LECTURE 3:

ENZYME KINETICS
V0
V0 = Vmax

V
½Vmax

k1 k3
E+S ES E+P
k2

KM [S]
As [S] increases, kinetic behavior changes
from 1st order to zero-order kinetics

Figure 13.7 Substrate saturation curve for

an enzyme-catalyzed reaction.
 The Michaelis-Menten Equation is the
Fundamental Equation of Enzyme Kinetics

 Louis Michaelis and Maud Menten's theory.

 It assumes the formation of an enzyme-substrate
complex.
 It assumes that the ES complex is in rapid
equilibrium with free enzyme.
 Breakdown of ES to form products is assumed to
be slower than 1) formation of ES and 2)
breakdown of ES to re-form E and S.
 Briggs and Haldane later introduced the steady
state assumtion.
 Kinetika enzim

 Kinetika reaksi yang dikatalisis enzim (laju reaksi tergantung

pada kondisi reaksi) ditentukan terutama oleh sifat katalis
 Reaksi tersebut lebih komplek daripada kinetika reaksi yang
tidak dikatalisis
 Tanpa enzim, laju reaksi (v) proporsional dengan konsentrasi
substrat ([A])
 Konstanta (k) adalah konstanta laju dari reaksi yang tidak
dikatalisa
 Reaksi yang dikatalisis enzim
 Sebagaimana semua katalis,
enzim E (konsentrasi total [E]t)
menghasilkan jalur reaksi baru.
 Pada tahap awal, substrat (A)
terikat pada E.
 Apabila reaksi tersebut dalam
kesetimbangan kimiawi, dengan
bantuan hukum aksi massa
maka [E]t = [E] + [EA]— dimana
konsentrasi enzim substrat [EA]
sebagai fungsi dari [A].
 Uncatalyis vs
catalysis
 kcat > k—in other words,
enzyme-bound substrate reacts
to B much faster than A alone
(partial reaction 2, right).
 kcat, the enzyme’s turnover
number, corresponds to the
number of substrate molecules
converted by one enzyme
molecule per second.
 Like the conversion A  B, the
formation of B from EA is a first-
order reaction—i. e., v = k.[EA]
applies
 The Michaelis-Menten Equation is the
Fundamental Equation of Enzyme Kinetics
k1 k2
E+S ES E+P
k-1

E = enzyme concentration.
S = Substrate concentration.
ES = Enzyme-substrate complex concentration
(noncovalent).
P = product concentration.
k1 = rate constant for formation of ES from E + S.
k-1 = rate constant for decomposition of ES to E + S.
k2 = rate constant for decomposition of ES to E + P.
 Development of the Michaelis-Menton
Equation
k1 k2
E+S ES E+P
k-1

1. The overall rate of product formation: v = k2 [ES]

2. Rate of formation of [ES]: vf = k1[E][S]
3. Rate of decomposition of [ES]:
vd = k-1[ES] + k2 [ES]
4. The steady state assumption requires that:
Rate of ES formation = Rate of ES decomposition
5. So: k1[E][S] = k-1[ES] + k2 [ES]
 Michaelis-Menton Derivation

6. In solving for [ES], use the enzyme balance to

eliminate [E]. ET = [E] + [ES]
7. k1 (ET - [ES])[S] = k-1[ES] + k2 [ES]
k1 ET[S] - k1[ES][S] = k-1[ES] + k2 [ES]
8. Rearrange and combine [ES] terms:
k1 ET[S] = (k-1 + k2 + k1 [S])[ES]
k1 ET[S]
9. Solve for [ES] = -----------------------
(k-1 + k2 + k1 [S])
 Michaelis-Menton Derivation

ET[S]
10. Divide through by k1: [ES] = -----------------------
(k-1 + k2)/k1 + [S]
11. Defined Michaelis constant: KM = (k-1 + k2) / k1
12. Substitute KM into the equation in step 10.
13. Then substitute [ES] into v = k2 [ES] from step1
and replace Vmax with k2 ET to give:

Vmax[S]
vo = -----------
KM + [S]
[ES] Remains Constant Through Much of
the Enzyme Reaction Time Course

Figure 13.8
Time course for a typical
enzyme-catalyzed reaction
obeying the Michaelis-Menten,
Briggs-Haldane models for
enzyme kinetics. The early
state of the time course is
shown in greater magnification
in the bottom graph.
There are a wide range of KM, Vmax , and
efficiency seen in enzymes

But how do we analyze kinetic data?

