JSV 34 (2), DESEMBER 2016 Kemampuan Fertilisasi Spermatozoa Sexing dan Perkembangan Awal Embrio Secara In Vitro pada

Sapi

Kemampuan Fertilisasi Spermatozoa Sexing dan Perkembangan Awal Embrio

Secara In Vitro pada Sapi

Fertilization Ability of Sexed Spermatozoa and Early Bovine Embryonic

Development In Vitro

Alvien Nur Aini1, Mohamad Agus Setiadi1,2, Ni Wayan Kurniani Karja2

1
Program Studi Biologi Reproduksi, Sekolah Pascasarjana, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor
2
Divisi Reproduksi dan Kebidanan, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi,
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor,
Jl. Agatis, Kampus IPB Dramaga, Bogor, 16680
Email: setiadi03@yahoo.com

Abstract
The aim of the present study was to investigate the fertilization ability of bovine oocytes and early bovine
embryonic development in vitro, fertilized by frozen X and Y sperm separated by bovine serum albumin (BSA)
gradient column. Oocytes were collected from slaughter house ovarian by flushing and slicing technique. Oocytes
were than maturated in tissue culture medium (TCM) 199 supplemented with 10 IU/ml pregnant mare’s serum
gonadotropin (PMSG), 10 IU/ml human chorionic gonadotropin (hCG) and 10% fetal bovine serum (FBS) for 24
h in 5% CO2 incubator 39oC. Oocytes then fertilized with three kind of different frozen spermatozoa (X,Y and un-
sexing spermatozoa as control) for 14 h with final concentration 2x106 spermatozoa/mL. Embryos were cultured in
synthetic oviductal fluid (SOF) supplemented with essential and non essential amino acid and 0.3% bovine serum
albumin (BSA) for 96 h. Results of the experiments revealed that there was no significant difference (P>0.05) in the
fertilization ability (49.17%; 51.40%; 53.42%) for X, Y and control group, respectively. No significant difference
(P>0.05) in the number of embryos development (47.77%; 48.25%; 54.43%) for X, Y and control group, respec-
tively. Furthermore, only small number of embryos could pass development blockade (23.80%; 26.08%; 23.61%)
for X, Y and control spermatozoa with statistically no significant difference (P>0.05). It is concluded that sexed
spermatozoa separated by BSA gradient column had comparable fertilization ability with unsexing spermatozoa
and had ability to supported early embryonic development.
Keywords: bovine, embryo, in vitro, sexing, spermatozoa

Abstrak
Penelitian ini bertujuan mengkaji kemampuan fertilisasi dan perkembangan awal embrio sapi yang
diproduksi menggunakan semen beku sexing X dan Y hasil pemisahan menggunakan gradien bovine serum albu-
min (BSA) secara in vitro. Oosit sapi dikoleksi dari ovarium yang berasal dari rumah potong hewan (RPH) meng-
gunakan teknik pencacahan dan pembilasan (slicing dan flushing). Oosit dimaturasi pada medium tissue culture
medium (TCM) 199 yang disuplementasi dengan 10 IU/ml pregnant mare’s serum gonadotropin (PMSG), 10
IU/ml human chorionic gonadotropin (hCG) dan 10% fetal bovine serum (FBS) selama 24 jam dalam inkubator
5% CO2 dan suhu 39oC. Oosit selanjutnya difertilisasi menggunakan tiga jenis semen beku yang berbeda (sper-
matozoa sexing X, Y dan spermatozoa tanpa proses sexing (unsexing) sebagai Kontrol) selama 14 jam dengan
konsentrasi akhir yaitu 2x106 spermatozoa/mL. Kultur embrio dilakukan selama 96 jam menggunakan medium
synthetic oviductal fluid (SOF) yang disuplementasi dengan asam amino esensial dan non esensial serta 0.3%
bovine serum albumin (BSA). Hasil penelitian menunjukkan bahwa kemampuan fertilisasi pada perlakuan X dan
Y tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (P>0.05) dibandingkan Kontrol dengan persentase masing-masing
49.17%; 51.40%; 53.42%. Tingkat pembelahan embrio juga tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (P>0.05)
dengan persentase masing-masing 47.77%; 48.25%; 54.43% pada kelompok X, Y dan Kontrol. Lebih lanjut,

225
Alvien Nur Aini et al.

hanya sedikit embrio yang mampu melewati blokade perkembangan (23.80%; 26.08%; 23.61%) pada spermato-
zoa X, Y dan Kontrol yang secara statistik tidak berbeda nyata (P>0.05). Dapat disimpulkan bahwa spermatozoa
sexing hasil pemisahan gradien BSA mempunyai kemampuan fertilisasi yang sama dengan spermatozoa unsexing
serta tetap dapat mendukung perkembangan awal embrio in vitro.

