UNIVERSIDAD EL BOSQUE

GUÍAS DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA

Estructura del Pre-informe

El pre-informe es una actividad realizada individualmente por el estudiante, en el cuaderno de
laboratorio, debe elaborarse previamente a la sesión de laboratorio y está compuesto por los
siguientes componentes:

• Título.
• Objetivos de la práctica.
• Desarrollo de las preguntas de aprendizaje.
• Procedimientos plasmados por medio de diagramas de flujo.
• Bibliografía consultada.

Estructura del informe

El informe es una actividad desarrollada por el estudiante o grupo de trabajo. Será entregado como
un documento a través del Aula Virtual. Esta constituido por los siguientes componentes:

• Título de la Práctica.
• Lugar de realización.
• Fecha de realización de la práctica.
• Nombre de los integrantes del grupo (si aplica).
• Procedimientos.
• Resultados en tablas de datos, gráficas y observaciones.
• Cálculos (si aplica).
• Análisis de resultados.
• Conclusiones.
• Bibliografía según normas APA.
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Primera Sesión: Alistamiento de material y Esterilización

Introducción:

El control microbiano en la práctica farmacéutica, cosmética o alimentaria es un requisito

fundamental que propende por garantizar la idoneidad de los productos generados en estas
industrias. Es fundamental para el Químico Farmacéutico conocer la manera adecuada de garantizar
la idoneidad microbiana de los materiales utilizados en la fabricación y muestreo de productos y
áreas.

Objetivos:

• Reconocerán los diferentes pasos del proceso de esterilización por calor húmedo.
• Conocerán la manera apropiada de empacar los materiales que deben esterilizarse por calor
húmedo.
• Aprenderán a elaborar medios de cultivo para muestreo microbiológico.

Tareas de aprendizaje para el pre-informe:

• ¿Cuál es el fundamento de la esterilización por calor húmedo?

• ¿Qué recomendaciones deben tenerse en cuenta para poder esterilizar adecuadamente los
materiales dentro de la autoclave?
• ¿De que manera se puede garantizar que el proceso de esterilización por calor húmedo se ha
realizado adecuadamente?

Materiales:

Solución detergente (Dextran)

HCl concentrado
Escobillones de lavado, esponjas.
Agua de llave
Agua destilada
Papel Kraft
Cinta de papel
Marcador
Algodón
Gasa
Tijeras
Hisopos de algodón
Cinta indicadora de esterilidad.

Lavado

1. Limpieza general u ordinaria

a. Colocar el material en recipientes que contengan soluciones detergentes apropiadas (de

preferencia usar Dextrán), procurando que el material quede totalmente sumergido; para
eliminar materia orgánica, dejar actuar durante 24 horas, si el material tiene sales someterlo
a un ligero calentamiento con HCl concentrado por espacio de 30 minutos,
b. Lavar el material con la solución detergente, auxiliándose de escobillones en buen estado y
de esponjas de celulosa o estropajos. No usar limpiadores abrasivos.
c. Enjuagar con abundante agua de la llave y al final con agua destilada por lo menos tres
veces.
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2. Preparación del material

a. Envolver con papel Kraft las cajas de Petri (2 por estudiante) como lo indique el profesor,
colocar el indicador de esterilidad, anotar en el papel el número de equipo y fecha de
preparación.
b. Poner en la boquilla de las pipetas un filtro de algodón, de tal manera que el aire pase
libremente a través de esta.
c. Envolver con papel Kraft cada pipeta (1 pipeta de 10 mL y 1 pipeta de 1 mL
independientemente por estudiante), marcando en la envoltura el volumen de cada una de
ellas y la dirección en la que se debe romper la envoltura, así como el número de equipo y
fecha de preparación. Colocar el indicador de esterilidad.
d. Abrir un cuarto de giro las tapas de los tubos de ensayo y colocar los tubos en un cesto de
alambre o en un bote y cubrirlos con papel Kraft (3 tubos por estudiante).
e. Envolver con papel Kraft los hisopos, marcando en la envoltura la dirección en la que se
debe romper la envoltura, así como el número de equipo y fecha de preparación. Colocar el
indicador de esterilidad (4 hisopos por estudiante, envolverlos por pares).
f. Todo el material debe ser identificado con su correspondiente etiqueta.