The double reciprocal plot

1  KM  1 1
   
vo  Vmax  S Vmax
 Lineweaver-Burk plot: slope = KM/Vmax,
1/vo intercept is equal to 1/Vmax
the extrapolated x intercept is equal to -1/KM

For small errors in at low [S] leads to large errors

in 1/vo
kcat is how many reactions an
enzyme can catalyze per
Vmax
kcat  second

ET The turnover number

For Michaelis -Menton kinetics k2= kcat
When [S] << KM very little ES is formed and [E] =
[E]T
and vo 
k2
ET S  ES
k cat
KM KM
Kcat/KM is a measure of catalytic efficiency
 What is catalytic perfection?
k1k 2
When k2>>k-1 or the is maximum
ratio k 1  k 2

kcat Or when every substrate that hits

Then
 k1 the enzyme causes a reaction to
KM take place. This is catalytic
perfection.
Diffusion-controlled limit- diffusion rate of a
substrate is in the range of 108 to 109 M-1s-1. An
enzyme lowers the transition state so there is no
activation energy and the catalyzed rate is as
fast as molecules collide.
 PENDEKATAN LAIN
 Linierisasi persamaan
Modifikasi persamaan ke bentuk linier
sehingga dapat dianalisis dengan
mudah
1. Persamaan “double-reciprocal”
atau “Lineweaver-Burk”
2. Persamaan “Eadie-Hofstee”
3. Persamaan “Hanes-Woolf”
 Persamaan “double-reciprocal”
atau “Lineweaver-Burk”
Vmax [S]
V
KM  [S]
 Jika ruas kiri dibalik dan demikian juga ruas kanan,
maka
1 KM 1 1
 . 
V Vmax [S] Vmax

 Sekarang persamaan ini akan mudah dianalisis

dengan metode linier sedehana
 Sekarang
y = 1/V ; x = 1/[S]
a = 1/Vmax ; b = KM/Vmax
dapat dianalisis dengan y = a + bx
Jika 1/V dihubungkan
dengan 1/[S], suatu
garis lurus akan 1/V
dihasilkan yang KM/Vmax
memotong sumbu y
pada 1/Vmax dan
sumbu x pada -1/KM
serta membentuk 1/Vmax
sudut terhadap sumbu -1/KM
x sebesar KM/Vmax.

1/[S]
Persamaan “Eadie-Hofstee”
Vmax [S]
V
KM  [S]
V ( K M  [ S ])  V max [ S ]
V[S]  VK M  Vmax [S]
 VK M  Vmax [S]
V
[S]

V
V  K M  Vmax
[S]
 Sekarang
y = V ; x = V/[S]
a = Vmax ; b = -KM
dapat dianalisis dengan y = a + bx
Vmax
Jika V dihubungkan
dengan V/[S], suatu garis
lurus akan dihasilkan yang V
memotong sumbu y pada
Vmax dan sumbu x pada KM
Vmax/KM serta
membentuk sudut
terhadap sumbu x sebesar Vmax/KM
KM

V/[S]
Persamaan “Hanes-Woolf”
Vmax [S]
V
KM  [S]
V(K M  [S])  Vmax[S]
[S] K M  [S]

V Vmax
[S] KM 1
  .[S]
V Vmax Vmax
[S] K M 1
  .[S]
V Vmax Vmax
 Sekarang
y = [S]/V ; x = [S]
a = KM/Vmax ; b = 1/Vmax
dapat dianalisis dengan y = a + bx
 Jika [S]/V dihubungkan
dengan [S], suatu garis
lurus akan dihasilkan [S]/V
yang memotong sumbu 1/Vmax
y pada KM/Vmax dan
sumbu x pada -KM serta
membentuk sudut
KM/Vmax
terhadap sumbu x
-KM
sebesar 1/Vmax.
[S]
STEPS OF MODEL DERIVATION
 STEPS OF MODEL DERIVATION
1. Pembentukan ES adalah inti dari hipotesis
tersebut
k1 k3
E+S ES E+P (1)
k2 k4
1. Reaksi E dengan S terjadi dengan kecepatan
k1 dan menghasilkan kompleks ES (enzim-
substrat)
2. Kompleks ES dapat berubah menjadi E dan S
bebas kembali dengan kecepatan k2, atau
menjadi E dan P dengan kecepatan k3.
4. Jika k3  k4 , maka reaksi bersifat
“irreversible”, sehingga produk P tidak ada
yang diubah kembali menjadi substrat asal dan
k4 dapat diabaikan.
5. Suatu hal penting yang perlu diingat adalah
bahwa konstanta k1, k2, k3 dan k4 proporsional
dengan G aktivasi substrat dari reaksi yang
bersangkutan
6. Pada [S] yang rendah, kebanyakan enzim
berada dalam bentuk bebas, sehingga
penambahan S akan langsung terikat dengan
E dan diubah menjadi P dengan demikian
kecepatan awal proporsional dengan
peningkatan [S]
7. Pada [S] yang lebih tinggi, kecepatan reaksi
bervariasi dengan peningkatan [S] karena
enzim mulai mengalami kejenuhan
8. Pada [S] yang tinggi, semua enzim dijenuhi
oleh substrat dan karenanya berada dalam
bentuk kompleks ES
9. Jadi enzim dalam suatu reaksi dapat berada
dalam keadaan bebas dan terikat dengan
substrat, sehingga total enzim secara
matematis adalah