Kata kunci: embrio, in vitro, pemisahan, spermatozoa, sapi

Pendahuluan pada pengencer semen, sehingga diharapkan mampu

mencegah terjadinya penurunan kualitas spermatozoa
Spermatozoa sexing merupakan salah satu hasil
setelah proses pemisahan. Afiati (2004) melaporkan
teknologi reproduksi yang dinilai sebagai alternatif
bahwa persentase spermatozoa hasil sexing gradien
yang menjanjikan dalam upaya efisiensi reproduksi
albumin diprediksi membawa kromosom X sebesar
untuk menghasilkan anak dengan jenis kelamin sesuai
80.88% dan Y sebesar 58.82% dengan motilitas
keinginan. Spermatozoa sexing telah diaplikasikan
sesudah proses sexing mencapai 75.00%. Lebih lanjut
untuk inseminasi buatan (IB) dan transfer embrio
dilaporkan oleh Kaiin et al. (2008) bahwa motilitas
dengan hasil bervariasi. Mari et al. (2011) melaporkan
spermatozoa sexing gradien kolom BSA 5-10%
bahwa persentase tingkat kebuntingan pada kuda
sesudah thawing tidak berbeda dengan spermatozoa
melalui teknik IB menggunakan spermatozoa sexing
unsexing yaitu 45% serta mampu menghasilkan
mencapai 47.6% serta pada sapi mencapai 52%
spermatozoa sexing dengan motilitas yang lebih
(Morotti et al. 2014). Lebih lanjut, Pellegrino et al.
tinggi pada gradien bawah. Persentase motilitas
(2016) melaporkan bahwa keberhasilan kebuntingan
tersebut masih memenuhi syarat sesuai standar SNI
melalui teknik transfer embrio sebesar 35.4%.
untuk keperluan inseminasi buatan (IB).
Teknik sexing spermatozoa dilakukan melalui
Pembuktian lebih lanjut tentang kemampuan
pemisahan kromosom X dan Y berdasarkan perbedaan
fertilisasi spermatozoa sexing dan kemampuannya
karakteristik morfologi, kandungan DNA, perbedaan
dalam mendukung perkembangan embrio secara in
protein makromolekul pada kedua kromosom serta
vitro belum banyak dilaporkan di Indonesia. Data
perbedaan berat dan pergerakan spermatozoa (Yan et
ini diperlukan untuk menjawab secara cepat potensi
al. 2006). Diperkirakan kandungan DNA spermatozoa
kesuburan dan keakuratan spermatozoa hasil sexing.
kromosom X adalah 3-5% lebih banyak dibandingkan
Oleh karena itu penelitian ini dilakukan untuk
dengan kromosom Y (Grant dan Chamley 2007;
mengetahui kemampuan fertilisasi spermatozoa hasil
Sureka 2013). Berdasarkan kriteria tersebut, maka
sexing dengan metode gradien BSA dalam mendukung
telah dikembangkan berbagai teknik pemisahan
kemampuan perkembangan embrio secara in vitro.
spermatozoa seperti metode flow cytometer (Blondin
et al. 2009; Jo et al. 2014), metode Gradien Percoll Materi dan Metode
(Machado et al. 2009; Villamil et al. 2012) serta metode
gradient BSA. Metode sexing menggunakan gradien Kemampuan Fertilisasi In Vitro Spermatozoa
Sexing
BSA dinilai efisien dan sederhana dibandingkan
dengan metode-metode lainnya. a. Seleksi dan Maturasi Oosit In Vitro
Teknik pemisahan spermatozoa dengan gradien Ovarium sapi diperoleh dari rumah potong
BSA dianggap tidak memanipulasi spermatozoa hewan (RPH) Bubulak Kotamadya Bogor. Ovarium
secara berlebihan, selain itu spermatozoa dipaparkan ditransportasikan ke Laboratorium menggunakan
pada medium BSA yang juga sering ditambahkan larutan NaCl 0.9% yang ditambahkan 100 IU/mL

