental Algunos Bacilos y cocos positivos
filamentosos, otros
ovalados

Medio líquido: caldo nutritivo

MUESTRA FORMA AGRUPACION GRAM

AMBIENTAL
Tubo Nº4 En cadenas y cocos negativos
racimos
Tubo Nº7 En cadenas bacilos negativos
Mano Circular estreptococos Positivos
filamentosa

DISCUSIONES Y OBSERVACIONES

 Hay agrupaciones de bacterias de cadena y en estas no se lograba ver la

forma adecuadamente.
 Se observó que la pared celular de las bacterias Gram positivas posee una
gruesa capa de peptidoglicano, en cambio en Gram negativas la capa de
peptidoglicano es delgada.
 En la mayoría encontramos bacterias gran negativas, estos e debe a que
sacamos una muestra de suelo que se encontraba contaminada.
 Se debe tener una buena elaboración de los tintes, ya que estos proporcionan
una mejor visión en el microscopio.
 Entre el tubo 4 y 7 tuvimos incobenientes ya que los números que anotamos
con el plumón indeleble se había borrado a la hora de lavar la muestra.

CONCLUSIONES:

Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se
presentan morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar
tinción de Gram en estas para identificar su grupo taxonómico, las Gram
positivas se tiñen de color violeta mientras que las Gram negativas se tiñen de
color rosado.

Mediante la tinción de Gram se identifican bacterias Gram positivas y Gram

negativas gracias al color que tornan después de ser teñidas; en el caso de las
bacterias Gram positivas se tiñen de violeta, esto se debe a que gracias a que
contienen una pared gruesa de peptidoglicano y gran cantidad de ácidos
teicóicos que permiten fijar y retener rápidamente el colorante inicial el cual es,
el cristal violeta de Hucker, y además son resistentes a la decoloración. Lo
contrario ocurre con el caso de las Gram negativas, las cuales poseen una pared
delgada con menos cantidad de peptidoglicano y lípidos, la cual requiere de un
colorante de contratincion como la safranina o la fucsina en este caso, ya que el
colorante inicial es fácilmente retirado en la decoloración con alcohol, debido a
que por su delgada pared celular no lo retienen.

La tinción de Gram permite conocer la morfología celular, el tamaño, la forma y

su clasificación taxonómica (Gram positivos o Gram negativos) de acuerdo al
color que tornan las bacterias después de la tinción, sin embargo no permite
conocer la especie o género de la bacteria al cual pertenece.

Las colonias de bacterias a las que se les realizó tinción de Gram se tomaron de
una muestra de suelo, lo cual explica la presencia de estas bacterias, debido a
que en el suelo predominan las bacterias Gram negativas. Sin embargo en el
suelo también se encuentran bacterias Gram positivas, pero en menor
proporción que las Gram negativas, lo cual también explica la presencia de estas
bacterias en el suelo. De acuerdo a esto Fue posible observar bacterias Gram
negativas con forma de bacilo (con forma de barra o vara) y Gram positivas como
Staphylococcus sp.

BIBLIOGRAFIA

(MARTES 28 DE MAYO DEL 2013). MORFOLOGIA Y AGRUPACION DE

BACTERIAS. KATHERINE RAMOS. MICROBIO-RS Recuperado de
http://katerineramos-morfologiadebacterias.blogspot.pe/

Luis Esaú López-Jácome,* Melissa Hernández-Durán,* Claudia Adriana Colín-Castro,*

Silvestre Ortega-Peña,* Guillermo Cerón-González,* Rafael Franco-Cendejas*.
(Enero-Marzo 2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
mediografic. Artículo de revisión Recuperado de
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

Ronald David Soto Flores. (26 de mayo el 2003). Fundamento de la tinción de Gram. .
classic Recuperado de http://coloraciondegram.blogspot.pe/
ANEXOS:

Reactivos utilizados para

tinción (alcohol acético y
safranina)

El traslada del
microorganismo a un medio
de cultivo en presencia de
una adecuada temperatura.

Microorganismo Gram
positiva observadas en el
microscopio
 Microorganismo Gram
positiva observadas en el
microscopio

Microorganismo Gram
negativa observadas en el
microscopio

Microorganismo Gram
negativa observadas en el
microscopio
 Microorganismo Gram
negativa observadas en el
microscopio

Observando por el
microscopio las muestra
aplicadas por la tinción.