[E]0 = [E]+[ES] (2)

10. Penurunan persamaan Michaelis-Menten
tergantung pada asumsi yang disebut
”Briggs-Haldane Steady-State”
11. Keadaan "steady state" adalah suatu
keadaan dimana konsentrasi intermediat
(perantara) ES tetap konstan, sementara
konsentrasi substrat dan produk berubah
12. Keadaan demikian terjadi apabila
kecepatan pembentukan ES sama dengan
kecepatan peruraian ES
13. Keadaan “steady” dapat dinyatakan
secara matematis seperti dengan
persamaan berikut
[ES]/t = 0 (3)
dimana t = waktu (menit)
14. Pernyataan [ES]/t dapat ditulis dari
sudut konstanta dan konsentrasi pers (1)
yaitu
Kecepatan pembentukan ES
ES = k1[E][S] (4a)
 Kecepatan peruraian ES

ES = (k2 + k3) (ES) (4b)

15. Dalam keadaan "steady state" kedua
persaman (4a) dan (4b) adalah sama,
sehingga

[ES]/t = k1[E][S]-(k2+k3)(ES) = 0
(5)
16. Subsitusi E dari pers (2) kedalam pers (5)
menghasilkan
(2) [E]0 = [E]+[ES] [E] = [E]0-[ES]
(5) [ES]/t = k1[S][E]-(k2+k3)(ES)
k1[S][E] = k1[S]([E]0-[ES])
= k1[S][E]0-k1[S][ES]

Hence
k1[S][E]0-k1[S][ES] - (k2+k3)(ES) = 0
k1[S][E]0–(k1[S]+k2+k3)[ES]=0 (6)
17. Pengaturan persamaan lebih lanjut
(k1[S]+k2+k3)[ES] = k1[S][E]0
(7)

18. Persamaan ini dapat dimodifikasi dengan cara

ruas kanan dibagi dengan k1[S],
[E]0
[ES]  (8)
1  (k 2  k 3 ) / k1[S]
19. Karena k1, k2, dan k3 adalah konstanta, maka
ketiga konstanta ini dapat dijadikan satu
konstanta yaitu (k2 + k3 )/k1 = KM yang dikenal
sebagai konstanta Michaelis-Menten
20. Untuk kebanyakan enzim k3  k2, sehingga KM akan
mendekati (k2 + k1), sedang (k2 + k3 )/ k1 adalah Ks
(konstanta dissosiasi kompleks enzim-substrat).
21. Jika KM, yang merupakan ukuran affinitas enzim akan
substrat, disubsitusikan kedalam pers (8), maka
[E]0
[ES]  (9)
1  (K M /[S])
22. Kecepatan reaksi katalisis dapat dinyatakan dengan
jumlah produk yang tebentuk per satuan waktu yaitu
produk dari konsentrasi kompleks ES dengan kapasitas
katalisis enzim k3 (turnover number).

[P]
V  k 3[ES] (10)
t
23. Subsitusi [ES] dari pers. (10) ke dalam pers (9)
memberikan
k 3 [ E ]0
V (12)
1  (K M /[S])
24. Pada keadaan E dijenuhi S yang berarti semua
enzim terikat dengan substrat dalam kompleks
ES, maka V = Vmax = k3[E]0. Kemudian
persamaan diatas dapat ditulis dalam bentuk
berikut.

Vmax Vmax [S]

V
1  ( KM / [S]) atau V  K  [S] (13)
M
25. Persamaan diatas dikenal sebagai persamaan
Michaelis-Menten yang digunakan secara luas
26. Stoikiometri pers (13) didasarkan atas satu
substrat dan satu produk (uni-uni), sementara
banyak reaksi enzimatis yang melibatkan
stoikiometri yang lebih kompleks seperti berikut;

S  P1 + P2 (Ui-Bi)
S1 + S2  P (Bi-Uni)
S1 + S2  P1 + P2 (Bi-Bi)
27. Tetapi, persamaan Michaelis-Menten berlaku
untuk reaksi yang lebih kompleks sekalipun
dengan mekanisme yang berbeda.
FIG. 2. Overall structure of Rubisco from C. reinhardtii. The view is down the local
4-fold axis. The L subunits are depicted in two shades of gray, and the S subunits are
in yellow. The S subunit A-B loops are shown in red. The inset shows a close-up view
of the same region in the Spinacia enzyme with the same color coding. Pictures were
produced with MOLSCRIPT (41) modified by Esnouf (42) and rendered with
RASTER3D (43). Taylor et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 48159–48164
Web Figure 8.3.A A model for the structure of rubisco in chloroplasts
from higher plants. Rubisco consists of 8 large (L) and 8 small (S) subunits
arranged as 4 dimers. Small subunits are shown in red (only four of the
small subunits are seen), large subunits are shown in blue and green, in
order to show the boundaries of the dimers. (From Malkin and Niyogi
2000.) (Click image to enlarge.)