226
 Kemampuan Fertilisasi Spermatozoa Sexing dan Perkembangan Awal Embrio Secara In Vitro pada Sapi

Penisilin (Sigma-Aldrich, USA) dan 0.1 mg/mL dan spermatozoa dilakukan selama 14 jam dalam
Streptomisin (Sigma-Aldrich, USA). Koleksi oosit inkubator CO2 5% dengan suhu 39 oC.
dilakukan dengan teknik pencacahan dan pembilasan
c. Evaluasi Tingkat Kemampuan Fertilisasi In
(slicing dan flushing) menggunakan Phosphate Buffer
Vitro
Saline (PBS) yang mengandung 5% Fetal Bovine
Tingkat kemampuan fertilisasi in vitro
Serum (FBS).
dievaluasi berdasarkan pada terbentuknya dua atau
Seleksi oosit dilakukan dibawah mikroskop
lebih pronukleus (PN). Oosit hasil fertilisasi pada
stereo berdasarkan kekompakan sel kumulus
masing-masing perlakuan didenudasi (dihilangkan sel
dan homogenitas sitoplasma. Oosit dimatangkan
kumulusnya), kemudian dibuat preparat dan difiksasi
menggunakan Tissue Culture Medium (TCM) 199
dalam larutan asam asetat dan ethanol absolut (1:3)
(Sigma, USA) yang disuplementasi dengan 10% FBS,
selama 48 jam, setelah itu dilakukan pewarnaan
10 IU/mL Pregnant Mare Serum Gonadotrophin
dengan 2% aceto orcein. Hasil pewarnaan diamati
(PMSG) (Kyoritsu Seiyaku, Tokyo, Japan), 10 IU/mL
di bawah mikroskop fase kontras (Olympus IX 70,
Human Chorionic Gonadotrophin (hCG) (Kyoritsu
Japan) terhadap jumlah PN yang terbentuk. Oosit
Seiyaku, Tokyo, Japan) dan 50 µg/mL Gentamisin
yang memiliki dua PN dianggap sebagai oosit yang
(Sigma-Aldrich, USA). Medium dibuat dalam
mengalami fertilisasi normal. Persentase tingkat
bentuk drop (100 µL) yang ditutup menggunakan
fertilisasi merupakan perbandingan antara jumlah
mineral oil (Sigma-Aldrich, USA) dalam petridish
oosit yang terfertilisasi dengan jumlah keseluruhan
steril (Nunclon, Denmark) untuk 10 hingga 15 oosit.
oosit yang difertilisasi.
Pematangan oosit dilakukan dalam inkubator 5% CO2
Tingkat Perkembangan Awal Embrio In Vitro
suhu 39 oC selama 24 jam.
Menggunakan Spermatozoa Sexing
b. Fertilisasi Oosit In Vitro
a. Seleksi, Maturasi dan Fertilisasi Oosit In Vitro
Fertilisasi in vitro dilakukan menggunakan
Proses seleksi, maturasi dan fertilisasi oosit in
spermatozoa sexing X dan Y sebagai perlakuan serta
vitro dilakukan seperti prosedur penelitian I.
spermatozoa unsexing sebagai Kontrol. Thawing
straw semen beku dilakukan pada air suhu 37oC b. Kultur Embrio In Vitro
selama 30 detik. Semen ditempatkan pada tabung Oosit hasil fertilisasi didenudasi sebagian
yang berisi medium fertilisasi (Suzuki et al. 2000) kumulusnya kemudian dipindahkan dalam drop
untuk menghilangkan pengencer melalui sentrifugasi medium kultur setelah dilakukan pencucian terlebih
dengan kecepatan 700g selama 8 menit, selanjutnya dahulu. Medium kultur yang digunakan adalah
bagian supernatan dibuang dan endapan spermatozoa Modified Synthetic Oviduct Fluid (mSOF) yang
diencerkan menggunakan medium fertilisasi dengan disuplementasi dengan 1% Minimum Essential
konsentrasi akhir 2x106 spermatozoa/mL (Lopez et Medium (MEM) (Sigma, M-7145), 2% Basal Medium
al. 2013; Muttaqin 2015). Medium fertilisasi yang Eagle (BME) (Sigma, B-6766), 50 µg/mL Gentamisin
berisi spermatozoa tersebut dibuat dalam bentuk drop (Sigma-Aldrich, USA) dan BSA 0.3%. Medium kultur
(100 µL). Oosit yang telah dimaturasi dipindahkan dibuat dalam bentuk drop (100 µL) dalam petridish
ke dalam drop medium fertilisasi sesuai perlakuan steril (Nunclon, Denmark) dan ditutup dengan mineral
(Spermatozoa sexing X, Y dan Kontrol) setelah oil (Sigma-Aldrich.Inc, M-8410). Kultur dilakukan
dilakukan pencucian terlebih dahulu. Inkubasi oosit selama 96 jam dalam inkubator CO2 5% suhu 39 oC.