3. Preparación de medios de cultivo

La cantidad de medio de cultivo que deberá de emplearse por litro está especificada en cada frasco,
se hacen los cálculos necesarios para las cantidades deseadas y a continuación se pesan.

Colocar el polvo en un matraz Erlenmeyer y añadir poco a poco el agua destilada; agitando
constantemente para evitar que se formen grumos; para efectuar la agitación se utiliza un agitador o
varilla de vidrio; la cantidad completa de agua se añade cuando todo el polvo se haya mojado bien;
los medios líquidos o caldos se disuelven bien a temperatura ambiente.

Los medios de agar tienen que calentarse hasta punto de ebullición para que se disuelvan por
completo. Esto puede realizarse de varias formas; el mejor procedimiento es calentar el matraz
manteniendo contenido bien agitado para impedir que se queme.

Otro método satisfactorio que reduce el tiempo de calentamiento del medio es hervir tres cuartas
partes de agua destilada y suspender el medio deshidratado en el resto de agua fría, teniendo
cuidado de que todo el medio sea suspendido uniformemente, entonces la suspensión se añade al
agua hirviendo hasta que la solución sea completa; también debe tenerse cuidado de que la
ebullición no sea demasiado fuerte y en un momento dado pueda ocasionar que el medio se derrame.

Los medios de agar y gelatina tienen que estar en una completa solución antes de verterlos en los
recipientes en los que habrán de esterilizarse.

Cuando se logra la disolución completa de los medios se prepara una torunda de algodón y gasa
para el matraz en el cual se encuentra contenido el medio, se introduce en la autoclave para
esterilizarlos; previamente marcados para su identificación.

Los medios de cultivo de agar están propensos a mostrar un precipitado, bajo una esterilización o
calentamiento prolongado. La repetida fusión del agar solidificado o el mantenerlo en fusión a alta
temperatura pueden, así mismo, causar la formación de un precipitado en el medio de cultivo.

Un medio que contenga agar también puede formar un precipitado floculante si el medio líquido se
mantiene en un baño de agua (baño María), a una temperatura de 43 a 45 oC, por un tiempo superior
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a los 30 min. Este precipitado de agar floculante, no obstante, puede disolverse calentando de nuevo
el medio.

Un calentamiento del medio también da como resultado un aumento de la acidez. Por un

calentamiento prolongado es posible destruir las propiedades de gelatinización y esta destrucción se
acelera a medida que se aumenta la acidez.

Cumplido el tiempo necesario para la esterilización se saca de la autoclave e inmediatamente se

coloca en los recipientes adecuados. Las cajas de Petri y los tubos de ensayo estériles se destapan
cerca de la flama de un mechero y se le agrega el medio para evitar cualquier contaminación.

4. Esterilización

Esterilización por calor húmedo (15 lb, 121 ºC, 15 a 20 minutos)

a. Este proceso se aplica al material que no resiste temperaturas arriba de135° C (material de vidrio
con torunda de algodón, jeringas desarmadas –no agujas-, recipientes con tapón de rosca –no
cerrados fuertemente-, tapones de hule envueltos en papel).

b. Todo material para tratar en forma individual o conjunta debe cubrirse perfectamente con
material permeable, resistente al calor, no debe usarse papel aluminio o celofán.