227
Alvien Nur Aini et al.

c. Evaluasi Tingkat Perkembangan Awal secara keseluruhan diolah menggunakan program

Embrio In Vitro SPSS versi 15.
Pengamatan perkembangan embrio dilakukan
pada hari kedua (jam ke-48) dan hari keempat (jam Hasil dan Pembahasan
ke-96) kultur dibawah mikroskop stereo (Nikon
a. Kemampuan Tingkat Fertilisasi In Vitro
MSZ800) untuk melihat stadium perkembangan
Kemampuan tingkat fertilisasi dihitung
embrio. Pewarnaan aceto orcein 2% dilakukan
berdasarkan jumlah oosit yang berhasil membentuk
sebagai pembuktian jumlah sel embrio yang
dua pronukleus (2PN) atau lebih dari dua pronukleus
terbentuk, kemudian diamati di bawah mikroskop fase
(>2PN) seperti disajikan pada Gambar 1. Persentase
kontras (Olympus IX 70, Japan). Persentase tingkat
tingkat kemampuan fertilisasi disajikan pada Tabel
pembelahan embrio merupakan perbandingan antara
1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kemampuan
jumlah oosit yang membelah dengan keseluruhan
fertilisasi spermatozoa sexing tidak memperlihatkan
jumlah oosit yang diduga telah dibuahi.
perbedaan yang nyata (P>0.05) dengan persentase
49.17% (X); 51.40% (Y) dan 53.42% (Kontrol). Hal
Analisis Data
ini menunjukkan bahwa spermatozoa sexing masih
Persentase oosit yang terfertilisasi dan tingkat
memiliki kemampuan memfertilisasi oosit yang
perkembangan embrio pada setiap hari pengamatan
sama dengan spermatozoa unsexing. Spermatozoa
pada ketiga perlakuan dianalisis secara statistik
hasil sexing metode gradien BSA (perlakuan X dan
menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) pada
Y) diduga mempunyai kemampuan motilitas dan
taraf nyata 95%. Perbandingan jumlah embrio yang
integritas membran yang tetap baik berdasarkan
mampu melewati blokade perkembangan (16-32
kemampuan fertilisasi oosit. Salah satu faktor yang
sel) pada hari keempat juga dianalisis menggunakan
mendukung keberhasilan fertilisasi dinilai berdasarkan
analisis sidik ragam (ANOVA) pada taraf nyata 95%
kemampuan motilitas post thawing spermatozoa.
untuk melihat potensi oosit yang mampu berkembang.
Kaiin et al. (2008) melaporkan bahwa proses sexing
Perbedaan pada masing-masing perlakuan kemudian
menggunakan BSA mampu mempertahankan motilitas
dilakukan uji lanjut menggunakan uji Duncan’s
spermatozoa sexing post thawing sebesar 45%.
Multiple Range Test (DMRT). Data hasil penelitian

Gambar 1. Pembentukan pronukleus (PN). Oosit dengan dua pronukleus (2PN)

(A); Oosit dengan lebih dari dua pronukleus (>2PN) (B); Tanda panah
menunjukkan pronukleus; Perbesaran 200x.

228
 Kemampuan Fertilisasi Spermatozoa Sexing dan Perkembangan Awal Embrio Secara In Vitro pada Sapi

Tabel 1. Tingkat fertilisasi oosit in vitro menggunakan spermatozoa sexing

Prk Jmlh oosit Total terfertilisasi Pembentukan pronukleus (% ±SEM)

(% ±SEM)
Normal (2PN) Polispermia (>2PN)
K 83 53.42±1.9 52.37±1.9 1.04±1.0
X 84 49.17±1.7 46.46±1.5 2.70±1.7
Y 84 51.40±2.4 48.07±2.9 3.33±2.1

Berdasarkan pengamatan pembentukan b. Tingkat Perkembangan Awal Embrio In Vitro

pronukleus (Tabel 1), tingkat fertilisasi normal yang Keberhasilan perkembangan embrio secara
ditandai dengan terbentuknya 2PN pada spermatozoa in vitro menggunakan spermatozoa sexing X
sexing tidak menunjukkan perbedaan yang nyata dan Y hasil pemisahan gradien BSA ditentukan
(P>0.05). Hasil penelitian mengindikasikan berdasarkan persentase embrio yang membelah.
bahwa spermatozoa sexing X dan Y memiliki Stadium pembelahan embrio mulai dari 2 hingga
kemampuan yang sama untuk membuahi oosit. 32 sel hasil produksi secara in vitro disajikan dalam
Data ini juga menunjukkan bahwa proses sexing Gambar 2. Persentase tingkat pembelahan dan
dengan gradien BSA tidak mengurangi kemampuan stadium perkembangan awal embrio selama 96 jam
spermatozoa untuk melakukan pembuahan, disajikan pada Tabel 2 dan Tabel 3. Hasil penelitian
sehingga dinilai bahwa BSA sebagai medium yang ini menunjukkan bahwa kemampuan perkembangan
digunakan selama proses sexing tidak merusak dan stadium pembelahan embrio yang diproduksi
spermatozoa. Proses sexing spermatozoa metode secara in vitro tidak menunjukkan perbedaan yang
gradien BSA dilakukan menggunakan konsentrasi nyata (P>0.05) dengan persentase 47.77% (X);
BSA yang bertingkat, kemudian spermatozoa 48.25% (Y) serta 54.43% (Kontrol). Hasil penelitian
dibiarkan bergerak menembus gradien tersebut. ini didukung oleh laporan Underwood et al. (2010a)
Mekanisme sexing tesebut dinilai lebih sederhana bahwa proses sexing spermatozoa secara umum tidak
dibandingkan dengan metode lainnya seperti menyebabkan terjadinya penurunan perkembangan
flow cytometer. Hal ini dikarenakan spermatozoa embrio. Kemampuan perkembangan embrio tersebut
tidak terlalu banyak terpapar perlakuan selama mengindikasikan bahwa spermatozoa sexing yang
proses sexing sehingga mampu mempertahankan digunakan mempunyai daya fertilisasi yang baik.
motilitas dan mengurangi kerusakan morfologi Keberhasilan perkembangan oosit yang telah
spermatozoa. Dow dan Bavister (1989) melaporkan difertilisasi ditentukan berdasarkan kemampuannya
bahwa paparan spermatozoa pada medium yang untuk membelah dan melanjutkan perkembangan.
mengandung BSA selama lebih dari empat jam Inisiasi perkembangan awal embrio didukung oleh
dikhawatirkan menyebabkan terjadinya kapasitasi ketersediaan mRNA dan aktivitas transkripsi oleh
dan reaksi akrosom dini. Hal ini karena protein maternal sebelum aktivasi genom dimulai. Graf et
pada serum albumin dapat mengikat kolesterol al (2014b) menyatakan bahwa aktivasi genom pada
dan ion zinc pada membran plasma spermatozoa embrio sapi dimulai pada stadium pembelahan 8
yang menyebabkan kehilangan kolesterol sehingga hingga 16 sel. Sintesis protein baru sebagai penanda
mengakibatkan membran menjadi tidak stabil dan dimulainya aktivasi genom pada embrio sapi mulai
meningkatkan fluiditas membran (Breitbart 2003). terjadi pada stadium pembelahan 4 hingga 8 sel.