c. Operar el esterilizador (autoclave) de acuerdo con las instrucciones del equipo. De manera
general el procedimiento es el que se indica a continuación: meter el material en la autoclave,
cerrarla, dejar calentar con la válvula abierta y esperar a que el aire del interior de la autoclave
sea desplazado totalmente por el vapor de agua, lo que se habrá conseguido cuando a través
de la válvula salga una columna continua de vapor de agua. Cerrar la válvula y esperar a que la
presión suba hasta 15 lb/in2 (15 psi) y una temperatura de 121 °C. Mantener estas condiciones
de 15 a 20 minutos (condiciones generales requeridas para esterilizar el material).
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Segunda Sesión: Toma de muestras de área de trabajo (mesones,

manos, ambiente)
Introducción:

En contexto de las Buenas Prácticas de Manufactura, es indispensable para el Químico

Farmacéutico entender la importancia del control microbiológico en las áreas de producción y la
higiene adecuada de las personas que intervienen en el proceso de producción de lo productos
farmacéuticos, cosméticos y alimenticios.

Objetivos:

• Aprender conceptos de aseo de áreas de aseo e higiene en las plantas de producción de

medicamentos, cosméticos y alimentos.
• Reconocer la importancia de la desinfección y sanitización de superficies animadas e
inanimadas.
• Aprender las técnicas adecuadas de la técnica aséptica.

Tareas de aprendizaje para el pre-informe:

• ¿Cómo puede garantizar que un área de trabajo pueda ser apropiada para disminuir la
probabilidad de contaminación microbiológica de un producto?
• ¿Qué es una cabina de flujo laminar, que tipos de cabinas de flujo laminar existen?
• ¿Cuál es la utilidad de las cabinas de flujo laminar?

Materiales:

Hisopo estéril X 4
Tubo de ensayo con tapa con 5 mL de caldo neutralizante X 1
Caja de Petri con Agar nutritivo X 5
Toallas de papel desechable
Jabón para manos.
Marcador indeleble (p.e. Sharpie).
Cinta de enmascarar
Regla
Alcohol en aspersor
Gasas estériles: 5 paquetes X 6 gasas
Mechero.
Beaker 50 mL X 1
Gradilla X 1
Encendedor

Lavado de manos

1. Elegir un compañero y sobre las manos sin lavar tomar muestras de la siguiente manera:
a. Tomar un hisopo impregnado con caldo neutralizante y frotar la palma de la mano para
obtener la muestra.
b. Frotar el hisopo sobre toda la superficie del agar neutralizante de la caja de Petri.
c. Incubar a 35 ºC por 48 horas.

2. Aplicar el procedimiento de lavado de manos con jabón y enjuagar con agua potable.
Secarse las manos con toallas de papel desechable.
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3. Volver a tomar las muestras de la superficie de la palma de la mano con un hisopo tal como
se indicó en el numeral 1.a.

4. Incubar las cajas de agar nutritivo a 35 ºC por 48 horas.

5. A las 48 horas de incubación leer los resultados.

Limpieza y desinfección de mesones

1. Escoger un mesón de laboratorio y delimitar un área de 25 cm X 25 cm con cinta de

enmascarar. Dentro del área delimitada, marcar, con cinta de enmascarar dos áreas de 10
cm X 10 cm.

2. De una de las zonas delimitadas (10 cm X 10 cm), tomar una muestra representativa con un
hisopo impregnado con caldo neutralizante así:
a. Frotar un hisopo impregnado con caldo neutralizante sobre una de las áreas
enmarcadas de 10 cm X 10 cm, de la zona delimitada del mesón.
b. Frotar el hisopo sobre toda la superficie del agar nutritivo de la caja de Petri.
c. Incubar a 35 ºC por 48 horas.

3. Limpieza del mesón

a. Con un atomizador asperjar la zona delimitada con alcohol 70%.
b. Con ayuda de gasas estériles restregar la zona.
c. Secar la superficie con gasas estériles.
d. Tomar la muestra de la zona próxima a la zona que muestreó según el procedimiento
descrito en 2.a y 2.b.
e. Incubar a 35 ºC por 48 horas.