229
Alvien Nur Aini et al.

Gambar 2. Embrio sapi tahap 2-32 sel yang diproduksi secara in vitro; tahap pembelahan 2
sel (A); 4 sel (B); 8 sel (C); 16 sel (D) dan 32 sel (E); perbesaran 200x.

Tabel 2. Tingkat pembelahan dan perkembangan embrio sapi yang diamati secara morfologi pada hari kedua
kultur in vitro
Prk Jmlh Tingkat pembelahan Perkembangan awal embrio n (% ± SEM)
embrio (rata-rata% ±SEM)
Pengamatan hari kedua
2 sel 4 sel 8 sel
K 86 47(54.43 ± 2.3) 16(36.30±12.5 ) 24(49.10 ±6.7) 7(14.58 ±8.1)
X 88 42(47.77 ± 1.6) 17(37.18 ±5.3) 22(54.76 ±6.1) 3(8.05 ±4.0)
Y 87 41(48.25 ± 2.8) 14(32.60 ±10.1) 20(49.36 ±8.6) 7(18.03±6.7)

Tabel 3. Tingkat perkembangan embrio sapi yang diamati secara morfologi dan pewarnaan pada hari keempat
kultur in vitro
Prk Perkembangan awal embrio n (% ± SEM)
Pengamatan hari keempat
2 sel 4 sel 8 sel 16 sel 32 sel
K 2(4.76 ±4.7) 17(38.39 ±7.8) 17(33.23 ±8.8) 8(17.36 ±6.8) 3(6.25±2.9)
X 2(6.11 ±3.8) 18(37.22 ±10.2) 14(32.85 ±8.7) 8(23.80 ±11.0) 0(0.00 ±0.0)
Y 0(0.00 ±0.0) 16(35.77 ±12.0) 15(38.14 ±11.5) 9(22.75 ±3.6) 1(3.33 ±3.3)

Transisi dari maternal ke embrio ditandai dengan embrio melakukan transkripsi mRNA serta tidak
aktifnya transkripsi oleh genom embrio karena mRNA lagi bergantung pada maternal genom (Graf et al.
maternal dan protein yang tersimpan pada oosit 2014a). Mengacu pada uraian diatas, hasil penelitian
mengalami degradasi (Graf et al. 2014a). Apabila menunjukkan bahwa persentase embrio yang mampu
terjadi kegagalan proses tersebut maka menyebabkan melewati blokade perkembangan (stadium pembelahan
hambatan ekspresi gen sehingga embrio tidak 16 hingga 32 sel) menunjukkan perbedaan yang tidak
mampu mengalami pembelahan lebih lanjut. Selama nyata (P>0.05) (Tabel 4) pada ketiga perlakuan. Data
masa transisi tersebut, nukleus memprogram tersebut menunjukkan hanya sekitar 23-26% embrio
aktivasi proses transkripsi oleh genom embrio yang yang mampu melewati blokade perkembangan dari
sebelumnya mengalami inaktivasi. Keberhasilan keseluruhan embrio yang berhasil membelah sehingga
aktivasi genom ditandai dengan kemampuan diharapkan mampu berkembang ke tahap blastosis.

230
 Kemampuan Fertilisasi Spermatozoa Sexing dan Perkembangan Awal Embrio Secara In Vitro pada Sapi

Tabel 4. Rekapitulasi persentase embrio yang Ucapan Terima Kasih

berhasil melewati blokade perkembangan
Ucapan Terima Kasih disampaikan kepada
Prk Tingkat pembelahan embrio 8 s/d 32 sel
(% ± SEM) Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan
K 23.61 ± 9.2 Tinggi yang telah memberikan Beasiswa Program
X 23.80 ± 11.0 Fresh Graduate Pendidikan Pascasarjana Dalam
Y 26.08 ± 4.5 Negeri (BPP-DN) Tahun 2014 serta kepada Lembaga
Keterangan: Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) yang telah
Prk : Perlakuan
memberikan dukungan dana penelitian pada Program
K : Kontrol (Spermatozoa unsexing)
X : Spermatozoa sexing X Beasiswa Pendidikan Tesis dan Disertasi Periode II
Y : Spermatozoa sexing Y
Tahun 2016.
Rendahnya angka perkembangan embrio
yang diperoleh disebabkan oleh beberapa faktor Daftar Pustaka
antara lain kualitas oosit (Lonergan dan Fair 2008)
Afiati F. (2004). Proporsi dan karakteristik
serta sistem kultur yang digunakan (Nedambale
spermatozoa X dan Y hasil separasi kolom
et al. 2006; Underwood et al. 2010b; Setiadi dan albumin. Media petern 27(1):16-20.
Karja 2013). Lebih lanjut, Meirelles et al. (2004)
Blondin, P., Beaulieu, M., Fournier, V., Morin, M.,
melaporkan bahwa rata-rata laboratorium kehilangan Crawford, L., Madan, P and King, W.A.. (2009).
60-70% kemampuan oosit yang berhasil difertilisasi Analysis of bovine sexed sperm for IVF from
sorting to the embryo. Theriogenology 71:30-38.
untuk berkembang menjadi embrio. Hal ini karena
oosit yang digunakan untuk produksi embrio secara Breitbart H. 2003. Signaling pathways in sperm
in vitro dikoleksi dari ovarium yang pada umumnya capacitation and acrosome reaction. Cell Mol
Biol . 49(3):1-7.
berasal dari individu yang berbeda, sehingga terjadi
variasi kemampuan untuk berkembang menjadi Dow MP, Bavister BD. 1989. Direct contact is
required between serum albumin and hamster
embrio lebih lanjut. Oleh karena itu diperlukan spermatozoa for capacitation in vitro. Gamete
kemampuan teknik pemilihan oosit yang lebih Res. 23:171-180.
cermat sehingga mampu menghasilkan embrio
Graf, A., Krebs, S., Heininen-Brown, M., Zakhartchenko,
dengan kualitas baik supaya mampu melakukan V., Blum, H. and Wolf, E. (2014a). Genom
aktivasi genom untuk mendukung perkembangan activation in bovine embryos: review of the
literature and new insights from RNA sequencing
dan kelangsungan hidupnya (Meirelles et al. 2004). experiment. Anim Reprod Sci 149:46-58.

Graf, A., Krebs, S., Heininen-Brown, M.,

Kesimpulan Zakhartchenko, V., Blum, H. and Wolf, E.
(2014b). Fine mapping of genome activation
Berdasarkan hasil penelitian dapat in bovine embryos by RNA sequencing. Dev
disimpulkan bahwa spermatozoa sexing metode Biol 111 (11): 4139-4144.
gradien BSA mempunyai kemampuan fertilisasi
Grant, V.J. and Chamley, L.W. (2007). Sex sorted
dan mendukung perkembangan embrio yang sama sperm and fertility: An alternative view. Biol
dengan spermatozoa unsexing. Masih diperlukan reprod 76:184-188.

penelitian lebih lanjut untuk mengevaluasi ketepatan Jo, H.T., Bang, J.I., Kim, S.S., Choi, B.H., Jin, J.I.,
jenis kelamin embrio yang diproduksi secara in vitro Kim, H.L., Jung, I.S., Suh, T.K., Ghanem, N.,
Wang, Z. and Kong, I.K. (2014). Production
menggunakan spermatozoa sexing X dan Y.