4. Después del período de incubación, hacer las lecturas de los recuentos antes y después de
los procesos de lavado y desinfección.

5. Evaluar la eficacia del procedimiento teniendo en cuenta los resultados.

En la figura, el recuadro azul

corresponde al sitio donde se
toma la muestra antes de
iniciar el proceso de limpieza.

El recuadro rojo corresponde

al sitio donde se toma la
muestra después de realizado
el proceso de limpieza.

Procesamiento de datos
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Población Antes de Procedimiento (PAP): sumatoria Los recuentos de las UFC/dispositivo

recuperadas antes del proceso de limpieza y desinfección.

Población Después de Procedimiento (PDP): sumatoria de los recuentos de las UFC/dispositivo

recuperadas después del proceso de limpieza y desinfección:

Los recuentos se reportan en UFC/m 2. En consecuencia, se calculan los recuentos con base en el
área muestreada.

Muestreo ambiental

1. Escoger un lugar en el laboratorio.

2. Tomar la caja de Petri con Agar nutritivo.

3. Destapar la caja de Petri con Agar nutritivo en el lugar elegido para la toma de la muestra
durante un lapso de 10 minutos.

4. Tape la caja de Petri con Agar nutritivo.

5. Incubar a 35 ºC por 48 horas.

6. Hacer recuento del número de UFC encontradas en el ambiente.

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Tercera Sesión: Tinciones diferenciales: Gram.

Introducción:

La caracterización morfológica de microorganismos es un proceso complejo que se aborda desde

diferentes técnicas analíticas, una de ellas consiste en clasificar a los microorganismos de acuerdo
con la constitución de su pared celular. La tinción de Gram permite clasificar a la gran mayoría de
las bacterias en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas.

Objetivos:

• Aprender la técnica de la tinción de Gram.

• Reconocer y reafirmar el uso correcto de los microscopios ópticos.

Tareas de aprendizaje para el pre-informe:

• ¿Por qué algunas bacterias se tiñen como Gram positivas y otras se tiñen como Gram negativas?
• ¿Por qué algunas bacterias no se pueden clasificar de acuerdo con la tinción de Gram?
• ¿Se pueden teñir con la técnica de Gram microorganismos diferentes a bacterias?
• ¿Cuál es la manera apropiada de mantener los objetivos y oculares de los microscopios ópticos
limpios?
• ¿Cómo se deben limpiar los objetivos que se encuentran cubiertos con aceite de inmersión?

Materiales:

Portaobjetos
Cubre objetos
Asa bacteriológica circular
Mechero bunsen
Papel seda

Material biológico

Cajas de Petri de cultivos de manos, superficies y ambiental de la sesión anterior.

Reactivos

Cristal violeta de Gram.

Lugol.
Alcohol-cetona de Gram.
Safranina de Gram.
Aceite de inmersión.

Equipo

Microscopio de campo claro.

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Preparación del frotis cultivos sólidos

1. Esterilice el asa.

2. Ponga una gota de agua en el portaobjetos con el asa y mézclelo con la muestra.

3. Esterilice el asa.

4. Dejar secar el frotis al aire.

5. Fije la preparación pasándola varias veces sobre la llama del mechero, procurando no
sobrecalentarla

Tinción de Gram

1. Cubrir el frotis con cristal violeta por un minuto.

2. Lavar con agua.

3. Aplicar lugol por un minuto.

4. Lavar con agua y secar rápidamente.

5. Decolorar de 7 a 8 segundos con la mezcla alcohol-acetona.

6. Lavar con agua y dejar secar.

7. Contrastar con safranina durante 30 segundos.

8. Lavar con agua y dejar secar.

9. Colocar sobre la muestra el cubreobjetos.

10. Observar al microscopio con el aumento de inmersión.

11. Anotar y dibujar los resultados encontrados.

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Cuarta Sesión: Aislamiento y cuantificación de microorganismos

Introducción:

En la naturaleza, habitualmente, los microorganismos se encuentran constituyendo comunidades

compuestas por múltiples especies de microorganismo. Con el objetivo de poder caracterizar
adecuadamente una especie microbiana se hace necesario poder aislarlo de la naturaleza.