231
Alvien Nur Aini et al.

of female bovine embryos with sex-sorted thawed in vitro produced blastocysts following
sperm using intracytoplasmic sperm injection: culture in defined medium supplemented with
Efficiency and in vitro developmental β-mercaptoethanol. Anim Reprod Sci 93:61-75.
competence. Theriogenology 81:675-682.
Pellegrino, C.A.G., Morotti. F., Untura, R.M.,
Kaiin, E.M., Said, S. dan Tappa, B. (2008). Kelahiran Pontes, J.H.F., Pellegrino, M.F.O., Campolina,
anak sapi hasil fertilisasi secara in vitro J.P., Seneda, M.M., Barsosa, F.A. and Henry,
dengan sperma hasil pemisahan. Media Petern M. (2016). Use of sexed sorted semen for
31(1):22-28. fixed time artificial insemination or fixed tima
embryo transfer of in vitro produced embryos
Lonergan, P. and Fair, T. (2008). In vitro produced in cattle. Theriogenology xxx: 1-6.
bovine embryos- Dealing with the warts.
Theriogenology 69:17-22. Setiadi, M.A. dan Karja, N.W.K. (2013). Tingkat
perkembangan awal embrio sapi in vitro
Lopez, S.R., Souza, J.Cd., Gonzalez, J.Z., Sanchez, menggunakan media tunggal berbahan dasar
A.D.O., Aguirregomezcorta, J.R., Carvalho, tissue culture medium (TCM) 1999. J Ked
R.R.de. and Rath, D. (2013). Use of sex sorted Hewan 7(2):150-154.
and unsorted frozen/thawed sperm and in vitro
fertilization events in bovine oocytes derived Sureka, P., Nilani, K., Eswaramohan, T. and
from ultrasound-guided aspiration. J R Bras Balasubramaniam, K. (2013). Sex pre-selection
Zootec 42(10):721-727. by quantification of Y chromosome bearing
spermatozoa in goat species. International
Machado, G.M., Carvalho, J.O., Filho, E.S., Caixeta, Journal of Scientific and Research Publications
E.S., Franco, M.M., Rumpf, R. and Dode, 3(1):1-4.
M.A.N. (2009). Effect of percoll volume,
duration and force of centrifugation, on in vitro Suzuki, K., Eriksson B., Shimizu H., Nagai T. and
production and sex ratio of bovine embryos. Rodriguez-Martinez H (2000). Effect of
Theriogenology 71:1289-1297. hyaluronan on monospermic penetration of
porcine oocytes fertilized in vitro. Int J Androl
Mari, G., Catagnetti, C., Rizzato, G., Mislei, B., 23: 13-21.
Lacono, E and Merio, B. (2011). Density
gradient centrifugation of sperm from subfertile Underwood, S.L., Bathgate, R., Maxwell, W.M.C.
stallion and effect on seminal plasma addition and Evans, G. (2010a). Birth of offspring after
on fertility. Anim Reprod Sci 126: 96-100. artificial insemination of heifers with frozen
thawed, sex sorted, refrozen thawed bull
Meirelles, F.V., Caetano, A.R., Watanabe, Y.F., sperm. Anim Reprod Sci 118:171–175.
Ripamonte, P., Carambula, S.F., Merighe,
G.K. and Garcia, S.M. (2004). Genome Underwood, S.L., Bathgate, R., Pereira, D.C.,
activation and developmental block in bovine Castro, A., Thomson, P.C., Maxwell, W.M.C.
embryos. Anim Reprod Sci 82-83:13-20. and Evans, G. (2010b). Embryos production
after in vitro fertilization with frozen thawed,
Morotti, F., Sanches, B.V., Pontes, J.H.F., Basso, sex sorted, re frozen thawe bull sperm.
A.C., Siqueira, E.R. and Lisboa, L.A. (2014). Theriogenology 73:97-102.
Pregnancy rate and birth rate of calves from a
large-scale IVF program using reverse-sorted Villamil, P.R., Wei, H., Moreira, G., Caccia,
semen in Bos indicus, Bos indicus-taurus and M., Taranco, M.F. and Bo, G.A. (2012).
Bos taurus cattle. Theriogenology 81: 696:701. Fertilization rate and in vitro embryo
production using sexed or non sexed semen
Muttaqin, Z., Karja, N.W.K. dan Setiadi, M.A. selected with silane-coated silica colloid or
(2015). Kemampuan maturasi dan fetilisasi percoll. Theriogenology 78:165-171.
oosit sapi yang diseleksi menggunakan teknik
pewarnaan Brilliant Cresyl Blue. J Veteriner Yan, J., Feng, H.L., Chen, Z.J., Jingmei, H., Xuan, G.
16(2):242-248. and Yingying, Q. (2006). Influence of swim-up
on the ratio of X and Y bearing spermatozoa.
Nedambale, T.L., Du, F., Yang, X. and Tian, X.C. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 129: 150-
(2006). Higher survival rate of vitrified and 154.

232