Por otro lado, cuando la concentración de microorganismos en una muestra es muy grande, es
necesario realizar procesos de dilución para poder cuantificarlos.

Objetivos:

• Desarrollar la habilidad de diluir adecuadamente, de manera seriada, una muestra para análisis
microbiológico.
• Mejorar la experticia en el uso de la técnica aséptica para el correcto manejo de muestras para
análisis microbiológico.
• Aprender la técnica de muestreo por extensión en medios de cultivo sólido.
• Reconocer la técnica de siembra por estría de colonias bacterianas.

Tareas de aprendizaje para el pre-informe:

• ¿Qué consideraciones deben tenerse en cuenta para obtener una adecuada técnica aséptica?
• ¿Cuál es el fundamento de la técnica de siembra por estría y cual es su utilidad?
• ¿Cuál es el objetivo de la siembra por extensión y cual es su utilidad?

Materiales por estudiante

Tubos de ensayo con tapa rosca ESTÉRILES X 3

Pipeta graduada de 10 mL ESTÉRIL X 1
Pipeta graduada de 1 mL ESTÉRIL X 1
Caldo Verde Brillante 35 mL
Gradilla X 1
Marcador indeleble X 1
Asa de Digralsky X 1
Caja de Petri con Agar Nutritivo X 2.
Asa bacteriológica circular.
Mechero
Pipeteador de cremallera
Muestra de agua de charco o muestra con microorganismos (debe ser traída por el estudiante).

Preparación de diluciones y conteo de población microbiana.

1. Tomar tres tubos de ensayo con tapa rosca ESTÉRILES y ponerlos en una gradilla e
identificarlos respectivamente con las diluciones 10-1 a 10-3.

2. En un ambiente aséptico, colocar en cada tubo de ensayo 9 mL de Caldo Verde Brillante

utilizando una pipeta graduada de 10 mL ESTÉRIL.
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3. Con una pipeta ESTÉRIL de 1 mL, tomar 1 mL de la muestra de agua de charco y adicionar
al tubo identificado como 10-1. Mezclar el contenido del tubo con ayuda de la pipeta de 1 mL
y el pipeteador.

4. Con la misma pipeta ESTÉRIL de 1 mL del paso 3, tomar 1 mL del tubo identificado como
10-1 y verterlo en el tubo marcado como 10-2. Mezclar el contenido del tubo con ayuda de la
pipeta de 1 mL y el pipeteador.

5. Con la misma pipeta ESTÉRIL de 1 mL del paso 3, tomar 1 mL del tubo identificado como
10-2 y verterlo en el tubo marcado como 10-3. Mezclar el contenido del tubo con ayuda de la
pipeta de 1 mL y el pipeteador.

6. Con la misma pipeta ESTÉRIL de 1 mL del paso 3, tomar 0,5 mL del tubo identificado como
10-3 y verterlo en la caja de Petri con Agar nutritivo, extender rápidamente la muestra en la
caja de Petri por medio de un asa de Digralsky ESTÉRIL.

7. Incubar la caja de Petri cultivada a 35 ºC por 48 horas.

8. Calcular la cantidad de microorganismos por mililitro de la muestra inicial. El resultado se

expresa como Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/mL).

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Aislamiento

1. De la muestra de agua de charco, tomar una muestra con ayuda del asa bacteriológica
circular ESTERIL.

2. Sembrar la colonia por agotamiento de estría en una caja de Petri con Agar Nutritivo.

3. Se incuba a 35 ºC hacer observaciones a las 24 y 48 horas.

4. Verificar la existencia de colonias aisladas en el medio de cultivo.

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Recuperada 25 ago 2020